Identifizierung und Charakterisierung von GDNF und TGF-beta1 als neurotropen Komponenten von sekretorischen, organischen bovinen chromaffin-Zellen
Prisca-Maryla Henheik
Dr. sc. hum. Identifizierung und Charakterisierung von GDNF und TGF-1 als neurotropen Komponenten von sekretorischen Speicherorganischen Bovine-Chromaffin-Zellen geboren am 17.08.1962 in Ebstorf Reifeprüfung am 14.05.1981 in Dannenberg Studiengang des Fachbereichs Chemie Diplom von WS 1981 bis SS 1994 Vordiplom am 16.02.1989 an der Universität Göttingen Diplom am 06.05.1994 an der Universität Göttingen Promotionsfach: Anatomie und Zellbiologie Doktor: Prof. Dr. med. K. Unsicker Ziel des vorliegenden Dissertations war es, die neurotropen Aktivität isolierter von der sekretorischen Speicherorganischen Bovine-Chromaffin-Zellen zu identifizieren bzw. nach Stimulation von stimulativer Chromatik freizugeben.
Die Isolierung der Proteine, die für die neurotropen Aktivität verantwortlich sind, wurde mit
Bei allen Reinigungsschritten dienten
eine hochspezifische Untersuchung von Ciliarganglien-Neuronen als Kontrolle für eine mögliche Anreicherung
Es sollte zunächst eine vollständige Abtrennung der neurotropen Aktivität erfolgen.
neurotropen Aktivität von Chromogranin
der Hauptbestandteil des Proteinmischens
Dies wurde durch zwei Trennverfahren erzeugt, die
Die Vorbereitungs-isoelektrische Fokussierung und die Heparin-Affinitätschromatographie
Die isoelektrische Fokussierung charakterisierte grundlegende Proteine, die in
Der pH-Bereich von 9,0 bis 9,2 war als neurotroph konzentriert. Bei der Affinität der neurotrophen Aktivität zu Heparin handelt es sich um eine lockere Bindung, die bereits durch 0,6 NaCl eingeweicht wurde. Darüber hinaus zeigte die Inkubation mit N-Glycosidase eine Verschiebung des Molekülgewichts der Proteine, so dass ein Vorhandensein von Glykoproteinen festgestellt werden konnte. In den folgenden Reinigungsversuchen konnte jedoch keine neurotrophe Aktivität mehr festgestellt werden. Im Laufe der Arbeit stellte sich heraus, dass zwei synergistisch wirkenden Faktoren nur gemeinsam eine neurotrophe Aktivität aufwiesen. Die verschiedenen proteinchemischen Methoden führten daher zur Trennung der Komponenten und zum Verlust der neurotrophen Aktivität.
Für zwei von chromaffinigen Zellen synthetisierte Wachstumsfaktoren,
1 und GDNF,
Durch Immunpräzipation und anschließende Western Blot konnte die Lokalisierung in
Chromaffine Granula und ihre Freisetzung in das Kulturmedium von kultivierten Chromaffinen
Zellen werden nach Choliner-Stimulus angezeigt.
Nachweis, dass die in chromaffinigen Granula lokalisierten Wachstumsfaktoren, TGF-1 und GDNF, die für die neurotropen Aktivität verantwortlich waren, durch die fast vollständige Neutralisierung der Aktivität von Ciliarganglien-Neuronen von GDNF und TGF-1 im chromaffinigen Granula durch protein-spezifische Antikörper entstanden sind.
Als Gegenprobe wurden die gereinigten rekombinanten Proteine getestet.
1 und GDNF
Sie hatten keine überlebensfördernde Wirkung auf die Ziliarganglien-Neuronen.
Diese Synergismus von TGF und GDNF konnte in vitro nicht nur für das Überleben von Ciliarganglien-Neuronen, sondern auch für Spinalganglien-Neuronen und auch für die sympathischen Neuronen des Hühnerschnittes gezeigt werden.
Als der zugrunde liegende molekulare Mechanismus der Synergismus wurde der Einfluss von
Ferner
Auf die GPI-Anbindung des Alpha-Rezeptors (GFR-Anbindung)
) von GDNF untersucht.
Es scheint, als ob es bei der Bereitstellung des GFR
Im Rahmen dieser Dissertation konnten die Proteine, die für die neurotropen Aktivität verantwortlich sind, in der chemischen Proteinmischung von Chromaffin Granula als synergetische Wachstumsfaktoren TGF-1 und GDNF identifiziert werden.