ii
DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS
Es e é um abalho académico que pode se u ilizado po e cei os desde que espei adas as eg as
e boas p á icas in e nacionalmen e acei es, no que conce ne aos di ei os de au o e di ei os
conexos.
Assim, o p esen e abalho pode se u ilizado nos e mos p e is os na licença abaixo indicada.
Caso o u ilizado necessi e de pe missão pa a pode aze um uso do abalho em condições não
p e is as no licenciamen o indicado, de e á con ac a o au o , a a és do Reposi ó iUM da
Uni e sidade do Minho.
Licença concedida aos u ilizado es des e abalho
A ibuição-NãoCome cial-SemDe i ações
CC BY-NC-ND
h ps://c ea i ecommons.o g/licenses/by-nc-nd/4.0/
iii
Ag adecimen os
A odos aqueles que con ibuí am pa a a ealização des e abalho, deixo aqui o meu
since o ag adecimen o.
Ao Dou o Rica do Pe ei a, po oda a o ien ação, dedicação, empenho, disponibilidade e
ajuda incansá eis, an o no abalho p á ico como no escla ecimen o de ques ões eó icas ao longo
de odo o p oje o.
Ao P o esso An ónio Vicen e, po oda a a enção e conside ação dadas não só a mim
como a odos os memb os do labo a ó io, e po c ia ambém condições de abalho modela es –
a quem ambém de o ag adece pela minha inse ção no Labo a ó io de Indús ia e P ocesso
du an e o pe íodo de es ágio.
Ao Engenhei o Guilhe me Pe ei a, pela conceção des e p oje o e pos e io c iação des a
opo unidade de abalho, igualmen e pelo seu empenho e in e esse pela ealização do mesmo e
po odos os conhecimen os p á icos ansmi idos.
A odos os memb os do LIP pela ajuda, paciência, amizade e disponibilidade ao longo da
conc e ização des e p oje o e pela o ma como me acolhe am, em especial ao Jean-Michel
Fe nandes pelo acompanhamen o na ealização do abalho – c ucial pa a a execução do mesmo.
Também ag adeço a oda a minha amília e amigos po odo o apoio, ca inho e
enco ajamen o demons ado ao longo des a e apa, em especial ao Ped o – a quem dedico es e
abalho.
i
DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE
Decla o e a uado com in eg idade na elabo ação do p esen e abalho académico e con i mo que
não eco i à p á ica de plágio nem a qualque o ma de u ilização inde ida ou alsi icação de
in o mações ou esul ados em nenhuma das e apas conducen e à sua elabo ação.
Mais decla o que conheço e que espei ei o Código de Condu a É ica da Uni e sidade do Minho.
Es abilização das Le edu as do Mos o de U as A a és da Tecnologia de Aquecimen o
Óhmico
O abalho e e como p incipal obje i o a a e iguação do papel da componen e elé ica da
ecnologia de Aquecimen o Óhmico aquando a sua aplicação na ina i ação mic obiológica de
mos o de inho. Te e ainda o p opósi o da o imização das condições de ina i ação da es i pe de
le edu a
Dekke a b uxellensis
PYCC 4801 – um con aminan e p oblemá ico na indús ia ínica –
a a és da aplicação da ecnologia do Aquecimen o Óhmico. Foi ainda, adicionalmen e, ealizado
o le an amen o da in luência des e a amen o na e men ação de mos o de Vinho Ve de.
Ve i ica am-se e ei os no ó ios de ina i ação da es i pe de le edu a a baixas empe a u as
de a amen o (40 ⁰C) e campos elé icos mode ados (400 V/cm). Foi possí el cons a a o impac o
da componen e elé ica na mesma ina i ação, sendo que a baixas empe a u as (40 ⁰C) mas na
ausência de campo elé ico ou p esença de campos elé icos baixos (75 V/cm ou 90 V/cm) o
e ei o de ina i ação oi nulo ou bas an e in e io ao isualizado nos ensaios em que se u iliza am
campos elé icos mode ados de ap oximadamen e 400 V/cm.
No espei an e à ca ac e ização ísico-química dos mos os usados pa a a amen o no
sis ema de aquecimen o óhmico, e i icou-se uma manu enção dos seus pa âme os p incipais; a
sua ca ac e ização mic obiológica e elou uma maio p esença de
Hanseniaspo a u a um
e
Schizosaccha omyces pombe
, uma espécie desconhecida de colo ação e de in enso e espécies
de ungos ilamen osos. De salien a que os e ei os de ina i ação po a amen o óhmico
obse a am-se p incipalmen e nas espécies mais dominan es do mos o
.
As condições mais p omisso as de a amen o óhmico o am aplicadas no a amen o de
mos o de Vinho Ve de (cas a Fe não Pi es), endo sido compa ada a e men ação de mos o a ado
em sis ema óhmico e a e men ação de mos o sem qualque ipo de a amen o. Ve i icou-se uma
con o midade das ca ac e ís icas ísico-químicas dos mos os, que du an e a e men ação, que
no inho inal.
Concluiu-se que a Tecnologia do Aquecimen o Óhmico é uma al e na i a p omisso a pa a
o con olo mic obiológico do p ocesso de p odução de Vinhos Ve des, sem que as suas
p op iedades sejam a e adas po es e a amen o.
Pala as-cha e: Aquecimen o Óhmico, Ele o-Tecnologias, Ina i ação, Mos o, Vinho Ve de

i
S abiliza ion o Yeas s P esen in Wine Mus Using Ohmic Hea ing Technologies
The main objec i e o his wo k was o in es iga e he ole o he elec ici y when using
ohmic hea ing echnologies in he mic obiological inac i a ion o wine mus . The e was also he
goal o op imizing he condi ions o inac i a ion o he yeas s ain
Dekke a b uxellensis
PYCC 4801
– a p oblema ic con aminan in he wine indus y – when ohmic hea ing echnology was used. In
addi ion, a s udy was made o analyse he in luence o his ea men on he e men a ion o mus
o Vinho Ve de.
I was ound ha he e we e no iceable inac i a ion e ec s on he yeas s ain a low
ea men empe a u es – 40 ⁰C – and mode a e elec ic ields – 400 V/cm. The ole o elec ici y
on yeas inac i a ion was also e i ied h oughou he es s pe o med a low empe a u es – 40 ⁰C
– and absence o elec ic ield o p esence o low elec ic ields – 75 V/cm o 90 V/cm – once he
inac i a ion e ec s we e null o signi ican ly lowe han he ones obse ed when using mode a e
elec ic ields – 400 V/cm.
Rega ding he physicochemical cha ac e iza ion o mus s, hei main pa ame e s we e
main ained; while i s mic obiological cha ac e iza ion e ealed a g ea e p esence o
Hanseniaspo a u a um
and
Schizosaccha omyces pombe
, an unknown species o in ense g een
colo a ion and also species o ilamen ous ungi. I is also impo an o poin ou ha inac i a ion
e ec s p omo ed by ohmic ea men had highe incidence on he dominan species o he mus .
The mos p omising condi ions o ohmic hea ing ea men we e applied in he ea men
o Vinho Ve de mus (Fe não-Pi es a ie y), and he e men a ion o ohmic ea ed mus and he
e men a ion o no - ea ed mus we e compa ed. The physicochemical cha ac e is ics o he mus s
we e ound o be compa ible ei he du ing e men a ion o in he inal wine.
I can be concluded ha Ohmic Hea ing Technology p o es o be a p omising al e na i e
o he mic obiological con ol o he Vinho Ve de p oduc ion p ocess, wi hou i s main p ope ies
being a ec ed by his ea men .
Keywo ds: Elec o Technologies, Inac i a ion, Mus , Ohmic Hea ing, Vinho Ve de
ii
Índice
Ag adecimen os ........................................................................................................................ iii
Es abilização das Le edu as do Mos o de U as A a és da Tecnologia de Aquecimen o Óhmico . i
S abiliza ion o Yeas s P esen in Wine Mus Using Ohmic Hea ing Technologies ........................ i
Índice de Figu as ....................................................................................................................... x
Índice de Tabelas .................................................................................................................... x
Lis a de Ab e ia u as, Siglas e Ac ónimos ................................................................................ x i
1.1. O ganização da disse ação ............................................................................................... 1
1.2. Es ado da A e ................................................................................................................... 1
1.3. Obje i os ........................................................................................................................... 2
2. Fundamen ação Teó ica ....................................................................................................... 3
2.1. His ó ia da Vinha e do Vinho .............................................................................................. 3
2.2. O ganização In e nacional da Vinha e do Vinho – OIV ......................................................... 4
2.2.1. Região Dema cada dos Vinhos Ve des ............................................................................ 7
2.3. P ocesso P odu i o do Vinho .............................................................................................. 9
2.3.1 Fa o es Que In luenciam a Fe men ação ........................................................................ 11
2.3.2. Mic obiologia da Vi i ini icação ...................................................................................... 13
2.3.2.1.
Dekke a b uxellensis
.................................................................................................. 14
2.4. Higiene e Segu ança Alimen a na P odução de Vinho B anco .......................................... 15
2.4.1. Des an agens da Sul i ação .......................................................................................... 16
2.5. P ocessos Al e na i os de Ina i ação Mic obiológica de Vinhos ......................................... 18
iii
2.5.1. As Ele o-Tecnologias Nos P ocessos de ina i ação ....................................................... 20
2.6. Aquecimen o Óhmico (OH) .............................................................................................. 23
3. Me odologias ...................................................................................................................... 26
3.1. Mic obiologia ................................................................................................................... 26
3.1.1. P epa ação de Meios de Cul u a ................................................................................... 26
3.1.2. P epa ação de
S ocks
de Le edu a ............................................................................... 27
3.1.3. Ca ac e ização Mic obiológica das Amos as ................................................................. 27
3.1.4. U ilização da Le edu a-Al o .......................................................................................... 28
3.2. Ensaios de Ina i ação U ilizando o Aquecimen o Óhmico .................................................. 28
3.2.1. A aliação em Mos o de Vinho Ve de .............................................................................. 32
3.3. Ca ac e ização Físico-Química do Mos o de Vinho ............................................................ 32
3.4. Fe men ação do Mos o de Vinho Ve de ............................................................................ 33
4. Resul ados e Discussão ...................................................................................................... 35
4.1. A aliação P elimina Em Le edu a Isolada – P o ocolo I ................................................... 35
4.2. A aliação P elimina em Le edu a Isolada – P o ocolo II .................................................. 38
4.3. A aliação P elimina Em Le edu a Isolada – P o ocolo III ................................................. 44
4.4. A aliação P elimina em Le edu a Isolada – P o ocolo IV ................................................. 47
4.5. Ca ac e ização Fisico-Química do Mos o de Vinho ............................................................ 55
4.6. Ca ac e ização Mic obiológica do Mos o de Vinho e Es udo do Tempo de P a elei a .......... 58
4.7. Mic o ini icação do Mos o Não-T a ado e do Mos o T a ado po Aquecimen o Óhmico ...... 63
5.1 Conclusões ...................................................................................................................... 68
ix
5.2. P incipais Recomendações e T abalho Fu u o ................................................................. 69
Bibliog a ia ............................................................................................................................. 70
Anexos ................................................................................................................................... 73
x i
Lis a de Ab e ia u as, Siglas e Ac ónimos
DO Denominação de O igem
IG Iden i icação Geog á ica
OH Aquecimen o Óhmico
OIV O ganização In e nacional da Vinha e do Vinho
PEF Campos Elé icos Pulsados
POH Aquecimen o Óhmico Pulsado
PYCC Po uguese Yeas Cul u e Collec ion
RCV Regis o Cen al Vi ícola
SO2 Dióxido de enxo e
SO32- Ião sul i o
SOX Óxidos de enxo e
WL Walle s ein Labo a o y Nu ien
YPD Yeas Pep one Dex ose
AT Acidez To al
AR Concen ação Em Açúca es Redu o es
CM Concen ação Mic obiológica das Amos as
SST Sólidos Solú eis To ais
Tempo
T Tempe a u a
TP Teo P o eico
UFC Unidades Fo mado as de Colónia
V Tensão da co en e
VNaOH Volume de i ulan

1
1.1. O ganização da disse ação
O p esen e documen o oi di idido em cinco capí ulos p incipais. O p imei o capí ulo
des ina-se ao escla ecimen o do desa io p opos o da sua ele ância no con ex o a ual; o segundo
capí ulo e e e-se à secção onde é ei o um le an amen o dos emas discu idos no deco e da
disse ação, ou seja, o p ocesso de p odução de inho, os seus p incipais desa ios e, po im, as
me odologias a uais e eme gen es e e en es a essa á ea de biop ocessos; no e cei o capí ulo
desc e em-se os ma e iais e mé odos expe imen ais emp egues no âmbi o da disse ação; no
qua o capí ulo é ealizada a ap esen ação e discussão dos esul ados ob idos; sendo que no
quin o capí ulo ap esen a am-se as p incipais conclusões e ecomendações pa a abalhos u u os.
1.2. Es ado da A e
O Vinho Ve de é um p odu o nacional p oduzido exclusi amen e na Região Dema cada
dos Vinhos Ve des. É um inho no o iamen e esco e u ado cujo in e esse e p ocu a em sido
cada ez mais mani es ados. Segundo os dados da Comissão Regulado a, o Vinho Ve de é um
p odu o que em indo a se cada ez mais p ocu ado po me cados es angei os, sendo que a
sua p ocu a em indo a aumen a exponencialmen e nos úl imos 20 anos, ge ando no ano de
2018 mais de 63 M€ e mais de 26∙106 L de inho endidos (CVRVV, 2019). É en ão de in e esse
a o imização da sua p odução, op ando po p ocessos com meno impac o ambien al e com o
mínimo de ope ações adicionais de manei a que haja a mínima al e ação das suas p op iedades
de eleição.
Já o p ocesso de p odução do inho aca e a uma g ande a iabilidade de
mic o ganismos, que pode ão in luencia a e men ação alcoólica e mani es a se um pe igo pa a
a saúde do consumido . O mé odo uni e salmen e u ilizado pa a conse ação do mos o baseia-se
na adição de dióxido de enxo e. Es e compos o, adicionado ao mos o e ao inho mais comumen e
na o ma líquida – denominada po solução sul u osa – é um p odu o an imic obiano e
an ioxidan e, con udo com p op iedades óxicas e ale génicas e associado a cus os adicionais pa a
a sua emoção do p odu o inal (Puxeu, M.
e al
., 2018).
Su ge en ão uma necessidade e opo unidade pa a a conceção de uma no a e melho
al e na i a a es a e apa indus ial. Uma al e na i a p omisso a consis e na aplicação de co en e
elé ica pa a o con olo mic obiológico do mos o de inho.
2
1.3. Obje i os
O obje i o p incipal des e abalho consis e no escla ecimen o do papel do e ei o não
é mico da ecnologia de aquecimen o ohmico na ina i ação de uma es i pe de le edu a
conside ada de maio isco -
Dekke a b uxellensis
PYCC 4801 – a e iguando ambém o papel da
in ensidade do campo elé ico aplicado. Como obje i os secundá ios, p e ende-se igualmen e
a alia os seguin es pon os:
- A a aliação da sine gia dos e ei os é micos e não é micos na ina i ação da
D. b uxellensis,
combinando aplicação de campo elé ico com o aumen o da empe a u a média
de a amen o (incluindo compa ação com o a amen o é mico con encional);
- A a aliação dos e ei os da aplicação de di e en es in ensidades de campo elé ico en e
os 50 V/cm e os 600 V/cm na ina i ação de
D. b uxellensis
;
- A aplicação das condições de a amen o elé ico mais p omisso as em mos o de inho
e de esco e a aliação dos esul ados nas componen es mic obiológica e ísica e quimica
- A a aliação p elimina do impac o des es a amen os na e men ação do mos o a ado
e a e iguação das suas p incipais ca ac e ís icas ísico-químicas.
3
2. Fundamen ação Teó ica
2.1. His ó ia da Vinha e do Vinho
Pensa-se que o Homem p é-his ó ico e á sido o p imei o a c ia , po aciden e, uma bebida
de sumo de u a e men ado – endo sido encon ados egis os a queológicos da sua p odução a é
5000 a.C. na egião que é conhecida como o C escen e Fé il (Jackson R.S, 2008).
Com a ansição do nomadismo pa a o seden a ismo, a domes icação da idei a e á indo
acoplada à conceção da ag icul u a de á ios p odu os alimen a es. E e á sido des a manei a que,
com o empo, espécies capazes de p oduzi cachos mais densos, com bagos de u a maio es e
mais concen ados em açúca es e a omas o am sendo p e e idos e, po an o, mais p ocu ados
pelas populações. Tal acon ecimen o despole ou, en ão, uma seleção na u al po idei as com
esse ipo de ca ac e ís icas, desen ol endo-se simul aneamen e ag upamen os de ca ac e ís icas
da u a em a iedades consoan e as suas pa icula idades, que ao longo do empo ie am-se a
conhece e denomina pelas a iedades de u a que se conhecem nos dias de hoje (Ha ding, J.
e
al.
, 2012).
A ualmen e exis em á ias espécies de idei a – plan as pe encen es à amília
Vi aceae
,
géne o
Vi is
– sendo que a maio ia des as é na i a à Amé ica do No e e Ásia O ien al – como o
exemplo da espécie
Vi is lab usca
, idei a na u al da Amé ica do No e cujas u as p oduzem um
inho com a omas bas an e dis in os, como sendo o a oma a pelo animal e a u a c is alizada, e
Vi is amu ensis
, plan a na i a da Ásia O ien al. Con udo, é a espécie na i a da Eu ásia que é a
mais u ilizada na indús ia ínica, a
Vi is iní e a
. Es a espécie, conside ada supe io em e mos
de qualidade e a omas que con e e ao inho, ainda pode se di idida em duas subespécies:
Vi is
iní e a L.
subsp
. iní e a
– plan a he ma odi a domes icada na zona da Eu ásia – e
Vi is iní e a
L. subsp. sil es is – plan a dióica sel agem encon ada no Ociden e Eu opeu, No e de Á ica e
a é em países da Ásia Cen al (Ha ding, J.
e al
., 2012).
Desde en ão, a u a p o ou se o u o de maio p odução e come cialização ag ícola a
ní el mundial, uma ez que pode se usada an o pa a consumo – u as de mesa ou u as passas
– como pa a p odução de bebidas alcoólicas. Em 2018, dados da O ganização In e nacional da
Vinha e do Vinho (OIV) e elam que a p odução de inho a ingi a um dos maio es picos de
p odução desde o ano 2000 – sendo es e alo apenas ul apassado nos anos 2004 e 2013.
Fo am somados ce ca de 282 milhões de hec oli os de inho p oduzidos a ní el mundial, em que
os países mais p odu o es o am a Espanha, F ança e I ália.
4
2.2. O ganização In e nacional da Vinha e do Vinho – OIV
Com o passa do empo, ge ou-se a necessidade de ha e uma en idade egulado a com
o obje i o de soco e e pad oniza a p odução e come cialização de u as e de inho. E oi assim
que, em 2001 oi c iada a O ganização In e nacional da Vinha e do Vinho po 35 es ados
sobe anos – sendo que, em 2018, esse núme o a ingiu os 47 es ados memb os, e ainda con a
com a pa icipação de en idades como a União Eu opeia (EU) e a In e na ional Wine Law
Associa ion (AIDV). Es a é uma o ganização com o p incipal obje i o de
s anda diza
as p á icas
enológicas a ní el mundial, e é a en idade de e e ência an o no domínio das inhas, do inho e
das bebidas à base de inho como de odos os p odu os de i ados da inha.
Segundo es a, no Regulamen o EU nº 1308/2013 do Pa lamen o Eu opeu e do seu
Conselho, inho é qualque p odu o p oduzido exclusi amen e po e men ação alcoólica, o al ou
pa cial, de u as escas, esmagadas ou não, ou de mos o de u as. Já u as são o u o da ideia
u ilizados pa a ini icação, madu os ou mesmo ligei amen e passados, susce í eis de se em
esmagados ou esp emidos com os meios no mais de adega e de o igina em espon aneamen e
uma e men ação alcoólica. Mos o de u as é o p odu o líquido ob ido na u almen e ou po
p ocessos ísicos a pa i de u as escas, cujo í ulo alcoomé ico olúmico adqui ido não pode á
ul apassa o alo de 1 %.
Pa a além da OIV, ainda oi c iada uma en idade nacional em 1986, denominada po
Ins i uição da Vinha e do Vinho (IVV), com o obje i o de p omo e os p odu os i i inícolas, ga an i
o uncionamen o da Comissão Nacional da O ganização In e nacional da Vinha e do Vinho e audi a
o sis ema de ce i icação de qualidade, en e ou as unções. Es a disponibilizou limi es de
segu ança da p esença de uma a iedade de subs âncias que pode ão oco e nesses p odu os –
alguns dados mais ele an es encon am-se expos os na Tabela 1 – e ainda o neceu dados pa a
os limi es de segu ança em caso da p esença de ce os con aminan es ínicos – es ando es es
p esen es na Tabela 2.
5
Tabela 1 Limi es analí icos e limi es de emp ego de ce as subs âncias em inhos, bebidas espi i uosas e
inag e de inho es abelecidos pela IVV (2019)
Pa âme o
Limi e
Base Ju ídica
Acidez To al
Vinhos (exp essa em
ácido a á ico)
> 3,5 g/l
> 46,6 meq/L
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III- 1 d)
Acúca es ( eo em açúca es, exp esso em glucose + u ose)
inhos espuman es
Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo
XIV - Pa e A
"b u o na u al"
< 3 g/L
"ex a b u o"
0 - 6 g/L
"b u o"
< 12 g/L
"ex a seco"
12 - 17 g/L
Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo
XIV - Pa e A
"seco"
17 - 32 g/L
"meio seco"
32 - 50 g/L
"doce"
> 50 g/L
P odu os di e en es
dos inhos
espuman es
Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo
XIV – Pa e B
"seco"
não supe io a:
- 4 g/L ou
- 9 g/L ,se a acidez o al, exp essa
em g/L de ácido a á ico, não o
in e io em mais de 2 g/L ao eo
de açúca esidual
"meio seco",
"adamado"
supe io ao máximo acima
indicado, mas não supe io a:
- 12 g/L ou
- 18 g/L , se a acidez o al,
exp essa em g/L de ácido
a á ico, não o in e io em mais
de 10 g/L ao eo de açúca
esidual
"meio doce"
supe io ao máximo acima
indicado, mas não supe io a:
- 45 g/L

6
Tabela 1. Limi es analí icos e limi es de emp ego de ce as subs âncias em inhos, bebidas espi i uosas
e inag e de inho es abelecidos pela IVV (2019) (con inuação)
Pa âme o
Limi e
Base Ju ídica
Acúca es ( eo em açúca es, exp esso em glucose + u ose)
"doce"
> 45 g/l
Vinhos in os e
palhe es
> 1,8 g/l
Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo
XIV – Pa e B
Sul a os (exp esso em sul a o de po ássio)
Vinhos
< 2 g/l
Po a ia nº 334/94, de 31 de
Maio
Tí ulo Alcoomé ico Volúmico To al (TAV To al)
Vinho
< 15% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 1 c)
Vinho Lico oso
> 17,5% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 3 b)
Vinho espuman e
> 8,5% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 4 d)
Vinho espuman e de
qualidade
> 9% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 5 d)
Vinho espuman e de
qualidade ipo
a omá ico
> 10% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 6 d)
Vinho isan e
> 9% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 8 a)
Vinho isan e
gasei icado
> 9% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 9 b)
Vinho p o enien e de
u as passa
> 16% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 15 b)
Vinho de u as
sob eamadu ecidas
> 15% ol.
Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo
III – 16 c)
Tabela 2
.
Teo es máximos de ce os con aminan es es abelecidos pela IVV (2019)
Con aminan e
Limi e
Base Ju ídica
Chumbo
< 0,15 mg/kg
Reg. (CE) nº 1881/2006,
Secção 3.1 do Anexo
Oc a oxina A
< 2,0 µg/kg
Reg. (CE) nº 1881/2006,
Secção 2.2. do Anexo
Pa ulina
< 50 µg/kg
Reg. (CE) nº 1881/2006,
Secção 2.3. do Anexo
7
2.2.1. Região Dema cada dos Vinhos Ve des
O inho p oduzido em Po ugal é no o iamen e um p odu o bas an e solici ado, an o pelo
me cado nacional como po me cados es angei os, endo mesmo sido c iado em 1703 um
a ado en e Po ugal e Ingla e a com o obje i o de egulamen a a en ada de inho po uguês
em egime especial nesse país – conhecido como o a ado de Me hween. Mas oi em 1908 que
o ei D. Ca los dema cou o icialmen e a egião i i inícola dos Vinhos Ve des, cuja á ea geog á ica
engloba as sub- egiões de Monção e Melgaço, Lima, Cá ado, A e, Bas o, Sousa, Ama an e, Pai a
e Baião – cada uma com o seu clima especí ico e ca ac e ís icas geológicas e de solo, que azem
com que es as egiões es ejam ambém mais ap as a p oduzi u as de um ce o núme o de cas as.
E oi em 1926 que oi c iada a Comissão de Vi icul u a da Região dos Vinhos Ve des
(CVRVV) e no amen e acen uada a delimi ação da egião, com o Dec e o n.º 12.866. Es a
ins i uição nacional de e minou como sua p incipal missão a p omoção, con olo e ce i icação dos
p odu os ínicos com Denominação de O igem Vinhos Ve de e Iden i icação Geog á ica Minho,
bem como a de esa do pa imónio egional e nacional dos Vinhos Ve des e o apoio e dinamização
da melho ia da qualidade da inha (CVRVV, 2019).
Sabe-se en ão que a Denominação de O igem (DO) de Vinhos Ve des engloba an o inhos
anquilos, como espuman es, agua den es ínicas e bagacei as e a é mesmo inag es; es ando
es es sujei os a uma sé ie de equisi os e legislações associadas à delibe ação dessa designação,
que ão desde as cas as que pode ão se selecionadas às ca ac e ís icas o ganolé icas do inho
inal. Es a denominação su ge como uma ga an ia do ní el de qualidade dos inhos que lhe es ão
associados – exis indo ainda a Indicação Geog á ica (IG), cuja designação é ambém con olada
pela En idade Ce i icado a e a qual segue as suas p óp ias legislações e equisi os especí icos.
Pa a um inho ob e a designação de Vinho Ve de é, en ão, necessá io a a essa uma
sé ie de equisi os, iniciando-se pelo cadas o das pa celas de inha no Regis o Cen al Vi ícola
(RCV), a insc ição na en idade ce i icado es de odos os p odu o es e come cian es a ope a em
com o p odu o, ambém a iden i icação das ins alações e con i mação da sua á ea geog á ica
pe ence à egião dema cada, de endo ainda se en egue a Decla ação de Colhei a e P odução
(DCP).
Sabe-se ainda que o Regulamen o CE n.º 479/2008 di a que um le an amen o, po pa e
da en idade con olado a, de e se ei o anualmen e aos p odu os nos labo a ó ios da CVRVV (no
caso dos Vinhos Ve des) das suas ca ac e ís icas o ganolé icas e analí icas e e i icação do
8
cump imen o das exigências es abelecidas – desde a concen ação de açúca es o ais (exp essa
em u ose e glucose), a acidez o al, a acidez olá il, concen ação de dióxido de enxo e o al ao
eo alcoólico o al e adqui ido, passando ainda po uma análise aos a omas, sabo e aspe o do
p odu o. Pa a p odu os ínicos que enham so ido alguma e i icação ou ajus e dos seus
pa âme os ísico-químicos, o mesmo Regulamen o ainda impõe que es es sejam mencionados –
é o exemplo da acidi icação ou desacidi icação, a adição de dióxido de enxo e, o aumen o do í ulo
alcoomé ico e o uso de no as p á icas enológicas.
O inho de e se p i ado de de ei os o ganolé icos, com a omas e sabo ca ac e ís icos
da sua egião dema cada, ainda p o endo de ca ac e ís icas especí icas de uma sub- egião
aquando a iden i icação da mesma – endo es es pa âme os de quali ica numa no ação igual ou
supe io a seis (numa escala de 1 a 10) pa a ambos os casos (CVRVV, 2019).
Ainda, os p odu o es de e ão ga an i que o seu endimen o máximo, po hec a e de
inha, não ul apassa os 10666 kg, dos quais o endimen o em mos o de u a após a emoção dos
bagaços não ul apassa os 75 L po 100 kg de u as – exce o pa a a cas a Al a inho, cujo limi e é
65 L de mos o po cada 100 kg de u as (CVRVV, 2015).
Aquando a o ulagem, de e á cons a a designação do p odu o bem como a sua ma ca,
uma indicação da sua p o eniência, uma e e ência ao lo e e ao enga a ado , o seu í ulo
alcoomé ico olúmico adqui ido, o olume nominal, indicação da p esença de ale génios e ainda,
no caso de se a a de um inho opalino, de e á p o e de uma menção da possibilidade da
o mação de um depósi o. Facul a i amen e pode á e , en e ou as indicações, uma e e ência à
co , ao seu ano de colhei a e às cas as p esen es.
Po an o, só após um cump imen o e e i icação de odos os equisi os es abelecidos é
que o p odu o pode á se candida o a u iliza o selo de ga an ia cedido pela Comissão de Vi icul u a
da Região dos Vinhos Ve des, al como é possí el e na Figu a 1 (CVRVV, 2019).
Figu a 1 Selo de ga an ia da Comissão de Vi icul u a da Região dos Vinhos Ve des (CVRVV,2019).
9
2.3. P ocesso P odu i o do Vinho
A ini icação, ou seja, o p ocesso p odu i o do ab ico de inho inicia-se com a colhei a da
u a e o que é conhecido po p á icas p é- e men a i as, ou seja, o desengace e o esmagamen o.
Es es passos, espe i amen e, e e em-se à sepa ação das u as dos engaços, olhas e ma e ial
lenhoso a elas associado, e ao esmagamen o das u as com a o u a da película e libe ação da
polpa e sumo.
No que diz espei o ao desengace, es e passo pode á se de especial in e esse no
p ocesso indus ial, uma ez que e i a os compos os enólicos – ca equinas, la onoides e ácido
ca á ico – do inho inal. Po ém, es es compos os pode ão se de especial in e esse no caso da
p odução de inho in o cuja a iedade da u a u ilizada seja ca ac e is icamen e pob e em
compos os enólicos. Os compos os enólicos p esen es na película con e em uma sensação de
ads ingência e ama gu a meno es em compa ação aos enóis p esen es nos engaços e nas
g ainhas. Apesa de não se ão usado a ualmen e, há quem e i e es e passo na p odução de
inho in o, uma ez que aumen a a concen ação de aninos, que p opo cionam ao inho uma
maio densidade de co e a sensação de um inho mais enco pado (Jackson R.S. ,2008).
Já o esmagamen o de e se ei o o mais p óximo possí el do desengace, e na e dade,
na colhei a da u a, de modo a e i a a con aminação e e ei os de escu ecimen o nas u as que
aciden almen e são eben adas du an e os passos que o p ecedem.
En e os passos de desengace e esmagamen o, pode á ainda ha e uma seleção das
u as, de manei a a emo e ma e iais indesejados deixados após o desengace – en e os quais
inse os, u as que não enham a ingido o seu pico de ma u ação e u as que enham so ido eações
de escu ecimen o – pa a não comp ome e a qualidade do p odu o inal.
Seguidamen e, em-se a mace ação da u a, em que sucede a o u a da película e
ca ac e iza-se pela libe ação da polpa e g ainhas e o con ac o des es ês cons i uin es. Es e
con ac o i á acili a a libe ação de á ios compos os como ácidos go dos, álcoois supe io es,
enzimas hid olí icas e compos os a ie ais como conjugados de S-cis eína, que i ão ainda acili a
a e men ação e melho a a iabilidade da le edu a e men a i a. Mas ambém pode á le a a
eações e p ocessos indesejá eis, como a ans e ência de p o eínas que são ins á eis ao calo –
al oco ência pode se emediada pelo uso de es abilizan es químicos, ou p e enida a a és de
um empo de mace ação mais cu o (Jackson R.S., 2008).
16
Da mesma análise esul am Pon os de Con olo C í icos (PCC), que são si uações que não
são p e is as po Códigos de Boas P á icas – não sendo en ão classi icadas como p é- equisi os
– e que podem causa danos à segu ança ou saúde no caso de se em conside ados signi ica i os.
Es es es ão ainda di ididos em pe igos químicos, ísicos e biológicos.
Pa a o p ocesso p odu i o do inho, a exis ência de p agas ou doenças na ma é ia-p ima
e/ou na água de i igação oi iden i icado como um pe igo biológico, a p esença de obje os
es anhos aquando a colhei a da u a é o exemplo de um pe igo ísico, sendo exemplos de pe igos
químicos a p esença de esíduos de desin e an es de i ados dos a amen os i ossani á ios e
he bicidas aquando a plan ação da inha, concen ações ele adas de sul i os adicionados pa a
con olo dos mic o ganismos e a p esença de Oc a oxina A (OIV, 2012).
No que oca à u ilização de adi i os aquando a p odução de inho, sendo o dióxido de
enxo e conside ado um adi i o de con olo mic obiológico, há uma sé ie de ecomendações –
incluindo a concen ação diá ia ecomendada – que de e ão se seguidas de manei a a que a sua
adição possa se en ão possí el (FAO & WHO, 2016).
É ainda de salien a que a p esença de oxinas como a Oc a oxina A no inho inal é
o emen e de ida à p esença de espécies como a
A. ca bona ius
e a
A. Nige
nas u as desde a
e apa da i icul u a. Uma ez que concen ações excessi as impedem a u ilização das u as – com
exceção de u as a e adas com “pod idão nob e” – de e-se eco e a uma colocação da inha
mais ap op iada, de modo e i a o con ac o dos cachos de u a com o solo e os seus espe i os
mic o ganismos e um melho planeamen o da da a da indima, e i ando ainda o con ac o com
animais que possam se on e de con aminação das u as (FAO, 2007).
2.4.1. Des an agens da Sul i ação
Na en a i a de um con olo mic obiano na p odução do inho, o mé odo mais comumen e
usado pela comunidade i i inícola é a adição de dióxido de enxo e. Es e compos o pode á se
adicionado na o ma sólida (me abissul i o de po ássio), gasosa ou, mais usualmen e, na o ma
líquida (solução sul u osa), e é conhecido po possui p op iedades an ioxidan es e an issé icas,
con ibuindo ambém pa a a manu enção da co e a omas do inho du an e a ma u ação. Es e
compos o é capaz de impedi o desen ol imen o de le edu as, bac é ias acido-lá icas e a é
algumas bac é ias acido-acé icas, conseguindo impedi eações como o apod ecimen o causado
po bac é ias ou o c escimen o de
B e anomyces spp
.. Consegue ainda impedi a oxidação de

17
compos os do inho e eações de escu ecimen o a a és da ina i ação de enzimas como a
pe oxidase.
A p esença de sul a o de enxo e exis e na u almen e no inho sem ha e a necessidade
de qualque ipo de adição. Tal ac o de e-se à p odução des e compos o aquando a e men ação
alcoólica po pa e das le edu as e men a i as, a a és do consumo de enxo e li e na sua o ma
molecula (S2-) du an e a sín ese de aminoácidos, ou à sua libe ação na o ma de sul a o de
hid ogénio (H2S) – sendo es a a sua o ma mais indesejada de ido ao chei o e ao sabo
desag adá eis (Coimb a, M.
e al
., 2012).
A capacidade de p odução de dióxido de enxo e po pa e de le edu as – sendo o exemplo
da
Saccha omyces ce e isiae
– a ia de espécie pa a espécie, mas pensa-se que possam di e gi
en e os 0 mg/L e os 115 mg/L. Nesse caso, o ac o de es e compos o se p oduzido pela célula
pode se cúmplice na esis ência de ce as le edu as ao adi i o de con olo mic obiológico mais
comum. Uma das soluções pa a es e possí el p oblema é o uso de es i pes de le edu a que
p oduzam pequenas quan idades de dióxido de enxo e (Puxeu, M.
e al
., 2018).
Quan idades mínimas de SO2 li e esul a ão numa ação pouco e icien e no con olo e
manu enção do inho, enquan o que concen ações excessi as i ão causa al e ações
o ganolé icas e danos à saúde humana. Uma ez que o SO2 pode es a p esen e nos inhos sob e
a o ma li e ou ligada, um mé odo iá el de dosagem e con olo da concen ação des e compos o
é di icul ado. Po ém, sabe-se que a sua o ma a i a – o ma com p op iedades an imic obianas e
an ioxidan es – é a o ma molecula SO2 li e, que es á dependen e da disponibilidade da mesma
e dos ní eis de pH. (Coimb a, M.
e al
., 2012).
De ido às eações ad e sas dos consumido es causadas pela p esença quan idades
signi ica i as de dióxido de enxo e – que pode ão mani es a -se na o ma de de ma i e alé gica,
u icá ia, dia eia, e di iculdades na espi ação – pa a além de uma pe da das p op iedades do
inho e, ainda, os obs áculos ambien ais associados à emoção des e compos o, em sido ei o
um es o ço pa a encon a al e na i as que possam subs i ui a u ilização des e compos o na
ini icação (Puxeu, M.
e al
., 2018). Alguns mé odos que êm sido es udados encon am-se
expos os na Tabela 3.
18
Tabela 3
.
Mé odos de con olo mic obiano e espe i os mecanismos de ação, baseado na publicação de
Ba owsky, E. J. (2009)
Al e na i as de Con olo Mic obiano
Mecanismo de Ação
T adicional
Dióxido de enxo e
Inibe o desen ol imen o de mic o ganismos
Fil ação
Remoção ísica dos mic o ganismos do inho
Química
Dica bona o de dime ilo (DMDC)
Reação i e e sí el com os aminoácidos nos
si es
a i os das enzimas
P odu os Na u ais
Lisossomas
Impede a sín ese de pa ede celula , le ando à
lise celula
Bac e iocinas
Modi ica os componen es da pa ede celula ,
le ando à lise celula
2.5. P ocessos Al e na i os de Ina i ação Mic obiológica de Vinhos
Um dos maio es desa ios da a ualidade é a conceção de no as ecnologias e soluções que
melho em o bem-es a do consumido , a qualidade e a segu ança alimen a , e que
simul aneamen e con ibuam pa a a de esa do plane a e uma meno pegada ecológica. Como já
oi e e ido, a sul i ação do mos o de u a e/ou do inho e men ado cons i ui um p oblema a ní el
económico, ambien al e um isco pa a a saúde; daí, po an o, se conside ado na á ea de
in es igação cien í ica como uma opo unidade pa a a c iação de no as e melho es opções pa a
o con olo mic obiológico do p ocesso de ab ico do inho.
19
Tabela 3. Mé odos de con olo mic obiano e espe i os mecanismos de ação, baseado na publicação de
Ba owsky, E. J. (2009) (con inuação)
Tecnologias Reco en es
Ul ahigh p essu e (UHP)
Dani ica a memb ana ci oplasmá ica, p o oca a
ina i ação enzimá ica
Ul assons de al a po ência
Causa o encu amen o da memb ana celula ,
aquecimen os localizados e p odução de adicais
li es
I adiação UV
Dani ica o ADN
Campos Elé icos Pulsados
P o oca o colapso da memb ana celula po
e ei os elé icos
Vá ios es o ços já o am en ão ei os numa en a i a de i a soluciona es e p oblema. De
en e eles, des aca-se o abalho ealizado po Du ne , D.
e al
., que, em 2017, es udou os e ei os
de ina i ação mic obiológica de a amen os com adiação ul a iole a em inho e mos o de inho.
Nos seus ensaios oi en ão u ilizado mos o de u a da a iedade
Riesling
com a sua mic o lo a
na i a, sendo es e a ado u ilizando uma lâmpada de me cú io a a és da qual a adiação UV-C
máxima ge ada e a de 245 nm. Foi concluído que o ní el de ina i ação das espécies p esen es
e a dependen e não só da espécie, mas ambém da concen ação inicial das mesmas an e io ao
a amen o. As le edu as p o a am se mais esis en es do que as espécies de bac é ias
p esen es, sendo que a
Saccha omyces ce e isiae
mos ou se a espécie mais esis en e à
i adiação. Fo am ob idos e ei os de ina i ação dos mic o ganismos p esen es semelhan es pa a
o caso do a amen o usando adiação UV-C e pa a o caso da pas eu ização, com a an agem de
a adiação UV-C não a e a a concen ação de p ecu so es de a oma do mos o e se capaz de
in e ompe a e men ação alcoólica mesmo na p esença de açúca es esiduais (Du ne , D. e al,
2007).
Al e na i amen e, Chen, P.
e al
em 2006 es udou as al as p essões hid os á icas (HHP)
na pas eu ização de inho com baixo eo alcoólico. A empe a u a oi man ida a 25 ⁰C enquan o
que a p essão oi colocada en e os 101,3∙103 kPa e os 354,64∙103 kPa du an e 0 min a é 30 min,
20
analisando-se a concen ação de bac é ias ae óbias, le edu as e bac é ias ácido-lá icas e ainda
p op iedades senso iais do inho a ado a a és de 10 painéis de es e (apenas pa a o inho
a ado a 354,64∙103 kPa po 10 min). A concen ação de bac é ias ae óbias oi conside ada nula
a pa i dos 20 min de a amen o a 303,98∙103 kPa e a pa i dos 10 min de a amen o a
354,64∙103 kPa, o mesmo e ei o de ina i ação oi obse ado pa a as bac é ias ácido-lá icas a pa i
dos 20 min a uma p essão de 303,98∙103 kPa ou a pa i dos 5 min a 354,64∙103 kPa; enquan o
que pa a as le edu as apenas com p essões supe io es a 303,98∙103 kPa é que se e i icou al
e ei o. Foi possí el cons a a que a a és da conceção da ciné ica de ina i ação dos
mic o ganismos que pode iam es a p esen es dois g upos dis in os de mic o ganismos no inho,
sendo um deles mais susce í el a es e ipo de a amen os uma ez que a axa de ina i ação nas
e apas iniciais e a supe io em elação às inais. Concluiu-se igualmen e que os a amen os a
HHP não i e am impac o nas ca ac e ís icas ísico-químicas do inho (Chen, P.
e al
, 2006).
2.5.1. As Ele o-Tecnologias Nos P ocessos de ina i ação
No que oca a ecnologias eco en es no âmbi o de biop ocessos e de in e esse an o
pa a a in es igação cien í ica como pa a a indús ia, é de salien a as ecnologias que en ol em a
u ilização de co en e elé ica como e o de p ocessamen o. De ac o, es as ecnologias englobam
em si um ex enso espe o de aplicações e uma sé ie de an agens desde a es abilização de
bioma e iais, a acili ação da ex ação de componen es à assis ência nos p ocessos de sepa ação.
Alguns dos e ei os deco en es da aplicação de campos elé icos en ol em a dissipação de pa e
da ene gia sob a o ma de calo – enómeno conhecido como E ei o de Joule ou aquecimen o
óhmico – e a ele opo ação, que se e e e ao enómeno que oco e de ido à capacidade do campo
elé ico pulsado de ele ada in ensidade p o oca uma pe meabilização da memb ana celula
causada pela ge ação de um po encial ansmemb ana (San os, P.,& Rod igues, R., 2018).
E e i amen e, dependendo do obje i o e das di e en es condições de aplicação e
equipamen o, di e en es p o ocolos elé icos podem se es abelecidos. A ualmen e, as p incipais
ecnologias baseadas na aplicação de campos elé icos encon am-se di ididas numa a iedade
de espe os, di e enciando-se en e si pelos seguin es a o es: ipo de co en e u ilizada,
in ensidade da o ça do campo elé ico, equência e ipo de onda elé ica, empo de a amen o e
o e ei o é mico. Des e modo, es as ecnologias pode ão se di ididas em: Aquecimen o Óhmico
(OH), Aquecimen o Óhmico Pulsado (POH), Campos Elé icos Mode ados (MEF), Campos Elé icos
Pulsados (PEF) e Desca gas Elé icas de Al a Vol agem (HVED).
21
No que diz espei o às HVED, ca ac e izadas po pulsos de al a co en e e al a ol agem,
é p omo ida a ele opo ação e dissipação de calo e ainda é comum oco e em enómenos como
a ca i ação, emissão de luz, e ei o de choque e o mação de adicais. Desa ios associados a es a
ecnologia baseiam-se na demanda e cus os dos ma e iais e equipamen os e limi ações
elacionadas à ope ação em si (San os, P.,
e al
, 2018).
A ecnologia PEF é p o a elmen e mais es udada no que diz espei o a mé odos de
ex ação. A a és des a ecnologia, conside ada como sendo não- é mica, são aplicados pulsos
elé icos na o dem dos quilo ol s po cen íme o, em in e alos de empo cu os (nanossegundos),
p o ocando assim a ele ope meabilização da memb ana e a dani icação de es u u as
in acelula es que podem de e mina a lise celula . Os a o es que con ibuem pa a a e iciência
des a écnica es ão elacionados com o ipo de pulso (unipola ou bipola ), núme o de pulsos po
unidade de empo, a sua du ação, a empe a u a de ope ação e as ca ac e ís icas do p óp io
p odu o e meio. A ualmen e, em-se e i icado a endência pa a o na os PEF, um p ocesso
essencialmen e econhecido como sendo não- é mico, num p ocesso que en ol a o e ei o da
empe a u a. Es a no a endência em concebido no os es udos, que denominam es a a ian e de
Aquecimen o Óhmico Pulsado (POH).
Pa a além das écnicas que usem co en e elé ica pulsada, exis em écnicas que se
se em da aplicação de campos elé icos sem es ições do empo de aplicação, o ma o de onda
e equência elé ica. São o exemplo disso od MEF e o OH, que se ca ac e izam ambas pela
aplicação de campos elé icos de baixa ou mode ada in ensidade sem es ições no empo de
a amen o, e cujo e ei o é mico pode se con olado ou minimizado (no caso do MEF) ou
di ecionado pa a p ocessamen o é mico (caso do OH). Ambas écnicas u ilizam co en e elé ica
al e nada, sendo que, po es a azão, no malmen e a sua aplicação esul a na dissipação
signi ica i a de calo . OH e MEF só se di e enciam pela ques ão do e ei o é mico; no caso do
MEF, o aquecimen o po e ei o de Joule pode se minimizado, limi ando a condu i idade elé ica
do meio, p ocu ando-se des a o a da ele o aos e ei os elé icos deco en es da ecnologia; em
sen ido con á io no caso do OH, p e ende-se assumidamen e acen ua a dissipação de calo . De
ac o, an o o MEF como o OH são écnicas com condições de implemen ação mais acili adas ao
con á io de ou as ele o- ecnologias mencionadas an e io men e, ainda com a ace a de
pe meabiliza a memb ana e induzi a ex ação de compos os (análise caso a caso), podendo se
usados numa a iedade de aplicações.

22
Ao longo dos anos, es e ipo de ecnologias em sido, en ão, cada ez mais es udado, bem
como a sua aplicação na indús ia dos inhos. Bousse a, N.
e al
., em 2015, es udou o e ei o de
ina i ação dos PEF e HVED em
Oenococcus oeni
,
Pediococcus pa ulus
e
B e anomyces
b uxellensis
, p esen es em inho in o (com a exceção de
O. oeni
e
P. pa ulus
pa a o a amen o
a HVED), bem como o seu e ei o na qualidade do inho. Pa a al, o am u ilizados os empos de
a amen o 1, 2, 4, 6, 8 e 10 ms e ol agens de 20 kV/cm e 40 kV/cm pa a o a amen o usando
PEF e HVED, espe i amen e. Fo am ambém es udados di e en es pa âme os ísico-químicos
nos inhos, nomeadamen e o pH, a concen ação de açúca es esiduais, concen ação de ácido
lá ico, ácido a á ico e ácido málico, bem como a sua acidez o al, acidez olá il e concen ação
em aninos e an ocianinas, en e ou os pa âme os. Hou e, en ão, a ina i ação da
B. b uxellensis,
O. oeni e P. pa ulus
pa a ambos os a amen os, sendo que pa a o a amen o a PEF es a
ina i ação oi mais bem-sucedida; ambém no que diz espei o aos pa âme os ísico-químicos,
e i icou-se que os a amen os a PEF não e ão ido um impac o nega i o na composição do inho
inal, ao con á io dos a amen os a HVED (Bousse a, N.
e al
., 2015).
Mok, C.
e al
., em 2018, ambém aplicou o concei o das ele o- ecnologias –
nomeadamen e os PEF – no a amen o de inho in o de baixo eo alcoólico. Pa a al, o am
u ilizados se e elé odos ligados em sé ie po onde se ize am passa co en es de al a ol agem
em pulsos de 1 µs, com o campo elé ico a a ia en e os 20 kV/cm e os 50 kV/cm e uma
equência en e os 500 Hz e os 1500 Hz. Espécies de le edu as p o a am se mais susce í eis a
es e ipo de a amen o, seguidas po espécies de bac é ias ae óbias e, po úl imo, bac é ias ácido-
lá icas. Ve i icou-se uma maio axa de mo e celula en e os 30 kV/cm e os 40 kV/cm com a
equência a a ia en e os 500 Hz e os 1500 Hz. No que diz espei o aos alo es
D
pa a a
equência da co en e elé ica necessá ia pa a eduzi o núme o de mic o ganismos, as le edu as
ap esen a am um alo meno em compa ação com os es an es mic o ganismos, seguidas po
bac é ias acé icas e, po úl imo, as bac é ias ácido-lá icas. Já o alo
D
que elaciona a equência
com o empo de a amen o oi meno pa a as le edu as, sendo que ambos os alo es
D
o am
in e sos à in ensidade do campo elé ico. O alo
z
que elaciona a equência com o empo de
a amen o e elou se mais baixo pa a as bac é ias ácido-lá icas, ce ca de 24,6 kV/cm, e mais
al o pa a as le edu as, ce ca de 46,8 kV/cm (Mok, C.
e al
., 2018).
23
2.6. Aquecimen o Óhmico (OH)
O OH a ecnologia com maio e iciência de implemen ação na indús ia, nomeadamen e
na pas eu ização e es e ilização de alimen os (San os, P.,
e al
, 2018). Aquecimen o Óhmico, ou
aquecimen o de Joule, é um mecanismo e sá il que emp ega ene gia elé ica no a amen o de
uma a iedade de p odu os, endo a pa icula idade de oco e a con e são quase o al da ene gia
elé ica emp egue em ene gia é mica, causada pela esis ência elé ica dos ma e iais e meio, e
consegue ainda o nece um aquecimen o homogéneo das pa ículas do meio que es á a a a
(Kau , N.
e al
., 2016). Nes e mecanismo é necessá io o con ac o en e os elé odos e o meio
condu o (p odu o al o) de o ma a pe mi i a passagem de co en e e dissipação de calo no seu
in e io ; es e é po isso um p ocesso de aquecimen o di e o, sendo que o calo ge ado no p odu o,
não sendo ans e ido a a és de supe ícies quen es (mé odos indi e os). O seu modo de ação
ambém em a an agem de e i a a deg adação de compos os sensí eis ao calo – sendo
e icien emen e ap o a conse a a qualidade do alimen o – e e i a a o mação de inc us ações e
sujidades p o eicas (e ei os de ouling).
En e ou os pa âme os, es e mecanismo depende da condu i idade elé ica do p odu o,
do o ma o em que o mesmo a a essa pelo sis ema, o espe i o empo de esidência e da
in ensidade do campo elé ico. O seu
design
baseia-se num ce o núme o de componen es-cha e,
exempli icados na Figu a 2, sendo es es um ge ado de ene gia (ligado a um ampli icado de sinal,
ou não) e ligado a dois elé odos que se encon am posicionados de modo a que es ejam em
con ac o com o p odu o e dis anciados o su icien e pa a pode em e e ua o a amen o no mesmo,
mas não o su icien e de modo a que a in ensidade da co en e aplicada seja mínima. Ainda de e á
e uma unidade de con olo da ol agem aplicada e um sis ema de aquisição de dados.
T adicionalmen e, es e mé odo é usado em ea o es ipo
ba ch
, mas exis em
designs
especi icamen e c iados de modo a que es a ope ação possa deco e em con ínuo (Bawa, A.
e
al
. 2014).
A condu i idade elé ica do p odu o a a a é um pa âme o c í ico des a ecnologia, que
de ine a ape ência de aplicação assim como axas e e iciência de aquecimen o. A condu i idade
elé ica é um pa âme o dependen e da es u u a e do ipo de ligações químicas p esen es na
ma iz alimen a – pa âme os como a o ça iónica e p esença de iões aumen am os alo es de
condu i idade elé ica. Sabe-se ambém que o aumen o da empe a u a po e ei o de Joule é
p opo cional ao aumen o da condu i idade elé ica do p odu o, es ando es e pa âme o en ão
24
Figu a 2 Esquema exempli ica i o de um sis ema de aquecimen o óhmico, e i ado de Mel on, L.
e al
.,
2019.
associado à e iciência do a amen o.
Ou os pa âme os a conside a são: a equência elé ica – baixas equências elé icas
podem p omo e a co osão dos elé odos dependendo do ipo de ma e ial e condu i idade elé ica
do meio; a ol agem e/ou campo elé ico aplicada – que i á de ini a axa de aquecimen o;
composição do alimen o – se a ma iz não o homogénea, o aquecimen o pode á não se
uni o me; e a iscosidade do luído, que pode in luencia o aquecimen o, nomeadamen e alo es
maio es de iscosidade endem a aquece mais dep essa.
Es a ecnologia es á, po an o, associada a um núme o de an agens, e elando-se uma
al e na i a a a i a pa a p ocessos como de ina i ação mic obiana. Algumas dessas an agens são
os baixos cus os associados à sua manu enção e cus os de ope ação, a sua ele ada e iciência no
a amen o de uma g ande a iedade de p odu os, an o líquidos como sólidos, associados a um
baixo isco da oco ência de danos no alimen o p o ocados po e ei o do calo (Bawa, A.
e al
.
2014). Nes e sen ido, o am já á ios os es udos ei os com o obje i o de ap o unda o
conhecimen o ace ca des a ecnologia e a sua possí el aplicação em p ocessos indus iais.
Pe ei a,
e al
, em 2007, de e minou a ciné ica de mo e da bac é ia
Esche ichia coli
, em
lei e c u com ecu so ao aquecimen o óhmico. Os esul ados o am compa ados com o a amen o
é mico con encional – sendo que os pe is é micos o am man idos idên icos
Fo am es adas as empe a u as 55 ⁰C, 63 ⁰C, 65 ⁰C, 67 ⁰C e, adicionalmen e, 70 ⁰C pa a
o caso do a amen o con encional. Dos ensaios esul a am alo es
D
pa a as amos as
subme idas a a amen o óhmico in e io es em compa ação aos alo es
D
das amos as a adas
25
pelo mé odo con encional, sendo a única exceção o caso em que a empe a u a de ensaio oi de
55 ⁰C. Já pa a o alo z, es e oi supe io no caso das amos as a adas pelo mé odo con encional
ela i amen e ao a amen o óhmico. Foi en ão possí el a e i que o a amen o óhmico oi mais
e icaz na ina i ação da
E. coli
nas amos as de lei e c u do que o a amen o pelo mé odo
con encional. Uma ez que ambos os a amen os o am ealizados sob o mesmo pe il é mico,
as di e enças a ibuídas o am jus i icadas pela p esença do campo elé ico. Concluiu-se que, nes e
caso, o OH e e um e ei o elé ico adicional na ina i ação do mic o ganismo (Pe ei a, R.
e al
,
2007).
Ainda em 2017, Kima, N.
e al
. es udou o e ei o de ina i ação do aquecimen o óhmico em
espo os de
Alicyclobacillus acido e es is
,
inoculada em sumo de maçã, compa ando-o ambém
ao aquecimen o con encional. 50 kg de sumo de maçã o am inoculados com
A.
acido e es is
,
sendo pos e io men e sujei os a a amen os com empe a u a a iá el en e os 85 °C e os 100
°C du an e in e alos de empo de a amen o de 30 s a 90 s, sendo ainda sujei os a uma po ência
elé ica de 26,7 V/cm e uma equência de 25 kHz exclusi amen e quando se a a a do
a amen o óhmico. Com a u ilização de cinco a amen os sequenciais, o aquecimen o óhmico
p o ou se uma al e na i a mais e icien e pa a a ina i ação de
A. acido e es is
do que o
aquecimen o con encional nas mesmas condições, sendo que as condições o imizadas de
ina i ação e ela am se 100 ⁰C a um in e alo de empo de 30 s (Kima, N.
e al
., 2017).
32
Já pa a os inóculos subme idos a um a amen o óhmico a uma ol agem baixa, os
elé odos e am ligados a um ge ado de sinal (33220ª, Agilen Technologies Inc., Es ados Unidos
da Amé ica) – onde o ipo de onda escolhido oi o sinusoidal e a equência de ope ação ixou-se
nos 50 kHz – a um ampli icado de sinal (CS 3000, Pea y Elec onics Co po a ion, Es ados Unidos
da Amé ica), que amplia a a ol agem do ge ado 30 ezes.
Foi ealizado ainda um es udo do empo de p a elei a após a ealização do P o ocolo IV,
onde as amos as em iplicado o am deixadas a uma empe a u a de 5 ⁰C, às quais que o am
e i adas amos as de 200 µL de modo a supe isiona o desen ol imen o mic obiano a a és da
lei u a da espe i a abso ância a 600 nm, e plaqueamen os em iplicado semp e que se
obse a a uma al e ação do alo da abso ância.
3.2.1. A aliação em Mos o de Vinho Ve de
Com base nos esul ados ob idos an e io men e e nas condições mais p omisso as, o am
ainda ealizados ensaios de ina i ação mic obiológica em mos o de inho. Pa a al, u ilizou-se o
mesmo sis ema de a amen o óhmico que nos ensaios an e io es, com um ea o cilínd ico de
capacidade de 500 mL e com elé odos de á ea supe icial de 49 cm² e um a as amen o de 8 cm.
De modo a a a , no mínimo, 1 L de mos o, o am ei os qua o a amen os de 250 mL ou 300
mL. Es es o am subme idos a um a amen o a 40 ⁰C, 400 V po um pe íodo de 20 min, sendo
o con eúdo do ea o e ido pa a um ma az de 2 L es e ilizado. Fo am ambém ealizados es udos
de empo de p a elei a pa a os dois p imei os a amen os, man endo as amos as de mos o
a ado e mos o não- a ado a 25 ⁰C e 5 ⁰C, espe i amen e pa a cada a amen o.
No inal, 1 L de mos o a ado po OH e 1 L de mos o não a ado (con olo) o am
colocados em ma azes de 2 L pa a pos e io e men ação ( e secção 3.4).
3.3. Ca ac e ização Físico-Química do Mos o de Vinho
As amos as de mos o o am subme idas a uma sé ie de ensaios de manei a a a e igua
quais as suas ca ac e ís icas in ínsecas an e io es ao p ocesso de e men ação. Esses ensaios
o am, espe i amen e, a de e minação dos Sólidos Solú eis To ais (SST), eo p o eico,
concen ação de açúca es edu o es (AR), acidez i ulá el (AT) e medição de pH.
Numa en a i a de ap oxima a ca ac e ização ao que já oi ei o, o eo de sólidos solú eis
o ais oi de e minado de aco do com o mé odo OIV-MA-AS2-02, u ilizando um e a óme o digi al
HI 96801 (Hanna Ins umen s, I ália); o eo p o eico oi quan i icado de aco do com o p o ocolo

33
B pa a mic oplacas do Ki Coomassie (B ad o d) P o ein Assay (The mo Fische Scien i icTM,
Es ados Unidos da Amé ica), onde oi concebida uma cu a de calib ação segundo as
ecomendações nele incluídas e cuja equação se encon a ep esen ada na Equação 6, com o
espe i o coe icien e de co elação de alo 0,9799.
𝑇𝑃
(mg/L)−1 =𝐴𝑏𝑠595𝑛𝑚−0,0017
0,0184 Equação 6
A de e minação da concen ação em açúca es edu o es oi ei a emp egando o mé odo
do DNS, sendo que, pa a al, oi cons uída uma cu a de calib ação u ilizando glucose em
concen ações de 1,2 g/L a 120 g/L e cuja equação se encon a desc i a na Equação 7 com um
coe icien e de co elação de 0,9961.
𝐴𝑅
(g/L)−1 =𝐴𝑏𝑠540𝑛𝑚−0,02997
0,35631 Equação 7
Pa a o cálculo da acidez o al, exp essa em g amas de ácido a á ico, u ilizou-se o mé odo
OIV-MA-AS313-01. Foi en ão usada uma solução indicado a de azul de b omo imol – ob ido a a és
da dissolução de 10 mg de azul de b omo imol em 10 mL de e anol 96 %, sendo es a mis u a
adicionada a 10 mL de água des ilada – e uma solução aquosa de NaOH, com uma concen ação
de 0,1 mol/L, pa a a i ulação u ilizando amos as de mos o. A equação seguin e ep esen a a
elação en e o olume i ulado da solução de NaOH egis ado aquando a ob enção da colo ação
azul- e de e a co esponden e acidez o al do mos o.
𝐴𝑇
(g/L)−1 =𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻
mL ×10 × 0,075 Equação 8
Po úl imo, oi medido o pH a a és de um po encióme o digi al equipado com elé odo
de id o (HI 2210, Hanna Ins umen s, I ália) calib ado com soluções pad ão de pH 4, pH 7 e pH
9.
3.4. Fe men ação do Mos o de Vinho Ve de
Numa en a i a de mic o ini icação do mos o de inho, oi p imei o p epa ado um inóculo
de le edu a e men a i a. Fo am adicionados 100 mL de uma solução de glucose e u ose a 100
mL de água a 50 ⁰C, sendo seguidamen e diluídos 1 g de mis u a de nu ien es (al a Collec ion
Nu ien Mix)– an o pa a a solução como pa a cada um dos ma azes de mos o – e, po im,
34
adicionados 10 g de le edu a desid a ada (al a Collec ion KB12). O inóculo oi deixado em epouso
du an e 30 min de modo a ea i a a le edu a, emo endo 1 mL pa a aze a con agem do núme o
de células na câma a de Newbaue – explicado no pon o 3.1 – de modo a p e e a concen ação
inicial de células a i as que se inocula em cada ma az de mos o, sendo que, po úl imo, oi
adicionado 10 mL do inóculo em cada ma az de 1 L de mos o.
No que oca ao seguimen o da e men ação pa a ma azes com 1 L de mos o, o am
u ilizadas cinco abo dagens di e en es de manei a a consegui uma maio ap oximação à
ealidade. Es as o am en ão a medição do pH e empe a u a – u ilizando uma me odologia
semelhan e à usada pa a a ca ac e ização do mos o, no pon o 3.3 – seguida de uma pesagem do
ma az, ha endo es e sido pesado azio p e iamen e ao enchimen o com mos o de modo a se
ob e apenas o peso do mos o. Também oi de e minada a concen ação de açúca es edu o es,
u ilizando o mesmo mé odo desc i o no pon o 3.3, oi medida a abso ância num espe o de 400
nm a 600 nm, com um in e alo de 10 nm, de uma amos a de 200 µL do mos o pa a análise de
co , e oi ainda medida a densidade com a ajuda de um densíme o – e eu-se 250 mL de mos o
pa a uma p o e a g aduada, me gulhou-se o densíme o a é à base da p o e a – egis ando a
medição do alo após es abilização. Pa a o egis o da empe a u a do mos o u ilizou-se um
e móme o digi al ipo a e a.
35
4. Resul ados e Discussão
4.1. A aliação P elimina Em Le edu a Isolada – P o ocolo I
De aco do com o P o ocolo I, o am ealizados a amen os a 40 ⁰C com campo elé ico
de 400 V/cm de manei a a es a os e ei os do a amen o óhmico num inóculo de le edu a PYCC
4801. A Figu a 3 ilus a a a iação da concen ação celula em unção do empo o al de
a amen o, sendo que a aplicação do campo elé ico oi ealizada po pulsos de o ma a minimiza
o e ei o da empe a u a e aumen a o empo ú il de exposição ao campo elé ico, que nes e caso
oi de 20 min; o es an e empo de e-se aos ciclos de e ige ação ( e Figu a 4.B).
Analisando o g á ico da Figu a 4.A, ê-se um aumen o da condu i idade elé ica a é ao ∙
30, jun amen e com um declínio da concen ação celula aos 10 min e 20 min, sendo que aos 30
min oco e um aumen o da concen ação celula , seguida de ou o declínio. Se ia de espe a que
oco esse uma diminuição da concen ação celula ao longo do empo de a amen o, jun amen e
com um aumen o da condu i idade elé ica. O máximo de concen ação celula que se e i ica aos
30 min pode ia e sido p o ocado po uma con aminação do inóculo, con udo não se e i ica al
acon ecimen o em placa. Também pode á e sido de ido a uma má homogeneização do inóculo,
esul ando numa concen ação celula desp opo cionada ao e dadei o compo amen o do
inóculo. O aumen o da condu i idade elé ica pode da a indicação de pe da da in eg idade celula
da le edu a, p omo endo assim a mig ação de compos os pa a a solução, à imagem do que
acon ece quando oco e elopo ação.
Figu a 3 Va iação da concen ação celula pa a amos as do inóculo de PYCC 4801 e i adas dos 0 min
aos 60 min.
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
3,00E+06
3,50E+06
4,00E+06
4,50E+06
0 1000 2000 3000
CM/UFC∙mL-1
/s
36
Figu a 4 Va iação da condu i idade elé ica (A) e empe a u a (B) pa a amos as do inóculo de PYCC 4801
e i adas dos 0 min aos 60 min.
De modo a en a um melho en endimen o dos esul os p elimina es ob idos, ez-se uma
en a i a de epe i o ensaio pa a elimina possí eis e os expe imen ais. A a iação da
concen ação celula e condu i idade elé ica ao longo do empo encon am-se ep esen adas na
Figu a 5.
A a és dos g á icos da Figu a 5 é possí el e a mesma endência pa a a condu i idade
elé ica compa a i amen e ao ensaio an e io , sendo que nes e ensaio o máximo de condu i idade
oi a ingido aos 20 min, seguido de um no o declínio, como no caso an e io . Já a concen ação
celula so eu um dec éscimo signi ica i o aos 1800 s de p ocessamen o, e i icando-se
igualmen e um aumen o da concen ação celula nos empos de a amen o seguin es. Ainda, com
1,00E-05
1,10E-05
1,20E-05
1,30E-05
1,40E-05
1,50E-05
1,60E-05
1,70E-05
0 1000 2000 3000
σ/S∙cm-1
/s
A
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
050 100 150
T/⁰C
/s
A
B
37
60 min de a amen o, oi e i icada uma edução de ce ca de 80 % da concen ação inicial do
inóculo. Concluiu-se en ão que apesa de alguns esul ados p omisso es e edução inicial da
concen ação celula , os empos de longos de a amen o e ciclos de e ige ação podem e
a e ado a es abilidade da le edu a du an e o a amen o e assim a ep odu ibilidade dos
esul ados.
Figu a 5 Va iação da concen ação célula (A) e condu i idade elé ica (B) pa a amos as do inóculo de
PYCC 4801 e i adas dos 0 min aos 60 min de a amen o.
0,00E+00
1,00E+05
2,00E+05
3,00E+05
4,00E+05
5,00E+05
6,00E+05
7,00E+05
8,00E+05
9,00E+05
1,00E+06
0 1000 2000 3000
CM/UFC∙mL-1
/s
2,50E-05
2,60E-05
2,70E-05
2,80E-05
2,90E-05
3,00E-05
3,10E-05
0 1000 2000 3000
σ/S∙cm-1
/s
A
B

38
Figu a 6 Va iação da empe a u a pa a amos as do inóculo de PYCC 4801 e i adas dos 0 min aos 60
min de a amen o.
4.2. A aliação P elimina em Le edu a Isolada – P o ocolo II
Um segundo p o ocolo de a amen os de ina i ação da le edu a su giu com o obje i o de
eduzi o empo de p ocessamen o e a alia po enciais e ei os elé icos. Os esul ados dum
p imei o ensaio encon am-se desc i os no Anexo II, uma ez que a condu i idade inicial do inóculo
e elou se demasiado baixa (< 2 µS/cm), azendo com que a in ensidade da co en e que
a a essa a o inóculo osse esidual.
Após esse p imei o ensaio, oi en ão no amen e es ado o segundo p o ocolo p opos o,
sendo que des a ez oi ixada a ol agem mais al a de 600 V, numa en a i a de c ia e ei os de
ina i ação na le edu a, azendo a ia a empe a u a de a amen o en e 40 ⁰C, 75 ⁰C e 90 ⁰C.
Como se pode e , a a és das igu as 7, 8 e 9 os ensaios o am bas an e in luenciados
pela condu i idade inicial do inóculo. Po um ou o lado, oi necessá io dilui alguns dos inóculos
co esponden es aos a amen os a 40 ⁰C e 75 ⁰C a a és da adição de água ul apu a, uma ez
que a sua condu i idade inicial e a bas an e al a e di icul a a o con olo da empe a u a.
A a és da análise da concen ação celula dos inóculos, pode-se obse a que, de uma
o ma ge al, odos os a amen os p omo e am a ina i ação da le edu a independen emen e da
empe a u a u ilizada, exce o nos casos em que a condu i idade e a demasiado baixa, o que não
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2000 4000 6000 8000
T/⁰C
/s
39
Figu a 7 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) das amos as subme idas a
ensaios com empo de a amen o de 20 min, a um campo elé ico de 600 V/cm e empe a u a de
a amen o de 40 ⁰C (A), 75 ⁰C (B) e 90 ⁰C (C).
0
0,000005
0,00001
0,000015
0,00002
0,000025
0,00003
0,000035
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0500 1000 1500 2000 2500
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,00E+00
1,00E-05
2,00E-05
3,00E-05
4,00E-05
5,00E-05
6,00E-05
7,00E-05
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0500 1000 1500 2000 2500 3000
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,00E+00
5,00E-06
1,00E-05
1,50E-05
2,00E-05
2,50E-05
3,00E-05
3,50E-05
0
20
40
60
80
100
120
0500 1000 1500 2000 2500
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B
B
C
40
pe mi iu a passagem de co en e elé ica e aumen o da empe a u a – que é o caso de OBZ2 e
OBZ3 ( e Figu as 43 e 44 p esen es no Anexo II). Es es esul ados e idenciam os e ei os elé icos
da ecnologia na ina i ação des e ipo de le edu as, sendo que campos elé icos de 600 V/cm
com empe a u as máximas de 40 ºC se ão su icien es pa a eduzi a ca ga mic obiológica inicial.
Nes e caso oi possí el eduzi ce ca de 7 log. Nos es an es ensaios, de ido à baixa condu i idade
de alguns inóculos, não oi possí el a aplicação e e i a do campo elé ico, o que de e minou algum
c escimen o con i mado em placa (Figu as 9 e 10). É ainda de salien a que se e i icou a
oco ência de algum c escimen o celula nas amos as a adas a 90 ⁰C e 600 V/cm quando se
apenas se a ingi am os 10 dias de c escimen o em placa, pa a alo es de 2,77∙106 UFC/mL. Tal
acon ecimen o pode se indica i o de que os a amen os de alguma o ma a e am o
desen ol imen o des as le edu as.
Figu a 8 Tempe a u a média das amos as subme idas a a amen o óhmico (os núme os que
se seguem à iden i icação das le as e e em-se aos iplicados).
De manei a a a e i de ini i amen e o papel do campo elé ico na ina i ação celula da
le edu a e conclui qual o papel da componen e elé ica e da componen e é mica, o am es ados
inóculos de le edu a – p epa ados como an e io men e – sendo ês deles subme idos a um
a amen o só usando empe a u a (40 ⁰C, po 20 min) enquan o que ou os ês inóculos e am
subme idos a a amen o com campo elé ico de 600 V/cm.
Nos a amen os em que oi conseguida a passagem de co en e elé ica e a subida de
empe a u a a é à empe a u a p e endida oi possí el e i ica a ina i ação o al dos
mic o ganismos neles p esen es; no en an o, a condu i idade elé ica de alguns s ocks de le edu a
25,5368 27,0017 26,8808
34,2482
12,5252
20,0001
35,6654
39,6582
43,4369
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
T/⁰C
OAZ1 OAZ2 OAZ3 OBZ1 OBZ2 OBZ3 OCZ1 OCZ2 OCZ3
41
Figu a 9 Concen ação celula em média no inal de cada ensaio de a amen o óhmico. Os ca ac e es a,
b, c e d ep esen am di e encias es a ís icas en e os alo es ob idos.
Figu a 10 Imagem cap ada após um pe íodo de cinco dias de c escimen o em placa das amos as de
con olo e das amos as subme idas a a amen o óhmico.
impossibili ou a passagem de co en e elé ica e, consequen emen e, e ei os de ina i ação – pelo
que a empe a u a média de a amen o, po esse mo i o, oi igualmen e baixa, jus i icando algum
c escimen o celula ( e Figu as 13 e 14). Nes e conjun o de ensaios e i ica am-se con aminações
de ou as espécies mic obianas, sendo que as UFC’s de
D. b uxellensis
se ap esen a am de
maio es dimensões em elação a ou as espécies mic obianas con aminan es. Es a con aminação
não oco eu du an e os ensaios uma ez que algumas placas do con olo já con inham as mesmas
6,30E+07
7,27E+06
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Con olo OAZ OBZ OCZ
CM/UFC∙mL-1
Con olo
OBZ
OCZ
OAZ
a
0,00E+00b
c
0,00E+00d
48
Figu a 18 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) pa a dois dos ensaios a 600
V/cm e uma empe a u a máxima de 40 ⁰C, po um empo de a amen o de 20 min, u ilizando o inóculo
la ado (A) e inóculo não-la ado (B).
0
0,000005
0,00001
0,000015
0,00002
0,000025
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
01000 2000 3000 4000 5000
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,00E+00
2,00E-04
4,00E-04
6,00E-04
8,00E-04
1,00E-03
1,20E-03
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0200 400 600 800 1000 1200 1400
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B

49
Figu a 19 Tempe a u as médias de a amen o aquando es ado o aquecimen o óhmico, incluindo os
inóculos a ados sem la agem p é ia do meio (NL).
Figu a 20 Concen ação celula dos inóculos de con olo la ado e não-la ado (NL), pa a os inóculos que
so e am apenas a amen o po aumen o da empe a u a e pa a os inóculos subme idos a aquecimen o
óhmico la ados e não-la ados. Os ca ac e es a, b, A e B ep esen am di e encias es a ís icas en e os
alo es ob idos.
26,4402
29,5495
24,5
25
25,5
26
26,5
27
27,5
28
28,5
29
29,5
30
OAZ OAX,NL
T/⁰C
1,27E+06
1,56E+07
8,89E+05
3,00E+07
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Con olo CA OAZ Con olo,NL OAX,NL
CM/UFC∙mL-1
a a
b A
0,00E+00B
50
Figu a 21 Imagem cap ada após um pe íodo de cinco dias de c escimen o em placa.
De manei a a a e i ace ca do e ei o de ina i ação do a amen o óhmico, e
consequen emen e o papel do campo elé ico, emp egando uma ol agem in e io e uma ol agem
supe io aquando compa ado com o mé odo adicional de ina i ação, oi execu ado o p o ocolo
em que o am es adas ês empe a u as di e en es – 40⁰ C, 75⁰ C e 90⁰ C – com campo elé ico
de 400 V/cm e 90 V/cm, com a adição de um a amen o sem a aplicação de campo elé ico
( a amen o é mico).
Analisando as Figu as 24 e 25 é possí el e i ica que o a amen o de maio empe a u a,
que na p esença de campo elé ico, que na ausência de campo elé ico, de e minou a ina i ação
o al das células do inóculo – de ido p esumi elmen e a e ei os é micos. Nesse sen ido, o
aquecimen o óhmico pode á se uma al e na i a in e essan e no p ocesso de pas eu ização de
Vinho Ve de, endo em con a a sua apidez de p ocesso e meno deg adação é mica da qualidade
associada.
Já pa a os a amen os a uma empe a u a in e io (40 ⁰C), ob e e-se o mesmo ní el de
ina i ação apenas quando o campo elé ico oi maio (400 V/cm), sendo que nos es an es casos
a concen ação celula so eu um aumen o em elação ao con olo. Des e modo, é possí el
con i ma que campos elé icos de 400 V/cm com empe a u as máximas de 40 ⁰C em
a amen os de 20 min se ão su icien es pa a p omo e a ina i ação da le edu a-al o. Nes e caso
a ina i ação oi de pelo menos 6 log, o que pe mi e p o a o concei o de ina i ação não-
é mica e o nece uma boa ma gem de segu ança do p ocesso.
Con olo
CA
OAZ
OAZ,NL
Con olo,NL
51
Con agens ealizadas em câma a de Neubaue pude am a e i ace ca da mo ologia e
quan idade de células i as e mo as. Os dados esul an es dessas con agens encon am-se
p esen es no Anexo II.
Figu a 22 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) pa a alguns dos ensaios de
a amen o do inóculo de le edu a não-la ado a 400 V/cm, empe a u a máxima de 40 ⁰C (A) e 75 ⁰C (B),
du an e um in e alo de empo de 20 min.
Numa en a i a de con e gi os esul ados ob idos e de se aze um es udo de p a elei a
de manei a a es uda a du abilidade do e ei o de ina i ação, ealizou- -se um no o ensaio u ilizando
o p o ocolo an e io . Os dados ace ca da a iação da empe a u a e condu i idade elé ica pa a
es e ensaio encon am-se expos os no Anexo II.
Analisando o g á ico da Figu a 28, pode-se con i ma os mesmos esul ados iniciais após
os a amen os de ina i ação, ou seja, que as empe a u as de a amen o de 75 ⁰C ina i am
e icazmen e a le edu a – possi elmen e de ido a e ei os é micos – e que há apenas c escimen o
celula nos a amen os a 40 ⁰C quando se e e ausência de campos elé icos ou quando os
0,000E+00
1,000E-04
2,000E-04
3,000E-04
4,000E-04
5,000E-04
6,000E-04
7,000E-04
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0500 1000 1500
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,000E+00
1,000E-04
2,000E-04
3,000E-04
4,000E-04
5,000E-04
6,000E-04
7,000E-04
8,000E-04
9,000E-04
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0500 1000
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B
52
Figu a 23 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) pa a alguns dos
ensaios de a amen o de inóculo de le edu a não-la ado a 45 V/cm, empe a u a máxima de
40 ⁰C (A) e 75 ⁰C (B), du an e um in e alo de empo de 20 min.
campos elé icos o am meno es (90 V/cm), sendo que, pa a a empe a u a de 40 ⁰C e campo
elé ico de 400 V/cm não hou e c escimen o celula logo após o a amen o. Es es esul ados
demons am que a in ensidade de campo elé ico é um a o impo an e na ina i ação celula .
Du an e o empo de a mazenamen o e i icou-se uma edução da concen ação celula
do con olo em elação a = 0 h, o que pode indica que as células de le edu a não es a iam a
sob e i e nas condições a que o am colocadas, sob e udo de ido à ausência de nu ien es no
meio. É de egis a que nas amos as mais p omisso as que o am subme idas a a amen o
elé ico (como a OAX e OBX) não se e i ica am g andes al e ações no pad ão de c escimen o ao
longo do es udo de empo de p a elei a ela i amen e às es an es.
0,000E+00
1,000E-04
2,000E-04
3,000E-04
4,000E-04
5,000E-04
6,000E-04
7,000E-04
8,000E-04
9,000E-04
1,000E-03
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,000E+00
2,000E-04
4,000E-04
6,000E-04
8,000E-04
1,000E-03
1,200E-03
1,400E-03
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0200 400 600 800 1000 1200 1400
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B
53
Figu a 24 Tempe a u as médias de a amen o aquando es ado o aquecimen o óhmico; os
núme os que se seguem à iden i icação das le as e e em-se a cada uma das éplicas.
Figu a 25 Concen ação celula dos inóculos de con olo, pa a os inóculos que so e am apenas
a amen o po aumen o da empe a u a e pa a os inóculos subme idos a aquecimen o óhmico.
Os ca ac e es a e b ep esen am di e encias es a ís icas en e os alo es ob idos.
26,4967 27,9017 26,5393
35,4060
0
5
10
15
20
25
30
35
40
OAX OBX OAV OBV
T/⁰C
4,63E+075,01E+07 6,72E+07
1,00E+00
1,00E+01
1,00E+02
1,00E+03
1,00E+04
1,00E+05
1,00E+06
1,00E+07
1,00E+08
Con ol
o
CA CB OAX OBX OAV OBV
CM/UFC∙mL-1
a a a
0,00E+00b 0,00E+00b
0,00E+00b
0,00E+00b

54
Figu a 26 Imagem cap ada após um pe íodo de se e dias de c escimen o em placa.
Apenas se obse a uma al e ação de endência no c escimen o celula em = 864 h, onde
hou e c escimen o celula em odas as placas – endo es e sido meno pa a o a amen o
con encional – e pa a = 936 h, onde hou e con aminação de á ias placas.
Figu a 27 Tempe a u as médias de a amen o aquando es ado o aquecimen o óhmico.
25,0677
38,7730
24,8313
48,0733
0
10
20
30
40
50
60
OAX OBX OAW OBW
T/⁰C
Con olo
CA
CB
OAW
OBW
OAX
OBX
55
Figu a 28 Va iação da concen ação celula ao longo do empo pa a odas as amos as es adas em
a amen o óhmico e pelo mé odo con encional, e ainda o con olo.
4.5. Ca ac e ização Fisico-Química do Mos o de Vinho
Pa a a ca ac e ização mic obiológica do mos o do inho com o obje i o de uma pos e io
e men ação, usou-se mos o de inho da cas a Fe não Pi es – sendo que os mos os 1 e 2 o am
amos as de mos o ecolhidas de um lo e de mos o de u as ei o em 2019 e o mos o 3 e 4 o am
amos as de mos o ecolhidas de um lo e dis in o de mos o de u as ambém p oduzido em 2019.
No que se e e e aos a amen os óhmicos do mos o, os g á icos e e en es à a iação da
condu i idade elé ica e empe a u a encon am-se expos os no Anexo II (Figu as 61 e 62). É de
menciona os seus meno es alo es de condu i idade elé ica, causados pelo di e en e
dis anciamen o e dimensões dos elé odos po necessidade de u iliza um ea o de maio es
dimensões onde osse possí el a a um maio olume em cada ensaio. A maio dis ância dos
elé odos pode á e ge ado uma co en e elé ica meno a passa pelo meio, diminuindo o alo
do campo elé ico em elação aos ou os ensaios e possi elmen e causando meno e ei o de
ina i ação.
Analisando a Figu a 29, as amos as i e am alguma a iabilidade em e mos de co e
quan idade de ma e ial deposi ado pa a os mos os não- a ados, no en an o, essa a iabilidade
não se e i icou nas es an es análises ísico-químicas. Apenas o am isí eis a olho nu a dis inção
0,00E+00
5,00E+05
1,00E+06
1,50E+06
2,00E+06
2,50E+06
3,00E+06
3,50E+06
4,00E+06
4,50E+06
5,00E+06
0200 400 600 800 1000
CM/UFC∙mL-1
(h)
Con olo
CA
CB
OAX
OAW
OBW
OBX
56
Figu a 29 Análise isual da a iabilidade das amos as de mos o co esponde ao mos o 1, 2 e 3 a ados
e não- a ados
en e amos as com mos o com maio depósi o, ob endo es as onalidades mais acas anhadas e
escu as em elação ao ou o caso. Já no mos o 2 e 3 a ado, oi isí el uma al e ação da co de
um ama elo cla o pa a âmba , sem a exis ência de depósi os de pa ículas sólidas – endo es as
possi elmen e essuspendido po e ei os do a amen o.
Nas abelas 3 e 4 es ão p esen es os alo es ob idos pa a os di e en es pa âme o ísico-
químicos es udados. Pode-se obse a que não hou e uma a iabilidade acen uada nos alo es
dos pa âme os es udados pa a os mos os não- a ados pe encen es à mesma cas a, com a
exceção do eo p o eico do mos o 1. Já o aquecimen o óhmico ambém não e e nenhum e ei o
apa en e nos pa âme os dos mos os – apenas pa a o eo p o eico se e i ica um aumen o do
alo pa a o mos o 2 e uma diminuição pa a o mos o 3. Uma ez que não hou e ep odu ibilidade
na análise em elação ao eo p o eico, não oi possí el a e i se o a amen o óhmico em in luência
sob e o mos o nesse pa âme o. Po im, a concen ação de açúca es edu o es encon a-se
expos a no Anexo II.
Mos o 2
Mos o 1
Mos o 3 Não-T a ado
Mos o 3 T a ado
57
Figu a 30 Aspe o isual do mos o 2 a ado (à di ei a) e não- a ado (à esque da) logo após o a amen o
óhmico.
Tabela 3. Teo p o eico dos á ios mos os es ados quan i icado pelo mé odo Coomassie – os ca ac e es
a, b, c e d ep esen am di e encias es a ís icas en e os alo es ob idos
Teo P o eico (mg/L)
Mos o 1
15,6343a ± 0,7135
Mos o 2
9,9547b ± 1,3973
Mos o 2 OH
14,9005a ± 0,2736
Mos o 3
9,2119c ± 0,5334
Mos o 3 OH
6,1501d ± 0,3805
Tabela 4. Valo es de pH, Acidez o al exp essa em g amas de ácido a á ico e concen ação de sólidos
solú eis o ais pa a os á ios mos os – os ca ac e es a, b e c ep esen am di e encias es a ís icas en e os
alo es ob idos
AT (g/L)
pH
SST (⁰B ix)
Mos o 1
4,9250a ± 0,1561
2,9833a ± 0,0404
17,0000a ± 0,3464
Mos o 2
4,5250a ± 0,1561
3,0000a ± 0,0700
18,2333b ± 0,0577
Mos o 2 OH
5,6250b ± 0,3000
2,9933a ± 0,0152
18,1333b ± 0,1528
Mos o 3
6,3750c ± 0,1984
3,0900a ± 0,0100
17,5667c ± 0,0577
Mos o 3 OH
7,0000c ± 0,3382
2,9400b ± 0,0265
17,1000c ± 0,1000
64
das 60 h de e men ação. Is o pode de e -se a uma má homogeneização do meio an e io à
medição. Em odo o caso, em abalhos u u os se á um pa âme o a a e igua .
Já a empe a u a so eu oscilações pequenas, pe manecendo numa gama de 21 ⁰C a
24 ⁰C, mas oi possí el assis i à sua diminuição, mais cla amen e a pa i das 50 h de
e men ação. A empe a u a inicial de 17 ⁰C do mos o 4 não- a ado de e-se pelo ac o de es e
mos o e iniciado a e men ação pouco empo depois de e sido e i ado da e ige ação, não
endo empo pa a a ingi a empe a u a ambien e. No en an o, os es an es pa âme os
encon am-se de aco do com o espe ado e de aco do com o compo amen o dos es an es mos os,
p o ando que es e não e á a asado – nem oi um a o de peso – du an e o início ou no deco e
da e men ação.
Pode-se conside a , com os dados expos os nes a secção, que o a amen o óhmico não
em nenhum e ei o no ó io em compa ação à e men ação de mos o que não so eu nenhum
a amen o p é io, de modo que a aplicação des e na p odução de inho de e á se impe ce í el
no que diz espei o aos pa âme os es udados nes e abalho.

65
Figu a 36 Va iação do peso dos mos os (A) e da densidade (B) ao longo do empo de e men ação
em mos o a ado e não- a ado no deco e de duas mic o ini icações dis in as.
0,6
0,65
0,7
0,75
0,8
0,85
0,9
0,95
1
1,05
1,1
020 40 60 80 100
m/kg
/h
Mos o 3
Mos o 3 OH
Mos o 4
Mos o 4 OH
980
990
1000
1010
1020
1030
1040
1050
1060
1070
020 40 60 80 100
densidade/% B ix
/h
Mos o 3
Mos o 3 OH
Mos o 4 OH
Mos o 4
B
A
66
Figu a 37 Va iação do pH (B) dos mos os ao longo do empo de e men ação em mos o as ado
e não- a ado no deco e de duas mic o ini icações dis in as.
Figu a 38 Va iação da empe a u a ao longo do empo de e men ação em mos o a ado e não-
a ado no deco e de duas mic o ini icações dis in as.
2,4
2,5
2,6
2,7
2,8
2,9
3
3,1
3,2
3,3
020 40 60 80 100
pH
/h
Mos o 3
Mos o 3 OH
Mos o 4 OH
Mos o 4
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
020 40 60 80 100
T/⁰C
/h
Mos o 3
Mos o 3 OH
Mos o 4
Mos o 4 OH
67
Figu a 39 Análise isual dos mos os subme idos a a amen o óhmico e não subme idos a
a amen o óhmico.
Mos o 3 no Início da Fe men ação
Mos o 4 no Início da Fe men ação
Mos o 3 no Final da Fe men ação
Mos o 4 no Final da Fe men ação
Mos o a ado
Mos o a ado
Mos o a ado
Mos o a ado
Mos o não- a ado
Mos o não- a ado
Mos o não- a ado
Mos o não- a ado
68
5.1 Conclusões
No es udo das condições de ina i ação ó imas da es i pe de le edu a
Dekke a b uxellensis
PYCC 4801, oi possí el cons a a o impac o da componen e elé ica na espe i a ina i ação.
T a amen os a empe a u as em que o e ei o de ina i ação é mico e a isolado – 40 ⁰C – com
ausência de campos elé icos ou p esença de campos elé icos baixos – meno do que 100 V/cm–
oi e i icado que o e ei o de ina i ação e a nulo ou bas an e in e io ao isualizado nos ensaios em
que se u iliza am campos elé icos mode ados – a pa i de 400 V/cm. Tal acon ecimen o oi
con inuamen e con i mado ao longo dos ensaios sendo possí el conclui que a p esença de
campos elé icos mode ados p o oca am e ei os de ina i ação dis in os sob e o inóculo de
le edu a isolada. Foi e i icado ambém que a ina i ação da le edu a oi possí el a a és de
a amen os de 20 min, com empe a u as máximas de a amen o de 40 ⁰C ( empe a u as médias
de a amen o ap oximadamen e supe io es a 30 ºC) e campos elé icos de 400 V/cm. Es a
ina i ação e elou-se o al em alguns casos (> 5 log) ou pa cial (< 1 log), dependendo da
condu i idade elé ica das soluções a adas. O a amen o pode á, en ão, se aplicado du an e o
a mazenamen o do mos o semp e que se jus i ica de o ma a con ola o desen ol imen o de
le edu as não desejadas ou u ilizado em sine gia com a adição de SO2 em quan idades
signi ica i amen e meno es do que as u ilizadas con encionalmen e.
Na ca ac e ização ísico-química dos mos os, não oi obse ada uma a iabilidade
acen uada dos pa âme os es udados. Também, na ca ac e ização mic obiológica dos mos os,
e i icou-se a maio p esença das espécies
Hanseniaspo a u a um
,
Schizosaccha omyces pombe,
de espécies de ungos ilamen osos e de uma espécie desconhecida de colo ação e de in enso
.
Apu ou-se ainda que o Aquecimen o Óhmico em e ei os na ina i ação das espécies p esen es em
maio es concen ações nas amos as de mos o não- a ado, com a exceção das espécies de ungos
ilamen osos, uma ez que es es pode ão e ido a opo unidade de se p oli e a em de ido à
edução da compe i i idade. Já na e men ação, a ealização de a amen o óhmico não al e ou as
p op iedades ísico-químicas do mos o, nem inibiu o desen ol imen o no mal da e apa de
e men ação.
69
5.2. P incipais Recomendações e T abalho Fu u o
Pa a es udos u u os, ecomenda-se o uso de di e en es meios de ca ac e ização
mic obiológica de o ma a complemen a a ca ac e ização ealizada das espécies de le edu as e
bac é ias, bem como a e igua qual a sua pe cen agem ela i a que pa a mos o a ado, como
pa a mos o não- a ado, de modo a ap o unda o es udo da sensibilidade das espécies mic obianas
ao a amen o.
Se ia aconselhada a análise do e ei o de ina i ação do mos o (e sucessi o es udo de empo
de p a elei a) u ilizando um sis ema que melho ep oduza as condições e alo es de campo
elé ico epo adas pa a que o aumen o de escala do p ocesso ga an a o mesmo e ei o de
ina i ação obse ado à escala labo a o ial. Também se ia necessá io a cons ução de cu as de
mo e é mica u ilizando as condições ó imas mani es adas nes e abalho, calculando os alo es
D e z pa a a amen os é micos den o dos in e alos usados nos p ocessos de emoção do SO2
de modo a ob e -se um es udo e melho comp eensão da ciné ica de mo e da le edu a-al o e
consequen e al e ação das p op iedades do mos o.
Ou o a o de in es igação pode esidi numa maio elucidação do e o de ina i ação, se
es e se de e à in ensidade do campo elé ico, densidade da co en e elé ica ou equência elé ica.
Pa a isso se necessá ia uma maio a aliação do papel da condu i idade elé ica na e icácia dos
a amen os.
De modo a a e igua as an agens do a amen o óhmico em mos o de inho, se ia
ecomendado o seguimen o e compa ação de mos o a ado po es e mesmo a amen o, a mos o
a ado pelo mé odo con encional, e ainda mos o subme ido a sul i ação, assim como um es udo
das suas p op iedades ísico-químicas e ca ac e ização mic obiológica.
De modo a a alia a implemen ação da ecnologia em odos os p odu os da emp esa, é
ecomendado que a mesma abo dagem de a amen o possa se aplicada pa a o Vinho Ve de
in o. E ainda, com a en a i a de elimina o p ocesso de sul i agem po comple o do p ocesso
p odu i o de Vinho Ve de, ecomenda-se a aplicação da ecnologia após a e men ação, com
es udo dos e ei os de ina i ação da le edu a e men a i a e possí el impac e nas ca ac e ís icas
ísicas e químicas do inho.

70
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73
Anexos
Anexo I - Composição do meio WL
Compos o
Concen ação/g∙L-1
Glucose
50,0
Aga
12,0
Pep ona
5,0
Ex a o de le edu a
4,0
KH2PO4
0,6
KCl
425,0 ×10-3
CaCl2
125,0 × 10-3
MgSO4
125,0 × 10-3
Ve de de B omoc esol
22,0 × 10-3
FeCl3
2,5× 10-3
MnSO4
2,5 × 10-3
Anexo II - Ensaios Complemen a es
P imei o Ensaio Pa a a A aliação P elimina em Le edu a Isolada – P o ocolo II
Foi ixada uma empe a u a de a amen o de 40 ⁰C e o am u ilizados dois campos
elé icos – 400 V/cm e 600 V/cm – du an e um empo de a amen o o al de 20 min. Po ém,
de ido à baixa condu i idade dos no os s ocks de p odução de le edu a u ilizados (< 2 µS/cm)
não oi possí el combina o e ei o elé ico com o e ei o é mico, como ilus a a Figu a 41. Apesa
de o meio pe mi i , a passagem de co en e em alguns momen os oi esidual, sendo que a
eduzida dissipação de calo não pe mi iu o aumen o da empe a u a do inóculo. Como é possí el
e a a és da Figu a 42, as empe a u as médias de a amen o não a ingi am os 20 ⁰C.
Apesa das baixas empe a u as de a amen o, é possí el obse a uma edução do
núme o de células, com a exceção do a amen o a 400 V/cm e 40 ⁰C, em que pon ualmen e
não se e i icou e ei o de ina i ação su icien e pa a que hou esse edução do núme o de células
iá eis, com alo es de concen ação de ap oximadamen e 3,6∙106 UFC/mL – o que jus i ica o
e o pad ão ele ado. É possí el, no en an o, obse a mais cla amen e a edução de 1 log com o
aumen o do campo elé ico pa a 600 V/cm, embo a enham sido de e adas algumas
con aminações pon uais de uma ou a espécie mic obiana em á ias placas, que pode ão e
in luenciado o núme o de UFC’s de
Dekke a b uxellensis
. O conjun o des es esul ados con i ma
80
Figu a 50 Imagem cap u ada de uma célula mo a de OAZ,NL (A) e uma célula i a de Con olo,NL (B).
No ensaio ela i o às Figu as 49 e 50, ha ia a p esença de um ele ado núme o de
aglome ados de células, endo ha ido a di iculdade em consegui a sepa ação dessas células de
manei a a pode em se ei as as espe i as con agens. Também se obse ou a p esença de células
com hi as, onde se op ou po não aze a sua con agem uma ez que não se de e iam a a da
D. b uxellensis
. Não o am isí eis ambém al e ações no ó ias na mo ologia das células en e os
inóculos a ados, ha endo obse ado uma di e ença de amanhos en e as células do con olo e
as células a adas po a amen o óhmico – ap esen ando-se es as maio es que as úl imas.
Figu a 51 Pe cen agem de células mo as das amos as de mos o la ado e não-la ado subme idas a
a amen o con encional a 40 ⁰C e a a amen o óhmico à mesma empe a u a.
As igu as 51, 52 e 53 ep esen am a con agem de células ei as po mic oscopia em
câma a de Neubaue de um ensaio ealizado seguindo o P o ocolo IV. Em compa ação à
Figu a 25, os e ei os de ina i ação não ap esen am se ão apa en es, ainda assim é igualmen e
isí el uma maio p esença de células i as nos ensaios de a amen o con encional, e uma meno
62,7928
56,5529 53,2368
63,4345
69,7581
92,1782 88,7831
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Con olo CA CB OAV OBV OAX OBX
Pe cen agem de células mo as/%
A
B

81
p esença de células i as nos a amen os a campos elé icos de 400 V/cm e 40 ⁰C. No que oca
à mo ologia, as células de con olo ap esen a am-se de maio es dimensões do que as es an es,
enquan o que as células subme idas a a amen o con encional ap esen a am uma mo ologia
alongada em compa ação aos ou os ensaios.
Figu a 52 Imagem cap u ada de uma célula i a de con olo (A) e células mo as de CA (B) e OAV (C),
em câma a de Neubaue .
Figu a 53 Imagem cap u ada em câma a de Neubaue de células mo as de OAX (A) e OBX (B) sem e
sido usada qualque diluição das amos as.
As igu as 54, 55 e 56 ep esen am a análise da mo ologia das células ei as em câma a
de Neubaue . Foi, em e mos de con agens e i icado uma pe cen agem de células mo as meno
pa a CA, bem como uma maio pe cen agem de células mo as pa a OAX e OBX – ais ac os
con e gem com o que se oi obse ado em placa. Já a mo ologia das células de con olo
ap esen a am e maio es dimensões nas amos as de con olo compa a i amen e às es an es,
sendo es as ambém mais edondas do que as células subme idas a condições em que hou e
e ei os da empe a u a (ap esen ando-se es as mais alongadas).
A
B
C
A
B
82
Figu a 54 Pe cen agem de células mo as das amos as de mos o la ado e não-la ado subme idas a
a amen o con encional a 40 ⁰C e a a amen o óhmico à mesma empe a u a.
Figu a 55 Imagem cap u ada em câma a de Neubaue de uma célula i a do Con olo (A) e células mo as
de CA (B), CB (C), OAW (D) e OBW (E).
Figu a 56 Imagem cap u ada em câma a de Neubaue de células mo as de OAX (A) e OBX (B).
A í ulo exposi i o, seguem-se alguns dos g á icos da a iação da empe a u a e
condu i idade elé ica e e en es ao ensaio que seguiu as p emissas do P o ocolo IV, o qual
ambém oi seguido de um es udo do empo de p a elei a dos inóculos a ados e não- a ado.
49,2511
42,7193
56,5398
64,0825 64,1270
79,7300
86,8519
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Con olo CA CB OAV OBW OAX OBX
Pe cen agem de células mo as/%
A
B
C
D
E
A
B
83
Figu a 57 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) pa a um a amen o de inóculo
de le edu a não-la ado com campo elé ico de 400 V/cm e uma empe a u a máxima de 40 ⁰C du an e
um in e alo de empo de 20 min.
Figu a 58 Va iação da empe a u a (azul) e condu i idade elé ica (la anja) pa a um a amen o de inóculo
de le edu a não-la ado com campo elé ico de 400 V/cm e uma empe a u a máxima de 75 ⁰C du an e
um in e alo de empo de 20 min.
0,000E+00
5,000E-03
1,000E-02
1,500E-02
2,000E-02
2,500E-02
3,000E-02
3,500E-02
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0200 400 600 800 1000 1200
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,000E+00
5,000E-03
1,000E-02
1,500E-02
2,000E-02
2,500E-02
3,000E-02
3,500E-02
4,000E-02
4,500E-02
5,000E-02
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0200 400 600 800 1000 1200 1400
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
84
Figu a 59 Va iação da empe a u a pa a um a amen o de inóculo de le edu a não-la ado com campo
elé ico de 90 V/cm, empe a u a máxima de 40 ⁰C du an e um in e alo de empo de 20 min.
Figu a 60 Va iação da empe a u a pa a um a amen o de inóculo de le edu a não-la ado com campo
elé ico de 90 V/cm, empe a u a máxima de 75 ⁰C du an e um in e alo de empo de 20 min.
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
0200 400 600 800 1000 1200 1400
T/⁰C
/s
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0200 400 600 800 1000 1200
T/⁰C
/s
85
T a amen o em Mos o – P o ocolo IV
De modo a aze em-se as ca ac e izações ísico-químicas e mic obiológicas do mos o,
jun amen e com a pos e io mic o ini icação, o am ei os ensaios em mos o de inho. Nas Figu as
61 e 62 es ão expos as as a iações de empe a u a e condu i idade elé ica pa a cada ensaio.
Figu a 61 Va iação da empe a u a e da condu i idade elé ica pa a o a amen o do mos o 1 (A) e mos o
2 (B) a um campo elé ico de 50 V/cm e empe a u a máxima de 40 ⁰C.
0,00E+00
5,00E-03
1,00E-02
1,50E-02
2,00E-02
2,50E-02
3,00E-02
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,00E+00
5,00E-03
1,00E-02
1,50E-02
2,00E-02
2,50E-02
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0500 1000 1500
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B

86
Figu a 62 Va iação da empe a u a e da condu i idade elé ica pa a o mos o 3 (A) e mos o 4 (B) com
um campo elé ico de 75 V/cm e empe a u a máxima de 40 ⁰C.
Ca ac e ização Mic obiológica dos Mos os
Tabela 6. Concen ação de açúca es edu o es dos á ios mos os (quan i icada pelo mé odo
DNS) sujei os, ou não, a a amen o óhmico – os ca ac e es a e b ep esen am di e encias
es a ís icas en e os alo es ob idos
Concen ação de açúca es edu o es (g/L)
Mos o 1
33,8220a ± 0,7451
Mos o 2
32,8173a ± 0,4616
Mos o 2 OH
31,7283a ± 1,7229
Mos o 3
49,2541b ± 3,4975
Mos o 3 OH
47,7435b ± 0,8891
0,00E+00
5,00E-03
1,00E-02
1,50E-02
2,00E-02
2,50E-02
3,00E-02
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0200 400 600 800 1000 1200 1400
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
0,00E+00
5,00E-03
1,00E-02
1,50E-02
2,00E-02
2,50E-02
3,00E-02
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
0500 1000 1500 2000
σ/S∙cm-1
T/⁰C
/s
A
B
87
A concen ação de açúca es edu o es do mos o 3 ap esen a-se supe io an o pa a o
mos o a ado como pa a o mos o não- a ado compa a i amen e aos mos os 1 e 2 (uma ez que
os úl imos pe encem ao mesmo lo e e o mos o 3 pe ence a um lo e di e en e, é plausí el os seus
con eúdos em açúca es edu o es se em dis in os).
Seguimen o da Fe men ação Alcoólica
No que diz espei o à concen ação de açúca es edu o es dos mos os du an e a
e men ação, es e alo so eu um aumen o que não se ia de espe a pa a odos os casos,
ap oximadamen e às = 20 h de e men ação. Se ia de espe a que a concen ação de açúca es
edu o es diminuísse com o deco e da e men ação, uma ez que a le edu a e men a i a es a ia
a me abolizá-los em álcool e dióxido de ca bono. No inal, assis e-se à edução da concen ação
de açúca es edu o es com os mos os a a ingi em o im da e men ação, onde começa a ha e
escassez de açúca es, sendo que a concen ação de açúca es edu o es inal nes e ensaio ondou
os 1,5 mg/mL. Uma possí el causa que pode á e le ado aos alo es inespe ados de açúca es
edu o es é, com a a i idade enzimá ica da le edu a e men a i a, açúca es com es u u as
maio es pode ão e sido ca alisadas em açúca es edu o es (como é o caso da saca ose, que é
ca alisada em glucose e u ose). E uma ez que o mé odo u ilizado pa a a quan i icação dos
açúca es apenas quan i ica açúca es edu o es, há a possibilidade de es e ipo de políme os não
e sido quan i icado, mas, não obs an e, e es ado p esen e na ma iz inicial – sendo depois
decompos os em es u u as meno es e quan i icá eis pelo mé odo, dando o igem ao aumen o da
concen ação des es. É possí el e a a és da Figu a 30 que o mos o a ado ap esen a a semp e
uma onalidade mais escu a em compa ação ao mos o não- a ado, sendo que a onalidade de
ambos, com o deco e da e men ação, oi-se o nando cada ez mais cla a a é se em
p a icamen e indis inguí eis. Sendo o mé odo de DNS um mé odo colo imé ico, a al e ação de
onalidade, assim como a p óp ia cla i icação do mos o ao longo da e men ação ambém pode
e ido in luência pa a o pad ão obse ado.
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Figu a 63 Va iação da concen ação de açúca es edu o es ao longo do empo de e men ação em mos o
a ado e não- a ado no deco e de duas mic o ini icações dis in as.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
020 40 60 80 100
Concen ação de Açúca es Redu o es/g∙L-1
/h
Mos o 3
Mos o 3 OH
Mos o 4
Mos o 4 OH