Signaltransduktion zwischen Endoplasma-Reticulum und Nucleus: Einfluss von Brefeldin A auf die Regulierung der Transkription von Gonadotropin-a-Unterheit im Menschen

Mathias Gante

Dr.sc.hum. Signaltransduktion zwischen Endoplasma-Reticulum und Nucleus: Einfluss von Brefeldin A auf die Regulierung der Transkription der Gonadotropin-Unterheit des Menschen Geboren am 27.3.1967 in Berlin Reifeprüfung am 5.6.1986 in Darmstadt Studiengang im Fachbereich Biologie von WS 88/89 bis SS 94 Abschluss am 25.6.1991 an der Technischen Hochschule Darmstadt Diplom am 21.4.1994 an der Technischen Hochschule Darmstadt Promotion: Biochemiker: Prof. Dr.phil. nat.

Aus einem genomischen DNA-Phagen-Bank wurde die Fördersequenz des -hCG-Gens mit einer 5′-Flankierungssequenz isoliert, die Sequenz wurde zusammen mit dem Anfangsbereich des 1. Exons von -hCG in einen Luciferase-Reportergen-Vektor gekloniert (pGL -1102/+50).

Dieser Reportergen-Vektor wurde in JAR-Chorion-Krebszellen transferiert und nach Lyse

Die Zellen wurden mit Luciferase-Aktivität gemessen.

Es ist jedoch nicht möglich, die Aktivität von

-HCG wird nach 12 Stunden um das 3.5-fache erhöht, wobei die

Bei der Behandlung mit BFA konnte ein biphasischer Effekt beobachtet werden. An den Messpunkten nach 10 Minuten und 30 Minuten war eine Verringerung der Promoteraktivität mit einer Induktion von 0,5 bzw. 0,9 festgestellt worden, während nach 60 Minuten und 120 Minuten mit einer Induktion von 1,9 bzw. 1,4 eine Erhöhung der Promoteraktivität festgestellt wurde.

Wenn die Zellen zunächst 8-Bromo-cAMP für 12 h angewendet wurden und dann 1 h BFA zugelassen wurde, konnte eine Induktion von 5,4 erreicht werden, was der Summe der zuvor gemessenen Einzelwerte entsprach. Die Wirkungsplatz des BFA-Effekts nach 1 h (Induktion 1.9fach) wurde durch Transfektionsversuche mit Reportergen-Konstruktionen mit schrittweise kleineren Insertionen des -hCG-Promotors auf das Bereich zwischen -938 bp und -1102 bp begrenzt. Ein DNA-Fragment, das sich in diesem Bereich umspannt, wurde für Bandshift-Experimente eingesetzt. Diese DNA-Protein-Extract-BFA-Unbehandelte JAR-Zellen erzeugten einen spezifischen Protein, der sich durch den Einsatz eines Protein-BFA-Bindungsproteins auf BFA-N-Extract-Base BFA-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-Z-

Eine weitere Reinigung mit einer Affinitätssäule war nicht mehr möglich. Um das eigentliche Ziel einer Reinigung, nämlich die Charakterisierung und Sequenzierung dieses Proteins, zu erreichen, muss diese auf einem größeren Maßstab und mit verschiedenen Säulen durchgeführt werden.

Bei dem

BFA-responsives DNA-Bindungsprotein

15 kDa) sind vermutlich

Der beobachtete Effekt ist BFA-responsiv, aber es ist nicht zu sagen, ob er auch BFA-spezifisch ist. Ein Vergleich mit den Arbeiten anderer Arbeitsgruppen lässt vermuten, dass es sich hierbei um eine Reaktion auf die Akkumulation von Proteinen in der ER handelt, wie sie durch BFA erzeugt wird.