Jou nal o science. Lyon №70/2025 3
BIOLOGICAL SCIENCES
STUDY OF THE EFFECT OF SERUM-FREE MEDIA ON THE CULTIVATION OF LEISHMANIA
PROMASTIGOTES IN VITRO
Aliye a Sh.,
PhD in biological sciences
V.Akhundo Scien i ic Resea ch Medical P e en i e Ins i u e
Aze baijan
Az1000, 216, M.Topchubasho s ., Baku
Huseyno a F.,
PhD in medical sciences
V.Akhundo Scien i ic Resea ch Medical P e en i e Ins i u e
Aze baijan
Az1000, 216, M.Topchubasho s ., Baku
Abseyno a Z.,
V.Akhundo Scien i ic Resea ch Medical P e en i e Ins i u e
Aze baijan
Az1000, 216, M.Topchubasho s ., Baku
Ey azli S.,
V.Akhundo Scien i ic Resea ch Medical P e en i e Ins i u e
Aze baijan
Az1000, 216, M.Topchubasho s ., Baku
Masimo a I.
V.Akhundo Scien i ic Resea ch Medical P e en i e Ins i u e
Aze baijan
Az1000, 216, M.Topchubasho s ., Baku
ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ БЕССЫВОРОТОЧНЫХ СРЕД НА КУЛЬТИВИРОВАНИЕ
ПРОМАСТИГОТ LEISHMANIA İN VİTRO
Алиева Ш.
Кандидат биологических наук
Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова
Азербайджан
Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку
Гусейнова Ф.
Кандидат медицинских наук
Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова
Азербайджан
Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку
Абсейнова З.
Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова
Азербайджан
Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку
Эйвазли С.
Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова
Азербайджан
Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку
Масимова И.
Научно-Исследовательский Институт Медицинской Профилактики им. В.Ахундова
Азербайджан
Az1000, 216, ул. М.Топчубашов, Баку
h ps://doi.o g/10.5281/zenodo.17256209
Abs ac
Leishmaniasis is a global ansmissible pa asi ic disease. The disease is widesp ead in 98 coun ies wo ld-
wide, wi h an annual incidence o app oxima ely 0,7–1 million people and 26,000–65,000 dea hs. Flagella ed
p o ozoa o he genus Leishmania a e he causa i e agen s o leishmaniasis. To e ec i ely comba his disease, o
c ea e d ugs and a accine, i is necessa y o ob ain a long- e m cul u e o pa hogens in i o. The main equi emen
o c ea ing a accine is he p oduc ion o a la ge olume o p omas igo es. A p esen , c ea ing an op imal medium
Jou nal o science. Lyon №70/2025 4
ha would suppo his condi ion is a signi ican challenge. The e a e di e en ypes o media used o Leishmania,
which mos ly equi e e al bo ine se um as an expensi e supplemen . A ailabili y o se um is a p oblem in some
pa s o opical and sub opical coun ies in ol ed in leishmaniasis. The e is also a isk o a ious con aminan s
in his se um. Se e al s udies ha e been conduc ed o eplace e al bo ine se um in he cul u e medium wi h a i-
ous o he componen s o educe he abo e-men ioned p oblems. The esul s o hese s udies showed ha he Leish-
mania pa asi e was able o g ow and su i e in a ious se um- ee media as well as in se um-supplemen ed media.
Аннотация
Лейшманиоз — это глобальное сложное трансмиссивное паразитарное заболевание. Это заболевание
широко распространено в 98 странах мира ежегодной заболеваемостью около 0,7–1 миллиона человек и
26 000–65 000 смертей. Жгутиконосные простейшие рода Leishmania являются возбудителями лейшмани-
оза. Для эффективной борьбы с этим заболеванием, для создания лекарственных препаратов и вакцины
требуется получение длительной культуры возбудителей in i o. Основным требованием для создания
вакцины является производство большого объема промастигот. В данное время создание оптимальной пи-
тательной среды, которая способствовала бы этому состоянию, является существенной проблемой. Суще-
ствуют различные типы сред, используемых для Leishmania, которые в основном требуют эмбриональной
бычьей сыворотки в качестве дорогостоящей добавки. Доступность сыворотки является проблемой в не-
которых частях тропических и субтропических стран, вовлеченных в лейшманиоз. Существует также риск
различных загрязнений в этой сыворотке. Было проведено несколько исследований по замене эмбриональ-
ной бычьей сыворотки в питательной среде другими различными компонентами для уменьшения выше-
упомянутых проблем. Результаты этих исследований показали, что паразит Leishmania способен расти и
выживать в различных средах в отсутствие сыворотки так же хорошо, как и в среде с добавлением сыво-
ротки.
Keywo ds: in i o cul i a ion, Leishmania p omas igo es, se um- ee medium, L.majo , L. a en olae.
Ключевые слова: культивирование in i o, промастиготы Leishmania, бессывороточная среда, L.ma-
jo , L. a en olae.
Введение
Лейшманиоз — это глобальное сложное транс-
миссивное паразитарное заболевание, вызываемое
облигатным внутриклеточным паразитом рода
Leishmania. Паразит передается в метациклической
форме млекопитающим-хозяевам через укусы ин-
фицированных самок москитов рода Phlebo omine
во время их кровососания (16). Это заболевание
широко распространено в 98 странах в некоторых
частях тропических и субтропических зон с миро-
вой ежегодной заболеваемостью около 0,7–1 мил-
лиона человек и 26 000–65 000 смертей. Около 350
миллионов человек подвержены риску этого ин-
фекционного заболевания (18).
Для эффективной борьбы с этим заболеванием,
для создания лекарственных препаратов и вакцины
требуется получение длительной культуры возбу-
дителей in i o.
За последние десятилетия для культивирова-
ния паразита Leishmania использовались различные
виды сред, которые подразделяются на две основ-
ные группы: полутвердые двухфазные среды и
жидкие монофазные среды. Эти среды (RPMI-1640,
M199, BHI и NNN, а также Schneide ’s D osophila),
нуждаются в обогащении путем добавления соот-
ветствующего количества крови или FBS ( e al
bo ine se um) для стимуляции деления клеток и
поддержки долгосрочного роста промастигот
Leishmania (8, 3).
FBS (эмбриональная бычья сыворотка) содер-
жит важные компоненты, такие как большое коли-
чество факторов роста, содержащих гормоны, вита-
мины, транспортные белки и факторы адгезии, ко-
торые все имеют решающее значение для непре-
рывного поддержания и размножения культивиру-
емого паразита (17, 9). Использование такого доро-
гостоящего компонента как FBS создает опреде-
ленные проблемы и также повышает риск контами-
нации (2). Таким образом, требуется надежная за-
мена животной сыворотки (4).
Основная часть
Важность культивирования клеток в бессыво-
роточных средах сегодня широко признана. Бессы-
вороточное культивирование паразитов Leishmania
является экономически эффективным и улучшает
крупномасштабное производство этих паразитов.
До сих пор было предпринято несколько попыток
найти подходящие заменители FBS путем разра-
ботки различных веществ, таких как вещества жи-
вотного происхождения (10), изолят соевого белка
(15) и смесь пептона и различных экстрактов (17,
14), а также некоторые определенные бессыворо-
точные среды (14, 1).
В исследовании Abdalla Hassan Sha ie e al.
(14) описана простая питательная среда для первич-
ной изоляции и последующего культивирования
промастигот Leishmania без использования сыво-
ротки или цельной крови. Была описана сравни-
тельно простая формула среды (CML) с использо-
ванием обычных, доступных и недорогих ингреди-
ентов, которые могут заменить FBS, для культиви-
рования промастигот Leishmania. Эта среда поддер-
живала рост паразитов со скоростью, сопоставимой
с той, которая получена с использованием среды
RPMI-1640 с добавлением сыворотки. Промасти-
готы Leishmania, размноженные в CML, продемон-
стрировали умеренную или высокую инфекцион-
ную способность при тестировании на линии мак-
рофагальных клеток J774. Не было отмечено суще-
ственной разницы между штаммами Leishmania,
культивируемыми в новой модифицированной
Jou nal o science. Lyon №70/2025 5
среде, и штаммами, выращенными в среде RPMI-
1640, в инфекционности и репликативном потенци-
але их клеток. Использование новой CML может
легко заменить другие двухфазные или жидкие
среды из-за простоты приготовления и мгновен-
ного использования, разумной цены, доступности
ингредиентов и длительного срока хранения, кото-
рый составляет 30–45 дней. Тот факт, что эта среда
схожа с другими питательными средами по долго-
вечности и количеству образующихся паразитов,
может дать ей преимущество перед другими ис-
пользуемыми в настоящее время средами.
В течение 8 недель непрерывного культивиро-
вания промастиготы L.dono ani и L.majo демон-
стрировали быстрое размножение как в среде
RPMI-1640, так и в среде CML. Рост промастигот
достиг наивысшего уровня на 6-й неделе культиви-
рования, оставался стабильным в течение корот-
кого периода после этого, а затем слегка снизился
или регрессировал на 8-й неделе. Размножение изо-
лятов Leishmania в среде CML оказалось близким к
размножению изолятов, выращенных в среде
RPMI-1640 в течение первых шести недель.
В работе Ali SA e al. (1) описана полусинтети-
ческая, автоклавируемая жидкая среда, не требую-
щая включения сыворотки плода теленка (FCS) для
успешного культивирования промастигот
Leishmania in i o. Паразиты выращивались в ком-
мерчески доступной среде 199 с добавлением 10%
FCS и 2% мочи млекопитающих, а рост сравни-
вался с той же средой без FCS. Рост паразитов в по-
лусинтетической среде без FCS оказался немного
лучше, чем в среде 199 с добавлением FCS.
San a em N e al. (13) отмечают, что идеальная
питательная среда для промастигот Leishmania
должна сохранять основные характеристики про-
мастигот, обнаруженных у москитов (морфология и
инфекционность). Исследователи проанализиро-
вали морфологию, жизнеспособность, прогрессию
клеточного цикла и инфекционность. Они разрабо-
тали простую среду без сыворотки (cRPMI). Пара-
зиты, растущие в разных средах, демонстрировали
разные биологические характеристики и различ-
ную инфекционность in i o и in i o. Разработан-
ная среда cRPMI оказалась менее дорогой заменой
традиционной среды с добавлением сыворотки для
поддержания промастигот in i o. Было выявлено
что cRPMI идеально подходит для поддержания па-
разитов в лабораторных условиях, уменьшая ожи-
даемую потерю вирулентности с течением вре-
мени, типичную для культивирования паразитов.
В другой работе (5) исследователи стремились
оценить новую бессывороточную среду в культуре
паразита Leishmania для будущей цели разработки
живой вакцины против Leishmania.
Среди различных видов Leishmania L. a en olae
является паразитом ящериц и непатогенен для че-
ловека. Этот паразит представлен как важный ин-
струмент для производства рекомбинантных бел-
ков из-за его характеристик. Также имеется ряд
других преимуществ: короткое время генерации в
культуральной среде 6-10 часов, простое и доступ-
ное требование к питательным веществам, высокая
скорость роста и простота в работе (6). L. a en olae
имеет потенциал и уже продемонстрировал эффек-
тивный подход для разработки безопасной и эффек-
тивной живой профилактической вакцины против
инфекций Leishmania (12).
В настоящей работе исследователи разрабо-
тали простую, легкую в обращении, монофазную
бессывороточную среду, названную CSFM, чтобы
продемонстрировать ее потенциал для культивиро-
вания живого непатогенного рекомбинантного
L. a en olae , секретирующего Ppsp15-EGFP в каче-
стве вакцинной мишени и патогенной формы
Leishmania (L.majo ). Кроме того, инфекционность
паразита L.majo в восприимчивой модели мышей
BALB/c были подтверждены в присутствии этой
новой бессывороточной среды.
Использовались три типа L. a en olae - штамм
L. a en olae Ta II (ATCC 30.267) дикого типа;
L. a en olae , экспрессирующий EGFP (L. a en olae
-EGFP) и рекомбинантный L. a en olae -PpSP15-
EGFP, а также штамм L.majo дикого типа
(MRHO/IR/75/ER). На первом этапе промастиготы
культивировались при 26°C в среде M199 с добав-
лением 5% инактивированной нагреванием FBS.
Питательная среда M199 была предоставлена в ка-
честве стандартной среды.
Рекомбинантный L. a en olae, секретирующий
PpSP15-EGFP и дикий тип L.majo культивирова-
лись в бессывороточной (CSFM) и сывороточно-до-
полненной среде. Затем оценивались и сравнива-
лись скорость роста, экспрессия белка и инфекци-
онность культивируемых паразитов в обоих усло-
виях.
Поведение роста рекомбинантного паразита
L. a en olae -PpSP15-EGFP, исследованное микро-
скопически в среде CSFM, сравнивали с обычной
средой M199 с 5% FBS. Выяснилось, что среда
CSFM, также, как и M199 с 5% FBS, может поддер-
живать рост паразита L. a en olae -PpSP15-EGFP.
Слегка значимая разница наблюдалась на 2-3-е дни
после инокуляции (p <0,05); однако уровень роста в
другие дни был схожим, и никаких значимых раз-
личий обнаружено не было (p >0,05). Проводилось
ежедневное микроскопическое наблюдение за по-
движностью паразита во время культивирования, и
паразиты были обнаружены в нормальном размере
с соответствующей подвижностью. Эти результаты
описывают способность среды CSFM поддержи-
вать размножение паразита L. a en olae -PpSP15-
EGFP.
Итак, в данном исследовании новая среда без
сыворотки, названная CSFM, сравнивалась с M199,
обогащенной 5% FBS, как коммерчески доступной
и широко используемой жидкой средой для оценки
морфологических и биологических критериев пара-
зитов L. a en olae -PpSP15-EGFP и L.majo дикого
типа. Было обнаружено, что типичный внешний
вид промастигот L. a en olae -PpSP15-EGFP - жгу-
тиконосцы, подвижные и нормального размера в
среде CSFM, точно такой же, как у паразитов, куль-
тивируемых в M199 с 5% FBS. Скорость роста про-
мастигот L.majo в среде CSFM оказалась схожей с
M199, дополненной 5% FBS. Как показано, не было
Jou nal o science. Lyon №70/2025 6
никаких существенных различий в уровне скорости
роста L.majo , культивируемых в среде CSFM, по
сравнению с контрольной группой во все указан-
ные временные точки (p > 0,05).
В настоящем исследовании ученые стреми-
лись заменить FBS экономически эффективными
дополнительными веществами для культивирова-
ния и размножения паразита Leishmania, особенно
для культивирования паразита L. a en olae- PpSP15-
EGFP в пользу разработки вакцин и терапевтиче-
ских целей, которые требовали безопасных условий
для производственного процесса. В этой связи,
чтобы найти подходящую замену FBS, были иссле-
дованы потребности паразитов Leishmania в пита-
нии. Известно, что потребности паразитов
Leishmania в аминокислотах сложны. В прошлом
были проведены некоторые исследования для опре-
деления необходимых аминокислот для промасти-
гот Leishmania путем удаления каждой аминокис-
лоты отдельно из культуральной среды, и резуль-
таты показали, что аминокислоты, включая трипто-
фан, фенилаланин, аргинин, лейцин, лизин, валин,
серин, гистидин, тирозин и треонин, необходимы
для выживания и непрерывного культивирования
промастигот Leishmania (11). Также известно, что
гем является важной биомолекулой, действующей
как критический регуляторный компонент в окис-
лительном метаболизме, хранении и транспорте
кислорода и передаче сигнала у различных видов
Leishmania , в конечном итоге влияя на рост и вы-
живание паразита. Уже показано, что паразит
Leishmania и другие простейшие, например, трипа-
носоматиды, имеют метаболический дефект и ли-
шены необходимых ферментов для синтеза этой
молекулы. Поэтому необходимо получать гем из
окружающей среды (7). Другие питательные веще-
ства, необходимые паразиту Leishmania, включают
витамины, такие как никотиновая кислота, фолие-
вая кислота, биотин, тиамин, рибофлавин и панто-
тенат (13).
Анализ иммуноблоттинга показал, что про-
филь экспрессии белка PpSP15-EGFP в промастиго-
тах L. a en olae -PpSP15-EGFP, выращенных в
среде CSFM, с точки зрения молекулярной массы и
относительной интенсивности аналогичен обога-
щенной сывороткой культуральной среде. Эти ре-
зультаты ясно продемонстрировали, что паразиты
L. a en olae -PpSP15-EGFP способны размножаться
и способны выживать в среде CSFM. Исследование
также продемонстрировало, что паразит, выращен-
ный в среде CSFM, обладал такой же способно-
стью, по сравнению с M199 с 5% FBS, заражать мы-
шей BALB/c. Мазки показали нормальные морфо-
логические характеристики промастигот L.majo ,
выращенных в обеих средах. Измерение паразитар-
ной нагрузки и отека подушечек лап со значитель-
ным поражением показало надлежащую инфекци-
онную силу промастигот L.majo в обеих средах.
Следовательно, рост в этой бессывороточной среде
не оказал влияния на типичные морфологические
характеристики и инфекционность паразита
L.majo . Эти результаты ясно продемонстриро-
вали, что удаление FBS из-за замены другими пита-
тельными веществами в среде CSFM не оказало
влияния на паразита на уровне инфекционности in
i o.
В целом эти данные подтверждают, что среда
CSFM благодаря своим компонентам, включая не-
заменимые и заменимые аминокислоты, витамины,
высокое содержание глюкозы и другие питатель-
ные вещества, способна поддерживать рост и ин-
фекционность как L. a en olae -PpSP15-EGFP, так и
L.majo дикого типа. Другим важным вопросом яв-
ляется то, что CSFM имеет доступные ингредиенты
с легким доступом, а также является экономически
эффективной. Кроме того, эта питательная среда
может использоваться в ферментере для массового
производства Leishmania для вакцинации и тера-
певтических целей. Это исследование показало, что
CSFM может быть перспективной заменой среды с
добавлением FBS в культуре паразитов Leishmania
для создания живой вакцины.
Выводы
Проведенные исследования показывают, что
для культивирования in i o промастигот
Leishmania можно использовать менее дорогостоя-
щие бессывороточные питательные среды. Удале-
ние FBS из состава питательных сред не оказывает
влияния на паразита на уровне инфекционности in
i o.
Список литературы:
1. Ali SA, Iqbal J, Ahmad B, Masoom M. A sem-
isyn he ic e al cal se um- ee liquid medium o in
i o cul i a ion o Leishmania p omas igo es. The
Ame ican jou nal o opical medicine and hygiene.
1998;59(1):163–165. doi: 10.4269/aj mh.1998.59.163.
2. B unne D, F ank J, Appl H, Schö l H, P alle
W, Gs aun hale G. The se um- ee media in e ac i e
online da abase. Al e na i es o animal expe imen a-
ion. 2010;27(1):53–62. doi: 10.14573/al ex.2010.1.53.
3. de Almeida Rod igues I, da Sil a BA, dos San-
os ALS, Ve melho AB, Al iano CS, Rosa MdSS. A
new expe imen al cul u e medium o cul i a ion o
Leishmania amazonensis: i s e icacy o he con inu-
ous in i o g ow h and di e en ia ion o in ec i e p o-
mas igo e o ms. Pa asi ology esea ch.
2010;106(5):1249–1252. doi: 10.1007/s00436-010-
1775-4.
4. Gs aun hale G. Al e na i es o he use o e al
bo ine se um: se um- ee cell cul u e. Al e na i es o
animal expe imen a ion. 2003;20(4):275–281.
5. Habibzadeh S, Do oud D, Tahe i T, Seyed N,
Ra a i S. Leishmania Pa asi e: he Impac o New Se-
um-F ee Medium as an Al e na i e o Fe al Bo ine
Se um. I an Biomed J. 2021;25(5):349–358. doi:
10.52547/ibj.25.5.349.
6. Kla S, Simpson L, Maslo DA, Kon hu Z.
Leishmania a en olae: Taxonomic classi ica ion and
i s applica ion as a p omising bio echnological exp es-
sion hos . PLoS neglec ed opical diseases.
2019;13(7):e0007424. doi: 10.1371/jou -
nal.pn d.0007424.
7. La anjei a-Sil a MF, Hamza I, Pé ez-Vic o ia
JM. I on and Heme Me abolism a he Leishmania–
Jou nal o science. Lyon №70/2025 7
Hos In e ace. T ends in Pa asi ology.
2020;36(3):279–289. doi: 10.1016/j.p .2019.12.010.
8. Me len T, Se eno D, B ajon N, Ros and F,
Lemes e JL. Leishmania spp: comple ely de ined me-
dium wi hou se um and mac omolecules (CDM/LP)
o he con inuous in i o cul i a ion o in ec i e p o-
mas igo e o ms. The Ame ican jou nal o opical
medicine and hygiene. 1999;60(1):41–50. doi:
10.4269/aj mh.1999.60.41.
9. Mesalam A, Lee KL, Khan I, Chowdhu y M,
Zhang S, Song SH, Joo MD, Lee JH, Jin JI, Kong IK.
A combina ion o bo ine se um albumin wi h insulin–
ans e in–sodium seleni e and/o epide mal g ow h
ac o as al e na i es o e al bo ine se um in cul u e
medium imp o es bo ine emb yo quali y and opho-
blas in asion by induc ion o ma ix me allop o ein-
ases. Rep oduc ion, e ili y and de elopmen .
2019;31(2):333–346. doi: 10.1071/RD18162.
10. Munia aj M, Lal C, Kuma S, Sinha P, Das P.
Milk o cow (Bos au us), bu alo (Bubalus bubalis),
and goa (Cap a hi cus): a be e al e na i e han e al
bo ine se um in media o p ima y isola ion, in i o
cul i a ion, and main enance o Leishmania dono ani
p omas igo es. Jou nal o clinical mic obiology.
2007;45(4):1353–1356. doi: 10.1128/JCM.01761-06.
11. Nayak A, Akpuna lie a S, Ba e M, Bu ch-
mo e R. A de ined medium o Leishmania cul u e al-
lows de ini ion o essen ial amino acids. Expe imen al
pa asi ology. 2018;185:39–52. doi:
10.1016/j.exppa a.2018.01.009.
12. Pi del L, Fa ajnia S. A non-pa hogenic ecom-
binan Leishmania exp essing Lipophosphoglycan 3
agains expe imen al in ec ion wi h Leishmania in an-
um. Scandina ian jou nal o immunology.
2017;86(1):15–22. doi: 10.1111/sji.12557.
13. San a em N, Cunha J, Sil es e R, Sil a C,
Mo ei a D, Ouelle e M, Co dei o-Da-Sil a A. The im-
pac o dis inc cul u e media in Leishmania in an um
biology and in ec i i y. Pa asi ology.
2014;141(2):192–205. doi:
10.1017/S0031182013001388.
14. Sha ie AH, Khalil EAG, Ome SA, Abdalla
HS. Inno a i e se um- ee medium o in i o cul i a-
ion o p omas igo e o ms o Leishmania species. Pa -
asi ology in e na ional. 2008;57(2):138–142. doi:
10.1016/j.pa in .2007.10.003.
15. Sidana A, Alam A, Fa ooq U. Soy p o ein iso-
la e: A subs i u e o e al bo ine se um o he in i o
cul i a ion o Leishmania dono ani. Legume esea ch-
an in e na ional jou nal. 2018;41(2):218–221.
16. S e e ding D. The his o y o leishmaniasis.
Pa asi es and ec o s. 2017;10(1):82. doi:
10.1186/s13071-017-2028-5.
17. Van de Valk J, Mello D, B ands R, Fische
R, G ube F, Gs aun hale G, Helleb eke s L, Hyllne
J, Jonke F, P ie o P, Baumans V. The humane collec-
ion o e al bo ine se um and possibili ies o se um-
ee cell and issue cul u e. Toxicology in i o.
2004;18(1):1–12. doi: 10.1016/j. i .2003.08.009.
18. WHO. Leishmaniasis. 2020.
h ps://www.who.in /news- oom/ ac -shee s/de-
ail/leishmaniasis.
