Christoph Helmer Antoni
Dr. med.
Vergleichende Untersuchungen zum Nachweis von Interferon-α und Interferon-β
„messenger“-Ribonukleinsäure durch in-situ Hybridisierung unter Verwendung
radioaktiver und nicht-radioaktiver Sonden
Geboren am 20.05.68 in Bremen
Reifeprüfung am 02.06.87 in Bremen
Studiengang der Fachrichtung Medizin vom SS 1989 bis SS 1996
Physikum am 03.04.91 an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Klinisches Studium in Heidelberg
Praktisches Jahr in Heilbronn
Staatsexamen am 06.05.96 an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Promotionsfach: Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ)
Doktorvater: Priv.-Doz. Dr. rer. nat. F. Rösl
Die in-situ Hybridisierung (ISH) ist eine moderne Methode der klinischen Diagnostik. Sie
ermöglicht mit hoher Präzision die genaue Lokalisation von Nukleinsäuresequenzen in
zytologischen Präparaten unter weitgehender Erhaltung der Morphologie von Chromosomen,
Zellen und Gewebeschnitten. Bislang wurden zur Detektion von Nukleinsäuren durch die ISH
hauptsächlich radioaktive Sonden eingesetzt. Seit einigen Jahren finden 33P-markierte
Radionukleotide Verwendung. Auch nicht-radioaktive Detektionssysteme sind schon länger
bekannt, wie z.B. Biotin- und Immunogoldmarkierungen. Die neueste Entwicklung ist die
Verwendung Digoxigenin (DIG)-markierter Nukleotide. Die Detektion erfolgt über einen
Enzym- oder Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Antikörper.
Zielsetzung dieser Arbeit war, die Sensitivität und das Auflösungsvermögen verschiedener
Verfahren zum Nachweis von mRNS-Transkripten in zytologischen Präparaten mit Hilfe der
ISH zu bearbeiten. Die Untersuchungen sollten am Beispiel der induzierbaren, aber nieder-
redundanten mRNS der Zytokine IFN-α2 und IFN-β in menschlichen Zellen verschiedener
Herkunft vorgenommen werden. Unter Zytokinen versteht man Proteine mit
Transmitterwirkung, die von lebenden Zellen konstitutiv oder auf einen Reiz hin abgegeben
werden. Eine Untergruppe der Zytokine bilden die Interferone (IFN). Aufgrund ihrer
immunmodulatorischen und antiproliferativen Wirkung haben sie ihren Einsatz in der
modernen Medizin gefunden und sind in den Therapien der chronischen Hepatitis C, sowie
der Haarzell-Leukämie, kutaner T-Zell-Lymphome und myeloproliferativer Erkrankungen
schon fest etabliert. Im Bereich der Diagnostik kommt dem Nachweis von Zytokinen, wie
dem Tumornekrosefaktor, Interleukin-1 und Interleukin-6 eine immer größer werdende
Bedeutung zu, da sie an der Pathogenese von Krankheiten des rheumatischen Formenkreises,
sowie den Autoimmunkrankheiten entscheidend beteiligt sind.
Im Vordergrund der Untersuchung stand der Vergleich verschiedener Markierungsverfahren
für die spezifischen Nukleinsäuren. Neben radioaktiv-markierten Sonden sollten auch DIG-
markierte Sonden zum Einsatz kommen. Der abschließende Vergleich der Ergebnisse der ISH
bei Verwendung radioaktiv bzw. nicht-radioaktiv markierter Sonden sollte Aufschluß über die
potentiellen Einsatzmöglichkeiten nicht-radioaktiver Detektionsverfahren in der
medizinischen Diagnostik geben.
Für die Untersuchung wurden Periphere Blutleukozyten (PBL) gesunder Spender, sowie zwei
Zellinien (Namalva-Zellen, MG-63-Zellen) ausgewählt. Die IFN-Induktion wurde mit Sendai-
Virus (SV), einem bekannten IFN-Induzenten, durchgeführt. Verglichen wurden im weiteren
die Art und Menge der sezernierten Interferone, sowie die Ergebnisse der RNS-Blot-
Hybridisierung mit der ISH. Es sollte versucht werden, eine Korrelation zwischen der IFN-
Sekretion und der Genexpression auf Einzellzellebene und im Gesamtzellextrakt darzustellen.
PBL und Namalva-Zellen sezernierten nach Infektion mit SV große Mengen Interferon in das
Medium. Durch Infektion mit 640 Hämagglutinationseinheiten (HAU) SV wurde eine
maximale Interferoninduktion erreicht. In den Neutralisationstests mit Antikörpern gegen
IFN-α und -β zeigte sich, daß die relativen Anteile beider IFN-Typen in PBL und Namalva-
Zellen variierten. So sezernierten SV infizierte Namalva-Zellen zu 75% IFN-α und zu 25%
IFN-β, während bei PBL gleiche Anteile von IFN-α und -β nachgewiesen werden konnten. In
RNS-Blot Analysen von über sechs Stunden mit SV infizierten PBL und Namalva-Zellen
zeigte sich ein deutliches Signal für IFN-α2 und IFN-β. In Analysen der RNS von MG-63-
Zellen, die vier Stunden mit dem synthetischen Polynukleotid poly(I):poly(C) und
Cycloheximid superinduziert wurden, konnte ein Signal für IFN-β nachgewiesen werden.
Densitometrisch ergab sich ein Verhältnis von IFN-α2 mRNS zu IFN-β mRNS in Namalva-
Zellen von 1,75 : 1, sowie in PBL von 2,3 : 1.
In allen untersuchten Zelltypen war nach der viralen IFN-Induktion ein stark heterogenes
Signal in der ISH zu beobachten, was auf stark unterschiedliche IFN-mRNS Expression auf
Einzellzellebene schließen läßt. Die Frequenzanalysen für IFN-α2 mRNS ergaben bei PBL
einen Anteil von 5,9% positive Zellen. Für IFN-β mRNS lagen die Werte bei 7,1% für DIG-,
bzw. bei 6,4% für 33P-markierte Proben. Bei den Namalva Zellen zeigten sich deutliche
Unterschiede im Vergleich der Markierungen. So lagen die Frequenzen positiver Zellen für
IFN-α2 mRNS zwischen 3,2% bei 32P und acht Tagen Exposition, bei 5,8% für 33P-
markierten Proben.Für IFN-β mRNS betrugen sie für DIG 2,3% und für 33P 4,6%. Bei der
Hybridisierung mit einem Gemisch beider Sonden (IFN-α2 und -β) konnte an Hand von DIG-
markierten Sonden gezeigt werden, daß die Frequenz der mit beiden Sonden positiven Zellen
nicht signifikant größer war als bei Verwendung einer IFN-β− oder einer IFN-α2-Sonde
allein. Daraus wurde der Schluß gezogen, daß 80% der positiven Zellen beide Interferone
produzieren. Das zeigt darüberhinaus, daß die Produzenten von IFN-α2 und IFN-β beide der
gleichen Population entstammen müssen. Auf Grund von morphologischen Kriterien konnten
die positiven Zellen den Monozyten zugeordnet werden. In den manuellen Auszählungen des
Differentialblutbildes des Donors betrug der prozentuale Anteil von Monozyten 5,4%, in einer
maschinellen Auswertung 6,1%.
Im statistischen Vergleich der Ergebnisse wurde deutlich, daß die Markierungsmethoden bei
dem Nachweis von IFN-α2 mRNS in PBL ähnliche Ergebnisse lieferten. Hingegen erbrachte
die DIG-Markierung bei dem Nachweis von IFN-β mRNS eine höhere Frequenz positiver
Zellen. Bei Namalva Zellen fand sich ein deutlicher Unterschied zwischen den Methoden. Die
radioaktiv-markierten Sonden ergaben deutlich höhere Frequenzen für beide IFN-mRNS-
Spezies. Dies kann daraus resultieren, daß Präparate mit Namalva Zellen gegenüber jeder Art
der Behandlung sehr empfindlich reagierten. So verlangt die Methode der DIG-Markierung
mehrere längere Wasch- und Inkubationsschritte, die der Morphologie der Zellen deutlich
mehr schadeten als die kürzere Behandlung in den Experimenten mit radioaktiv-markierten
Sonden.
Zusammenfassend läßt sich sagen, daß DIG-markierte Sonden vergleichbare Resultate zu
radioaktiv-markierten Sonden liefern. Eingeschränkt wird dies durch die schlechtere
Auswertbarkeit. Sie resultiert aus der subjektiven Empfindung der Stärke der Färbung der
positiven Zellen. So lassen sich mit DIG-markierten Sonden qualitative Aussagen gut,
quantitative Aussagen hingegen nur bedingt treffen. Andererseits bieten DIG-markierte
Sonden eine schnellere Alternative zu den durch die längere Expositionszeit zeitlich
aufwendigeren Methoden mit radioaktiv-markierten Sonden. Auch in zytologischen
Präparaten adhärenter Zellen (MG-63) zeigen die DIG-markierten Sonden gute Resultate, so
daß eine Anwendung in Gewebeschnitten zu gute Ergebnisse führen kann. Das eröffnet neue
Perspektiven, die einen breiteren Einsatz der in-situ Hybridisierung insbesondere in der
Routinediagnostik ermöglichen.
Aufgrund seiner exzellenten Auflösung und des geringen Hintergrundsignals ist 33P ein für
die in-situ Hybridisierung sehr gut geeignetes Radioisotop. Es bietet deshalb für die
Grundlagen-forschung hervorragende Bedingungen.
