Reverse-Dot-Blot-Hybridisierung zur schnellen Identifizierung von Mycobacteria-Spezies
Katja Christine Benz
Dr. med. Reverse Dot-Blot-Hybridisierung zur schnellen Identifizierung von Mykobakterienarten Geboren am 13.01.1970 in Stuttgart Reifeprüfung am 25.05.1989 in Ludwigsburg Studiengang des Fachbereichs Medizin von SS 1990 bis WS 1997 Physik im März 1992 an der Universität Heidelberg Klinische Studie in Heidelberg/Mannheim Praktischjahr im Diakonissenhaus in Mannheim Prüfungen am 04.11.1997 an der Universität Heidelberg Promotionsfach: Chirurgie Doktor Prof. Dr. med. Schmidt-Gayk Die Zahl der Tuberkulose-Krankheiten und Erkrankungen, die durch die ycobacter han uculosis (MOTT) verursacht werden, hat in den letzten Jahren zugenommen.
Diese Entwicklung hängt eng mit dem drastischen Anstieg von Krankheiten wie AIDS oder Tumorerkrankungen und Therapien zusammen, die mit einer Schwächung des Immunsystems verbunden sind. Im Gegensatz zu Mycobacterium (M.) tuberculosis kommen die MOTT-Erregter, zu denen alle Mycobacterienarten außer M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum und M.leprae ubiquitär in der Umwelt sind und über Wasser, Staub oder Tiere überall mögliche Infektionsquellen darstellen.
Die Diagnose einer Mycobacteriosis ist schwierig.
Auch die Tuberkulin-Inhaltsprüfung, die bei Tuberkulose als Screening-Methode verwendet wird, und die serologischen Verfahren, die bei anderen Infektionen weit verbreitet sind, erwiesen sich bei MOTT-Infektionen als wenig befriedigend.
Die am häufigsten verbreitete traditionelle Methode der Mycobacterialindizierung ist
Pflanzung von Bakterienkulturen mit folgenden Interpretationen der morphologischen und
Das Wachstum der Kulturen in den langsam wachsenden
Mykobakterien über einen Zeitraum von 3 bis 6 Wochen und die zur Identifizierung notwendigen
Biochemische Tests sind aufwendig und oft nur wenige Speziallabors vorbehalten.
Die Grundlagen der herkömmlichen Diagnosemethoden sind die relativ wenig variablen phänotypischen Eigenschaften von Mikroorganismen, die von vielen verschiedenen Nukleotidsequenzen kodiert werden können.
Ein weiterer Ansatz bieten daher molekulare genetische Diagnosemethoden.
Diese Methoden sind die Sondetechnik, die für die verschiedenen Mycobacteria-Spezies verwendet wird.
In der Regel werden charakteristische Sequenzen, sogenannte Sequenzsignaturen, ausgewählt.
Sequenzsignaturen werden ergänzende Oligonukleotid-Sonden konstruiert. Ein ideales Molekül als Zielsequenz dieser Gensonden ist die rRNS und die rDNS, die sie kodiert. Sie ist universell in allen Organismen vorhanden und besitzt neben konservierten Regionen auch hochvariable Bereiche. Diese eignen sich optimal für die Konstruktion spezifischer Gensonden, während die konservativen Abschnitte als Bindungsstätte der Oligonukleotid-Sonden für die Verstärkung definierter DNA-Abschnitte in vitro mit Hilfe der PCR verwendet werden. Bei der Einbeziehung der PCR in die Spezialtechnik ist bereits ein kurzes Wachstum von 4-6 Tagen bis zur DNA-Isolierung ausreichend.
Ein rDNS-Abschnitt, der optimal für die Sondenkonstruktion und Speziedifferenzierung geeignet ist
ist die hochvariable Einbindung der 23S rDNS in Helix 54 der Domäne III, die spezifisch für grampositive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt an ihrer DNA ist. Diese Einbindung ermöglicht die Differenzierung einer großen Anzahl von Mycobacteria-Stämmen auf einem DNA-Fragment von nur 100 Basispaaren Länge.
In dieser Arbeit wurde die bislang unbekannte Primärstruktur der 23S rDNS-Insertion von fünf Mycobacteria-Stämme erstellt und einige bereits bekannte Sequenzen korrigiert. Für die am häufigsten isolierten oder klinisch relevanten Mycobacteria-Spezies wurde eine Sequenz-Alignment im Vergleich zu 29 verschiedenen Mycobacteria-Spezies Oligo-Nucleotid-Sonden konstruiert. Darin wurden acht Gensonden neu entwickelt und zusammen mit acht bereits bekannten Oligonukleotid-Sonden auf Kreuzaktivität getestet.
Auf diese Weise können die Mykobakterien innerhalb eines einzigen Tages identifiziert werden, wenn sie nach kurzem Kulturwachstum sauerhaltige Stäbe in der Flüssigkultur erkennen, was im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren eine Zeitersparnis von 2 bis 6 Wochen bedeutet.