Estabilização das leveduras do mosto de uvas através da tecnologia de aquecimento óhmico

ii DIREITOS DE AUTOR E CONDIÇÕES DE UTILIZAÇÃO DO TRABALHO POR TERCEIROS Este é um trabalho académico que pode ser utilizado por terceiros desde que respeitadas as regras e boas práticas internacionalmente aceites, no que concerne aos direitos de autor e direitos conexos. Assim, o presente trabalho pode ser utilizado nos termos previstos na licença abaixo indicada. Caso o utilizador necessite de permissão para poder fazer um uso do trabalho em condições não previstas no licenciamento indicado, deverá contactar o autor, através do RepositóriUM da Universidade do Minho. Licença concedida aos utilizadores deste trabalho Atribuição-NãoComercial-SemDerivações CC BY-NC-ND https://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ iii Agradecimentos A todos aqueles que contribuíram para a realização deste trabalho, deixo aqui o meu sincero agradecimento. Ao Doutor Ricardo Pereira, por toda a orientação, dedicação, empenho, disponibilidade e ajuda incansáveis, tanto no trabalho prático como no esclarecimento de questões teóricas ao longo de todo o projeto. Ao Professor António Vicente, por toda a atenção e consideração dadas não só a mim como a todos os membros do laboratório, e por criar também condições de trabalho modelares – a quem também devo agradecer pela minha inserção no Laboratório de Indústria e Processo durante o período de estágio. Ao Engenheiro Guilherme Pereira, pela conceção deste projeto e posterior criação desta oportunidade de trabalho, igualmente pelo seu empenho e interesse pela realização do mesmo e por todos os conhecimentos práticos transmitidos. A todos os membros do LIP pela ajuda, paciência, amizade e disponibilidade ao longo da concretização deste projeto e pela forma como me acolheram, em especial ao Jean-Michel Fernandes pelo acompanhamento na realização do trabalho – crucial para a execução do mesmo. Também agradeço a toda a minha família e amigos por todo o apoio, carinho e encorajamento demonstrado ao longo desta etapa, em especial ao Pedro – a quem dedico este trabalho. iv DECLARAÇÃO DE INTEGRIDADE Declaro ter atuado com integridade na elaboração do presente trabalho académico e confirmo que não recorri à prática de plágio nem a qualquer forma de utilização indevida ou falsificação de informações ou resultados em nenhuma das etapas conducente à sua elaboração. Mais declaro que conheço e que respeitei o Código de Conduta Ética da Universidade do Minho. v Estabilização das Leveduras do Mosto de Uvas Através da Tecnologia de Aquecimento Óhmico O trabalho teve como principal objetivo a averiguação do papel da componente elétrica da tecnologia de Aquecimento Óhmico aquando a sua aplicação na inativação microbiológica de mosto de vinho. Teve ainda o propósito da otimização das condições de inativação da estirpe de levedura Dekkera bruxellensis PYCC 4801 – um contaminante problemático na indústria vínica – através da aplicação da tecnologia do Aquecimento Óhmico. Foi ainda, adicionalmente, realizado o levantamento da influência deste tratamento na fermentação de mosto de Vinho Verde. Verificaram-se efeitos notórios de inativação da estirpe de levedura a baixas temperaturas de tratamento (40 ⁰C) e campos elétricos moderados (400 V/cm). Foi possível constatar o impacto da componente elétrica na mesma inativação, sendo que a baixas temperaturas (40 ⁰C) mas na ausência de campo elétrico ou presença de campos elétricos baixos (75 V/cm ou 90 V/cm) o efeito de inativação foi nulo ou bastante inferior ao visualizado nos ensaios em que se utilizaram campos elétricos moderados de aproximadamente 400 V/cm. No respeitante à caracterização físico-química dos mostos usados para tratamento no sistema de aquecimento óhmico, verificou-se uma manutenção dos seus parâmetros principais; a sua caracterização microbiológica revelou uma maior presença de Hanseniaspora uvarum e Schizosaccharomyces pombe , uma espécie desconhecida de coloração verde intenso e espécies de fungos filamentosos. De salientar que os efeitos de inativação por tratamento óhmico observaram-se principalmente nas espécies mais dominantes do mosto . As condições mais promissoras de tratamento óhmico foram aplicadas no tratamento de mosto de Vinho Verde (casta Fernão Pires), tendo sido comparada a fermentação de mosto tratado em sistema óhmico e a fermentação de mosto sem qualquer tipo de tratamento. Verificou-se uma conformidade das características físico-químicas dos mostos, quer durante a fermentação, quer no vinho final. Concluiu-se que a Tecnologia do Aquecimento Óhmico é uma alternativa promissora para o controlo microbiológico do processo de produção de Vinhos Verdes, sem que as suas propriedades sejam afetadas por este tratamento. Palavras-chave: Aquecimento Óhmico, Eletro-Tecnologias, Inativação, Mosto, Vinho Verde vi Stabilization of Yeasts Present in Wine Must Using Ohmic Heating Technologies The main objective of this work was to investigate the role of the electricity when using ohmic heating technologies in the microbiological inactivation of wine must. There was also the goal of optimizing the conditions of inactivation of the yeast strain Dekkera bruxellensis PYCC 4801 – a problematic contaminant in the wine industry – when ohmic heating technology was used. In addition, a study was made to analyse the influence of this treatment on the fermentation of must of Vinho Verde. It was found that there were noticeable inactivation effects on the yeast strain at low treatment temperatures – 40 ⁰C – and moderate electric fields – 400 V/cm. The role of electricity on yeast inactivation was also verified throughout the tests performed at low temperatures – 40 ⁰C – and absence of electric field or presence of low electric fields – 75 V/cm or 90 V/cm – once the inactivation effects were null or significantly lower than the ones observed when using moderate electric fields – 400 V/cm. Regarding the physicochemical characterization of musts, their main parameters were maintained; while its microbiological characterization revealed a greater presence of Hanseniaspora uvarum and Schizosaccharomyces pombe , an unknown species of intense green coloration and also species of filamentous fungi. It is also important to point out that inactivation effects promoted by ohmic treatment had higher incidence on the dominant species of the must. The most promising conditions of ohmic heating treatment were applied in the treatment of Vinho Verde must (Fernão-Pires variety), and the fermentation of ohmic treated must and the fermentation of not-treated must were compared. The physicochemical characteristics of the musts were found to be compatible either during fermentation or in the final wine. It can be concluded that Ohmic Heating Technology proves to be a promising alternative for the microbiological control of the Vinho Verde production process, without its main properties being affected by this treatment. Keywords: Electro Technologies, Inactivation, Must, Ohmic Heating, Vinho Verde vii Índice Agradecimentos ........................................................................................................................ iii Estabilização das Leveduras do Mosto de Uvas Através da Tecnologia de Aquecimento Óhmico . iv Stabilization of Yeasts Present in Wine Must Using Ohmic Heating Technologies ........................ vi Índice de Figuras ....................................................................................................................... x Índice de Tabelas .................................................................................................................... xv Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrónimos ................................................................................ xvi 1.1. Organização da dissertação ............................................................................................... 1 1.2. Estado da Arte ................................................................................................................... 1 1.3. Objetivos ........................................................................................................................... 2 2. Fundamentação Teórica ....................................................................................................... 3 2.1. História da Vinha e do Vinho .............................................................................................. 3 2.2. Organização Internacional da Vinha e do Vinho – OIV ......................................................... 4 2.2.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes ............................................................................ 7 2.3. Processo Produtivo do Vinho .............................................................................................. 9 2.3.1 Fatores Que Influenciam a Fermentação ........................................................................ 11 2.3.2. Microbiologia da Vitivinificação ...................................................................................... 13 2.3.2.1. Dekkera bruxellensis .................................................................................................. 14 2.4. Higiene e Segurança Alimentar na Produção de Vinho Branco .......................................... 15 2.4.1. Desvantagens da Sulfitação .......................................................................................... 16 2.5. Processos Alternativos de Inativação Microbiológica de Vinhos ......................................... 18 viii 2.5.1. As Eletro-Tecnologias Nos Processos de inativação ....................................................... 20 2.6. Aquecimento Óhmico (OH) .............................................................................................. 23 3. Metodologias ...................................................................................................................... 26 3.1. Microbiologia ................................................................................................................... 26 3.1.1. Preparação de Meios de Cultura ................................................................................... 26 3.1.2. Preparação de Stocks de Levedura ............................................................................... 27 3.1.3. Caracterização Microbiológica das Amostras ................................................................. 27 3.1.4. Utilização da Levedura-Alvo .......................................................................................... 28 3.2. Ensaios de Inativação Utilizando o Aquecimento Óhmico .................................................. 28 3.2.1. Avaliação em Mosto de Vinho Verde .............................................................................. 32 3.3. Caracterização Físico-Química do Mosto de Vinho ............................................................ 32 3.4. Fermentação do Mosto de Vinho Verde ............................................................................ 33 4. Resultados e Discussão ...................................................................................................... 35 4.1. Avaliação Preliminar Em Levedura Isolada – Protocolo I ................................................... 35 4.2. Avaliação Preliminar em Levedura Isolada – Protocolo II .................................................. 38 4.3. Avaliação Preliminar Em Levedura Isolada – Protocolo III ................................................. 44 4.4. Avaliação Preliminar em Levedura Isolada – Protocolo IV ................................................. 47 4.5. Caracterização Fisico-Química do Mosto de Vinho ............................................................ 55 4.6. Caracterização Microbiológica do Mosto de Vinho e Estudo do Tempo de Prateleira .......... 58 4.7. Microvinificação do Mosto Não-Tratado e do Mosto Tratado por Aquecimento Óhmico ...... 63 5.1 Conclusões ...................................................................................................................... 68 ix 5.2. Principais Recomendações e Trabalho Futuro ................................................................. 69 Bibliografia ............................................................................................................................. 70 Anexos ................................................................................................................................... 73 xvi Lista de Abreviaturas, Siglas e Acrónimos DO Denominação de Origem IG Identificação Geográfica OH Aquecimento Óhmico OIV Organização Internacional da Vinha e do Vinho PEF Campos Elétricos Pulsados POH Aquecimento Óhmico Pulsado PYCC Portuguese Yeast Culture Collection RCV Registo Central Vitícola SO2 Dióxido de enxofre SO32Ião sulfito SOX Óxidos de enxofre WL Wallerstein Laboratory Nutrient YPD Yeast Peptone Dextrose AT Acidez Total AR Concentração Em Açúcares Redutores CM Concentração Microbiológica das Amostras SST Sólidos Solúveis Totais t Tempo T Temperatura TP Teor Proteico UFC Unidades Formadoras de Colónia V Tensão da corrente VNaOH Volume de titulant 1 1.1. Organização da dissertação O presente documento foi dividido em cinco capítulos principais. O primeiro capítulo destina-se ao esclarecimento do desafio proposto da sua relevância no contexto atual; o segundo capítulo refere-se à secção onde é feito um levantamento dos temas discutidos no decorrer da dissertação, ou seja, o processo de produção de vinho, os seus principais desafios e, por fim, as metodologias atuais e emergentes referentes a essa área de bioprocessos; no terceiro capítulo descrevem-se os materiais e métodos experimentais empregues no âmbito da dissertação; no quarto capítulo é realizada a apresentação e discussão dos resultados obtidos; sendo que no quinto capítulo apresentaram-se as principais conclusões e recomendações para trabalhos futuros. 1.2. Estado da Arte O Vinho Verde é um produto nacional produzido exclusivamente na Região Demarcada dos Vinhos Verdes. É um vinho notoriamente fresco e frutado cujo interesse e procura tem sido cada vez mais manifestados. Segundo os dados da Comissão Reguladora, o Vinho Verde é um produto que tem vindo a ser cada vez mais procurado por mercados estrangeiros, sendo que a sua procura tem vindo a aumentar exponencialmente nos últimos 20 anos, gerando no ano de 2018 mais de 63 M€ e mais de 26∙106 L de vinho vendidos (CVRVV, 2019). É então de interesse a otimização da sua produção, optando por processos com menor impacto ambiental e com o mínimo de operações adicionais de maneira que haja a mínima alteração das suas propriedades de eleição. Já o processo de produção do vinho acarreta uma grande variabilidade de microrganismos, que poderão influenciar a fermentação alcoólica e manifestar ser um perigo para a saúde do consumidor. O método universalmente utilizado para conservação do mosto baseia-se na adição de dióxido de enxofre. Este composto, adicionado ao mosto e ao vinho mais comumente na forma líquida – denominada por solução sulfurosa – é um produto antimicrobiano e antioxidante, contudo com propriedades tóxicas e alergénicas e associado a custos adicionais para a sua remoção do produto final (Puxeu, M. et al ., 2018). Surge então uma necessidade e oportunidade para a conceção de uma nova e melhor alternativa a esta etapa industrial. Uma alternativa promissora consiste na aplicação de corrente elétrica para o controlo microbiológico do mosto de vinho. 2 1.3. Objetivos O objetivo principal deste trabalho consiste no esclarecimento do papel do efeito não térmico da tecnologia de aquecimento ohmico na inativação de uma estirpe de levedura considerada de maior risco - Dekkera bruxellensis PYCC 4801 – averiguando também o papel da intensidade do campo elétrico aplicado. Como objetivos secundários, pretende-se igualmente avaliar os seguintes pontos: - A avaliação da sinergia dos efeitos térmicos e não térmicos na inativação da D. bruxellensis, combinando aplicação de campo elétrico com o aumento da temperatura média de tratamento (incluindo comparação com o tratamento térmico convencional); - A avaliação dos efeitos da aplicação de diferentes intensidades de campo elétrico entre os 50 V/cm e os 600 V/cm na inativação de D. bruxellensis ; - A aplicação das condições de tratamento elétrico mais promissoras em mosto de vinho verde fresco e avaliação dos resultados nas componentes microbiológica e física e quimica - A avaliação preliminar do impacto destes tratamentos na fermentação do mosto tratado e averiguação das suas principais características físico-químicas. 3 2. Fundamentação Teórica 2.1. História da Vinha e do Vinho Pensa-se que o Homem pré-histórico terá sido o primeiro a criar, por acidente, uma bebida de sumo de uva fermentado – tendo sido encontrados registos arqueológicos da sua produção até 5000 a.C. na região que é conhecida como o Crescente Fértil (Jackson R.S, 2008). Com a transição do nomadismo para o sedentarismo, a domesticação da videira terá vindo acoplada à conceção da agricultura de vários produtos alimentares. E terá sido desta maneira que, com o tempo, espécies capazes de produzir cachos mais densos, com bagos de uva maiores e mais concentrados em açúcares e aromas foram sendo preferidos e, portanto, mais procurados pelas populações. Tal acontecimento despoletou, então, uma seleção natural por videiras com esse tipo de características, desenvolvendo-se simultaneamente agrupamentos de características da uva em variedades consoante as suas particularidades, que ao longo do tempo vieram-se a conhecer e denominar pelas variedades de uva que se conhecem nos dias de hoje (Harding, J. et al. , 2012). Atualmente existem várias espécies de videira – plantas pertencentes à família Vitaceae , género Vitis – sendo que a maioria destas é nativa à América do Norte e Ásia Oriental – como o exemplo da espécie Vitis labrusca , videira natural da América do Norte cujas uvas produzem um vinho com aromas bastante distintos, como sendo o aroma a pelo animal e a fruta cristalizada, e Vitis amurensis , planta nativa da Ásia Oriental. Contudo, é a espécie nativa da Eurásia que é a mais utilizada na indústria vínica, a Vitis vinífera . Esta espécie, considerada superior em termos de qualidade e aromas que confere ao vinho, ainda pode ser dividida em duas subespécies: Vitis vinífera L. subsp . vinífera – planta hermafrodita domesticada na zona da Eurásia – e Vitis vinífera L. subsp. silvestris – planta dióica selvagem encontrada no Ocidente Europeu, Norte de África e até em países da Ásia Central (Harding, J. et al ., 2012). Desde então, a uva provou ser o fruto de maior produção e comercialização agrícola a nível mundial, uma vez que pode ser usada tanto para consumo – uvas de mesa ou uvas passas – como para produção de bebidas alcoólicas. Em 2018, dados da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV) revelam que a produção de vinho atingira um dos maiores picos de produção desde o ano 2000 – sendo este valor apenas ultrapassado nos anos 2004 e 2013. Foram somados cerca de 282 milhões de hectolitros de vinho produzidos a nível mundial, em que os países mais produtores foram a Espanha, França e Itália. 4 2.2. Organização Internacional da Vinha e do Vinho – OIV Com o passar do tempo, gerou-se a necessidade de haver uma entidade reguladora com o objetivo de socorrer e padronizar a produção e comercialização de uvas e de vinho. E foi assim que, em 2001 foi criada a Organização Internacional da Vinha e do Vinho por 35 estados soberanos – sendo que, em 2018, esse número atingiu os 47 estados membros, e ainda conta com a participação de entidades como a União Europeia (EU) e a International Wine Law Association (AIDV). Esta é uma organização com o principal objetivo de standardizar as práticas enológicas a nível mundial, e é a entidade de referência tanto no domínio das vinhas, do vinho e das bebidas à base de vinho como de todos os produtos derivados da vinha. Segundo esta, no Regulamento EU nº 1308/2013 do Parlamento Europeu e do seu Conselho, vinho é qualquer produto produzido exclusivamente por fermentação alcoólica, total ou parcial, de uvas frescas, esmagadas ou não, ou de mosto de uvas. Já uvas são o fruto da videia utilizados para vinificação, maduros ou mesmo ligeiramente passados, suscetíveis de serem esmagados ou espremidos com os meios normais de adega e de originarem espontaneamente uma fermentação alcoólica. Mosto de uvas é o produto líquido obtido naturalmente ou por processos físicos a partir de uvas frescas, cujo título alcoométrico volúmico adquirido não poderá ultrapassar o valor de 1 %. Para além da OIV, ainda foi criada uma entidade nacional em 1986, denominada por Instituição da Vinha e do Vinho (IVV), com o objetivo de promover os produtos vitivinícolas, garantir o funcionamento da Comissão Nacional da Organização Internacional da Vinha e do Vinho e auditar o sistema de certificação de qualidade, entre outras funções. Esta disponibilizou limites de segurança da presença de uma variedade de substâncias que poderão ocorrer nesses produtos – alguns dados mais relevantes encontram-se expostos na Tabela 1 – e ainda forneceu dados para os limites de segurança em caso da presença de certos contaminantes vínicos – estando estes presentes na Tabela 2. 5 Tabela 1 Limites analíticos e limites de emprego de certas substâncias em vinhos, bebidas espirituosas e vinagre de vinho estabelecidos pela IVV (2019) Parâmetro Limite Base Jurídica Acidez Total Vinhos (expressa em ácido tartárico) > 3,5 g/l > 46,6 meq/L Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III1 d) Acúcares (teor em açúcares, expresso em glucose + frutose) vinhos espumantes Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo XIV - Parte A "bruto natural" < 3 g/L "extra bruto" 0 - 6 g/L "bruto" < 12 g/L "extra seco" 12 - 17 g/L Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo XIV - Parte A "seco" 17 - 32 g/L "meio seco" 32 - 50 g/L "doce" > 50 g/L Produtos diferentes dos vinhos espumantes Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo XIV – Parte B "seco" não superior a: - 4 g/L ou - 9 g/L ,se a acidez total, expressa em g/L de ácido tartárico, não for inferior em mais de 2 g/L ao teor de açúcar residual "meio seco", "adamado" superior ao máximo acima indicado, mas não superior a: - 12 g/L ou - 18 g/L , se a acidez total, expressa em g/L de ácido tartárico, não for inferior em mais de 10 g/L ao teor de açúcar residual "meio doce" superior ao máximo acima indicado, mas não superior a: - 45 g/L 6 Tabela 1. Limites analíticos e limites de emprego de certas substâncias em vinhos, bebidas espirituosas e vinagre de vinho estabelecidos pela IVV (2019) (continuação) Parâmetro Limite Base Jurídica Acúcares (teor em açúcares, expresso em glucose + frutose) "doce" > 45 g/l Vinhos tintos e palhetes > 1,8 g/l Reg. (CE) nº 607/2009, Anexo XIV – Parte B Sulfatos (expresso em sulfato de potássio) Vinhos < 2 g/l Portaria nº 334/94, de 31 de Maio Título Alcoométrico Volúmico Total (TAV Total) Vinho < 15% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 1 c) Vinho Licoroso > 17,5% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 3 b) Vinho espumante > 8,5% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 4 d) Vinho espumante de qualidade > 9% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 5 d) Vinho espumante de qualidade tipo aromático > 10% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 6 d) Vinho frisante > 9% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 8 a) Vinho frisante gaseificado > 9% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 9 b) Vinho proveniente de uvas passa > 16% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 15 b) Vinho de uvas sobreamadurecidas > 15% vol. Reg. (CE) nº 491/2009, Anexo III – 16 c) Tabela 2 . Teores máximos de certos contaminantes estabelecidos pela IVV (2019) Contaminante Limite Base Jurídica Chumbo < 0,15 mg/kg Reg. (CE) nº 1881/2006, Secção 3.1 do Anexo Ocratoxina A < 2,0 µg/kg Reg. (CE) nº 1881/2006, Secção 2.2. do Anexo Patulina < 50 µg/kg Reg. (CE) nº 1881/2006, Secção 2.3. do Anexo 7 2.2.1. Região Demarcada dos Vinhos Verdes O vinho produzido em Portugal é notoriamente um produto bastante solicitado, tanto pelo mercado nacional como por mercados estrangeiros, tendo mesmo sido criado em 1703 um tratado entre Portugal e Inglaterra com o objetivo de regulamentar a entrada de vinho português em regime especial nesse país – conhecido como o tratado de Methween. Mas foi em 1908 que o rei D. Carlos demarcou oficialmente a região vitivinícola dos Vinhos Verdes, cuja área geográfica engloba as sub-regiões de Monção e Melgaço, Lima, Cávado, Ave, Basto, Sousa, Amarante, Paiva e Baião – cada uma com o seu clima específico e características geológicas e de solo, que fazem com que estas regiões estejam também mais aptas a produzir uvas de um certo número de castas. E foi em 1926 que foi criada a Comissão de Viticultura da Região dos Vinhos Verdes (CVRVV) e novamente acentuada a delimitação da região, com o Decreto n.º 12.866. Esta instituição nacional determinou como sua principal missão a promoção, controlo e certificação dos produtos vínicos com Denominação de Origem Vinhos Verde e Identificação Geográfica Minho, bem como a defesa do património regional e nacional dos Vinhos Verdes e o apoio e dinamização da melhoria da qualidade da vinha (CVRVV, 2019). Sabe-se então que a Denominação de Origem (DO) de Vinhos Verdes engloba tanto vinhos tranquilos, como espumantes, aguardentes vínicas e bagaceiras e até mesmo vinagres; estando estes sujeitos a uma série de requisitos e legislações associadas à deliberação dessa designação, que vão desde as castas que poderão ser selecionadas às características organoléticas do vinho final. Esta denominação surge como uma garantia do nível de qualidade dos vinhos que lhe estão associados – existindo ainda a Indicação Geográfica (IG), cuja designação é também controlada pela Entidade Certificadora e a qual segue as suas próprias legislações e requisitos específicos. Para um vinho obter a designação de Vinho Verde é, então, necessário atravessar uma série de requisitos, iniciando-se pelo cadastro das parcelas de vinha no Registo Central Vitícola (RCV), a inscrição na entidade certificadores de todos os produtores e comerciantes a operarem com o produto, também a identificação das instalações e confirmação da sua área geográfica pertencer à região demarcada, devendo ainda ser entregue a Declaração de Colheita e Produção (DCP). Sabe-se ainda que o Regulamento CE n.º 479/2008 dita que um levantamento, por parte da entidade controladora, deve ser feito anualmente aos produtos nos laboratórios da CVRVV (no caso dos Vinhos Verdes) das suas características organoléticas e analíticas e verificação do 8 cumprimento das exigências estabelecidas – desde a concentração de açúcares totais (expressa em frutose e glucose), a acidez total, a acidez volátil, concentração de dióxido de enxofre total ao teor alcoólico total e adquirido, passando ainda por uma análise aos aromas, sabor e aspeto do produto. Para produtos vínicos que tenham sofrido alguma retificação ou ajuste dos seus parâmetros físico-químicos, o mesmo Regulamento ainda impõe que estes sejam mencionados – é o exemplo da acidificação ou desacidificação, a adição de dióxido de enxofre, o aumento do título alcoométrico e o uso de novas práticas enológicas. O vinho deve ser privado de defeitos organoléticos, com aromas e sabor característicos da sua região demarcada, ainda provendo de características específicas de uma sub-região aquando a identificação da mesma – tendo estes parâmetros de qualificar numa notação igual ou superior a seis (numa escala de 1 a 10) para ambos os casos (CVRVV, 2019). Ainda, os produtores deverão garantir que o seu rendimento máximo, por hectare de vinha, não ultrapassa os 10666 kg, dos quais o rendimento em mosto de uva após a remoção dos bagaços não ultrapassa os 75 L por 100 kg de uvas – exceto para a casta Alvarinho, cujo limite é 65 L de mosto por cada 100 kg de uvas (CVRVV, 2015). Aquando a rotulagem, deverá constar a designação do produto bem como a sua marca, uma indicação da sua proveniência, uma referência ao lote e ao engarrafador, o seu título alcoométrico volúmico adquirido, o volume nominal, indicação da presença de alergénios e ainda, no caso de se tratar de um vinho opalino, deverá prover de uma menção da possibilidade da formação de um depósito. Facultativamente poderá ter, entre outras indicações, uma referência à cor, ao seu ano de colheita e às castas presentes. Portanto, só após um cumprimento e verificação de todos os requisitos estabelecidos é que o produto poderá ser candidato a utilizar o selo de garantia cedido pela Comissão de Viticultura da Região dos Vinhos Verdes, tal como é possível ver na Figura 1 (CVRVV, 2019). Figura 1 Selo de garantia da Comissão de Viticultura da Região dos Vinhos Verdes (CVRVV,2019). 9 2.3. Processo Produtivo do Vinho A vinificação, ou seja, o processo produtivo do fabrico de vinho inicia-se com a colheita da uva e o que é conhecido por práticas pré-fermentativas, ou seja, o desengace e o esmagamento. Estes passos, respetivamente, referem-se à separação das uvas dos engaços, folhas e material lenhoso a elas associado, e ao esmagamento das uvas com a rotura da película e libertação da polpa e sumo. No que diz respeito ao desengace, este passo poderá ser de especial interesse no processo industrial, uma vez que retira os compostos fenólicos – catequinas, flavonoides e ácido caftárico – do vinho final. Porém, estes compostos poderão ser de especial interesse no caso da produção de vinho tinto cuja variedade da uva utilizada seja caracteristicamente pobre em compostos fenólicos. Os compostos fenólicos presentes na película conferem uma sensação de adstringência e amargura menores em comparação aos fenóis presentes nos engaços e nas grainhas. Apesar de não ser tão usado atualmente, há quem evite este passo na produção de vinho tinto, uma vez que aumenta a concentração de taninos, que proporcionam ao vinho uma maior densidade de cor e a sensação de um vinho mais encorpado (Jackson R.S. ,2008). Já o esmagamento deve ser feito o mais próximo possível do desengace, e na verdade, na colheita da uva, de modo a evitar a contaminação e efeitos de escurecimento nas uvas que acidentalmente são rebentadas durante os passos que o precedem. Entre os passos de desengace e esmagamento, poderá ainda haver uma seleção das uvas, de maneira a remover materiais indesejados deixados após o desengace – entre os quais insetos, uvas que não tenham atingido o seu pico de maturação e uvas que tenham sofrido reações de escurecimento – para não comprometer a qualidade do produto final. Seguidamente, tem-se a maceração da uva, em que sucede a rotura da película e caracteriza-se pela libertação da polpa e grainhas e o contacto destes três constituintes. Este contacto irá facilitar a libertação de vários compostos como ácidos gordos, álcoois superiores, enzimas hidrolíticas e compostos varietais como conjugados de S-cisteína, que irão ainda facilitar a fermentação e melhorar a viabilidade da levedura fermentativa. Mas também poderá levar a reações e processos indesejáveis, como a transferência de proteínas que são instáveis ao calor – tal ocorrência pode ser remediada pelo uso de estabilizantes químicos, ou prevenida através de um tempo de maceração mais curto (Jackson R.S., 2008). 16 Da mesma análise resultam Pontos de Controlo Críticos (PCC), que são situações que não são previstas por Códigos de Boas Práticas – não sendo então classificadas como pré-requisitos – e que podem causar danos à segurança ou saúde no caso de serem considerados significativos. Estes estão ainda divididos em perigos químicos, físicos e biológicos. Para o processo produtivo do vinho, a existência de pragas ou doenças na matéria-prima e/ou na água de irrigação foi identificado como um perigo biológico, a presença de objetos estranhos aquando a colheita da uva é o exemplo de um perigo físico, sendo exemplos de perigos químicos a presença de resíduos de desinfetantes derivados dos tratamentos fitossanitários e herbicidas aquando a plantação da vinha, concentrações elevadas de sulfitos adicionados para controlo dos microrganismos e a presença de Ocratoxina A (OIV, 2012). No que toca à utilização de aditivos aquando a produção de vinho, sendo o dióxido de enxofre considerado um aditivo de controlo microbiológico, há uma série de recomendações – incluindo a concentração diária recomendada – que deverão ser seguidas de maneira a que a sua adição possa ser então possível (FAO & WHO, 2016). É ainda de salientar que a presença de toxinas como a Ocratoxina A no vinho final é fortemente devida à presença de espécies como a A. carbonarius e a A. Niger nas uvas desde a etapa da viticultura. Uma vez que concentrações excessivas impedem a utilização das uvas – com exceção de uvas afetadas com “podridão nobre” – deve-se recorrer a uma colocação da vinha mais apropriada, de modo evitar o contacto dos cachos de uva com o solo e os seus respetivos microrganismos e um melhor planeamento da data da vindima, evitando ainda o contacto com animais que possam ser fonte de contaminação das uvas (FAO, 2007). 2.4.1. Desvantagens da Sulfitação Na tentativa de um controlo microbiano na produção do vinho, o método mais comumente usado pela comunidade vitivinícola é a adição de dióxido de enxofre. Este composto poderá ser adicionado na forma sólida (metabissulfito de potássio), gasosa ou, mais usualmente, na forma líquida (solução sulfurosa), e é conhecido por possuir propriedades antioxidantes e antisséticas, contribuindo também para a manutenção da cor e aromas do vinho durante a maturação. Este composto é capaz de impedir o desenvolvimento de leveduras, bactérias acido-láticas e até algumas bactérias acido-acéticas, conseguindo impedir reações como o apodrecimento causado por bactérias ou o crescimento de Brettanomyces spp .. Consegue ainda impedir a oxidação de 17 compostos do vinho e reações de escurecimento através da inativação de enzimas como a peroxidase. A presença de sulfato de enxofre existe naturalmente no vinho sem haver a necessidade de qualquer tipo de adição. Tal facto deve-se à produção deste composto aquando a fermentação alcoólica por parte das leveduras fermentativas, através do consumo de enxofre livre na sua forma molecular (S2-) durante a síntese de aminoácidos, ou à sua libertação na forma de sulfato de hidrogénio (H2S) – sendo esta a sua forma mais indesejada devido ao cheiro e ao sabor desagradáveis (Coimbra, M. et al ., 2012). A capacidade de produção de dióxido de enxofre por parte de leveduras – sendo o exemplo da Saccharomyces cerevisiae – varia de espécie para espécie, mas pensa-se que possam divergir entre os 0 mg/L e os 115 mg/L. Nesse caso, o facto de este composto ser produzido pela célula pode ser cúmplice na resistência de certas leveduras ao aditivo de controlo microbiológico mais comum. Uma das soluções para este possível problema é o uso de estirpes de levedura que produzam pequenas quantidades de dióxido de enxofre (Puxeu, M. et al ., 2018). Quantidades mínimas de SO2 livre resultarão numa ação pouco eficiente no controlo e manutenção do vinho, enquanto que concentrações excessivas irão causar alterações organoléticas e danos à saúde humana. Uma vez que o SO2 pode estar presente nos vinhos sobre a forma livre ou ligada, um método fiável de dosagem e controlo da concentração deste composto é dificultado. Porém, sabe-se que a sua forma ativa – forma com propriedades antimicrobianas e antioxidantes – é a forma molecular SO2 livre, que está dependente da disponibilidade da mesma e dos níveis de pH. (Coimbra, M. et al ., 2012). Devido às reações adversas dos consumidores causadas pela presença quantidades significativas de dióxido de enxofre – que poderão manifestar-se na forma de dermatite alérgica, urticária, diarreia, e dificuldades na respiração – para além de uma perda das propriedades do vinho e, ainda, os obstáculos ambientais associados à remoção deste composto, tem sido feito um esforço para encontrar alternativas que possam substituir a utilização deste composto na vinificação (Puxeu, M. et al ., 2018). Alguns métodos que têm sido estudados encontram-se expostos na Tabela 3. 18 Tabela 3 . Métodos de controlo microbiano e respetivos mecanismos de ação, baseado na publicação de Bartowsky, E. J. (2009) Alternativas de Controlo Microbiano Mecanismo de Ação Tradicional Dióxido de enxofre Inibe o desenvolvimento de microrganismos Filtração Remoção física dos microrganismos do vinho Química Dicarbonato de dimetilo (DMDC) Reação irreversível com os aminoácidos nos sites ativos das enzimas Produtos Naturais Lisossomas Impede a síntese de parede celular, levando à lise celular Bacteriocinas Modifica os componentes da parede celular, levando à lise celular 2.5. Processos Alternativos de Inativação Microbiológica de Vinhos Um dos maiores desafios da atualidade é a conceção de novas tecnologias e soluções que melhorem o bem-estar do consumidor, a qualidade e a segurança alimentar, e que simultaneamente contribuam para a defesa do planeta e uma menor pegada ecológica. Como já foi referido, a sulfitação do mosto de uva e/ou do vinho fermentado constitui um problema a nível económico, ambiental e um risco para a saúde; daí, portanto, ser considerado na área de investigação científica como uma oportunidade para a criação de novas e melhores opções para o controlo microbiológico do processo de fabrico do vinho. 19 Tabela 3. Métodos de controlo microbiano e respetivos mecanismos de ação, baseado na publicação de Bartowsky, E. J. (2009) (continuação) Tecnologias Recorrentes Ultrahigh pressure (UHP) Danifica a membrana citoplasmática, provoca a inativação enzimática Ultrassons de alta potência Causa o encurtamento da membrana celular, aquecimentos localizados e produção de radicais livres Irradiação UV Danifica o ADN Campos Elétricos Pulsados Provoca o colapso da membrana celular por efeitos elétricos Vários esforços já foram então feitos numa tentativa de vir a solucionar este problema. De entre eles, destaca-se o trabalho realizado por Durner, D. et al ., que, em 2017, estudou os efeitos de inativação microbiológica de tratamentos com radiação ultravioleta em vinho e mosto de vinho. Nos seus ensaios foi então utilizado mosto de uva da variedade Riesling com a sua microflora nativa, sendo este tratado utilizando uma lâmpada de mercúrio através da qual a radiação UV-C máxima gerada era de 245 nm. Foi concluído que o nível de inativação das espécies presentes era dependente não só da espécie, mas também da concentração inicial das mesmas anterior ao tratamento. As leveduras provaram ser mais resistentes do que as espécies de bactérias presentes, sendo que a Saccharomyces cerevisiae mostrou ser a espécie mais resistente à irradiação. Foram obtidos efeitos de inativação dos microrganismos presentes semelhantes para o caso do tratamento usando radiação UV-C e para o caso da pasteurização, com a vantagem de a radiação UV-C não afetar a concentração de precursores de aroma do mosto e ser capaz de interromper a fermentação alcoólica mesmo na presença de açúcares residuais (Durner, D. et al, 2007). Alternativamente, Chen, P. et al em 2006 estudou as altas pressões hidrostáticas (HHP) na pasteurização de vinho com baixo teor alcoólico. A temperatura foi mantida a 25 ⁰C enquanto que a pressão foi colocada entre os 101,3∙103 kPa e os 354,64∙103 kPa durante 0 min até 30 min, 20 analisando-se a concentração de bactérias aeróbias, leveduras e bactérias ácido-láticas e ainda propriedades sensoriais do vinho tratado através de 10 painéis de teste (apenas para o vinho tratado a 354,64∙103 kPa por 10 min). A concentração de bactérias aeróbias foi considerada nula a partir dos 20 min de tratamento a 303,98∙103 kPa e a partir dos 10 min de tratamento a 354,64∙103 kPa, o mesmo efeito de inativação foi observado para as bactérias ácido-láticas a partir dos 20 min a uma pressão de 303,98∙103 kPa ou a partir dos 5 min a 354,64∙103 kPa; enquanto que para as leveduras apenas com pressões superiores a 303,98∙103 kPa é que se verificou tal efeito. Foi possível constatar que através da conceção da cinética de inativação dos microrganismos que poderiam estar presentes dois grupos distintos de microrganismos no vinho, sendo um deles mais suscetível a este tipo de tratamentos uma vez que a taxa de inativação nas etapas iniciais era superior em relação às finais. Concluiu-se igualmente que os tratamentos a HHP não tiveram impacto nas características físico-químicas do vinho (Chen, P. et al , 2006). 2.5.1. As Eletro-Tecnologias Nos Processos de inativação No que toca a tecnologias recorrentes no âmbito de bioprocessos e de interesse tanto para a investigação científica como para a indústria, é de salientar as tecnologias que envolvem a utilização de corrente elétrica como vetor de processamento. De facto, estas tecnologias englobam em si um extenso espetro de aplicações e uma série de vantagens desde a estabilização de biomateriais, a facilitação da extração de componentes à assistência nos processos de separação. Alguns dos efeitos decorrentes da aplicação de campos elétricos envolvem a dissipação de parte da energia sob a forma de calor – fenómeno conhecido como Efeito de Joule ou aquecimento óhmico – e a eletroporação, que se refere ao fenómeno que ocorre devido à capacidade do campo elétrico pulsado de elevada intensidade provocar uma permeabilização da membrana celular causada pela geração de um potencial transmembranar (Santos, P.,& Rodrigues, R., 2018). Efetivamente, dependendo do objetivo e das diferentes condições de aplicação e equipamento, diferentes protocolos elétricos podem ser estabelecidos. Atualmente, as principais tecnologias baseadas na aplicação de campos elétricos encontram-se divididas numa variedade de espetros, diferenciando-se entre si pelos seguintes fatores: tipo de corrente utilizada, intensidade da força do campo elétrico, frequência e tipo de onda elétrica, tempo de tratamento e o efeito térmico. Deste modo, estas tecnologias poderão ser divididas em: Aquecimento Óhmico (OH), Aquecimento Óhmico Pulsado (POH), Campos Elétricos Moderados (MEF), Campos Elétricos Pulsados (PEF) e Descargas Elétricas de Alta Voltagem (HVED). 21 No que diz respeito às HVED, caracterizadas por pulsos de alta corrente e alta voltagem, é promovida a eletroporação e dissipação de calor e ainda é comum ocorrerem fenómenos como a cavitação, emissão de luz, efeito de choque e formação de radicais. Desafios associados a esta tecnologia baseiam-se na demanda e custos dos materiais e equipamentos e limitações relacionadas à operação em si (Santos, P., et al , 2018). A tecnologia PEF é provavelmente mais estudada no que diz respeito a métodos de extração. Através desta tecnologia, considerada como sendo não-térmica, são aplicados pulsos elétricos na ordem dos quilovolts por centímetro, em intervalos de tempo curtos (nanossegundos), provocando assim a eletropermeabilização da membrana e a danificação de estruturas intracelulares que podem determinar a lise celular. Os fatores que contribuem para a eficiência desta técnica estão relacionados com o tipo de pulso (unipolar ou bipolar), número de pulsos por unidade de tempo, a sua duração, a temperatura de operação e as características do próprio produto e meio. Atualmente, tem-se verificado a tendência para tornar os PEF, um processo essencialmente reconhecido como sendo não-térmico, num processo que envolva o efeito da temperatura. Esta nova tendência tem concebido novos estudos, que denominam esta variante de Aquecimento Óhmico Pulsado (POH). Para além das técnicas que usem corrente elétrica pulsada, existem técnicas que se servem da aplicação de campos elétricos sem restrições do tempo de aplicação, formato de onda e frequência elétrica. São o exemplo disso od MEF e o OH, que se caracterizam ambas pela aplicação de campos elétricos de baixa ou moderada intensidade sem restrições no tempo de tratamento, e cujo efeito térmico pode ser controlado ou minimizado (no caso do MEF) ou direcionado para processamento térmico (caso do OH). Ambas técnicas utilizam corrente elétrica alternada, sendo que, por esta razão, normalmente a sua aplicação resulta na dissipação significativa de calor. OH e MEF só se diferenciam pela questão do efeito térmico; no caso do MEF, o aquecimento por efeito de Joule pode ser minimizado, limitando a condutividade elétrica do meio, procurando-se desta fora dar relevo aos efeitos elétricos decorrentes da tecnologia; em sentido contrário no caso do OH, pretende-se assumidamente acentuar a dissipação de calor. De facto, tanto o MEF como o OH são técnicas com condições de implementação mais facilitadas ao contrário de outras eletro-tecnologias mencionadas anteriormente, ainda com a faceta de permeabilizar a membrana e induzir a extração de compostos (análise caso a caso), podendo ser usados numa variedade de aplicações. 22 Ao longo dos anos, este tipo de tecnologias tem sido, então, cada vez mais estudado, bem como a sua aplicação na indústria dos vinhos. Boussetta, N. et al ., em 2015, estudou o efeito de inativação dos PEF e HVED em Oenococcus oeni , Pediococcus parvulus e Brettanomyces bruxellensis , presentes em vinho tinto (com a exceção de O. oeni e P. parvulus para o tratamento a HVED), bem como o seu efeito na qualidade do vinho. Para tal, foram utilizados os tempos de tratamento 1, 2, 4, 6, 8 e 10 ms e voltagens de 20 kV/cm e 40 kV/cm para o tratamento usando PEF e HVED, respetivamente. Foram também estudados diferentes parâmetros físico-químicos nos vinhos, nomeadamente o pH, a concentração de açúcares residuais, concentração de ácido lático, ácido tartárico e ácido málico, bem como a sua acidez total, acidez volátil e concentração em taninos e antocianinas, entre outros parâmetros. Houve, então, a inativação da B. bruxellensis, O. oeni e P. parvulus para ambos os tratamentos, sendo que para o tratamento a PEF esta inativação foi mais bem-sucedida; também no que diz respeito aos parâmetros físico-químicos, verificou-se que os tratamentos a PEF não terão tido um impacto negativo na composição do vinho final, ao contrário dos tratamentos a HVED (Boussetta, N. et al ., 2015). Mok, C. et al ., em 2018, também aplicou o conceito das eletro-tecnologias – nomeadamente os PEF – no tratamento de vinho tinto de baixo teor alcoólico. Para tal, foram utilizados sete elétrodos ligados em série por onde se fizeram passar correntes de alta voltagem em pulsos de 1 µs, com o campo elétrico a variar entre os 20 kV/cm e os 50 kV/cm e uma frequência entre os 500 Hz e os 1500 Hz. Espécies de leveduras provaram ser mais suscetíveis a este tipo de tratamento, seguidas por espécies de bactérias aeróbias e, por último, bactérias ácidoláticas. Verificou-se uma maior taxa de morte celular entre os 30 kV/cm e os 40 kV/cm com a frequência a variar entre os 500 Hz e os 1500 Hz. No que diz respeito aos valores D para a frequência da corrente elétrica necessária para reduzir o número de microrganismos, as leveduras apresentaram um valor menor em comparação com os restantes microrganismos, seguidas por bactérias acéticas e, por último, as bactérias ácido-láticas. Já o valor D que relaciona a frequência com o tempo de tratamento foi menor para as leveduras, sendo que ambos os valores D foram inversos à intensidade do campo elétrico. O valor z que relaciona a frequência com o tempo de tratamento revelou ser mais baixo para as bactérias ácido-láticas, cerca de 24,6 kV/cm, e mais alto para as leveduras, cerca de 46,8 kV/cm (Mok, C. et al ., 2018). 23 2.6. Aquecimento Óhmico (OH) O OH a tecnologia com maior eficiência de implementação na indústria, nomeadamente na pasteurização e esterilização de alimentos (Santos, P., et al , 2018). Aquecimento Óhmico, ou aquecimento de Joule, é um mecanismo versátil que emprega energia elétrica no tratamento de uma variedade de produtos, tendo a particularidade de ocorrer a conversão quase total da energia elétrica empregue em energia térmica, causada pela resistência elétrica dos materiais e meio, e consegue ainda fornecer um aquecimento homogéneo das partículas do meio que está a tratar (Kaur, N. et al ., 2016). Neste mecanismo é necessário o contacto entre os elétrodos e o meio condutor (produto alvo) de forma a permitir a passagem de corrente e dissipação de calor no seu interior; este é por isso um processo de aquecimento direto, sendo que o calor gerado no produto, não sendo transferido através de superfícies quentes (métodos indiretos). O seu modo de ação também tem a vantagem de evitar a degradação de compostos sensíveis ao calor – sendo eficientemente apto a conservar a qualidade do alimento – e evitar a formação de incrustações e sujidades proteicas (efeitos de fouling). Entre outros parâmetros, este mecanismo depende da condutividade elétrica do produto, do formato em que o mesmo atravessa pelo sistema, o respetivo tempo de residência e da intensidade do campo elétrico. O seu design baseia-se num certo número de componentes-chave, exemplificados na Figura 2, sendo estes um gerador de energia (ligado a um amplificador de sinal, ou não) e ligado a dois elétrodos que se encontram posicionados de modo a que estejam em contacto com o produto e distanciados o suficiente para poderem efetuar o tratamento no mesmo, mas não o suficiente de modo a que a intensidade da corrente aplicada seja mínima. Ainda deverá ter uma unidade de controlo da voltagem aplicada e um sistema de aquisição de dados. Tradicionalmente, este método é usado em reatores tipo batch , mas existem designs especificamente criados de modo a que esta operação possa decorrer em contínuo (Bawa, A. et al . 2014). A condutividade elétrica do produto a tratar é um parâmetro crítico desta tecnologia, que define a apetência de aplicação assim como taxas e eficiência de aquecimento. A condutividade elétrica é um parâmetro dependente da estrutura e do tipo de ligações químicas presentes na matriz alimentar – parâmetros como a força iónica e presença de iões aumentam os valores de condutividade elétrica. Sabe-se também que o aumento da temperatura por efeito de Joule é proporcional ao aumento da condutividade elétrica do produto, estando este parâmetro então 24 Figura 2 Esquema exemplificativo de um sistema de aquecimento óhmico, retirado de Melton, L. et al ., 2019. associado à eficiência do tratamento. Outros parâmetros a considerar são: a frequência elétrica – baixas frequências elétricas podem promover a corrosão dos elétrodos dependendo do tipo de material e condutividade elétrica do meio; a voltagem e/ou campo elétrico aplicada – que irá definir a taxa de aquecimento; composição do alimento – se a matriz não for homogénea, o aquecimento poderá não ser uniforme; e a viscosidade do fluído, que pode influenciar o aquecimento, nomeadamente valores maiores de viscosidade tendem a aquecer mais depressa. Esta tecnologia está, portanto, associada a um número de vantagens, revelando-se uma alternativa atrativa para processos como de inativação microbiana. Algumas dessas vantagens são os baixos custos associados à sua manutenção e custos de operação, a sua elevada eficiência no tratamento de uma grande variedade de produtos, tanto líquidos como sólidos, associados a um baixo risco da ocorrência de danos no alimento provocados por efeito do calor (Bawa, A. et al . 2014). Neste sentido, foram já vários os estudos feitos com o objetivo de aprofundar o conhecimento acerca desta tecnologia e a sua possível aplicação em processos industriais. Pereira, et al , em 2007, determinou a cinética de morte da bactéria Escherichia coli , em leite cru com recurso ao aquecimento óhmico. Os resultados foram comparados com o tratamento térmico convencional – sendo que os perfis térmicos foram mantidos idênticos Foram testadas as temperaturas 55 ⁰C, 63 ⁰C, 65 ⁰C, 67 ⁰C e, adicionalmente, 70 ⁰C para o caso do tratamento convencional. Dos ensaios resultaram valores D para as amostras submetidas a tratamento óhmico inferiores em comparação aos valores D das amostras tratadas 25 pelo método convencional, sendo a única exceção o caso em que a temperatura de ensaio foi de 55 ⁰C. Já para o valor z, este foi superior no caso das amostras tratadas pelo método convencional relativamente ao tratamento óhmico. Foi então possível aferir que o tratamento óhmico foi mais eficaz na inativação da E. coli nas amostras de leite cru do que o tratamento pelo método convencional. Uma vez que ambos os tratamentos foram realizados sob o mesmo perfil térmico, as diferenças atribuídas foram justificadas pela presença do campo elétrico. Concluiu-se que, neste caso, o OH teve um efeito elétrico adicional na inativação do microrganismo (Pereira, R. et al , 2007). Ainda em 2017, Kima, N. et al . estudou o efeito de inativação do aquecimento óhmico em esporos de Alicyclobacillus acidoterrestris , inoculada em sumo de maçã, comparando-o também ao aquecimento convencional. 50 kg de sumo de maçã foram inoculados com A. acidoterrestris , sendo posteriormente sujeitos a tratamentos com temperatura variável entre os 85 °C e os 100 °C durante intervalos de tempo de tratamento de 30 s a 90 s, sendo ainda sujeitos a uma potência elétrica de 26,7 V/cm e uma frequência de 25 kHz exclusivamente quando se tratava do tratamento óhmico. Com a utilização de cinco tratamentos sequenciais, o aquecimento óhmico provou ser uma alternativa mais eficiente para a inativação de A. acidoterrestris do que o aquecimento convencional nas mesmas condições, sendo que as condições otimizadas de inativação revelaram ser 100 ⁰C a um intervalo de tempo de 30 s (Kima, N. et al ., 2017). 32 Já para os inóculos submetidos a um tratamento óhmico a uma voltagem baixa, os elétrodos eram ligados a um gerador de sinal (33220ª, Agilent Technologies Inc., Estados Unidos da América) – onde o tipo de onda escolhido foi o sinusoidal e a frequência de operação fixou-se nos 50 kHz – a um amplificador de sinal (CS 3000, Peavy Electronics Corporation, Estados Unidos da América), que ampliava a voltagem do gerador 30 vezes. Foi realizado ainda um estudo do tempo de prateleira após a realização do Protocolo IV, onde as amostras em triplicado foram deixadas a uma temperatura de 5 ⁰C, às quais que foram retiradas amostras de 200 µL de modo a supervisionar o desenvolvimento microbiano através da leitura da respetiva absorvância a 600 nm, e plaqueamentos em triplicado sempre que se observava uma alteração do valor da absorvância. 3.2.1. Avaliação em Mosto de Vinho Verde Com base nos resultados obtidos anteriormente e nas condições mais promissoras, foram ainda realizados ensaios de inativação microbiológica em mosto de vinho. Para tal, utilizou-se o mesmo sistema de tratamento óhmico que nos ensaios anteriores, com um reator cilíndrico de capacidade de 500 mL e com elétrodos de área superficial de 49 cm² e um afastamento de 8 cm. De modo a tratar, no mínimo, 1 L de mosto, foram feitos quatro tratamentos de 250 mL ou 300 mL. Estes foram submetidos a um tratamento a 40 ⁰C, 400 V por um período de 20 min, sendo o conteúdo do reator vertido para um matraz de 2 L esterilizado. Foram também realizados estudos de tempo de prateleira para os dois primeiros tratamentos, mantendo as amostras de mosto tratado e mosto não-tratado a 25 ⁰C e 5 ⁰C, respetivamente para cada tratamento. No final, 1 L de mosto tratado por OH e 1 L de mosto não tratado (controlo) foram colocados em matrazes de 2 L para posterior fermentação (ver secção 3.4). 3.3. Caracterização Físico-Química do Mosto de Vinho As amostras de mosto foram submetidas a uma série de ensaios de maneira a averiguar quais as suas características intrínsecas anteriores ao processo de fermentação. Esses ensaios foram, respetivamente, a determinação dos Sólidos Solúveis Totais (SST), teor proteico, concentração de açúcares redutores (AR), acidez titulável (AT) e medição de pH. Numa tentativa de aproximar a caracterização ao que já foi feito, o teor de sólidos solúveis totais foi determinado de acordo com o método OIV-MA-AS2-02, utilizando um refratómetro digital HI 96801 (Hanna Instruments, Itália); o teor proteico foi quantificado de acordo com o protocolo 33 B para microplacas do Kit Coomassie (Bradford) Protein Assay (Thermo Fischer ScientificTM, Estados Unidos da América), onde foi concebida uma curva de calibração segundo as recomendações nele incluídas e cuja equação se encontra representada na Equação 6, com o respetivo coeficiente de correlação de valor 0,9799. 𝑇𝑃 (mg/L)−1 =𝐴𝑏𝑠595𝑛𝑚−0,0017 0,0184 Equação 6 A determinação da concentração em açúcares redutores foi feita empregando o método do DNS, sendo que, para tal, foi construída uma curva de calibração utilizando glucose em concentrações de 1,2 g/L a 120 g/L e cuja equação se encontra descrita na Equação 7 com um coeficiente de correlação de 0,9961. 𝐴𝑅 (g/L)−1 =𝐴𝑏𝑠540𝑛𝑚−0,02997 0,35631 Equação 7 Para o cálculo da acidez total, expressa em gramas de ácido tartárico, utilizou-se o método OIV-MA-AS313-01. Foi então usada uma solução indicadora de azul de bromotimol – obtido através da dissolução de 10 mg de azul de bromotimol em 10 mL de etanol 96 %, sendo esta mistura adicionada a 10 mL de água destilada – e uma solução aquosa de NaOH, com uma concentração de 0,1 mol/L, para a titulação utilizando amostras de mosto. A equação seguinte representa a relação entre o volume titulado da solução de NaOH registado aquando a obtenção da coloração azul-verde e a correspondente acidez total do mosto. 𝐴𝑇 (g/L)−1 =𝑉𝑁𝑎𝑂𝐻 mL ×10 × 0,075 Equação 8 Por último, foi medido o pH através de um potenciómetro digital equipado com elétrodo de vidro (HI 2210, Hanna Instruments, Itália) calibrado com soluções padrão de pH 4, pH 7 e pH 9. 3.4. Fermentação do Mosto de Vinho Verde Numa tentativa de microvinificação do mosto de vinho, foi primeiro preparado um inóculo de levedura fermentativa. Foram adicionados 100 mL de uma solução de glucose e frutose a 100 mL de água a 50 ⁰C, sendo seguidamente diluídos 1 g de mistura de nutrientes (alfa Collection Nutrient Mix)– tanto para a solução como para cada um dos matrazes de mosto – e, por fim, 34 adicionados 10 g de levedura desidratada (alfa Collection KB12). O inóculo foi deixado em repouso durante 30 min de modo a reativar a levedura, removendo 1 mL para fazer a contagem do número de células na câmara de Newbauer – explicado no ponto 3.1 – de modo a prever a concentração inicial de células ativas que se inocula em cada matraz de mosto, sendo que, por último, foi adicionado 10 mL do inóculo em cada matraz de 1 L de mosto. No que toca ao seguimento da fermentação para matrazes com 1 L de mosto, foram utilizadas cinco abordagens diferentes de maneira a conseguir uma maior aproximação à realidade. Estas foram então a medição do pH e temperatura – utilizando uma metodologia semelhante à usada para a caracterização do mosto, no ponto 3.3 – seguida de uma pesagem do matraz, havendo este sido pesado vazio previamente ao enchimento com mosto de modo a se obter apenas o peso do mosto. Também foi determinada a concentração de açúcares redutores, utilizando o mesmo método descrito no ponto 3.3, foi medida a absorvância num espetro de 400 nm a 600 nm, com um intervalo de 10 nm, de uma amostra de 200 µL do mosto para análise de cor, e foi ainda medida a densidade com a ajuda de um densímetro – verteu-se 250 mL de mosto para uma proveta graduada, mergulhou-se o densímetro até à base da proveta – registando a medição do valor após estabilização. Para o registo da temperatura do mosto utilizou-se um termómetro digital tipo vareta. 35 4. Resultados e Discussão 4.1. Avaliação Preliminar Em Levedura Isolada – Protocolo I De acordo com o Protocolo I, foram realizados tratamentos a 40 ⁰C com campo elétrico de 400 V/cm de maneira a testar os efeitos do tratamento óhmico num inóculo de levedura PYCC 4801. A Figura 3 ilustra a variação da concentração celular em função do tempo total de tratamento, sendo que a aplicação do campo elétrico foi realizada por pulsos de forma a minimizar o efeito da temperatura e aumentar o tempo útil de exposição ao campo elétrico, que neste caso foi de 20 min; o restante tempo deve-se aos ciclos de refrigeração (ver Figura 4.B). Analisando o gráfico da Figura 4.A, vê-se um aumento da condutividade elétrica até ao ∙ 30, juntamente com um declínio da concentração celular aos 10 min e 20 min, sendo que aos 30 min ocorre um aumento da concentração celular, seguida de outro declínio. Seria de esperar que ocorresse uma diminuição da concentração celular ao longo do tempo de tratamento, juntamente com um aumento da condutividade elétrica. O máximo de concentração celular que se verifica aos 30 min poderia ter sido provocado por uma contaminação do inóculo, contudo não se verifica tal acontecimento em placa. Também poderá ter sido devido a uma má homogeneização do inóculo, resultando numa concentração celular desproporcionada ao verdadeiro comportamento do inóculo. O aumento da condutividade elétrica pode dar a indicação de perda da integridade celular da levedura, promovendo assim a migração de compostos para a solução, à imagem do que acontece quando ocorre eloporação. Figura 3 Variação da concentração celular para amostras do inóculo de PYCC 4801 retiradas dos 0 min aos 60 min. 0,00E+00 5,00E+05 1,00E+06 1,50E+06 2,00E+06 2,50E+06 3,00E+06 3,50E+06 4,00E+06 4,50E+06 0 1000 2000 3000 CM/UFC∙mL-1 t/s 36 Figura 4 Variação da condutividade elétrica (A) e temperatura (B) para amostras do inóculo de PYCC 4801 retiradas dos 0 min aos 60 min. De modo a tentar um melhor entendimento dos resultos preliminares obtidos, fez-se uma tentativa de repetir o ensaio para eliminar possíveis erros experimentais. A variação da concentração celular e condutividade elétrica ao longo do tempo encontram-se representadas na Figura 5. Através dos gráficos da Figura 5 é possível ver a mesma tendência para a condutividade elétrica comparativamente ao ensaio anterior, sendo que neste ensaio o máximo de condutividade foi atingido aos 20 min, seguido de um novo declínio, como no caso anterior. Já a concentração celular sofreu um decréscimo significativo aos 1800 s de processamento, verificando-se igualmente um aumento da concentração celular nos tempos de tratamento seguintes. Ainda, com 1,00E-05 1,10E-05 1,20E-05 1,30E-05 1,40E-05 1,50E-05 1,60E-05 1,70E-05 0 1000 2000 3000 σ/S∙cm-1 t/s A 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 050 100 150 T/⁰C t/s A B 37 60 min de tratamento, foi verificada uma redução de cerca de 80 % da concentração inicial do inóculo. Concluiu-se então que apesar de alguns resultados promissores e redução inicial da concentração celular, os tempos de longos de tratamento e ciclos de refrigeração podem ter afetado a estabilidade da levedura durante o tratamento e assim a reprodutibilidade dos resultados. Figura 5 Variação da concentração célula (A) e condutividade elétrica (B) para amostras do inóculo de PYCC 4801 retiradas dos 0 min aos 60 min de tratamento. 0,00E+00 1,00E+05 2,00E+05 3,00E+05 4,00E+05 5,00E+05 6,00E+05 7,00E+05 8,00E+05 9,00E+05 1,00E+06 0 1000 2000 3000 CM/UFC∙mL-1 t/s 2,50E-05 2,60E-05 2,70E-05 2,80E-05 2,90E-05 3,00E-05 3,10E-05 0 1000 2000 3000 σ/S∙cm-1 t/s A B 38 Figura 6 Variação da temperatura para amostras do inóculo de PYCC 4801 retiradas dos 0 min aos 60 min de tratamento. 4.2. Avaliação Preliminar em Levedura Isolada – Protocolo II Um segundo protocolo de tratamentos de inativação da levedura surgiu com o objetivo de reduzir o tempo de processamento e avaliar potenciais efeitos elétricos. Os resultados dum primeiro ensaio encontram-se descritos no Anexo II, uma vez que a condutividade inicial do inóculo revelou ser demasiado baixa (< 2 µS/cm), fazendo com que a intensidade da corrente que atravessava o inóculo fosse residual. Após esse primeiro ensaio, foi então novamente testado o segundo protocolo proposto, sendo que desta vez foi fixada a voltagem mais alta de 600 V, numa tentativa de criar efeitos de inativação na levedura, fazendo variar a temperatura de tratamento entre 40 ⁰C, 75 ⁰C e 90 ⁰C. Como se pode ver, através das figuras 7, 8 e 9 os ensaios foram bastante influenciados pela condutividade inicial do inóculo. Por um outro lado, foi necessário diluir alguns dos inóculos correspondentes aos tratamentos a 40 ⁰C e 75 ⁰C através da adição de água ultrapura, uma vez que a sua condutividade inicial era bastante alta e dificultava o controlo da temperatura. Através da análise da concentração celular dos inóculos, pode-se observar que, de uma forma geral, todos os tratamentos promoveram a inativação da levedura independentemente da temperatura utilizada, exceto nos casos em que a condutividade era demasiado baixa, o que não 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 2000 4000 6000 8000 T/⁰C t/s 39 Figura 7 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) das amostras submetidas a ensaios com tempo de tratamento de 20 min, a um campo elétrico de 600 V/cm e temperatura de tratamento de 40 ⁰C (A), 75 ⁰C (B) e 90 ⁰C (C). 0 0,000005 0,00001 0,000015 0,00002 0,000025 0,00003 0,000035 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0500 1000 1500 2000 2500 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,00E+00 1,00E-05 2,00E-05 3,00E-05 4,00E-05 5,00E-05 6,00E-05 7,00E-05 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0500 1000 1500 2000 2500 3000 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,00E+00 5,00E-06 1,00E-05 1,50E-05 2,00E-05 2,50E-05 3,00E-05 3,50E-05 0 20 40 60 80 100 120 0500 1000 1500 2000 2500 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B B C 40 permitiu a passagem de corrente elétrica e aumento da temperatura – que é o caso de OBZ2 e OBZ3 (ver Figuras 43 e 44 presentes no Anexo II). Estes resultados evidenciam os efeitos elétricos da tecnologia na inativação deste tipo de leveduras, sendo que campos elétricos de 600 V/cm com temperaturas máximas de 40 ºC serão suficientes para reduzir a carga microbiológica inicial. Neste caso foi possível reduzir cerca de 7 log. Nos restantes ensaios, devido à baixa condutividade de alguns inóculos, não foi possível a aplicação efetiva do campo elétrico, o que determinou algum crescimento confirmado em placa (Figuras 9 e 10). É ainda de salientar que se verificou a ocorrência de algum crescimento celular nas amostras tratadas a 90 ⁰C e 600 V/cm quando se apenas se atingiram os 10 dias de crescimento em placa, para valores de 2,77∙106 UFC/mL. Tal acontecimento pode ser indicativo de que os tratamentos de alguma forma afetam o desenvolvimento destas leveduras. Figura 8 Temperatura média das amostras submetidas a tratamento óhmico (os números que se seguem à identificação das letras referem-se aos triplicados). De maneira a aferir definitivamente o papel do campo elétrico na inativação celular da levedura e concluir qual o papel da componente elétrica e da componente térmica, foram testados inóculos de levedura – preparados como anteriormente – sendo três deles submetidos a um tratamento só usando temperatura (40 ⁰C, por 20 min) enquanto que outros três inóculos eram submetidos a tratamento com campo elétrico de 600 V/cm. Nos tratamentos em que foi conseguida a passagem de corrente elétrica e a subida de temperatura até à temperatura pretendida foi possível verificar a inativação total dos microrganismos neles presentes; no entanto, a condutividade elétrica de alguns stocks de levedura 25,5368 27,0017 26,8808 34,2482 12,5252 20,0001 35,6654 39,6582 43,4369 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 T/⁰C OAZ1 OAZ2 OAZ3 OBZ1 OBZ2 OBZ3 OCZ1 OCZ2 OCZ3 41 Figura 9 Concentração celular em média no final de cada ensaio de tratamento óhmico. Os caracteres a, b, c e d representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos. Figura 10 Imagem captada após um período de cinco dias de crescimento em placa das amostras de controlo e das amostras submetidas a tratamento óhmico. impossibilitou a passagem de corrente elétrica e, consequentemente, efeitos de inativação – pelo que a temperatura média de tratamento, por esse motivo, foi igualmente baixa, justificando algum crescimento celular (ver Figuras 13 e 14). Neste conjunto de ensaios verificaram-se contaminações de outras espécies microbianas, sendo que as UFC’s de D. bruxellensis se apresentavam de maiores dimensões em relação a outras espécies microbianas contaminantes. Esta contaminação não ocorreu durante os ensaios uma vez que algumas placas do controlo já continham as mesmas 6,30E+07 7,27E+06 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 Controlo OAZ OBZ OCZ CM/UFC∙mL-1 Controlo OBZ OCZ OAZ a 0,00E+00b c 0,00E+00d 48 Figura 18 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) para dois dos ensaios a 600 V/cm e uma temperatura máxima de 40 ⁰C, por um tempo de tratamento de 20 min, utilizando o inóculo lavado (A) e inóculo não-lavado (B). 0 0,000005 0,00001 0,000015 0,00002 0,000025 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 01000 2000 3000 4000 5000 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,00E+00 2,00E-04 4,00E-04 6,00E-04 8,00E-04 1,00E-03 1,20E-03 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0200 400 600 800 1000 1200 1400 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B 49 Figura 19 Temperaturas médias de tratamento aquando testado o aquecimento óhmico, incluindo os inóculos tratados sem lavagem prévia do meio (NL). Figura 20 Concentração celular dos inóculos de controlo lavado e não-lavado (NL), para os inóculos que sofreram apenas tratamento por aumento da temperatura e para os inóculos submetidos a aquecimento óhmico lavados e não-lavados. Os caracteres a, b, A e B representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos. 26,4402 29,5495 24,5 25 25,5 26 26,5 27 27,5 28 28,5 29 29,5 30 OAZ OAX,NL T/⁰C 1,27E+06 1,56E+07 8,89E+05 3,00E+07 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 Controlo CA OAZ Controlo,NL OAX,NL CM/UFC∙mL-1 a a b A 0,00E+00B 50 Figura 21 Imagem captada após um período de cinco dias de crescimento em placa. De maneira a aferir acerca do efeito de inativação do tratamento óhmico, e consequentemente o papel do campo elétrico, empregando uma voltagem inferior e uma voltagem superior aquando comparado com o método tradicional de inativação, foi executado o protocolo em que foram testadas três temperaturas diferentes – 40⁰ C, 75⁰ C e 90⁰ C – com campo elétrico de 400 V/cm e 90 V/cm, com a adição de um tratamento sem a aplicação de campo elétrico (tratamento térmico). Analisando as Figuras 24 e 25 é possível verificar que o tratamento de maior temperatura, quer na presença de campo elétrico, quer na ausência de campo elétrico, determinou a inativação total das células do inóculo – devido presumivelmente a efeitos térmicos. Nesse sentido, o aquecimento óhmico poderá ser uma alternativa interessante no processo de pasteurização de Vinho Verde, tendo em conta a sua rapidez de processo e menor degradação térmica da qualidade associada. Já para os tratamentos a uma temperatura inferior (40 ⁰C), obteve-se o mesmo nível de inativação apenas quando o campo elétrico foi maior (400 V/cm), sendo que nos restantes casos a concentração celular sofreu um aumento em relação ao controlo. Deste modo, é possível confirmar que campos elétricos de 400 V/cm com temperaturas máximas de 40 ⁰C em tratamentos de 20 min serão suficientes para promover a inativação da levedura-alvo. Neste caso a inativação foi de pelo menos 6 log, o que permite provar o conceito de inativação nãotérmica e fornecer uma boa margem de segurança do processo. Controlo CA OAZ OAZ,NL Controlo,NL 51 Contagens realizadas em câmara de Neubauer puderam aferir acerca da morfologia e quantidade de células vivas e mortas. Os dados resultantes dessas contagens encontram-se presentes no Anexo II. Figura 22 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) para alguns dos ensaios de tratamento do inóculo de levedura não-lavado a 400 V/cm, temperatura máxima de 40 ⁰C (A) e 75 ⁰C (B), durante um intervalo de tempo de 20 min. Numa tentativa de convergir os resultados obtidos e de se fazer um estudo de prateleira de maneira a estudar a durabilidade do efeito de inativação, realizou- -se um novo ensaio utilizando o protocolo anterior. Os dados acerca da variação da temperatura e condutividade elétrica para este ensaio encontram-se expostos no Anexo II. Analisando o gráfico da Figura 28, pode-se confirmar os mesmos resultados iniciais após os tratamentos de inativação, ou seja, que as temperaturas de tratamento de 75 ⁰C inativam eficazmente a levedura – possivelmente devido a efeitos térmicos – e que há apenas crescimento celular nos tratamentos a 40 ⁰C quando se teve ausência de campos elétricos ou quando os 0,000E+00 1,000E-04 2,000E-04 3,000E-04 4,000E-04 5,000E-04 6,000E-04 7,000E-04 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0500 1000 1500 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,000E+00 1,000E-04 2,000E-04 3,000E-04 4,000E-04 5,000E-04 6,000E-04 7,000E-04 8,000E-04 9,000E-04 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0500 1000 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B 52 Figura 23 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) para alguns dos ensaios de tratamento de inóculo de levedura não-lavado a 45 V/cm, temperatura máxima de 40 ⁰C (A) e 75 ⁰C (B), durante um intervalo de tempo de 20 min. campos elétricos foram menores (90 V/cm), sendo que, para a temperatura de 40 ⁰C e campo elétrico de 400 V/cm não houve crescimento celular logo após o tratamento. Estes resultados demonstram que a intensidade de campo elétrico é um fator importante na inativação celular. Durante o tempo de armazenamento verificou-se uma redução da concentração celular do controlo em relação a t = 0 h, o que pode indicar que as células de levedura não estariam a sobreviver nas condições a que foram colocadas, sobretudo devido à ausência de nutrientes no meio. É de registar que nas amostras mais promissoras que foram submetidas a tratamento elétrico (como a OAX e OBX) não se verificaram grandes alterações no padrão de crescimento ao longo do estudo de tempo de prateleira relativamente às restantes. 0,000E+00 1,000E-04 2,000E-04 3,000E-04 4,000E-04 5,000E-04 6,000E-04 7,000E-04 8,000E-04 9,000E-04 1,000E-03 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,000E+00 2,000E-04 4,000E-04 6,000E-04 8,000E-04 1,000E-03 1,200E-03 1,400E-03 0 10 20 30 40 50 60 70 80 0200 400 600 800 1000 1200 1400 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B 53 Figura 24 Temperaturas médias de tratamento aquando testado o aquecimento óhmico; os números que se seguem à identificação das letras referem-se a cada uma das réplicas. Figura 25 Concentração celular dos inóculos de controlo, para os inóculos que sofreram apenas tratamento por aumento da temperatura e para os inóculos submetidos a aquecimento óhmico. Os caracteres a e b representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos. 26,4967 27,9017 26,5393 35,4060 0 5 10 15 20 25 30 35 40 OAX OBX OAV OBV T/⁰C 4,63E+075,01E+07 6,72E+07 1,00E+00 1,00E+01 1,00E+02 1,00E+03 1,00E+04 1,00E+05 1,00E+06 1,00E+07 1,00E+08 Control o CA CB OAX OBX OAV OBV CM/UFC∙mL-1 a a a 0,00E+00b 0,00E+00b 0,00E+00b 0,00E+00b 54 Figura 26 Imagem captada após um período de sete dias de crescimento em placa. Apenas se observa uma alteração de tendência no crescimento celular em t = 864 h, onde houve crescimento celular em todas as placas – tendo este sido menor para o tratamento convencional – e para t = 936 h, onde houve contaminação de várias placas. Figura 27 Temperaturas médias de tratamento aquando testado o aquecimento óhmico. 25,0677 38,7730 24,8313 48,0733 0 10 20 30 40 50 60 OAX OBX OAW OBW T/⁰C Controlo CA CB OAW OBW OAX OBX 55 Figura 28 Variação da concentração celular ao longo do tempo para todas as amostras testadas em tratamento óhmico e pelo método convencional, e ainda o controlo. 4.5. Caracterização Fisico-Química do Mosto de Vinho Para a caracterização microbiológica do mosto do vinho com o objetivo de uma posterior fermentação, usou-se mosto de vinho da casta Fernão Pires – sendo que os mostos 1 e 2 foram amostras de mosto recolhidas de um lote de mosto de uvas feito em 2019 e o mosto 3 e 4 foram amostras de mosto recolhidas de um lote distinto de mosto de uvas também produzido em 2019. No que se refere aos tratamentos óhmicos do mosto, os gráficos referentes à variação da condutividade elétrica e temperatura encontram-se expostos no Anexo II (Figuras 61 e 62). É de mencionar os seus menores valores de condutividade elétrica, causados pelo diferente distanciamento e dimensões dos elétrodos por necessidade de utilizar um reator de maiores dimensões onde fosse possível tratar um maior volume em cada ensaio. A maior distância dos elétrodos poderá ter gerado uma corrente elétrica menor a passar pelo meio, diminuindo o valor do campo elétrico em relação aos outros ensaios e possivelmente causando menor efeito de inativação. Analisando a Figura 29, as amostras tiveram alguma variabilidade em termos de cor e quantidade de material depositado para os mostos não-tratados, no entanto, essa variabilidade não se verificou nas restantes análises físico-químicas. Apenas foram visíveis a olho nu a distinção 0,00E+00 5,00E+05 1,00E+06 1,50E+06 2,00E+06 2,50E+06 3,00E+06 3,50E+06 4,00E+06 4,50E+06 5,00E+06 0200 400 600 800 1000 CM/UFC∙mL-1 t (h) Controlo CA CB OAX OAW OBW OBX 56 Figura 29 Análise visual da variabilidade das amostras de mosto corresponde ao mosto 1, 2 e 3 tratados e não-tratados entre amostras com mosto com maior depósito, obtendo estas tonalidades mais acastanhadas e escuras em relação ao outro caso. Já no mosto 2 e 3 tratado, foi visível uma alteração da cor de um amarelo claro para âmbar, sem a existência de depósitos de partículas sólidas – tendo estas possivelmente ressuspendido por efeitos do tratamento. Nas tabelas 3 e 4 estão presentes os valores obtidos para os diferentes parâmetro físicoquímicos estudados. Pode-se observar que não houve uma variabilidade acentuada nos valores dos parâmetros estudados para os mostos não-tratados pertencentes à mesma casta, com a exceção do teor proteico do mosto 1. Já o aquecimento óhmico também não teve nenhum efeito aparente nos parâmetros dos mostos – apenas para o teor proteico se verifica um aumento do valor para o mosto 2 e uma diminuição para o mosto 3. Uma vez que não houve reprodutibilidade na análise em relação ao teor proteico, não foi possível aferir se o tratamento óhmico tem influência sobre o mosto nesse parâmetro. Por fim, a concentração de açúcares redutores encontra-se exposta no Anexo II. Mosto 2 Mosto 1 Mosto 3 Não-Tratado Mosto 3 Tratado 57 Figura 30 Aspeto visual do mosto 2 tratado (à direita) e não-tratado (à esquerda) logo após o tratamento óhmico. Tabela 3. Teor proteico dos vários mostos testados quantificado pelo método Coomassie – os caracteres a, b, c e d representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos Teor Proteico (mg/L) Mosto 1 15,6343a ± 0,7135 Mosto 2 9,9547b ± 1,3973 Mosto 2 OH 14,9005a ± 0,2736 Mosto 3 9,2119c ± 0,5334 Mosto 3 OH 6,1501d ± 0,3805 Tabela 4. Valores de pH, Acidez total expressa em gramas de ácido tartárico e concentração de sólidos solúveis totais para os vários mostos – os caracteres a, b e c representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos AT (g/L) pH SST (⁰Brix) Mosto 1 4,9250a ± 0,1561 2,9833a ± 0,0404 17,0000a ± 0,3464 Mosto 2 4,5250a ± 0,1561 3,0000a ± 0,0700 18,2333b ± 0,0577 Mosto 2 OH 5,6250b ± 0,3000 2,9933a ± 0,0152 18,1333b ± 0,1528 Mosto 3 6,3750c ± 0,1984 3,0900a ± 0,0100 17,5667c ± 0,0577 Mosto 3 OH 7,0000c ± 0,3382 2,9400b ± 0,0265 17,1000c ± 0,1000 64 das 60 h de fermentação. Isto pode dever-se a uma má homogeneização do meio anterior à medição. Em todo o caso, em trabalhos futuros será um parâmetro a averiguar. Já a temperatura sofreu oscilações pequenas, permanecendo numa gama de 21 ⁰C a 24 ⁰C, mas foi possível assistir à sua diminuição, mais claramente a partir das 50 h de fermentação. A temperatura inicial de 17 ⁰C do mosto 4 não-tratado deve-se pelo facto de este mosto ter iniciado a fermentação pouco tempo depois de ter sido retirado da refrigeração, não tendo tempo para atingir a temperatura ambiente. No entanto, os restantes parâmetros encontram-se de acordo com o esperado e de acordo com o comportamento dos restantes mostos, provando que este não terá atrasado – nem foi um fator de peso – durante o início ou no decorrer da fermentação. Pode-se considerar, com os dados expostos nesta secção, que o tratamento óhmico não tem nenhum efeito notório em comparação à fermentação de mosto que não sofreu nenhum tratamento prévio, de modo que a aplicação deste na produção de vinho deverá ser impercetível no que diz respeito aos parâmetros estudados neste trabalho. 65 Figura 36 Variação do peso dos mostos (A) e da densidade (B) ao longo do tempo de fermentação em mosto tratado e não-tratado no decorrer de duas microvinificações distintas. 0,6 0,65 0,7 0,75 0,8 0,85 0,9 0,95 1 1,05 1,1 020 40 60 80 100 m/kg t/h Mosto 3 Mosto 3 OH Mosto 4 Mosto 4 OH 980 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 1060 1070 020 40 60 80 100 densidade/% Brix t/h Mosto 3 Mosto 3 OH Mosto 4 OH Mosto 4 B A 66 Figura 37 Variação do pH (B) dos mostos ao longo do tempo de fermentação em mosto trastado e não-tratado no decorrer de duas microvinificações distintas. Figura 38 Variação da temperatura ao longo do tempo de fermentação em mosto tratado e nãotratado no decorrer de duas microvinificações distintas. 2,4 2,5 2,6 2,7 2,8 2,9 3 3,1 3,2 3,3 020 40 60 80 100 pH t/h Mosto 3 Mosto 3 OH Mosto 4 OH Mosto 4 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 020 40 60 80 100 T/⁰C t/h Mosto 3 Mosto 3 OH Mosto 4 Mosto 4 OH 67 Figura 39 Análise visual dos mostos submetidos a tratamento óhmico e não submetidos a tratamento óhmico. Mosto 3 no Início da Fermentação Mosto 4 no Início da Fermentação Mosto 3 no Final da Fermentação Mosto 4 no Final da Fermentação Mosto tratado Mosto tratado Mosto tratado Mosto tratado Mosto não-tratado Mosto não-tratado Mosto não-tratado Mosto não-tratado 68 5.1 Conclusões No estudo das condições de inativação ótimas da estirpe de levedura Dekkera bruxellensis PYCC 4801, foi possível constatar o impacto da componente elétrica na respetiva inativação. Tratamentos a temperaturas em que o efeito de inativação térmico era isolado – 40 ⁰C – com ausência de campos elétricos ou presença de campos elétricos baixos – menor do que 100 V/cm– foi verificado que o efeito de inativação era nulo ou bastante inferior ao visualizado nos ensaios em que se utilizaram campos elétricos moderados – a partir de 400 V/cm. Tal acontecimento foi continuamente confirmado ao longo dos ensaios sendo possível concluir que a presença de campos elétricos moderados provocaram efeitos de inativação distintos sobre o inóculo de levedura isolada. Foi verificado também que a inativação da levedura foi possível através de tratamentos de 20 min, com temperaturas máximas de tratamento de 40 ⁰C (temperaturas médias de tratamento aproximadamente superiores a 30 ºC) e campos elétricos de 400 V/cm. Esta inativação revelou-se total em alguns casos (> 5 log) ou parcial (< 1 log), dependendo da condutividade elétrica das soluções tratadas. O tratamento poderá, então, ser aplicado durante o armazenamento do mosto sempre que se justificar de forma a controlar o desenvolvimento de leveduras não desejadas ou utilizado em sinergia com a adição de SO2 em quantidades significativamente menores do que as utilizadas convencionalmente. Na caracterização físico-química dos mostos, não foi observada uma variabilidade acentuada dos parâmetros estudados. Também, na caracterização microbiológica dos mostos, verificou-se a maior presença das espécies Hanseniaspora uvarum , Schizosaccharomyces pombe, de espécies de fungos filamentosos e de uma espécie desconhecida de coloração verde intenso . Apurou-se ainda que o Aquecimento Óhmico tem efeitos na inativação das espécies presentes em maiores concentrações nas amostras de mosto não-tratado, com a exceção das espécies de fungos filamentosos, uma vez que estes poderão ter tido a oportunidade de se proliferarem devido à redução da competitividade. Já na fermentação, a realização de tratamento óhmico não alterou as propriedades físico-químicas do mosto, nem inibiu o desenvolvimento normal da etapa de fermentação. 69 5.2. Principais Recomendações e Trabalho Futuro Para estudos futuros, recomenda-se o uso de diferentes meios de caracterização microbiológica de forma a complementar a caracterização realizada das espécies de leveduras e bactérias, bem como averiguar qual a sua percentagem relativa quer para mosto tratado, como para mosto não-tratado, de modo a aprofundar o estudo da sensibilidade das espécies microbianas ao tratamento. Seria aconselhada a análise do efeito de inativação do mosto (e sucessivo estudo de tempo de prateleira) utilizando um sistema que melhor reproduza as condições e valores de campo elétrico reportadas para que o aumento de escala do processo garanta o mesmo efeito de inativação observado à escala laboratorial. Também seria necessário a construção de curvas de morte térmica utilizando as condições ótimas manifestadas neste trabalho, calculando os valores D e z para tratamentos térmicos dentro dos intervalos usados nos processos de remoção do SO2 de modo a obter-se um estudo e melhor compreensão da cinética de morte da levedura-alvo e consequente alteração das propriedades do mosto. Outro fator de investigação pode residir numa maior elucidação do vetor de inativação, se este se deve à intensidade do campo elétrico, densidade da corrente elétrica ou frequência elétrica. Para isso se necessária uma maior avaliação do papel da condutividade elétrica na eficácia dos tratamentos. De modo a averiguar as vantagens do tratamento óhmico em mosto de vinho, seria recomendado o seguimento e comparação de mosto tratado por este mesmo tratamento, a mosto tratado pelo método convencional, e ainda mosto submetido a sulfitação, assim como um estudo das suas propriedades físico-químicas e caracterização microbiológica. De modo a avaliar a implementação da tecnologia em todos os produtos da empresa, é recomendado que a mesma abordagem de tratamento possa ser aplicada para o Vinho Verde tinto. E ainda, com a tentativa de eliminar o processo de sulfitagem por completo do processo produtivo de Vinho Verde, recomenda-se a aplicação da tecnologia após a fermentação, com estudo dos efeitos de inativação da levedura fermentativa e possível impacte nas características físicas e químicas do vinho. 70 Bibliografia Anli, E., Ozturk, B. (2017). Pulsed electric fields (PEF) applications on wine production: A review. BIO Web of Conferences 9, 02008. 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Apesar de o meio permitir, a passagem de corrente em alguns momentos foi residual, sendo que a reduzida dissipação de calor não permitiu o aumento da temperatura do inóculo. Como é possível ver através da Figura 42, as temperaturas médias de tratamento não atingiram os 20 ⁰C. Apesar das baixas temperaturas de tratamento, é possível observar uma redução do número de células, com a exceção do tratamento a 400 V/cm e 40 ⁰C, em que pontualmente não se verificou efeito de inativação suficiente para que houvesse redução do número de células viáveis, com valores de concentração de aproximadamente 3,6∙106 UFC/mL – o que justifica o erro padrão elevado. É possível, no entanto, observar mais claramente a redução de 1 log com o aumento do campo elétrico para 600 V/cm, embora tenham sido detetadas algumas contaminações pontuais de uma outra espécie microbiana em várias placas, que poderão ter influenciado o número de UFC’s de Dekkera bruxellensis . O conjunto destes resultados confirma 80 Figura 50 Imagem capturada de uma célula morta de OAZ,NL (A) e uma célula viva de Controlo,NL (B). No ensaio relativo às Figuras 49 e 50, havia a presença de um elevado número de aglomerados de células, tendo havido a dificuldade em conseguir a separação dessas células de maneira a poderem ser feitas as respetivas contagens. Também se observou a presença de células com hifas, onde se optou por não fazer a sua contagem uma vez que não se deveriam tratar da D. bruxellensis . Não foram visíveis também alterações notórias na morfologia das células entre os inóculos tratados, havendo observado uma diferença de tamanhos entre as células do controlo e as células tratadas por tratamento óhmico – apresentando-se estas maiores que as últimas. Figura 51 Percentagem de células mortas das amostras de mosto lavado e não-lavado submetidas a tratamento convencional a 40 ⁰C e a tratamento óhmico à mesma temperatura. As figuras 51, 52 e 53 representam a contagem de células feitas por microscopia em câmara de Neubauer de um ensaio realizado seguindo o Protocolo IV. Em comparação à Figura 25, os efeitos de inativação não apresentam ser tão aparentes, ainda assim é igualmente visível uma maior presença de células vivas nos ensaios de tratamento convencional, e uma menor 62,7928 56,5529 53,2368 63,4345 69,7581 92,1782 88,7831 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Controlo CA CB OAV OBV OAX OBX Percentagem de células mortas/% A B 81 presença de células vivas nos tratamentos a campos elétricos de 400 V/cm e 40 ⁰C. No que toca à morfologia, as células de controlo apresentavam-se de maiores dimensões do que as restantes, enquanto que as células submetidas a tratamento convencional apresentavam uma morfologia alongada em comparação aos outros ensaios. Figura 52 Imagem capturada de uma célula viva de controlo (A) e células mortas de CA (B) e OAV (C), em câmara de Neubauer. Figura 53 Imagem capturada em câmara de Neubauer de células mortas de OAX (A) e OBX (B) sem ter sido usada qualquer diluição das amostras. As figuras 54, 55 e 56 representam a análise da morfologia das células feitas em câmara de Neubauer. Foi, em termos de contagens verificado uma percentagem de células mortas menor para CA, bem como uma maior percentagem de células mortas para OAX e OBX – tais factos convergem com o que se foi observado em placa. Já a morfologia das células de controlo apresentaram ter maiores dimensões nas amostras de controlo comparativamente às restantes, sendo estas também mais redondas do que as células submetidas a condições em que houve efeitos da temperatura (apresentando-se estas mais alongadas). A B C A B 82 Figura 54 Percentagem de células mortas das amostras de mosto lavado e não-lavado submetidas a tratamento convencional a 40 ⁰C e a tratamento óhmico à mesma temperatura. Figura 55 Imagem capturada em câmara de Neubauer de uma célula viva do Controlo (A) e células mortas de CA (B), CB (C), OAW (D) e OBW (E). Figura 56 Imagem capturada em câmara de Neubauer de células mortas de OAX (A) e OBX (B). A título expositivo, seguem-se alguns dos gráficos da variação da temperatura e condutividade elétrica referentes ao ensaio que seguiu as premissas do Protocolo IV, o qual também foi seguido de um estudo do tempo de prateleira dos inóculos tratados e não-tratado. 49,2511 42,7193 56,5398 64,0825 64,1270 79,7300 86,8519 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Controlo CA CB OAV OBW OAX OBX Percentagem de células mortas/% A B C D E A B 83 Figura 57 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) para um tratamento de inóculo de levedura não-lavado com campo elétrico de 400 V/cm e uma temperatura máxima de 40 ⁰C durante um intervalo de tempo de 20 min. Figura 58 Variação da temperatura (azul) e condutividade elétrica (laranja) para um tratamento de inóculo de levedura não-lavado com campo elétrico de 400 V/cm e uma temperatura máxima de 75 ⁰C durante um intervalo de tempo de 20 min. 0,000E+00 5,000E-03 1,000E-02 1,500E-02 2,000E-02 2,500E-02 3,000E-02 3,500E-02 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0200 400 600 800 1000 1200 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,000E+00 5,000E-03 1,000E-02 1,500E-02 2,000E-02 2,500E-02 3,000E-02 3,500E-02 4,000E-02 4,500E-02 5,000E-02 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0200 400 600 800 1000 1200 1400 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 84 Figura 59 Variação da temperatura para um tratamento de inóculo de levedura não-lavado com campo elétrico de 90 V/cm, temperatura máxima de 40 ⁰C durante um intervalo de tempo de 20 min. Figura 60 Variação da temperatura para um tratamento de inóculo de levedura não-lavado com campo elétrico de 90 V/cm, temperatura máxima de 75 ⁰C durante um intervalo de tempo de 20 min. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0200 400 600 800 1000 1200 1400 T/⁰C t/s 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0200 400 600 800 1000 1200 T/⁰C t/s 85 Tratamento em Mosto – Protocolo IV De modo a fazerem-se as caracterizações físico-químicas e microbiológicas do mosto, juntamente com a posterior microvinificação, foram feitos ensaios em mosto de vinho. Nas Figuras 61 e 62 estão expostas as variações de temperatura e condutividade elétrica para cada ensaio. Figura 61 Variação da temperatura e da condutividade elétrica para o tratamento do mosto 1 (A) e mosto 2 (B) a um campo elétrico de 50 V/cm e temperatura máxima de 40 ⁰C. 0,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02 3,00E-02 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0500 1000 1500 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B 86 Figura 62 Variação da temperatura e da condutividade elétrica para o mosto 3 (A) e mosto 4 (B) com um campo elétrico de 75 V/cm e temperatura máxima de 40 ⁰C. Caracterização Microbiológica dos Mostos Tabela 6. Concentração de açúcares redutores dos vários mostos (quantificada pelo método DNS) sujeitos, ou não, a tratamento óhmico – os caracteres a e b representam diferencias estatísticas entre os valores obtidos Concentração de açúcares redutores (g/L) Mosto 1 33,8220a ± 0,7451 Mosto 2 32,8173a ± 0,4616 Mosto 2 OH 31,7283a ± 1,7229 Mosto 3 49,2541b ± 3,4975 Mosto 3 OH 47,7435b ± 0,8891 0,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02 3,00E-02 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0200 400 600 800 1000 1200 1400 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s 0,00E+00 5,00E-03 1,00E-02 1,50E-02 2,00E-02 2,50E-02 3,00E-02 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 0500 1000 1500 2000 σ/S∙cm-1 T/⁰C t/s A B 87 A concentração de açúcares redutores do mosto 3 apresenta-se superior tanto para o mosto tratado como para o mosto não-tratado comparativamente aos mostos 1 e 2 (uma vez que os últimos pertencem ao mesmo lote e o mosto 3 pertence a um lote diferente, é plausível os seus conteúdos em açúcares redutores serem distintos). Seguimento da Fermentação Alcoólica No que diz respeito à concentração de açúcares redutores dos mostos durante a fermentação, este valor sofreu um aumento que não seria de esperar para todos os casos, aproximadamente às t = 20 h de fermentação. Seria de esperar que a concentração de açúcares redutores diminuísse com o decorrer da fermentação, uma vez que a levedura fermentativa estaria a metabolizá-los em álcool e dióxido de carbono. No final, assiste-se à redução da concentração de açúcares redutores com os mostos a atingirem o fim da fermentação, onde começa a haver escassez de açúcares, sendo que a concentração de açúcares redutores final neste ensaio rondou os 1,5 mg/mL. Uma possível causa que poderá ter levado aos valores inesperados de açúcares redutores é, com a atividade enzimática da levedura fermentativa, açúcares com estruturas maiores poderão ter sido catalisadas em açúcares redutores (como é o caso da sacarose, que é catalisada em glucose e frutose). E uma vez que o método utilizado para a quantificação dos açúcares apenas quantifica açúcares redutores, há a possibilidade de este tipo de polímeros não ter sido quantificado, mas, não obstante, ter estado presente na matriz inicial – sendo depois decompostos em estruturas menores e quantificáveis pelo método, dando origem ao aumento da concentração destes. É possível ver através da Figura 30 que o mosto tratado apresentava sempre uma tonalidade mais escura em comparação ao mosto não-tratado, sendo que a tonalidade de ambos, com o decorrer da fermentação, foi-se tornando cada vez mais clara até serem praticamente indistinguíveis. Sendo o método de DNS um método colorimétrico, a alteração de tonalidade, assim como a própria clarificação do mosto ao longo da fermentação também pode ter tido influência para o padrão observado. 88 Figura 63 Variação da concentração de açúcares redutores ao longo do tempo de fermentação em mosto tratado e não-tratado no decorrer de duas microvinificações distintas. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 020 40 60 80 100 Concentração de Açúcares Redutores/g∙L-1 t/h Mosto 3 Mosto 3 OH Mosto 4 Mosto 4 OH