Vergleichende Untersuchungen zur Erkennung von Interferon-Alpha- und Interferon-Beta-Messenger-Ribonukleinsäure durch in-situ-Hybridisierung mit radioaktiven und nicht-radioaktiven Proben
Christoph Helmer Antoni
Dr. med. Vergleichende Untersuchungen zur Erkennung von Interferon- und Interferon- messenger- -Ribonukleinsäure durch In-situ-Hybridisierung mit Hilfe von radioaktiven und nicht-radioaktiven Sonden Geboren am 20.05.68 in Bremen Reifeprüfung am 02.06.87 in Bremen Studiengang der Fachrichtung Medizin von SS 1989 bis SS 1996 Physik am 03.04.91 an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Klinische Studie in Heidelberg Praxisjahr in Heilbronn Staatsprüfung am 06.05.96 an der Rupert-Karls-Universität Heidelberg Promotion: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ) Doktorat: Privellen-Doz.
Verwendung von Digoxigenin (DIG) markierten Nukleotiden.
Ziel dieser Arbeit war es, die Empfindlichkeit und Auflösungsfähigkeit verschiedener Verfahren zur Ermittlung von mRNA-Transkripten in zytologischen Präparaten mit Hilfe von ISH zu untersuchen. Untersuchungen sollten beispielsweise der induzierbaren, aber niedrig-redundanten mRNA der Zytokine IFN-2 und IFN- in menschlichen Zellen verschiedener Herkunft durchgeführt werden. Unter Zytokinen werden Proteine mit Transmitterwirkung verstanden, die von zoprotein- oder anreizenden Zellen abgegeben werden. Eine Untergruppe der Zytokine bilden Interferone (NIF). Aufgrund ihrer nachmodulierenden und antiproliferativen Wirkung haben sie ihre Anwendung in modernen Krankheiten und in der Medizin gefunden, die bereits eine wichtige Rolle bei der Diagnose von Tumozytiken spielen, da sie im Bereich der Krebserkrankheiten, wie der Krebserkrankheit, der Krebserkrankheit, der Krebserkrankheit und der Krebserkrankheit, wie z.B.
Im Vorfeld der Untersuchung wurde der Vergleich verschiedener Markierungsprozesse untersucht.
Neben den radioaktiv markierten Sonden sollten auch DIG-Sonden für die spezifischen Nukleinsäuren verwendet werden.
Die endgültige Vergleiche der ISH-Ergebnisse
Bei der Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungsmessgeräten sollte eine Übersicht über die
Möglichkeiten für den Einsatz von nicht-radioaktiven Detektionsverfahren in der
Für die Untersuchung wurden periphere Blutleukozyten (PBL) von gesunden Spendern sowie zwei Zelllinien (Namalva-Zellen, MG-63 Zellen) ausgewählt. Die IFN-Induktion wurde mit Sendai-Virus (SV), einem bekannten IFN-Induzenten, durchgeführt.
PBL- und Namalva-Zellen trennten nach Infektion mit SV große Mengen von Interferon in das Medium. Durch Infektion mit 640 Hämagglutinationseinheiten (HAU) SV wurde eine maximale Interferoninduktion erreicht. In Neutralisierungstests mit IFN- und Namalva-Antikörpern zeigten sich die relativen Anteile beider IFN-Typen in PBL- und Namalva-Zellen unterschiedlich. So trennten SV-infizierten Namalva-Zellen waren 75% IFN und 25% IFN, während bei PBL die gleichen Anteile von IFN und IFN nachgewiesen wurden.
Densitometrisch ergab sich ein Verhältnis von
2 mRNS zu IFN
MNRN in Namalva
In allen untersuchten Zelltypen war nach der viralen IFN-Induktion ein stark heterogenes Signal in der ISH zu beobachten, was auf stark unterschiedliche IFN-mRNA-Expression auf Einzelzellebene hindeutet. Die Frequenz-Analysen für IFN-2 mRNA ergaben bei PBL einen Anteil von 5,9% positiven Zellen. Für IFN-mRNA lagen die Werte bei 7,1% für DIG- und 6,4% für P-markierte Proben. Bei den beiden Namalva-Zellen zeigten sich deutliche Unterschiede im Vergleich zu den Markierungen. Bei den Proben lagen die Frequenzzeiten für beide IFN-2 mRNA-Sonden zwischen 3,2% P und 8,0% allein bei der Exposition, für IFN-2 mRNA-Sonden ließen sich 5,8% für PIG- und IFN-MRNA-Markierte von 2,3% für die Nutzung von 2 und 4,0% für die positive DIG- und IFN-Morgane auf der Hand, die zeigen, dass sie nicht mit einer positiven DIG- und IFN-Morgane-Markierung von 2,0% oder mehr als bei den beiden IFN-Morgane-Zellen aufgenommen werden konnten.
In den manuellen Berechnungen der Monosäten werden die positiven Zellen zu den Monozyten zugeordnet.
Der Prozentsatz von Monozyten lag bei 5,4% in einem
Im Vergleich zu den Ergebnissen wurde deutlich, dass die Markierungsmethoden bei der Erkennung von IFN-2 mRNS in PBL ähnliche Ergebnisse lieferten, während die DIG-Markierung bei der Erkennung von IFN-mRNS eine höhere Frequenz von positiven Zellen lieferte. Bei Namalva-Zellen gab es einen deutlichen Unterschied zwischen den Methoden. Die radioaktiv markierten Sonden lieferten deutlich höhere Frequenzen für beide IFN-mRNS-Spezies. Dies kann dazu führen, dass Präparate mit Namalva-Zellen auf jede Art der Behandlung sehr gut reagierten.
Die Ergebnisse der DIG-markierten Sonden sind vergleichbar mit den Ergebnissen der DIG-markierten Sonden.
Dies wird eingeschränkt durch schlechtere
Es entsteht aus der subjektiven Empfindung der Stärke der Farbungen.
So lassen sich qualitative Aussagen mit DIG-markierten Sonden gut machen,
Auf der anderen Seite bieten DIG-markierte
Sonden eine schnellere Alternative zu den durch die längere Expositionszeit zeitlich
In der Zytologischen Technologie ist es auch möglich, dass die Zythologische Technologie mit radioaktiv markierten Messgeräten verarbeitet wird.
Die DIG-markierten Sonden zeigen gute Ergebnisse bei den Präparaten für adhesive Zellen (MG-63), so
In diesem Zusammenhang ist die Kommission der Auffassung, daß eine Anwendung in Gewebeschnitten zu guten Ergebnissen führen kann, was neue Perspektiven für eine breitere Anwendung der In situ Hybridisierung ermöglicht, insbesondere in der Routine-Diagnostik.