Katja Christine Benz
Dr. med.
Reverse Dot-Blot-Hybridisierung zur schnellen Identifizierung von
Mykobakterienspezies
Geboren am 13.01.1970 in Stuttgart
Reifeprüfung am 25.05.1989 in Ludwigsburg
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1990 bis WS 1997
Physikum im März 1992 an der Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg/Mannheim
Praktisches Jahr im Diakonissenkrankenhaus in Mannheim
Staatsexamen am 04.11.1997 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Chirurgie
Doktorvater Prof. Dr. med. Schmidt-Gayk
Die Zahl der Tuberkuloseerkrankungen und Erkrankungen, die durch „Mycobacteria Other
Than Tuberculosis“ (MOTT) verursacht sind, hat in den letzten Jahren stark zugenommen.
Diese Entwicklung hängt eng mit dem drastischen Ansteigen von Krankheiten wie AIDS oder
Tumorerkrankungen und Therapien, die mit einer Schwächung des Immunsystems
einhergehen, zusammen.
Im Gegensatz zu Mycobacterium (M.) tuberculosis kommen die MOTT-Erreger, zu denen alle
Mykobakterienspezies außer M.tuberculosis, M.bovis, M.africanum und M.leprae zählen,
ubiquitär in der Umwelt vor und stellen über Wasser, Staub oder Tiere überall potentielle
Infektionsquellen dar.
Die Diagnosestellung einer Mykobakteriose ist schwierig. Die klinischen Symptome sind
unspezifisch und zeigen oft einen schleichenden Verlauf. Auch der bei der Tuberkulose als
Screeningmethode verwendete Tuberkulinhauttest und die bei anderen Infektionen weit
verbreiteten serologischen Verfahren erwiesen sich bei Infektionen durch MOTT als wenig
befriedigend. Um eine Mykobakteriose diagnostizieren zu können, ist der direkte Nachweis
der verursachenden Mykobakterienspezies erforderlich.
Die am weitesten verbreitete traditionelle Methode des Mykobakteriennachweises ist die
Anzucht von Bakterienkulturen mit nachfolgender Interpretation der morphologischen und
biochemischen Eigenschaften. Das Kulturwachstum benötigt bei den langsam wachsenden
Mykobakterien einen Zeitraum von 3-6 Wochen und die zur Identifikation notwendigen
biochemischen Tests sind aufwendig und oft nur wenigen Speziallabors vorbehalten. Auch
bedeuten sie einen zusätzlichen Zeitaufwand von 2-4 Wochen.
Die Grundlage der konventionellen Diagnostikverfahren sind die bei Mikroorganismen
vergleichsweise wenig variablen phänotypischen Eigenschaften, die von vielen verschiedenen
Nukleotidsequenzen codiert sein können.
Einen anderen Ansatzpunkt bieten daher molekulargenetische Diagnostikmethoden. Eine
dieser Methoden ist die Sondentechnik, bei der für die verschiedenen Mykobakterienspezies
charakteristische Sequenzen, sogenannte Sequenzsignaturen, ausgewählt werden. Gegen diese
Sequenzsignaturen werden komplementäre Oligonukleotidsonden konstruiert.
Ein ideales Molekül als Zielsequenz dieser Gensonden ist die rRNS und die sie codierende
rDNS. Sie kommt universell bei allen Organismen vor, und besitzt neben konservierten
Regionen auch hochvariable Bereiche. Diese eignen sich optimal für die Konstruktion
spezies-spezifischer Gensonden, während die konservativen Abschnitte als Bindungsstelle der
Oligonukleotidprimer für die Amplifikation definierter DNS-Abschnitte in vitro mit Hilfe der
PCR genutzt werden. Unter Einbeziehung der PCR in die Sondentechnik ist schon ein kurzes
Kulturwachstum von 4-6 Tagen bis zur DNS-Isolierung ausreichend.
Ein zur Sondenkonstruktion und Speziesdifferenzierung optimal geeigneter rDNS-Abschnitt
ist die hochvariable Insertion der 23S rDNS in Helix 54 der Domäne III, die spezifisch für
grampositive Bakterien mit hohem G+C-Gehalt ihrer DNS ist. Diese Insertion ermöglicht eine
Differenzierung einer großen Anzahl von Mykobakterienstämmen auf einem DNS-Fragment
von nur 100 Basenpaaren Länge.
In dieser Arbeit wurde die bisher unbekannte Primärstruktur der 23S rDNS-Insertion von fünf
Mykobakterienstämmen erstellt und einige bereits bekannte Sequenzen korrigiert. Für die am
häufigsten isolierten oder klinisch relevanten Mykobakterienspezies wurden über ein
Sequenzalignement im Vergleich mit 29 verschiedenen Mykobakterienspezies Oligo-
nukleotidsonden konstruiert. Davon waren acht Gensonden neu entwickelt und wurden
zusammen mit acht bereits bekannten Oligonukleotidsonden auf Kreuzreaktivität getestet. Als
ein für klinische Routinediagnostik zur Differenzierung von Mykobakterien hervorragend
geeignetes Verfahren erwies sich die Reverse Dot-Blot-Hybridisierung. Bei dieser Methode
wurden die Spezies-spezifischen Oligonukleotidsonden, die gegen die 23S rDNS-Insertion
gerichteten waren, kovalent an eine Membran gebunden. Das Kulturmaterial wurde in vitro
amplifiziert, mit Digoxigenin-dUTP markiert und nachfolgend in einem einzigen
Hybridisierungsvorgang mit der Membran identifiziert.
Auf diese Weise kann bei Nachweis säurefester Stäbchen in der Flüssigkultur nach kurzem
Kulturwachstum die Identifikation der Mykobakterienspezies innerhalb eines einzigen Tages
erfolgen. Das bedeutet gegenüber traditionellen Verfahren eine Zeitersparnis von 2-6 Wochen.
