ENZYMATISCHE
MODIFIZIERUNG
VON
ENZYMEN
GLUCOAMYLASE
ALS
BEISPIEL
AUS DER
STARKEVERARBEITUNG
G.
Konieczny-Janda
Miles
Kali-Chemie
GmbH
&
Co.
KG
Biochemisches
We k
Hans-Böckle -Allee
20
D
-
3000
Hanno e
1
The
chemical
modi ica ion
o
mic obial
enzymes
has
gained
inc eased
impo ance.
A
con olled
enzyma ic
ea men
o
bioca alys s
can
be
ano he
s ep
owa ds
" aylo -made"
enzymes
o
use
in
ood
indus y.
The
ans o ma ion
o
s a ch
con aining
aw
ma e ials
in
mal ose,
glu-
cose
and
uc ose
a e
es ablished
p ocesses.
Anyhow,
i
will
be
shown
in
his
p esen a ion,
how
a
speci ic
modi ica ion
o
ASPERGILLUS
NIGER-Glucoamylases
can
lead
o
in e es ing
p ope ies
in
he
applica-
ion
o
indus ial
saccha i ica ion.
Du ing
he
la e
s age
o
he
subme se
p oduc ion
o
glucoamylase
om
ASPERGILLUS
NIGER,
a
p o eoly ic
modi ica ion
o
he
enzyme
molecule
happens.
The
o med enzyme
shows
a
sligh ly
di e en
subs a e
speci-
ici y
han
he
o iginal
enzyme.
The
p ope ies
o
he
pu i ied
gluco-
amylase-isoenzymes
a e
demons a ed
by
means
o
deg ada ion
ials
wi h
b anched
and
linea
oligosaccha ides.
Isomal ose
is
o med
as
he
main
p oduc
o
he
e e se
ac ion
om
glucose
as
subs a e
by
bo h
isoenzymes.
Bo h
glucoamylases
a e
able
o
spli
alpha-1-6-glucosidic
bonds
o
mal ooligosaccha ides.
The
p ac ical
impo ance
and
possible
in luences
o
a
ce ain
isoenzyme
a io
o
comme cial
glucoamylases
a e
explained
wi h
compa a i e
saccha i ica ion
ials
using
enzyma i-
cally
lique ied
whea
s a ch
as
subs a e.
144
G.
Konieczny-Janda
Die
indus ielle
Ve zucke ung
on
S ä kehyd olysa en
zu
P oduk ion
on
Dex ose
mi
ASPERGILLUS
NIGER
Glucoamylasen
wi d
sei
ielen
Jah-
en
mi
E olg du chge üh . Eine
kon inuie liche
Wei e en wicklung
diese
Ve zucke ungsenzyme
-
wie
z.
B.
die
En wicklung
T ansglucosi-
dase- eie
Glucoamylasen
-
ha
zu
eine
wesen lichen
Ve besse ung
de
Glucoseausbeu en
ge üh .
Eine
wei e e
Op imie ung
dieses
Enzymsys ens
is
jedoch
nu
übe
eine
genaue
Kenn nis
de
biochemischen
Vo gänge
bei
de
P oduk ion
on
Glucoamylasen,
de
Eigenscha en
de
gebilde en
P o eine
und
de en
anwendungs echnische
Bedeu ung
möglich.
Abe auch
eine
Ände ung
des
Rohs o es
-
ein
Teil
des
nach
Eu opa
zu
impo ie enden
Maises
wi d
du ch
den
heimischen
Rohs o
Weizen
e -
se z
-
üh
du ch
die
no wendig
we dende
Modi izie ung
de
P ozeßbe-
dingungen
zu
ande en
An o de ungen
an
die
e wende en
Enzyme.
De
bekann e
Fo sche
Ueda
[1]
and
1957
in
Japan,
daß
in
Kul u il-
a en
on
ASPERGILLUS
AWAMORI
e schiedene
Fo men
de
Glucoamylase
o kommen.
Inzwischen
is
auch
bei
de
Fe men a ion
ande e
Schimmel-
pilze,
wie
MUCOR
[2],
PENICILLIUM
[3]
und
auch
ASPERGILLUS
NIGER
[4,5]
die
Bildung
meh e e
exogen
wi kende
Glucose-abspal ende
Amylasen
nachgewiesen
wo den.
Eine
Reihe
in e essan e
Un e schiede
in
den
Ei-
genscha en
diese
Glucoamylase-Isoenzyme
sind
be ich e
wo den.
Übe
die
Bedeu ung
des
einen
ode
ande en
Isoenzyms
beim
echnischen
P o-
zeß
de
Ve zucke ung
is
alle dings
wenig
bekann ,
obwohl
in
allen
komme ziellen
Glucoamylasen
meh e e
ak i e
Enzym ak ionen
o kommen.
Man
kann
je
nach
P oduzen en
eine
un e schiedliche
Zusammense zung
de
Isoenzym e eilung
es s ellen,
z.
T.
on
Cha ge
zu
Cha ge
un e -
schiedlich.
Eine
Ve ände ung
de
Isoenzym e eilung
schon
wäh end
de
Lage ung
eines
bes imm en
Handelsp äpa a es
wu de
on
S ensson
1982
[5]
besch ieben.
In
ASPERGILLUS
NIGER-Glucoamylasep äpa a en
wu den
bishe
bis
zu
d ei
ak i e
Glucoamylase ak ionen
nachgewiesen
und
in
de
Li e a u
besch ieben.
Mi
eine
Ve besse ung
de
Analysen echnik
is
das
Au inden
wei e e
Komponen en
nich
ausgeschlossen.
Zu
Fes legung
de
Nomenkla u
wi d
das
P o ein
mi
dem
höchs en
Moleku-
la gewich
als
Glucoamylase
I
und
das
Enzym
mi
dem
e was
nied ige en
Molekula gewich
und
dem
höhe en
isoelek ischen
Punk
als
Glucoamy-
lase
II
bezeichne .
Die
P imä s uk u
de
Glucoamylase
I
wu de
du ch
S ensson
[6,
7]
und
Mi a bei e
(Analyse
de
komple en
Aminosäu ese-
quenz)
und
Pazu
[8]
und
Mi a bei e
(Analyse
des
Kohlenhyd a an eils
des
Enzyms)
wei gehend
au geklä .
In
de
gezeig en
Tabelle
sind
eini-
ge
de
Eigenscha en
diese
Isoenzyme da ges ell .
Enzyma ische
Modi izie ung
on
Enzymen
145
Isoenzym
GAI
GAIl
Typ
Glykop o ein
Glykop o ein
Molekula gewich
110000
84000
(GPC)
Isoelek ische
3.25 3.58
Punk
Kohlenhyd a an eil
Mannose,
Glucose,
Mannose,
Glucose,
Galak ose
Galak ose
P o ein-Kohlenhyd a -
44-46/
Mol
Enzym
44-46/Mol
Enzym
Bindungss ellen
Monosaccha id-
99-102/Mol
Enzym
99-102/Mol
Enzym
äqui alen e
Tab.ı
Eigenscha en
de
e schiedenen
Aspe gillus
nige -Glucoamylasen
Beide
Enzyme
sind
Glykop o eine
mi
einem
hohen
Kohlenhyd a an eil.
Die
übe
Eichp o eine
mi
de
Gelpe mea ionsch oma og aphie
e mi el-
en
Molekula gewich e
sind
wie
übliche wiese
bei
Glykop o einen
mi
einem
ela i
hohen
Fehle
beha e ; die
übe
die
komple e
Aminosäu-
esequenz
on
S ensson
e hal enen
We e
on
82
000
Dal on
ü
Gluco-
amylase
I
und
de
um
ca.
12
000
Dal on
nied ige e
We
on
70
000
ü
GA
II
dü e
zu e lässige
sein.
De
Saccha idan eil
is
wei gehend
0-
glykosidisch
an
die
Polypep idke e
gebunden.
Es
übe wieg
Mannose,
die
an
ca.
44
Bindungss ellen
an
Se in,
Th eonin
und
Aspa agin
in
Fo m
on
Mono-,
Di-,
T i-
ode
Te asaccha iden
gebunden
is
[6].
Die
Sac-
cha ide
sind
z.
T.
übe
1-2
und
1-6
Bindungen
e zweig .
Diese
Koh-
lenhyd a an eil
wi d
in
Zusammenhang
geb ach
mi
de
ehlenden
P äzi-
pi ie ba kei
du ch
Elek oly e
ode
Tannin
und
eine
gu en
S abili ä
des
Enzyms
gegenübe
he mischen
und
ande en
chemischen
Ein lüssen.
So
bleib
nach
Abspal ung
des
Saccha idan eils
die
Ak i i ä
wei gehend
e hal en,
die
The mos abili ä
ha
dann
alle dings
d as isch
abgenom-
men.
De
übe wiegende
Teil
de
Saccha ide
wu de
in
einem
übe aschend
engen
Be eich
on
ca.
70
Aminosäu en
ge unden
[7]
(Abb.
1).
146
G.
Konieczny-Janda
Isoenzym
GAI
GAIl
Na i e
S a ke
-
Adso p ion
+
-
- Abbau
+
w
Pullulan
—
Abbau
++
+
++++:
as
olls ändig
Ve kleis e e
S ä ke
-
Abbau
++++
+++
Co
+:
ge ing
=:
nich
nachweisba
Tab.2
Wi kung
on
Aspe gillus
nige -Glucoamylasen
au
hochmolekula e
Subs a e
Glucoamylase
I
hyd olysie
hochmolekula e
Subs a e
e heblich
schnel-
le
als
Isoenzym
II.
Dieses
gil
besonde s
ü
alpha
1-6
Bindungen
en hal ende
Polyme e,
wie
z.
B.
Pullulan.
Auch
e kleis e e
S ä ke
wi d
on
Glucoamylase
II
e was
langsame
und
nich
so
wei gehend
wie
du ch
Isoenzym
I
abgebau
(Tab.
2).
Zu
Un e suchung,
ob
dieses
auch
au
den
hochmolekula en
An eil
in
e lüssig en
Weizens ä kehyd olysa en
zu i ,
wu de
handelsübliche
Weizen-A-S ä ke
nach
Säu e-Enzym-
ode
Enzym-Enzym-Ve lüssigung
mi
eine
komme ziellen
BACILLUS
LICHENIFORMIS
Alpha-Amylase
OPTITHERM-L
420
au
un e schiedliche
Dex ose-Äqui alen e
hyd olysie .
Die
Tempe-
a u en
e eich en
in
de
e s en
Ve lüssigungss u e
max.
160
°C,
die
enzyma ische
Ve lüssigung
de
zwei en
S u e wu de
bei
95
°C
du chge-
üh .
Die
Hyd olysa e
wu den
bei
pH
4,2
und
60
°C
und
eine
T ocken-
subs anzkonzen a ion
on
35
-
38
%
e zucke .
Die
eingese z en
Glu-
coamylasen
wa en
Ve suchsp oduk e,
bei
denen du ch
geziel e
Fe men a-
ion
eines
ASPERGILLUS
NIGER
S ammes
ein
bes imm es
Isoenzym e häl nis
e hal en
wu de.
Die
ela i e
Alpha-Amylase-Ak i i ä
in
den
Glucoamy-
lasen
wa
gleich
hoch.
Die
e schiedenen
Ve lüssigungs e ah en
zeig-
en
zwa
nach
Ve zucke ung
un e schiedliche
DX-We e,
de
Ein luß
de
Isoenzym e eilung
au
die
Ve zucke ung
wa
abe
in
de
Tendenz
gleich.
Enzyma ische
Modi izie ung
on
Enzymen
147
NH2
NH>
=
___
Kohlenhyd a -
ey
sei enke e
Polypep id-
Riickg a
—
Be eich
(Ee
=
|
=
S
COOH
P o ease
COOH
GLUCOAMYLASE
|
|
[
GLUCOAMYLASE
II
Abb.1
Schema ische
Da s ellung
de
S uk u
und
Bildung
on
Aspe gillus
nige -Glucoamylase
GAI
und
GAIl
(modi izie
nach
B.S ensson
e
al)
Dieses
seh
ein ache
Modell
zeig ,
daß
diese
hochglykosidie e
Be-
eich
unge äh
100
Aminosäu en
om
C- e minalen
Ende
lokalisie
is .
Die
Glucoamylase
II
is
wei gehend
iden isch
und
un e scheide
sich
nu
du ch
ein
ehlendes
S ück
on
ca.
100
Aminosäu en,
die
immunolo-
gischen
Eigenscha en
sind
gleich.
Als
E klä ung
ü
diese
g oße
Ähn-
lichkei
kann
z.
B.
das on
Boel
[9]
und
Mi a bei e n
besch iebene
splicing
de
Glucoamylase
I-mRNA
he angezogen
we den,
das
zu
seh
ähn-
lichen
P o einen
üh en
kann.
Alle dings
deu en
eine
Vielzahl
on Pub-
lika ionen
-
besonde s
du ch
Hayashida
[10,
11,
12]
-
auch
au
die
hie
schema isch
da ges ell e
Möglichkei
de
p o eoly ischen
Bildung
onn
niede molekula en
De i a en
de
Glucoamylase
I
wäh end
de
sub-
me sen
Fe men a ion
hin.
In
de
Ta
gib
es
iele
ande e
Beispiele
ü
eine
spezi ische
P o eolyse,
die
eine
g oße
Rolle
in
ielen
physiolo-
gischen
P ozessen
spiel .
Die
Ak i ie ung
on
T ypsinogen,
des
Diph-
e ie
Toxins
ode
die
Umwandlung
on
P oglucagon
in
Glucagon
ode
P o-

148
G.
Konieczny-Janda
insulin
in
Insulin
sind
nu
einige
Beispiele
de
Bedeu ung
de
limi-
ie en
P o eolyse.
A280
nm
oe
Re en ionszei
(min)
Abb.2
Gelpe mea ionsch oma og aphische
Analysen
de
Umwandiung
on
Aspe gillus
nige -Glucoamylase
|
in
Glucoamylase
II
wäh end
eine
Modell e men a ion
zu
P oduk ion
on
Glucoamylase
(2x Bio
Rad
TSK
250 -30
x
0.75 cm-.
0
5
mi/min
Phospha pu e
pH
68)
Ta sächlich
läß
sich
-
auch
bei
de
subme sen
Fe men a ion
on
ASPER-
GILLUS
NIGR
-
mi
de
Gelpe mea ionsch oma og aphie
un e
bes imm en
Ums änden
mi
o sch ei ende
Fe men a ionszei
ein
zunehmende
Umbau
de
zue s
gebilde en
höhe molekula en
Glucoamylase
I
in
ein
Enzym
mi
nied ige em
Molekula gewich
e olgen
(Abb.
2).
Gleichzei ig
s eig
die
Konzen a ion
niede molekula e
Pep ide
im
Näh medium
an.
Diese
Abbau
kann
auch
in
i o
mi
ge einig e
Glucoamylase
I
und
P o ease
s a inden.
Un e
bes imm en
Ums änden
komm
es
zu
eine
wei e gehen-
Gen
Hyd olyse,
de
Kohlenhyd a gehal
kann
dann
abnehmen.
Ein
de a i-
ge
Mechanismus
könn e
auch
die
o he
e wähn e
Ve schiebung
de
Iso-
enzym e eilung
wäh end
de
Lage ung
diese
bes imm en
Glucoamylase
he bei üh en.
Zu
nähe en
Un e suchung
de
anwendungs echnischen
Eigenscha en
de
beiden
hie
gezeig en
Glucoamylase-Isoenzyme
wu den
die
P o eine
aus
unse em
komme ziellen
A.
NIGER-Glucoamylasep äpa a
OPTIDEX
du ch
Sephadex-G
25
und
DEAE-Cellulose-Ch oma og aphie
p äpa a i
gewonnen
und
übe
Rech oma og aphie
mi
einem
Salzg adien en
und
wei gehende
Ul a il a ion
ge einig .
Die
ge ie ge ockne en
F ak ionen
zeig en
sowohl
mi
de
Ionenaus auschch oma og aphie
als
auch
mi
de
Gelpe -
mea ionsch oma og aphie
einen
homogenen
Peak,
bei
de
isoelek ischen
Fokussie ung
wu de
jeweils
nu
eine
Bande
ge unden.
Die
beiden
hie
Enzyma ische
Modi izie ung
on
Enzymen
149
gezeig en
Enzyme
zeigen
ge inge
Un e schiede
im
Tempe a u -Ak i i ä s
p o il.
Rela i e
Ak i i ä
%)
100—
ee
ges
a3
4
60
40
e
Isoenzym
|
4
Isoenzym
Il
=
4%
lösliche
S ä ke
2—
1'h
Reak ionszei
0
TTS
ae
] ]
60
62
64 66 68 70
Tempe a u
(°C)
Abb.3
Ein luß
de
Tempe a u
au
die
Ak i i ä
on
A.nige -Glucoamylase
|
und
I!
Un e
diesen
Bedingungen
wu de
das
Op imum
ii
beide
P o eine
bei
66
°C
ge unden
(Abb.
3).
Bei
höhe en
Tempe a u en
is
de
Ab all
de
Ak i i ä
bei
Isoenzym
I
ge inge .
De
hie
ge undene
Un e schied
in
de
Tempe a u s abili ä
is
in
Übe eins immung
mi
den
in
de
Li e a-
u
publizie en
Da en.
Wie
bekann ,
spiel
die
Reak ionszei
eine
e -
hebliche
Rolle,
so
lieg
un e
Ve zucke ungsbedingungen
die
Op imal-
empe a u
bei
60
-
62
°C.
Rela i e
Ak i i ä
(%)
100
oa
5
a
>
%
80—
a
6o—
40—
e
Isoenzym
|
4
Isoenzym
Il
=
4%
lösliche
S ä ke
60°C
20-4
1h
Reak ionszei
Abb.4
Ein luß
des
pH-We es
au
die
Ak i i ä
on
A.nige -Glucoamylase
I
und
Il
150
G.
Konieczny-Janda
Das
pH-Ak i i ä sp o il
(Abb.
4)
de
beiden
Glucoamylasen
zeig
Op ima
um
pH
4,4
mi
hohen
Ak i i ä en
on
Isoenzym
I
auch
im
s a k
sau en
Be eich.
Dieses
mag
beim
Abbau
de
S ä ke
in
F uch sä en
on
Bedeu-
ung
sein,
ein
posi i e
ode
nega i e
Ein luß
au
den
DX-We
bei
de
Ve zucke ung
konn e
nich
ge unden
we den.
Alle dings
lieg
in
de
indus iellen
P axis
kein
Ace a pu e
o .
Res ak i i ä
pH
(%)
100—
80
60
404
e
lsoenzym
|
204
4
Isoenzym
Il
E
ı
T
T
|
o
10
20
30 40
50
60
70
Inkuba ionszei
ıhı
Abb.5
Ak i i ä sab all
on
A.nige -Glucoamylase
|
und
Il
in
Gegenwa
on
Glucose
und
bei
einem
simulie en
pH-Ab all
wäh end
de
Inkuba ion
(30%-w/w-Glucose.
60°C.
180
GAU/kg
T ockensubs anz)
Mi
30
%ige
Glucose
und
einem
simulie en
pH-Ab all
on
4,2
au
3,8
als
Modell
ü
die
Bedingungen
bei
de
enzyma ischen
Ve zucke ung
is
ein
signi ikan e
Un e schied
in
de
Res ak i i ä
(Abb.
5)
nich
zu
beobach en.
Nach
72
S unden
zeigen
beide
Glucoamylasen
die
gleiche
Res ak i i ä .
De
hie
simulie e
pH-Ab all
on
0,4
Einhei en
is
in
de
P axis
eben alls
zu
beobach en.
Du ch
Bildung
o ganische
Säu en
kann
e
besonde s
bei
de
Ve zucke ung
on
Weizens ä kehyd olysa en
bis
zu
0,6
Einhei en
inne halb
72
S unden
allen.
Enzyma ische
Modi izie ung
on
Enzymen
151
Abb.6
Hyd olysegeschwindigkei en
un e zweig e
Mal osacha ide
als
Funk ion
des
Polyme isa ionsg ades
n
-
Abbau
mi
A.nige -Glucoamylase
|
und
II
-
(100
mmol/l,
60°C,
pH
4.2,
90
GAU/mol)
Die
Wi kung
de
Glucoamylase
au
alpha-glykosidische
1-4
Bindungen
s eig
mi
zunehmende Ke enlänge
de
Mal osaccha ide
an
(Abb.
6),
die
Michaeliskons an e
nimm
ab.
Die
An angshyd olysegeschwindigkei
nimm
alle dings
nich
unbeg enz
zu,
sie
e eich
bei
den
hie
ge ei-
nig en
Alpha-Amylase- eien
Glucoamylasen
ein
Maximum
bei
Mal o e a-
ose
und
äll
danach
wiede
e was
ab.
Diese
Ab all
de
Abbau a e
läß
sich
mi
de
Bildung
nich p oduk i e
Enzym-Subs a -Komplexe,
beson-
de s
mi
Subs a en
g öße e
Ke enlänge,
e klä en.
Ein
seh
ähnliches
Ve hal en
wu de
on
Hi omi
[13]
ü
RHIZOPUS-Glucoamylasen
besch ie-
ben.
Die
Abbildung
zeig
bei
Mal ose
und
besonde s
Mal o iose
leich
höhe e
Abbau a en
mi
Isoenzym
II.
Die
Dosie ung
de
Enzyme
wa
ak i-
i ä sgleich,
gemessen
an
de
Wi kung
gegenübe
lösliche
S ä ke;
eine
übliche
Me hode
mi
de
wi
auch
unse e
komme ziellen
Glucoamylasen
s anda disie en.
De
Abbau
de
in
enzym e lüssig en
S ä ken
p ak isch
olls ändig
e hal enen
1-6
Bindungen
s ell
eine
wesen liche
Limi ie-
ung
de
Hyd olysegeschwindigkei
e lüssig e
S ä ke
da .
Selbs
die
Abbau a en
de
den
Ve zweigungss ellen
benachba en
1-4
Bindungen
sind
deu lich
he abgese z .