T abajo de Su iciencia in es igado a
(Sep iemb e 2003)
De e minación del con enido lipídico en
C yp hecodinium cohnii
po ci ome ía de lujo
Adelina de la Ja a Valido
Índice
Ab
· , . 1
eVla u as
y
ac o nmos
...................
..
...
..
..........................
...
...
......
...
...
.
..
..
..
..
..
.. .
1.
In oducción..............
...
...........................................................................
..
..... 2
2.
Ma e ial y
mé odos
......
..
..........
..
..
..
...
.
..
...
..
..................................................... 3
2.1. Cul i o celula
2.2. Análisis g a imé ico y c oma og á ico
2.3. Ci ome ía
de
lujo
2.4. Análisis
de
da os
3.
Resul ados...................................
..
..............................................
...
..
....
......
..
. 6
4. Discusión .............
..
....
..
...
..
..........................................
..
......
.
...
...................... 8
5.
Conclusión ...............
..
..........................................................................
..
....... 9
6. Bibliog a ia........................... ..... ..... ..........
..
...
..
.
.. ..
....... ...............
...
........... .... 10
Po ada:
células
de
C yp hecodinium cohnii
Ab e ia u as y ac ónimos
AGPCLs: ácidos g asos poliinsa u ados de cadena la ga
DHA: ácido docohexaenoico
RN
: ojo nilo
1.
In oducción
Los lípidos son nu ien es i ales pa a el c ecimien o celula ya que, además de cons i ui
•
la ese a ene gé ica de la célula (Demps e y Somme eld, 1998), son es uc u almen e
indispensables. Químicamen e son és e es de ácidos g asos. Una clase especial den o del
conjun o de ácidos g asos son los poliinsa u ados de cadena la ga (AGPCLs) (Salhi, 1994) que
encon amos undamen almen e en los os olípidos de las memb anas biológicas. Los p ecu so es
de es e g upo se denominan ácidos g asos esenciales, su u a de sín esis se encuen a únicamen e
en las células ege ales y el es o de los o ganismos nos emos obligados a inco po a los a a és
de la "die a e de". La g an impo ancia de es os compues os jun o a las ca encias de la
alimen ación ac ual conlle a la necesidad de usa complemen os die é icos (leches, man equillas,
pos es y bolle ía en iquecidos con
00-3)
ab icados a pa i de acei es ex aídos de o ganismos
p oduc o es.
Es impo an e que los o ganismos p oduc o es cons i uyan, de po si, una uen e de al o
endimien o. Si además se puede manipula el pe il a pa i de las condiciones de cul i o, es
posible en abiliza el p oduc o y aba a a su p ecio en el me cad
o.
Cie as mic o algas cumplen
es os eque imien o, su pe il lipídico
es
ealmen e in e esan e
y,
además, se puede modi ica
manipulando cie os pa áme os isico-químicos (luz, empe a u a y/o disponibilidad de
nu ien es) (Bo owi zka, 1988; Chel , 1990). El con ol de las dis in as condiciones de cul i o
sob e la calidad bioquímica del cul i o debe se pe iódica. Las écnicas que nos pe mi en lle a a
cabo es a a ea son muy di e sas: c oma og a ia, g a ime ía, y luo ime ía (Lee el al.,
1998).
De las écnicas enume adas, la
~
ime ía
es la más sencilla y ápida, es necesano,
solamen e,
~
ma cado luo escen e especí ico. Di e sos es udios sob e el ma cado
sol a oc ó nico Rojo nilo (NR; 9-die hyla nina-5H-benzo[a]phenoxazine-5-one) ma ca lípidos
celula es, luo esciendo exclusi amen e en ambien es hid o óbicos (G eenspan and Fowle , 1985;
G eenspan el a
l.
1985). Es e ma cado se ha usado p e iamen e en la cuan i icación
espec o luo omé ica de lípidos pola es y neu os (Alonzo and Mayzaud, 1999). La ci ome ía
de lujo es una écnica luo imé ica que pe mi e medi simul áneamen e au o luo escencia y
luo escencia de células indi iduales a medida que iajan en un
l
ujo lamina ( ig. 1).
2
El o ganismo seleccionado pa a es e es udio ue C yp hecodinium cohnii, un dino lagelado
he e o ó ico ma ino con un con enido lipídico mayo del 20% de su peso seco y cuyo con enido
en DHA ep esen a más del 30% de los ácidos g asos o ales (Ha ing on and Holz, 1968, Swaa
e al., 1999). El obje i o de es e es udio ue comp oba la idoneidad del ma cado
RN
combinado
con la ci ome ia de lujo pa a e alua de o ma ápida el con enido lipídico de cul i os de
C.
cohnii.
(4)
(3
) (2)
Unidades
a bi a ias
de
luo escencia
Figu a
1.
Esquema de un ci óme o de lujo. Las pa ículas (1)
VIajan
Inme sas
en un lujo lamina , cada ez que el láse (2) incide en una de ellas se p oduce
dispe sión de luz y emisión de luo escencia. Es os pa áme os isicos son de ec ados
po los o omul iplicado es (3) y aducidos a señales elec ónicas que podemos lee con
la ayuda de un so wa e especial (4, 5).
2.
Ma e iales y mé odos
2.1. Cul i o celula
C yp hecodinium cohnii (CCMP316) se cul i a on 500 mL de medio /2 + NPM (Guilla d
e
al.
, 1975) en iquecido con 5 g de glucosa
L-
1, usando e lenmeye s de bo osilica o de 1000 mL.
Los cul i os se man u ie on en oscu idad a 20 ±
2°C
con un suminis o de oxígeno median e
bu bujeo de ai e. El inóculo se ob u o de un s ock que se man iene median e subcul i o semanal.
3

•
•
Las condiciones ensayadas ue on:
Disponibilid
ad
de ni ógeno: se ob u o con un
/
2 + NPM comple o en iquecido con 5 g
de glucosa
L-
1
Sup esión de ni
óg
eno: se ob u o cosechando las células en
a
se es aciona ia median e-
cen i ugación (5000 g min, 5 minu os) y einoculando en medio sin N. El medio sin N se
ob u o eliminando comple amen e del medio las soluciones de ni ógeno (o gánica e
ino gánica
).
La densidad celula se con oló median e con aje dia io en
un
hemoci óme o y se exp esa
como celo
nL
-1• La asa de c ecimien o se calculó según C ow and Kimu a (1970) y se exp esa
como di isiones po día (di ' d-1
).
Las mues as pa a el análisis se oma on de cul i os en
di e en es ases de c ecimien o.
2.2. Análisis g a imé ico y c oma og á ico
A pa i de un concen ado celula congelado se lle ó a cabo una ex acción lipídica usando
pa a ello una modi icación del mé odo de Folch (1957). A una alícuo a del concen ado celula
(50-100¡. l) se le añadió un olumen de me anoVclo o o mo
(1
:2, / ), depués de eposa 5
mino
se cen i ugó du an e 2 min (5000 g min), el sob enadan e se ecogió en un ubo limpio y se
añadió 1
nL
de una solución de clo u o de sodio (0.9%, w/ ) po cada 5
nL
de ex ac o lipídico.
Es a mezcla se agi ó ue emen e y se dejó eposa du an e 5 minu os, al cabo de los cuales se
obse ó la o mación de dos ases, el sob enadan e se eliminó po se una ase acuosa ica en
componen es no lipídicos. La ase oleosa se denominó ex ac o lipídico y ue el ma e ial u ilizado
pa a de e mina el con enido lipídico o al, las acciones de lípidos pola es y neu os y el pe il
de ácidos g asos.
El con enido lipídico o al se ob u o deshid a ando el ex ac o lipídico (85°C,
15
min.)
median e pesada.
Las acciones lipídicas se ob u ie on a pa i del ex ac o lipídico median e un p o ocolo
modi icado de Yongmani chai and Wa d, 1992. P ime amen e se eluye on los lípidos neu os con
16
mL de clo o o mo a a és de ca uchos de sílica. Luego se ecupe a on los lípidos pola es
4
eluyendo con 10 mL de me anol. Las acciones ob enidas se deshid a a on (85°C,
15
min) Y se
de e mina on g a imé icamen e. Los esul ados se exp esan como pg lípidos' Ce l.
La composición de ácidos g asos se ob u o a pa i de bio
ma
sa congelada (una semana de
almacenamien o a -20°C). Pa a ello se anses e i ica on alícuo as de biomasa con clo u o de
me anol (Pe ko e al
.,
1994). Los ácidos g asos ob enidos se pu i ica on usando c oma og a ia
en capa ina. Se u ilizó ácido pen adecanoico como es ánda in e no. Los análisis de
c oma og a ia de gases se ealiza on en un c oma óg a o Va ian cp-38 con un de ec o FID. La
iden i icación de los me il és e es de ácidos g asos se lle ó a cabo compa ando los iempos de
e ención con los de es ánda es au én icos (Supelco F.A.M.
E.
Mix C4-C24
).
2.3. Ci ome ía
de
lujo
El ma cado in acelula se ealizó median e una modi icación del mé odo de Demps e y
So nme eld (1988). Se añadie on 50
~L
de una solución de a
ba
jo de
RN
en ace ona
(lmg
/
10
mL) a 1 mL de cul i o (105-106 ceVmL) y se incuba on en oscu idad (10 min., 37°C). La señal
de
RN
se de e minó usando un ci óme o de lujo F ACSCalibu (Ins umen os Bec on Dickinson)
equipado con
un
láse de a gón de 488 nm. Rojo nilo es un ma cado sol a oc ómico, cuya
luo escencia a ía espec almen e según la pola idad del medio en el que se encuen e. Al se
exci ado po una longi ud de onda de 488 nm,
RN
disuel o en lípidos neu os emi e luo escencia
ama illa-do ada in ensa, mien as que disuel o en lípidos pola es emi e luo escencia oja
(Shapi o, 1995). El sis ema óp ico usado en el sis ema F ASCSCalib
u
ecoge la luz ama illa y
na anja (560-640
nm
, que co esponde a los lípidos neu os) en el canal FL2 y la luz oja (>650
nm
co espondien e a lípidos pola es) en el canal FL3. Ap oximadamen e 3000 células ue on
analizadas median e una ampli icación loga í mica de la señal
l
uo escen e. Se u iliza on células
no ma cadas como con ol in e no. Los da os se exp esan en unidades a bi a ias de
luo escencia.
2.4. Análisis de da os
La signi icación es adís ica de los da os se e aluó median e un análisis de eg esión lineal
de e minando el coe icien e de co elación de Pea son (R). Las d
i
e encias signi ica i as en e las
dis in as condiciones de cul i o y el con enido o al de lípidos, el cocien e pola es/neu os, el
5
con enido DHA Y el po cen aje de DHA del o al de ácidos g asos se es ablecie on median e un
ANOV A. a=0.05, n = 14 excep o en el caso
de
la asa de c ecimien o en
el
que n =44.
3. Resul ados
La co elación ob enida en e la señal media de luo escencia de células ma cadas con RN
y el con enido lipídico de e minado g a imé icamen e
ue
al a (FL2 -neu os, R2= 0.93 Y FL3 -
pola es, R2= 0.83) ( ig.2). El cocien e ci omé ico FL3/FL2, po an o, ambién co elacionó con
el cocien e de e minado g a imé icamen e (R2= 0.96) ( ig.3).
4000 -3000 -
N
'l
.,.;¡
Y =
14.895x
-
863.29
.,.;¡
Y = 61,514x -689,36
~ ~
'"
3000 -RZ
=0.9336
'"
R2 = 0,8293
:o :o
Gol Gol
2000 -
e e
'"
2000 -
'"
.¡;¡ .¡;¡
e e
Gol
Gol
c.¡
c.¡
1000 -
'" '"
Gol
1000 -
Gol
lo
lo
<:) <:)
= =
¡i; • ¡i;
O O ,
O
100
200 300 O 20 40 60
Upidos neu os (pg/cel) Upidos pola es (pg/cel)
Figu a
2.
Los diag amas
de
dispe sión ep esen an lípldos pola es y neu os
Ys
.
FL3,
FL2 media espec i amen e. Los da os de lípidos se exp esan como pg/cel y los da os de
luo escencia como unidades a bi a ias. Las co elaciones lineales pa a ambos (lípidos
neu os (R2=0.93) y pola es (R2=0.83)) son signi ica i as.
La luo escencia de lípidos neu os y pola es co elacionó signi ica i amen e con el
con enido celula de DHA de e minado po c oma og a ia (FL2 -neu os, R2= 0.60;
FL3
-
pola es, R2= 0.71) ( ig.
4).
Se encon ó una co elación signi ica i a, aunque baja, en e el
cocien e FL3/FL2 y el po cen aje
de
DHA en el con enido o al de ácidos g asos
(R2=
0.44)
( ig.5). Exis e una endencia en e el cocien e FL3/FL2 y la asa
de
c ecimien o
(R2=
0.56) ( ig.6).
En
10
e e en e
al
e ec o de las condiciones
de
cul i o en la composición lipídica, las
mayo es can idades de lípidos y DHA, se ob u ie on en aquellos cul i os en los que se eliminó el
ni ógeno. Sin emba go,
el
mayo po cen aje
de
ácidos g asos o ales se encon a on en aquellos
6
S.O
4
.
_~
4.0
,...
J.S
~
.-
~
. -J.O
('1
-1
2.5
u..
..........
2.0
¡- .
-1
L.:...
1.5
1.0
0.5
0.0
0.0
0.2
0.4 O
.Ó
O.X
Pola /neu al
a iD
Figu a
3.
El diag ama de dispe sión ep esen a
el
cocien e
pola /neu os de e minados g a imé icamen e en e al
mismo cocien e hallado ci omé icamen e
(R
2=
0.9592)
2S00
2000
ISOO
1000
-
-
SOO
o o
,
.,:-
~
n.
71"¡-J
:.
-
___
•
•
•
su
•
• •
lOO
DHA
(pg'
cel
')
.
..,
-
•
ISO
Figu a 4. El diag ama de dispe sión ep esen a el
con enido de DHA en e a la luo escencia media en FL3
(R2= 0.7144)