Comparazione di due protocolli di PCR diversi per la rilevazione diretta di Mycobacterium tuberculosis in sputum e di due coloranti per la rilevazione del DNA tramite gelatelettroporesi
Marco Faas
Dr. med. dent. nato il 01.08.1968 a Pforzheim esame di maturità il 03.05.1988 a Pforzheim corso di studio della facoltà di odontoiatria da SS 1989 a SS 1995 Fisica il 05.10.1992 presso la Ruprecht-Karls Universität Heidelberg Studi clinici a Heidelberg esami statali il 02.08.1995 presso la Ruprecht-Karls Universität Heidelberg Hans-Peter Hornig Dr. med. dent.
Nato il 23 maggio 1967 a Heidelberg
Prova di maturità del 03.05.1986 a Heidelberg
Corso di studi della facoltà di odontoiatria dal WS 1989 al SS 1995
Fisica al 02.10.1992 presso l'Università di Heidelberg di Ruprecht-Karls
Studi clinici a Heidelberg
Esami di Stato del 02.08.1995 presso l'Università Ruprecht-Karl di Heidelberg
Domanda di laurea: patologia
Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. K. Kayser
Comparazione di due protocolli di PCR diversi per la prova diretta di
Mycobacterium tuberculosis in sputum e due coloranti per la prova del DNA
con gielettroforesi
Ci sono due protocolli diversi per la reazione a catena di polimerasi
I campioni di sputum dei 50 pazienti esaminati sono stati suddivisi in tre gruppi: il primo gruppo comprendeva 20 pazienti affetti da tubercolosi sicura; il secondo gruppo includeva 20 pazienti in un letto non tubercoloso senza segni di tubercolosi; il terzo gruppo comprendeva 10 pazienti di cui non sapevamo né diagnosi né risultati culturali né histologici al momento della sputazione.
I seguenti risultati sono stati ottenuti in tutti i 50 pazienti esaminati con la PCR standard e
Risultati ottenuti con Nested PCR: sensibilità 92,9% (standard) e 64,3% (Nested), specificità
Nel comparare i due coloranti fluorescenti DNA etidiumbromide e Sybr®GreenI per l'elettrophoresi gel, abbiamo utilizzato segelli di agarose del 2%. I coloranti sono stati valutati in termini di sensibilità, diminuzione dell'intensità luminosa sotto l'influenza UV e fluorescenza di fondo.
L'analisi dei risultati ha rilevato una sensibilità di 10,5 volte superiore a quella di Sybr®GreenI e una sensibilità di 6 volte superiore a quella di Sybr®GreenI dopo 10 minuti di esposizione alla luce UV di etidiumbromide.
In conclusione, si conclude che:
la reazione a catena di polymerase ha una elevata sensibilità e
La diagnosi delle infezioni microbiche è molto specifica all'inizio.
Tuttavia, la relativa affidabilità dei metodi di PCR non dovrebbe essere
Metodi di indagine quali la prova histologica e la coltivazione di agenti culturali
La diagnosi nei pazienti con PCR standard non definiti non è necessaria.
I risultati sono facilitati da un'ulteriore analisi con un PCR Nested.Il confronto tra i due DNA coloranti etidiumbromide e Sybr®GreenI mostra che l'uso di Sybr®GreenI per l'applicazione pratica nell'elettrophoresia di routine ha vantaggi rispetto al DNA colorante etidiumbromide usato.Al di là dei costi più elevati, questi risultano dalla maggiore sensibilità alla luce, dalla bassa perdita di fluorescenza (fading) e dalla quasi assenza di tossicità.