Ins i u o de Biomedicina de Se illa
Depa amen o de Fisiología Médica y Bio ísica
Uni e sidad de Se illa
ACUAPORINAS EN DIVERSAS PATOLOGÍAS NEUROLÓGICAS
Ismael Sánchez Goma
T abajo p esen ado pa a op a al g ado de Doc o po la Uni e sidad de
Se illa, 2016.
Dª. Mi iam Eche a ía I us a, P o eso a Ti ula de Fisiología, adsc i a al
Depa amen o de Fisiología Médica y Bio ísica de la Uni e sidad de Se illa,
CERTIFICA:
Que Ismael Sánchez Goma ha ealizado bajo su di ección el abajo i ulado:
“Acuapo inas en di e sas pa ologías neu ológicas” que p esen a pa a op a
al g ado de Doc o po la Uni e sidad de Se illa.
Fdo. Dª. Mi iam Eche a ía I us a
Se illa, 19 de Ab il de 2016
Ins i u o de Biomedicina de Se illa
Hospi al Uni e si a io Vi gen del Rocío
A da. Manuel Siu o s/n, 41013, Se illa
I
ÍNDICE
Con enido pág.
ABREVIATURAS ........................................................................................ VI
INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 3
1. Acuapo inas .............................................................................................. 3
1.1 In oducción a las acuapo inas (AQPs)............................................. 3
1.2 Clasi icación y dis ibución de las acuapo inas ................................ 4
1.3 Es uc u a de las acuapo inas .......................................................... 5
1.4 Acuapo inas en el sis ema ne ioso cen al (SNC)........................... 7
1.5 Acuapo ina 4 .................................................................................... 7
1.6 Acuapo ina 1 .................................................................................... 9
1.7 Acuapo ina 9 .................................................................................. 10
1.8 Funciones de las acuapo inas en el SNC ........................................ 11
1.8.1 Mo imien o de agua en el ce eb o ......................................... 11
1.8.2 P oducción de líquido ce alo aquídeo ................................... 13
1.8.3 Mig ación de as oci os ............................................................ 14
1.8.4 Neu oexci ación ......................................................................... 14
2. Pa ologías del sis ema ne ioso cen al asociado a AQPs ..................... 16
2.1 Edema ............................................................................................ 16
2.2 Tumo es ce eb ales ....................................................................... 18
2.3 Epilepsia ......................................................................................... 18
2.4 Neu omieli is óp ica ...................................................................... 19

II
2.4.1 In oducción ............................................................................. 19
2.4.2 Clasi icación ............................................................................. 20
2.4.3 C i e ios de diagnós ico y ca ac e ís icas clínicas ............... 22
2.4.4 Pa ogénesis .............................................................................. 22
2.4.5 De ección de an icue pos an i-AQP4 (NMO-IgG) ............... 26
2.4.6 T a amien o ............................................................................. 28
2.4.7 AQP1 en NMOSD ..................................................................... 29
3. Hid oce alia ............................................................................................. 31
3.1 De inición ....................................................................................... 31
3.2 P oducción de líquido ce alo aquídeo. Plexo co oideo ............... 32
3.3 Papel de las AQPs en hid oce alia de humano .............................. 33
OBJETIVOS .............................................................................................. 38
MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................ 42
1. Técnicas de cul i o celula ...................................................................... 42
1.2 Condiciones de cul i o de la línea celula HEK293 (células
emb iona ias de iñón humano) ............................................................ 42
1.3 Cul i o p ima io de plexo co oideo de a a .................................. 43
1.3.1 Disección y dispe sión de ejido ............................................. 43
1.3.2 Cul i o ....................................................................................... 44
2. Técnicas de biología molecula ............................................................... 46
2.1 Gene ación de las cons ucciones del cDNA de AQP4 humana .... 46
2.2 T ans ecciones de cul i os celula es de HEK 293 .......................... 52
III
2.3 Cul i os es ables HEK293-pEGFP-N1-AQP4 ................................... 53
2.4 Wes e n Blo .................................................................................. 54
2.4.1 Ex acción de p o eínas .......................................................... 54
2.4.2 Elec o o esis SDS-PAGE, ans e encia e
inmunode ección ..................................................................... 54
2.5 Análisis de exp esión de ARN mensaje os .................................... 56
2.5.1 Ex acción de ARN o al .......................................................... 56
2.5.2 Re o ansc ipción ................................................................... 58
2.5.3 PCR cuan i a i a o en iempo eal (PCRq) ............................ 58
3. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSo ben Assay) ...................................... 61
3.1 ELISA indi ec o ............................................................................... 61
3.1.1 Ex acción de p o eínas .......................................................... 62
3.1.2 De ección de an icue pos ....................................................... 63
3.2 ELISA sándwich .............................................................................. 65
4. Animales de expe imen ación ................................................................ 65
4.1 PCR con encional pa a geno ipado de a ones ............................ 67
4.1.1 Ra ones hid oce álicos hop gai (hyh) .................................. 67
4.1.2 Ra ones AQP1-KO .................................................................... 69
4.2 Exposición de a ones a hipoxia e hipe capnia ............................. 69
4.3 Ob ención de ejidos ..................................................................... 70
5. Técnicas inmunológicas .......................................................................... 72
5.1 Inmunohis oquímica...................................................................... 72
IV
5.2 Inmuno luo escencia indi ec a ..................................................... 72
5.3 Inmuno luo escencia indi ec a – Mé odo de diagnós ico ............ 73
5.3.1 Op imización del mé odo de diagnós ico ............................. 75
6. P ocesamien o de mues as de pacien es ............................................. 76
7. Análisis es adís ico .................................................................................. 77
8. Anexos .................................................................................................... 78
8.1 Consen imien o in o mado ........................................................... 78
8.2 Clasi icación de mues as de pacien es ........................................ 82
8.3 An icue pos p ima ios ................................................................... 83
8.4 An icue pos secunda ios ............................................................... 84
RESULTADOS .......................................................................................... 88
1. Desa ollo de un sis ema de diagnós ico pa a la Neu omieli is óp ica .. 89
1.1 De ección de an icue pos an i-AQP4 ............................................ 89
1.2 Ve i icación del mé odo de diagnós ico ........................................ 92
1.3 Resul ados globales po pa ología ................................................ 94
1.4 Op imización del mé odo de diagnós ico ..................................... 95
1.5 Falsos posi i os p oducidos po a amien o con na alizumab .... 98
2. P esencia de an icue pos an i-AQP1 en sue o de pacien es con
deso denes que se incluyen den o del sínd ome de la NMO
(NMOSD) ............................................................................................... 102
2.1 De ección de an icue pos an i-AQP1 po inmuno luo escencia. 103
2.2 De ección de an icue pos an i-AQP1 po ELISA .......................... 108
V
3. Es udio de AQPs en líquido ce alo aquídeo de pacien es con
hid oce alia ............................................................................................ 109
4. Es udio de AQP1 en plexo co oideo de a ón ...................................... 112
5. De ección de AQP4 en plexo co oideo de a ón .................................. 116
6. Explo ación de acuapo inas en o as á eas del ce eb o de a ón ....... 118
7. Es udio de AQPs en ce eb o del a ón mu an e hyh (hyd ocephalus hop
gai ) ....................................................................................................... 120
DISCUSIÓN ........................................................................................... 126
1. Desa ollo de sis ema de diagnós ico pa a NMO ................................. 126
2. Op imización del sis ema de diagnós ico ............................................. 128
3. Falsos posi i os p oducidos po Na alizumab ………………………………… 129
4. AQP1 como bioma cado de la NMOSD .............................................. 132
5. Papel de las aquapo inas en la hid oce alia en humanos ................... 134
6. In luencia de la hipoxia en aquapo inas del plexo co oideo ............... 135
7. Papel de las acuapo inas en ce eb o ................................................... 137
8. Papel de AQPs en a ón hid oce álico hyh .......................................... 138
9. AQP4 en plexo co oideo ...................................................................... 139
CONCLUSIONES ..................................................................................... 143
BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 148
4
INTRODUCCIÓN
obs an e no ue has a los años no en a cuando, de o ma aza osa al
pu i ica la p o eína de 32 kDa de la memb ana de los e i oci os
esponsable del ac o Rh, se aisló o a acción p o eica de 28 kDa la cual
ue denominada CHIP28, ab e iado del inglés channel- o ming in eg al
p o ein de 28 kDa, y que más a de se ía denominada como AQP1 (P es on y
Ag e, 1991). Poco después, se demos ó la capacidad de es a p o eína pa a
acili a el anspo e de agua a a és de la memb ana plasmá ica median e
la exp esión he e óloga en o oci os de Xenopus la eis (P es on y col., 1992).
Se es ableció así la iden idad molecula del p ime canal de agua, además la
iden i icación molecula de AQP1 ue el de onan e de la búsqueda que
condujo al descub imien o de las ece acuapo inas que hoy se conocen en
humanos (Eche a ia y col., 1994; Fushimi y col., 1993; Jung y col., 1994;
Raina y col., 1995).
1.2 Clasi icación y dis ibución de las acuapo inas
En mamí e os se han iden i icado has a el momen o 13 miemb os
pe enecien es a la amilia de las AQPs. La Tabla 1 mues a la dis ibución de
es as p o eínas en di e en es ejidos. Se puede ap ecia cómo las
acuapo inas se exp esan en epi elios y endo elios implicados en el
anspo e de luidos, pe o ambién en ejidos donde, en p incipio, el
asiego de agua es meno ; como la piel, ejido adiposo, as oglía, neu onas,
e c.

5
INTRODUCCIÓN
Acuapo ina
Exp esión
AQP0
Células ib osas del c is alino
AQP1
E i oci os, iñón, co azón plexo co oideo, áquea,
endo elio ascula , ejiga u ina ia, u e a, pulmón,
es ículo, piel, co nea, ú e o, placen a…
AQP2
Riñón
AQP3
Riñón, epide mis, epi elio de las ías aé eas, ac o
gas oin es inal, epi elios glandula es, hígado, pulmón,
e i oci os, ú e o…
AQP4
Riñón, ce eb o, pulmón, es ómago, músculo esquelé ico y
e ina
AQP5
Epi elios glandula es, có nea, epi elio al eola , ac o
gas oin es inal
AQP6
Riñón
AQP7
Tejido adiposo, es ículo, iñón, co azón, ac o
gas oin es inal
AQP8
Hígado, pánc eas, in es ino, glándulas sali a es, co azón,
iñón, ías aé eas
AQP9
Hígado, leucoci os, es ículo, ce eb o, iñón, pulmón,
médula ósea
AQP10
In es ino delgado
AQP11
Riñón, hígado, ce eb o, es ículo
AQP12
Células acina es de pánc eas, ojo
Tabla 1. Pa ón de exp esión isula de las acuapo inas humanas (Modi icado de (Ve kman, 2005))
1.3 Es uc u a de las acuapo inas
Cada monóme o de acuapo ina (AQP) pesa al ededo de 30kDa, y en
gene al, con iene 6 segmen os helicoidales ansmemb ana y dos que no
aba can la o alidad de la memb ana (Figu a 1b) (Walz y col., 2009). Las
AQPs gene almen e o man e áme os es ables en las memb anas, aunque
cada monóme o supone po sepa ado un canal de agua (Figu a 1a). Da os
es uc u ales de al a esolución mues an que los dominios
ansmemb anas helicoidales aba can los espacios ci oplasmá icos y
6
INTRODUCCIÓN
ex acelula siendo conec ados a a és de un po o acuoso (Ho y col., 2009).
Simulaciones de dinámica molecula y da os es uc u ales sugie en que las
moléculas de agua se mue en a a és de es e es echo po o acuoso y que
los ac o es es é icos y elec os á icos son los esponsables de la
selec i idad del agua de las AQPs (Cui y Bas ien, 2011; Hub y col., 2009). La
es uc u a esul an e encie a una zona cen al es echa que se ensancha
ab iéndose hacia ambos lados de la memb ana o mando un po o en o ma
de eloj de a ena. En la zona más es echa del po o se ace can los dos
iple es NPA (aspa agina (N), p olina (P) y alanina (A)), secuencias
conse adas en odas las AQPs (Figu a 1c) (Eche a ia y Ilundain, 1998).
Figu a 1. Es uc u a de las acuapo inas. Vis a desde a iba de la ca a ex e na de la memb ana de un
homo e áme o de AQP1, con los monóme os que lo cons i uyen enume ados del 1-4 (a). La p o eína
p esen a 6 dominios helicoidales ansmemb ana (M1, M2, M4, M5, M6, Y M8) y o os dos (M3 y M7)
donde se encuen an los mo i os conse ados NPA (b). Los mo i os NPA se disponen empa ejados en
la memb ana o iginando un es echamien o del po o. En ojo, c, se ep esen a una cis eína sensible a
compues os me cu iales, con ac i idad bloquean e del canal (c). Modi icado de Ve kman AS, 2014 y
Cheidde y Scho , 1999.
7
INTRODUCCIÓN
1.4 Acuapo inas en el sis ema ne ioso cen al (SNC)
La exp esión de acuapo inas ha sido es udiada ampliamen e en el
sis ema ne ioso cen al, ó ganos senso iales y sis ema ne ioso en é ico y
pe i é ico. Su es udio es de g an ele ancia debido a la implicación en la
e iología de di e en es pa ologías neu ológicas, siendo AQP1, AQP4 y AQP9
las desc i as en el SNC.
1.5 Acuapo ina 4
Exis en dos iso o mas p incipales de la p o eína AQP4, M1 y M23,
dependiendo de la longi ud del ex emo amino. M1 es la iso o ma que
p esen a una longi ud mayo , siendo M23 más co a, po la al a de 23
aminoácidos en el ex emo amino e minal (Figu a 2a) (Lu y col., 1996; Yang
y col., 1995). AQP4 puede o ma ag egados sup amolecula es en la
memb ana denominadas OAPs (del inglés o ogonal a ays o pa icles), que
se isualizan median e mic oscopía elec ónica de c io ac u a como
conjun os ensamblados de pa ículas (Figu a 2b) (Wolbu g, 1995). M23 po
sí mismo o ma g andes OAPs en células ans ec adas (Yang y col., 1996),
mien as que M1 o ma pocos o ningún OAPs. Sin emba go, M1 puede
asocia se con M23 y o ma OAPs mix os (Figu a 2c), siendo es os de meno
amaño que los que o ma M23 po sí sola (Fu man y col., 2003). Pa ece se
que las o mación de OAPs iene de e minada po la in e acción en e los N-
e minales de M23-M23 en e e áme os, in e acción que no se p oduce en
el caso de M1 po la di e encia de esiduos de aminoácidos (C ane y
Ve kman, 2009).
8
INTRODUCCIÓN
Figu a 2. Secuencia y es uc u a de AQP4. El esquema mues a la secuencia de aminoácidos p ima ia
y ubicación en la memb ana (AQP4). Es a AQP p esen a ocho segmen os helicoidales in eg ados en la
memb ana y dos si ios de iniciación, me 1 y me 23, co espondien e a las iso o mas M1 y M23.
Te áme os de AQP4 pueden o ma ag upaciones o ogonales (OAPs) a a és de las asociaciones de
N- e minales in e molecula es en e iso o mas M23 que implican los esiduos que apa ecen en colo
mo ado (A). Fo og a ía de mic oscopía elec ónica po c io ac u a de los OAPs en la memb ana
plasmá ica (B). En una o og a ía ob enida median e el mé odo dSTORM se obse a como en los OAPs
se coexp esan las iso o mas M1 y M23 (C). Modi icado de (Papadopoulos y Ve kman, 2013).
AQP4 es el canal de agua más abundan e en el ce eb o (Papadopoulos
y col., 2004), médula espinal (Oshio y col., 2004) y ne io óp ico (Nagelhus y
col., 1998). En el ce eb o, AQP4 se localiza p incipalmen e en las
p olongaciones de as oci os subpiales que o man la memb ana glial
limi an e que ac úa como in e ase en e el SNC y el líquido ce alo aquídeo
9
INTRODUCCIÓN
(LCR), los pies de los as oci os pe i ascula es que se encuen an en la
in e ase en e SNC y sang e, y en la memb ana basola e al de los podoci os
de las células ependimales y subependimales que o man la in e ase en e
el SNC y el LCR (Nielsen y col., 1997; Rash y col., 1998). Es e pa ón de
exp esión de AQP4 en los lími es en e el ce eb o y los p incipales
compa imen os que con ienen agua sugie en que AQP4 acili a el lujo de
agua den o y ue a del ce eb o (Papadopoulos y Ve kman, 2013).
1.6 Acuapo ina 1
AQP1 se encuen a en la memb ana plasmá ica de las células
epi eliales del plexo co oideo que dan al en ículo, lo que sugie e la
pa icipación de es e canal en la sec eción del LCR. AQP1 ambién se
exp esa en las células endo eliales ascula es de odo el o ganismo pe o
es á ausen e en el endo elio ce eb o ascula a excepción de los ó ganos
ci cun en icula es. Las células epi eliales ce eb o ascula es exp esan AQP1
en cul i o y en umo es ce eb ales malignos cuando la ba e a
hema oence álica es á al e ada. El cocul i o con as oci os inhibe la
exp esión del ARNm de Aqp1 de las células epi eliales de mic o asos
ascula es. Es o sugie e que la in e acción en e los podoci os y las células
endo eliales inhibe la exp esión de AQP1 (Papadopoulos y Ve kman, 2013).

10
INTRODUCCIÓN
1.7 Acuapo ina 9
AQP9 es la acuapo ina menos abundan e en el ce eb o y su
localización no ha sido aún bien de inida debido a la baja especi icidad de
los an icue pos disponibles. Has a el momen o, se ha desc i o la p esencia
de AQP9 en neu onas de la sus ancia neg a, anici os y algunos as oci os.
Pa icipa en el anspo e de sus a os ene gé icos como glice ol y lac a o,
desempeñando po an o un papel impo an e en el con ol ene gé ico del
me abolismo ce eb al (Badau y Regli, 2004).
Figu a 3. Exp esión y localización de AQPs en el ce eb o. En el ce eb o, AQP4 se exp esa
p incipalmen e en las p olongaciones de los as oci os de la glía limi an e ex e na y en los pies de los
as oci os pe i ascula es. También se encuen a en la memb ana plasmá ica basola e al de células
ependima ias y en las p olongaciones de as oci os subependima ios de la glía limi an e ex e na.
AQP1 se exp esa en la memb ana plasmá ica del epi elio de plexo co oideo, en la ca a expues a al
líquido ce alo aquídeo. La exp esión de AQP1 y AQP4 ambién exis e en la médula espinal. Los
luga es de exp esión de AQP9 siguen sin es a cla os. Modi icado de (Papadopoulos y Ve kman,
2013).
11
INTRODUCCIÓN
1.8 Funciones de las acuapo inas en el SNC
El conocimien o de las unciones de las acuapo inas en el SNC se
de i an en g an pa e de expe imen os ealizados en a ones knockou de
AQPs (AQP-KO) pa a di e en es condiciones pa ológicas, pues o que has a la
echa no se han desc i o inhibido es de AQPs que no sean óxicos pa a el
o ganismo y ampoco han sido iden i icadas en humanos mu aciones en
AQPs que conlle en pé dida de unción de és as. Al menos es g upos han
gene ado a ones AQP4-KO que han pe mi ido desc ibi es p incipales
unciones como son el acili a el paso de agua hacia den o y hacia ue a del
SNC, mig ación de as oci os y neu oexci ación. Expe imen os in i o
desc iben la ausencia de AQP1 en as oci os de a ón, pe o sin emba go su
exp esión si se de ec a en as oci os de mono (A cienega y col., 2010),
sugi iendo es o que puede exis i una a iación en la uncionalidad o
impo ancia de AQPs en e oedo es y p ima es. A con inuación se desc ibe
más en de alle como las AQPs pa icipan de es as es unciones p incipales
en el SNC.
1.8.1 Mo imien o de agua en el ce eb o
En adul os, la ca idad in ac aneal es á comp endida po a ios
compa imen os (sang e, líquido ce alo aquídeo y los espacios in e s iciales
e in acelula es del pa énquima ce eb al) y es á odeada po un c áneo no
dis ensible. El mo imien o del agua a a és de es os compa imen os se
p oduce en espues a a cambios osmó icos y ue zas hid os á icas. Aunque
las moléculas de agua pueden a a esa las memb anas di ec amen e y en
12
INTRODUCCIÓN
meno g ado a a és de anspo ado es de glucosa y canales iónicos, AQP4
juega un papel esencial en la de e minación de la pe meabilidad al agua de
la ba e a hema oence álica (BHE). La eliminación de la exp esión de AQP4
se asocia a una educción de sie e eces la pe meabilidad al agua de la
memb ana plasmá ica en cul i o de as oci os (Soleno y col., 2004) y de
diez eces la pe meabilidad en la BHE en ce eb o de a ón (Papadopoulos y
Ve kman, 2005). La educción del 27% de la exp esión de AQP4 median e
ARN in e e en e (siRNA), causó en ce eb o de a a una disminución del 50%
en el coe icien e de di usión apa en e, lo que es consis en e con una
educción de la pe meabilidad al agua en la memb ana plasmá ica de los
as oci os (Badau y col., 2011). Sin emba go, en a ones AQP4-KO se ha
obse ado una p esión in ac aneal no mal (Papadopoulos e al., 2004) y an
sólo un pequeño inc emen o en el con enido de agua o al del ce eb o (Haj-
Yasein y col., 2011; Papadopoulos e al., 2004). Es os esul ados sugie en
que AQP4 no es necesa ia pa a mo imien os ela i amen e len os del agua
den o y ue a del ce eb o que iene luga bajo condiciones isiológicas
no males, ya que es os pueden ocu i a a és de ías independien es de
dicha p o eína. En en e medades del SNC, ales como daño ce eb al,
meningi is, umo ce eb al e hid oce alia, el lujo de agua hacia den o y
ue a del ce eb o aumen a, causando un inc emen o de la p esión
in ac aneal po el exceso de acumulación de agua en los compa imen os
in ac aneales. Es e aumen o de la p esión in ac aneal es pe judicial, ya
que puede causa isquemia ce eb al, he nia y, en úl ima ins ancia, la mue e
ce eb al (Ma ma ou, 2007; Papadopoulos y Ve kman, 2007). Es en es as
si uaciones pa ológicas en las que AQP4 acili a el anspo e de agua
ce eb al, cob ando así impo an e ele ancia uncional.
13
INTRODUCCIÓN
1.8.2 P oducción de líquido ce alo aquídeo
La idea gene al que se iene en la ac ualidad en elación a las AQPs y
su papel en la homeos ásis del LCR es que AQP1 pa icipa en la sec eción de
LCR y AQP4 en su abso ción. El LCR es sec e ado po el plexo co oideo y
abso bido a a és de las g anulaciones a acnoideas del seno enoso y o as
u as como el lujo ansependimal en el ce eb o. La p oducción de LCR
in oluc a el anspo e ac i o de Na+, ia la ATPasa Na+/K+, desde la sang e a
los en ículos, gene ando un g adien e osmó ico que impulsa el lujo de
agua. AQP1 se exp esa en la ca a apical del epi elio del plexo co oideo
(Nielsen y col., 1993). La compa ación de a ones AQP1-KO espec o a
sil es es mues an una educción de cinco eces la pe meabilidad al agua, y
un descenso del 50% en la p esión in ac aneal. En AQP1-KO la p oducción
de LCR se io educida en un 25%, sugi iendo la pa icipación de AQP1 en su
p oducción, aunque no de o ma exclusi a (Oshio y col., 2005). Po su pa e,
AQP4 p esen e en células ependima ias y as oci os subependima ios
pa ece se de e minan e en el lujo de LCR en e en ículos y pa énquima
ce eb al, no quedando cla o sin emba go el papel que desempeña en los
plexos co oideos (Mobashe i y col., 2007; Speake y col., 2003; Suzuki y col.,
2013; Vene o y col., 1999). El bene icio clínico de la inducción de AQP4, es
p edicho po un modelo de análisis de múl iples compa imen os, en el que
an sólo duplicando la pe meabilidad de AQP4 se educi ía la dila ación
en icula y la p esión in ac aneal en más de un 40%, y pod ía ene un
impac o signi ica i o en el esul ado clínico de las hid oce alias (Bloch y col.,
2006).
20
INTRODUCCIÓN
EM y aunque exis en da os de pacien es con NMO de odos los con inen es,
los es udios epidemiológicos son muy escasos y su incidencia y p e alencia
es án oda ía pob emen e es ablecidos (Mandle , 2006; Mealy y col., 2012).
La incidencia de NMO es mayo en poblaciones asiá icas, india y neg a con
espec o a la población caucásica, coincidiendo a su ez es os g upos é nicos
con una asa de pacien es con EM más baja (Cossbu n y col., 2012; Lana-
Peixo o, 2008; Ri e a y col., 2008).
La mayo ía de los pacien es que desa ollan la NMO suelen se
muje es, llegando a se la asa de incidencia de en e 3:1 o incluso 6:1 según
la población (Cossbu n e al., 2012; Mealy e al., 2012; Winge chuk, 2009).
La p e alencia de la en e medad en muje es puede suge i alguna
asociación di ec a al c omosoma X o que las ho monas sexuales juegan un
papel en el desa ollo de la NMO (Winge chuk, 2009).
La edad de inicio a ía desde la in ancia has a la edad adul a, pe o la
en e medad a ec a a los adul os, en su mayo ía jó enes, con una edad
media de inicio supe io a la de EM (Kim e al., 2011; Lana-Peixo o, 2008) y
que en unción del país de es udio, se con empla den o del ango de los 40
a 55 años (Mealy e al., 2012; Papais-Al a enga y col., 2002).
2.4.2 Clasi icación
La en e medad puede segui un cu so mono ásico o ecidi an e. La
NMO de cu so mono ásico ue la p ime a desc i a po Eugène De ic (De ic,
1894), donde la mieli is ans e sa y la neu i is óp ica ocu en
simul áneamen e o en un co o pe íodo de iempo. Sin emba go, en más del
80-90% de los casos, la NMO suele segui un cu so ecidi an e, siendo la de

21
INTRODUCCIÓN
cu so mono ásico la menos ecuen e (Ma a y Lolli, 2011; Papadopoulos y
col., 2014).
La al a especi icidad de los an icue pos IgG an i AQP4 (NMO-IgG) ha
sido u ilizada pa a expandi el espec o clínico y de neu oimagen de la NMO.
Se ha es ablecido un consenso pa a la de inición de es e nue o espec o
clínico de la NMO (NMOSD), que uni ica el concep o adicional de la NMO
jun o a las de iniciones mode nas su gidas en o no a NMOSD. Es e
consenso pe mi e un diagnós ico de la NMOSD donde ienen cabida la
se oposi i idad y se onega i idad de las mues as pa a NMO-IgG, siemp e
que es én asociadas a o as ca ac e ís icas clínicas como se mues an en la
Tabla 2 (Winge chuk y col., 2015).
C i e ios de diagnós ico pa a NMOSD con AQP4-IgG
1. Al menos una ca ac e ís ica clínica básica.
2. Tes posi i o pa a an icue pos AQP4-IgG median e mé odo de de ección (CBA
ecomendada)
3. Exclusión de diagnós icos al e na i os
C i e ios de diagnós ico pa a NMOSD sin AQP4-IgG o sin de e mina
1. Al menos 2 ca ac e ís icas clínicas básicas ocu en como esul ado de uno o más a aques y
cumple con los siguien es eque imien os:
a. Al menos una ca ac e ís ica clínica básica debe se neu i is óp ica, mieli is aguda con
LETM o sínd ome del á ea pos ema.
b. Diseminación en el espacio
c. Cumplimien o de IRM eque idas
2. Tes nega i o pa a an icue pos AQP4-IgG o es no disponible
Ca ac e ís icas clínicas básicas
1. Neu i is óp ica
2. Mieli is aguda
3. Sínd ome de á ea pos ema
4. Sínd ome del onco del encé alo agudo
5. Na colepsia o sínd ome dience álico agudo con lesiones en IRM ípicas de NMOSD
Tabla 2. Guía diagnós ica pa a la NMOSD. Tomado y modi icado de (Winge chuk e al., 2015)
22
INTRODUCCIÓN
2.4.3 C i e ios de diagnós ico y ca ac e ís icas clínicas
Pa a un diagnós ico co ec o de la en e medad, los c i e ios
es ablecidos desde 2006 de e minan que se debe cumpli que el pacien e
p esen e una mieli is aguda, neu i is óp ica y al menos uno de los siguien es
c i e ios: lesión de al menos 3 segmen os de la médula espinal, no cumpli
c i e ios de diagnós ico pa a EM o p esen a an icue pos an i-AQP4 en
sue o (Winge chuk y col., 2006).
Di e sas en e medades au oinmunes han sido desc i as en al menos
un 30% de pacien es con NMO, lo que sugie e que pe sonas con es a
condición pueden ene una p edisposición gené ica a una au oinmunidad
anómala (Iye y col., 2014). La p esencia de mu aciones en AQP4, pa ece no
ene en cuen a la suscep ibilidad a NMO (Ma iello y col., 2011), y aunque
algunos es udios pa ecen encon a elación en e alelos HLA (an ígenos
leucoci a ios humanos) y NMO (B um y col., 2010; Ma sushi a y col., 2009),
o os no han encon ado elación (Zephi y col., 2009), lo que sugie e una
suscep ibilidad gené ica compleja, mul i ac o ial, que hace que es a
en e medad sea he edable en an sólo un 3% de los casos (Ma iello y col.,
2010).
2.4.4 Pa ogénesis
La espues a de las inmunoglobulinas (IgG) a au oan ígenos e leja la
colabo ación y egulación de las células T con células B an ígeno especí icas.
El papel de las células T e ec o as, especí icas pa a AQP4, no ha sido desc i o
aún, pe o és as células pod ían con ibui al inicio en la dis upción de la
ba e a hema oence álica (Pi ock y col., 2006). En lesiones es ablecidas de
23
INTRODUCCIÓN
NMO, las células plasmá icas, un ipo de lin oci o B p oduc o de
an icue pos, p oducen IgG y exis e e idencia de un inc emen o de
p oducción in a ecal de NMO-IgG, obse ándose que a ele ados ni eles
hay co elación signi ica i a con a aques se e os de la en e medad (Io io y
col., 2011; K eme y col., 2013; Magana y col., 2009; Ve nan y col., 1997).
La in e leucina 6, ci oquina con ac i idad p oin lama o ia, mejo a la
supe i encia de las células plasmá icas, siendo mayo es sus ni eles en
plasma de pacien es con NMO que en con oles sanos. Es as células
plasmá icas se de ec an en sang e pe i é ica de pacien es con NMO y son
más nume osas en la ase de a aque de la en e medad. En expe imen os in
i o, se ha obse ado que la in e leucina 6 p omue e la p oducción de IgG
especí icas de AQP4 po células plasmá icas de i adas de sang e y LCR de
pacien es con NMO (Long y col., 2014a; McKeon y col., 2008; Pi ock y col.,
2008; Ve nan e al., 1997).
Pa a que enga luga la pa ogenicidad de las células, se equie e de la
unión de IgG al dominio ex acelula de AQP4 (McKeon y col., 2009). AQP4-
IgG es p edominan emen e del ipo IgG1, un po en e ac i ado del sis ema
del complemen o. La o mación de OAPs po AQP4 cub e un papel
impo an e en la pa ogénesis de la en e medad, ya que los an icue pos
NMO-IgG se unen con mayo a inidad a los OAPs que a los e áme os
aislados que ambién o ma AQP4 (C ane y col., 2011). El inc emen o de
es a a inidad desc i a, implica un mayo e ec o en la ci o oxicidad, en el que
la p o eína del complemen o C1q, se une con mayo e iciencia cuando AQP4
o ma es as es uc u as mac omolecula es (Phuan y col., 2012). Los
an icue pos NMO-IgG que es án unidos a e áme os de la iso o ma M1,
ápidamen e se in e nalizan en esículas po mecanismos de p o ección
24
INTRODUCCIÓN
p opios de la célula, sin emba go, los que se unen a los OAPs, o mados
p incipalmen e po M23, poseen un amaño mayo que excede la capacidad
del as oci o pa a pode se endoci ado (Be gamaschi y col., 2009). Los OAPs
pe mi i án c ea un en o no de ele ada densidad de IgG ag upados que an e
la p esencia del complemen o p oduci á una llama i a ac i ación de és e,
p omo iendo la quimio axis de leucoci os, pe meabilidad ascula con
a luencia masi a de plasma ico en IgG, complemen o y ac o euma oide,
el cual mejo a aún más la ac i ación del complemen o (McKeon e al.,
2009).
El bloqueo del lujo de agua po los au oan icue pos, pod ía explica el
p ominen e edema in amielínico obse ado en lesiones emp anas de
NMO, el cual es un p ecu so po encial de la desmielinización (A magan y
col., 2012; Be gamaschi e al., 2009).
La al e ación de la homeos asis del glu ama o es o a posible
p opiedad po encialmen e pa ógena de AQP4-IgG. El anspo ado de
glu ama o ambién llamado “exci a o y aminoacid anspo e -2, (EAAT2)”
es á unido de o ma no co alen e a AQP4 en la memb ana p esináp ica de
as oci os, po lo que se co-in e naliza an e la p esencia de AQP4-IgG. EAAT2
ealiza el 90% de la cap ación de glu ama o en el SNC. Expe imen os in i o
mues an como en cul i os de as oci os, an e la p esencia de AQP4-IgG se
educe la cap ación de glu ama o. Además, las lesiones de medula espinal
en pacien es de NMO mues an una ma e ia g is con ele ada de iciencia de
EAAT2 (Reindl y col., 2013). Es e e ec o de los an icue pos AQP4-IgG sob e el
anspo ado EAAT2, educiendo su ac i idad, iene como consecuencia el
aumen o de ni eles ex acelula es de glu ama o, los cuales esul an óxicos
pa a los oligodend oci os ocasionando su mue e, y po ello se pos ula como
25
INTRODUCCIÓN
o a posible causa de la desmielinización en NMO (Ho be ge y col., 2015;
Ki ley y col., 2014b). El á maco Ce iaxone, po en e es imulado del
anspo ado de glu ama o (EEAT2) (Ro hs ein y col., 2005), ue p opues o
pa a su uso en NMO (Ra elade y Ve kman, 2012), sin emba go, o os
au o es, desca an la elación de al os ni eles de NMO-IgG con la
disminución en la cap ación de glu ama o (Ra elade y col., 2011).
Figu a 5. Mecanismos de pa ogénesis de NMO. AQP4-IgG y las células plasmá icas p oduc o as de
es os an icue pos, a a iesan la ba e a hema oence álica hacia el SNC, donde AQP4-IgG se une a las
AQP4 de los as oci os. Es a unión implica la ac i ación del sis ema del complemen o, que conduce a
la in lamación, daño en oligodend oci os, desmielinización y mue e neu onal (Papadopoulos e al.,
2014).

26
INTRODUCCIÓN
2.4.5 De ección de an icue pos an i-AQP4 (NMO-IgG)
En la ac ualidad, son a ias las écnicas que pe mi en de ec a los
an icue pos an i-AQP4 en el sue o de pacien es, écnicas que pueden se
clasi icadas en unción de si el ensayo se ealiza sob e ejido, células o
p o eínas (T ebs y col., 2014). La de ección de an icue pos an i-AQP4 ha
a anzado conside ablemen e en los úl imos años mejo ando la sensibilidad
del diagnós ico sin comp ome e la especi icidad (Winge chuk e al., 2015).
De las écnicas desa olladas has a la echa, los esul ados ob enidos
indican que el mé odo basado en células ans ec adas con AQP4 (Cell Based
Assay, CBA) es el que pe mi e un mejo diagnós ico, con una sensibilidad de
76% y especi icidad del 99%. O os mé odos, como el que se ealiza sob e
ejidos con exp esión endógena de AQP4 (Tissues Based Assay, TBA), o
ensayos de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSo ben Assay), mues an meno
sensibilidad y especi icidad, siendo en el TBA la sensibilidad del 59% y la
especi icidad del 98%, o en los ensayos de ELISA la sensibilidad del 65% y la
especi icidad del 97% (Ruiz-Ga i ia y col., 2015).
Exis en pacien es que cumplen los c i e ios del NMOSD, en los que no
se han de ec ado an icue pos an i-AQP4, lo que supone un e dade o e o
en el diagnós ico (Ma ignie y col., 2013). La mayo ía de los pacien es que
padecen NMO en su a ian e mono ásica ienen más p obabilidad de se
se onega i os pa a an icue pos an i-AQP4 que los que p esen an la a iable
con ecaídas (Ja ius y col., 2012). Pa a una pequeña pa e de los pacien es
que p esen an ca ac e ís icas clínicas de NMO, casi odos se onega i os en
la de ección de NMO-IgG, se ha desc i o la p esencia de an icue pos con a
la glicop o eína de la mielina de oligodend oci os (MOG) (Ki ley e al.,
27
INTRODUCCIÓN
2014b; Ki ley y col., 2012; Made y col., 2011; Sa o y col., 2014). Es os
hallazgos pod ían suge i que algunos pacien es se onega i os pa a NMO-
IgG con ca ac e ís icas clínicas y de neu oimagen de NMOSD ienen una
pa ogénesis subyacen e di e en e (Ma ignie e al., 2013), aunque el papel
de los an i-MOG y o os an icue pos aún es á po de e mina (Reindl e al.,
2013). Ocasionalmen e puede ocu i que un pacien e en un p ime análisis
no p esen e an icue pos NMO-IgG, pe o que pos e io men e si los p esen e.
Aunque es e hecho pueda ene explicaciones écnicas, en algunos casos los
ni eles de an icue pos se en inc emen ados en episodios de ecaída y a su
ez disminuyen con los a amien os de inmunosup esión al que se some en
los pacien es (Ja ius y col., 2008). Exis en casos clínicos de NMO en los que
se han de ec ado an icue pos NMO-IgG en líquido ce alo aquídeo, pe o no
en sue o, aunque no esul a ecuen e (Ja ius y col., 2010; Kallu i y col.,
2010; Klawi e y col., 2009; McKeon y col., 2011). La de ección de
an icue pos NMO-IgG acili a el diagnós ico de la en e medad en es adíos
emp anos, o al menos pa a desca a como diagnós ico la escle osis
múl iple, esul ando se un a ance de g an impo ancia, ya que
obse aciones ecien es sugie en que el a amien o pa a EM como
in e e ón-β, na alizumab y ingolimod pueden se pe judiciales pa a
pacien es con NMO (Kimb ough y col., 2012; Klei e y col., 2012; Min y col.,
2012; Papeix y col., 2007).
28
INTRODUCCIÓN
2.4.6 T a amien o
Las e apias pa a a a la NMO consis en en educi al mínimo la
discapacidad neu ológica ali iando los a aques agudos y p e iniendo de las
exace baciones u u as. Las e apias agudas es án diseñadas pa a minimiza
las lesiones y acele a la ecupe ación, mien as que las e apias p e en i as
se cen an en la educción de la ecuencia y se e idad de los a aques.
Pa a a a a aques agudos suele aplica se un a amien o basado en
me ilp ednisolona in a enosa y plasma é esis. Los co icos e oides ienen
mul i ud de e ec os an iin lama o ios e inmunosup eso es, incluyendo la
educción de lin oci os y monoci os ci culan es; disminución de la exp esión
de moléculas de adhesión celula y me alop o einasas; y la al e ación de la
ansc ipción de ci oquinas p oin lama o ias.
Pa a la p e ención de los a aques, se aplica una e apia
inmunosup eso a desde el p ime o, debido a la al a p obabilidad de
epe iciones. Las e apias p e en i as se u ilizan pa a ago a poblaciones de
células inmunes, disminui an icue pos AQP4-IgG ci culan e, o in e e i en
la p oli e ación celula inmune o de ac i ación. Cu iosamen e, los agen es
más comúnmen e usados, aza iop ina, mico enola o y i uximab, se di igen
p incipalmen e a los lin oci os y pa ecen disminui la ac i idad de la
en e medad sin e ec os consis en es sob e los í ulos de AQP4-IgG. La
espues a clínica sugie e que los lin oci os pod ían p omo e la ac i idad de
la en e medad a a és de di e sas y complejas unciones, incluyendo la
p esen ación de an ígenos, la p oducción de ci oquinas p oin lama o ias y
al e ación de edes inmunes egulado as (Papadopoulos e al., 2014).
29
INTRODUCCIÓN
Exis en o os a amien os que esul an e ec i os pa a a a la
escle osis múl iple pe o que sin emba go pueden empeo a el cu so de la
NMO. Un ejemplo es el caso del na alizumab, un an icue po monoclonal
di igido con a la in eg ina α4β1 VLA-4 ( e y la e an igen 4). Se ha desc i o
que el na alizumab no iene e ec o o incluso p oduce un empeo amien o de
la en e medad en pacien es con NMO se oposi i os pa a NMO-IgG (Ba ne
y col., 2012; Klei e e al., 2012) y ambién en pacien es NMO se onega i os
(Ki ley y col., 2014a). En un es udio de 5 pacien es con NMO a los cuales se
les a ó con na alizumab, se egis a on 9 ecaídas y un inc emen o en la
Escala Expandida del Es ado de Discapacidad (EDSS) de 4 a 7 de media
(Klei e e al., 2012). Las lesiones obse adas du an e el a amien o con
na alizumab mos a on una desmielinización ac i a, una se e a in il ación
de neu ó ilos y eosinó ilos y mue e de as oci os (Ba ne e al., 2012). El
na alizumab puede inc emen a la ac i idad de la en e medad a causa del
inc emen o del núme o de células T p oin lama o ias pe i é icas o
eosinó ilos (Polman y col., 2006) , pudiendo es os úl imos mig a al SNC y
ag a a la o mación de la lesión (Lucchine i y col., 2002; Zhang y Ve kman,
2013) o acili a la es abilización de células plasmá icas de la médula ósea
especí icas de AQP4 (Chu y col., 2011).
2.4.7 AQP1 en NMOSD
Va ias publicaciones han desc i o que además de AQP4, los as oci os
del SNC ambién exp esan abundan e AQP1 en la supe icie (Gao y col.,
2012; Misu y col., 2013; Sa oh y col., 2007). Especialmen e se ha obse ado
una ele ada exp esión en á eas p opensas a desa olla lesiones
OBJETIVOS

38
OBJETIVOS
OBJETIVOS
Dos g andes Obje i os o ien a on el abajo que aquí se p esen a.
- El p ime o ue en ende el papel de AQP4 en la pa ología de la
Neu omieli is óp ica (NMO), y desa olla un sis ema de diagnós ico,
especí ico, sensible, ápido y cuan i a i o, pa a la NMO median e la
de ección de an icue pos an i-AQP4 (y an i AQP1) en sue o de
pacien es.
- El segundo ue es udia la pa icipación de las p incipales
acuapo inas de ce eb o en la homeos asis del líquido
ce alo aquídeo (LCR) en si uación con ol y bajo el es ímulo
hipóxico; y disce ni el posible papel de es as p o eínas en el
desa ollo de la hid oce alia, usando modelos animales y analizando
mues as de LCR de humanos.
MATERIALES Y MÉTODOS

42
MATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y MÉTODOS
1. Técnicas de cul i o celula
1.2 Condiciones de cul i o de la línea celula HEK293 (células
emb iona ias de iñón humano)
La línea celula HEK293 ue u ilizada en los expe imen os de de ección
de an icue pos an i-AQP4 y an i-AQP1 de sue os de pacien es.
La composición del medio u ilizado pa a su cul i o ue la siguien e:
Pa a el man enimien o de las células, an o las sil es es (wild ype)
como las líneas de sob eexp esión de AQP1 y AQP4, se semb aban en placas
de polies i eno a adas pa a cul i o celula (Nunc, Dinama ca) de 10 cm de
diáme o, con 10 ml del medio desc i o an e io men e y se man u ie on en
el incubado a 37ºC, 5% CO2 y sa u ación de humedad.
Los pases se ealizaban cada 4 días, cuando alcanzaban una
con luencia del 90-95%, a una dilución 1:5 u ilizando ipsina 0,25% (Sigma,
EEUU) pa a despega las células. Las ans ecciones se ealizaban en e los
pases 3 y 15.
•DMEN (Dulbecco’s Modi ied Eagle’s Medium) (GIBCO)
•1% Penicilina/Es ep omicina (10000 U/ml) (BioWhi ake )
•10% Sue o e al de e ne o (GIBCO) inac i ado 30 min a 65ºC.
Medio de cul i o - HEK293
43
MATERIALES Y MÉTODOS
1.3 Cul i o p ima io de plexo co oideo de a a
1.3.1 Disección y dispe sión de ejido
Pa a la elabo ación del cul i o p ima io de plexo co oideo de a a, se
pa ió de los ejidos ex aídos como se de alla en el apa ado 4.3,
conse ados en un eppendo de 1,5ml con 0,5 ml de HBSS (Gibco) ío y
es é il. Los ejidos ue on agmen ados mecánicamen e en campana de
ex acción de lujo (Tels a Bio II A) con unas ije as es é iles ipo cas o iejo
con la pa e ac i a cu a (WPI, 501234) du an e al menos 5 minu os. Con
es e p ocedimien o oceamos el ejido, pe o pa a ob ene una dispe sión a
ni el de célula, se incubó el ejido en un ubo de 15ml con 1 ml de solución
de diges ión que con enía p o easas (p onase, Calbiochem) a una
concen ación de 4mg/ml. Es a solución ue p e iamen e il ada con un
il o de 0,22µm pa a man ene las condiciones de es e ilidad. Se dejó
incuba en el baño a 37ºC du an e 10 minu os. A con inuación se de u o la
diges ión añadiéndole 4ml de HBSS. Pa a limpia el homogenado celula se
cen i ugó a 800x g du an e 5 minu os a 4ºC. Pa a una mayo limpieza, as
desecha el sob enadan e, se esuspendió en 6ml de HBSS y se epi ie on las
mismas condiciones de cen i ugado. T as es o, se desca ó el sob enadan e
y el pelle se esuspendió en 2ml de medio de cul i o, siendo la composición
de és e:
44
MATERIALES Y MÉTODOS
Seguidamen e, pa a e i a acúmulos, se dispe sa on mecánicamen e
las células con ayuda de una je inga y aguja de 20 gauges, pasándolas a
a és de és a al menos 10 eces. Pa a el ecuen o de células ue on
e i ados 10 µl que ue on mezclados a su ez con 10µl de azul de ipano
(T ypan Blue, Sigma), p oduc o que iñe las células mue as. Se con a on
eñidas con “ ipan blue” con con ado de células (ma ca), ob eniéndose
no malmen e suspensiones en o no a un o al de 4x105 células/ml.
1.3.2 Cul i o
Las células se semb a on en placas de 35mm (ma ca) p e iamen e
a ados con colágeno ipo I (ma ca). El a amien o de las placas se
ealizaba del siguien e modo: Se p epa aba una dilución 1:10 del colágeno
en agua es é il con la que se cub ían comple amen e la supe icie de las
placas, dejándose du an e 24 ho as a empe a u a ambien e. T anscu ido
es e iempo, se le e i aba el colágeno y se dejaba seca en condiciones de
es e ilidad.
•DMEN (Dulbecco’s Modi ied Eagle’s Medium) (GIBCO)
•1% Penicilina/Es ep omicina (10000 U/ml) (BioWhi ake )
•10% Sue o e al de e ne o (GIBCO) inac i ado 30 min a
65ºC.
•Fac o de c ecimien o epidé mico (EGF) (Sigma Ald ich)
Medio de cul i o - plexo co oideo-
51
MATERIALES Y MÉTODOS
Figu a 10. Clonación de las iso o mas M1 y M23 de AQP4 en pEGFP-N1. En el esquema se mues a la
es uc u a de las cons ucciones pEGFP-N1-AQP4M1 y pEGFP-N1-AQP4M23 sucesi amen e. El plásmido
pEGFP-N1 codi ica una a ian e de la GFP na i a, op imizada pa a ob ene una mayo exp esión y
luo escencia más b illan e en células de mamí e os. La egión MCS se encuen a en e el p omo o
CMV y la secuencia codi ican e de EGFP, así los genes clonados en el MCS se exp esa án usionados
po el ex emo N- e minal a la p o eína EGFP. Rep esen ación de los plásmidos que se desa olla on,
donde se mues a la clonación de las iso o mas M1 y M23 po sepa ado en el ec o pEGFP-N1. El
ec o posee un gen de esis encia a kanamicina, impo an e pa a la selección de colonias bac e ianas
que po an el plásmido, y ambién un gen de esis encia a neomicina.
Pa a la clonación de las iso o mas M1 y M23 de AQP4 se usa on
écnicas básicas de biología molecula en e las que se incluyen: pu i icación
de agmen o de ADN desde geles de aga osa con el ki QIAEX II (QIAGEN,
Alemania); eacciones de ligación con T4 ligasa (P omega, EE.UU.),
ans o mación de células compe en es E. coli DH5α, ex acción de ADN
(mini-p ep y maxi-p ep (QIAGEN)) de colonias ans o man es, análisis y
con i mación de las cons ucciones po enzimas de es icción y
secuenciación.

52
MATERIALES Y MÉTODOS
2.2 T ans ecciones de cul i os celula es de HEK 293
Las ans ecciones en líneas celula es se ealiza on median e
lipo ección (Lipo ec amine 2000, In i ogen) (Figu a 11). El día an e io a la
ans ección, al cul i o se le sus i uía el medio po el mismo sin sue o ni
an ibió icos, ya que el sue o a ec a a la ac i idad de la lipo ec amina y los
an ibió icos pueden daña la célula po los po os que p oduce en la
memb ana plasmá ica. Pa a la o mación de los complejos plásmido-
lipo ec amina se ealiza on en medio OPTI-MEM (Gibco), usando los
olúmenes indicados po el ab ican e. La mezcla se homogeneizó y se
incubó du an e 20 min a empe a u a ambien e ( .a.). Es a mezcla se añadió
go a a go a en la placa que con enía el cul i o. Las placas se incuba on a
37ºC du an e 6 h. T anscu ido es e iempo, se le sus i uía el medio po el
DMEN comple o.
Figu a 11. P oceso de lipo ans ección.
53
MATERIALES Y MÉTODOS
2.3 Cul i os es ables HEK293-pEGFP-N1-AQP4
Median e el p ocedimien o de ans ección, se ob iene un cul i o
ansi o io, pe o el in e és inal e a ene un cul i o es able. Pa a ello, en el
p ime pase de las células se semb a on a una dilución ele ada (1:30), de
es e modo las células c ece ían lo su icien emen e dispe sas como pa a
pode selecciona las. T as unos 4 días de c ecimien o, se p ocedía a pica las
colonias o madas de la siguien e mane a: En las condiciones máximas de
es e ilidad, bajo una lupa (Olympus SZX10), con una pipe a P10, se iban
e i ando colonias aisladas y es as se semb aban di ec amen e en placa de
24 pocillos (Nunc) con medio DMEN comple o más gene icina (20 mg/ml)
(G418, Gibco). La placa se incubaba a 37ºC. Los cul i os es ables se
ealiza on con las ans ecciones del clon pEGFP-N1-AQP4, cons ucción que
lle a asociada al gen de in e és el gen pa a la p o eína luo escen e, EGFP
(Enhanced G een Fluo escen P o ein). Es a simul aneidad de exp esión nos
pe mi i á e bajo el mic oscopio in e ido de luo escencia (Olympus IX-71)
con el il o FITC (Fluo escein iso hiocyana e) qué células de las que hemos
seleccionado exp esan la AQP4, ya que al mic oscopio se e án e des.
T anscu idos al menos 4 días, se e i icaba la pu eza de los cul i os
seleccionados bajo el mic oscopio y se seleccionaban como candida as
de ini i as pa a el cul i o es able, semb ándolas en una nue a placa de un
amaño mayo .
54
MATERIALES Y MÉTODOS
2.4 Wes e n Blo
2.4.1 Ex acción de p o eínas
T as los di e en es a amien os a los que ue on expues os las células,
las p o eínas se ex aje on del siguien e modo: Las células e an la adas con
PBS ío a pH 7.4 y se ecogían en 1ml de PBS 1x con ayuda de un ecolec o
(cell sc ape , Sa s ed ). Las células esuspendidas se ecogían en un
eppendo y se cen i ugaban du an e 5 min a 300 x g a 4ºC. Pa a la
ex acción de p o eínas del plexo co oideo, ambién se ealizaba un paso de
cen i ugación pa a elimina los es os de PBS p esen e en la mues a.
Los pelle s ob enidos e an esuspendidos en un ampón de ex acción
de p o eínas. En el caso del ejido, pa a una mejo disg egación, se
pipe eaba epe idas eces has a deja de ap ecia a simple is a la
mo ología memb anosa. T as 5 min en hielo las mues as se
homogenizaban con un ó ex du an e 10 segundos y se cen i ugaba a
elocidad máxima (Eppendo , 5415R) a 4ºC du an e 15 min. Finalmen e se
ecogía el sob enadan e y conse aba a -20ºC has a su uso.
La concen ación de p o eínas se de e minaba po el mé odo
B ad o d u ilizando el ki come cial Bio ad P o ein Assay (Bio ad, EEUU).
2.4.2 Elec o o esis SDS-PAGE, ans e encia e inmunode ección
Pa a el análisis de p o eínas po wes e n blo se usa on 20 µg de
p o eínas o ales. En p ime luga se desna u alizaban some iéndolas a
choque é mico de 95ºC du an e 5 min en ampón de ca ga, pa a co e las
55
MATERIALES Y MÉTODOS
en un gel de poliac ilamida al 10% bajo condiciones desna u alizan es y
educ o as (SDS-PAGE) u ilizando el sis ema Mini-p o ean (Bio ad). La
elec o o esis se ealizó a 150mV en la misma solución de ca ga ( e abajo
su composición).
Los geles se ans e ían a memb anas PVDF (poli luo u o de
inilideno; Hybond-P; Ame sham Biosciences, EEUU), p e iamen e ac i adas
con me anol, en un sis ema de ans e encia semi-seca (Sigma) du an e 2
ho as a 52,8 mA y u ilizando una solución de ans e encia, cuya
composición se indica a con inuación.
T as la ans e encia las memb anas se pasaban a 0.1% Tween 20 en
PBS (PBTw 0.1%) y se bloqueaban du an e 2 ho as en solución bloquean e
cuya composición se desc ibe abajo, pa a luego se incubadas du an e oda
la noche a 4ºC con el an icue po p ima io a dilución óp ima (Tabla). T as la
incubación con el an icue po 1º las memb anas se la aban 4 eces en PBTw
0.1% du an e al menos 5 min e incubaban 1 ho a a .a. en solución
bloquean e con el an icue po secunda io conjugado con pe oxidasa a la
dilución óp ima (Tabla). Finalmen e, se hacían 4 la ados de 5 min en PBTw
0.1% y se p ocedía al e elado po quimioluminiscencia u ilizando el ki ECL
PLUS Wes e n Blo De ec ion Sys em (GE Heal hca e, EEUU) siguiendo las
ins ucciones del ab ican e. La luo escencia emi ida se de ec aba median e
el lec o Typhoon 9400 Va iable Mode Imagen y se cuan i icaba u ilizando el
p og ama Image J (NIH).
56
MATERIALES Y MÉTODOS
2.5 Análisis de exp esión de ARN mensaje os
2.5.1 Ex acción de ARN o al
Los es udios de exp esión génica se lle a on a cabo median e la
ex acción de ARN o al de los ejidos o células en cul i os p ima ios de PC.
La can idad de ma e ial dependió del expe imen o y del ipo de mues a.
El a amien o del ma e ial, an o en la disg egación como en el
p ocesado pa a la ex acción de ARNm ue di e en e según el caso:
Cul i o p ima io de plexo co oideo
Se añadía 1 ml de TRIzol (In i ogen) al cul i o celula y las células se
le an aban de la placa con la ayuda de un sc ape . Una ez esuspendidas, el
homogeneizado se ecogía con una pipe a de la placa y se pasaba a un ubo
eppendo lib e de ARNasa. A con inuación se incubaba du an e 5 minu os a
•Tampón de ex acción de p o eínas:50 mM HEPES pH 7.3 (ajus ado
con KOH), 5 mM EDTA pH 8, 250 mM NaCl, 5 mM DTT, y 0.2 % NP-40.
Se le añadía jus o an es de la ex acción de p o eínas, un cock ail de
inhibido es de p o eínas (Sigma) a una concen ación inal de 1/100,
o o anada o sódico (Na3VO4) y luo u o de enilme il sul onilo
(PMSF) a una concen ación inal de 1mM.
•Tampón de ca ga:62.5 mM T is-HCl pH 6.8, 10% glice ol, 2% SDS,
100 mM DTT y 0.004% B omophenol blue.
•Tampón de elec o o esis:25mM T is, 192mM glicina y 0.1% SDS.
•Solución de ans e encia:25 mM T is, 192 mM glicina y me anol al
20 % ( / ).
•Solución bloquean e: 5% (p/ ) leche desna ada en pol o (Cen al
Leche a As u iana, España) en PBTw-0.1%
Soluciones u ilizadas

57
MATERIALES Y MÉTODOS
.a. Con el in de sepa a las p o eínas se añade 200 μl de clo o o mo po
cada ml de TRIzol. Se agi aba igo osamen e y dejaba 2-3 minu os a .a. A
con inuación la mezcla se cen i ugaba a no más de 12000 x g 15 min a 4ºC.
T as la cen i ugación se podía obse a es ases bien di e enciadas, de las
cuales se ecogía cuidadosamen e la ase supe io acuosa y pasaba a un
eppendo limpio. Se añadían 500 μl de isop opanol pa a p ecipi a el ARN
(500 μl/ml de TRIzol), agi ándolo sua emen e e incubando 10 minu os a .a.
y e mina cen i ugando a 12000 x g 10 minu os a 4°C. El pelle de ARN se
la aba con e anol 75% io y se cen i uga a 7500 x g, y se deja seca en hielo
pa a esuspende lo inalmen e en agua desionizada lib e de ARNasa.
Plexo co oideo
El ins umen al u ilizado pa a la ci ugía y disección se a ó
p e iamen e con e anol 70% y con RNaseZap (Ambion). Las soluciones
u ilizadas se a a on con Die ilpi oca bona o (DEPC, Sigma) pa a inhibi las
ARNasas. Los PC se ecolec aban en un eppendo lib e de ARNasas, se
congelaban inmedia amen e en ni ógeno líquido y se gua daban a -80ºC
has a ealiza la ex acción del ARN.
La ex acción se ealizó median e el ki RNeasy Mic o Ki (Qiagen). A la
mues a se le añadía 350μl de solución de lisis RLT (Qiagen) con 3,5μl de β-
me cap oe anol (Sigma) y se homogenizaba en el poli ón (P o Scien i ic,
Inc-02-07075). La ex acción se con inuaba según las indicaciones del
ab ican e.
La can idad de ARNm se cuan i icó midiendo la densidad óp ica a 260
nm en el NanoD op 2000 (The mo Scien i ic, EE.UU.). Las mues as se
gua daban a -80°C has a su u ilización.
58
MATERIALES Y MÉTODOS
2.5.2 Re o ansc ipción
La ansc ipción in e sa siemp e se inició con 5 μg de ARN en el caso
de las células, p e iamen e a ado con DNasa I (Roche, Alemania) a in de
elimina el ADN genómico con aminan e. En el caso del plexo pa imos de 1
μg a causa de la poca can idad ob enida. La e o ansc ipción se lle ó a
cabo usando el ki Supe Sc ip II RNase H- e e se ansc ip ase (In i ogen).
El ARN se incubaba con una mezcla de 50 ng de Random Hexame s y 1mM
de dNTPs, du an e 5 min a 65°C. Pos e io men e se añadía a la mezcla 5mM
MgCl2, 10mM DTT, 40U de inhibido de RNasas y 50U de la enzima
Supe Sc ip II. Es a mezcla se incubaba a 25°C du an e 15 min, después a
42°C du an e 50 min y po úl imo se inac i aban las enzimas incubando a
72°C du an e 15 min. Se lle aba a cabo un paso opcional de eliminación de
ARN añadiendo 1 μl de ARNasaH e incubando a 37ºC du an e 20 min. El ADN
complemen a io (ADNc) ob enido se conse aba a -20ºC has a su uso.
2.5.3 PCR cuan i a i a o en iempo eal (PCRq)
La ampli icación del ADN en una eacción de PCRq iene es ases bien
di e enciadas: exponencial, lineal y de mese a. La moni o ización de dichas
ases en iempo eal es posible median e el empleo de luo oc omos como
el SYBR G een (Applied-Biosys ems); es a molécula se in e cala en el su co
meno de la doble hélice de ADN y luo esce cuando es i adiada con luz
ul a iole a.
59
MATERIALES Y MÉTODOS
Figu a 12. Dibujo que mues a el p oceso de unión del SYBR G een a las nue as cadenas de ADN
sin e izadas.
La cuan i icación po PCR a iempo eal se basa en el hecho de que,
du an e la ase exponencial de la eacción, la can idad de ADN ampli icado
es di ec amen e p opo cional a la can idad de ADN molde inicial. El
pa áme o p incipal que nos a a pe mi i la cuan i icación es el
denominado “C ” (Th eshold Cycle), el ciclo en el cual comienza a de ec a se
la ampli icación del ADN.
Las eacciones de PCR cuan i a i a se ealiza on u ilizando el sis ema
“ABI P ism 7000 y 7500 Sequence De ec ion Sys em” (Applied-Biosys ems,
Ingla e a). El p o ocolo op imizado de PCR, según las ecomendaciones del
ab ican e, consis ió en una p ime a ase de 10 min a 95°C y una segunda
con 45 ciclos de 15 seg de desna u alización a 95°C y 1 min de ampli icación
a 60°C.
Los oligonucleó idos se diseña on con el p og ama “P ime Exp ess”
Ve sión 2.0 (Applied-Biosys ems). Cada pa eja de oligonucleó idos ue on
diseñados pa a gene a un amplicón de no más de 150-200 nucleó idos, al
y como ecomienda el ab ican e pa a una óp ima e iciencia de la eacción.
En la Tabla 5 se mues a un lis ado de los oligonucleó idos u ilizados pa a la
ampli icación de los di e en es genes analizados po PCRq.
60
MATERIALES Y MÉTODOS
Las eacciones de PCR se ealiza on po iplicado en un olumen o al
de 30 μl que con enía 15 μl de Mas e mix SYBR G een (Applied-Biosys ems),
150-300nM de oligonucleó idos especí icos y 0,1-1 μl de ADNc.
T as el p o ocolo de ampli icación, se incluyó un paso adicional que
consis ió en un aumen o p og esi o de la empe a u a de 60 a 95°C pa a
ob ene la “cu a de disociación”. Con es e p o ocolo se ob iene la
empe a u a de disociación o Tm (Tempe a u e o mel ing) del agmen o de
ADN ampli icado. La cu a de disociación pe mi e, po un lado, comp oba si
la Tm ob enida se co esponde con el alo eó ico pa a el amplicón y, po
o o, di e encia los p oduc os especí icos de la ampli icación de los p ime -
dime s. En odos los expe imen os ealizados se comp obó que las cu as de
disociación mos asen un pico único de luo escencia y que coincidie a con
el alo eó ico de la Tm pa a cada agmen o ampli icado.
Tabla 5. Oligonucleó idos diseñados pa a la PCRq. En la abla se mues an las secuencias de los
oligonucleó idos sense y an isense diseñados pa a la PCR cuan i a i a.
Pa a el análisis de los esul ados se empleó el mé odo de
cuan i icación ela i a. No obs an e, siemp e se de e minó la e iciencia de
Gen
Sense 5’ 3’
An isense 5’ 3’
AQP4 (m)
GCGGTGGGGTAAGTGTGGA
TTCTCCACGGTCAATGTCA
AQP4 ( )
TGGCAGGTGCACTTTACGAGT
CAGCTTTGCTGAAGGCTTCCT
AQP1 (m)
TTCACTTGGCCGCAATGA
CCAGCTGCAGAGTGCCAAT
AQP1 ( )
CCATTGACCACTGGCATAGTACA
AGTGTCCTGACCTGTGAAGTGAGTA
AQP9 (m)
GGAAAACTGCTCGTCGTAGG
CCCAGGTTTCTGGAGTCAAA
18s (m)
AACGAGACTCTGGCATGCTAA
GCCACTTGTCCCTCTAAGAAGT
HPRT ( )
AGTCCCAGCGTCGTGATTAG
CCATCTCCTTCATGACATCTCG
α4 INTEG
GGCAAGGAAGTTCCAGGTTACAT
ATGCTTCCTGTAATCACGTCAGAA
CYCLO
ATGGCAAATGCTGGACCAAA
CATGTCGTCCCAGTTGGTAACA
β-ACTIN
AGGCCAACCGTGAAAAGATG
GCCTGGATGGCTACGTACATG
67
MATERIALES Y MÉTODOS
Los oedo es ue on suminis ados y es abulados po el Animala io de
la Uni e sidad de Se illa y po el Se icio de P oducción y Expe imen ación
Animal del Ins i u o de Biomedicina de Se illa (IBiS). La es abulación se
ealizó en jaulas en iladas, con empe a u a cons an e (22±1ºC), con ciclos
al e nan es de luz-oscu idad de 12 h, y con lib e acceso al alimen o y al
agua. Pa a el manejo expe imen al y su pos e io sac i icio los animales
ue on anes esiados median e inyección in ape i oneal de ioba bi al
(B/B aun), a una dosis eu anásica de 200 mg/kg en el caso de las a as, o
median e dislocación ce ical en el caso de los a ones. Ambas d ogas
ue on suminis adas po la Fa macia del Hospi al Vi gen del Rocío. Todos
los animales ue on manipulados y a ados de acue do a la guía de
cuidados de animales de labo a o io del Consejo Comuni a io Eu opeo
(86/609/EEC). Todos los p ocedimien os ue on ap obados po el Comi é
É ico de In es igación con Animales de la Uni e sidad de Se illa.
4.1 PCR con encional pa a geno ipado de a ones
4.1.1 Ra ones hid oce álicos hop gai (hyh)
El geno ipado de los a ones hid oce álicos se ealizó median e una
PCR es ánda , seguida de una diges ión enzimá ica (L.F. Bá iz e al.). En
p ime luga se ealizaba la PCR pa a ampli ica la secuencia del gen Napa,
ob eniéndose an o en homocigo os pa a la mu ación como en sil es es, un
agmen o de ADN del mismo amaño (108 pb). Pa a pode disce ni en e
un geno ipo u o o, e a necesa io ealiza una es icción de la secuencia
ampli icada po PCR con la enzima de es icción BspHI, ya que la secuencia

68
MATERIALES Y MÉTODOS
que econoce es a enzima se e modi icada en la mu ación, ealizándose
únicamen e el co e en el gen sil es e (Figu a 7).
L.F.Bá iz e al.
Figu a 15. P ocedimien o de geno ipado en a ones hid oce álicos hop gai (hyh).
69
MATERIALES Y MÉTODOS
4.1.2 Ra ones AQP1-KO
El geno ipado de los a ones se ealizó median e PCR es ánda , usando
cebado es o “p ime s” especí icos (Ma e al, 1998) que pe mi en iden i ica
a los a ones homocigo os KO (-/-) po la ampli icación de una banda de 460
pa es de bases, a los homocigo os (+/+) po una banda de 530 pb y a los
he e ocigo os (+/-) median e la ampli icación de las dos bandas espec i as.
4.2 Exposición de a ones a hipoxia e hipe capnia
Los animales se some ie on a hipoxia c ónica del 10% de O2 usando
cáma as he mé icas (COY Labo a o y P oduc s INC) (Figu a 16). La cáma a se
compone de una caja es anca de me ac ila o, que dispone de una esclusa
con doble pue a, que pe mi e la en ada y salida de jaulas de animales sin
que se al e en las condiciones en el in e io del equipo. También dispone de
un senso de O2 que pe mi e la moni o ización con inua de los ni eles de
es e gas. Es e senso egula la inyección an o de N2, pa a disminui la
p esión pa cial de O2, como de ai e pa a aumen a la; consiguiéndose así
man ene es ables los ni eles eque idos de hipoxia. Pa a con ola la
empe a u a y e i a que aumen e en el in e io de la cáma a se dispone de
ai e acondicionado en la habi ación, pe maneciendo la empe a u a a
22±1°C. La humedad ela i a del ai e se man iene en e el 70-80% po dos
sis emas; uno que p oduce condensación de agua median e en iamien o y
o o que pe mi e la eci culación del ai e po unas columnas de gel de sílice
(Pan eac, España). Los ni eles de CO2 en la cáma a pe manecen po debajo
70
MATERIALES Y MÉTODOS
del 0,1% median e un sis ema que il a el ai e po columnas de Sodaso b
(G ace lab., F ancia).
Los animales con oles man enidos en no moxia (21% de oxígeno) se
some ie on a las mismas condiciones en la cáma a de hipoxia, siendo la
única a iación la de los ni eles de oxígeno.
Figu a 16. Cáma a de hipoxia. Fo og a ía de la cáma a de hipoxia u ilizada pa a some e a los
animales a un a amien o c ónico de hipoxia, pudiendo con ola es ables a iables como la
humedad.
4.3 Ob ención de ejidos
Los a ones ue on sac i icados median e dislocación ce ical,
mien as que a las a as se les adminis ó una dosis eu anásica de ioba bi al
seguido del uso de la guillo ina.
Pa a la ob ención del plexo co oideo, se ex aía el ce eb o comple o y
se pasaba a una placa con PBS 1x io. Con la ayuda de un bis u í y unas
pinzas, se ealizaba un co e pa a sepa a el ce ebelo, desechándose. O o
co e e a ealizado sagi almen e, di idiendo el ce eb o en dos y que
71
MATERIALES Y MÉTODOS
pe mi ía accede di ec amen e al en ículo la e al como se indica en la
Figu a 17. Con la ayuda de unas pinzas se accedía al en ículo donde se
encuen a el plexo co oideo, siendo ex aído con sumo cuidado pinzando en
el luga de anclaje de és e. El plexo e a conse ado en ni ógeno líquido y
luego a -80ºC en el caso de que se ue a a u iliza en expe imen os de ARN o
p o eínas, o se conse aban en PBS ío pa a se u ilizado inmedia amen e
en écnicas inmunohis oquímicas o cul i o p ima io.
Figu a 17. Fo og a ía de ce eb o de a a. En las imágenes se mues a indicado los luga es de co e
pa a deja el en ículo la e al a la is a y así pode accede ácilmen e al plexo co oideo.
72
MATERIALES Y MÉTODOS
5. Técnicas inmunológicas
5.1 Inmunohis oquímica
Es a écnica ue u ilizada pa a e i ica la p esencia de AQP1 en el
plexo co oideo. Pa a ello, se ex aje on PC de a ones sil es es y KO pa a
AQP1 de la línea de a ones AQP1-KO. Pa a es e ensayo
inmunohis oquímico ue necesa io bloquea p e iamen e la enzima
pe oxidasa endógena del ejido, lo cual se ealiza po incubación del ejido
du an e 30 minu os con pe óxido de hid ógeno (Fluka) al 0,4% en PBS 1x. A
con inuación se bloquea du an e una ho a con una solución PBS 1x con 10%
de sue o bo ino (Gibco), 0,1% de BSA (albúmina sé ica bo ina) y 0.3% de
T i ón X- 100 (Sigma). Se incuba el ejido con an icue po p ima io policlonal
de conejo an i-AQP1 (Tabla 8) oda la noche a 4ºC, seguido del an icue po
secunda io an i-conejo bio inilado (1:1, Ki Dako Sys em-HRP DAB) du an e
2 ho as a .a. En el paso siguien e se p oduce la unión de los complejos de
a idina-bio ina-pe oxidasa al secunda io bio inilado pa a ampli ica la señal.
Seguidamen e se p ocede al e elado de 3 minu os median e la eacción de
la pe oxidasa con un sus a o c omogénico, la diaminobencidina (DAB),
apa eciendo un p ecipi ado ma ón allá donde exis a exp esión de AQP1.
5.2 Inmuno luo escencia indi ec a
Se ealiza on ensayos de inmuno luo escencia sob e plexos co oideos,
pa a el es udio de localización de AQP1 y 4. Es e ensayo se ealizaba el
mismo día que se ex aían los plexos. Se incubaban du an e 10 min en

73
MATERIALES Y MÉTODOS
pa a o maldehido (PFA) (Sigma) al 4% pa a ija el ejido. Seguidamen e se
la a on 3 eces en PBS 1x du an e 5 min, con inuando con el bloqueo con
una solución de PBS 1x con 5% de BSA du an e 1 ho a a .a. Se incuba on
con los an icue pos p ima ios de AQP1 y 4 (Tabla 8); y el sue o de pacien e
NMO-IgG+ y NMO-IgG -, du an e oda la noche a 4ºC. Al día siguien e, se
la aban los ejidos con 0.1% de T i ón X-100 (Sigma), 3 eces du an e 5 min
cada una. De es e modo, a la ez que se la aba el ejido ambién se
pe meabilizaba, paso que has a aho a e a p escindible debido a que las
acuapo inas son p o eínas de memb ana y se puede e a ec ada su
de ección. Sin emba go, pa a la de ección de p o eínas como TTR
( ans i e ina), e-cadhe ina es necesa io pe meabiliza el ejido. T as la
pe meabilización, se ealizaba un nue o bloqueo con solución PBS1x con 5%
de BSA y 0,1% T i ón X-100 du an e 1 ho a a .a. Seguidamen e se incubaba
con el an icue po p ima io de e-cadhe ina y TTR ( abla 8) du an e oda la
noche a 4ºC. Al dia siguien e se la aba con PBS1x, 3 eces, 5 min. A
con inuación, se incubaba con el an icue po secunda io co espondien e
(Tabla 9) en solución de bloqueo du an e 1 ho a a .a.. T anscu ido es e
iempo, se la aban los ejidos 3 eces con PBS 1x. Po úl imo se incubaba
con dapi (4 ',6-diamino-2- enilindol, 1:1000) du an e 10 min a .a. y se
p ocedía a mon a los ejidos sob e po as con solución Dako (S302380-
Dako).
5.3 Inmuno luo escencia indi ec a – Mé odo de diagnós ico
Una ez pues o a pun o el cul i o es able con la p o eína de in e és
sob eexp esándose, es as p epa aciones se empleaban en los ensayo de
74
MATERIALES Y MÉTODOS
inmuno luo escencia pa a la de ección de an icue pos. En el caso de la
de ección de an icue pos an i-AQP4 (NMO-IgG) en sue o de pacien es, es e
ensayo se ía como diagnós ico pa a la neu omieli is óp ica (NMO), debido
a la exclusi a p esencia de an icue pos an i-AQP4 en es os pacien es. En el
caso de AQP1, su de ección, se usó con in e és más desc ip i o que clínico.
Las células se semb aban en placas con pocillos de 15,6 mm de
diáme o con cub es a ados con Poly-L-lysine solu ion (Sigma) al 10%. Se
dejaban du an e 24 ho as c eciendo en medio DMEN comple o, y se pasaba
a ealiza la inmuno luo escencia. T anscu idas las 24 ho as, las células se
la aban con PBS 1x una sola ez, a con inuación se ijaban con
pa a o maldehído (Sigma) al 3% du an e 5 min a .a. Se hace una ijación
ápida pa a a ec a lo menos posible a las p o eínas de memb ana. Se
ealizaban 3 la ados con PBS 1x seguidos del bloqueo con 5% BSA (albúmina
sé ica bo ina), 10% FBS (sue o bo ino e al) en PBS 1x, du an e 45 min a .a.
A con inuación, se incubaba con el an icue po p ima io, que en es e caso
e a el sue o de pacien e (1:50), du an e 1 ho a a .a. Como con ol posi i o
se u ilizaba un sue o de pacien e con an icue pos an i-AQP4 (NMO-IgG)
p e iamen e ya con i mado po el Hospi al Clinic de Ba celona, y como
con ol nega i o se u ilizó un sue o de pacien e con escle osis múl iple y po
an o sin an icue pos NMO-IgG. Las mues as se la aban con PBS 1x 3 eces,
5 min, y se pasaba a incuba con el an icue po secunda io Alexa luo an i-
human (Tabla 9) du an e 30 min a .a. De nue o, se la aban las mues as
con PBS 1x 3 eces. Po úl imo se incubaban las mues as con DAPI (Tabla 9),
ma caje luo escen e nuclea du an e 10 min a .a. Los cub es e an
mon ados en cub es con solución Dako (S302380, Dako) y as deja seca
pasaban a analiza se al mic oscopio de luo escencia (Olympus DX-61).
75
MATERIALES Y MÉTODOS
En el caso de la de ección de an icue pos an i-AQP1, se ealizó el
mismo p o ocolo, a excepción del con ol posi i o, que se u ilizó un
an icue po p ima io come cial ( abla 8) y se dejó incuba du an e 24 ho as a
4ºC.
5.3.1 Op imización del mé odo de diagnós ico
Es e ensayo, al ene in e és clínico, ue mejo ado pa a que los
esul ados se ob u iesen con la mayo apidez posible (Figu a 10). Pa a ello,
una ez ue on ijadas las células, és as se congela on a -80ºC inme sa en
una solución de 10% DMSO (dime ilsul óxido, Sigma) en PBS 1x. De es e
modo, siemp e que se ecibía una mues a de pacien e, en el mismo día e a
posible ene un esul ado cuali a i o, y dos pa a uno cuan i a i o.
Figu a 18. Diag ama esumen de la mejo a del mé odo de diagnós ico.
76
MATERIALES Y MÉTODOS
6. P ocesamien o de mues as de pacien es
Tan o pa a los ensayos de de ección de an icue pos en sue o de
pacien es an i-AQP4 (NMO-IgG) como pa a la de ección de la p o eína de
AQP1 y AQP4 en mues as de líquido ce alo aquídeo, con ábamos con la
colabo ación de neu ólogos y neu oci ujanos del Hospi al Uni e si a io
Vi gen del Rocío (HUVR) pa a la ecogida de mues as de pacien es. Las
mues as se ecogían cumpliendo odos los equisi os necesa ios pa a se
egis adas en el Biobanco pe enecien e al HUVR, median e la
cumplimen ación del consen imien o in o mado de inido po es e
o ganismo (Figu a 11).
En el caso de las mues as pa a la de ección de NMO-IgG, se ecibían
ex acciones de sang e en ubos acu aine , con ac i ado de la coagulación
y gel sepa ado de sue o. Median e una cen i ugación a 500g du an e 15
min a 4ºC, se ob enía el sue o, y e a ápidamen e conse ado a -80ºC. Las
mues as ecogidas pe enecían a pacien es que p esen aban algún ipo de
en e medad neu ológica, siendo las más ecuen es la de pacien es con
escle osis múl iple (Tabla 6)
Las mues as de líquido ce alo aquídeo se ecibían en ubos sin
ningún ipo de a amien o. Es as mues as se cen i ugaban en las mismas
condiciones que an es se ha desc i o y se desca aba los es os de ejido
p esen es en la mues a. Igualmen e, se conse aban a -80ºC. Las mues as
e an clasi icadas según el ipo de hid oce alia que padeciese el pacien e
(Tabla 7), disc iminándose en e hid oce alia obs uc i a, comunican e o sin
hid oce alia.
83
MATERIALES Y MÉTODOS
Diagnós ico
Tipo de
hid oce alia
Nº
pacien es
Géne o
F/M
Media edad
+/- sd
Hid oce alia
Obs uc i a
14
9/5
51,4 +/-
18,6
Comunican e
56
30/26
57,42 +/-
18,64
No hid oce alia
No hid oce alia
15
6/9
53,07 +/-
17,81
Tabla 7. Va iables demog á icas y clínicas de pacien es en el es udio de la hid oce alia. Tabla con la
in o mación demog á ica y clínica de las mues as de sue o u ilizadas en los ensayos elacionados con
la hid oce alia. En la abla se mues an las di e en es mues as de líquido ce alo aquídeo clasi icadas
en unción de la p esencia de hid oce alia o no, y el sub ipo en caso de p esen a se.
8.3 An icue pos p ima ios
An ígeno
O igen
Tipo
Dilución
Compañía
Re .
AQP4
Conejo
Poli
1:1000
Abcam
ab46182
AQP4
Conejo
Poli
1:1000
Alpha Diagnos ics
AQP41-A
AQP1
Conejo
Poli
1:10000
Abcam
ab15080
β-ac ina
Ra ón
Mono
1:10000
Abcam
ab6276
G6PDH
Conejo
Poli
1:1000
Abcam
ab993
TTR
O eja
Poli
1:500
Abcam
ab9015
e-cadhe ina
Ra ón
Mono
1:300
BD Bioscience
610181
AQP1
Ra ón
Mono
1:500
Abcam
ab117970
Na alizumab
Mono
1:10
Tysab i
ID: 3753128
Tabla 8. Lis ado de an icue pos p ima ios u ilizados.

84
MATERIALES Y MÉTODOS
8.4 An icue pos secunda ios
An ígeno
Reac i idad
O igen
Dilución
Compañía
Re .
IgG H&L (HRP)
Humano
Pollo
1:30000
Abcam
Ab6864
IgG H&L (HRP)
Conejo
Cab a
1:5000
Pie ce
31460
Alexa 635 IgG
Ra ón
Cab a
1:400
In i ogen
A31340
Alexa 488 IgG
Ra ón
Mono
1:200
In i ogen
A21202
Alexa 568 IgG
Cab a
Mono
1:400
In i ogen
A11057
Alexa 568 IgG
Humano
Cab a
1:1000
In i ogen
A21090
Dapi
Todos
Químico
1:1000
In i ogen
D1306
Tabla 9. Lis ado de an icue pos secunda ios y ma cado es
RESULTADOS
88
RESULTADOS
RESULTADOS
Los esul ados que se p esen an en el p esen e abajo abo dan la
implicación de di e sos miemb os de la amilia de las AQPs en el desa ollo
de dos en e medades neu ológicas, la neu omieli is óp ica y la hid oce alia.
En la neu omieli is óp ica, basados en abajos p e ios que apo an
obse aciones clínicas y pa ológicas que indican la pa icipación di ec a de
los an icue pos an i-AQP4 en el desa ollo y diagnós ico de la NMO (Lennon
y col., 2004; Lucchine i e al., 2002; Nakamu a y col., 2005; Pi ock e al.,
2006) quisimos es udia en mayo p o undidad el papel desempeñado po
las AQPs en la e iología de la en e medad y su uso clínico como ma cado
biológico en el diagnós ico de es a en e medad.
En la hid oce alia po o a pa e, donde la pa icipación de AQP1 había
sido ambién p opues a pa a explica el o igen de és a pa ología (Filippidis y
col., 2011; Kalani e al., 2012; Wang y col., 2011), quisimos ahonda en
en ende si exis e elación isiopa ológica en e la exp esión de AQPs
ce eb ales y la hid oce alia, analizando mues as de líquido ce alo aquídeo
de pacien es hid oce álicos y haciendo uso de dos modelos animales de los
que disponíamos, el KO (-/-) de AQP1 y el a ón “hop gai ” gené icamen e
hid oce álico (Ba iz y col., 2006; B onson y Lane, 1990).

89
RESULTADOS
1. Desa ollo de un sis ema de diagnós ico pa a la Neu omieli is
óp ica
Con el in de pode es ablece en nues o labo a o io un sis ema de
diagnós ico pa a la neu omieli is óp ica, se desa olla on écnicas pa a la
de ección de an icue pos an i-AQP4 humanos (NMO-IgG), median e la
sob eexp esión de AQP4 humana en células, que se i ían como an ígeno
pa a de ec a median e écnicas de inmuno luo escencia los an icue pos
p esen es en sue o de pacien es po encialmen e a ec ados po la
en e medad y como con oles sue os de pacien es que pe enecían a un
amplio espec o de en e medades neu ológicas y olun a ios sanos.
1.1 De ección de an icue pos an i-AQP4
El cDNA que codi ica pa a la p o eína de AQP4 humana en sus
iso o mas M1 y M23, ue clonado en el ec o de exp esión pCMV6 el cual
codi ica ambién po la exp esión de una p o eína luo escen e e de
llamada EGFP, po “enhanced G een luo escen p o ein”, bajo el mismo
p omo o del inse o (AQP4). De es e modo, al exp esa se la p o eína de
AQP4, a su ez se exp esa á ambién la p o eína EGFP, e idenciándose su
exp esión po la p esencia de un colo e de que se de ec a á al
mic oscopio de luo escencia. En la pues a a pun o inicial de de ección de
an icue pos an i-AQP4 se hizo uso de una mues a de sue o de un pacien e
posi i o pa a NMO y que enía an icue pos an i AQP4, con i mados po el
Hospi al Clinic de Ba celona, cen o de e e encia en España pa a es e
diagnós ico. Como se ap ecia en la igu a 20, la señal e de (EGFP) “in si u”
indica la exp esión de AQP4, que coincide con el ma caje ojo p oducido po
90
RESULTADOS
el an icue po secunda io- luo escen e, que econoce a la IgG del sue o del
pacien e unida a la p o eína de AQP4 exp esada. En es a igu a se puede
obse a cla amen e, además, los OAPs (“o ogonal a ay p o eins”) a eglo
o ogonal ípico o mado po la sob exp esión de la iso o ma M23 de AQP4.
Figu a 20. Colocalización de AQP4 y EGFP median e de ección con an icue pos an i AQP4 p esen es
en el sue o de pacien e NMO posi i o. La sob exp esión de pCMV6-N-EGFP-AQP4 se mues a
median e luo escencia de colo e de (A). Inmuno luo escencia indi ec a que mues a la p esencia de
an icue pos an i AQP4 en la mues a de sue o de pacien e (B). Colocalización de las señales de
sob exp esión de AQP4 y de la de ección de an icue pos (C y D).
91
RESULTADOS
La pues a a pun o del ensayo de diagnós ico se amplió haciendo una
explo ación de mues as pe enecien es a con oles sanos y o as
en e medades de ca ác e neu odegene a i o pa a así comp oba la
e iciencia del mé odo desa ollado. A su ez, median e el p og ama
in o má ico Image J, se cuan i icó la señal de luo escencia ob enida,
exp esada en píxeles. La obse ación al mic oscopio de luo escencia (Figu a
21a), mos ó que únicamen e las mues as de pacien es con NMO,
p esen aban ni eles de luo escencia ap eciables compa ables al con ol
posi i o, a di e encia del es o de mues as que no p esen a on ningún ipo
de ma caje. En la Figu a 21b se co obo ó es e esul ado median e la
cuan i icación de la luo escencia, encon ándose di e encias
es adís icamen e signi ica i as cuando se compa a on los ni eles de
luo escencia de las mues as de con oles posi i os pa a la NMO con
espec o a la de ec ada en el con ol nega i o.
92
RESULTADOS
Figu a 21. Fo os de mic oscopia luo escen e y cuan i icación de la luo escencia en mues as de
pacien es. Inmuno luo escencia indi ec a pa a la de ección de an icue pos an i-AQP4 (A) y
cuan i icación con image-J de la luo escencia en mues as de pacien es con Neu omieli is óp ica
(NMO), escle osis múl iple (EM), mieli is longi udinal ex ensa (MLE) y con oles sanos (CS). (*p<0.05 y
**p<0.01) (B).
1.2 Ve i icación del mé odo de diagnós ico
Con la ayuda del D . Albe Sáiz, neu ólogo de e e encia del Hospi al
Clinic de Ba celona, expe o en el diagnós ico de Neu omieli is óp ica en el
país, ob u imos mues as de sue os de pacien es ya analizadas en ese
99
RESULTADOS
Figu a 26. Ma caje p oducido po el sue o de pacien e con a amien o de na alizumab.
Inmuno luo escencia indi ec a an i-AQP4 de mues a NMO+ y sue o de pacien es a ados con
na alizumab (A). Cuan i icación de la luo escencia de mues as NMO+ ( e de), NMO- (g is) y sue o de
pacien es a ados con na alizumab (na anja). **p≤0.01, ***p≤0.001 (B).

100
RESULTADOS
Pa a con i ma que es os esul ados se debían a e ec os p oducidos
po la p esencia de Na alizumab en el sue o de los pacien es se p ocedió a
epe i el ensayo inmunológico pe o u ilizando Tysab i di ec amen e como
an icue po p ima io, en ez de usa el sue o de los pacien es. Tysab i es un
p oduc o come cial que con iene el mismo p incipio ac i o p esen e en el
a amien o gené ico conocido como na alizumab. Los esul ados ( igu a x),
mos a on g an simili ud en e el pa ón de ma caje mos ado po el sue o
de un pacien e que es aba bajo a amien o con na alizumab y el p oducido
po Tysab i. En ambos casos se obse ó un ma caje especí ico de
memb ana, pe o sin elación con la sob exp esión de EGFP-AQP4. Se
obse ó ma caje de odas las células mien as que la sob eexp esión de
EGFP-AQP4, en es a ocasión aba caba menos del 50% del o al de células en
el campo.
101
RESULTADOS
Figu a 27. De ección de na alizumab en sue o en e al come cial. Inmuno luo escencia indi ec a que
mues a el ma caje p oducido po el sue o de pacien e con a amien o de na alizumab y el
na alizumab come cial (Tysab i).
Una ez e i icada la in e e encia del na alizumab en el diagnós ico y
comp oba que el ma caje no co espondía a AQP4, se pasó a busca cual
e a el an ígeno esponsable po es a señal ( alsa posi i a) que
obse ábamos.
El na alizumab, es un an icue po monoclonal que in e acciona con
in eg inas, glicop o eínas de memb ana que pa icipan en la unión de la
célula con la ma iz ex acelula o con o as células. En nues os cul i os se
usa on células HEK293 (células emb iona ias de iñón humano), las cuales
exp esan de o ma cons i u i a un ipo de in eg ina, la in eg ina al a 4. La
p esencia de es a in eg ina se con i mó, median e el es udio de la exp esión
po PCR cuan i a i a en cul i os de HEK293 sin ans ec a y ans ec ados
con AQP4-M23 y con un ec o acío (p3T). Como se obse a en la Figu a 28,
102
RESULTADOS
se de ec ó exp esión de la in eg ina en los di e en es casos de células HEK
analizadas, comp obándose que la exp esión cons i u i a de és a in eg ina
no se eía a ec ada al se las células ans ec adas con o os genes.
Figu a 28. PCR cuan i a i a de ITGα4. Se mues an los ni eles de exp esión de ITGα4 en cul i o
celula HEK293 sin ans ec a y ans ec ada con los genes de AQP4-M23 y p3T.
Así, el ma caje de memb ana que p esen an algunas mues as de
sue os de pacien es con EM, es debido al a amien o de na alizumab, y al
econocimien o po es e an icue po monoclonal de las in eg inas que se
encuen an en la memb ana de las células HEK293 usadas pa a el ensayo.
2. P esencia de an icue pos an i-AQP1 en sue o de pacien es con
deso denes que se incluyen den o del sínd ome de la NMO
(NMOSD)
Va ios es udios han desc i o la p esencia de an icue pos an i-AQP1 en
sue o de pacien es clasi icados como den o del espec o clínico de la NMO.
U ilizando ensayos de inmuno luo escencia (Long e al., 2014b) o median e
103
RESULTADOS
écnicas de ELISA y adioinmunop ecipi ación (Tza os e al., 2013), es os
au o es de ec an la p esencia de AQP1. Sin emba go, las inconsis encias
encon adas en ambos abajos y la al a de ep oducibilidad de dichos
esul ados po o os au o es (Schanda e al., 2015), han añadido muchos
in e ogan es a la posibilidad de una e dade a elación en e la p esencia
de an icue pos an i-AQP1 y el espec o clínico de la NMO
En es e apa ado se mues an los esul ados de di e sos análisis, de
inmuno luo escencia indi ec a en células ans ec adas con AQP1 y ensayos
de ELISA, ealizados con las mues as de sue o ecolec adas y p e iamen e
analizadas pa a la de ección de an i NMO-IgG, y aho a usadas pa a la
de ección de an icue pos an i-AQP1.
2.1 De ección de an icue pos an i-AQP1 po inmuno luo escencia
El ensayo se ealizó siguiendo el p o ocolo ya pues o a pun o pa a la
de ección de an icue pos an i-AQP4, pe o aho a u ilizando células HEK293 a
las que se les ans ec ó el clon pCMV6-AQP1-EGFP pa a así ob ene un
cul i o celula que sob eexp esaba AQP1 y EGFP simul áneamen e. Se
analiza on odos los sue os ecolec ados has a la echa y se compa a on con
los esul ados ob enidos en la de ección de an icue pos an i-AQP4. Los
esul ados (Figu a 29) mos a on que los sue os pe enecien es a pacien es
del espec o NMO (NMOSD) (A’) p esen aban un ma caje simila al con ol
nega i o (B’). Po el con a io, la de ección de an icue pos an i-AQP4 en los
mismos sue os ealizada pa alelamen e mos ó una in ensa señal en las
mues as de sue o de pacien es NMO+.
104
RESULTADOS
Figu a 29. Inmuno luo escencia de AQP1 y AQP4 con sue o de pacien es sob e células no
pe meabilizadas. Compa ación de la señal de AQP1 y AQP4 con el ensayo de inmunode ección hecho
usando células sin pe meabiliza al como se desc ibió pa a el diagnós ico de AQP4. Exp esión de
AQP1-EGFP (A,B).Exp esión de AQP4-EGFP (C,D). Sue o de pacien e NMOSD posi i o (A’,C’). Sue o de
pacien e NMOSD nega i o (B’,D’).
T as los esul ados nega i os ob enidos, el ensayo de
inmuno luo escencia ue epe ido, pe o es a ez siguiendo las condiciones
de pe meabilización del ejido desc i as p e iamen e (Long, Youming e al.,
2014) po au o es que con i man la p esencia de an icue pos an i-AQP1 en

105
RESULTADOS
el sue o de pacien es con NMOSD. Es e p o ocolo, a di e encia del an e io ,
pe meabiliza las células, disminuyendo conside ablemen e la especi icidad y
sensibilidad de la écnica. Como se puede ap ecia en la Figu a 29, se
obse a mucho ma caje, an o en las células que sob eexp esan AQP1,
como en las que exp esan AQP4, así como ambién en las que no exp esan
ninguna de es as p o eínas. El esul ado ue simila en las mues as
pe enecien es a pacien es con NMOSD (A’, C’), como en las mues as de
pacien es que no pe enecían al NMOSD (B’, D’). Es a señal de luo escencia
que se de ec a es po an o inespecí ica, debida a la unión de componen es
del sue o a la célula que se desconocen.
106
RESULTADOS
Figu a 29. Inmuno luo escencia de AQP1 y AQP4 con sue o de pacien es sob e células
pe meabilizadas. Compa ación de la señal de AQP1 y AQP4 con el ensayo de inmunode ección hecho
usando células pe meabilizadas. Exp esión de AQP1-EGFP (A,B).Exp esión de AQP4-EGFP (C,D). Sue o
de pacien e NMOSD posi i o (A’,C’). Sue o de pacien e NMOSD nega i o (B’,D’).
107
RESULTADOS
Figu a x. Inmuno luo escencia de AQP1 con Ac come cial y sue o. Inmuno luo escencia de AQP1 sin
pe meabiliza donde se mues a el ma caje del Ac come cial de AQP1 en e a los sue os de pacien e.
108
RESULTADOS
2.2 De ección de an icue pos an i-AQP1 po ELISA
Acep ando la posibilidad de que los an icue pos an i-AQP1 es u ie an
p esen es en el sue o pe o ue an di íciles de de ec a debido a su baja
concen ación y a la poca sensibilidad de la écnica inmuno luo escen e, las
mues as se analiza on en onces usando un mé odo de mayo sensibilidad
como es el ELISA. Los esul ados (Figu a 30) e idencia on en algunas
mues as la p esencia signi ica i a de an icue pos an i-AQP1. Sin emba go,
las mues as con ni eles de an icue pos más al os no solo se encon aban en
el g upo NMOSD, ambién mues as de EM p esen a on ni eles ele ados.
Del g upo NMOSD, únicamen e 2 sue os que pe enecían a pacien es con
neu i is óp ica de epe ición (NO .) y 3 de pacien es con mieli is longi udinal
ex ensa (MLE) die on alo es posi i os pa a an i-AQP1. En el g upo de
NMOSD nega i o, des aca on como posi i as 3 mues as de pacien es con
escle osis múl iple (EM). La signi icancia es adís ica de los da os se halló po
compa ación a la media más la des iación ípica (línea pun eada en la Figu a
30), del alo del an icue po ob enido en con oles sanos, de e minado po
iplicado.
115
RESULTADOS
Figu a 35. Análisis de exp esión de AQP1 en plexo co oideo de a ón. LA exp esión de AQP1 en plexo
co oideo de a ones C57J ue analizado po Wes e n Blo as expone los animales a condiciones de
hipoxia du an e 24 y 48 ho as.
Median e inmunohis oquímica analizamos la exp esión de AQP1 en
las células del plexo co oideo, e idenciándose como e a de espe a una
localización de memb ana de es a p o eína (Figu a 36).

116
RESULTADOS
Figu a 36. De ección de AQP1 en plexo co oideo. Las o og a ías mues an imágenes de mic oscopía
de luo escencia del plexo co oideo de a ón wild ype de la línea C57J, p ocesado pa a la de ección
inmunohis oquímica de AQP1 ( e de) y el ma cado especí ico de plexo TTR ( ojo).
5. De ección de AQP4 en plexo co oideo de a ón
Los abajos publicados has a la echa des acan el papel de AQP1 en la
p oducción y egulación de LCR en los plexos co oideos (Day y col., 2014;
Papadopoulos y Ve kman, 2013), sin emba go poco se conoce del papel de AQP4
en es e p oceso. Aunque la idea p e alen e en el campo es que AQP4 no juega
ningún papel en la p oducción de LCR, es udios p e ios mues an exp esión de
AQP4 en el plexo co oideo (Mobashe i e al., 2007; Speake e al., 2003; Suzuki e
al., 2013; Vene o e al., 1999) y jun o a los esul ados ob enidos en el análisis de
ARNm en el apa ado an e io , quisimos analiza de o ma especí ica si exis e
exp esión de es a p o eína en el ejido en cues ión.
117
RESULTADOS
Analizamos la exp esión de la p o eína median e las écnicas de wes e n blo
e inmuno luo escencia. Como se mues a en la Figu a 37a, el análisis de la
exp esión de AQP4 en di e en es mues as: con oles, cul i os celula es de HEK293
sin ans ec a y ans ec adas con las dos iso o mas de AQP4 (M1 y M23); co eza
de ce eb o de a ón y po úl imo cul i os p ima ios de plexo co oideo, dejó cla o
que si hay exp esión de la p o eína. En la Figu a 37b, se mues an los esul ados de
de ección de AQP4 en plexo co oideo de a ón po inmuno luo escencia indi ec a,
donde se puede ap ecia que AQP4 ( ojo) p esen a una dis ibución homogénea en
el ci oplasma, y no de memb ana como mues a el con ol e-cadhe ina ( e de).
Figu a 37. Exp esión de AQP4 en plexo co oideo. La igu a mues a la p esencia de AQP4 a ni el de
p o eína en el plexo co oideo. Los ni eles de exp esión de AQP4 ue on analizados median e wes e n
blo en e mues as de di e en es cul i os pe enecien es a HEK293 sin ans ec a , HEK293
ans ec ada con AQP4-M1 y M23, co eza de a ón y cul i o p ima io de plexo co oideo de a a (n=4)
(A). Median e inmuno luo escencia indi ec a sob e plexo co oideo de a ón se de ec a on las
p o eínas AQP4 ( ojo) y e-cadhe ina ( e de) como con ol (B).
118
RESULTADOS
6. Explo ación de acuapo inas en o as á eas del ce eb o de a ón
Una p oducción excesi a o una eabso ción educida del LCR lle a án a una
si uación de hid oce alia, la cual pudie a es a asociada a una exp esión al e ada o
una dis unción de las AQPs p esen es en la in e ase en e el SNC y los
compa imen os donde se encuen a el LCR. Como ya se indicó en la in oducción
de es a esis son a ias las AQPs que a día de hoy han sido localizadas en el ce eb o
de mamí e os y pudie an se ele an es en el con ex o del p esen e abajo.
Quisimos en onces explo a la exp esión de las acuapo inas 4 y 9, que jun o
con AQP1 son las que se exp esan p incipalmen e en el SNC, y analiza la exp esión
de es as es p o eínas en di e en es secciones del ce eb o. Pa a ello, se aisla on
zonas especí icas ales como epéndima, co eza, plexo co oideo y es iado, en las
cuales la p esencia de AQPs ha sido desc i a p e iamen e en la li e a u a.
Los a ones se expusie on a hipoxia du an e 48 ho as y la exp esión de las
AQPs ue analizada po PCR cuan i a i a.
Como se obse a en la Figu a 38a, AQP1 se exp esa únicamen e en plexo
co oideo y como se mos ó an e io men e en el apa ado 2 de esul ados, aquí
nue amen e se con i mó una mayo exp esión en condiciones de hipoxia. La
exp esión de AQP4 sin emba go, se encon ó en los 4 ejidos analizados (Figu a
38b). Cla as di e encias en la exp esión de es a p o eína po hipoxia se obse a on
en el plexo co oideo y la co eza, siendo es as di e encias es adís icamen e
signi ica i as solo en la co eza. Cu iosamen e se obse ó además que la hipoxia
aumen a la exp esión de la p o eína en el plexo co oideo, mien as que la educe
en la co eza. Po úl imo, los esul ados mos a on (Figu a 38c) que AQP9 se
exp esa en odos los ejidos y que la hipoxia aumen a su exp esión en odos ellos,
aunque las di e encias solo ue on es adís icamen e signi ica i as en el es iado.
119
RESULTADOS
Figu a 38. Análisis en dis in as zonas del ce eb o de la exp esión de AQP1, AQP4 y AQP9 po RT-
PCRq bajo condiciones de hipoxia. Los a ones (n=4) se man u ie on en hipoxia al 10% de O2 du an e
48 h. Las g á icas mues an el análisis po RT-qPCR de AQP1 (A), AQP4 (B) y AQP9 (C) en los cua o
ejidos es udiados: epéndima, plexo co oideo, es iado y co eza, * p≤0,05.
120
RESULTADOS
7. Es udio de AQPs en ce eb o del a ón mu an e hyh
(hyd ocephalus hop gai )
El a ón mu an e hyh, como se ha desc i o en la in oducción, es un
a ón que p esen a una mu ación pun ual que a ec a a la exp esión de la
p o eína α-SNAP, que le p oduce una acumulación de LCR en los en ículos
acompañada de una es enosis en el acueduc o de Sil io, desa ollando una
hid oce alia se e a. Es e a ón p esen a un eno ipo hid oce álico que se
asemeja en algunos aspec os a la hid oce alia congéni a en humanos ales
como en el aumen o de la p esión in ac aneal, aumen o del olumen de
LCR, es enosis, en e o os, y es po ello que haya sido seleccionado como
modelo en el es udio de la elación en e la hid oce alia y la exp esión de
acuapo inas.
Al igual que en el apa ado an e io , se analizó la exp esión de las
acuapo inas más abundan es en el SNC: AQP1, AQP4 y AQP9 en ejidos
como el plexo co oideo, co eza, epéndima y es iado. Se usa on a ones
hyh en e 15 y 25 días de edad y como con oles se usa on los de geno ipo
sil es e (wild ype) de la misma línea. Los ni eles de exp esión de AQPs
ue on analizados median e PCR cuan i a i a.
Como se obse a en la Figu a 39a, AQP1 únicamen e se exp esa en
plexo co oideo, sin encon a se di e encias signi ica i as en e el a ón
con ol y el hyh. La exp esión de AQP4 (Figu a 39b), mos ó se mayo en
epéndima, es iado y co eza de a ones w , siendo es adís icamen e
signi ica i os es as di e encias solo en epéndima y es iado. En el plexo
co oideo, los ni eles de AQP4 ue on más ele adas en a ones hyh, con una
di e encia es adís icamen e signi ica i a 10 eces mayo en hyh que en el

121
RESULTADOS
w . La exp esión de AQP9 (Figu a 39c), al igual que AQP4 ambién se io
aumen ada en epéndima, es iado y co eza en a ones w espec o a hyh,
siendo las di e encias es adís icamen e signi ica i as únicamen e en el
epéndima. En plexo co oideo a di e encia del apa ado an e io , AQP9 sin
emba go, no es de ec ada.
122
RESULTADOS
Figu a 39. Análisis de exp esión de AQP1, AQP4 y AQP9 po RT-PCRq en a ones hop gai .. Pa a el
análisis se u iliza on 4 a ones sil es es y 4 a ones con hid oce alia (hyh). Las g á icas mues an el
análisis po RT-qPCR de AQP1 (A), AQP4 (B) y AQP9 (C), en los ejidos: epéndima, plexo co oideo,
es iado y co eza. . * p≤0,05.
DISCUSIÓN
131
DISCUSIÓN
HEK e a el o igen de la señal. El análisis más cuidadoso de los sue os de
pacien es a ados con na alizumab mos ó que si los pacien es habían
de enido el a amien o de na alizumab mas allá de 6 meses p e ios a la
ob ención del sue o, dejaban de p esen a ese pa ón con uso de ma caje y
los ni eles de luo escencia que mos aban e an muy simila es a los del
sue o con ol nega i o, indicando que los ni eles de na alizumab en sang e
disminuían du an e la gos pe iodos de iempo (6 meses al menos),
haciéndose inde ec ables po el ensayo de diagnós ico.
Si bien las células HEK o ecen p opiedades muy a o ables pa a los
ensayos de CBA aquí usados, ales como al a e iciencia de ans ección y
ni eles de exp esión de AQP4 humana, una des en aja de usa es as células
en ensayos de NMO ambién se pone de mani ies o en el p esen e abajo:
conc e amen e que la exp esión cons i u i a de in eg inas en la memb ana
celula p oduce la unión de los an icue pos que componen el na alizumab,
siendo es os econocidos po an icue pos an i-IgG humano dando luga a
una alsa señal pa a el diagnós ico de NMO. Se ía impo an e ealiza una
explo ación de es a eac i idad c uzada del na alizumab en di e en es líneas
celula es pa a así pode mejo a el sis ema de diagnós ico. Po o o lado,
una espues a simila a la eac i idad c uzada obse ada con el na alizumab,
ambién pod ía se p oducido po o as inmuno e apias que ac ualmen e se
aplican a es e ipo de en e medades au oinmunes, lo que puede conduci a
alsos posi i os en el diagnós ico. A la is a de es os esul ados cabe
menciona , que algunos de los e ec os secunda ios ad e sos de algunas
inmuno e apias pudie an debe se a la unión de an icue pos del á maco a
an ígenos endógenos del cue po humano no desc i os aún (Sanchez Goma
y col., 2014). Po úl imo además, es impo an e des aca el alo que iene

132
DISCUSIÓN
hace diagnós icos cla os que ayuden a di igi con apidez y acie o las
e apias ya que conc e amen e en el caso de na alizumab, es e ipo de
a amien o es e ec i o en pacien es con EM, pe o al con a io en pacien es
con NMO, se ha obse ado como el na alizumab puede p oduci ecaídas
se e as, lesiones en el cue po calloso, discapacidad cogni i a, en de ini i a,
un empeo amien o de la en e medad (Ba ne e al., 2012; Jacob y col.,
2012; Ki ley e al., 2014a).
4. AQP1 como bioma cado de la NMOSD
Además de AQP4, en los as oci os del SNC humano se ha de ec ado
al a exp esión de AQP1 (Misu e al., 2013; Sa oh e al., 2007).
Conc e amen e se ha is o que AQP1 se encuen a sob eexp esado en á eas
p opensas a desa olla lesiones ípicas de la NMO (Misu e al., 2013). Es a
p emisa ha lle ado a pensa en AQP1 como un posible bioma cado de la
NMOSD a causa de la se onega i idad pa a AQP4 encon ada en muchos
sue os de pacien es que pe enecen a es e g upo. Pa a el es udio de la
implicación de AQP1 en la en e medad, analizamos de nue o las mues as
en busca de an icue pos an i-AQP1. Pa a ello, en p ime luga pusimos a
pun o la misma écnica (CBA) que an buen esul ado nos dio pa a la
de ección de an icue pos an i-AQP4, pe o aho a pa a de ec a an i-AQP4.
T as el análisis de las 181 mues as ya analizadas pa a AQP4 no de ec amos
an icue pos an i-AQP1 en ninguna de las mues as analizadas. En nues o
mé odo, en el cual las células no se ijan ni pe meabilizan has a el inal del
ensayo pa a así man ene la p o eína de AQP lo más conse ada posible en
la memb ana y así el epí opo inmune, suponiendo que sea simila al de
133
DISCUSIÓN
AQP4 y es é localizado en los lazos ex amemb ana de las células (Io io y
col., 2013), no se de ec ó p esencia de IgG an i-AQP1.
Un único abajo en la li e a u a (Long e al., 2014b) de ec a
an icue pos an i-AQP1 usando un mé odo simila al nues o (CBA) aquí
desc i o. Es os au o es sin emba go, solo consiguen de ec a los an icue pos
an i-AQP1 ealizando un p e a amien o de las HEK-AQP4 con T i on X-100
(Long e al., 2014b), mien as que no los de ec an en ausencia de
pe meabilización. Po ello, epe imos el mismo ensayo, pe o es a ez
siguiendo al de alle las condiciones es ablecidas po el g upo de Long y col
(2014), ealizando el p e a amien o de las células con T i on X-100. En
nues o caso, no ob u imos ningún sue o posi i o en la de ección de an i-
AQP1, pe o lo que si obse amos ue un in enso ma caje inespecí ico en
odas las mues as analizadas p obablemen e debido a múl iples uniones
inespecí icas que esul an de la unión de IgG sé icas a p o eínas u o os
elemen os del in e io celula accesibles a consecuencia de la
pe meabilización con el i ón.
Un es udio p e io (Tza os e al., 2013), ambién ha mos ado
p esencia de an icue pos an i-AQP1 median e las écnicas ELISA y RIPA, y no
con el mé odo de CBA. En nues o caso, la de ección de an icue pos an i-
AQP1 con ELISA ha cie amen e mos ado esul ados posi i os en algunos
sue os, pe o es os no co esponden exclusi amen e a mues as del espec o
clínico de NMO. Como mues a la Figu a 30, mues as de pacien es con EM
ambién mos a on ni eles signi ica i os de an icue pos an i-AQP1,
desca ándolos como ma cado es que puedan se usados pa a el
diagnós ico o como diana e apéu ica de la en e medad; al menos de
134
DISCUSIÓN
momen o y dada la sensibilidad de las écnicas de las que disponemos en la
ac ualidad.
5. Papel de las acuapo inas en la hid oce alia en humanos
AQP1, que se encuen a al amen e exp esada en la memb ana apical
del plexo co oideo, hace una con ibución sus ancial a la p oducción de LCR
y es una posible diana e apéu ica en el a amien o de as o nos de la
ci culación del LCR. AQP4, sin emba go, se exp esa en la memb ana
basola e al del epéndima en icula y juega un papel impo an e en la
homeos asis del agua ce eb al. En nues os análisis de p o eína de AQP1 y
AQP4 en líquido ce alo aquídeo humano imos como en los casos de
hid oce alia, los ni eles de ambas p o eínas e an mayo es an o en los casos
de hid oce alia comunican e como en la obs uc i a. En el caso de AQP1,
aunque los alo es esul an bas an e he e ogéneos, donde mayo núme o
de p o eína se de ec ó en el LCR ue en los pacien es con hid oce alia
comunican e, seguido de los pacien es con hid oce alia obs uc i a. Es
posible que es o ocu a po que an e condiciones de hid oce alia, el
aumen o de LCR en el en ículo p oduce un inc emen o de la p esión
in ac aneal, la cual puede desencadena una espues a egulado a pa a
de ene la p oducción de LCR, y po ello, la exp esión de AQP1 se ea
educida (Paul y col., 2011). Sumado a es o puede ocu i que pa a a o ece
aún más la educción de la asa de p oducción de LCR, a la ez que la
exp esión de AQP1 es educida, la p o eína ya exp esada en la memb ana,
sea desechada hacia el in e io del en ículo, siendo es a p o eína la
de ec ada po noso os median e ELISA. En el caso de AQP4, ambién
135
DISCUSIÓN
de ec amos mayo es ni eles de p o eína en pacien es con hid oce alia
espec o a los con oles, lo que hace pensa que al igual que en AQP1, la
exp esión de la p o eína se e educida. En algunos es udios se ha is o que
en modelos animales que desa ollan hid oce alia, la exp esión de AQP4
aumen a en el epéndima, de es a o ma pe mi e aumen a la eabso ción de
LCR como espues a egulado a de la homeos asis (Feng y col., 2009;
Filippidis y col., 2012). Sin emba go, a su ez se sucede o o e en o, ya que
al aumen a el olumen de LCR, como consecuencia, las pa edes del
en ículo se expanden induciendo la denudación de células ependima ias
(Dominguez-Pinos y col., 2005). Es a denudación ependima ia es á
ín imamen e elacionada con AQP4, ya que és a pa icipa en la es abilidad
de la pa ed median e la egulación de la conexina-43, que dan luga a las
uniones GAP, po lo que, an e una si uación de dila ación en icula , las
uniones gap se en a ec adas jun o a AQP4, siendo e idas al LCR
(Cas aney a-Ruiz e al., 2013; Dominguez-Pinos e al., 2005). Es e suceso
ag a a ía la si uación de hid oce alia, y pod ía con ibui a que una
hid oce alia comunican e desemboque en una obs uc i a. Po eso, en
nues os da os se obse a como la hid oce alia obs uc i a p esen a los
mayo es ni eles de AQP4, indicando posiblemen e el pun o de máxima
denudación del epéndima.
6. In luencia de la hipoxia en aquapo inas del plexo co oideo
Son nume osos los abajos que desc iben en di e en es modelos
animales de hid oce alia como es a es á asociada a una diminución de los
ni eles de oxígeno en el ce eb o (Del Bigio y col., 2012; Domb owski y col.,
136
DISCUSIÓN
2008). Es a hipoxia, puede ene e ec os en la exp esión de AQP1 en
ce eb o, como ya se ha desc i o en abajos p e ios del labo a o io donde se
mues a como la hipoxia a ec a a la exp esión de AQP1 al alza (Ab eu-
Rod iguez y col., 2011). En nues o caso, as pone a a ones bajo
condiciones de hipoxia, imos como en los plexos co oideos, la exp esión de
AQP1 mos aba una endencia en el aumen o de su exp esión alcanzando su
pico a las 48 ho as, a excepción del cul i o p ima io de plexo co oideo que
no mos aba di e encia alguna. En lo e e en e a si AQP1 e inc emen ada o
disminuida su exp esión en condiciones de hid oce alia, a día de hoy es á
bas an e discu ida, ya que mien as unos au o es en como la hid oce alia
p o oca la educción de la exp esión de AQP1 y con ello la p esión
in ac aneal y la p oducción de LCR, o os o no encuen an a iación alguna
u obse an una sob exp esión de la p o eína (Kalani e al., 2012). De odos
modos, la mayo ía apun a a que an e una si uación de hid oce alia, AQP1 e
educida su exp esión en plexo co oideo como mecanismo p o ec o que
pe mi a disminui la p esión in ac aneal y la p oducción de LCR. Po ello,
aunque la hid oce alia pueda p oduci una si uación de hipoxia, y es o
p o oca el aumen o de la exp esión de AQP1, pueden ac i a se o os
mecanismo en el o ganismo que como consecuencia enga la egulación a la
baja pa a que deje de pa icipa en la p oducción del LCR, o como po
ejemplo, al y como ocu e al inc emen a la p esión in ac aneal, agen es
neu oendoc inos del ipo pép idos na iu é icos, son eclu ados, siendo
capaces de educi el anspo e de agua en plexo co oideo al ac i ando a
cGMP que pe mi e bloquea a AQP1 (Paul e al., 2011).

137
DISCUSIÓN
7. Papel de las acuapo inas en ce eb o
Pa a una apo a una isión más global del papel que pueden ene las
acuapo inas en el SNC se analiza on di e en es á eas del ce eb o y la
exp esión de las acuapo inas que se exp esan en ellos. Se analiza on en
a ones bajo condiciones de hipoxia y en la línea de a ón hid oce álico hyh
como e emos en el siguien e apa ado. AQP1 al y como enimos
comen ando en el apa ado an e io sigue mos ando ese aumen o de su
exp esión bajo condiciones de hipoxia siendo egis ado su p esencia
únicamen e en plexo co oideo. Sin emba go, AQP4 es de ec ada en odos
los ejidos analizados mos ando una endencia p incipalmen e a aumen a
su exp esión en condiciones de hipoxia, al igual que ocu e en la o mación
de edemas, donde la si uación de hipoxia c eada a o ece su exp esión y
pa icipa aumen ando el paso de agua en la lesión (Kau y col., 2006). En
condiciones de hid oce alia, el en o no hipóxico c eado puede induci la
exp esión de AQP4, a o eciendo la eabso ción de agua, con ibuyendo a la
egulación homeos á ica. En el caso de AQP9, es de ec ada en odos los
ejidos y mos ó un aumen o de exp esión en odos, lo cual coincide con la
li e a u a, donde se obse a que an e algún daño ce eb al que lle e
asociado una hipoxia como un edema, AQP9 e aumen ada su exp esión
(Higashida y col., 2011).
138
DISCUSIÓN
8. Papel de AQPs en a ón hid oce álico hyh
En el caso de los a ones de eno ipo hid oce álico hyh, as ealiza un
análisis simila al de la hipoxia, se obse ó un pa ón de exp esión en las
acuapo inas di e en e, alejando a la hipoxia como p o agonis a en la
e iología de la en e medad, aunque no po ello no desempeñe algún papel.
En el caso de AQP1, en es e caso, en los a ones hyh la exp esión es meno ,
lo cual concue da con muchos de los es udios an es mencionado en el que
indicaban que an e una si uación de hid oce alia, como mecanismo
egulado , se inhibe la exp esión de AQP1 o se bloquea su unción, pa a que
así no pa icipe en la p oducción de LCR (Kalani e al., 2012). En el caso de
AQP4, emos como po lo gene al la exp esión disminuye en los a ones
hyh, a excepción del plexo co oideo, donde la exp esión aumen a
no ablemen e. En una si uación de hid oce alia, lo desc i o has a aho a es
que AQP4 en epéndima aumen a su exp esión pa a pode abso be el
exceso de líquido acumulado en el en ículo, sin emba go, en es e modelo
animal de hid oce alia, el epéndima su e una denudación que comienza en
los p ime os días de ida y acaba al alcanza la semana de habe nacido. Con
es a denudación del ejido ependima io, es a as ado con ello AQP4,
pe diendo a su ez la capacidad de egulación homeos á ica necesa ia pa a
sol en a esa acumulación de LCR en el en ículo (Roales-Bujan y col.,
2012). Es o puede explica la ele ada di e encia egis ada en plexo
co oideo, ya que pod ía es a sob eexp esándose en es e ejido pa a así
pode ealiza la unción pe dida en el epéndima. En el caso de AQP9, a
di e encia de la hipoxia, en condiciones de hid oce alia disminuye la
exp esión, lo cual puede se debido a un mecanismo egulado pa a no
a o ece la en ada de agua al ce eb o.
139
DISCUSIÓN
9. AQP4 en plexo co oideo
Has a aho a, en el plexo co oideo, siemp e se ha des acado el papel
exclusi o de AQP1 en su unción colabo ado a en la p oducción de LCR. Sin
emba go, ya son a ios los es udios que empiezan a da le cabida a AQP4 en
es e ejido, que, aunque no p esen a los mismos ni eles de exp esión que
AQP1, sin emba go, si se encuen a p esen e (Mobashe i e al., 2007;
Speake e al., 2003; Suzuki e al., 2013; Vene o e al., 1999). En nues os
esul ados, an o, po imnunihis oquímica, wes e n blo y PCR cuan i a i a,
hemos demos ado su p esencia an o a ni el de ARN como de p o eína,
aunque bien es cie o, que cuando in en amos localiza su ubicación, el
ma caje que nos p esen ó ue a ni el ci oplasmá ico y no de memb ana
como uno pod ía espe a . Es os esul ados esul an cohe en es con los
ob enidos espec o a los análisis de exp esión en condiciones e hipoxia y en
a ones hyh, ya que como hemos mencionado an e io men e an e
si uaciones de hipoxia AQP4 iende a sob eexp esa se, y en a ones hyh
exis e un aumen o de exp esión muy no able espec o al con ol w ,
pudiendo se debido a la compensación po la pé dida de AQP4 dispues a
en el ejido ependima io.