ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON ENZYMEN GLUCOAMYLASE ALS BEISPIEL AUS DER STÄRKEVERARBEITUNG

ENZYMATISCHE MODIFIZIERUNG VON ENZYMEN GLUCOAMYLASE ALS BEISPIEL AUS DER STARKEVERARBEITUNG G. Konieczny-Janda Miles Kali-Chemie GmbH & Co. KG Biochemisches We k Hans-Böckle -Allee 20 D - 3000 Hanno e 1 The chemical modi ica ion o mic obial enzymes has gained inc eased impo ance. A con olled enzyma ic ea men o bioca alys s can be ano he s ep owa ds " aylo -made" enzymes o use in ood indus y. The ans o ma ion o s a ch con aining aw ma e ials in mal ose, glu- cose and uc ose a e es ablished p ocesses. Anyhow, i will be shown in his p esen a ion, how a speci ic modi ica ion o ASPERGILLUS NIGER-Glucoamylases can lead o in e es ing p ope ies in he applica- ion o indus ial saccha i ica ion. Du ing he la e s age o he subme se p oduc ion o glucoamylase om ASPERGILLUS NIGER, a p o eoly ic modi ica ion o he enzyme molecule happens. The o med enzyme shows a sligh ly di e en subs a e speci- ici y han he o iginal enzyme. The p ope ies o he pu i ied gluco- amylase-isoenzymes a e demons a ed by means o deg ada ion ials wi h b anched and linea oligosaccha ides. Isomal ose is o med as he main p oduc o he e e se ac ion om glucose as subs a e by bo h isoenzymes. Bo h glucoamylases a e able o spli alpha-1-6-glucosidic bonds o mal ooligosaccha ides. The p ac ical impo ance and possible in luences o a ce ain isoenzyme a io o comme cial glucoamylases a e explained wi h compa a i e saccha i ica ion ials using enzyma i- cally lique ied whea s a ch as subs a e. 144 G. Konieczny-Janda Die indus ielle Ve zucke ung on S ä kehyd olysa en zu P oduk ion on Dex ose mi ASPERGILLUS NIGER Glucoamylasen wi d sei ielen Jah- en mi E olg du chge üh . Eine kon inuie liche Wei e en wicklung diese Ve zucke ungsenzyme - wie z. B. die En wicklung T ansglucosi- dase- eie Glucoamylasen - ha zu eine wesen lichen Ve besse ung de Glucoseausbeu en ge üh . Eine wei e e Op imie ung dieses Enzymsys ens is jedoch nu übe eine genaue Kenn nis de biochemischen Vo gänge bei de P oduk ion on Glucoamylasen, de Eigenscha en de gebilde en P o eine und de en anwendungs echnische Bedeu ung möglich. Abe auch eine Ände ung des Rohs o es - ein Teil des nach Eu opa zu impo ie enden Maises wi d du ch den heimischen Rohs o Weizen e - se z - üh du ch die no wendig we dende Modi izie ung de P ozeßbe- dingungen zu ande en An o de ungen an die e wende en Enzyme. De bekann e Fo sche Ueda [1] and 1957 in Japan, daß in Kul u il- a en on ASPERGILLUS AWAMORI e schiedene Fo men de Glucoamylase o kommen. Inzwischen is auch bei de Fe men a ion ande e Schimmel- pilze, wie MUCOR [2], PENICILLIUM [3] und auch ASPERGILLUS NIGER [4,5] die Bildung meh e e exogen wi kende Glucose-abspal ende Amylasen nachgewiesen wo den. Eine Reihe in e essan e Un e schiede in den Ei- genscha en diese Glucoamylase-Isoenzyme sind be ich e wo den. Übe die Bedeu ung des einen ode ande en Isoenzyms beim echnischen P o- zeß de Ve zucke ung is alle dings wenig bekann , obwohl in allen komme ziellen Glucoamylasen meh e e ak i e Enzym ak ionen o kommen. Man kann je nach P oduzen en eine un e schiedliche Zusammense zung de Isoenzym e eilung es s ellen, z. T. on Cha ge zu Cha ge un e - schiedlich. Eine Ve ände ung de Isoenzym e eilung schon wäh end de Lage ung eines bes imm en Handelsp äpa a es wu de on S ensson 1982 [5] besch ieben. In ASPERGILLUS NIGER-Glucoamylasep äpa a en wu den bishe bis zu d ei ak i e Glucoamylase ak ionen nachgewiesen und in de Li e a u besch ieben. Mi eine Ve besse ung de Analysen echnik is das Au inden wei e e Komponen en nich ausgeschlossen. Zu Fes legung de Nomenkla u wi d das P o ein mi dem höchs en Moleku- la gewich als Glucoamylase I und das Enzym mi dem e was nied ige en Molekula gewich und dem höhe en isoelek ischen Punk als Glucoamy- lase II bezeichne . Die P imä s uk u de Glucoamylase I wu de du ch S ensson [6, 7] und Mi a bei e (Analyse de komple en Aminosäu ese- quenz) und Pazu [8] und Mi a bei e (Analyse des Kohlenhyd a an eils des Enzyms) wei gehend au geklä . In de gezeig en Tabelle sind eini- ge de Eigenscha en diese Isoenzyme da ges ell . Enzyma ische Modi izie ung on Enzymen 145 Isoenzym GAI GAIl Typ Glykop o ein Glykop o ein Molekula gewich 110000 84000 (GPC) Isoelek ische 3.25 3.58 Punk Kohlenhyd a an eil Mannose, Glucose, Mannose, Glucose, Galak ose Galak ose P o ein-Kohlenhyd a - 44-46/ Mol Enzym 44-46/Mol Enzym Bindungss ellen Monosaccha id- 99-102/Mol Enzym 99-102/Mol Enzym äqui alen e Tab.ı Eigenscha en de e schiedenen Aspe gillus nige -Glucoamylasen Beide Enzyme sind Glykop o eine mi einem hohen Kohlenhyd a an eil. Die übe Eichp o eine mi de Gelpe mea ionsch oma og aphie e mi el- en Molekula gewich e sind wie übliche wiese bei Glykop o einen mi einem ela i hohen Fehle beha e ; die übe die komple e Aminosäu- esequenz on S ensson e hal enen We e on 82 000 Dal on ü Gluco- amylase I und de um ca. 12 000 Dal on nied ige e We on 70 000 ü GA II dü e zu e lässige sein. De Saccha idan eil is wei gehend 0- glykosidisch an die Polypep idke e gebunden. Es übe wieg Mannose, die an ca. 44 Bindungss ellen an Se in, Th eonin und Aspa agin in Fo m on Mono-, Di-, T i- ode Te asaccha iden gebunden is [6]. Die Sac- cha ide sind z. T. übe 1-2 und 1-6 Bindungen e zweig . Diese Koh- lenhyd a an eil wi d in Zusammenhang geb ach mi de ehlenden P äzi- pi ie ba kei du ch Elek oly e ode Tannin und eine gu en S abili ä des Enzyms gegenübe he mischen und ande en chemischen Ein lüssen. So bleib nach Abspal ung des Saccha idan eils die Ak i i ä wei gehend e hal en, die The mos abili ä ha dann alle dings d as isch abgenom- men. De übe wiegende Teil de Saccha ide wu de in einem übe aschend engen Be eich on ca. 70 Aminosäu en ge unden [7] (Abb. 1). 146 G. Konieczny-Janda Isoenzym GAI GAIl Na i e S a ke - Adso p ion + - - Abbau + w Pullulan — Abbau ++ + ++++: as olls ändig Ve kleis e e S ä ke - Abbau ++++ +++ Co +: ge ing =: nich nachweisba Tab.2 Wi kung on Aspe gillus nige -Glucoamylasen au hochmolekula e Subs a e Glucoamylase I hyd olysie hochmolekula e Subs a e e heblich schnel- le als Isoenzym II. Dieses gil besonde s ü alpha 1-6 Bindungen en hal ende Polyme e, wie z. B. Pullulan. Auch e kleis e e S ä ke wi d on Glucoamylase II e was langsame und nich so wei gehend wie du ch Isoenzym I abgebau (Tab. 2). Zu Un e suchung, ob dieses auch au den hochmolekula en An eil in e lüssig en Weizens ä kehyd olysa en zu i , wu de handelsübliche Weizen-A-S ä ke nach Säu e-Enzym- ode Enzym-Enzym-Ve lüssigung mi eine komme ziellen BACILLUS LICHENIFORMIS Alpha-Amylase OPTITHERM-L 420 au un e schiedliche Dex ose-Äqui alen e hyd olysie . Die Tempe- a u en e eich en in de e s en Ve lüssigungss u e max. 160 °C, die enzyma ische Ve lüssigung de zwei en S u e wu de bei 95 °C du chge- üh . Die Hyd olysa e wu den bei pH 4,2 und 60 °C und eine T ocken- subs anzkonzen a ion on 35 - 38 % e zucke . Die eingese z en Glu- coamylasen wa en Ve suchsp oduk e, bei denen du ch geziel e Fe men a- ion eines ASPERGILLUS NIGER S ammes ein bes imm es Isoenzym e häl nis e hal en wu de. Die ela i e Alpha-Amylase-Ak i i ä in den Glucoamy- lasen wa gleich hoch. Die e schiedenen Ve lüssigungs e ah en zeig- en zwa nach Ve zucke ung un e schiedliche DX-We e, de Ein luß de Isoenzym e eilung au die Ve zucke ung wa abe in de Tendenz gleich. Enzyma ische Modi izie ung on Enzymen 147 NH2 NH> = ___ Kohlenhyd a - ey sei enke e Polypep id- Riickg a — Be eich (Ee = | = S COOH P o ease COOH GLUCOAMYLASE | | [ GLUCOAMYLASE II Abb.1 Schema ische Da s ellung de S uk u und Bildung on Aspe gillus nige -Glucoamylase GAI und GAIl (modi izie nach B.S ensson e al) Dieses seh ein ache Modell zeig , daß diese hochglykosidie e Be- eich unge äh 100 Aminosäu en om C- e minalen Ende lokalisie is . Die Glucoamylase II is wei gehend iden isch und un e scheide sich nu du ch ein ehlendes S ück on ca. 100 Aminosäu en, die immunolo- gischen Eigenscha en sind gleich. Als E klä ung ü diese g oße Ähn- lichkei kann z. B. das on Boel [9] und Mi a bei e n besch iebene splicing de Glucoamylase I-mRNA he angezogen we den, das zu seh ähn- lichen P o einen üh en kann. Alle dings deu en eine Vielzahl on Pub- lika ionen - besonde s du ch Hayashida [10, 11, 12] - auch au die hie schema isch da ges ell e Möglichkei de p o eoly ischen Bildung onn niede molekula en De i a en de Glucoamylase I wäh end de sub- me sen Fe men a ion hin. In de Ta gib es iele ande e Beispiele ü eine spezi ische P o eolyse, die eine g oße Rolle in ielen physiolo- gischen P ozessen spiel . Die Ak i ie ung on T ypsinogen, des Diph- e ie Toxins ode die Umwandlung on P oglucagon in Glucagon ode P o- 148 G. Konieczny-Janda insulin in Insulin sind nu einige Beispiele de Bedeu ung de limi- ie en P o eolyse. A280 nm oe Re en ionszei (min) Abb.2 Gelpe mea ionsch oma og aphische Analysen de Umwandiung on Aspe gillus nige -Glucoamylase | in Glucoamylase II wäh end eine Modell e men a ion zu P oduk ion on Glucoamylase (2x Bio Rad TSK 250 -30 x 0.75 cm-. 0 5 mi/min Phospha pu e pH 68) Ta sächlich läß sich - auch bei de subme sen Fe men a ion on ASPER- GILLUS NIGR - mi de Gelpe mea ionsch oma og aphie un e bes imm en Ums änden mi o sch ei ende Fe men a ionszei ein zunehmende Umbau de zue s gebilde en höhe molekula en Glucoamylase I in ein Enzym mi nied ige em Molekula gewich e olgen (Abb. 2). Gleichzei ig s eig die Konzen a ion niede molekula e Pep ide im Näh medium an. Diese Abbau kann auch in i o mi ge einig e Glucoamylase I und P o ease s a inden. Un e bes imm en Ums änden komm es zu eine wei e gehen- Gen Hyd olyse, de Kohlenhyd a gehal kann dann abnehmen. Ein de a i- ge Mechanismus könn e auch die o he e wähn e Ve schiebung de Iso- enzym e eilung wäh end de Lage ung diese bes imm en Glucoamylase he bei üh en. Zu nähe en Un e suchung de anwendungs echnischen Eigenscha en de beiden hie gezeig en Glucoamylase-Isoenzyme wu den die P o eine aus unse em komme ziellen A. NIGER-Glucoamylasep äpa a OPTIDEX du ch Sephadex-G 25 und DEAE-Cellulose-Ch oma og aphie p äpa a i gewonnen und übe Rech oma og aphie mi einem Salzg adien en und wei gehende Ul a il a ion ge einig . Die ge ie ge ockne en F ak ionen zeig en sowohl mi de Ionenaus auschch oma og aphie als auch mi de Gelpe - mea ionsch oma og aphie einen homogenen Peak, bei de isoelek ischen Fokussie ung wu de jeweils nu eine Bande ge unden. Die beiden hie Enzyma ische Modi izie ung on Enzymen 149 gezeig en Enzyme zeigen ge inge Un e schiede im Tempe a u -Ak i i ä s p o il. Rela i e Ak i i ä %) 100— ee ges a3 4 60 40 e Isoenzym | 4 Isoenzym Il = 4% lösliche S ä ke 2— 1'h Reak ionszei 0 TTS ae ] ] 60 62 64 66 68 70 Tempe a u (°C) Abb.3 Ein luß de Tempe a u au die Ak i i ä on A.nige -Glucoamylase | und I! Un e diesen Bedingungen wu de das Op imum ii beide P o eine bei 66 °C ge unden (Abb. 3). Bei höhe en Tempe a u en is de Ab all de Ak i i ä bei Isoenzym I ge inge . De hie ge undene Un e schied in de Tempe a u s abili ä is in Übe eins immung mi den in de Li e a- u publizie en Da en. Wie bekann , spiel die Reak ionszei eine e - hebliche Rolle, so lieg un e Ve zucke ungsbedingungen die Op imal- empe a u bei 60 - 62 °C. Rela i e Ak i i ä (%) 100 oa 5 a > % 80— a 6o— 40— e Isoenzym | 4 Isoenzym Il = 4% lösliche S ä ke 60°C 20-4 1h Reak ionszei Abb.4 Ein luß des pH-We es au die Ak i i ä on A.nige -Glucoamylase I und Il 150 G. Konieczny-Janda Das pH-Ak i i ä sp o il (Abb. 4) de beiden Glucoamylasen zeig Op ima um pH 4,4 mi hohen Ak i i ä en on Isoenzym I auch im s a k sau en Be eich. Dieses mag beim Abbau de S ä ke in F uch sä en on Bedeu- ung sein, ein posi i e ode nega i e Ein luß au den DX-We bei de Ve zucke ung konn e nich ge unden we den. Alle dings lieg in de indus iellen P axis kein Ace a pu e o . Res ak i i ä pH (%) 100— 80 60 404 e lsoenzym | 204 4 Isoenzym Il E ı T T | o 10 20 30 40 50 60 70 Inkuba ionszei ıhı Abb.5 Ak i i ä sab all on A.nige -Glucoamylase | und Il in Gegenwa on Glucose und bei einem simulie en pH-Ab all wäh end de Inkuba ion (30%-w/w-Glucose. 60°C. 180 GAU/kg T ockensubs anz) Mi 30 %ige Glucose und einem simulie en pH-Ab all on 4,2 au 3,8 als Modell ü die Bedingungen bei de enzyma ischen Ve zucke ung is ein signi ikan e Un e schied in de Res ak i i ä (Abb. 5) nich zu beobach en. Nach 72 S unden zeigen beide Glucoamylasen die gleiche Res ak i i ä . De hie simulie e pH-Ab all on 0,4 Einhei en is in de P axis eben alls zu beobach en. Du ch Bildung o ganische Säu en kann e besonde s bei de Ve zucke ung on Weizens ä kehyd olysa en bis zu 0,6 Einhei en inne halb 72 S unden allen. Enzyma ische Modi izie ung on Enzymen 151 Abb.6 Hyd olysegeschwindigkei en un e zweig e Mal osacha ide als Funk ion des Polyme isa ionsg ades n - Abbau mi A.nige -Glucoamylase | und II - (100 mmol/l, 60°C, pH 4.2, 90 GAU/mol) Die Wi kung de Glucoamylase au alpha-glykosidische 1-4 Bindungen s eig mi zunehmende Ke enlänge de Mal osaccha ide an (Abb. 6), die Michaeliskons an e nimm ab. Die An angshyd olysegeschwindigkei nimm alle dings nich unbeg enz zu, sie e eich bei den hie ge ei- nig en Alpha-Amylase- eien Glucoamylasen ein Maximum bei Mal o e a- ose und äll danach wiede e was ab. Diese Ab all de Abbau a e läß sich mi de Bildung nich p oduk i e Enzym-Subs a -Komplexe, beson- de s mi Subs a en g öße e Ke enlänge, e klä en. Ein seh ähnliches Ve hal en wu de on Hi omi [13] ü RHIZOPUS-Glucoamylasen besch ie- ben. Die Abbildung zeig bei Mal ose und besonde s Mal o iose leich höhe e Abbau a en mi Isoenzym II. Die Dosie ung de Enzyme wa ak i- i ä sgleich, gemessen an de Wi kung gegenübe lösliche S ä ke; eine übliche Me hode mi de wi auch unse e komme ziellen Glucoamylasen s anda disie en. De Abbau de in enzym e lüssig en S ä ken p ak isch olls ändig e hal enen 1-6 Bindungen s ell eine wesen liche Limi ie- ung de Hyd olysegeschwindigkei e lüssig e S ä ke da . Selbs die Abbau a en de den Ve zweigungss ellen benachba en 1-4 Bindungen sind deu lich he abgese z .