Papel de los Recep o es LXR en la
Di e enciación y Especialización
de Mac ó agos
Papel de los Recep o es LXR en la Di e enciación y Especialización de Mac ó agos
TESIS DOCTORAL
José A. Guillén Salgado
2015
José A.
Guillén
Salgado
2015
Uni e sidad de Las Palmas de G an Cana ia
Consejo Supe io de In es igaciones Cien i icas
UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS
DE GRAN CANARIA
ULPGC
ULPGC
Los Mac ó agos son células agocí icas especializadas del
Sis ema Inna o. En la p esen e Tesis Doc o al, se es udia la
in luencia de los Recep o es Nuclea es LXR en el desa ollo de
las poblaciones de Mac ó agos de la Zona Ma ginal del bazo en
a ones. También se analiza la impo ancia de LXRa en la
pola ización de mac ó agos en espues a a las señales de
di e enciación iniciadas po M-CSF y GM-CSF en mac ó agos
mu inos. Así mismo, se desc iben los ac o es que in e ienen
en la egulación de CD209a, un gen ma cado de células
mieloides mononuclea es ac i adas.
UNIVERSIDAD*DE*LAS*PALMAS*DE*GRAN*CANARIA*
*
*
DEPARTAMENTO*DE*PATOLOGÍA*ANIMAL,*PRODUCCIÓN*ANIMAL,*
BROMATOLOGÍA*Y*TECNOLOGÍA*DE*LOS*ALIMENTOS*
*
DEPARTAMENTO*DE*CIENCIAS*CLÍNICAS*
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PROGRAMA*DE*DOCTORADO:*
CLÍNICA*E*INVESTIGACIÓN*TERAPÉUTICA*
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Memo ia*pa a*Ob ene *el*G ado*de*DOCTOR:*
!
"PAPEL!DE!LOS!RECEPTORES!LXR!EN!LA!DIFERENCIACIÓN!Y!
ESPECIALIZACIÓN!DE!MACRÓFAGOS"!
*
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p esen ada*po :*
*
José*Ángel*Guillén*Salgado*
Lic.*Bioquímica*
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Las*Palmas*de*G an*Cana ia,*a*15*de*Ab il*de*2015*
*
José*A.*Guillén*Salgado*
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Fdo.*Doc o ando*
D .*An onio*Cas illo*Vigue a*
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Fdo.*Di ec o *
D .*Félix*I.*López*Blanco*
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Fdo.*Codi ec o *
D .*Ge mán*Galla do*Campos*
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Fdo.*Codi ec o *
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El* T abajo* expe imen al* de* la* p esen e* memo ia* ue*
desa ollado* po * D.* José* A.* Guillén* Salgado* en* el* Depa amen o* de*
Bioquímica,*Biología*Molecula ,*Fisiología,*Gené ica*e*Inmunología*de*
la* Facul ad* de* Medicina* en* la* Uni e sidad* de* Las* Palmas* de* G an*
Cana ia*(ULPGC)*y*en*la*Unidad*Asociada*de*Biomedicina*del*Ins i u o*
de* In es igaciones* Biomédicas* "Albe o* Sols",* Agencia* Es a al* del*
Consejo*Supe io *de*In es igaciones*Cien í icos*(CSIC).*
*
*
Es e*T abajo*en*su*conjun o*ha*sido*desa ollado*g acias*a*las*
ayudas* siguien es:* Beca* de* Fo mación* de* P o eso ado* Uni e si a io*
(FPU)**BOE*2008*Julio 13026,**P oyec o*INNOVA*2010*de*la*Fundación*
Uni e si a ia*de*Las*Palmas*(FULP),*un*con a o*asociado*al*p oyec o*
S2010/BMD 2350*RAPHYME CAM,*y*la*ayuda*de*p oyec os*nacionales*
inanciados* po * el* MICINN* y* MINECO* SAF2008 00057* y* SAF2011
29244.*
UNIDAD*DE*BIOMEDICINA**
CSICNULPGC*
*
DEPARTAMENTO*DE*BIOQUÍMICA,*
BIOLOGÍA*MOLECULAR,**
FISIOLOGÍA,*GENÉTICA*E*
INMUNOLOGÍA*
*

A los que me quie en
Además de enseña , enseña a duda de lo que has enseñado
José O ega y Gasse
3.6.5 T ansducción de células de la médula ósea y asplan e. 58
3.7 Análisis de la Exp esión de ARN mensaje o. 59
3.7.1 Ex acción de ARN mensaje o. 59
3.7.2 Es udio de pe il ansc ipcional median e Mic oa ay. 59
3.7.3 Análisis de ARN mensaje o po RT-PCR. 60
3.7.4 Análisis de la inhibición de la exp esión génica
median e siRNA. 61
3.8 Análisis de la Exp esión de P o eínas. 62
3.8.1 P epa ación de ex ac os p o eicos. 62
3.8.2 Elec o o esis en geles de poliac ilamida (SDS-PAGE)
y Wes e n Blo . 62
3.8.3 Ci ome ía de Flujo. 62
3.9 Análisis "Chip-Seq". 64
3.9.1 O igen de los Chip-Seqs. 64
3.9.2 Análisis de los Chip-Seqs. 65
3.9.3 Búsqueda de secuencias de unión consenso. 65
3.10 His ología. 66
3.10.1 Ob ención y conse ación de la mues a. 66
3.10.2 Ob ención de c iosecciones. 66
3.10.3 Tinciones. 66
3.10.3.a Inmuno luo escencia. 66
3.10.3.b Inmunohis oquímica. 67
3.11 Análisis Es adís ico. 67
4 RESULTADOS 69
4.1 Es udio de las poblaciones de Mac ó agos del bazo. 71
4.2 Es udio de las señales de o mación de la Zona Ma ginal
del bazo. 71
4.3 Expe imen os de esca e de eno ipo de la Zona Ma ginal. 73
4.4 Modelo de depleción de las poblaciones de Mac ó agos po
clod ona o. 75
4.5 Gene ación de una cepa de a ones ca en es de LXRα en las

células hema opoyé icas (LXRα l/ l/Va -iC e+/-). 78
4.6 Es udio de la Zona Ma ginal en a ones ca en es de LXRα
en células hema opoyé icas (LXRα l/ l/Va -iC e+/-). 82
4.7 Recons i ución de la ac i idad de LXRα en p ogeni o es
hema opoyé icos median e Len i i us. 87
4.8 Es udio de la agoci osis de plaque as opsonizadas en la Zona
Ma ginal. 87
4.9 Es udio ansc ipcional en Mac ó agos en espues a a M-CSF
ó GM-CSF. 91
4.9.1 Exp esión génica en espues a a M-CSF. 92
4.9.2 Exp esión génica en espues a a GM-CSF. 96
4.10 La exp esión de CD209a es inducida, p incipalmen e,
po GM-CSF en a ones y po IL-4 en humanos. 100
4.11 La exp esión de CD209a es dependien e de LXRα en células
BMDM. 100
4.12 La ida media de LXRα es meno que la de LXRβ. 101
4.13 La exp esión de CD209a equie e de la exp esión de LXRα,
pe o es independien e de ac i ación a macológica. 104
4.14 El Lipopolisaca ido (LPS) inhibe la exp esión de
CD209a in i o. 104
4.15 La cap ación de Manosa y Fucosa no p esen a di e encias
signi ica i as en e células WT y LXRα-/-. 106
4.16 Es udio de la ía de señalización de GM-CSF. 108
4.17 Fac o es de T ansc ipción que in e ienen en la egulación
de la exp esión de CD209a. 111
4.18 Los Fac o es de T ansc ipción STAT5, PU.1, C/EBPα
y LXRα in e ienen en la egulación de CD209a. 115
5 DISCUSIÓN 119
6 CONCLUSIONES 133
REFERENCIAS 137
LISTA DE FIGURAS.
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!
Figu a'1.1.'O igen'on ogénico'p opues o'pa a'los'mac ó agos.'
Figu a'1.2.'Monoci os'sanguíneos'mu inos.'
Figu a'1.3.'Esquema'de'los'p incipales' ipos'de'Células'Dend í icas.'
Figu a' 1.4.' Modelo' ac ual' de' la' acción' de' las' ci oquinas' GMBCSF' y' MBCSF' sob e' el'
núme o'y' eno ipo'de'mac ó agos'y'células'dend í icas.''
Figu a'1.5.'Rep esen ación'esquemá ica'del' ecep o 'de'GMBCSF'(GMR)'humano'y'sus'
módulos'de'señalización.'
Figu a'1.6.'Localización'genómica'y'es uc u a'p o eica'de'CD209.'
Figu a'1.7.'Ul aes uc u a'del'bazo'mu ino.'
Figu a'1.8.'Modelo'po 'el'que'los' ac o es'de' ansc ipción'de e minan es'de'linaje'
modi ican' la' c oma ina' y' pe mi en' la' unión' de' ac o es' de' ansc ipción'
dependien es'de'señal.'
Figu a' 1.9.' Esquema' de' la' o ganización' en' dominios' de' un' ecep o ' nuclea ' y'
mecanismos''de'acción'de'he e odíme os'RXR.''
Figu a'1.10.'Rep esen ación'esquemá ica'de'la'es uc u a'de'LXR'y'la'simili ud'en e'
las'iso o mas'LXRα'y'LXRβ.''
Figu a'3.1.'La' ecombinasa'C e'induce'la'escisión'de'la' egión' lanqueada'con'si ios'
LoxP.''
Figu a'3.2.'Es a egia'de'c uce'pa a'la'ob ención'de' a ones'LXRα l/ l'iC e+/B.''
Figu a'3.3.''Rep esen ación'esquemá ica'del'p omo o 'sin é ico'mac ó agoBespecí ico''
SPB146'y'de'los'plásmidos'len i i ales.'
Figu a'4.1.'Las'poblaciones'de'mac ó agos'de'la'zona'ma ginal'del'bazo'dependen'de'
LXRα"pa a$su$desa ollo.'
Figu a'4.2.'La'exp esión'de'ci oquinas'implicadas'en'la' o mación'del'bazo'y'la'zona'
ma ginal'no'p esen a'di e encias'en e'WT'y'DKO.'**
Figu a' 4.3.' T asplan es' con' médula' ósea' de' a ones' que' exp esan' LXRα" pe mi en(
ecupe a 'las'poblaciones'de'mac ó agos)de)la)zona)ma ginal)del)bazo.'
Figu a'4.4.'La#ac i ación# a macológica#de#LXRα" acele a&la&ciné ica&de& epoblación&
de#las#poblaciones#de#mac ó agos#del#bazo.!*
Figu a'4.5.'Geno ipado*pa a*la*ob ención*de*las*cepas*de* a ones*LXRαBFlox%y%Va B
iC e.'
Figu a% 4.6.% Geno ipado% de% los% descendien es% del% c uce% de% a ones% LXRαBFlox% y% Va B
iC e.&'
Figu a'4.7.'Análisis'de'la'exp esión'de'LXRα'a'ni el'de'ARNm'en' a ios' ejidos.'
Figu a'4.8.'Análisis'de'la'exp esión'de'LXRα'a'ni el'de'p o eína'en' a ios' ejidos.'
Figu a!4.9.$La$escisión$de$LXRα!en#células#hema opoyé icas#de e mina#la#ausencia#de#
mac ó agos*de*zona*ma ginal*del*bazo.*
Figu a'4.10.'La' o mación'de'la'zona'ma ginal'demues a'haplosu iciencia'(I).'
Figu a'4.11.'La' o mación'de'la'zona'ma ginal'demues a'haplosu iciencia)(II).)'
Figu a'4.12.'Ra ones'LXRαB/B! asplan ados)con)HSCs) ans ec adas(con(Len iBSPBGFP$
mues an,*8*semanas*después,*en* o no*al*40%*de*monoci os*en*sang e*GFP*posi i os."*
Figu a' 4.13.' Recupe ación' pa cial' de' las' poblaciones' de' MMM' (CD169+)" y!MZM#
(MARCO+/TimB4+)"en" a ones" asplan ados"con"HSCs" a adas"con"len iBSPBLXRα.!*
Figu a'4.14.'Cap u a'de'plaque as'opsonizadas'en'la'Zona'Ma ginal.'
Figu a'4.15.'Diag ama'de'Venn'y'Mapa'de'Calo 'de'los'genes'up egulados!po $MBCSF$
en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.'
Figu a'4.16.'Diag ama'de'Venn'y'Mapa'de'Calo 'de'los'genes' ep imidos'po 'MBCSF$
en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.'
Figu a'4.17.'Diag ama'de'Venn!y"Mapa"de"Calo "de"los"genes"inducidos"po "GMBCSF$
en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.'
Figu a'4.18.'Diag ama'de'Venn'y'Mapa'de'Calo 'de'los'genes' ep imidos'po 'GMBCSF$
en#células#BMDM#WT#y#LXRαB/B!.'
Figu a'4.19.'La'exp esión'de'CD209a'en'células'BMDM'depende'de!GMBCSF$y$LXRα.'
Figu a'4.20.'LXRα"es#sensible#a#CHX,#lo#que#a ec a#a#la#exp esión#de#CD209a.'
Figu a'4.21.'La'exp esión'de'CD209a'en' espues a'a'GMBCSF'se' e'a ec ada'po 'un'
inhibido ' a macológico' de' LXR' (GW233)' y' po ' LPS,' pe o' no' po ' un' agonis a'
especi ico'de'LXR'(GW3965).'
Figu a' 4.22.' La' cap ación' de' Manosa' y' Fucosa' no' mues a' di e encias' en' células'
de i adas(de(la(médula(ósea%WT%y%LXRαB/B.'
Figu a' 4.23.' E ec o' de' la' inhibición' de' los' p incipales' in e media ios' de' la'
señalización+de+GMBCSF$sob e$la$exp esión$de$CD209a.'
Figu a'4.24.'La'exp esión'de'CD209a' equie e'de'la' os o ilación'de'Jak2/STAT5.'
Figu a'4.25.'Es udio'de'la"unión"de" ac o es"de" ansc ipción"al"gen"de"CD209a"(I).'
Figu a'4.26.'Es udio'de'la'unión'de' ac o es'de' ansc ipción'al'gen'de'CD209a'(II).'
Figu a'4.27.'El'silenciamien o'de'LXRα,"PU.1"C/EBPα!y"STAT5"median e"siRNA"inhibe"
la#exp esión#de#CD209a#inducida"po "GMBCSF.'
!

LISTA DE TABLAS.
______________________________________________________________
TABLA'1.1.'P incipales'poblaciones'de'mac ó agos.'
TABLA'3.1.'Cebado es.''
TABLA'3.2.'An icue pos.'
TABLA' 4.1.' El' análisis' on ogénico' e ela' que' el' a amien o' con' MBCSF' induce' la'
exp esión,'p incipalmen e,'de'genes'de'la'di isión'celula .**
TABLA' 4.2.' El' análisis' on ogénico' e ela' que' el' a amien o' con' GMBCSF' induce' la'
exp esión,''p incipalmen e,'de'genes'de'la' espues a'in lama o ia'y'la'quimio axis.**
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ABREVIATURAS.
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ABC Familia de T anspo ado es de Memb ana de unión a ATP ipo “Casse e”.
AF Dominio de Función Ac i ado a.
AP P o eína Ac i ado a.
Api6 Inhibido de la Apop osis en Mac ó agos.
Apo Apolipop o eína.
ADN Ácido Desoxi ibonucleico.
ADNc Ácido Desoxi ibonucleico Complemen a io.
APC Células P esen ado as de An ígenos.
ARN Ácido Ribonucleico.
ARNm Ácido Ribonucleico Mensaje o.
BMDC Células Dend í icas De i adas de Médula Ósea.
BMM Mac ó agos De i ados de Médula Ósea.
BSA Albúmina de Sue o Bo ino.
CCL Ligando de Quimioquinas C-C.
CD Clus e o Di e en ia ion.
cDC Células Dend í icas Con encionales.
CDP P ecu so Común de Células Dend í icas.
CETP P o eína T anspo ado a de És e es de Coles e ol.
ChIP Inmunop ecipi ación de C oma ina.
ChIP-Seq Secuenciación de la Inmunop ecipi ación de la C oma ina.
CLP P ogeni o Lin oide Común.
CLRs Recep o es de Lec ina ipo C.
CMP P ogeni o Mieloide Común.
COX Ciclooxigenasa.
CRD Dominio de Reconocimien o de Ca bohid a os.
CSF1 Fac o Es imulado de Colonias 1 (sinónimo de M-CSF).
CSF1R Recep o del Fac o Es imulado de Colonias 1.
CX3CR1 Recep o 1 de Quimioquina CX3.
Cyp7a1 Ci oc omo P450, amilia 7, sub amilia A, polipép ido 1.
DAMP Pa ones Molecula es Asociados a Daño.
DAPI 4,6-diamidino-2- enilindol diclo hid a o.
DBD Dominio de unión a ADN.
DC Célula Dend í ica.
DEPC Die il Pi oca bona o.
DKO Double Knock-Ou .
DMEM Dulbecco’s Modi ied Eagle's Medium.
DMSO Dime ilsul óxido.
DR Repe ición Di ec a.
ECL Enhanced Chemiluminescence.
EDTA E ilendiamino Te a-Ace a o Sódico.
ERK Ex acellula signal-Regula ed Kinase.
FAS Sin asa de Ácidos G asos.
FBS Sue o Fe al Bo ino.
FC Ci ome ía de Flujo.
FITC Iso iociana o de Fluo esceína.
FSC Tamaño ( o wa d sca e ).
GFP P o eína Ve de Fluo escen e.
GM-CSF Fac o Es imulado de Colonias de Mac ó agos y G anuloci os.
GO On ología Génica.
HDAC Deace ilasa de His ona.
HDL Lipop o eínas de Al a Densidad.
HRE Elemen o de Respues a Ho monal.
HSC Células Mad e Hema opoyé icas.
ICQ Inmunoci oquímica.
IF Inmuno luo escencia.
IL In e leuquina.
iNOS Sin asa de Óxido Ní ico Inducible.
IRF Fac o Regulado del In e e ón.
IVIG Inmunoglobulina In a enosa.
JNK c-Jun N- e minal Kinase.
KO Knock-Ou .
LBD Dominio de unión a ligando.
LC Células de Lange hans.
LDTF Fac o es de T ansc ipción de e minan es de Linaje.
LDL Lipop o eínas de baja densidad.
LFA-1 An ígeno asociado a la unción de Lin oci os 1.
LP Lámina P opia.
LPL Lipop o eína Lipasa.
LPS Lipopolisacá ido Bac e iano.
LXR Recep o es X Hepá icos.
LXRE Elemen o de Respues a a LXR.
MAPK P o eína Kinasa Ac i ada po Mi ógenos.
M-CSF Fac o Es imulado de Colonias de Mac ó agos.
MCP P o eína Quimioa ayen e de Monoci os.
MDP P ogeni o de Mac ó agos y Células Dend í icas.
MDSC Células Sup eso as de o igen Mieloide.
MHC Complejo Mayo de His ocompa ibilidad.
MMM Mac ó agos Me alo ílicos de la Zona Ma ginal.
MMP Me alopep idasa de Ma iz.
NAD Nico inamida Adenina Dinucleó ido.
MZ Zona Ma ginal del Bazo.
MZM Mac ó agos de la Zona Ma ginal.
N-CoR P o eína co- ep eso a de Recep o es Nuclea es.
NF-kB Fac o Nuclea kappa de Células B.
NK Na u al Kille .
o/n Toda la noche.
PAMP Pa ones Molecula es Asociados a Pa ógenos.
PBS Tampón Fos a o Salino.
PI3K Fos a idilinosi ol 3 kinasa.
PLTP P o eína T anspo ado a de Fos olípidos.
ROS Especies de Oxígeno Reac i o.
PPAR Recep o es Ac i ados po P oli e ado es Pe oxisomales.
PRR Recep o de Reconocimien o de Pa ones.
RPMI Medio de cul i o celula desa ollado en Roswell Pa k Memo ial Ins i u e.
RT Room Tempe a u e - empe a u a ambien e (~20ºC).
RT-qPCR Re o ansc ipción y Reacción en Cadena de la Polime asa a Tiempo Real.
RXR Recep o es X de Re inoico.
1.!In oducción!
!
5
Los monoci os se han conside ado, de mane a clásica, eslabones in e medios
en e células HSC y o as células madu as, que se o iginan en la médula ósea y que as
desplaza se po la sang e dan luga a mac ó agos isula es ( an Fu h and Cohn, 1968) y a
células dend í icas (Randolph e al., 1999; Sallus o and Lanza ecchia, 1994),
p obablemen e pasando po un es adio in e medio denominado p ogeni o de mac ó agos
y células dend í icas (MDP, Mac ophage and Dend i ic cell P ogeni o ) (Fogg e al., 2006).
Sin emba go, ecien emen e, es udios gené icos y de mapeo de des ino celula
sugie en que, en ealidad, la mayo ía de poblaciones de mac ó agos y monoci os
ep esen an líneas agocí icas di e en es (Hashimo o e al., 2013; Schulz e al., 2012;
Yona e al., 2013). Mien as que los monoci os ci culan es de i an de HSC y p ogeni o es
in e media ios que ocupan nichos especializados en la médula ósea (Me cie e al., 2012),
muchas de las poblaciones de mac ó agos isula es esiden es, incluyendo las del pulmón,
hígado, ce eb o, pe i oneo, médula ósea y algunas especí icas del bazo se es ablecen an es
del nacimien o a pa i del saco i elino (Schulz e al., 2012) o p ecu so es de hígado e al
(Guilliams e al., 2013). Es os mac ó agos son independien es del ac o de ansc ipción
c-Myb y, po an o, apa ecen en el desa ollo emb iona io de a ones c-Myb-/- que
ca ecen de HSC y, po an o, de monoci os. Feno ípicamen e, las poblaciones de
mac ó agos que p oceden del saco i elino se dis inguen po se F4/80high, mien as que
las poblaciones que p oceden de HSCs son F4/80low (Schulz e al., 2012).
Pa a es udia si los mac ó agos F4/80high p oceden es del saco i elino se
man ienen du an e la edad adul a o se enue an a pa i de HSCs, el g upo de Geissmann
eliminó las HSCs median e la deleción condicional de c-Myb en adul os y asplan ó
médula ósea c-Myb+/+ pa a es ablece una quime a. T as 3 meses, odos los monoci os
F4/80low CD11bhigh p ocedían de la médula ósea donan e, mien as que los mac ó agos
F4/80high en el hígado (células de Kup e ), piel (células de Lange hans) y ce eb o
(mic oglía), y ambién sub ipos del pulmón, iñón, pánc eas y bazo, e an del ecep o
(Schulz e al., 2012). És e, y o os expe imen os, apoyan la idea de que exis en dos linajes
de mac ó agos en el a ón: uno que p ocede del saco i elino y da luga a los mac ó agos
F4/80high que se suelen asocia con es uc u as epi eliales y o o que p ocede de la médula
ósea y da luga a mac ó agos F4/80low CD11bhigh y células dend í icas. Po ello, el g upo
de Geissmann p opone es ingi el uso del é mino "mac ó ago" a aquellas poblaciones
de mac ó agos esiden es con desa ollo c-Myb independien e (mac ó agos F4/80high), y
usa el é mino de "células mieloides" a los mac ó agos c-Myb dependien es (F4/80low
CD11bhigh). En es a Tesis doc o al, sin emba go, no adop a emos aún es a nomencla u a
y usa emos el é mino mac ó ago en su acepción clásica más amplia.
Es a nue a hipó esis debe aún esol e , sin emba go, cómo se man ienen y
enue an (si lo hacen) es as poblaciones de mac ó agos independien es de la médula ósea.
Es de des aca que du an e mucho iempo se ha conside ado a los mac ó agos como
células sin capacidad de di idi se, que se eno aban a pa i de los monoci os ci culan es
( an Fu h and Cohn, 1968). Teniendo en cuen a que los mac ó agos isula es ienen un
o igen independien e del monoci o (Schulz e al., 2012), es necesa io conoce cómo es el
man enimien o y eno ación de es as poblaciones a lo la go de la ida del indi iduo.

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6
Figu a'1.1.'O igen'on ogénico'p opues o'pa a'los'mac ó agos.'
Según!in es igaciones! ecien es,!las!poblaciones!de!mac ó agos! ienen!dos!o ígenes!di e en es:!un!o igen!
emb iona io! que! da ía! luga ! a! las! poblaciones! de! mac ó agos! esiden es! (F4/80high)! y! un! o igen!
hema opoyé ico!en!la!médula!ósea!adul a!que!da ía!luga !a!las!poblaciones!de!mac ó agos!de i ados!de!
monoci os!(F4/80low),! al!y!como!se!de alla!en!el! ex o.!En!lesiones!mode adas,!en!las!que!hay!una!cie a!
pé dida!de!mac ó agos! esiden es!y!no!se!p oduce! eclu amien o!de!monoci os!sanguíneos,!la! epoblación!
ocu e! a! pa i ! de! la! población! inicial! de! mac ó agos! esiden es.! Los! mac ó agos! esiden es! pueden!
egene a se!localmen e!( lecha!ci cula ),!po !ejemplo,!du an e!una!in ección!po !nemá odos!en!la!ca idad!
pleu al!o!en!casos!de!in lamación!del!sis ema!ne ioso.!En!el!caso!de!la!placa!a e oscle ó ica,!se!p oduce!la!
p oli e ación! de! mac ó agos! locales! y! mac ó agos! de i ados! de! monoci os,! los! cuales! p oli e an!
localmen e!y!dan!luga !a!un!mosaico!de!mac ó agos!o!"mac ophage*chimae a",!consis en e!en!una!mezcla!
de!mac ó agos!de!o igen!emb iona io!y!adul o.!Es e!p oceso! ambién!ocu e!en! un!modelo!mu ino!de!
in ección! de! piel! po ! el! i us! de! he pes! simplex! (HSV).! Sin! emba go,! aún! no! se! sabe! si! es e! mosaico!
pe manece!en!el! iempo!o!es!un!añadido! empo al!a!la!población!local.!En!el!caso!de!lesiones!se e as!que!
impliquen!la!pé dida!de!la!población!de!mac ó agos! esiden es!(aspa! oja),!la! epoblación! iene!luga !a!
pa i ! de! monoci os! sanguíneos,! como! po ! ejemplo! en! el! caso! de! sob eexposición! de! la! piel! a! la! luz!
ul a iole a.! HSC! =! Hema opoie ic* S em* Cell,! MDP! =! Myeloid* De i ed* P ogeni o .! Elabo ado! a! pa i ! de!
Ginhoux!and!Jung,!2014!y!de!Neumann!and!Weke le,!2013.!
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"56:@B?789(
"56:@B?789(
1.!In oducción!
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7
Va ios g upos de in es igación han encon ado e idencias que pod ían explica
es e aspec o de la biología del mac ó ago. Según es os au o es, el mac ó ago iene cie a
capacidad de p oli e a y au o eno a se, an o en condiciones basales (Hashimo o e al.,
2013) como an e es ímulos conc e os, como in ecciones helmín icas (Jenkins e al., 2011;
Robbins e al., 2013) a lo la go de la ida del indi iduo. Un esquema del o igen y
man enimien o de las poblaciones de mac ó agos se ep esen a en la Figu a 1.1.
1.4.1 Monoci os.
Los monoci os son células mieloides que se encuen an de mane a abundan e
en la sang e, médula ósea y bazo, y que no p oli e an en condiciones basales (Swi ski e
al., 2009). Se o iginan dependien es del ac o CSF1 y su ecep o CSF1R, ambién
denominado CD115 (aunque es o se ha pues o en duda, éase Ginhoux e al., 2010) a
pa i de p ecu so es hema opoyé icos, y es án equipados con ecep o es de ci oquinas y
de econocimien o de pa ógenos que median su quimio axis y ex a asación desde la
sang e a los ejidos du an e una in ección. Cons i uyen al ededo de un 10 % de los
leucoci os de la sang e en humanos, y un 4 % en a ones (Au ay e al., 2009).
Exis en dos sub ipos uncionales de monoci os ( e Figu a 1.2), unos
denominados "in lama o ios", ca ac e izados po los ma cado es CD115+ Ly-6Chigh, y
o os denominados "pa olling", que se dis inguen po los ma cado es CD115+ Ly-6Clow
(Au ay e al., 2009).
Los monoci os Ly-6Chigh son los más nume osos. Exp esan ecep o de
quimioquinas CCR2, la molécula de adhesión L-selec in (CD62L) y bajos ni eles del
ecep o de quimioquinas CX3CR1 (Au ay e al., 2009). En humanos, su equi alen e
son los monoci os CD14+. Acuden selec i amen e a los ejidos in lamados y nódulos
in lamados in i o y p oducen una espues a de ipo M1 con al os ni eles de TNF-α e
IL-1, po lo que se denomina on "in lama o ios" (Au ay e al., 2009). Dan luga a
mac ó agos y DCs en a ios modelos de in ección.
Po ejemplo, en el caso de in ección po Lis e ia monocy ogenes, los monoci os
Ly-6Chigh dan luga a un ipo de DCs denominado Tip-DCs (TNFα/iNOS-p oducing
DCs) que p oducen mediado es in lama o ios como TNFα, óxido ní ico y ROS (Na ni-
Mancinelli e al., 2007). En el caso de in ección con Toxoplasma gondii, los monoci os Ly-
6Chigh se di e encian a mac ó agos de mucosa que a di e encia de las Tip-DCs son
CD11c- (Dunay e al., 2008). En el con ex o de un umo , po o o lado, los monoci os
Ly-6Chigh o man pa e de la población de las células sup eso as de ipo mieloide
(MDSC, Myeloid-De i ed Supp esso Cells), que in e iene en el desa ollo de ane gia de
las células T hacia el umo . En pa icula , las MDSC impiden las espues as an ígeno-
especí icas de las células T CD8+ median e un mecanismo molecula que in oluc a la
p oducción de NO y ROS (Au ay e al., 2009; B on e e al., 2000, 1999; Gallina e al.,
2006; Rössne e al., 2005). La inhibición de la señalización CCL2-CCR2 bloquea el
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8
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Figu a'1.2.'Monoci os'sanguíneos'mu inos.'
Panel!A.!Se!mues a!un!monoci o!sanguíneo!Ly_6Chigh!que!p esen a!mayo ! amaño!(FSC)!y!complejidad!
(SSC),!que!los!monoci os!Ly_6C!low.!
Panel!B.!Se!mues an!monoci os!sanguíneos!Ly_6Clow.!
Ob enido!de!Swi ski!e !al.,!2009.!
A.!
B.
!
!
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FSC:!118.8!±!3.0!!
SSC:!51.4!±!2.3!
!
!
FSC:!133.2!±!4.4!!
SSC:!64.3!±!4.7!
1.!In oducción!
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9
eclu amien o de monoci os in lama o ios, p olongando la ida de a ones con umo
(Qian e al., 2011).
Los monoci os Ly-6Clow son menos nume osos. Se ca ac e izan po ene
meno amaño, exp esa el ecep o de quimioquinas CX3CR1, LFA-1 y CD43, y ca ece
de exp esión de CCR2 y L-selec ina (Geissmann e al., 2003). También se denominan
esiden es po que ienen una ida media más la ga in i o y se localizan an o en ejido
no mal como in lamado. Median e expe imen os de mic oscopía in a i al, se descub ió
que los monoci os Ly-6Clow pa ullan los asos sanguíneos, odando po el endo elio
g acias a la in eg ina LFA-1 y al ecep o de quimioquinas CX3CR1 (Au ay e al.,
2007). Es o pod ía ene el obje i o de igila posibles pa ógenos y agoci a células
mue as y lípidos oxidados (Au ay e al., 2007).
En el caso de una in ección po Lis e ia monocy ogenes, los monoci os Ly-6Clow
se ex a asan ápidamen e y empiezan a p oduci TNF-α a las 2 ho as de la in ección.
T as 8 ho as, sin emba go, los mayo es p oduc o es de TNF-α son los monoci os Ly-
6Chigh. Pos e io men e, los monoci os Ly-6Clow empiezan un p og ama de ac i ación
al e na i a con ma cado es de ipo M2 como A ginasa, Mgl2 e IL-4Rα (Au ay e al.,
2007). Es e ipo de espues a se elaciona con el emodelado isula , la epa ación de
he idas y la inmunomodulación (Alla ena e al., 2008). Po o o lado, as un in a o de
mioca dio, los monoci os Ly-6Clow exp esan ac o de c ecimien o ascula -endo elial
(VEGF, ascula -endo helial g ow h ac o ). En es e con ex o, se piensa que in e ienen en
la ecupe ación del ejido p omo iendo la a acción de mio ib oblas os, la angiogénesis y
la deposición de colágeno (Nah endo e al., 2007). Sin emba go, su ol en la
angiogénesis aún necesi a un es udio más p o undo (Geissmann e al., 2010).
Po an o, los monoci os son células de una g an plas icidad, capaces de
esponde a dis in as señales y da luga a o mas más especializadas, lo que en úl imo
é mino pe mi e una espues a más e icien e a la inmensa di e sidad de e os
inmunológicos posibles.
1.4.2 Células Dend í icas.
Las células dend í icas se o iginan a pa i de p ecu so es de la médula ósea, si
bien no exis e consenso si p oceden de uno o a ios de ellos, ales como MDP
(Monocy e/mac ophage and D endi ic cell P ecu so ), CDP (Common Dend i ic Cell P ecu so )
o monoci os (Au ay e al., 2009; Va ol e al., 2007).
Las células dend í icas se suelen di idi en es g upos: células de Lange hans
(LC), DCs con encionales CD11chigh (cDC, con en ional DC) y DCs plasmaci oides
(pDC, plamacy oid DC) (Sho man and Liu, 2002). A es os g upos se les añaden o os
de inidos más ecien emen e, como las Tip-DCs (Na ni-Mancinelli e al., 2007) o las
DCs de i adas de monoci os (MO-DCs, MOnocy e-de i ed Dend i ic Cell) (Cheong e
al., 2010) ( e Figu a 1.3).
!
10
Figu a'1.3.'Esquema'de'los'p incipales' ipos'de'Células'Dend í icas.'
En!la!médula!ósea,!el!p ecu so !MDP!da!luga !al!p ecu so !CDP!y!a!monoci os.!CDP!da!luga !a!p e_cDC!y!
pDC!en!sang e,!que!se!desplazan!a!los! ejidos!lin oides!pa a!da !luga !a!cDCs!y!pDCs!.!El!monoci o!po !su!
pa e!da!luga !a!MO_DCs!y!TIP_DCs.!Su!papel!como!p ecu so !de!células!de!Lange hans!es á!cada! ez!más!
discu ido! ( e ! ex o).! MDP! (monocy e/mac ophages* and* DC* p ecu so ),! CDP! (Common* Dend i ic* Cell*
P ecu so ),! p e_cDC! (p ecu so ! de! Células! Dend í icas! Con encionales),! pDC! (Células! Dend í icas!
Plasmaci oides),! MO_DC! (Células! Dend í icas! de i adas! de! Monoci os),! TIP_DC! (TNF/iNOS?P oducing*
Dend i ic*Cells).!Modi icado!a!pa i !de!Geissmann!e !al.,!2010.!
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1.!In oducción!
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11
Los dis in os ipos se dis inguen po su localización y po sus ma cado es de
supe icie. Po ejemplo, en el bazo de a ón los sub ipos que podemos encon a son pDC
(B220+ CD11cin GR1−), MO-DC (B220− CD11cin GR1±), y cDC (B220− CD11chigh
GR1−). Las cDC se suelen di idi en CD8α+ (CD11chigh, B220−, DEC205+, CD24high,
CD11b−) y CD8α− (CD11chigh, B220−, DEC205−, CD24low, CD11b+,CD172+,CD4±)
(Fue es Ma aco e al., 2012).
Las LC se encuen an en la epide mis y se han clasi icado adicionalmen e
como células dend í icas. Sin emba go, dependen de IL-34 y CSF1R du an e su
desa ollo (G e e e al., 2012b; Wang e al., 2012), no ienen un o igen monocí ico
(Va ol e al., 2007) sino emb iona io (Hoe el e al., 2012) y su p og ama ansc ipcional
(Sa pa hy e al., 2012) pa ece si ua las más den o del linaje de los mac ó agos esiden es,
po lo que su clasi icación como dend í icas esponde más a mo i os his ó icos que
uncionales. Sin emba go, su clasi icación como mac ó agos ampoco pa ece cla a, ya que
p esen an capacidad mig a o ia, y as mig a , adquie en la exp esión de ma cado es
ípicos de cDCs como Fl 3, CCR7 y Zb b46 (Mille e al., 2012).
Las cDCs ue on desc i as o iginalmen e po R. S einman y A. Cohn
(S einman and Cohn, 1973). Pueden se de dos ipos: mig a o ias o esiden es. Las cDC
mig a o ias cap u an pa ógenos en el si io de in ección y ápidamen e se desplazan al
nódulo lin á ico más ce cano pa a la p esen ación del an ígeno. También son impo an es
en la egulación de la ole ancia a lo p opio (Idoyaga e al., 2013). Según los ma cado es
de supe icie, las cDC mig a o ias son CD4-CD8- y se subdi iden en CD11b+, CD11b-
CD103- y CD103+ (Idoyaga e al., 2013). Las cDC esiden es ac úan más bien como
cen inelas en ó ganos lin oides secunda ios y o os ejidos pa a la cap u a y p esen ación
del an ígeno in si u (Fue es Ma aco e al., 2012). Según los ma cado es de supe icie, las
cDCs esiden es, a su ez, se subdi iden en dos (CD8-, CD8+) (Idoyaga e al., 2013;
Sho man and Hea h, 2010) o es subg upos (CD4+CD8-, CD4-CD8- y CD4- CD8+)
(V emec e al., 2000).
Las pDCs ep esen an un linaje independien e según su mo ología, exp esión
génica y habilidad pa a sec e a g andes can idades de in e e ón ipo I en espues a a
i us (Robbins e al., 2008; Siegal e al., 1999). A di e encia de las cDCs, son ine icien es
en la cap u a y p esen ación de an ígenos. Además, en con as e a la apa iencia
"dend í ica" de las cDCs, las pDCs exhiben una o ma es é ica ca ac e ís ica simila a
células plasmá icas. Según sus ma cado es de supe icie, las pDCs se dis inguen de cDCs
po la exp esión de B220, Siglec-H y Bs 2 en a ón, y BDCA2 (CD303) en humanos
(Sa pa hy e al., 2012).
Las células dend í icas de i adas de Monoci os, Mo-DCs, se descub ie on po
p ime a ez en 1994 (Sallus o and Lanza ecchia, 1994), y su ele ancia como DCs in i o
ha sido cues ionada po dis in os in es igado es desde en onces. El g upo de R. S einman,
sin emba go, las de ine como au én icas células dend í icas po a ias azones. P ime o, en
é minos de mo ilidad, son células no adhe en es que con inuamen e o man y e aen
!
12
ex ensiones, de mane a idén ica a como lo hacen las células dend í icas en las á eas T de
los nódulos lin á icos (Lindquis e al., 2004). Además, se concen an en las á eas T, una
ca ac e ís ica de las DCs clásicas, y es a localización acili a la selección clonal de células T
an ígeno-especí icas del a senal ci culan e. Feno ípicamen e, son muy simila es a las DCs
de los ejidos lin oides, incluyendo la pé dida de ma cado es que se han usado
p e iamen e pa a de ini monoci os in lama o ios in i o, ales como Ly6C, G -1 y
CD115. Finalmen e, cuando se compa a la uncionalidad de MO-DCs y cDCs de un
mismo ganglio lin á ico, las MO-DCs son incluso supe io es en la p esen ación de
an ígenos an o in i o como in i o (Cheong e al., 2010).
1.4.3 Mac ó agos.
Los mac ó agos son agoci os p o esionales esiden es en ejidos que p esen an
muy poca capacidad de mig a , y que son, en gene al, mucho menos e icien es que las
células dend í icas en la p esen ación del an ígeno. En con aposición, poseen una al a
ac i idad ca abólica y p o eolí ica, que les pe mi e inge i y deg ada pa ógenos, obje os
ex años, células mue as y deb is celula es (Mu ay and Wynn, 2011).
Exis e una g an di e sidad de ipos de mac ó agos, con di e sas unciones ales
como emodelado óseo, emodelación del ejido y mo ogénesis, ep oducción,
angiogénesis, eciclado del hie o y, po supues o, unción inmuni a ia (Ve Tabla 1.1).
En condiciones basales, los mac ó agos p esen an ac i idad inmuni a ia an i-
in lama o ia que con ibuye a la homeos asis isula , en pa e po la p oducción de IL-10
(Denning e al., 2007). En condiciones in lama o ias, los mac ó agos se pueden ac i a de
mane a "clásica" y pa icipa en la espues a p oin lama o ia hacia los pa ógenos. Así, el
IFNγ p oducido po células Th1, T ci o óxicas CD8+ y células NK con ie e a los
mac ó agos en células con ele ada capacidad ci o óxica, mic obicida y an i-p oli e a i a.
Es a ac i ación clásica, llamada ambién pola ización M1, se ca ac e iza po la sec eción
de ele ados ni eles de IL-12 e IL-23 y bajos ni eles de IL-10 en espues a a in ecciones
como las causadas po el géne o Mycobac e ium sp. (Ma inez e al., 2009).
Po o o lado, en espues a a las ci oquinas Th2 IL-4 e IL-13, los mac ó agos
se pueden ac i a de mane a "al e na i a", ambién llamada pola ización M2. En es as
condiciones, p oducen g andes can idades de IL-10 y TGFβ y bajos ni eles de IL-12. La
espues a Th2 se ca ac e iza po eosino ilia, baso ilia, mas oci osis, cambio de clase en las
células B y p oducción de an icue pos IgE e IgG1. Es a espues a es esencial en el con ol
de pa ási os ex acelula es. En es e con ex o, la ac i ación al e na i a de los mac ó agos
disminuye su capacidad de p oduci óxido ní ico (NO, Ni ic Oxide) y su ac i idad clásica
en e a i us y bac e ias pe o induce la exp esión de mediado es de emodelado isula
(Ma inez e al., 2009).
1.!In oducción!
!
13
TABLA'1.1.'P incipales'poblaciones'de'mac ó agos.''
Simpli icación!de!las!p incipales!poblaciones!de!mac ó agos.!El!símbolo!"_"!indica!la! al a!de!nomb e!
especí ico.!Elabo ada!a!pa i !de!Polla d,!2009!y!Da ies!e !al.,!2013.!
Tejido
Nomb e especí ico
Función p incipal
Hueso
Os eoclas o
Remodelado del hueso. P o ee un
nicho a las células mad e.
Mac ó ago de la médula ósea
E i opoiesis.
Ce eb o
Célula mic oglial
Conec i idad y supe i encia
neu onal, epa ación as lesión.
Piel
Célula de Lange hans
Vigilancia inmuni a ia.
Mac ó agos dé micos
Vigilancia inmuni a ia.
Ojo
-
Remodelado ascula .
In es ino
Mac ó ago c íp ico
Vigilancia inmuni a ia.
Bazo
Mac ó ago de la pulpa oja
Reciclado del hie o, agoci osis de
e i oci os iejos.
Mac ó agos me alo ílicos de la
zona ma ginal (MMM)
Vigilancia inmuni a ia.
Mac ó agos de la zona
ma ginal (MZM)
Vigilancia inmuni a ia.
Mac ó agos de la pulpa blanca
Eliminación de células apop ó icas
del cen o ge minal.
Riñón
-
Desa ollo de conduc os.
Hígado
Células de Kup e
Eliminación de deb is sanguíneos,
epa ación del ejido hepá ico as
lesión.
Glándula Mama ia
-
Desa ollo de conduc os y
mo ogénesis de las ami icaciones.
O a io
-
P oducción de ho mona es e oidea
y o ulación.
Pánc eas
-
Desa ollo de las islas.
Tes ículos
-
P oducción de ho mona es e oidea.
Ú e o
DC u e ina
Angiogénesis y decidualización.
Mac ó ago u e ino
Madu ación ce ical.
Tejidos Se osos
Mac ó agos pe i oneales
Vigilancia inmuni a ia.
Mac ó agos pleu ales
Vigilancia inmuni a ia.
Pulmón
Mac ó agos al eola es
Vigilancia inmuni a ia y eciclado
del su ac an e.
Mac ó agos in e s iciales
Regulación de la madu ación y
ac i ación de DCs.
Tejido Adiposo
Mac ó agos asociados a Tejido
Adiposo
Con ol de la sensibilidad a insulina
y e mogénesis.
!
14
1.4.3.a Regulación de la pola ización del mac ó ago po ci oquinas.
Las ci oquinas son pequeñas p o eínas que ac úan modulando la ac i idad,
exp esión génica y pola ización de células diana. Dos ci oquinas impo an es pa a
con ola el núme o y la unción de poblaciones de mac ó agos, an o en el es adio
es aciona io como en condiciones in lama o ias, son las ci oquinas "Fac o es imulado de
colonias de mac ó agos y g anuloci os" (GM-CSF, G anulocy e-Monocy e Colony-
S imula ing Fac o , ambién llamada CSF2) y "Fac o es imulado de colonias de
mac ó agos" (M-CSF, Mac ophage Colony-S imula ing Fac o , ambién llamado CSF1).
Es udios en a ones denominados Cs 1op/op, que poseen una mu ación ecesi a
en el gen del M-CSF, mues an que es a ci oquina es esencial en el desa ollo de
de e minadas poblaciones de mac ó agos, ales como os eoclas os, mac ó agos
pe i oneales, mac ó agos me alo ílicos de la zona ma ginal del bazo y mac ó agos del seno
subcapsula de nódulos lin á icos (Wik o -Jed zejczak e al., 1982; Wi me -Pack e al.,
1993). O as poblaciones, como células de Kup e , mic oglía o mac ó agos al eola es,
apa ecen educidas, mien as que o as ienen un desa ollo apa en emen e no mal, como
los mac ó agos de la lámina p opia in es inal (Wi me -Pack e al., 1993). El es udio de
a ones KO pa a el ecep o de M-CSF, CSF1R-/-, indica que CSF1R ( ambién conocido
como CD115) es esencial pa a la p oducción de mac ó agos de i ados del saco i elino y
mic oglía (Ginhoux e al., 2010). Hay que ene en cuen a que las poblaciones de
mac ó agos a ec adas en a ones CSF1-/- y en a ones CSF1R-/- no ienen po qué se
exac amen e coinciden es, ya que al ecep o CSF1R se pueden uni o os ligandos
di e en es a M-CSF, como IL-34 (Ginhoux e al., 2010; Wang e al., 2012).
CSF1R se usa habi ualmen e como ma cado de monoci os, y se c ee que los
monoci os ienen un desa ollo CSF1R dependien e (Au ay e al., 2009; Dai e al.,
2002). So p enden emen e, es udios ecien es han desc i o la posibilidad del desa ollo de
monoci os de mane a independien e a CSF1R (Ginhoux e al., 2010). Aunque ambos
g upos usan a ones CSF1R-/-, la explicación a es a apa en e con adicción pod ía se
debida a que el g upo de Dai y colabo ado es mide los ni eles de monoci os en adul os (6-
8 semanas), mien as que el g upo de Ginhoux y colabo ado es mide los ni eles de
monoci os du an e el desa ollo emb iona io. Además, Dai y colabo ado es iden i ican a
los monoci os según su pa ón de dispe sión de la luz (FSC-SSC) (Dai e al., 2002)
mien as que Ginhoux y colabo ado es usan los ma cado es CD45+CD11b+F4/80+
(Ginhoux e al., 2010).
En el mismo sen ido, se pensaba que CSF1 e a esencial pa a el desa ollo de los
monoci os (Wik o -Jed zejczak e al., 1982), aunque pa ece que el núme o de monoci os
en a ones adul os Cs 1op/op es no mal (Chi u and S anley, 2006; Dai e al., 2004), lo que
pod ía explica se po la écnica usada a la ho a de medi los monoci os. En un caso se
mide en un o is sanguíneo con inción de W igh (Wik o -Jed zejczak e al., 1982),
mien as que en o o se ealizó po ci ome ía de lujo con ma cado es Mac1+/G -1- (Dai
e al., 2004). O o es udio indica que el núme o de monoci os F4/80low de la médula ósea
1.!In oducción!
!
21
Figu a'1.6.'Localización'genómica'y'es uc u a'p o eica'de'CD209.'
Panel! A.!Localización!del!gen! CD209! en!el!c omosoma!19!del!genoma!humano! ( e sión!GRCh37/hg19)!
según!UCSC*Genome*B owse .!
Panel!B.!Localización!de!los!genes!de!la! amilia!CD209!en!el!c omosoma!8!del!genoma!mu ino!( e sión!
NCBI37/mm9)!según!UCSC*Genome*B owse .!
Panel!C.!Rep esen ación!esquemá ica!de!los!dominios!de!la! amilia!CD209/SIGNR!en!humano!y! a ón.!En!
azul!se! ep esen an!segmen os!que!se! epi en!a!lo!la go!del!cuello!del! ecep o !mien as!que!en! e de!se!
ep esen an!dominios! a iables.!Según!Powlesland!e !al.,!2006.!
Cd209!Clec4M!Clec4gp1!
Fce 2!Clec4g!
7,760,000| 7,770,000| 7,780,000| 7,790,000| 7,800,000| 7,810,000| 7,820,000| 7,830,000| 7,840,000| 7,850,000| 7,860,000|!
50 kb!hg19!
19p12!
ch 19! 19p13.3 19p13.2 13.12 19p13.11!
Cd209a!Cd209e!Cd209d!Cd209b!Cd209 !Cd209g!
Clec4g!Cd209c!
100 kb!mm9!
3,700,000| 3,750,000| 3,800,000| 3,850,000| 3,900,000| 3,950,000| 4,000,000| 4,050,000| 4,100,000| 4,150,000|!
8qA1.1! 8qA2 8qA3 8qA4 B1.1 8qB1.3 8qB2!
ch 8!
Fce 2a!
A.!
B.!
C.!
!
!!!Ra ón!
!!Humano!

!
22
exp esión de CD209b y CD209d en células dend í icas, pe o a mucho meno ni el (Pa k
e al., 2001).
La unción p incipal de los componen es de la amilia SIGNR es el
econocimien o de ca bohid a os. Powlesland y colabo ado es es udia on la habilidad
ela i a de manosa y ucosa pa a compe i po la unión de casi odos los componen es de
la amilia SIGNR. Según sus esul ados, los miemb os de SIGNR con unión p e e en e a
ucosa se ían DC-SIGN humano (CD209), SIGNR1 (cd209b), SIGNR3 (cd209d) y
SIGNR7 (cd209g), mien as que los que p esen an unión p e e en e a manosa se ían
DC-SIGNR humano (CD209L), SIGNR5 (cd209a, DC-SIGN) y SIGNR8 (cd209 ).
En es e con ex o, los au o es sugie en que, según su unión a ca bohid a os, CD209a
ecue da más a DC-SIGNR y CD209b a DC-SIGN (Powlesland e al., 2006).
CD209b (SIGNR1) es quizá la p o eína más es udiada de los homólogos,
g acias en pa e a que se iden i icó como el an ígeno que econoce el an icue po
monoclonal ER-TR9 (Kang e al., 2003). SIGNR1 se exp esa en mac ó agos de la zona
ma ginal y mac ó agos pe i oneales, y colabo a en la cap u a de pa ógenos como
S ep ococcus pneumoniae inyec ados ía in ape i oneal (Lanoue e al., 2004) o ía
in anasal (Koppel e al., 2005). También se ha elacionado con el e ec o e apéu ico de la
inmunoglobulina in a enosa (IVIG, In aVenous ImmunoGlobulin) en en e medades
como la pú pu a omboci opénica idiopá ica (An hony e al., 2008b).
1.4.5.a CD209a como ma cado celula .
En humanos, DC-SIGN es á p esen e en células dend í icas de i adas de
monoci os (Mo-DCs) (Be gman e al., 2004; Geij enbeek e al., 2000b) y se ha p opues o
ambién como ma cado de mac ó agos M2 (Ve eck e al., 2006).
En a ones, CD209a se ha mos ado ú il pa a dis ingui en e Mo-DCs y DCs
clásicas en suspensiones celula es y en secciones de ejido (Cheong e al., 2010), lo que
iene implicaciones impo an es pa a en ende las unciones de es as células. De mane a
consis en e, en o o es udio con células aisladas de bazo, se de ec ó la exp esión de
CD209a a ni el de ARNm en pDC y DC CD11b+, pe o no en DCs CD8a+, células
mieloides, NK, T CD8+, T CD4+ o células B (Robbins e al., 2008).
1.4.5.b Con ol ansc ipcional de DC-SIGN/CD209a.
En humanos, la exp esión de DC-SIGN depende de IL-4 (Relloso e al.,
2002; Teles e al., 2010) y es á egulada po PU.1 (Dominguez-So o e al., 2005). En
a ones, aunque la exp esión de CD209a no se ha es udiado en de alle, exis e un
p eceden e donde se desc ibe cómo su exp esión aumen a en espues a a GM-CSF e IL4
(Cheong e al., 2010), pe o su egulación po PU.1 no ha sido es udiada.
1.!In oducción!
!
23
Po o o lado, aunque se ha desc i o que la es imulación con LPS mo iliza las
Mo-DCs CD209a+ CD206+ en a ones in i o (Cheong e al., 2010), an o el LPS como
el TNFα disminuyen la exp esión de DC-SIGN/CD209a en a ones y humanos in i o
(Caminschi e al., 2001; Geij enbeek e al., 2000b). La explicación p obablemen e esida
en la ac i ación de las células T, las cuales median en la p oducción in i o de Mo-DCs
CD209a+, en un p oceso mediado po CD40L (Da idson e al., 2013).
1.5 Ó ganos Lin oides.
Los ó ganos lin oides se clasi ican uncionalmen e en dos ipos: p ima ios y
secunda ios. Los p ima ios suminis an el mic oambien e necesa io pa a la madu ación de
los lin oci os, mien as que los secunda ios acili an el encuen o con el an ígeno. Los
dis in os ó ganos lin oides es án in e conec ados po asos sanguíneos y lin á icos, de
modo que o man una ed uni a ia. Los ó ganos lin oides p ima ios son el imo, donde se
p oducen las células T, y la médula ósea, donde se p oducen las células B. Los ó ganos
lin oides secunda ios son los ganglios, el ejido asociado a mucosas y el bazo.
1.6 El Bazo.
El bazo es el p incipal ó gano lin oide secunda io, an o en amaño como en
uncionalidad. Además, es el único que se encuen a in e calado en el o en e
ci cula o io. En él se p oduce la cap u a y p ocesamien o de an ígenos y su p esen ación a
las células T pa a empeza la espues a adap a i a. A pa e de su unción inmuni a ia, el
bazo desempeña o as unciones como elimina los e i oci os senescen es pa a el eciclaje
del hie o de su g upo hemo, ac ua de ese o io de sang e libe ada en caso de
hipo olemia, y cons i ui un ese o io de de e minados ipos celula es como plaque as y
monoci os (B on e and Pi e , 2013; Swi ski e al., 2009).
El bazo se encuen a ecubie o po un ejido conjun i o capsula , que se eúne
en un co dón llamado hilio a a és del que en an y salen los asos sanguíneos. La
ascula ización del bazo se o ganiza, en esencia, como un “á bol” de a e ias denominadas
b anquiales, p oceden es de una a e ia esplénica que después se ami ica en pequeñas
a e iolas, las cuales e minan en un sis ema sinusoidal enoso (Mebius and K aal, 2005).
Es a especial ascula ización, en la que in e iene un sis ema sinusoidal abundan e,
pe mi e al bazo desempeña una e icaz a ea de cap u a de las células ojas senescen es y
posibles an ígenos p esen es en la sang e.
El pa énquima esplénico se denomina pulpa, y puede se de dos ipos: la pulpa
blanca y la pulpa oja, dis inguibles a simple is a. En medio, se o ganiza la llamada zona
ma ginal, dis inguible sólo con ayuda de un mic oscopio ( e Figu a 1.7).
!
24
Figu a'1.7.'Ul aes uc u a'del'bazo'mu ino.'
!
Panel!A.!Rep esen ación!de!la!o ganización!mic oscópica!del!bazo!en!la!que!se!des aca!la!cápsula,!pulpa!
oja,!zona!ma ginal!y!pulpa!blanca.!Según!B on e!and!Pi e ,!2013.!
Panel!B.!Rep esen ación!de!los! ipos!celula es!más!abundan es!de!la!zona!ma ginal!del!bazo,!seno!ma ginal!
y!pulpa!blanca.!Según!O’Neill!e !al.,!2013.!
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1.!In oducción!
!
25
1.6.1 Pulpa Blanca.
La a e ia esplénica a e en e se encuen a odeada de zonas de lin oci os T y a
su ez las a e iolas se odean po lin oci os B o ganizados en olículos. Es as zonas de
ejido lin oide o man lo que se denomina la pulpa blanca del bazo. La pulpa blanca es
es uc u almen e simila a un nódulo lin á ico, con un compa imen o de lin oci os B y T
además de células e icula es y un sub ipo de células dend í icas conocidas como células
dend í icas olicula es. Los lin oci os T se o ganizan en o ma de ainas de lin oci os T
pe ia e iola es conocidas como PALS (Pe ia e iola Lymphoid Shea h). Es as células T
econocen los an ígenos p esen ados po las células dend í icas y lin oci os B,
p omo iendo la gene ación de an icue pos. Los olículos de lin oci os B se si úan
al ededo de es as zonas T, y es el luga en el que ocu e el p oceso de expansión clonal
una ez el lin oci o B en a en con ac o con el an ígeno. La o ganización y man enimien o
de la pulpa blanca es á con olada po cie as quimioquinas que a aen a los lin oci os B y
lin oci os T a sus zonas especí icas den o de la pulpa blanca (Mebius and K aal, 2005).
Al igual que en o os ó ganos lin oides secunda ios, exis en poblaciones de mac ó agos en
las zonas T y las zonas B que se denominan mac ó agos de la pulpa blanca, y que se
ca ac e izan po se F4/80lo/-CD68+Tim-4+. En las zonas B, ambién denominadas cen os
ge minales, que son luga es en los que ocu e la p oli e ación, di e enciación y
madu ación de los lin oci os B, es os mac ó agos eciben el nomb e de Tingible Body
Mac ophages (TBM) (den Haan and K aal, 2012).
Las a e iolas pequeñas ie en al espacio ma ginal, á ea en e la pulpa blanca y
la zona ma ginal, mien as que o as a a iesan la zona ma ginal y se in oducen en la
pulpa oja, donde pasan a o ma pa e del sis ema enoso.
1.6.2 Pulpa Roja.
En la pulpa oja la sang e luye a a és de sinuoides, que cons i uyen un
sis ema sanguíneo abie o sin lámina endo elial en e los que se encuen an los co dones
de Bill o h cons i uidos po ib oblas os y ib as e icula es (G oom e al., 1991). Es e
sis ema abie o con una o ganización e icula pe mi e la e ención de los e i oci os iejos
que p esen an memb anas menos lexibles, impidiendo su e o no al o en e sanguíneo a
a és de la ena colec o a. Los mac ó agos de la pulpa oja F4/80+CD68+ es án
especializados en la agoci osis de los e i oci os e enidos, iniciándose el p oceso de
eciclado del hie o (Kohyama e al., 2009).
1.6.3 Zona Ma ginal.
La zona ma ginal (MZ) se desc ibe his ológicamen e como una capa celula
odeando a la pulpa blanca, cuyo lími e lo ma can células epi eliales MadCAM-1+ (K aal,
1992). Su p esencia se desc ibió po p ime a ez en 1929 po Wa d J. MacNeal
(MacNeal, 1929), quien ya sub ayó su impo ancia en la agoci osis. Quizá la
ca ac e ís ica ana ómica más llama i a de la zona ma ginal es la p esencia de un seno o
espacio ma ginal en el que ie en muchos asos sanguíneos. Es o pe mi e que la mayo
pa e de la sang e que en a al bazo sea c ibada po a ios ipos celula es esiden es,
incluyendo dos sub ipos de mac ó agos y una población de lin oci os B ( e Figu a 1.7).
!
26
Los dos sub ipos de mac ó agos especializados se denominan mac ó agos de
zona ma ginal (MZM) y mac ó agos me alo ílicos de zona ma ginal (MMM) y se
ca ac e izan po se CD68-F4/80lo/-. Ambos exp esan un amplio conjun o de ecep o es de
econocimien o de pa ones (PRR) que les pe mi en agoci a pa ógenos y empeza la
espues a inna a. Po ejemplo, en un es udio se es ableció que los mac ó agos de la zona
ma ginal (MZM y MMM) son necesa ios pa a gene a espues as T-CD8+ en un modelo
de in ección i al in a enosa (Hu e al., 2011). Además, pa ecen es a elacionados con la
cap u a de células apop ó icas y la au o ole ancia. Median e la depleción de los
mac ó agos de la zona ma ginal, la inyección de células apop ó icas asociadas con au o-
an ígenos conc e os y la pos e io inducción de un sínd ome au oinmune (EAE) en
a ones no males, se comp obó que aquellos a ones que no enían mac ó agos en la zona
ma ginal p esen aban una meno ole ancia inmuni a ia y desa ollaban la en e medad
an es (Miyake e al., 2007), lo que se ha demos ado en o os modelos como lupus
e i ema oso sis émico (McGaha e al., 2011). Así, los au o es sugie en un papel egulado
pa a los mac ó agos de zona ma ginal de la espues a inmuni a ia a an ígenos asociados a
células apop ó icas.
Los MMM se iden i ica on po p ime a ez en 1964 po Snook (Snook, 1964)
y se di e encian eno ípicamen e de los MZM y de los mac ó agos de la pulpa oja en la
exp esión de la molécula Sialoadhesina (Sn). La Sialoadhesina es un miemb o de la
amilia de las lec inas ipo-inmunoglobulina que unen ácido siálico, (Siglec-1, Sialic acid-
binding Ig-like Lec in) que se desc ibió o iginalmen e como un ecep o de e i oci os
(C ocke and Go don, 1989) y es á codi icada po el gen CD169. P e iamen e, y de
mane a independien e, se había desa ollado o o an icue po denominado MOMA-1 que
econocía especí icamen e los MMM (K aal and Janse, 1986) y que pos e io men e se
comp obó que econocía la misma molécula de Sialoadhesina (Oe ke e al., 2006a). La
Sialoadhesina es á in oluc ada en la ac i ación de las células T, ligando la inmunidad
inna a a la adqui ida (Backe e al., 2010; Jiang e al., 2006; Oe ke e al., 2006b).
Recien emen e, se ha descubie o el ol de los MMM en la agoci osis de exosomas a
a és de Sialoadhesina (Saunde son e al., 2014). Los exosomas son esículas ci culan es
que con ienen au oan ígenos y que pod ían in e eni en la egulación de la espues a
inmuni a ia en e a au oan ígenos, incluyendo umo es (Saunde son e al., 2014).
Los mac ó agos de zona ma ginal, MZM, se si úan en o ma de anillo
compues o po dos o es capas celula es al ededo de los MMM y el espacio o seno
ma ginal. Es os mac ó agos se dis inguen eno ípicamen e po la exp esión de las
moléculas SIGN-R1, que es una lec ina ipo-C homóloga a la molécula DC-SIGN en
humanos, MARCO, que es un ecep o Sca enge de ipo-I y TIM-4, una glicop o eína
que une os a idilse ina de células apop ó icas.
Los MZM p esen an una g an ac i idad agocí ica que, unido a su ubicación
en la zona ma ginal, les con ie e un papel esencial en la e i ada de pa ógenos y an ígenos
anspo ados po la sang e (Geij enbeek e al., 2002). En conc e o, la molécula SIGN-
R1 p esen a una g an a inidad en el econocimien o e in e nalización de polisacá idos de

1.!In oducción!
!
27
dex ano, los cuales es án p esen es en algunas bac e ias (Geij enbeek e al., 2002; Kang e
al., 2004, 2003). La ausencia de exp esión de MHC clase II en es as células y su g an
ac i idad en el econocimien o y agoci osis de pa ógenos y an ígenos, pod ían pa ece
an agónicos ya que as la agoci osis de esos an ígenos debe ía habe un p ocesamien o y
p esen ación de los mismos pa a gene a la espues a inmuni a ia en e a ellos. Se piensa
que los MZM in e nalizan los pa ógenos y, más a de, los p oduc os de deg adación se
desp enden de la supe icie de la célula y son cap ados po lin oci os B de zona ma ginal
que mig an al in e io del olículo y los p esen an, p o ocando así el inicio de la espues a
inmuni a ia (Geij enbeek e al., 2002). Po an o, exis e una in e dependencia en e los
mac ó agos y los lin oci os B de zona ma ginal en la gene ación de la espues a
inmuni a ia.
Los lin oci os B de zona ma ginal (MZB) se dis inguen de los lin oci os B de
la pulpa blanca en que no o man olículos, cap u an an ígenos anspo ados en la sang e
median e ecep o es de complemen o y p omue en espues as inmuni a ias dependien es
e independien es de células T (Cinamon e al., 2008; Faga asan, 2000; Pillai and
Ca iappa, 2009). Tan o las células B olicula es como las MZB exp esan el ecep o
CXCR5, y po an o ienen capacidad de espues a a CXCL13, que a ae a las células B al
olículo. Sin emba go, las MZB p esen an al as can idades de ecep o es S1PR1 y S1PR3.
La unión de es ingosina 1 os a o (SP1) a es os ecep o es induce la acumulación de MZB
en la MZ y la pulpa oja, donde SP1 se encuen a en al as concen aciones (Cinamon e
al., 2004). La exp esión de in eg inas como VLA-4 y LFA-1 en las MZB acili a su
ijación en el o en e ci cula o io de la MZ. Sin emba go, es as células no son sésiles, sino
que se mue en con inuamen e en e la MZ y los olículos. Es o se ha is o g acias a
écnicas de mic oscopía in a i al, y el mecanismo subyacen e pa ece se la
desensibilización ansi o ia de S1PR1 hacia su ligando (que pe mi e la mig ación desde
la MZ al olículo), seguida po una esensibilización (que pe mi e la mig ación de uel a a
la MZ). Es e p oceso de desensibilización cíclico es á egulado po GRK2, y explica la
en ada de los MZB al olículo en con a de g adien e de S1P (A non e al., 2013, 2011).
Allí pueden p esen a el an ígeno, iniciándose la espues a inmuni a ia humo al
(Cinamon e al., 2008). Adicionalmen e, las MZB pa ecen desempeña un papel
es uc u al en la e ención de los MZM median e la in e acción con el ecep o
MARCO, exp esado en es os mac ó agos (Ka lsson e al., 2003). Es a unción de
e ención de las células pa ece se ecíp oca, y po an o, hab ía una cie a
in e dependencia en e los lin oci os B y los mac ó agos de zona ma ginal.
Po úl imo, algunos es udios lle ados a cabo en los úl imos años elacionan los
mac ó agos de la zona ma ginal con el desa ollo y el a amien o de las en e medades
au oinmunes. La adminis ación en a ones de IgG in a enosa, IVIG, sus ancia que se
adminis a con éxi o en clínica pa a comba i los sín omas de la A i is Reuma oide y de
la Pú pu a T omboci opénica Idiopá ica (ITP), e eló que es as inmunoglobulinas
es aban di igidas especí icamen e a los mac ó agos de zona ma ginal (An hony e al.,
2008b). Conc e amen e, son las moléculas de SIGNR1 las que se p oponen como
ecep o es de es a sus ancia y las que se ían esponsables del inicio de la sup esión
in lama o ia p omo ida po la adminis ación del IVIG (An hony e al., 2008b).
!
28
1.7 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN.
Los ac o es de ansc ipción (TF, T ansc ip ion Fac o s) son p o eínas que
egulan la exp esión génica de la célula en espues a a las señales del medio que le odea.
En un o ganismo plu icelula con di e en es ipos celula es, los ac o es de ansc ipción
juegan un papel impo an e en la ac i ación y egulación del conjun o génico ca ac e ís ico
de cada linaje celula .
Po ejemplo, el ac o de ansc ipción c-Myb es necesa io pa a la p oducción
de HSC ue a del saco i elino. La mu ación de es e gen gene a una anemia se e a en los
e os a pa i del día 15 de ges ación, momen o en el que cesa la hema opoyesis en el saco
i elino y empieza la hema opoyesis adul a de ini i a (Mucenski e al., 1991). Sin
emba go, no in e ie e en el desa ollo de una línea p ecu so a de mac ó agos c-Myb-
independien e (Cla ke e al., 2000), que inalmen e da á luga a los mac ó agos isula es
(Schulz e al., 2012).
Po o o lado, a ios es udios han des acado la impo ancia de los ac o es de
ansc ipción de e minan es de linaje (LDTF, Lineage-De e mining T ansc ip ion Fac o s),
ambién denominados ac o es pione os o egulado es p incipales, en la selección de
enhance s especí icos de ipo celula (Ga be e al., 2012; T ompouki e al., 2011). Los
enhance s no son más que egiones del ADN donde los ac o es de ansc ipción se pueden
uni y egula la exp esión génica. Según el modelo ac ual, la unión de los LDTFs a los
enhance s p edispone a esa egión de ADN median e modi icaciones his ónicas en
egiones egulado as cis ac i as. Es as modi icaciones pe mi en la unión de TFs
dependien es de señal (SDTF, Signal-Dependen T ansc ip ion Fac o s), que inalmen e
egulan la exp esión génica (Ghisle i e al., 2010; Heinz e al., 2010; Mullen e al., 2011).
Los pa ógenos pa ecen habe descubie o hace iempo es a egulación de la c oma ina en
su ca e a a mamen ís ica, pues p esen an mecanismos pa a in en a usa la a su a o
(A bibe, 2008), po lo que es a egulación se es á empezando a in es iga en
au oinmunidad y cánce (Woan e al., 2012). El modelo p opues o pod ía explica 1) po
qué TFs di e en es ienden a colocaliza en el genoma en un mismo ipo celula , 2) po
qué el mismo TF p esen a pa ones de unión al genoma di e en es en dis in os ipos
celula es (Heinz e al., 2010).
Di e sos es udios han iden i icado a PU.1 y C/EBPα como LDTFs
impo an es en el desa ollo mielo-monocí ico (F iedman, 2007; Heinz e al., 2013, 2010;
Schulz e al., 2012).
PU.1 (PU ine- ich box 1, codi icado po el gen Spi-1) es un ac o de
ansc ipción de la amilia ETS (E-Twen y Six), que puede egula la exp esión génica
median e la unión a mo i os ETS canónicos u o os si ios g acias a su in e acción con
o os ac o es de ansc ipción, como I 4, I 8, C/EBPα, C/EBPβ y c-Jun (Ca o a e al.,
2010). En células mieloides, PU.1 se encuen a en las egiones egulado as de
p ác icamen e odos los genes analizados, incluyendo ecep o es de ci oquinas (CSF1R y
CSF2R), ma cado es de supe icie (CD11b, CD18, CD45, FcRs), y enzimas con acción
1.!In oducción!
!
29
Figu a' 1.8.' Modelo' po ' el' que' los' ac o es' de' ansc ipción' de e minan es' de' linaje'
modi ican'la'c oma ina'y'pe mi en'la'unión'de' ac o es'de' ansc ipción'dependien es'de'
señal.'
La!unión!de!los! ac o es!de! ansc ipción!de e minan es!de!linaje!(LDTF)!como!PU.1!y!CEBP!a!enhance s!
ab en! la! c oma ina! y! acili an! la! monome ilación! de! la! lisina! 4! de! las! his onas! (H3K4Me1).! Es a!
modi icación!pe mi e!la!unión!de! ac o es!de! ansc ipción!dependien es!de!señal!(SDTF),!como!LXR_RXR.!
Modi icado!de!Heinz!e !al.,!2010.!
Unión!de!LDTF:!PU.1!/!CEBP!
Monome ilación:!H3K4M1!
Unión!de!SDTF:!LXRIRXR!
!
30
mic obicida como gp91 (Ca o a e al., 2010). E ec i amen e, median e la écnica del
ChIP-Seq se iden i ican unos 45.000 si ios de unión de PU.1 al genoma de mac ó agos
(Ghisle i e al., 2010; Heinz e al., 2010). Los a ones PU.1-/- ca ecen de lin oci os B y
monoci os, y p esen an un meno núme o de neu ó ilos (McKe che e al., 1996; Sco e
al., 1994). Po o o lado, las células mieloides p esen an mayo es ni eles de PU.1 que las
células lin oides, y la in oducción de PU.1 en p ogeni o es lin oides los edi ige hacia el
linaje monocí ico (DeKo e and Singh, 2000).
C/EBPα (CCAAT/Enhance Binding P o ein) es un ac o de ansc ipción de la
amilia C/EBP, cuyos miemb os o man homo o he e odíme os a a és de una
c emalle a de leucina y se unen al ADN a a és de una egión de ca ác e básico (Mille
e al., 2003). C/EBPα puede o ma he e odíme os con PU.1 (Ca o a e al., 2010) y
miemb os de las amilias CREB (Shuman e al., 1997) y AP-1 (Hong e al., 2011), y se
ha demos ado que, al igual que PU.1, egula los genes de CSF1R y CSF2R, y el p opio
gen pa a PU.1 (Kummalue and F iedman, 2003). Median e ChIP-Seq, se iden i ican
unos 40.000 si ios de unión de C/EBPα, un 35 % de ellos si uados a menos de 100pb de
PU.1 (Heinz e al., 2010). Ra ones C/EBPα-/- ecién nacidos p esen an monoci os pe o
ca ecen de g anuloci os, mien as que los adul os ca ecen an o de monoci os y
g anuloci os debido a un de ec o en la o mación del p ogeni o de g anuloci os y
monoci os (GMP, G anulocy e-Monocy e P ogeni o ) (Hea h e al., 2004; Zhang e al.,
1997).
PU.1 y C/EBPα p esen an unciones di e en es en cuan o a la de e minación
del linaje monoci o/g anuloci o, siendo PU.1 esencial pa a la di e enciación de monoci os
a expensas de la di e enciación g anulocí ica (Dakic e al., 2005) y an agonizando a
C/EBPα (Dahl e al., 2003), que es esencial pa a el desa ollo de g anuloci os (Zhang e
al., 1997). A pesa de ep imi mu uamen e el p og ama ansc ipcional del o o, es de
des aca que es necesa ia la p esencia de ambos TFs pa a el no mal desa ollo de
monoci os y g anuloci os. Así, a ones PU.1-/- p esen an meno es ni eles de neu ó ilos
(McKe che e al., 1996) y a ones C/EBPα-/- p esen an de ec os en el desa ollo de
mac ó agos (Hea h e al., 2004). Además, en expe imen os de exp esión ec ópica se ha
obse ado que ambos TFs son necesa ios pa a la ep og amación de células B (Xie e al.,
2004), p ogeni o es T (Laiosa e al., 2006) y ib oblas os (Feng e al., 2008) hacia
mac ó agos.
Una hipó esis pa a explica es a apa en e pa adoja es el denominado sis ema
bies able, según el cual una célula p ogeni o a (ines able en el iempo) p esen a bajos
ni eles de exp esión de ambos TFs, que se encuen an co ep imidos. Una pequeña
di e encia en los ni eles de exp esión de uno de los dos TFs inclina á la balanza hacia uno
de los dos des inos celula es posibles (es ables): monoci o o g anuloci o (Laslo e al.,
2006; Muzzey and an Oudenaa den, 2006). Es o sub aya la impo ancia de las moléculas
con las que in e acciona un TF pa a egula su unción (Sieweke and G a , 1998),
incluido sus ep eso es.
1.!In oducción!
!
37
!"#$%&'$($)"""""*+,-.*/"0+/1,23"
!"45657589$)"""""""*:*-.*/"0/+1;23"
# Iden idad: 59/78 (75.6%)!
# Simili ud: 65/78 (83.3%)!
!"#$%&'(%&'$#)%&!!#!%&
&&&&&*+,&&&&&&&&&&&&&&&&&&&-&&&&&&&&&&&&&&&&.&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&/&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&&0&&&&&&&&&&&&&&&&&
Figu a'1.10.'Rep esen ación' esquemá ica' de' la' es uc u a' de' LXR' y' la' simili ud' en e' las'
iso o mas'LXRα'y'LXRβ.''
De!cada! egión!se! ealizó!un!alineamien o!de!las!secuencias!p o eicas!mu inas!de!las!iso o mas!LXR
α!y!
LXRβ
,!ob eniéndose!una!iden idad!del!33!%!en!la! egión!A/B,!un!75,6!%!en!la! egión!C!(que!co esponde!a!
la!DBD),!un!39,5!%!en!la! egión!D!(que!co esponde!a!la! egión!bisag a)!y!un!78!%!en!la! egión!E/F!(que!
co esponde!a!la!LBD).!La! egión!F!es á!p ác icamen e!ausen e!en!LXR.!En!ama illo!se!des acan!los!"dedos!
de! zinc"! de! unión! al! ADN.! ! Pa áme os! del! alineamien o:! Algo i hm:! Wa e ! (local! alignmen ),!
Ma ix:!
EBLOSUM62,!Gap_open:!10.0,!Gap_ex end:!0.5.!
!

!
38
p edominan e en hígado, luga donde se lle a a cabo la lipogénesis, y LXRβ se exp esa de
mane a ubicua y iene eó icamen e más peso en el anspo e e e so del coles e ol, se
es án buscando agonis as LXRβ especí icos pa a aumen a el anspo e e e so del
coles e ol sin aumen a la lipogénesis hepá ica (Lund e al., 2006; Miao e al., 2004).
Po o o lado, a ios es udios pa ecen indica que LXRα pod ía se la
p incipal iso o ma uncional de mac ó agos, mayo men e en cuan o a la egulación de su
unción inmuni a ia. Po ejemplo, se ha demos ado que LXRα es p imo dial en la
supe i encia de los mac ó agos a la in ección po Lis e ia monocy ogenes (LM) (Joseph e
al., 2004). Es e e ec o es á mediado po la inducción del gen an iapop ó ico AIM/Spα
(Apop osis Inhibi o exp essed by Mac ophages, Aim/Spα) (Miyazaki e al., 1999) que es un
gen diana exclusi o de LXRα (Joseph e al., 2004; Valledo e al., 2004). O o gen diana
egulado po LXRα en mac ó agos es SCD-1 (E bay e al., 2009), que media en la
esis encia a la mue e celula inducida po sob eca ga de lípidos, en un p oceso mediado
po es és del e ículo endoplásmico y que e mina en apop osis (E bay e al., 2009).
LXRα ambién educe los e ec os p oa e ogénicos de Chlamydia pneumoniae en un
modelo de a e oscle osis (Naiki e al., 2008), es más e icien e que LXRβ en la inducción
de A ginasa I (Pou ce e al., 2011) y median e ap oximaciones ansc ip ómicas se ha
iden i icado como uno de los TFs egulado es de mac ó agos ( e ablas suplemen a ias
11 y 13 de Jojic e al., 2013). Po o o lado, se ha descubie o que LXRα es impo an e en
hígado pa a la homeos asis de los ni eles de coles e ol (Zhang e al., 2012).
LXRβ, po su pa e, pod ía se más impo an e en el con ol lipídico y
p oli e ación. Así, LXRβ in e acciona di ec amen e con ABCA1 (Hozoji e al., 2008;
Hozoji-Inada e al., 2011), y el con ol de los es e oles se ha elacionado con la
modulación de la p oli e ación celula y la inmunidad adqui ida (Bensinge e al., 2008).
El abajo de Bensinge y colabo ado es demues a que la egulación de la p oli e ación de
a ios ipos celula es, en e ellos los lin oci os T y B, es dependien e de la homeos asis de
es e oles po pa e de LXRβ. Más conc e amen e, al disminui la iabilidad de es e oles,
la iso o ma LXRβ inhibe la expansión de lin oci os en espues a a TCR (T Cell Recep o ) y
BCR (B Cell Recep o ). Ra ones LXRβ-/- p esen an hipe plasia lin oide y una mayo
espues a a an ígenos, indicando que la egulación de es e oles dependien e de LXRβ es
impo an e en la espues a inmuni a ia (Bensinge e al., 2008).
Además, en cuan o a modi icaciones pos anslacionales, pa ece se que la
os o ilación ocu e en LXRα (Chen e al., 2006; To a e al., 2008) y que la
SUMOilación pod ía lle a se a cabo de mane a di e en e en una iso o ma que o a, al
menos en as oci os (Lee e al., 2009), mien as que o as modi icaciones como la
modi icación O-be a-N-ace ilglucosamina (An honisen e al., 2010) o la ace ilación (Li
e al., 2007) se ían equi alen es en ambas iso o mas.
!
!
!
!
!
!
OBJETIVOS
2.
!

!
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!
43
OBJETIVOS
_______________________________________________________________
En esumen, los Obje i os plan eados pa a es a Tesis son los siguien es:
* Es udia la ele ancia de los ecep o es nuclea es LXR en la o mación de las
poblaciones de mac ó agos esplénicos.
* Es ablece el o igen on ogené ico de las células mieloides que dan luga a las
poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal del bazo.
* Es udia la espues a ansc ipcional de células mieloides ca en es de
ecep o es LXRα a las ci oquinas M-CSF y GM-CSF.
* Analiza la egulación ansc ipcional de genes inducidos po es as ci oquinas
en los que LXRα juegue un papel p imo dial.
!
2.
!
!
!
!
MATERIAL Y MÉTODOS
3.
!
3.!Ma e ial!y!Mé odos!
!
53
3.3 Cul i o de Líneas Celula es.
Todas las células se cul i a on a 37°C en una a mós e a que con enía 5 % de
CO2 – 95 % de ai e. A menos que se especi ique lo con a io, los medios empleados son
RPMI 1640 (Lonza) comple o o DMEM (Lonza) comple o - suplemen ados con 10 %
de FBS (PAA Labo a o ies GmbH), Penicilina (100U/ml) (Sigma) y Es ep omicina
(100 µg/ml) (Sigma).
3.3.1 Cul i os P ima ios.
3.3.1.a Ob ención de mac ó agos de i ados de medula ósea mu ina (BMDM).
La médula ósea del in e io del ému y la ibia se ex ae haciendo pasa una
solución de PBS (Tampón os a o salino pH 7,4) con una je inguilla de 10 ml y una aguja
de 0,5 mm. El ejido medula se disg ega a a és de un sepa ado celula de Nylon, con
un amaño de po o de 70 µm (BD FalconTM, BD Bioscience). La suspensión celula se
cen i uga a 1500 pm 4ºC du an e 5 minu os, y se esuspende en medio hipo ónico (Red
Blood Lysis Bu e , Sigma) du an e 2 minu os pa a a o ece la lisis de los e i oci os. T as
2 minu os, se añade PBS y se cen i uga a 1500 pm 4ºC du an e 5 minu os. Las células
se siemb an en pla os bac e iológicos con 10ml de medio RPMI 1640 comple o
suplemen ado con 1/3 de medio L929. La médula ósea p oceden e de 1 a ón se siemb a
inalmen e en 4 pla os (5 x 106 células ap oximadamen e). T as 7 días de cul i o, las
células se ecogie on con a ios la ados de PBS y PBS-EDTA 10 mM, se con a on y se
semb a on en pla os a ados (Nunc) con medio RPMI 1640 comple o suplemen ado con
10 ng/ml de ci oquinas ecombinan es mu inas M-CSF o GM-CSF (Immuno ools),
según se indique.
3.3.1.b Ob ención de mac ó agos de i ados de monoci os de sang e pe i é ica
humana (MDM, monocy e-de i ed mac ophages).
La sang e de olun a ios sanos se sepa ó median e un g adien e de densidad
con Lymphop ep, y de los bu y coa s se aisla on las células CD14+ median e
en iquecimien o magné ico (Mil enyi). Las células ob enidas se cul i a on en medio de
cul i o: DMEM comple o suplemen ado con 10 ng/ml de M-CSF humano (Pep o ech).
La ci oquina se añadió cada e ce día. T as 7 días las células se subcul i an en pla os
a ados con medio de cul i o esco DMEM comple o + 10 ng/ml de M-CSF humano
(Pep o ech). Al día siguien e, las células se la a on con PBS y se añadie on los
a amien os M-CSF, GM-CSF o IL-4 humano (Pep o ech) du an e 24 ho as.
3.3.1.c Ob ención de mac ó agos pe i oneales mu inos.
Pa a induci el eclu amien o de los mac ó agos del pe i oneo, inyec amos 3ml
de ioglicola o en la ca idad pe i oneal de a ones LXRα l/ l Va -iC e-/-, LXRα l/- Va -
iC e+/ y LXRα l/ l Va -iC e+/. T es días después se sac i ica on y se aisla on las células del
pe i oneo median e es la ados de la ca idad pe i oneal con 10 ml de PBS, que se il ó a
a és de un sepa ado celula de Nylon con un po o de 70 µm (BD FalconTM, BD
Bioscience) pa a elimina impu ezas. Las células se cen i uga on a 300g du an e 10', se
esuspendie on en medio RPMI 1640 comple o y se semb a on en placas de cul i o. Al

!
54
cabo de 4 ho as, se ealiza on la ados con PBS pa a e i a las células no adhe idas, y las
células adhe idas se lisa on pa a el análisis de p o eínas al y como se de alla en la sección
7.1.
3.3.2 Líneas celula es.
3.3.2.a Cul i o de células RAW-LXRα-3FLAG.
Las células RAW264.7 que sob eexp esan LXRα unido a es epe iciones del
oc apép ido FLAG (Alonso-Gonzalez e al., 2009; Chen e al., 2006) se cul i a on en
pla os a ados (Nunc) con medio DMEM comple o.
3.4 T a amien os in i o.
Los a amien os in i o se ealiza on en cul i os celula es de células BMDM.
Po un lado, se es udió la in luencia de CD209a en la cap ación de azúca es y po o o se
ealiza on es udios a macológicos pa a es udia las ías de señalización que egulan la
exp esión de CD209a.
3.4.1 Cap ación de azúca es de células BMDM.
El es udio de cap ación de azúca es se ealizó modi icado lige amen e las
indicaciones de Se ano-Gomez e al., 2008. B e emen e, 0,3 x 106 células BMDM WT
o LXRα-/- se semb a on en pla os de 35 mm con cub eobje os a ados p e iamen e con
poli-L-Lisina (Sigma P4707) en medio RPMI comple o con M-CSF o GM-CSF (10
ng/ml). Al día siguien e, las células es aban ya adhe idas al cub eobje os. Los cub eobje os
se la a on con PBS y se incuba on 30 minu os a empe a u a ambien e con azúca es a una
concen ación de 100 µg/ml en medio RPMI comple o. Los azúca es (α-D-Manosa o α-
L-Fucosa) se encuen an conjugados a es e as de poliac ilamida (PAA)-FITC, p oceden
de la compañía Lec ini y (Rusia) y han sido usados p e iamen e (Se ano-Gomez e al.,
2008). Como con ol se usa on es e as de PAA-FITC sin conjuga . Pos e io men e, las
células se la a on con PBS, se ija on con PFA 4 %, se ol ie on a la a con PBS, se
mon a on con medio de mon aje Vec ashield Moun ing Medium wi h DAPI (Vec o
labo a o ies), se o og a ia on en el mic oscopio de luo escencia Eclipse 80i (Nikon) y se
analiza on en el p og ama NIS-Elemen s F3.0 (Nikon).
3.4.2 T a amien os Fa macológicos e Inhibido es.
Los a amien os a macológicos se lle a on a cabo en 2,5 x 106 células BMDM
cul i adas en pla os de 60 mm y a las concen aciones indicadas en la sección de
Resul ados.
Pa a el es udio de la unción de LXR-RXR se usa on los ligandos sin é icos
GW3965 (GSK), LG268 (Ligand Pha maceu icals) y el an agonis a GW233 (Zue che
e al., 2010).
3.!Ma e ial!y!Mé odos!
!
55
Pa a el es udio de las u as de señalización de GM-CSF las células se
le an a on, con a on y semb a on en RPMI comple o + M-CSF (10 ng/ml). Al día
siguien e se la a on con PBS y se cul i a on con medio RPMI comple o (sin ci oquina).
T as 1 ho a se añadie on los inhibido es y as 2 ho as se dispensó GM-CSF (10 ng/ml).
A las 6 ho as del a amien o con GM-CSF se p ocedió a la ex acción del ARNm con
T izol. Los inhibido es usados ue on PD98059, BI605906, SN50, SB203580,
LY294002, wo manina (cedidos amablemen e po el D . Lisa do Boscá y la D a. Susana
Alemany ), JakI (cedido amablemen e po la D a. Sonsoles Ho elano), AG490 (cedido
amablemen e po el D . Bo ja Gue a) y Cicloheximida (Sigma).
3.5 T a amien os in i o.
3.5.1 Plaque as opsonizadas.
Las plaque as se p epa a on siguiendo el p o ocolo del labo a o io del D .
John W. Semple (Semple e al., 2007), ob enido du an e una es ancia en el labo a o io del
D . Alan H. Laza us. P ime o, se ecoge la sang e de la ena ca a de a ones sac i icados
median e inhalación de se o luo ano (Abbo ) y se deposi a en ubos de c is al “BD
Vacu aine Se um” (Re 366430) con 500 µl de PBS y el an icoagulan e ci a o- os a o-
dex osa-adenina (CPDA, Sigma C4431) ( a io 10:1). La sang e de a ios a ones se
cen i uga a 150g, y se aísla el plasma ico en plaque as (PRP). Las plaque as se la an en
PBS y se ajus an a 109 células/mL en PBS-CPDA. A con inuación, 150 x 106 plaque as se
opsonizan con 5 µg de an icue po en e a CD41 (BD Pha Mingen #553847), o se dejan
opsoniza como con ol, se la an, y se inyec an po la ía de la ena de la cola. La
p esencia de CD41 en el bazo se de ec a median e Inmunohis oquímica, empleando un
an icue po secunda io an i- a a-AF488. Al e na i amen e, las plaque as se incuban con
20 µM de Red CellT acke CMTPX (In i ogen C34552) y 5 µg de an icue po en e a
CD41 a 37ºC 30 minu os, empleando plaque as sin ma ca como con ol. En ambos
casos, el aislamien o de los bazos pa a pos e io análisis se ealizó as 90 minu os de
a amien o.
3.5.2 Clod ona o.
El clod ona o (Cl2MBP; diclo ome ileno-bi os ona o) es un compues o que se
ha usado p e iamen e pa a elimina empo almen e las poblaciones de mac ó agos (Van
Rooijen and Sande s, 1994). Se adminis a po ía in a enosa encapsulado en el in e io
de liposomas (Encapsula Nanosciences) que son agoci ados y causan la mue e del
mac ó ago. Como con ol se usan liposomas acíos sin clod ona o. Se emplea on animales
LXRα-/- y LXRβ-/-, y a las 48h una pa e de los a ones se sac i ica on pa a comp oba la
e icacia del a amien o con clod ona o.
T as dos semanas, un g upo de a ones se a ó ía in ape i oneal con una
solución de GW3965 a 20 mg/kg de peso co po al o ehículo cada 2 días. Una semana
después de empeza el a amien o con GW3965, se sac i ica on los animales y se analizó
la econs i ución de mac ó agos esplénicos median e inmunohis oquímica, empleando
pa a ello an icue pos especí icos.
!
56
3.6 Len i i us.
La e apia génica es una écnica consis en e en la in oducción de un gen
uncional pa a supli un gen de ec uoso in i o. Se ha empleado con cie o éxi o pa a el
a amien o de en e medades monogené icas como la de iciencia en adenosina deaminasa
(ADA) (Wi h e al., 2013). En nues o caso, usamos la e apia génica pa a econs i ui
p ogeni o es de médula ósea LXRαβ-/- con el gen de LXRα mu ino empleando un
sis ema len i i al especial. En es a e apia génica, las HSCs se ansducen ex i o con
ec o es len i i ales pa a pe mi i la in eg ación es able del gen de in e és y se
ein oducen de mane a au óloga. Como el gen se encuen a egulado po un p omo o
especí ico de mac ó agos, se exp esa á p e e en emen e en es as células. Po an o, la
elección de un p omo o adecuado es de i al impo ancia pa a la especi icidad de es a
écnica.
3.6.1 P omo o .
En la li e a u a podemos encon a a ios p omo o es especí icos pa a
mac ó agos: sheep isna i us long e minal epea , p omo o de CD68, chicken lysozyme
minigene cons uc o el p omo o del ecep o sca enge A (SA), pe o esul an no se lo
su icien emen e po en es y/o especí icos pa a las inalidades de la e apia génica (He e al.,
2006). En es a Tesis usa emos un p omo o sin é ico especí ico de células mieloides, que
ha sido usado p e iamen e con éxi o en animales asplan ados (He e al., 2006). Pa a
gene a el p omo o especí ico, los au o es unie on al aza en la zona 5' del p omo o de
p47phox elemen os cis pa a PU.1, C/EBPα, AML-1, Sp1 y AP-1, ( e Figu a 3.3A) y
de e mina on la e iciencia y especi icidad median e un sis ema de luci e asa en células
monocí icas THP-1, así como en células no monocí icas ales como células epi eliales del
in es ino Caco-2, células de ca cinoma epi elioide de cé ix Hela o células emb iona ias
de iñón HEK293.
3.6.2 Vec o es Len i i ales.
Los Len i i us son Re o i us, es deci , ienen un genoma de ARN que deben
ansc ibi e e samen e a ADN pa a in eg a se en el genoma de la célula hospedado a y
así pode mul iplica se. Como ec o es p esen an la en aja de pode in ec a an o a
células quiescen es como a células en di isión, mien as que el es o de Re o i us sólo
puede in ec a células en di isión.
Los ec o es len i i ales que hemos usado en es a Tesis es án basados en el
i us de la Inmunode iciencia Humana (VIH-1) y p oceden del labo a o io del D . Li (Li
e al., 2011). Pe enecen a la e ce a gene ación de ec o es len i i ales, en los que se ha
inc emen ado la segu idad median e un sis ema de 4 plásmidos ( e Figu a 3.3B y 3.3C)
desp o is os de odas las secuencias codi ican es y que únicamen e apo an en ans las
secuencias del ARN i al necesa ias pa a la ansc ipción e e sa, la in eg ación y el
encapsidamien o del ARN genómico (Dull e al., 1998). En conc e o, con ienen un ac o
polipu ínico (PPT, polypu ine ac ) necesa io pa a la sín esis de la segunda cadena,
3.!Ma e ial!y!Mé odos!
!
57
Figu a' 3.3.'Rep esen ación' esquemá ica' del' p omo o ' sin é ico' mac ó agoHespecí ico'
SPH146'y'de'los'plásmidos'len i i ales.'
Panel!A.!En!la!pa e!supe io !se! ep esen a!la!secuencia!de!módulos!de!unión!del!p omo o !SP_146.!En!
la!pa e!in e io !izquie da,!la!leyenda!de!cada!uno!de!los!módulos,!y!en!la!pa e!in e io !de echa,!su!
secuencia.(He!e !al.,!2006).!
Panel! B.!Rep esen ación! esquemá ica! de! los! 4! plásmidos! usados! en! la! ob ención! de! ec o es!!!
len i i ales.!Elabo ado!a!pa i !de!in o mación!de!Dull!e !al.,!1998!y!Li!e !al.,!2011.!
Panel!C.!Ob ención!de! ec o es!len i i ales! as! ans ección!de!una!célula!huésped!con!los!plásmidos!
adecuados.!
!
B.1
A.1
C.1
!
58
secuencia de e minación cen al (CTS, cen al e mina ion sequence) y elemen os
egula o ios pos - ansc ipcionales del i us de la hepa i is de ma mo a. Po o a pa e,
ca ecen de odos los genes acceso ios ( i , p , pu y ne ), genes egulado es ( a ) y
u ilizan una epe ición e minal la ga au o-inac i an e. Además, es án pseudo- ipados con
la glicop o eína de la en uel a del i us de la es oma i is esicula (VSVg), el cual iene un
amplio opismo, lo que signi ica que una g an can idad de ipos celula es se pueden
ansduci con es e sis ema. La VSVg ambién con ie e una g an es abilidad a las
pa ículas i ales, lo que pe mi e concen a las po ul acen i ugación (Naldini e al.,
1996).
3.6.3 Ob ención de los Plásmidos.
Los plásmidos necesa ios pa a ob ene len i i us de e ce a gene ación
pMDLg-pRRE, pRSV/Re , pMD.G, Len i-SP-GFP y Len i-SP-LXRα p oceden del
labo a o io del D . S. Li (Li e al., 2011), y se usa on pa a ans o ma células
compe en es DH5α. Pos e io men e, se ealiza on minip eps (Qiagen Qiap ep Spin
Minip ep Ki ), se comp obó la iden idad de los plásmidos median e diges ión con
enzimas de es icción especí icas y se p ocedió a ampli ica los po maxip ep (Omega Bio-
eck EZNA Endo-F ee Plasmid Maxi Ki ).
3.6.4 T ans ección.
Los plásmidos Len i-SP-GFP o Len i-SP-LXRα jun o con los plásmidos
acceso ios pMDLg-pRRE, pRSV/Re y pMD.G se co- ans ec a on en células 293T a
un a io de 10:6:1.5:2.5, usando FuGENE HD (P omega). El medio con i us se
ecolec ó a 48h, se cen i ugó a 2500G 10 minu os a 4ºC pa a desca a deb ís celula es, y
el sob enadan e se cen i ugó a 86000G du an e 90 minu os a 4ºC en una ul acen í uga
Beckman Op ima L-100 XP usando un o o SW41Ti. El pelle esul an e se
esuspendió en S emP o-34 SFM (Li e Technologies) 1 % L-Glu , 1 % Pen+S ep y se
almacenó a -80ºC. La e iciencia de las pa ículas len i i ales se examinó po ci ome ía en
células RAW264.7.
3.6.5 T ansducción de células de la médula ósea y T asplan e.
Pa a aumen a los ni eles de HSCs, los a ones donan es se a a on con 5-
luo ou acilo (110mg/kg) i.p. 4 días an es de su sac i icio. Pos e io men e, la médula ósea
ob enida de ému es y ibias se cen i ugó en el medio de sepa ación po densidad
Lympholy e-M (Tebu-Bio) pa a concen a las células blancas, que se ecupe a on y
cul i a on en S emP o-34 (Li e Technologies) 1 % L-Glu , 1 % Pen+S ep, 2 % S em
P o-34 Nu ien Supplemen (Li e Technologies), y 10 ng/ml de IL-3, IL-6, IL-1α y
mSCF (Pep o ech) du an e 18 ho as a 37ºC y 5 % de CO2. Los ec o es len i i ales más
Sul a o de P o amina 8 µl/ml (Sigma P3369) se añaden a las células y la mezcla se incuba
du an e 5 ho as.
Seis ho as an es del asplan e se i adian los a ones LXRα-/- ecipien es con un
dosis le al de 900 ads. Las HSCs ans ec adas se cen i ugan, se esuspenden en PBS 2

3.!Ma e ial!y!Mé odos!
!
59
% FBS, se cuen an y se inyec an 2 x 106 de HSCs ans ec adas jun o a una acción de
células o ales de médula ósea de un LXRα-/- sano (50 x 104) en un olumen de 200 µl ía
plexo e o-o bi al. T as 8-12 semanas, se ecoge la sang e y el bazo de los animales
asplan ados pa a su análisis po ci ome ía e his ología, espec i amen e.
3.7 Análisis de la Exp esión de ARN mensaje o.
3.7.1 Ex acción de ARN mensaje o.
El ARN se ex ajo según la écnica del enol/clo o omo usando el eac i o
come cial TRIZOL (In i ogen). Pa a ejidos se usó el homogenizado ULTRA-
TRURRAX (IKA). Pos e io men e, se añadió clo o o mo en una p opo ción 1:5 espec o
al olumen de TRIZOL y se agi ó igo osamen e 10 segundos. T as 5 minu os a RT, se
cen i uga on 15 minu os a 4ºC y 13.000 pm. A 4ºC, se ans i ió el sob enadan e a un
nue o ubo y se añadió isop opanol ío en una p opo ción 1:1 al sob enadan e. La
p ecipi ación se ob u o a 1h RT o -20ºC oda la noche, y a con inuación se cen i ugó 15
minu os a 4ºC y 13.000 pm. El p ecipi ado se la ó con una solución ía de e anol al 75
% en agua es é il a ado con DEPC, se cen i ugó 5 minu os a 4ºC y 13.000 pm y se
esuspendió en un olumen con enien e de agua es é il a ada con DEPC. La can idad
de ARN se cuan i icó median e espec o o óme o Nanod op (ND-1000 Spec opho ome e ,
Nanod op Technologies) y comp obó su calidad según a io A260/A280 y a io 18S/28S en
elec o o esis de aga osa 1,5 % con bu e MOPS.
3.7.2 Es udio de pe il ansc ipcional median e Mic oa ay.
Los mic oa ays o chips de ADN son placas que pe mi en analiza la exp esión
de miles de genes de mane a simul ánea. Pa a es udia los cambios ansc ipcionales, se
ealiza on es expe imen os independien es en los que se di e encia on BMDM
p oceden es de WT o αKO con ci oquina M-CSF (10 ng/ml) du an e 7 días. Al sép imo
día, se le an a on, con a on, semb a on y se a a on con M-CSF (10 ng/ml), GM-CSF
(10 ng/ml) o ehículo du an e 24 ho as. Las ci oquinas son p o eínas ecombinan es
mu inas y p oceden de Immuno ools. T as el a amien o, se ob u o el ARN según el
mé odo p e iamen e desc i o. Pos e io men e, se p ocedió a la euni icación del ARN de
los es expe imen os (en can idades iguales) y se pu i icó con el ki RNeasy (Qiagen).
El mic oa ay se ealizó en el Pa que Cien í ico de Mad id - UCM. La placa
empleada ue el modelo A yme ix Mouse Gene 2.0 ST A ay y el so wa e de p ocesado
de da os el GeneChip Analysis Sui e (A yme ix). Las ep esen aciones de Diag amas de
Venn y Mapas de calo (hea maps) las ealizamos usando Bioconduc o (Gen leman e al.,
2004), un paque e en lenguaje R ( e sión 2.14.1, en in e az RS udio e sión 0.97.173).
La On ología Génica (Gene On ology [GO] en inglés) es un campo de es udio enca gada
de la desc ipción y ca alogación de los genes según la unción que lle e a cabo la p o eína
a ni el molecula (p. ej. kinasa, nucleasa, ecep o ...), p ocesos biológicos en los que
pa icipa (p. ej. u a de señalización, anspo e de sus a os, apop osis...) y localización
den o de la célula (p.ej. núcleo, ci osol...). Median e el análisis GO de los esul ados de
un mic oa ay se puede conoce los p ocesos, unciones y localizaciones que se encuen an
di e encialmen e al e ados debidos al ac o expe imen al a es udio. Pa a el análisis GO se
!
60
empleó la he amien a GO illa (Eden e al., 2009), a la que p opo cionamos dos lis as
denominadas " a ge " y "backg ound". La lis a " a ge " con iene los genes di e encialmen e
up egulados o down egulados de los que se quie e conoce las ca ego ías GO en iquecidas
espec o al "backg ound". La lis a "backg ound" co esponde a odos los genes p esen es en
el mic oa ay, en nues o caso el A yme ix Mouse Gene 2.0 ST A ay. En ambos casos,
el p og ama usa á sólo aquellas sondas y genes que engan asignado una ca ego ía GO.
De cada ca ego ía GO ob enemos una lis a de genes, un FDR "q- alue" y un
"En ichmen (N,B,n,b)". P ocede emos a explica con más de alle es os úl imos
pa áme os.
GO illa ob iene el " alo P" según el modelo hipe geomé ico (hype geome ic,
HG). Una dis ibución hipe geomé ica es una dis ibución de p obabilidad disc e a
elacionada con mues eos alea o ios sin eemplazamien o. La asa de descub imien os
alsos (False Disco e y Ra e, FDR) es la co ección del " alo P" según el mé odo de
Benjamini y Hochbe g (1995), que ajus a el " alo P" eniendo en cuen a los e o es ipo I
( alsos posi i os) pa a múl iples es s. En esumen, el alo "FDR q- alue" ep esen a la
p opo ción espe ada de alsos posi i os en e aquellos elemen os que ue on signi ica i os.
El en iquecimien o "En ichmen (N,B,n,b)" se de ine como el núme o de eces
más que se encuen a un g upo GO espec o a lo espe ado. Po ejemplo, un alo de 2
signi ica que ese g upo GO es á el doble de ep esen ado espec o a lo espe ado.
N - núme o o al de genes en la lis a "backg ound".
B - núme o o al de genes que se encuen an asociados en la base de da os a un
de e minado é mino GO.
n - núme o de genes p esen es en la lis a " a ge ".
b - núme o de genes de la lis a " a ge " que se asocian al é mino GO.
El en iquecimien o se calcula como (b/n)/(B/N)
También se analizó el expe imen o de mic oa ay GSE13125 disponible de
mane a pública en las bases de da os. El obje i o del mic oa ay GSE13125 es de ec a
di e encias de exp esión as la ac i ación de PU.1. Pa a ello se emplean células PUER,
células p oceden es de p ecu so es hema opoyé icos mu inos a las que se ansduce
e o i almen e a exp esa PU.1 usionado con el ecep o de es ógenos. De es a mane a,
al añadi amoxi eno (ligando del ecep o de es ógenos) se p oduce la ac i ación de
PU.1. En el expe imen o, se ecoge la exp esión génica en condiciones basales y as 24
ho as de amoxi eno, en iplicados. Es os da os en o ma o .CEL los hemos analizado
median e la in e az Mic oa ay Я Us (Dai e al., 2012), usando el paque e Limma
(Smy h, 2004) y análisis es adís ico 1-way Ano a (Ano a de un ac o ).
3.7.3 Análisis de ARN mensaje o po RT-PCR.
Pa a el análisis de los ni eles ela i os de ARN mensaje o (ARNm) se u ilizó la
écnica de la Real Time-Polyme ase Chain Reac ion (RT-PCR) y el mé odo de análisis
3.!Ma e ial!y!Mé odos!
!
61
ΔΔC . Es e mé odo pe mi e cuan i ica la abundancia ela i a de un ARNm con espec o
a un gen de e e encia cuya exp esión no cambia en las condiciones expe imen ales, y que
se suele denomina housekeeping gene.
P ime o, una can idad de 0,5-1 µg de ARNm ue e o ansc i a a ADN
complemen a io (ADNc) usando iSc ip cDNA Syn hesis Ki (BioRad), siguiendo las
ins ucciones del ab ican e. Pos e io men e, se usa on 12,5-25 ng de ADNc pa a ealiza
la RT-PCR con 400 nM de cebado es especí icos y 15 µl de cóc el SYBR® G een PCR
Mas e Mix (SYBR G een 2X, Diagenode) en un olumen de eacción de 20 µl. La
ampli icación y de ección se lle ó a cabo en un e mociclado (iQTM5, Mul icolo Real-
Time PCR De ec ion Sys em, BioRad), y los da os se analiza on con iQ5 So wa e Da a
Analysis (BioRad). En odos los casos, la exp esión ela i a de ARNm se no malizó con
espec o a la exp esión endógena del gen 36B4.
3.7.4 Análisis de la inhibición de la exp esión génica median e
siRNA.
La ecnología del siRNA (small in e e ing RNA) se basa en que la unión de un
ARN complemen a io (el siRNA) a un ARN mensaje o impide su aducción, haciendo
que la exp esión absolu a del gen disminuya. En nues o caso, se ealiza on es udios con
los siguien es siRNA come ciales: con ol siRNA (Ambion 4390843), C/EBPα (sc-
37048), PU.1 (sc-36331 e In i ogen 5255362, con esul ados simila es), LXRα (sc-
38829), STAT5 (sc-29496). Pa a la ans ección se usa on células BMDM de 4 días de
di e enciación. Las células se la a on con PBS, le an a on con PBS-EDTA 10 mM, y se
semb a on en pla os de cul i o a ados de 60 mm (BD FALCON #353004) a 1,5 x 106
celulas en 2,5 ml de medio RPMI comple o + 1/3 medio L929. Al día siguien e, se
ans ec an las células con medio Op i-MEM I (Gibco #11058) y Lipo ec amine
RNAiMAX (In i ogen #13778-075) según las ecomendaciones del ab ican e.
B e emen e, se usa siRNA a una concen ación inal de 20 nM, en una mezcla con Op i-
MEM I y RNAiMAx, de la siguien e mane a:
Tubo A 300 µl Op i Mem I + siRNA
Tubo B 300 µl Op i Mem I + 10 µl RNAiMAX
T as 5 minu os, se mezclan los ubos A y B y la mezcla se deja eposa 25
minu os a empe a u a ambien e. En es e pe iodo, se p ocede al la ado de las células con
PBS. En onces se añade 1 ml de Op i-MEM I po pla o y 600 µl de mezcla A+B y se
deja ans ec a du an e 8 ho as. Pasado es e iempo, se pone 1600 µl de medio 2X
consis en e en RPMI 20 %+Ab. 2X+20 ng/ml M-CSF o GM-CSF, según el a amien o.
T as 48 ho as, se aísla el ARN con T izol pa a medi la exp esión génica.
!
62
3.8 Análisis de la Exp esión de P o eínas.
3.8.1 P epa ación de ex ac os p o eicos.
Las células se lisa on en bu e RIPA (10 mM T is-HCl (pH 7.5), 150 mM
NaCl, T i ón X100 1 %, deoxicola o sódico 0,5 %, SDS 0,1 % y un cóc el de inhibido es
de p o easas Comple e p o ease inhibi o cock ail, (Roche #11697498001). En las mues as
en las que se midió la os o ilación p o eica, el bu e con enía adicionalmen e cóc el de
inhibido es de os a asas (Sigma #P-2850 y #P-5726). Los ejidos se homogeniza on en
bu e RIPA en el i u ado Ul a-T u ax (IKA). A con inuación, los lisados de células o
ejidos se cen i uga on 5 minu os a 4ºC y 14.000 pm. Se sepa a on los sob enadan es y
se cuan i ica on según el mé odo del ácido bicinconínico (Smi h e al., 1985). Como
con ol de de ección de LXRα se usa on ex ac os de células RAW264.7 que
sob eexp esan LXRα-3FLAG, desc i as en la sección 3.3.2.a de Ma e ial y Mé odos.
3.8.2 Elec o o esis en geles de poliac ilamida (SDS-PAGE) y
Wes e n Blo .
Las p o eínas se sepa a on según su amaño median e elec o o esis en gel de
ac ilamida en condiciones desna u alizan es. Se empleó ac ilamida (Bio-Rad) con una
p opo ción 29:1 de ac ilamida:bisac ilamida. La elec o o esis se ealizó en cube as Mini
P o ean II® (Bio-Rad), con ampón de elec o o esis compues o po glicina 1.25 M, T is-
HCl 12mM y SDS 0.2 %.
Las p o eínas sepa adas en el gel de poliac ilamida se ans i ie on a memb anas
de ni ocelulosa (Blo ans e Medium, Bio Rad Labo a o ies) a un ampe aje cons an e de
400 mA, du an e 90 minu os, a 4º C en un medio de ans e encia cons i uido po T is
25 mM, glicina 192 mM y me anol 20 %, pH 8,3. Las memb anas se incuba on du an e
una ho a a empe a u a ambien e con una solución que con enía leche desna ada al 5 %
disuel a en TBS (T is–HCl, 50 mM pH 7.4, NaCl 200 mM), con el in de e i a uniones
inespecí icas de los an icue pos. Las memb anas se incuba on oda la noche a 4°C en
agi ación sua e con el an icue po p ima io diluido en solución de bloqueo al 1:2 en TBS-
T (Tampón salino de T is con el de e gen e Tween-20 al 0,1 %). Al día siguien e se
ealiza on 3 la ados de cinco minu os con TBS-T. Pos e io men e, las memb anas se
incuba on du an e una ho a a empe a u a ambien e con el an icue po secunda io que
lle a acopladas moléculas de pe oxidasa de ábano (Ho seadishpe oxidase, HRP). T as
ealiza o os es la ados, la p esencia de las p o eínas se e eló con luminol (ECL Plus,
Ame sham), un compues o que en su oxidación po la pe oxidasa emi e luminiscencia que
puede se de ec ada po exposición en una película o osensible o con el sis ema
ChemiDoc XRS (Bio-Rad). Los an icue pos empleados se desc iben en la Tabla 3.2.
3.8.3 Ci ome ía de Flujo.
El análisis de p o eínas de memb ana po ci ome ía de lujo cons i uye un
mé odo e icaz y p eciso que pe mi e cuan i ica y compa a la exp esión de de e minados
ma cado es celula es en e a ias mues as, y de e mina dis in as poblaciones celula es.
!
!
RESULTADOS
4.

!
!
! !
71
RESULTADOS
_______________________________________________________________
4.1 Es udio de las poblaciones de mac ó agos del bazo.
Tal y como se de alló en la in oducción, el es oma del bazo se di ide en pulpa
oja y pulpa blanca, delimi adas ambas egiones po la zona ma ginal. Las p incipales
poblaciones de mac ó agos en el bazo se co esponden con los mac ó agos me alo ílicos de
la zona ma ginal (MMM), ca ac e ís icos po la ele ada exp esión de CD169 o
Sialoadhesina (CD169+), los mac ó agos de la zona ma ginal (MZM) que des acan po
se SIGNR1+, MARCO+ y Tim-4+, los mac ó agos de la pulpa blanca que son CD68+ y
los mac ó agos de la pulpa oja, dis inguibles po su exp esión de F4/80+. Po o o lado,
un núme o c ecien e de publicaciones demues an la impo ancia del ecep o nuclea
LXR en la biología del mac ó ago, p incipalmen e en el con ex o del anspo e de lípidos
y con ol de la espues a in lama o ia (Joseph e al., 2003) y la e i ada de células
apop ó icas (Alonso-Gonzalez e al., 2009).
Con el obje i o de es udia la in luencia de LXR sob e las poblaciones de
mac ó agos esplénicos, ealizamos inciones inmunohis oquímicas de bazos p oceden es
de a ones WT, LXRα-/-, LXRβ-/- y LXR-DKO -ca en e de ambas iso o mas-. De es a
mane a, pudimos comp oba el no mal desa ollo de la población de mac ó agos de la
pulpa oja (F4/80+) en a ones de odos los geno ipos (Ve Figu a 4.1A). Sin emba go,
obse amos que los bazos de a ones que no exp esan LXRα, en conc e o los geno ipos
LXRα-/- y LXR-DKO, ca ecen de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal
MMM y MZM, mien as que los a ones con geno ipos que exp esan LXRα como WT y
LXRβ-/-, p esen an ambas poblaciones bien de inidas ( e Figu a 4.1.B).
Con es e expe imen o pudimos conclui que la exp esión de LXRα es esencial
pa a la o mación de cie as poblaciones de mac ó agos en el bazo, en conc e o MMM y
MZM, pe o no de o as, como los mac ó agos de la pulpa oja.
4.2 Es udio de las señales de o mación de la zona ma ginal del
bazo.
P ocedimos en onces a ealiza una búsqueda bibliog á ica sob e ías de
señalización impo an es pa a la o mación de las poblaciones de mac ó agos de la zona
4.
!
72
!
!
A.!
LAMININA
F4/80
Figu a'4.1.'Las'poblaciones' de' mac ó agos' de' la' zona' ma ginal' del' bazo' dependen' de' LXRα'
pa a'su'desa ollo.'
Tinciones!inmunohis oquímicas!de!las!poblaciones!de!mac ó agos!esplénicos!en!bazos!p oceden es!de! a ones!
WT,!LXRα_/_,!LXRβ_/_!y!LXR_DKO.!
Panel!A.!Inmunode ección! de!Laminina!(azul)!y! F4/80!(ma ón)!en! la! que! no!se! ap ecian!di e encias!en!la!
población!de!mac ó agos!de!la!pulpa! oja!(F4/80+)!en e!geno ipos.!!
Panel! B.!!Inmunode ección! de! Ma co! (azul)! y! CD169!(ma ón)! en! la! que! se! ap ecia! la! ausencia! de! las!
poblaciones! de! mac ó agos! me alo ílicos! de! la! zona! ma ginal! (MMM,! CD169+)! y! de! mac ó agos! de! la! zona!
ma ginal!(MZM,!MARCO+)!en!los!geno ipos!ca en es!de!LXRα!(LXRα_/_!y!DKO).!
Los!da os!son! ep esen a i os!de!4!expe imen os!con!n=3_5! a ones!po !g upo.!La!ba a! ep esen a!50!μm.!
WT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXRα–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXR_DKO!
MARCO
CD169
WT!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXRα–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
!
LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!LXR_DKO!
B.!
4.!Resul ados!
!
73
ma ginal en el bazo. Encon amos que los a ones pl /pl , que ca ecen de la exp esión
uncional de las quimoquinas CCL19 y CCL21, p esen an un meno núme o de
mac ó agos MZM en compa ación con a ones no males C57BL/6, debido a un de ec o
en la localización (A o e al., 2004). Es deci , exis e un meno núme o de mac ó agos en
la zona ma ginal po que las señales in oluc adas en su localización ana ómica es án
ausen es.
Po an o, nos p egun amos si la ausencia de mac ó agos de la zona ma ginal
en los a ones que ca ecen de LXRα pod ía ene elación con un de ec o en las ci oquinas
esponsables de la localización de los mac ó agos, es deci , del mic oambien e de
señalización esplénico.
Es udios p e ios de nues o labo a o io nos pe mi ie on conoce que en a ones
la localización de los mac ó agos en la zona ma ginal ocu e ap oximadamen e en la
e ce a semana del desa ollo pos na al. Consecuen emen e, aislamos bazos de a ones
WT y LXR-DKO ecién nacidos de 1, 2 y 3 semanas de edad, y medimos la exp esión de
CCL19 y CCL21 median e RT-PCR. Como se puede obse a en la igu a 4.2, la
exp esión de es as quimioquinas aumen a con la edad, pe o no se obse an di e encias
en e ambos geno ipos que pudie an explica la ausencia de poblaciones de mac ó agos de
la zona ma ginal. Tampoco obse amos di e encias en la exp esión de LTα (lympho oxin
α) y su ecep o , LTBR (lympho oxin
β
ecep o ), moléculas que in e ienen en la
o mación de los ó ganos lin oides (Tumano e al., 2003). Po o o lado, la exp esión de
LXRα aumen a de mane a pa alela a la o mación de la zona ma ginal, de mane a simila
al pa ón de exp esión de Tim-4 -un ma cado de los mac ó agos de la zona ma ginal
MZM- i ualmen e ausen e en bazos de a ones LXR-DKO.
Es os esul ados indican que la exp esión de las quimioquinas CCL19 y
CCL21 implicadas en la o ganogénesis lin oide y localización de los mac ó agos de la
zona ma ginal no p esen a g andes di e encias que pudie an explica el eno ipo
obse ado.
4.3 Expe imen os de esca e de eno ipo de la zona ma ginal.
LTα es una ci oquina de la amilia de TNF que in e iene en el desa ollo de
los ó ganos lin á icos, o ganización y man enimien o del mic oambien e lin oide y en el
p oceso de in lamación (Wa e, 2005). Los a ones de icien es en lin o oxina LTα ca ecen
de zona ma ginal, pe o a di e encia de los a ones ca en es de LXRα, p esen an de ec os
adicionales en los ganglios lin á icos que no obse amos en los a ones LXRα-/-. Es e
eno ipo es debido al papel de la lin o oxina LTα en la quimio axis y localización, es deci ,
LTα p opo ciona las señales ap opiadas pa a la localización de los ipos celula es
in oluc ados en la o ganización de los ó ganos lin oides secunda ios como bazo y ganglios
lin á icos. Es impo an e ene en cuen a que los asplan es de médula ósea de a ones
WT a a ones de icien es en LTα no consiguen ecupe a las poblaciones de la zona
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Exp esión!Rela i a!de!ARNm!
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0,0!
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1,5!
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3,0!
Exp esión!Rela i a!de!ARNm!
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25!
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Exp esión!Rela i a!de!ARNm!
0!
10!
20!
30!
40!
50!
60!
Exp esión!Rela i a!de!ARNm!
LTA!
LTBR!
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CCL19!
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0!
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10!
15!
20!
25!
30!
Exp esión!Rela i a!de!ARNm!
Figu a' 4.2.' La' exp esión' de' ci oquinas' implicadas' en' la' o mación' del' bazo' y' la' zona'
ma ginal'no'p esen a'di e encias'en e'WT'y'DKO.'!!
Se!es udió!los!ni eles!de!exp esión!de!CCL19,!CCL21,!LTA,!LTBR,!LXRα
!y!TIM_4!en!bazos!de! a ones! ecién!
nacidos!de!1,!2!y!3!semanas!de!edad!WT!y!LXR_DKO.!La!exp esión!de! odos!ellos!aumen a!con!la!edad!sin!
di e encias!signi ica i as!en e!geno ipos,!sal o!la!exp esión!de!LXRα!y!TIM_4.!Se!indica!la!media!
±!SD!de!
es!expe imen os!independien es.!*!p<0,05.!
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WT!
DKO!
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LXRα!
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TIM_4!
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*!
CCL21!
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4.!Resul ados!
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75
ma ginal (Tumano e al., 2003), p obablemen e debido a que es e de ec o en la
señalización no pe mi e a los p ecu so es localiza se donde deben.
Con el obje i o de comp oba si las poblaciones de mac ó agos de la zona
ma ginal se podían ecupe a en a ones ca en es de exp esión de LXRα, asplan amos
médula ósea p oceden e de a ones WT, LXRα-/-, LXRβ-/- y LXR-DKO a a ones LXR-
DKO. Comp obamos que el asplan e con médula ósea de a ones que exp esan LXRα
(en conc e o WT y LXRβ-/-) pe mi e la ecupe ación de los mac ó agos de la zona
ma ginal en a ones LXR-DKO (Ve Figu a 4.3A), e ec o que no se obse a cuando los
donan es de medula ósea son a ones ca en es de LXRα como LXRα-/- y LXR-DKO. Po
o o lado, la población de mac ó agos de la pulpa oja F4/80+ no se e a ec ada po la
p esencia o ausencia de LXR (Ve Figu a 4.3B).
Es os esul ados apoyan la idea de que el mic oambien e de señalización en el
bazo de los a ones ca en es de LXRα es co ec o y po ello los p ecu so es de la médula
ósea que exp esan LXRα son capaces de epobla la zona ma ginal de a ones LXR-
DKO. Es o nos pe mi e o mula la hipó esis de que la acción de LXRα debe ocu i a
ni el de es os p ecu so es hema opoyé icos.
4.4 Modelo de depleción de las poblaciones de mac ó agos po
clod ona o.
El clod ona o es un bis os ona o, una sus ancia que al se cap ada po los
mac ó agos se ans o ma en un análogo óxico del ATP que causa la mue e celula po
apop osis. Pa a acili a la cap ación y agoci osis, las moléculas de clod ona o se
adminis an incluidas den o de liposomas. Con el obje i o de es udia la in luencia de
LXR en la ciné ica de epoblación de las poblaciones de mac ó agos del bazo, se
adminis ó liposomas de clod ona o a dis in as coho es de a ones pa a p omo e
p ime o la desapa ición de dichas poblaciones. Pos e io men e, a amos a los a ones con
un agonis a de LXR pa a induci su ac i ación y obse a su in luencia en la epoblación.
Según es udios an e io es, as un a amien o de liposomas con clod ona o la
epoblación de los mac ó agos de la pulpa oja ocu e en 2 semanas ap oximadamen e,
mien as que la epoblación de los mac ó agos de la zona ma ginal ocu e a lo la go de 4
semanas ( an Rooijen e al., 1989). Los liposomas, que con enían clod ona o o PBS como
con ol, se adminis a on po ía in ape i oneal a a ones LXRβ-/- y LXRα-/-. T as 48
ho as se sac i icó una pa e de los a ones y se comp obó la e icacia del clod ona o en
induci la desapa ición de mac ó agos en el bazo. E ec i amen e, se comp ueba que el
clod ona o consigue elimina an o las dos poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal
(CD169+ y MARCO+) como los mac ó agos de la pulpa oja (F4/80+) ( e Figu a 4.4).
T as dos semanas, a los es an es a ones se les adminis ó una dosis del
agonis a de LXR (GW3965) o ehículo cada 2 días. T as una semana de a amien o con
GW3965 (3 semanas desde el a amien o con clod ona o), se sac i ica on los a ones y se
!
76
Figu a'4.3.'T asplan es'con'médula'ósea'de' a ones'que'exp esan'LXRα'pe mi en' ecupe a '
las'poblaciones'de'mac ó agos'de'la'zona'ma ginal'del'bazo.'
Tinciones!inmunohis oquímicas!de! bazos!p oceden es!de! a ones!DKO!a! los!que!se!ha! asplan ado!con!
médula!ósea!de! a ones!WT,!LXRα_/_,!LXRβ_/_!o!DKO,!según!se!indica.!
Panel!A.!Se!obse a!la! ecupe ación!de!las!poblaciones!de!mac ó agos!de!la!zona!ma ginal!en!los! a ones!
asplan ados!con!médula!ósea!p oceden e!de!geno ipos!que!exp esan!LXRα!(WT!y!LXRβ_/_).!
Panel!B.1La!población!de!mac ó agos!de!la!pulpa! oja!F4/80+!pe manece!inal e ada.!
Los!da os!son! ep esen a i os!de!2!expe imen os!con!n=6! a ones!po !g upo.!La!ba a! ep esen a!50!μm.!
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DKO!!!!!!!!!DKO!
WT!!!!!!!!!!DKO!
A.!
MARCO
CD169
LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!DKO!
LXRα
–/–!!!!!!!!!!!!!!
DKO!
LXRβ–/–!!!!!!!!!!!!!DKO!
LXRα
–/–!!!!!!!!!!!!!!
DKO!
DKO!!!!!!!!!DKO!
WT!!!!!!!!!!DKO!
B.!
LAMININA
F4/80
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PBS$48h
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Clo+Lip
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$48h
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LXRβ
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LXRα
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LXRβ
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LXRβ
–/–
LXRα
–/–
LXRα
–/–
CD169&
MARCO&
F4/80&
Figu a'4.4.'La'ac i ación' a macológica'de'LXRα'acele a'la'ciné ica'de' epoblación'de'las'
poblaciones'de'mac ó agos'del'bazo.!!
La! ac i ación! de! LXRα! con! el! ligando! sin é ico! GW3965! aumen a! sensiblemen e! la! elocidad! de!
epoblación!de!los!mac ó agos!de!la!zona!ma ginal!CD169+!y!MARCO+
,!mien as!que!la! epoblación!de!los!
mac ó agos!de!la!pulpa! oja!F4/80+!es!independien e!de!es a!ac i ación.
Imágenes! ep esen a i as!de!un!expe imen o!con!5! a ones!po !g upo. Escala!150!μm.
Clo+Lip$
$3$semanas
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+$DMSO$$
Clo+Lip
$
3$semanas$
+$GW3965$$
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es udia on las poblaciones de mac ó agos esplénicos. Median e inmunohis oquímica, se
obse a que los mac ó agos de la pulpa oja F4/80+ se han ecupe ado de mane a e icien e
independien emen e de LXRα. Sin emba go, se obse a una mayo ecupe ación de la
zona ma ginal en a ones a ados con GW3965, al y como indican los ma cado es
CD169 y MARCO, con espec o a los a ones a ados con ehículo. Además, es a
ecupe ación es dependien e de LXRα ya que sólo se obse a en los a ones LXRβ-/- y no
en a ones LXRα-/- (Ve Figu a 4.4).
Es a ap oximación nos pe mi e comp oba que LXRα es impo an e en la
ecupe ación de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal as un a amien o
ago óxico, y que es e p oceso se puede acele a median e ac i ación a macológica.
4.5 Gene ación de una cepa de a ones ca en es de LXRα en las
células hema opoyé icas (LXRα l/ l/Va -iC e+/-).
Con el obje o de con i ma el papel de LXRα en los p ecu so es de la médula
ósea, gene amos un modelo mu ino ca en e de la exp esión de LXRα en células
hema opoyé icas. Pa a ello, se ealiza on una se ie de c uces en e a ones con el gen de
LXRα " loxeado" (LXRα l/ l) y a ones con el gen de Va -iC e, al y como se de alla a
con inuación.
P ime o, pa a ob ene a ones homocigo os LXRα l/ l, se c uza on a ones
he e ocigo os LXRα l/+ en e sí ( e Figu a 4.5A). Pa a aumen a el núme o de
indi iduos, ambién se debie on de c uza los a ones Va -iC e en e sí. Es de des aca
que po la na u aleza del geno ipado de es e gen es imposible dis ingui homocigo os de
he e ocigo os, po lo que emplea emos el símbolo Va -iC e+/ pa a designa a los
po ado es ( e Figu a 4.5B). En cualquie caso, una única copia del gen es su icien e pa a
escindi la egión loxeada (de Boe e al., 2003).
Finalmen e, se ealiza on los c uces 1 y 2 desc i os en la sección 3.1.2 de
Ma e ial y Mé odos pa a ob ene los a ones LXRα l/ l/Va -iC e+/- ( e Figu a 4.6). Pa a
el geno ipado del c uce LXRα l/ l/Va -iC e+/- se empleó ADN de células de la médula
ósea. En la cola de a ón no se obse a la escisión, po que Va -iC e sólo se exp esa en
células hema opoyé icas.
Pa a comp oba el g ado de escisión se es udió la exp esión a ni el de ARNm
de LXRα en dis in os ejidos. Obse amos que en ó ganos en los que la mayo ía de
células ienen un o igen hema opoyé ico como el bazo y en células de i adas de la médula
ósea (BMDM), la exp esión de LXRα ha sido p ác icamen e anulada, pe o en o os
ó ganos como el hígado en los que el po cen aje de células hema opoyé icas es mucho
meno la exp esión de LXRα se conse a ( e Figu a 4.7A). Además, como es de espe a ,
sólo los a ones homocigo os LXRα l/ l/Va -iC e+/ p esen an deleción o al de LXRα
4.!Resul ados!
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Va _iC e!_/!!
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Va _iC e!+/!!
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LXRα l/ l!
Va _iC e!+/!!
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A.!
B.!
C.!
Figu a'4.10.'La' o mación'de'la'zona'ma ginal'demues a'haplosu iciencia'(I).'
Iden i icación!de!mac ó agos!de!la!pulpa! oja!(F4/80+,!en! e de)!y!mac ó agos!de!la!zona!ma ginal!(SIGNR_
1+
,!en! ojo).!Como! e e encia!se!usó!un!ma cado !de!láminas!basales!(Laminin,!en!azul).!En!el!Panel!B!se!
obse a!que!los! a ones!he e ocigo os!(LXRα l/ l!y!Va _iC e+/),!los!cuales!exp esan!un!ni el!in e medio!de!
LXRα!( igu a!4.6!y!4.7),!p esen an!una!población!no mal!de!MZM.!!
La!ba a! ep esen a!50!μm.!Se!mues a!un!expe imen o! ep esen a i o!de,!al!menos,!o os! es!po !g upo.
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Laminin1
SIGNR11F4/801

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Figu a'4.11.'La' o mación'de'la'zona'ma ginal'demues a'haplosu iciencia'(II).''
Iden i icación! simul ánea!de! las!dos!poblaciones!de!mac ó agos! de! la!zona!ma ginal!(MMM! CD169+
,!en!
e de!y!MZM!Ma co+
,!en! ojo).!Como! e e encia!se!usó!un!ma cado !de!núcleos!(DAPI,!en!azul).!!En!el!Panel!
B.!se!obse a!que!los! a ones!he e ocigo os!(LXRα l/ l!y!Va _iC e+/),!los!cuales!exp esan!un!ni el!in e medio!
de!LXRα!( igu a!4.6!y!4.7),!p esen an!poblaciones!no males!de!MMM!y!MZM.!!
La!ba a! ep esen a!50!μm.!Se!mues a!un!expe imen o! ep esen a i o!de,!al!menos,!o os! es!!po !g upo.
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A.!
LXRα l/ l!
Va _iC e!_/!!
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LXRα l/_!
Va _iC e!+/!!
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LXRα l/ l!
Va _iC e!+/!!
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B.!
C.!
DAPI1CD1691MARCO11
4.!Resul ados!
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células hema opoyé icas es su icien e pa a el desa ollo de las poblaciones de mac ó agos
de la zona ma ginal, enómeno conocido como haplosu iciencia.
4.7 Recons i ución de la ac i idad de LXRα en p ogeni o es
hema opoyé icos median e Len i i us.
Pa a ahonda en el es udio de la o mación de la zona ma ginal y de la
señalización dependien e de LXRα, es ablecimos un modelo de ganancia de unción de
LXRα. Pa a ello, econs i uimos la exp esión de LXRα en HSCs de a ones LXRα-/-
usando un sis ema len i i al especí ico de células mieloides (Li e al., 2011). Es os
len i i us es án pseudo ipados con la glicop o eína de la en uel a del i us de la
es oma i is esicula (VSVg), lo que les con ie e un al o opismo y po an o, capacidad
pa a ansduci muchos ipos celula es di e en es. Po o o lado, el p omo o sin é ico SP
(Syn he ic P omo e ) que di ige la exp esión del gen se ac i a sólo en células mieloides, po
lo que la exp esión de LXRα es a á es ingida a dicho linaje, al y como se de alla en la
sección 3.6 de Ma e ial y Mé odos. Como con ol de la exp esión se empleó un len i i us
que en luga de LXRα con iene la p o eína e de luo escen e GFP (G een Fluo escen
P o ein), cuya p esencia es ácilmen e de ec able.
P ime o, examinamos la exp esión de GFP en monoci os de animales LXRα-/-
asplan ados con medula ósea en iquecida con HSCs ans ec adas con Len i-SP-GFP o
Len i-SP-LXRα. Obse amos que as 8 semanas, en e un 30 % a un 40 % de los
monoci os de sang e pe i é ica son GFP+ ( e Figu a 4.12). Es os da os indican que la
ans ección de las células HSCs con el len i i us ha dado luga a un po cen aje sus ancial
de monoci os sanguíneos ans ec ados, po lo que, a las 12 semanas, p ocedimos a
es udia la econs i ución de la zona ma ginal de es os a ones. Los análisis de secciones
de bazo mues an una ecupe ación pa cial en los a ones asplan ados con células
a adas con len i-SP-LXRα de ambas poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal
según los ma cado es CD169, Ma co y Tim-4, mien as que los a ones asplan ados con
HSCs a adas con len i-SP-GFP ca ecen de las poblaciones de mac ó agos de la zona
ma ginal, en consonancia con nues a hipó esis inicial ( e Figu a 4.13).
Con es os esul ados mos amos que la e-in oducción del gen LXRα en
células de médula ósea LXR-de icien es es su icien e pa a, median e asplan e, induci
una ecupe ación de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal.
4.8 Es udio de la agoci osis de plaque as opsonizadas en la Zona
Ma ginal.
Como pa e de o os es udios ealizados en nues o labo a o io, habíamos
comp obado la g an capacidad de los mac ó agos de la zona ma ginal pa a agoci a
an ígenos sanguíneos ales como dex ano o pa ículas de S. au eus (A-Gonzalez e al.,
2013). A con inuación, nos p opusimos es udia el papel de los mac ó agos de la zona
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Figu a' 4.12.' Ra ones' LXRαH/H' asplan ados' con' HSCs' ans ec adas' con' Len iHSPHGFP'
mues an,'8'semanas'después,'en' o no'al'40'%'de'monoci os'en'sang e'GFP'posi i os.!!
Siguiendo! el! p ocedimien o! desc i o! en!Ma e ial! y! Mé odos! (sección! 3.8.3),! los! monoci os! ob enidos! a!
pa i ! de! la! sang e! de! a ones! LXRα_/_! ue on! de ec ados! median e! ci ome ía! de! lujo.! El! núme o!
mos ado! den o! de! la! zona! enma cada! en! azul! (de echa)! indica! el! po cen aje! de! células! GFP+! de! la!
población!CD115+!(izquie da).!!
Se!mues a!un!expe imen o! ep esen a i o!de!o os! es,!cada!uno!de!ellos!con!n=4_5! a ones!po !g upo.!
Ly6C
CD115
GFP
10
4
10
3
10
2
10
1
10
4
10
3
10
2
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1
101
102
103
104
101
102
103
104
0.5
38
Con ol
Len i_GFP
4.!Resul ados!
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LXRα–/–!
+"Len i_GFP
LXRα
–/–
+"Len i+LXRα
Figu a' 4.13.' Recupe ación' pa cial' de' las' poblaciones' de' MMM' (CD169
+
)' y' MZM'
(MARCO+/TimH4+)'en' a ones' asplan ados'con'HSCs' a adas'con'len iHSPHLXRα.!!
Los!bazos!de! a ones!LXRα!_/_! a ados!con!len i i us!se! ecolec a on! as!12!semanas!y!se! ealizó!una!
inmunode ección! luo escen e!según! se!desc ibe!en! Ma e ial!y!Mé odos!(sección! 5).!En! azul! se! mues a!
Laminin.!En! ojo!se!mues a!en!el!Panel!A.!CD169,!en!el!Panel!B.1MARCO!y!en!el!Panel!C.!Tim_4.'!
La!ba a! ep esen a!100!μm.!Imágenes! ep esen a i as!de!2!expe imen os!independien es!con! esul ados!
simila es,!con!n=4_5! a ones!po !g upo.!
Laminin11111!CD1691
Laminin11111!MARCO1
Laminin11111!TimI41
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Figu a'4.14.'Cap u a'de'plaque as'opsonizadas'en'la'Zona'Ma ginal.'
Inmuno luo escencia! de!secciones! se iadas! de!bazo! de! a ones! WT! y! LXR_DKO!a!los!que!se!les!inyec ó!
plaque as!opsonizadas! en e!a!CD41,!según!se!explica!en!Ma e ial!y!Mé odos!sección!3.5.1.!!
Panel! A.!El! econocimien o! de! las! plaque as! opsonizadas! po ! CD41! se! e eló! usando! un! an icue po!
secunda io! an i_ a a! AF488.!La!unión! inespecí ica! del! secunda io! se! alo ó! en! a ones! a! los! que! se! les!
inyec ó!plaque as!sin!opsoniza .!Como!ma cado !de!la!zona!ma ginal!se!usó!SIGNR1!(en! ojo).!La!ba a!
ep esen a!300!µm.!!
Panel!B.!Las!plaque as!se!ma ca on!con!cell acke _CMTPX!p e io!a!su!opsonización,!lo!que!les!con ie e!un!
colo ! ojo.!Como!ma cado !de!la!zona!ma ginal!se!usó!Ma co!(en! e de).!La!ba a! ep esen a!120!µm.!
Las! o os!son! ep esen a i as!de!3!expe imen os!independien es!con!5! a ones!po !g upo.!
DKO!
WT!
WT!
DKO!
CD411
CD411
MARCO1
MARCO1
CMTPXIPlaque as1
CMTPXIPlaque as1
SIGNR11
SIGNR11
A.!
B.!

4.!Resul ados!
!
91
ma ginal en la agoci osis de plaque as en un modelo mu ino de Pú pu a
T omboci opénica Idiopá ica (cuyas siglas en inglés son ITP), una en e medad con una
p e alencia de 9,5 casos po cada 100.000 pe sonas en los EEUU (Michel, 2009), que se
ca ac e iza po un bajo con aje de plaque as y médula ósea no mal, en la que hay una
des ucción ele ada de plaque as po au oan icue pos en e a an ígenos de memb ana
plaque a ios (Geo ge e al., 1994).
P ocedimos a aisla plaque as de sang e de a ones donan es y las opsonizamos
con un an icue po en e a la in eg ina gpαIIb (CD41), si uada en la supe icie de plaque as
(Mizu ani e al., 1993), al y como se desc ibe en la sección 3.5.1 de Ma e ial y Mé odos.
Las plaque as opsonizadas se inyec a on en a ones WT y DKO, y como p ocedimien o
con ol se inyec a on plaque as sin opsoniza . T as 90 minu os, se aisla on los bazos y se
e eló la p esencia de CD41 median e un an icue po secunda io especí ico y la población
de mac ó agos de la zona ma ginal con un an icue po en e a SIGNR1. Se obse a que
las plaque as opsonizadas son cap u adas de o ma mayo i a ia en la zona ma ginal en
a ones WT, mien as que en a ones LXR-DKO, en los que no hay mac ó agos de zona
ma ginal, las plaque as opsonizadas se obse an dispe sas po la pulpa oja (Ve Figu a
4.14A).
Pa a co obo a los esul ados ob enidos, p ocedimos a ealiza un expe imen o
adicional con un en oque di e en e. En ez de de ec a el an icue po an i-CD41 que
opsoniza a las plaque as, la de ección la conseguimos ma cando a las plaque as con
CMTPX, un p oduc o luo escen e no óxico capaz de ma ca células in i o. De es a
mane a, as la opsonización e inyección, pudimos de ec a de mane a di ec a los luga es
en los que se acumulan las plaque as opsonizadas. Pudimos comp oba que, al igual que
en el caso an e io , las plaque as colocalizan con mac ó agos de la zona ma ginal
(MARCO+) en a ones WT, mien as que en a ones LXR-DKO las plaque as se
encuen an dispe sas po la pulpa oja (Ve Figu a 4.14B).
Po an o, hemos podido comp oba que los mac ó agos de la zona ma ginal no
sólo son impo an es en la cap u a de bac e ias y cue pos ex años, sino que con ibuyen a
la cap u a de células p opias opsonizadas, enómeno posible en en e medades
au oinmunes como la ITP.
4.9 Es udio ansc ipcional en Mac ó agos en espues a a M-CSF
o GM-CSF.
Los esul ados has a aquí p esen ados, así como o os expe imen os ealizados
en nues o labo a o io, pa ecen demos a que los p ogeni o es de las poblaciones de
mac ó agos de la zona ma ginal p oceden de la médula ósea. Además, hemos mos ado
que la ausencia de exp esión de LXRα en es os p ogeni o es hema opoyé icos es la que
impide la o mación de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal, al y como se
obse a en los a ones LXRα l/ l/Va -iC e+/- y en los a ones LXRα-/- asplan ados con
médula ósea econs i uida con Len i i us-LXRα, y que la ac i ación a macológica acele a
la ciné ica de epoblamien o en a ones con ac i idad LXRα.
!
92
Con el obje o de es udia las u as génicas gobe nadas po LXRα que nos
pe mi a p o undiza en el conocimien o de es os enómenos, nos plan eamos un es udio
ansc ipcional empleando como modelo la di e enciación in i o de p ogeni o es de
médula ósea en p esencia o ausencia de LXRα. Pa a ello, es udiamos median e mic oa ay
la exp esión génica de monoci os de i ados de médula ósea (BMDM) p oceden es de
a ones WT y LXRα-/- a los que se es imuló du an e 24 ho as con las ci oquinas M-CSF,
GM-CSF o ehículo, de mane a simila a la ap oximación desc i a en Flee wood e al.,
2007. De es a mane a, p e endemos sus ancia el papel egula o io de LXRα sob e los
genes modulados po es as ci oquinas.
4.9.1 Exp esión génica en espues a a M-CSF.
T as la es imulación de células BMDM con M-CSF ecombinan e mu ina
du an e 24 ho as, un o al de 222 genes se encuen an inducidos de mane a común en
ambos geno ipos con espec o al con ol sin a a , mien as que se inducen de mane a
di e encial 74 genes en WT y 78 genes en LXRα-/- ( e Figu a 4.15A).
La exp esión de cada uno de los genes se ep esen a en la Figu a 4.15B en
o ma de código de colo es (hea map), así como la exp esión y el nomb e de los 20 genes
más inducidos de cada g upo en la Figu a 4.15C. El análisis de la On ología Génica
(GO) indica que el p oceso más ep esen ado po los genes cuya exp esión es inducida po
M-CSF es el de la di isión celula (cell di ision), an o en los genes inducidos en WT
como en los genes inducidos en LXRα-/- y en los genes inducidos en ambos, al y como se
obse a en la Tabla 4.1. O as ca ego ías di e encialmen e ep esen adas co esponden a
genes in oluc ados en el man enimien o de la eplicación del ADN (main enance o ideli y
in ol ed in DNA-dependen DNA eplica ion) y genes con ac i idad helicasa (helicase
ac i i y).
De mane a exclusi a en LXRα-/- se encuen an inducidos genes in oluc ados
en la ac i idad quimioquina (chemokine ac i i y) y espues a in lama o ia (in lamma o y
esponse) (Tabla 4.1), lo que sugie e que las células BMDM ca en es del ecep o nuclea
LXRα p esen an una mayo espues a p oin lama o ia a M-CSF.
Po o o lado, la es imulación con M-CSF conduce a la ep esión de la
exp esión de 5 genes de mane a común en WT y LXRα-/-, 8 genes en WT y 25 en
LXRα-/- ( e Figu a 4.16). Debido al bajo núme o de genes ep imidos, el análisis GO en
es e caso no nos apo a ca ego ías signi ica i amen e eguladas.
Po an o, el a amien o de células BMDM con la ci oquina M-CSF iene
como e ec o p incipal la inducción de genes in oluc ados mayo i a iamen e en la di isión
celula .
4.!Resul ados!
!
93
!
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Figu a' 4.15.' Diag ama' de' Venn' y' Mapa' de' Calo ' de' los' genes' up egulados' po ' MHCSF'en'
células'BMDM'WT'y'LXRαH/H'.'
T as! 7! días! de! di e enciación,! las! células! BMDM! se! a a on! con! M_CSF!du an e! 24h! y! se! analizó! la!
exp esión!génica!con! espec o!al!con ol!sin! a a ,! al!y!como!se!de alla!en!Ma e ial!y!Mé odos!sección!
3.3.1.a.!!
Panel!A.!Diag ama!de!Venn!que!pe mi e! isualiza ! es!g upos!de!genes:!genes!inducidos!exclusi amen e!
en! WT! (n=74),! genes! inducidos! de! mane a! común! en! ambos! g upos! (n=222)! y! genes! inducidos!
exclusi amen e!en!LXRα_/_!(n=78).!
Panel! B.!Mapa!de!calo !
de!los!genes!inducidos!po !M_CSF!en!células!BMDM!WT!(columna!izquie da)!y!
LXRα_/_!(columna!de echa).!Se! ep esen a!la!exp esión!de!los!genes!ag upados!según!el!Diag ama!de!Venn!
del!Panel!A.!!
Panel! C.!Mapa! de! calo ! de! los! 20! genes! con! mayo ! di e encia! de! exp esión! con! espec o! al! con ol!
ag upados!según!el!Diag ama!de!Venn!del!Panel!A.!!
Valo es!de!exp esión!en!escala!loga í mica.!
!
LXRαI/I1
WT1
Comunes1
WT!
n=74!!
!
LXRα
_/_!
n=78!
!
Comunes!
n=222!
!
!!WT!!!!!!!!!!LXRα_/_!
!
!WT!!!!!!!!!!!
LXRα_/_!
!
WT!
!
!
Comunes!
!
B.!
A.!
C.!
LXRα
_/_!
!
!
94
!
TABLA'4.1.'El'análisis'on ogénico' e ela'que'el' a amien o'con'MHCSF'induce'la'exp esión'p incipalmen e'de'
genes'de'la'di isión'celula .!!
Selección!de!ca ego ías!GO!signi ica i amen e!en iquecidas!en!cada!uno!de!los! es!g upos!es ablecidos!po !el!Diag ama!de!Venn!
(Figu a! 4.12).! Desc ipción! de alla! del! FDR! q_ alue! y! En ichmen ! en! el! apa ado! de! Ma e ial! y! Mé odos! sección! 3.7.2.! En! la!
columna!"Abundancia"!se! ep esen a!en!un!g á ico!el!núme o!de!genes!de!cada!g upo!("WT"!en!neg o,!"Comunes"!en!g is!y!
"LXRα!_/_"!en!blanco)!p esen es!en!cada!ca ego ía!GO.!
!
GO !
!
!
Desc ipción!
!
WT
Comunes
LXRα -/-
Abundancia!
!
!
!
!
!
!
GO:0051301!
1
1
1
1
1
1
cell1
di ision1
!
Syce2,Nek2,Ska1,!
Nup43,Cenpw,Cdca3,!
Ube2c,Cks1b.!
!
!
Cenph,Cdca7,Mas l,Zwilch,Kn c1,Dsn
1,Wee1,Cdca2,Lig1,Nu 2,Fbxo5,Ci ,!
Tipin,Spc25,Sgol1,Au kb,Au ka,!
Cdca5,Racgap1,Casc5,Ki 18b,Mad2l1,
Top2a,F630043A04Rik,Ncaph,Spag5,
Ncapd2,Cdc6,Ki 11,Plk1,E cc6l,!
Mcm5,Tpx2,Ccna2,Cep55,Anln,Ec 2,!
Ccne1,Ccnd2,Ccnd1,Ccnb1,Smc2,!
Ccn ,Cks2,Ccne2,Ndc80,Cdc7,!
6720463M24Rik,Ki 2c,!
Cdk1,Cdc25c,Ki 20b,Cdc45,P c1,!
Bub1b,Bub1,Hells,Nsl1,Nusap1,!
Bi c5,!Oip5.!
!
!
Fam83d,Cenpe,Ccnb2,Cdca8,!
Sgol2,Cdc25a,Cenp ,!
!
FDR!
q_ alue!
4.95E_2!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
6.83!
(21400,353,71,8)!
FDR!
q_ alue!
2.85E_54!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
16.96!
(21400,353,218,61)!
FDR!
q_ alue!
9.63E_2!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
5.66!
(21400,353,75,7)!
GO:0045005!
!
!
!
!
!
main enance1o 1
ideli y1
in ol ed1in1
DNAIdependen 1
DNA1 eplica ion1
!
Z anb,3,!
Pold1.!
!
B ca2,Tonsl,!
Tipin,Mms22l.!
!
_!
!
FDR!
q_ alue!
5.52E_1!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
46.37!
(21400,13,71,2)!
FDR!
q_ alue!
6.54E_4!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
30.20!
(21400,13,218,4)!
!
_!
!
!
_!
!
GO:0004386!
!
!
!
helicase1
ac i i y1
1
!
_!
!
!
Mcm8,Hells,Mcm2,Mcm4,!
Polq,Rad54l,Mcm3,Mcm7,!
E cc6l,B ip1,Mcm5,Mcm6.!
!
_!
!
!
!
!
_!
!
_!
!
!
FDR!
q_ alue!
2.44E_6!
!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
8.54!
(21400,138,218,12)!
!
!
_!
!
!
!
_!
!
!
!
GO:0008009!
!
!
!
chemokine1
ac i i y1
1
1
!
!
_!
!
!
_!
!
Ccl12,Ccl6,Cxcl3,!
Ccl17,Ccl3,Ccl4.!
!
!
!
_!
!
!
_!
!
!
_!
!
!
_!
!
FDR!
q_ alue!
8.79E_6!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
48.91!
(21400,35,75,6)!
GO:0006954!
!
in lamma o y1
esponse1
!
!
_!
!
!
!
_!
!
!
Il1a,Ccl12,Cxcl3,Ccl3,!
Rasg p1,Ccl4.!
!
!
!
_!
!
!
_!
!
!
_!
!
!
_!
!
FDR!
q_ alue!
1.06E_1!
!
!
En ichmen !
(N,B,n,b)!
6.69!
(21400,256,75,6)!
!
4.!Resul ados!
!
101
de CD209a en células mu inas depende exclusi amen e de su inducción po GM-CSF y
no po M-CSF.
Pa a comp oba que las células ca en es de LXRα esponden co ec amen e a
GM-CSF, y que el de ec o es á es ingido sólo a un subg upo de genes como CD209a,
se analizó la exp esión de genes que, basándonos en los esul ados ob enidos en el
mic oa ay, se inducen en espues a a GM-CSF an o en células WT como LXRα. De
es a mane a, con i mamos que el pa ón de exp esión de genes como IRF4 y Clec10a1 en
células BMDM en espues a a GM-CSF es simila en ambos geno ipos (Ve Figu a
4.19C). Es os da os sugie en que la ía de señalización de GM-CSF no se encuen a
a ec ada de mane a gene al en células WT y LXRα, pe o que la exp esión de CD209a
equie e de la p esencia de LXRα.
4.12 La ida media de LXRα es meno que la de LXRβ.
Recien emen e, se ha desc i o que LXRα iene una asa de eno ación
molecula mucho más al a que LXRβ en células humanas (Igna o a e al., 2013). Pa a
es udia es e e ec o en células mu inas, hemos empleado un inhibido de sín esis p o eica
denominado cicloheximida (CHX) (Schneide -Poe sch e al., 2010) an o en células
RAW264.7 ans ec adas con LXRα-3FLAG como en células BMDM WT (Figu a 4.20
A).
Hemos comp obado po wes e n blo que as un a amien o de CHX de 6
ho as, los ni eles de LXRα disminuyen signi ica i amen e (Ve Figu a 4.20A). De
mane a simila , los ni eles de ABCA1 se educen de mane a muy llama i a as el
a amien o con CHX. Es o concue da con abajos p e ios (A akawa e al., 2009; Zhou
e al., 2010) en los que se desc ibe la al a asa de eno ación de ABCA1, sus en ada en
una al a asa de deg adación y sín esis p o eica.
La exp esión de LXRβ, STAT5 o β-ac ina no se en a ec adas po el
a amien o con CHX (Ve Figu a 4.20A). Es o se debe a que ienen una mayo ida
media y una meno asa de ecambio que LXRα y ABCA1, y po an o, la inhibición de
la sín esis p o eica du an e un in e alo de 6h no modi ica sus ni eles de p o eína.
Po o o lado, el a amien o con CHX conduce a un bloqueo en la inducción
de la exp esión de CD209a en espues a a GM-CSF (Figu a 4.20 B). Es o es consis en e
con un papel de LXRα en la egulación de CD209a, ya que hemos comp obado median e
wes e n blo , que el a amien o con CHX consigue p ác icamen e sup imi los ni eles de
p o eína de LXRα.

!
102
0!
2!
4!
6!
8!
10!
Exp esión$RelaK a$
c l!
M_CSF!
GM_CSF!
0!
2!
4!
6!
8!
10!
Exp esión$RelaK a$
c l!
M_CSF!
GM_CSF!
0!
5!
10!
15!
20!
BMDM!
MDM!
Exp esión!Rela i a!
con ol!
IL4!
GM_CSF!
GM_CSF+IL4!
0!
10!
20!
30!
40!
WT!
LXRα!_/_!
LXRβ!_/_!
LXRαβ!_/_!
Exp esión!Rela i a!
con ol!
M_CSF!
GM_CSF!
IRF4!
!
CLEC10a1!
!
A.!
B.!
C.!
CD209a!
!
CD209a/DC_SIGN!
!
Figu a'4.19.'La'exp esión'de'CD209a'en'células'BMDM'depende'de'GMHCSF'y'LXRα.'
Panel!A.!Se!midió!la!exp esión!de!CD209a!en!BMDM!( a ón)! a adas!con!GM_CSF!o!IL4!mu inas!(10!ng/ml!
en!cada!caso)!y!DC_SIGN!en!MDM!(humano)! a adas!con!IL_4!(1000!U/ml),!o!GM_CSF!(100!ng/ml)!humanas!
du an e!16!ho as.!!Como!con ol!se!usa on!células! a adas!con!M_CSF.!!
Panel!B.!Se!midió!la!exp esión!de!CD209a!en!BMDM!p oceden es!de! a ones!de!los!4!geno ipos!indicados,!!
a adas!con!M_CSF!o!GM_CSF!(10!ng/ml)!o! ehículo!du an e!24!ho as.!!!
Panel!C.!Se!midió!la!exp esión!de!IRF4!y!Clec10a1!en!BMDM!ex aídas!de! a ones!WT!o!de!LXRα_/_,! a adas!
con!M_CSF!o!GM_CSF!(10!ng/ml)!o! ehículo!du an e!24!ho as.!!!
Se!indica!la!media!±!SD!de! es!expe imen os!independien es.!*!p<0,05,!p<0,01!con! espec o!a!su!con ol.!
!
!
*!
*!
!!!!!!!!!*!
*!
!!!!**!
!!!!!!**!
*!
*!
*!
*!
4.!Resul ados!
!
103
!
!
!
0!
20!
40!
60!
80!
100!
0h
1h
3h
6h
Exp esión!Rela i a!
GM!
GM+CHX!
CHX(5µM) - - + + - - + +
GW(1µM)+LG(100nM) - + - + - + - +
ABCA1
!
RAW_LXRα_3FLAG
!
BMDM!WT!!
LXRβ
!
LXRα_3FLAG!
LXRα!
STAT5
!
β_ac ina
!
A.!
B.!
Figu a'4.20.'LXRα'es'sensible'a'CHX,'lo'que'a ec a'a'la'exp esión'de'CD209a.'
Panel!A.!Inmunode ección!de!los!ni eles!de!LXRα,!LXRβ,!ABCA1,!STAT5!y!β_ac ina!en!células!RAW_LXRα_
lag!y!BMDM!WT!en! espues a!a!ligandos!y!Cicloheximida!(CHX).!Se!comp ueba!el!e ec o!de!un! a amien o!
de! 6h.! de! CHX! en! p o eínas! de! al o! ecambio! como! LXRα! y! ABCA1,! mien as! que! p o eínas! de! meno !
ecambio! molecula ! como! LXRβ,! STAT5! y! β_ac ina! no! se! en! a ec adas.! ! Se! mues an! imágenes!
ep esen a i as!de!2!expe imen os!independien es.!
Panel!B.!Exp esión!de!CD209a!medida!median e!RT_PCR!en!células!BMDM!WT! a adas!con!GM_CSF!(10!
ng/ml)!y!cicloheximida!(CXH,!5μM)!o! ehículo!du an e!los! iempos!especi icados.!Se!indica!la!media!±!SD!
de!dos!expe imen os!independien es.!*!p<0,05.!
!
!
CD209a!
!
!!!*!
!
104
4.13 La exp esión de CD209a equie e de la exp esión de LXRα,
pe o es independien e de ac i ación a macológica.
P e iamen e, hemos demos ado que las células BMDM de a ones ca en es de
LXRα no son capaces de induci la exp esión de CD209a en espues a a GM-CSF (Ve
Figu a 4.19B). A con inuación, nos p egun amos si es posible induci la exp esión de
CD209a median e la ac i ación a macológica de LXR con el ligando GW3965, o po el
con a io inhibi la con el an agonis a GW233.
Obse amos que el ligando GW3965 no inc emen a la exp esión de CD209a
ni en soli a io (Ve Figu a 4.21A), ni en conjunción con GM-CSF (da os no mos ados).
Po o o lado, como e a de espe a , el a amien o con GW3965 sí inc emen a la
exp esión de ABCA1, una diana conocida de LXR (Ve Figu a 4.21A).
Pa alelamen e, ealizamos un a amien o con el an agonis a de LXR llamado
GW233 (Zue che e al., 2010). Es á desc i o que GW233 es capaz de an agoniza con el
ligando GW3965 en la inducción a macológica de ABCA1 y que, además, puede
disminui los ni eles de ABCA1 po debajo de los ni eles sin es imulación a macológica,
es deci , es capaz incluso de disminui los ni eles basales de ABCA1 (Zue che e al.,
2010), lo que hemos podido comp oba en nues os expe imen os (Ve Figu a 4.21A).
Además, se obse a que la inhibición de LXR median e GW233 disminuye la exp esión
basal de CD209a al ededo de un 70 % (Ve Figu a 4.21A), y que cuando GW233 se usa
en conjunción con GM-CSF, se p oduce una inhibición de la inducción de CD209a de
al ededo de un 40 % (Ve Figu a 4.21B).
Es os so p enden es esul ados ob enidos con GW3965, con a ios a nues a
hipó esis p e ia, nos indican que a pesa de que la exp esión de CD209a es dependien e
de LXRα, la es imulación a macológica con es e ligando sin é ico no conduce a cambios
signi ica i os en su exp esión. Po o o lado, el hecho de que GW233 sea capaz de
disminui los ni eles basales de ABCA1 pod ía explica se po el mayo amaño molecula
del inhibido , que implica ía una pe u bación de la es uc u a con o macional de LXR
que di icul e la asociación de p o eínas coac i ado as (Zue che e al., 2010). Quizá, es o
pueda explica po qué la ac i ación a macológica no consigue induci la exp esión de
CD209a, pe o el a amien o con el an agonis a GW233 es capaz de inhibi los ni eles
basales y la inducción de CD209a.
4.14 El Lipopolisaca ido (LPS) inhibe la exp esión de CD209a in
i o.
Se ha desc i o que la inyección de LPS, un componen e de la memb ana
ex e na de bac e ias G am nega i as, p omue e el eclu amien o de células Mo-DCs
CD209a+ a nódulos lin á icos de la piel (pe o no al bazo) en a ones in i o (Cheong e
al., 2010). En consecuencia, nos p opusimos es udia la in luencia del a amien o de LPS
en la egulación de CD209a mediada po GM-CSF en células BMDM in i o.
4.!Resul ados!
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105
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GW3965 - - + + - - + +
GW233 - + - + - + - +
CD209a!
0!
1!
2!
3!
4!
5!
Exp esión Rela i a!
0!
2!
4!
6!
8!
10!
12!
14!
Exp esión Rela i a!
ABCA1!
GM-CSF - + +
GW233 - - +
CD209a!
GM-CSF - + - + - + - +
LPS - - + + - - + +
0!
500!
1000!
1500!
2000!
2500!
Exp esión!Rela i a!
GM-CSF - + - + - + - +
LPS - - + + - - + +
iNOS!
CD209a!
Figu a'4.21.'
La'exp esión'de'CD209a'en' espues a'a'GMHCSF'se' e'a ec ada'po 'un'inhibido '
a macológico' de' LXR' (GW233)' y' po ' LPS,' pe o' no' po ' un' agonis a' especi ico' de' LXR'
(GW3965).'
Panel!A.!Ni eles!de!ARNm!de!CD209a!y!ABCA1!en!células!BMDM!WT! a adas!du an e!24h.!Se!obse a!que!
el!ligando! de! LXR!GW3965! (1μM)!no!induce!la!exp esión!de!CD209a,!pe o!el! inhibido !de!LXR!GW233!
(2μM)!si!inhibe!su!exp esión!basal.!*!p<0,05!con! espec o!a!su!con ol.!
Panel! B.!Ni eles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! a adas! du an e! 24h.! Se! obse a! una!
inhibición!de!la!inducción!de!CD209a!po !GM_CSF!(10!ng/ml)!debida!al!inhibido !de!LXR!GW233!(2μM).!
Panel! C.!y! D.!Ni eles!de! ARNm! de! iNOS! y!CD209a!en! células! BMDM! WT! (neg o)!y! LXRα_/_!(blanco)! en!
espues a!a!GM_CSF!(10!ng/ml)!y!LPS!(100!ng/ml)!du an e!24h.!Se!obse a!la!inhibición!inducida!po !LPS!
sob e!la!exp esión!de!CD209a.!*!p<0,05.!
Se!indica!la!media!±!SD!de!dos!expe imen os!independien es.!
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C.!
A.!
B.!
D.!
0!
50!
100!
150!
Exp esión!Rela i a!
WT!
LXRα_/_!
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*!
*!
*!
*!
*!
*!
WT!
LXRα_/_!
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106
La exp esión de la óxido ní ico sin asa inducible (iNOS) aumen a en espues a
a LPS (Nussle e al., 1992), po lo que en es e caso lo usa emos como con ol de una
adecuada es imación in lama o ia. Como podemos e en la Figu a 4.21C, el a amien o
con LPS induce la exp esión de iNOS pe o inhibe an o la inducción mediada po GM-
CSF como los ni eles basales de CD209a (Ve Figu a 4.21D). En conco dancia con es os
esul ados, el eclu amien o de la ARN Polime asa II (Pol2) al p omo o de CD209a
disminuye as una exposición de 60 minu os a LPS en células BMDCs, al y como
de alla emos más adelan e (Ve Figu a 4.26B).
Es as e idencias pa ecen indica que la señalización LPS-TLR4 p omue e el
eclu amien o de monoci os in i o, p obablemen e a a és de las moléculas CD14 y
CCR7, hacia las zonas icas en lin oci os T de de e minados ganglios lin á icos en o ma
de Mo-DCs CD209a+ (Cheong e al., 2010), pe o in i o iene un e ec o inhibi o io en
la exp esión de CD209a sob e células de i adas de la médula ósea.
4.15 La cap ación de Manosa y Fucosa no p esen a di e encias
signi ica i as en e células WT y LXRα-/-.
Ya hemos adelan ado en la in oducción que CD209a es un ecep o de ipo
lec ina, ecep o es especializados en la unión de azúca es (Powlesland e al., 2006). El
ecep o DC-SIGN humano une p e e en emen e oligosacá idos o mados po manosa y
ucosa (Guo e al., 2004), al igual que los homólogos mu inos (Powlesland e al., 2006),
oligosacá idos que se encuen an en es uc u as p opias pe o ambién en pa ógenos (Guo
e al., 2004).
Debido a las di e encias de exp esión de CD209a en células BMDM WT y
LXRα-/-, y que el p oceso de unión de manosa se encuen a di e encialmen e egulado en
nues o Mic oa ay (Ve Tabla 4.2), nos p opusimos in es iga si es a di e encia se
aduci ía en una di e encia en la unión de manosa o ucosa. Pa a ello, se cul i a on las
células BMDM con es e as de poliac ilamida-FITC conjugadas con manosa (FITC-
PAA-Man) o ucosa (FITC-PAA-Fuc) y as e ec ua sucesi os la ados pa a elimina
es e as no unidas, es udiamos la cap ación median e mic oscopía de luo escencia (Ve
Figu a 4.22).
Las células BMDM es imuladas con M-CSF, p esen an una mayo cap ación
de es e as de FITC-PAA-Man que de FITC-PAA-Fuc, aunque no se ap ecian
di e encias signi ica i as en e geno ipos. Po o o lado, la cap ación de es e as de FITC-
PAA-Fuc es muy simila a la cap ación de es e as de FITC-PAA-Man en células
BMDM a adas con GM-CSF.
Po an o de acue do a los esul ados de nues a ap oximación, a pesa de la
g an di e encia de exp esión de CD209a, la cap ación de es e as de FITC-PAA-Man y
FITC-PAA-Fuc no pa ece p esen a g andes di e encias en células BMDM WT y
LXRα-/-.

4.!Resul ados!
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FITC!_PAA!
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FITC!_PAA_FUCOSA!
FITC!_PAA_MANOSA!
WT!
LXRα_/_!
WT!
LXRα_/_!
M_CSF!
GM_CSF!
Figu a'4.22.'La'cap ación'de'Manosa'y'Fucosa'no'mues a'di e encias'en'células'de i adas'
de'la'médula'ósea'WT'y'LXRαH/H.'
Se!es udió!la!cap u a!de!las!es e as!FITC_PAA_azúca !o! ehículo!FITC_PAA!(100!μg/ml)!en!células!BMDM!
WT! y! LXRα_/_! a adas! p e iamen e! con! M_CSF! o! GM_CSF! du an e! 24! ho as.! Median e! mic oscopía! de!
luo escencia!no!se!obse a on!di e encias!signi ica i as!en e!geno ipos.!Imágenes! ep esen a i as!de!3!
expe imen os!independien es! omadas!a!un!aumen o!de!40X.!
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108
4.16 Es udio de la ía de señalización de GM-CSF.
Tal y como se de alló en la in oducción, GM-CSF induce su espues a a a és
de un ecep o he e odimé ico cons i uido po una subunidad GMRα exclusi a y una
subunidad GMRβc común a los ecep o es de IL3 e IL5. Las p incipales u as de
señalización son Jak-STAT, PI3K-AKT y ERK-MAPK (Pe ugini e al., 2010). Pa a
explo a qué in e media ios de señalización juegan un papel ele an e en la exp esión de
CD209a, decidimos emplea inhibido es especí icos de dichas u as (Ve Figu a 4.23A).
En p ime luga , pa ece que la ía de ERK no in e iene en la egulación de
CD209a, ya que un inhibido especí ico de es a ía, PD98059, no al e a su exp esión en
espues a a GM-CSF.
Po o o lado, empleamos dos inhibido es de la ac i idad de la u a IKK-NF-
κB denominados BI605906 y SN50. BI605906 es un inhibido de IKK B, mien as que
SN50 es un pép ido que con iene la secuencia NLS de p50 y ac úa bloqueando la
anslocación nuclea del díme o RelA:p50. A la is a de los esul ados, pa ece que la
señalización de la ía IKK-NF-κB no iene un papel p imo dial en la inducción de la
exp esión de CD209a po GM-CSF.
El inhibido de p38 SB203580 inhibe pa cialmen e la exp esión de CD209a.
En es e caso, puede que la ac i idad de p38 in e enga en la cascada de señalización que
conduce a la inducción de CD209a, aunque se han desc i o p o eínas di e en es a p38
(o - a ge ) a ec adas po es e inhibido (Bain e al., 2007), po lo que se eque i ía un
es udio más de allado.
Con espec o a los inhibido es de PI3K wo manina y LY294002 hemos
ob enido esul ados con adic o ios. Si bien ambos son capaces de inhibi la os o ilación
de AKT en espues a a es imulación ápida con GM-CSF (Ve Figu a 4.23B), es a
inhibición no se e leja en una inhibición de la exp esión de CD209a a iempos más la gos
de es imulación con GM-CSF en el caso de wo manina, pe o sí en el caso de LY294002
(Ve Figu a 4.23A). O os es udios ambién han ob enido esul ados con adic o ios
usando ambos inhibido es (Hazeki e al., 2006), y es o es posible que sea debido a la
inhibición de p o eínas di e en es de PI3K (o - a ge ) po LY294002 (Gha bi e al.,
2007; Hazeki e al., 2006). Conside ando que la wo manina es un inhibido de PI3K
más especí ico que el LY294002 (Bain e al., 2007), en endemos que los esul ados
ob enidos con wo manina e lejan mejo la ealidad y, po an o, no enemos da os
concluyen es que indiquen que la u a de señalización PI3K-AKT in e enga de mane a
impo an e en la inducción de CD209a mediada po GM-CSF.
Finalmen e, los inhibido es Jak-I (inhibido de odas las Jaks) y AG490
(inhibido de Jak2) impiden la exp esión de CD209a en espues a a GM-CSF ( e Figu a
4.24A). Además, hemos comp obado median e wes e n blo el e ec o inhibi o io de Jak-I
sob e la os o ilación de Jak2 y STAT5 en espues a a GM-CSF ( e Figu a 4.24B).
4.!Resul ados!
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0!
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20!
25!
30!
Exp esión!Rela i a!
con ol!
GM!
GM+SB!
0$
5$
10$
15$
20$
25$
30$
CD209a$
con ol!
GM!
GM+BI!
Figu a'4.23.'E ec o'de'la'inhibición'de'los'p incipales'in e media ios'de'la'señalización'de'
GMHCSF'sob e'la'exp esión'de'CD209a.'
Panel! A.!Ni eles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! a adas! con! GM_CSF! du an e! 6! ho as! y!
p eincubadas!1!ho a!con! ehículo!o!inhibido !según!se!indica,!a!las!siguien es!concen aciones:!PD98059!
(20µM),!BI605906!(5µM),!SN50!(20µM),!!SB203580!(20µM),!!wo manina!(500nM)!y!LY294002!(25µM).!
Se!indica!la!media!±!SD!de!dos!expe imen os!independien es.!*!p<0,05!con! espec o!a!GM.!
Panel!B.!Comp obación!del!e ec o!inhibido !de!wo manina!y!LY294002!sob e!la! os o ilación!de!AKT!y!
STAT5!median e!wes e n*blo .!
PD98059!
SB203580
BI605906!
A.!
B.!
Wo manina!
*!
*!
0$
5$
10$
15$
20$
25$
30$
SN50$
con ol$
GM$
GM+SN50$
SN50!
0!
5!
10!
15!
20!
25!
30!
Exp esión!Rela i a!
con ol!
GM!
GM+PD!
0$
5$
10$
15$
20$
25$ con ol$
GM$
GM+wo $
0$
5$
10$
15$
20$
25$ con ol$
GM$
GM+LY$
LY294002!
*!
GM-CSF - + + +
wo manina - - + -
LY294002 - - - +
P_STAT5!
!!!!STAT5!
AKT!
P_AKT!
CD209a!
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A.!
Figu a'4.24.'La'exp esión'de'CD209a' equie e'de'la' os o ilación'de'Jak2/STAT5.'
Panel! A.!Ni eles! de! ARNm! de! CD209a! en! células! BMDM! WT! a adas! con! GM_CSF! du an e! 6! ho as! y!
p eincubadas! 1! ho a! con! ehículo! o! inhibido ! según! se! indica,! a! las! siguien es! concen aciones:! Jak_I!
(10µM)! y! AG490! (10µM).!Se! indica! la! media!
±! SD! de! dos! expe imen os! independien es.! *! p<0,05!con!
espec o!a!GM.!
Panel! B.!Comp obación! del! e ec o! inhibido ! de! Jak_I! sob e! la! os o ilación! de! Jak2! y! STAT5! median e!
wes e n*blo .!
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0$
5$
10$
15$
20$
25$
30$
Exp esión$RelaK a$
con ol$
GM$
GM+JakI$
!!!!!JakI!
0$
5$
10$
15$
20$
25$
30$ con ol$
GM$
GM+AG490$
!!!!AG490!
*!
*!
P_STAT5!
STAT5! o al
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P_JAK2!
GM-CSF (20 ng/ml) - + + +
JAK-I inh(10µM) - - 2 10
B.!
CD209a!
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DISCUSIÓN
5.
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121
DISCUSIÓN
_______________________________________________________________
Las células mieloides del sis ema inmuni a io cons i uyen el eje cen al de la
espues a inna a y un eslabón undamen al de enlace hacia la espues a adap a i a
(Geissmann e al., 2010). Pa a pode man ene la in eg idad y salud del indi iduo, la
espues a inmuni a ia debe de se capaz de esponde e icazmen e a una eno me a iedad
de posibles pa ógenos y, a su ez, econoce las células y es uc u as p opias. Es o ocu e
g acias a la especialización de las células del sis ema inmuni a io en unción del ejido en
el que se encuen an, el ambien e al que se en expues as y los e os inmunológicos a los
que deben de hace en e. Es p ecisamen e es a di e sidad uncional la que di icul a, en
g an medida, una clasi icación es ánda de odos los ipos celula es, y la que en pa e ha
es imulado los es ue zos de la comunidad cien í ica.
T adicionalmen e, los monoci os se han conside ado simples p ecu so es
sanguíneos que se ex a asan a los ejidos pa a da luga a células e minalmen e
di e enciadas como células dend í icas y mac ó agos, las cuales se dis inguen a su ez en
base a su mo ología, ma cado es de supe icie, capacidad de agoci osis y capacidad de
p esen ación de an ígeno. Exis e una g an di e sidad de poblaciones de mac ó agos
(Gau ie e al., 2012 y Tabla 1.1) cuyo o igen on ogené ico es á empezando a e ela se.
Recien emen e, se ha descubie o que muchas poblaciones de mac ó agos esiden es
ienen su o igen du an e el desa ollo emb iona io en el saco i elino (Schulz e al., 2012;
Yona e al., 2013) o p ecu so es de hígado e al (Guilliams e al., 2013), y hay e idencias
que sugie en que su man enimien o a lo la go de la ida del indi iduo ocu e po
p oli e ación local de mane a independien e de p ecu so es hema opoyé icos de la médula
ósea (Hashimo o e al., 2013; Jenkins e al., 2011; Robbins e al., 2013). Es os
mac ó agos se ca ac e izan po se F4/80high e independien es del ac o de ansc ipción
c-Myb (Schulz e al., 2012). O as poblaciones de mac ó agos p oceden de p ecu so es
HSC en la e apa adul a, y se ca ac e izan po se F4/80low y dependien es de c-Myb
(Schulz e al., 2012). Es os esul ados p oceden es de nue as ap oximaciones basadas en
mapeo del des ino celula pa ecen con i ma es udios an e io es que habían pasado
inad e idos. Po ejemplo, en un expe imen o clásico Van Fu h y Diesselho -den Dulk
mos a on el o igen dual de los mac ó agos isula es ma cando monoci os de la médula
ósea con Timidina[3H]. Con es e expe imen o llega on a la conclusión de que al ededo
del 55 % de los mac ó agos esplénicos enían su o igen en los monoci os ma cados,
mien as que el 45 % es an e enía un o igen local (Van Fu h and Diesselho -den Dulk,
1984). Po o o lado, median e expe imen os de quime ismo, se obse a que sólo el 10 %
5.
!
122
de los mac ó agos F4/80high del bazo p oceden del donan e, es deci , los mac ó agos
F4/80high del bazo apenas se enue an a pa i de p ecu so es p o enien es de la médula
ósea (Schulz e al., 2012).
Po o a pa e, se han iden i icado ac o es de ansc ipción denominados
LDTFs (Lineage De e mining T ansc ip ion Fac o s), en e los que se encuen an PU.1
(Schulz e al., 2012) y C/EBPα (Hea h e al., 2004), cuyo de ec o de e mina la ausencia
de la p ác ica o alidad de los mac ó agos isula es. Es de des aca que las poblaciones de
mac ó agos p esen an una di e sidad génica conside able, y únicamen e compa en la
exp esión de unos pocos cien os de ARNm (Gau ie e al., 2012). La egulación
subyacen e a la di e enciación de cada una de es as poblaciones es en g an medida
desconocida. Recien emen e, se ha descubie o que la ausencia de un único ac o de
ansc ipción de la amilia de PU.1, denominado Spi-C, di icul a el desa ollo de la
población de mac ó agos esplénicos de la pulpa oja F4/80high sin a ec a o as
poblaciones, de ec o que se mani ies a isiológicamen e a ni el del eciclado del hie o
(Kohyama e al., 2009).
Resul ados de nues o labo a o io mues an que los a ones LXRα-/- ca ecen de
las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal del bazo (Fig. 4.1), po lo que pod ía
es a egulando la localización o la di e enciación celula . Nues o es udio de los ni eles de
exp esión de ci oquinas implicadas en la o mación y compa imen alización del bazo,
como CCL19, CCL21, LTA y LTBR (desc i as en A o e al., 2004; Mebius and K aal,
2005), no e eló di e encias en a ones WT y LXR-DKO de 1 a 3 semanas de edad (Fig.
4.2). Es os da os apoyan la idea de que la señalización y la localización no es án al e adas
en a ones ca en es de LXR, aspec o que hemos con i mado median e una es a egia de
asplan es. En e ec o, pudimos comp oba que la medula ósea de a ones WT es capaz de
induci la o mación de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal en a ones
asplan ados LXR-DKO (Fig. 4.3), y que el de ec o es debido a la ausencia de LXRα, ya
que la médula de a ones LXRβ -/-, pe o no de LXRα -/-, es capaz de induci la o mación
de la MZ (Fig. 4.3).
En es a Tesis, hemos abo dado a ias ap oximaciones que con i man la decisi a
in luencia del ac o de ansc ipción LXRα en la di e enciación de las dos poblaciones de
mac ó agos de la zona ma ginal (MMM y MZM). Po un lado, la econs i ución con
len i-SP-LXRα de células hema opoyé icas adul as aisladas de a ones LXR-DKO
con i mó la e e sibilidad del eno ipo, al menos de mane a pa cial. En un plazo de 8
semanas as el asplan e con len i-SP-GFP, se de ec a un 30 % de monoci os ci culan es
GFP-posi i os median e ci ome ía (Fig. 4.12). Es e po cen aje de ans ección es muy
simila al 26,4 % publicado en o o labo a o io independien e (Zhong e al., 2014). En
conco dancia con es os ni eles de ans ección de la población de monoci os ci culan es,
los bazos de los a ones asplan ados con médula a ada con len i-SP-LXRα mues an
una ecupe ación pa cial de los ma cado es CD169, MARCO y Tim-4 en la MZ (Fig.
4.13). Además, la ac i ación a macológica de LXR median e su ligando sin é ico
GW3965 acele a la ciné ica de epoblación de los mac ó agos de la zona ma ginal en

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a ones a ados p e iamen e con clod ona o (Fig. 4.4), sin a ec a a la ciné ica de
epoblación de los mac ó agos de la pulpa oja.
Po o o lado, hemos gene ado a ones KO ejido especí icos median e la
ap oximación LoxP-C e. En conc e o, nues os a ones LXRα l/ l Va -iC e+/ p esen an
una exp esión no mal de LXRα en odos los ejidos menos en las células de i adas de la
médula ósea, an o a ni el de ARNm (Fig. 4.7) como a ni el de p o eína (Fig. 4.8). El
undamen o es la escisión especí ica del gen loxeado LXRα po pa e de la ecombinasa
Va -iC e, que p esen a una exp esión es ingida a células de la línea hema opoyé ica (de
Boe e al., 2003). Con es a ap oximación, hemos podido comp oba que los mac ó agos
de la pulpa oja F4/80+ se desa ollan de mane a independien e de LXRα, mien as que
las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal equie en de la exp esión de LXRα+ en
los p ecu so es hema opoyé icos pa a pode desa olla se (Ve Fig. 4.9). Además, la
exp esión de una única copia de LXRα es su icien e, al y como se obse a en los
he e ocigo os LXRα l/+ Va -iC e+/ (Fig. 4.10 y 4.11), enómeno conocido como
haplosu iciencia. Es a ap oximación, unida al es udio de las poblaciones esplénicas en
dis in os es adíos del desa ollo pos na al (Fig. 4.2), con i ma el o igen hema opoyé ico de
los p ecu so es de los mac ó agos de la zona ma ginal. Debemos ene en cuen a que en
condiciones de i adiación p opias de un asplan e de médula ósea, las poblaciones de
mac ó agos esiden es se pueden e sus i uidas po monoci os p oceden es de la médula
ósea (Gomez Pe digue o and Geissmann, 2013), lo que hemos podido e i a median e la
ecnología Lox-C e. Además, el o igen hema opoyé ico de las poblaciones de mac ó agos
de la zona ma ginal concue da con su eno ipo F4/80-/low, ípico de mac ó agos
p oceden es de p ecu so es HSC (Schulz e al., 2012).
La explicación pa a la dis in a p ocedencia de las poblaciones de mac ó agos,
bien sea desa ollo emb iona io o médula ósea, aún no se conoce. Es p obable que el
o igen monocí ico de los mac ó agos de la zona ma ginal les con ie a unas cualidades
únicas. Po ejemplo, los mac ó agos de i ados de los monoci os pa ecen es a mejo
equipados que los que de i an del saco i elino pa a empeza y modula la espues a
inmuni a ia (Schulz e al., 2012), una ca ac e ís ica que puede se esencial en el ambien e
de la zona ma ginal, luga donde se c iba odo el o en e sanguíneo. Además, es p obable
que los mac ó agos de la zona ma ginal, al igual que los mac ó agos del sis ema diges i o
(Hashimo o e al., 2013; Yona e al., 2013), nunca es én en es ado de " eposo" debido a la
epe ida exposición a an ígenos, lo que de e mina la acumulación de monoci os y su
di e enciación local a mac ó agos ac i ados (B on e and Pi e , 2013).
En la zona ma ginal se cap u an la inmensa mayo ía de an ígenos ci culan es
en la sang e (Aichele e al., 2003). La Pú pu a T omboci openica Idiopá ica (Idiopa hic
Th ombocy openic Pu pu a, ITP), ambién llamada Pú pu a T omboci opénica
Au oinmune (Au oimmune Th ombocy openic Pu pu a, AITP), es una en e medad que se
ca ac e iza po un con aje bajo de plaque as y médula ósea no mal, en la que hay una
des ucción ele ada de plaque as po au oan icue pos en e a an ígenos de memb ana
plaque a ios (Geo ge e al., 1994). P esen a una p e alencia de 9,5 casos po cada 100.000
pe sonas en los EEUU (Michel, 2009). Dado que el bazo es el p incipal si io de cap u a
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124
de los complejos plaque a-an icue po, una in e ención e apéu ica muy ex endida pa a
e i a el descenso de plaque as es la esplenec omía, que iene éxi o en al ededo del 66 %
de los casos (Kojou i e al., 2004). Pa a es udia la ele ancia uncional de la zona
ma ginal en una en e medad como la ITP, hemos pues o a pun o un modelo mu ino en el
que se induce la opsonización de las plaque as median e un an icue po en e a la
in eg ina gpαIIb (CD41). De es a mane a, las plaque as opsonizadas son ma cadas pa a
agoci osis, disminuyéndose sus ni eles ci culan es (Mizu ani e al., 1993; C ow e al.,
2001). A las 3 ho as de la inyección del an icue po hemos comp obado median e
ci ome ía de lujo un descenso del 80 % de los ni eles ci culan es de plaque as en a ones
WT, lo que demues a la e ec i idad del a amien o (da os no mos ados). En a ones
LXR-DKO, el descenso ue del 35 % (da os no mos ados). Es a no able di e encia en la
cap u a de plaque as opsonizadas puede se debida a la ausencia de zona ma ginal, pe o
no se pueden desca a o as explicaciones. En conc e o, se ha desc i o que as la unión
del an icue po, la plaque a se uel e apop ó ica (Ley in e al., 2006), y es conocida la
meno capacidad de e i ada de células apop ó icas po pa e de los mac ó agos ca en es
de LXR (Alonso-Gonzalez e al., 2009). Es p obable, po an o, que el esul ado sea
debido a un e ec o conjun o de ambos enómenos. No obs an e, median e la inyección de
plaque as ya opsonizadas pudimos comp oba que en condiciones no males el p incipal
si io de cap u a den o del bazo es la zona ma ginal en a ones WT, mien as que en la
zona ma ginal de a ones LXR-DKO exis e un de ec o en su cap u a (Fig. 4.14).
El es udio de los mac ó agos de la zona ma ginal es complicado, ya que los
ma cado es molecula es no son exclusi os de es a población. Aún cuando es os
ma cado es son muy abundan es en la zona ma ginal, es p obable que las es a egias de
silenciamien o de es as p o eínas median e gene ación de animales knock-ou o depleción
selec i a como en el caso de los animales CD169-DTR, a ec en ambién a o as
poblaciones de mac ó agos, pues su exp esión es ambién signi ica i a en o os sub ipos de
mac ó agos isula es. O as ap oximaciones emplean clod ona o a baja concen ación, que
elimina p e e en emen e los mac ó agos de zona ma ginal. Las conclusiones de es os
es udios implican a los mac ó agos de la zona ma ginal en el p oceso de la ole ancia
inmuni a ia y la egulación del a amien o de en e medades au oinmunes (An hony e
al., 2008a; McGaha e al., 2011; Miyake e al., 2007; Ra ishanka e al., 2012). Po an o,
no deja de se pa adójico que los mac ó agos de la zona ma ginal, que e i an la apa ición
de en e medades au oinmunes median e la e i ada de células p opias en es ado
apop ó ico (McGaha e al., 2011), con ibuyan, median e la e i ada de plaque as
opsonizadas, a las consecuencias ad e sas de una en e medad au oinmune como es la
Pú pu a T omboci opénica Idiopá ica.
El mecanismo gené ico úl imo po el cual LXRα egula la o mación de los
mac ó agos de la zona ma ginal aún no se conoce, pe o hipo e izamos que debe de es a
mediado po un p og ama gené ico especí ico de una iso o ma de LXR, es deci , egulado
po LXRα pe o no egulado po LXRβ. Un ejemplo de es a egulación es el gen SPα,
ambién conocido como AIM (Apop osis Inhibi o o Mac ophage). Los a ones ca en es de
LXRα son especialmen e suscep ibles a apop osis inducida po la bac e ia Lis e ia
Monocy ogenes (LM) debido, en pa e, a la pé dida de egulación del gen SPα (Joseph e
al., 2004). En la Tesis de la D a. Noelia Alonso González, de nues o labo a o io, se
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es udió la zona ma ginal de bazos p oceden es de a ones SPα-/-, y se comp obó que las
poblaciones de mac ó agos MMM y MZM p esen an un desa ollo no mal. Po an o,
concluimos que la ausencia de exp esión de SPα no es un de e minan e génico en la
o mación o man enimien o de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal. Po
o o lado, los mac ó agos son sensibles a la sob eca ga de lípidos, pudiendo en a en
apop osis po es és del e ículo endoplásmico (Feng e al., 2003). Se ha p opues o que
LXRα es el egulado p incipal de SCD-1 (s eao yl CoA desa u ase) en mac ó agos, y que
su inducción p o ege a es e ipo celula en e a la apop osis po sob eca ga de lipidos
(E bay e al., 2009). Como hemos indicado an e io men e, la zona ma ginal es una zona
de exposición con inua a an ígenos (B on e and Pi e , 2013) y el luga p incipal de
cap u a de células apop ó icas (K aal and Mebius, 2006; Ra ishanka e al., 2012). Po
an o, cons i uye una localización ana ómica p opensa a una sob eca ga lipídica de los
mac ó agos po agoci osis. En consecuencia, se ía in e esan e comp oba en el u u o el
desa ollo de las poblaciones de mac ó agos de la zona ma ginal de los a ones SCD-1-/-.
Pa a es udia la egulación ansc ipcional eje cida po LXRα en células
mieloides in i o, ealizamos un es udio del análisis de la exp esión génica median e
mic oa ay de células BMDM p oceden es de a ones WT y LXRα -/- en espues a a un
a amien o de 24 ho as con las ci oquinas M-CSF o GM-CSF, al y como se desc ibe en
la sección 3.7.2 de Ma e ial y Mé odos. La Tabla 5.1 mues a un esumen del núme o de
genes di e encialmen e egulados con espec o al con ol en WT, LXRα -/- y genes
di e encialmen e egulados con espec o al con ol en ambos geno ipos, que hemos
denominado genes "Comunes".
TABLA'5.1.'Núme o1 de1genes1 cuya1 exp esión1 es1 mayo 1 o1 meno 1 espec o1 a1 su1 con ol1 en1
espues a1a1GMICSF1o1MICSF.1
WT
Comunes
LXRα
GM-CSF
Más exp esados
72
210
158
Menos exp esados
75
99
89
M-CSF
Más exp esados
74
222
78
Menos exp esados
8
5
25
El análisis de la On ología Génica (GO) indica que el p oceso más
ep esen ado en espues a a M-CSF es el de la di isión celula (cell di ision) mien as que
en espues a a GM-CSF los p ocesos más ep esen ados son los de quimio axis
(chemo axis) y espues a in lama o ia (in lamma o y esponse) ( e Tablas 4.1 y 4.2). Es o
concue da con unciones conocidas de es as ci oquinas (Lacey e al., 2012). Se sabe que la
p oducción de la ci oquina M-CSF ocu e de mane a ubicua y que con ola el núme o de
mac ó agos en a ios ejidos, mien as que la ci oquina GM-CSF p esen a bajos ni eles
ci culan es que a menudo se ele an du an e eacciones inmuni a ias o in lama o ias
(Lacey e al., 2012). Además, en algunas condiciones pa ológicas ca ac e izadas po
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in lamación c ónica, como es el caso del asma, la p oducción y libe ación de GM-CSF,
IL-3 e IL-5 en pulmón causa la in il ación y ac i ación de células mieloides, lo que
acen úa el daño en las ías aé eas (B ough on e al., 2012). Es de des aca el mayo
núme o de genes exp esados en espues a a GM-CSF en células BMDM de a ones
LXRα -/- (n=158) en compa ación con WT (n=72), además de la mayo ep esen ación de
genes de p ocesos p o-in lama o ios como la biosín esis de p os aglandinas (p os aglandin
biosyn he ic p ocess). Se sabe que, en el con ex o de la espues a a LPS, la ac i ación de
LXR iene un e ec o an iin lama o io, ac uando ambas iso o mas de mane a edundan e
y, que en es e mismo con ex o, células ca en es de LXR p esen an una espues a p o-
in lama o ia abe an e (Joseph e al., 2003). Sin emba go, a nues o en ende , es la
p ime a ez que se es udia el e ec o de un a amien o agudo de GM-CSF en células
BMDM ca en es de una única iso o ma (LXRα). En es e sen ido, nues os da os apun an
a una mayo inducción de genes y ías in lama o ias en células BMDM LXRα -/- que en
células BMDM WT en espues a a GM-CSF.
Debemos ene en cuen a, po o o lado, que la in lamación es un p oceso
isiológico no mal esencial en la espues a inmuni a ia (Janssen and Henson, 2012). Po
eso nos esul ó in e esan e es udia aquellos p ocesos isiológicos que se ac i an en células
BMDM WT en espues a a GM-CSF, ya que pod ían cons i ui u as po encialmen e
eguladas po LXRα. Po ejemplo, el p oceso de unión a manosa (mannose binding,
GO:0005537) se encuen a sob e-exp esado solamen e en WT (Tabla 4.2). Uno de los
genes p esen es en es e g upo es CD209a, que además se encuen a en e los 20 genes
más di e encialmen e egulados en WT (Ve Figu a 4.17C). Es e gen cons i uye un
ma cado de células Mo-DC (Cheong e al., 2010) y mac ó agos de la ase de esolución
(S ables e al., 2011). Basándonos en la ele ancia e in e és de es e gen desde el pun o de
is a inmuni a io, decidimos es udia su egulación en mayo p o undidad.
Según el consenso ac ual, el gen mu ino CD209a es homólogo del gen humano
DC-SIGN (Cheong e al., 2010). Sin emba go, hemos comp obado que la egulación de
ambos genes es lige amen e di e en e en células mieloides mu inas y humanas. Así, la
ci oquina IL-4 es el p incipal egulado de la exp esión de DC-SIGN en humanos
(Relloso e al., 2002); mien as que la p incipal ci oquina implicada en la egulación de
CD209a hemos descubie o que es GM-CSF (Ve Figu a 4.19A). En es e sen ido, es á
desc i o que las p o eínas JAK1 y STAT6 in e ienen en la cascada de señalización de IL-
4 (Luzina e al., 2012), mien as que en el caso de la cascada de señalización de GM-CSF
in e ienen las iso o mas JAK2 y STAT5 (Pe ugini e al., 2010). Es po an o p obable
que la di e en e egulación de DC-SIGN/CD209a en humanos y a ones se a icule
ambién a a és de algunas di e encias a ni el de ac o es de ansc ipción, ac i ados
di e encialmen e po las ías mencionadas.
Po o o lado, hemos descubie o que la p esencia de LXRα es imp escindible
pa a la exp esión de CD209a en espues a a GM-CSF en células BMDM. Así, células
ca en es de LXRα, como LXRα-/- o LXR-DKO, p esen an una inducción de icien e de
CD209a en espues a a GM-CSF, mien as que las células ca en es de la iso o ma LXRβ
p esen an una exp esión equipa able a la de células WT. Además, hemos encon ado que