Acuaporinas en diversas patologías neurológicas

Instituto de Biomedicina de Sevilla Departamento de Fisiología Médica y Biofísica Universidad de Sevilla ACUAPORINAS EN DIVERSAS PATOLOGÍAS NEUROLÓGICAS Ismael Sánchez Gomar Trabajo presentado para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla, 2016. Dª. Miriam Echevarría Irusta, Profesora Titular de Fisiología, adscrita al Departamento de Fisiología Médica y Biofísica de la Universidad de Sevilla, CERTIFICA: Que Ismael Sánchez Gomar ha realizado bajo su dirección el trabajo titulado: “Acuaporinas en diversas patologías neurológicas” que presenta para optar al grado de Doctor por la Universidad de Sevilla. Fdo. Dª. Miriam Echevarría Irusta Sevilla, 19 de Abril de 2016 Instituto de Biomedicina de Sevilla Hospital Universitario Virgen del Rocío Avda. Manuel Siurot s/n, 41013, Sevilla I ÍNDICE Contenido pág. ABREVIATURAS ........................................................................................ VI INTRODUCCIÓN ........................................................................................ 3 1. Acuaporinas .............................................................................................. 3 1.1 Introducción a las acuaporinas (AQPs)............................................. 3 1.2 Clasificación y distribución de las acuaporinas ................................ 4 1.3 Estructura de las acuaporinas .......................................................... 5 1.4 Acuaporinas en el sistema nervioso central (SNC)........................... 7 1.5 Acuaporina 4 .................................................................................... 7 1.6 Acuaporina 1 .................................................................................... 9 1.7 Acuaporina 9 .................................................................................. 10 1.8 Funciones de las acuaporinas en el SNC ........................................ 11 1.8.1 Movimiento de agua en el cerebro ......................................... 11 1.8.2 Producción de líquido cefalorraquídeo ................................... 13 1.8.3 Migración de astrocitos ............................................................ 14 1.8.4 Neuroexcitación ......................................................................... 14 2. Patologías del sistema nervioso central asociado a AQPs ..................... 16 2.1 Edema ............................................................................................ 16 2.2 Tumores cerebrales ....................................................................... 18 2.3 Epilepsia ......................................................................................... 18 2.4 Neuromielitis óptica ...................................................................... 19 II 2.4.1 Introducción ............................................................................. 19 2.4.2 Clasificación ............................................................................. 20 2.4.3 Criterios de diagnóstico y características clínicas ............... 22 2.4.4 Patogénesis .............................................................................. 22 2.4.5 Detección de anticuerpos anti-AQP4 (NMO-IgG) ............... 26 2.4.6 Tratamiento ............................................................................. 28 2.4.7 AQP1 en NMOSD ..................................................................... 29 3. Hidrocefalia ............................................................................................. 31 3.1 Definición ....................................................................................... 31 3.2 Producción de líquido cefalorraquídeo. Plexo coroideo ............... 32 3.3 Papel de las AQPs en hidrocefalia de humano .............................. 33 OBJETIVOS .............................................................................................. 38 MATERIALES Y MÉTODOS........................................................................ 42 1. Técnicas de cultivo celular ...................................................................... 42 1.2 Condiciones de cultivo de la línea celular HEK293 (células embrionarias de riñón humano) ............................................................ 42 1.3 Cultivo primario de plexo coroideo de rata .................................. 43 1.3.1 Disección y dispersión de tejido ............................................. 43 1.3.2 Cultivo ....................................................................................... 44 2. Técnicas de biología molecular............................................................... 46 2.1 Generación de las construcciones del cDNA de AQP4 humana .... 46 2.2 Transfecciones de cultivos celulares de HEK 293 .......................... 52 III 2.3 Cultivos estables HEK293-pEGFP-N1-AQP4 ................................... 53 2.4 Western Blot .................................................................................. 54 2.4.1 Extracción de proteínas .......................................................... 54 2.4.2 Electroforesis SDS-PAGE, transferencia e inmunodetección ..................................................................... 54 2.5 Análisis de expresión de ARN mensajeros .................................... 56 2.5.1 Extracción de ARN total .......................................................... 56 2.5.2 Retrotranscripción ................................................................... 58 2.5.3 PCR cuantitativa o en tiempo real (PCRq) ............................ 58 3. ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) ...................................... 61 3.1 ELISA indirecto ............................................................................... 61 3.1.1 Extracción de proteínas .......................................................... 62 3.1.2 Detección de anticuerpos ....................................................... 63 3.2 ELISA sándwich .............................................................................. 65 4. Animales de experimentación ................................................................ 65 4.1 PCR convencional para genotipado de ratones ............................ 67 4.1.1 Ratones hidrocefálicos hop gait (hyh) .................................. 67 4.1.2 Ratones AQP1-KO .................................................................... 69 4.2 Exposición de ratones a hipoxia e hipercapnia ............................. 69 4.3 Obtención de tejidos ..................................................................... 70 5. Técnicas inmunológicas .......................................................................... 72 5.1 Inmunohistoquímica...................................................................... 72 IV 5.2 Inmunofluorescencia indirecta ..................................................... 72 5.3 Inmunofluorescencia indirecta – Método de diagnóstico ............ 73 5.3.1 Optimización del método de diagnóstico ............................. 75 6. Procesamiento de muestras de pacientes ............................................. 76 7. Análisis estadístico .................................................................................. 77 8. Anexos .................................................................................................... 78 8.1 Consentimiento informado ........................................................... 78 8.2 Clasificación de muestras de pacientes ........................................ 82 8.3 Anticuerpos primarios ................................................................... 83 8.4 Anticuerpos secundarios ............................................................... 84 RESULTADOS .......................................................................................... 88 1. Desarrollo de un sistema de diagnóstico para la Neuromielitis óptica .. 89 1.1 Detección de anticuerpos anti-AQP4 ............................................ 89 1.2 Verificación del método de diagnóstico ........................................ 92 1.3 Resultados globales por patología ................................................ 94 1.4 Optimización del método de diagnóstico ..................................... 95 1.5 Falsos positivos producidos por tratamiento con natalizumab .... 98 2. Presencia de anticuerpos anti-AQP1 en suero de pacientes con desordenes que se incluyen dentro del síndrome de la NMO (NMOSD) ............................................................................................... 102 2.1 Detección de anticuerpos anti-AQP1 por inmunofluorescencia. 103 2.2 Detección de anticuerpos anti-AQP1 por ELISA .......................... 108 V 3. Estudio de AQPs en líquido cefalorraquídeo de pacientes con hidrocefalia ............................................................................................ 109 4. Estudio de AQP1 en plexo coroideo de ratón ...................................... 112 5. Detección de AQP4 en plexo coroideo de ratón .................................. 116 6. Exploración de acuaporinas en otras áreas del cerebro de ratón ....... 118 7. Estudio de AQPs en cerebro del ratón mutante hyh (hydrocephalus hop gait) ....................................................................................................... 120 DISCUSIÓN ........................................................................................... 126 1. Desarrollo de sistema de diagnóstico para NMO ................................. 126 2. Optimización del sistema de diagnóstico ............................................. 128 3. Falsos positivos producidos por Natalizumab ………………………………… 129 4. AQP1 como biomarcador de la NMOSD .............................................. 132 5. Papel de las aquaporinas en la hidrocefalia en humanos ................... 134 6. Influencia de la hipoxia en aquaporinas del plexo coroideo ............... 135 7. Papel de las acuaporinas en cerebro ................................................... 137 8. Papel de AQPs en ratón hidrocefálico hyh .......................................... 138 9. AQP4 en plexo coroideo ...................................................................... 139 CONCLUSIONES ..................................................................................... 143 BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................... 148 4 INTRODUCCIÓN obstante no fue hasta los años noventa cuando, de forma azarosa al purificar la proteína de 32 kDa de la membrana de los eritrocitos responsable del factor Rh, se aisló otra fracción proteica de 28 kDa la cual fue denominada CHIP28, abreviado del inglés channel-forming integral protein de 28 kDa, y que más tarde sería denominada como AQP1 (Preston y Agre, 1991). Poco después, se demostró la capacidad de esta proteína para facilitar el transporte de agua a través de la membrana plasmática mediante la expresión heteróloga en ovocitos de Xenopus laveis (Preston y col., 1992). Se estableció así la identidad molecular del primer canal de agua, además la identificación molecular de AQP1 fue el detonante de la búsqueda que condujo al descubrimiento de las trece acuaporinas que hoy se conocen en humanos (Echevarria y col., 1994; Fushimi y col., 1993; Jung y col., 1994; Raina y col., 1995). 1.2 Clasificación y distribución de las acuaporinas En mamíferos se han identificado hasta el momento 13 miembros pertenecientes a la familia de las AQPs. La Tabla 1 muestra la distribución de estas proteínas en diferentes tejidos. Se puede apreciar cómo las acuaporinas se expresan en epitelios y endotelios implicados en el transporte de fluidos, pero también en tejidos donde, en principio, el trasiego de agua es menor; como la piel, tejido adiposo, astroglía, neuronas, etc. 5 INTRODUCCIÓN Acuaporina Expresión AQP0 Células fibrosas del cristalino AQP1 Eritrocitos, riñón, corazón plexo coroideo, tráquea, endotelio vascular, vejiga urinaria, uretra, pulmón, testículo, piel, cornea, útero, placenta… AQP2 Riñón AQP3 Riñón, epidermis, epitelio de las vías aéreas, tracto gastrointestinal, epitelios glandulares, hígado, pulmón, eritrocitos, útero… AQP4 Riñón, cerebro, pulmón, estómago, músculo esquelético y retina AQP5 Epitelios glandulares, córnea, epitelio alveolar, tracto gastrointestinal AQP6 Riñón AQP7 Tejido adiposo, testículo, riñón, corazón, tracto gastrointestinal AQP8 Hígado, páncreas, intestino, glándulas salivares, corazón, riñón, vías aéreas AQP9 Hígado, leucocitos, testículo, cerebro, riñón, pulmón, médula ósea AQP10 Intestino delgado AQP11 Riñón, hígado, cerebro, testículo AQP12 Células acinares de páncreas, ojo Tabla 1. Patrón de expresión tisular de las acuaporinas humanas (Modificado de (Verkman, 2005)) 1.3 Estructura de las acuaporinas Cada monómero de acuaporina (AQP) pesa alrededor de 30kDa, y en general, contiene 6 segmentos helicoidales transmembrana y dos que no abarcan la totalidad de la membrana (Figura 1b) (Walz y col., 2009). Las AQPs generalmente forman tetrámeros estables en las membranas, aunque cada monómero supone por separado un canal de agua (Figura 1a). Datos estructurales de alta resolución muestran que los dominios transmembranas helicoidales abarcan los espacios citoplasmáticos y 6 INTRODUCCIÓN extracelular siendo conectados a través de un poro acuoso (Ho y col., 2009). Simulaciones de dinámica molecular y datos estructurales sugieren que las moléculas de agua se mueven a través de este estrecho poro acuoso y que los factores estéricos y electrostáticos son los responsables de la selectividad del agua de las AQPs (Cui y Bastien, 2011; Hub y col., 2009). La estructura resultante encierra una zona central estrecha que se ensancha abriéndose hacia ambos lados de la membrana formando un poro en forma de reloj de arena. En la zona más estrecha del poro se acercan los dos tripletes NPA (asparagina (N), prolina (P) y alanina (A)), secuencias conservadas en todas las AQPs (Figura 1c) (Echevarria y Ilundain, 1998). Figura 1. Estructura de las acuaporinas. Vista desde arriba de la cara externa de la membrana de un homotetrámero de AQP1, con los monómeros que lo constituyen enumerados del 1-4 (a). La proteína presenta 6 dominios helicoidales transmembrana (M1, M2, M4, M5, M6, Y M8) y otros dos (M3 y M7) donde se encuentran los motivos conservados NPA (b). Los motivos NPA se disponen emparejados en la membrana originando un estrechamiento del poro. En rojo, c, se representa una cisteína sensible a compuestos mercuriales, con actividad bloqueante del canal (c). Modificado de Verkman AS, 2014 y Cheidde y Schorr, 1999. 7 INTRODUCCIÓN 1.4 Acuaporinas en el sistema nervioso central (SNC) La expresión de acuaporinas ha sido estudiada ampliamente en el sistema nervioso central, órganos sensoriales y sistema nervioso entérico y periférico. Su estudio es de gran relevancia debido a la implicación en la etiología de diferentes patologías neurológicas, siendo AQP1, AQP4 y AQP9 las descritas en el SNC. 1.5 Acuaporina 4 Existen dos isoformas principales de la proteína AQP4, M1 y M23, dependiendo de la longitud del extremo amino. M1 es la isoforma que presenta una longitud mayor, siendo M23 más corta, por la falta de 23 aminoácidos en el extremo amino terminal (Figura 2a) (Lu y col., 1996; Yang y col., 1995). AQP4 puede formar agregados supramoleculares en la membrana denominadas OAPs (del inglés ortogonal arrays of particles), que se visualizan mediante microscopía electrónica de criofractura como conjuntos ensamblados de partículas (Figura 2b) (Wolburg, 1995). M23 por sí mismo forma grandes OAPs en células transfectadas (Yang y col., 1996), mientras que M1 forma pocos o ningún OAPs. Sin embargo, M1 puede asociarse con M23 y formar OAPs mixtos (Figura 2c), siendo estos de menor tamaño que los que forma M23 por sí sola (Furman y col., 2003). Parece ser que las formación de OAPs viene determinada por la interacción entre los Nterminales de M23-M23 entre tetrámeros, interacción que no se produce en el caso de M1 por la diferencia de residuos de aminoácidos (Crane y Verkman, 2009). 8 INTRODUCCIÓN Figura 2. Secuencia y estructura de AQP4. El esquema muestra la secuencia de aminoácidos primaria y ubicación en la membrana (AQP4). Esta AQP presenta ocho segmentos helicoidales integrados en la membrana y dos sitios de iniciación, met1 y met23, correspondiente a las isoformas M1 y M23. Tetrámeros de AQP4 pueden formar agrupaciones ortogonales (OAPs) a través de las asociaciones de N-terminales intermoleculares entre isoformas M23 que implican los residuos que aparecen en color morado (A). Fotografía de microscopía electrónica por criofractura de los OAPs en la membrana plasmática (B). En una fotografía obtenida mediante el método dSTORM se observa como en los OAPs se coexpresan las isoformas M1 y M23 (C). Modificado de (Papadopoulos y Verkman, 2013). AQP4 es el canal de agua más abundante en el cerebro (Papadopoulos y col., 2004), médula espinal (Oshio y col., 2004) y nervio óptico (Nagelhus y col., 1998). En el cerebro, AQP4 se localiza principalmente en las prolongaciones de astrocitos subpiales que forman la membrana glial limitante que actúa como interfase entre el SNC y el líquido cefalorraquídeo 9 INTRODUCCIÓN (LCR), los pies de los astrocitos perivasculares que se encuentran en la interfase entre SNC y sangre, y en la membrana basolateral de los podocitos de las células ependimales y subependimales que forman la interfase entre el SNC y el LCR (Nielsen y col., 1997; Rash y col., 1998). Este patrón de expresión de AQP4 en los límites entre el cerebro y los principales compartimentos que contienen agua sugieren que AQP4 facilita el flujo de agua dentro y fuera del cerebro (Papadopoulos y Verkman, 2013). 1.6 Acuaporina 1 AQP1 se encuentra en la membrana plasmática de las células epiteliales del plexo coroideo que dan al ventrículo, lo que sugiere la participación de este canal en la secreción del LCR. AQP1 también se expresa en las células endoteliales vasculares de todo el organismo pero está ausente en el endotelio cerebrovascular a excepción de los órganos circunventriculares. Las células epiteliales cerebrovasculares expresan AQP1 en cultivo y en tumores cerebrales malignos cuando la barrera hematoencefálica está alterada. El cocultivo con astrocitos inhibe la expresión del ARNm de Aqp1 de las células epiteliales de microvasos vasculares. Esto sugiere que la interacción entre los podocitos y las células endoteliales inhibe la expresión de AQP1 (Papadopoulos y Verkman, 2013). 10 INTRODUCCIÓN 1.7 Acuaporina 9 AQP9 es la acuaporina menos abundante en el cerebro y su localización no ha sido aún bien definida debido a la baja especificidad de los anticuerpos disponibles. Hasta el momento, se ha descrito la presencia de AQP9 en neuronas de la sustancia negra, tanicitos y algunos astrocitos. Participa en el transporte de sustratos energéticos como glicerol y lactato, desempeñando por tanto un papel importante en el control energético del metabolismo cerebral (Badaut y Regli, 2004). Figura 3. Expresión y localización de AQPs en el cerebro. En el cerebro, AQP4 se expresa principalmente en las prolongaciones de los astrocitos de la glía limitante externa y en los pies de los astrocitos perivasculares. También se encuentra en la membrana plasmática basolateral de células ependimarias y en las prolongaciones de astrocitos subependimarios de la glía limitante externa. AQP1 se expresa en la membrana plasmática del epitelio de plexo coroideo, en la cara expuesta al líquido cefalorraquídeo. La expresión de AQP1 y AQP4 también existe en la médula espinal. Los lugares de expresión de AQP9 siguen sin estar claros. Modificado de (Papadopoulos y Verkman, 2013). 11 INTRODUCCIÓN 1.8 Funciones de las acuaporinas en el SNC El conocimiento de las funciones de las acuaporinas en el SNC se derivan en gran parte de experimentos realizados en ratones knockout de AQPs (AQP-KO) para diferentes condiciones patológicas, puesto que hasta la fecha no se han descrito inhibidores de AQPs que no sean tóxicos para el organismo y tampoco han sido identificadas en humanos mutaciones en AQPs que conlleven pérdida de función de éstas. Al menos tres grupos han generado ratones AQP4-KO que han permitido describir tres principales funciones como son el facilitar el paso de agua hacia dentro y hacia fuera del SNC, migración de astrocitos y neuroexcitación. Experimentos in vivo describen la ausencia de AQP1 en astrocitos de ratón, pero sin embargo su expresión si se detecta en astrocitos de mono (Arcienega y col., 2010), sugiriendo esto que puede existir una variación en la funcionalidad o importancia de AQPs entre roedores y primates. A continuación se describe más en detalle como las AQPs participan de estas tres funciones principales en el SNC. 1.8.1 Movimiento de agua en el cerebro En adultos, la cavidad intracraneal está comprendida por varios compartimentos (sangre, líquido cefalorraquídeo y los espacios intersticiales e intracelulares del parénquima cerebral) y está rodeada por un cráneo no distensible. El movimiento del agua a través de estos compartimentos se produce en respuesta a cambios osmóticos y fuerzas hidrostáticas. Aunque las moléculas de agua pueden atravesar las membranas directamente y en 12 INTRODUCCIÓN menor grado a través de transportadores de glucosa y canales iónicos, AQP4 juega un papel esencial en la determinación de la permeabilidad al agua de la barrera hematoencefálica (BHE). La eliminación de la expresión de AQP4 se asocia a una reducción de siete veces la permeabilidad al agua de la membrana plasmática en cultivo de astrocitos (Solenov y col., 2004) y de diez veces la permeabilidad en la BHE en cerebro de ratón (Papadopoulos y Verkman, 2005). La reducción del 27% de la expresión de AQP4 mediante ARN interferente (siRNA), causó en cerebro de rata una disminución del 50% en el coeficiente de difusión aparente, lo que es consistente con una reducción de la permeabilidad al agua en la membrana plasmática de los astrocitos (Badaut y col., 2011). Sin embargo, en ratones AQP4-KO se ha observado una presión intracraneal normal (Papadopoulos et al., 2004) y tan sólo un pequeño incremento en el contenido de agua total del cerebro (HajYasein y col., 2011; Papadopoulos et al., 2004). Estos resultados sugieren que AQP4 no es necesaria para movimientos relativamente lentos del agua dentro y fuera del cerebro que tiene lugar bajo condiciones fisiológicas normales, ya que estos pueden ocurrir a través de vías independientes de dicha proteína. En enfermedades del SNC, tales como daño cerebral, meningitis, tumor cerebral e hidrocefalia, el flujo de agua hacia dentro y fuera del cerebro aumenta, causando un incremento de la presión intracraneal por el exceso de acumulación de agua en los compartimentos intracraneales. Este aumento de la presión intracraneal es perjudicial, ya que puede causar isquemia cerebral, hernia y, en última instancia, la muerte cerebral (Marmarou, 2007; Papadopoulos y Verkman, 2007). Es en estas situaciones patológicas en las que AQP4 facilita el transporte de agua cerebral, cobrando así importante relevancia funcional. 13 INTRODUCCIÓN 1.8.2 Producción de líquido cefalorraquídeo La idea general que se tiene en la actualidad en relación a las AQPs y su papel en la homeostásis del LCR es que AQP1 participa en la secreción de LCR y AQP4 en su absorción. El LCR es secretado por el plexo coroideo y absorbido a través de las granulaciones aracnoideas del seno venoso y otras rutas como el flujo transependimal en el cerebro. La producción de LCR involucra el transporte activo de Na+, via la ATPasa Na+/K+, desde la sangre a los ventrículos, generando un gradiente osmótico que impulsa el flujo de agua. AQP1 se expresa en la cara apical del epitelio del plexo coroideo (Nielsen y col., 1993). La comparación de ratones AQP1-KO respecto a silvestres muestran una reducción de cinco veces la permeabilidad al agua, y un descenso del 50% en la presión intracraneal. En AQP1-KO la producción de LCR se vio reducida en un 25%, sugiriendo la participación de AQP1 en su producción, aunque no de forma exclusiva (Oshio y col., 2005). Por su parte, AQP4 presente en células ependimarias y astrocitos subependimarios parece ser determinante en el flujo de LCR entre ventrículos y parénquima cerebral, no quedando claro sin embargo el papel que desempeña en los plexos coroideos (Mobasheri y col., 2007; Speake y col., 2003; Suzuki y col., 2013; Venero y col., 1999). El beneficio clínico de la inducción de AQP4, es predicho por un modelo de análisis de múltiples compartimentos, en el que tan sólo duplicando la permeabilidad de AQP4 se reduciría la dilatación ventricular y la presión intracraneal en más de un 40%, y podría tener un impacto significativo en el resultado clínico de las hidrocefalias (Bloch y col., 2006). 20 INTRODUCCIÓN EM y aunque existen datos de pacientes con NMO de todos los continentes, los estudios epidemiológicos son muy escasos y su incidencia y prevalencia están todavía pobremente establecidos (Mandler, 2006; Mealy y col., 2012). La incidencia de NMO es mayor en poblaciones asiáticas, india y negra con respecto a la población caucásica, coincidiendo a su vez estos grupos étnicos con una tasa de pacientes con EM más baja (Cossburn y col., 2012; LanaPeixoto, 2008; Rivera y col., 2008). La mayoría de los pacientes que desarrollan la NMO suelen ser mujeres, llegando a ser la tasa de incidencia de entre 3:1 o incluso 6:1 según la población (Cossburn et al., 2012; Mealy et al., 2012; Wingerchuk, 2009). La prevalencia de la enfermedad en mujeres puede sugerir alguna asociación directa al cromosoma X o que las hormonas sexuales juegan un papel en el desarrollo de la NMO (Wingerchuk, 2009). La edad de inicio varía desde la infancia hasta la edad adulta, pero la enfermedad afecta a los adultos, en su mayoría jóvenes, con una edad media de inicio superior a la de EM (Kim et al., 2011; Lana-Peixoto, 2008) y que en función del país de estudio, se contempla dentro del rango de los 40 a 55 años (Mealy et al., 2012; Papais-Alvarenga y col., 2002). 2.4.2 Clasificación La enfermedad puede seguir un curso monofásico o recidivante. La NMO de curso monofásico fue la primera descrita por Eugène Devic (Devic, 1894), donde la mielitis transversa y la neuritis óptica ocurren simultáneamente o en un corto período de tiempo. Sin embargo, en más del 80-90% de los casos, la NMO suele seguir un curso recidivante, siendo la de 21 INTRODUCCIÓN curso monofásico la menos frecuente (Mata y Lolli, 2011; Papadopoulos y col., 2014). La alta especificidad de los anticuerpos IgG anti AQP4 (NMO-IgG) ha sido utilizada para expandir el espectro clínico y de neuroimagen de la NMO. Se ha establecido un consenso para la definición de este nuevo espectro clínico de la NMO (NMOSD), que unifica el concepto tradicional de la NMO junto a las definiciones modernas surgidas en torno a NMOSD. Este consenso permite un diagnóstico de la NMOSD donde tienen cabida la seropositividad y seronegatividad de las muestras para NMO-IgG, siempre que estén asociadas a otras características clínicas como se muestran en la Tabla 2 (Wingerchuk y col., 2015). Criterios de diagnóstico para NMOSD con AQP4-IgG 1. Al menos una característica clínica básica. 2. Test positivo para anticuerpos AQP4-IgG mediante método de detección (CBA recomendada) 3. Exclusión de diagnósticos alternativos Criterios de diagnóstico para NMOSD sin AQP4-IgG o sin determinar 1. Al menos 2 características clínicas básicas ocurren como resultado de uno o más ataques y cumple con los siguientes requerimientos: a. Al menos una característica clínica básica debe ser neuritis óptica, mielitis aguda con LETM o síndrome del área postrema. b. Diseminación en el espacio c. Cumplimiento de IRM requeridas 2. Test negativo para anticuerpos AQP4-IgG o test no disponible Características clínicas básicas 1. Neuritis óptica 2. Mielitis aguda 3. Síndrome de área postrema 4. Síndrome del tronco del encéfalo agudo 5. Narcolepsia o síndrome diencefálico agudo con lesiones en IRM típicas de NMOSD Tabla 2. Guía diagnóstica para la NMOSD. Tomado y modificado de (Wingerchuk et al., 2015) 22 INTRODUCCIÓN 2.4.3 Criterios de diagnóstico y características clínicas Para un diagnóstico correcto de la enfermedad, los criterios establecidos desde 2006 determinan que se debe cumplir que el paciente presente una mielitis aguda, neuritis óptica y al menos uno de los siguientes criterios: lesión de al menos 3 segmentos de la médula espinal, no cumplir criterios de diagnóstico para EM o presentar anticuerpos anti-AQP4 en suero (Wingerchuk y col., 2006). Diversas enfermedades autoinmunes han sido descritas en al menos un 30% de pacientes con NMO, lo que sugiere que personas con esta condición pueden tener una predisposición genética a una autoinmunidad anómala (Iyer y col., 2014). La presencia de mutaciones en AQP4, parece no tener en cuenta la susceptibilidad a NMO (Matiello y col., 2011), y aunque algunos estudios parecen encontrar relación entre alelos HLA (antígenos leucocitarios humanos) y NMO (Brum y col., 2010; Matsushita y col., 2009), otros no han encontrado relación (Zephir y col., 2009), lo que sugiere una susceptibilidad genética compleja, multifactorial, que hace que esta enfermedad sea heredable en tan sólo un 3% de los casos (Matiello y col., 2010). 2.4.4 Patogénesis La respuesta de las inmunoglobulinas (IgG) a autoantígenos refleja la colaboración y regulación de las células T con células B antígeno específicas. El papel de las células T efectoras, específicas para AQP4, no ha sido descrito aún, pero éstas células podrían contribuir al inicio en la disrupción de la barrera hematoencefálica (Pittock y col., 2006). En lesiones establecidas de 23 INTRODUCCIÓN NMO, las células plasmáticas, un tipo de linfocito B productor de anticuerpos, producen IgG y existe evidencia de un incremento de producción intratecal de NMO-IgG, observándose que a elevados niveles hay correlación significativa con ataques severos de la enfermedad (Iorio y col., 2011; Kremer y col., 2013; Magana y col., 2009; Vernant y col., 1997). La interleucina 6, citoquina con actividad proinflamatoria, mejora la supervivencia de las células plasmáticas, siendo mayores sus niveles en plasma de pacientes con NMO que en controles sanos. Estas células plasmáticas se detectan en sangre periférica de pacientes con NMO y son más numerosas en la fase de ataque de la enfermedad. En experimentos in vitro, se ha observado que la interleucina 6 promueve la producción de IgG específicas de AQP4 por células plasmáticas derivadas de sangre y LCR de pacientes con NMO (Long y col., 2014a; McKeon y col., 2008; Pittock y col., 2008; Vernant et al., 1997). Para que tenga lugar la patogenicidad de las células, se requiere de la unión de IgG al dominio extracelular de AQP4 (McKeon y col., 2009). AQP4IgG es predominantemente del tipo IgG1, un potente activador del sistema del complemento. La formación de OAPs por AQP4 cubre un papel importante en la patogénesis de la enfermedad, ya que los anticuerpos NMO-IgG se unen con mayor afinidad a los OAPs que a los tetrámeros aislados que también forma AQP4 (Crane y col., 2011). El incremento de esta afinidad descrita, implica un mayor efecto en la citotoxicidad, en el que la proteína del complemento C1q, se une con mayor eficiencia cuando AQP4 forma estas estructuras macromoleculares (Phuan y col., 2012). Los anticuerpos NMO-IgG que están unidos a tetrámeros de la isoforma M1, rápidamente se internalizan en vesículas por mecanismos de protección 24 INTRODUCCIÓN propios de la célula, sin embargo, los que se unen a los OAPs, formados principalmente por M23, poseen un tamaño mayor que excede la capacidad del astrocito para poder ser endocitado (Bergamaschi y col., 2009). Los OAPs permitirán crear un entorno de elevada densidad de IgG agrupados que ante la presencia del complemento producirá una llamativa activación de éste, promoviendo la quimiotaxis de leucocitos, permeabilidad vascular con afluencia masiva de plasma rico en IgG, complemento y factor reumatoide, el cual mejora aún más la activación del complemento (McKeon et al., 2009). El bloqueo del flujo de agua por los autoanticuerpos, podría explicar el prominente edema intramielínico observado en lesiones tempranas de NMO, el cual es un precursor potencial de la desmielinización (Armagan y col., 2012; Bergamaschi et al., 2009). La alteración de la homeostasis del glutamato es otra posible propiedad potencialmente patógena de AQP4-IgG. El transportador de glutamato también llamado “excitatory aminoacid transporter-2, (EAAT2)” está unido de forma no covalente a AQP4 en la membrana presináptica de astrocitos, por lo que se co-internaliza ante la presencia de AQP4-IgG. EAAT2 realiza el 90% de la captación de glutamato en el SNC. Experimentos in vitro muestran como en cultivos de astrocitos, ante la presencia de AQP4-IgG se reduce la captación de glutamato. Además, las lesiones de medula espinal en pacientes de NMO muestran una materia gris con elevada deficiencia de EAAT2 (Reindl y col., 2013). Este efecto de los anticuerpos AQP4-IgG sobre el transportador EAAT2, reduciendo su actividad, tiene como consecuencia el aumento de niveles extracelulares de glutamato, los cuales resultan tóxicos para los oligodendrocitos ocasionando su muerte, y por ello se postula como 25 INTRODUCCIÓN otra posible causa de la desmielinización en NMO (Hoftberger y col., 2015; Kitley y col., 2014b). El fármaco Ceftriaxone, potente estimulador del transportador de glutamato (EEAT2) (Rothstein y col., 2005), fue propuesto para su uso en NMO (Ratelade y Verkman, 2012), sin embargo, otros autores, descartan la relación de altos niveles de NMO-IgG con la disminución en la captación de glutamato (Ratelade y col., 2011). Figura 5. Mecanismos de patogénesis de NMO. AQP4-IgG y las células plasmáticas productoras de estos anticuerpos, atraviesan la barrera hematoencefálica hacia el SNC, donde AQP4-IgG se une a las AQP4 de los astrocitos. Esta unión implica la activación del sistema del complemento, que conduce a la inflamación, daño en oligodendrocitos, desmielinización y muerte neuronal (Papadopoulos et al., 2014). 26 INTRODUCCIÓN 2.4.5 Detección de anticuerpos anti-AQP4 (NMO-IgG) En la actualidad, son varias las técnicas que permiten detectar los anticuerpos anti-AQP4 en el suero de pacientes, técnicas que pueden ser clasificadas en función de si el ensayo se realiza sobre tejido, células o proteínas (Trebst y col., 2014). La detección de anticuerpos anti-AQP4 ha avanzado considerablemente en los últimos años mejorando la sensibilidad del diagnóstico sin comprometer la especificidad (Wingerchuk et al., 2015). De las técnicas desarrolladas hasta la fecha, los resultados obtenidos indican que el método basado en células transfectadas con AQP4 (Cell Based Assay, CBA) es el que permite un mejor diagnóstico, con una sensibilidad de 76% y especificidad del 99%. Otros métodos, como el que se realiza sobre tejidos con expresión endógena de AQP4 (Tissues Based Assay, TBA), o ensayos de ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), muestran menor sensibilidad y especificidad, siendo en el TBA la sensibilidad del 59% y la especificidad del 98%, o en los ensayos de ELISA la sensibilidad del 65% y la especificidad del 97% (Ruiz-Gaviria y col., 2015). Existen pacientes que cumplen los criterios del NMOSD, en los que no se han detectado anticuerpos anti-AQP4, lo que supone un verdadero reto en el diagnóstico (Marignier y col., 2013). La mayoría de los pacientes que padecen NMO en su variante monofásica tienen más probabilidad de ser seronegativos para anticuerpos anti-AQP4 que los que presentan la variable con recaídas (Jarius y col., 2012). Para una pequeña parte de los pacientes que presentan características clínicas de NMO, casi todos seronegativos en la detección de NMO-IgG, se ha descrito la presencia de anticuerpos contra la glicoproteína de la mielina de oligodendrocitos (MOG) (Kitley et al., 27 INTRODUCCIÓN 2014b; Kitley y col., 2012; Mader y col., 2011; Sato y col., 2014). Estos hallazgos podrían sugerir que algunos pacientes seronegativos para NMOIgG con características clínicas y de neuroimagen de NMOSD tienen una patogénesis subyacente diferente (Marignier et al., 2013), aunque el papel de los anti-MOG y otros anticuerpos aún está por determinar (Reindl et al., 2013). Ocasionalmente puede ocurrir que un paciente en un primer análisis no presente anticuerpos NMO-IgG, pero que posteriormente si los presente. Aunque este hecho pueda tener explicaciones técnicas, en algunos casos los niveles de anticuerpos se ven incrementados en episodios de recaída y a su vez disminuyen con los tratamientos de inmunosupresión al que se someten los pacientes (Jarius y col., 2008). Existen casos clínicos de NMO en los que se han detectado anticuerpos NMO-IgG en líquido cefalorraquídeo, pero no en suero, aunque no resulta frecuente (Jarius y col., 2010; Kalluri y col., 2010; Klawiter y col., 2009; McKeon y col., 2011). La detección de anticuerpos NMO-IgG facilita el diagnóstico de la enfermedad en estadíos tempranos, o al menos para descartar como diagnóstico la esclerosis múltiple, resultando ser un avance de gran importancia, ya que observaciones recientes sugieren que el tratamiento para EM como interferón-β, natalizumab y fingolimod pueden ser perjudiciales para pacientes con NMO (Kimbrough y col., 2012; Kleiter y col., 2012; Min y col., 2012; Papeix y col., 2007). 28 INTRODUCCIÓN 2.4.6 Tratamiento Las terapias para tratar la NMO consisten en reducir al mínimo la discapacidad neurológica aliviando los ataques agudos y previniendo de las exacerbaciones futuras. Las terapias agudas están diseñadas para minimizar las lesiones y acelerar la recuperación, mientras que las terapias preventivas se centran en la reducción de la frecuencia y severidad de los ataques. Para tratar ataques agudos suele aplicarse un tratamiento basado en metilprednisolona intravenosa y plasmaféresis. Los corticosteroides tienen multitud de efectos antiinflamatorios e inmunosupresores, incluyendo la reducción de linfocitos y monocitos circulantes; disminución de la expresión de moléculas de adhesión celular y metaloproteinasas; y la alteración de la transcripción de citoquinas proinflamatorias. Para la prevención de los ataques, se aplica una terapia inmunosupresora desde el primero, debido a la alta probabilidad de repeticiones. Las terapias preventivas se utilizan para agotar poblaciones de células inmunes, disminuir anticuerpos AQP4-IgG circulante, o interferir en la proliferación celular inmune o de activación. Curiosamente, los agentes más comúnmente usados, azatioprina, micofenolato y rituximab, se dirigen principalmente a los linfocitos y parecen disminuir la actividad de la enfermedad sin efectos consistentes sobre los títulos de AQP4-IgG. La respuesta clínica sugiere que los linfocitos podrían promover la actividad de la enfermedad a través de diversas y complejas funciones, incluyendo la presentación de antígenos, la producción de citoquinas proinflamatorias y alteración de redes inmunes reguladoras (Papadopoulos et al., 2014). 29 INTRODUCCIÓN Existen otros tratamientos que resultan efectivos para tratar la esclerosis múltiple pero que sin embargo pueden empeorar el curso de la NMO. Un ejemplo es el caso del natalizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido contra la integrina α4β1 VLA-4 (very late antigen 4). Se ha descrito que el natalizumab no tiene efecto o incluso produce un empeoramiento de la enfermedad en pacientes con NMO seropositivos para NMO-IgG (Barnett y col., 2012; Kleiter et al., 2012) y también en pacientes NMO seronegativos (Kitley y col., 2014a). En un estudio de 5 pacientes con NMO a los cuales se les trató con natalizumab, se registraron 9 recaídas y un incremento en la Escala Expandida del Estado de Discapacidad (EDSS) de 4 a 7 de media (Kleiter et al., 2012). Las lesiones observadas durante el tratamiento con natalizumab mostraron una desmielinización activa, una severa infiltración de neutrófilos y eosinófilos y muerte de astrocitos (Barnett et al., 2012). El natalizumab puede incrementar la actividad de la enfermedad a causa del incremento del número de células T proinflamatorias periféricas o eosinófilos (Polman y col., 2006) , pudiendo estos últimos migrar al SNC y agravar la formación de la lesión (Lucchinetti y col., 2002; Zhang y Verkman, 2013) o facilitar la estabilización de células plasmáticas de la médula ósea específicas de AQP4 (Chu y col., 2011). 2.4.7 AQP1 en NMOSD Varias publicaciones han descrito que además de AQP4, los astrocitos del SNC también expresan abundante AQP1 en la superficie (Gao y col., 2012; Misu y col., 2013; Satoh y col., 2007). Especialmente se ha observado una elevada expresión en áreas propensas a desarrollar lesiones OBJETIVOS 38 OBJETIVOS OBJETIVOS Dos grandes Objetivos orientaron el trabajo que aquí se presenta. - El primero fue entender el papel de AQP4 en la patología de la Neuromielitis óptica (NMO), y desarrollar un sistema de diagnóstico, específico, sensible, rápido y cuantitativo, para la NMO mediante la detección de anticuerpos anti-AQP4 (y anti AQP1) en suero de pacientes. - El segundo fue estudiar la participación de las principales acuaporinas de cerebro en la homeostasis del líquido cefalorraquídeo (LCR) en situación control y bajo el estímulo hipóxico; y discernir el posible papel de estas proteínas en el desarrollo de la hidrocefalia, usando modelos animales y analizando muestras de LCR de humanos. MATERIALES Y MÉTODOS 42 MATERIALES Y MÉTODOS MATERIALES Y MÉTODOS 1. Técnicas de cultivo celular 1.2 Condiciones de cultivo de la línea celular HEK293 (células embrionarias de riñón humano) La línea celular HEK293 fue utilizada en los experimentos de detección de anticuerpos anti-AQP4 y anti-AQP1 de sueros de pacientes. La composición del medio utilizado para su cultivo fue la siguiente: Para el mantenimiento de las células, tanto las silvestres (wild type) como las líneas de sobreexpresión de AQP1 y AQP4, se sembraban en placas de poliestireno tratadas para cultivo celular (Nunc, Dinamarca) de 10 cm de diámetro, con 10 ml del medio descrito anteriormente y se mantuvieron en el incubador a 37ºC, 5% CO2 y saturación de humedad. Los pases se realizaban cada 4 días, cuando alcanzaban una confluencia del 90-95%, a una dilución 1:5 utilizando tripsina 0,25% (Sigma, EEUU) para despegar las células. Las transfecciones se realizaban entre los pases 3 y 15. •DMEN (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (GIBCO) •1% Penicilina/Estreptomicina (10000 U/ml) (BioWhittaker) •10% Suero fetal de ternero (GIBCO) inactivado 30 min a 65ºC. Medio de cultivo - HEK293 43 MATERIALES Y MÉTODOS 1.3 Cultivo primario de plexo coroideo de rata 1.3.1 Disección y dispersión de tejido Para la elaboración del cultivo primario de plexo coroideo de rata, se partió de los tejidos extraídos como se detalla en el apartado 4.3, conservados en un eppendorf de 1,5ml con 0,5 ml de HBSS (Gibco) frío y estéril. Los tejidos fueron fragmentados mecánicamente en campana de extracción de flujo (Telstar Bio II A) con unas tijeras estériles tipo castroviejo con la parte activa curva (WPI, 501234) durante al menos 5 minutos. Con este procedimiento troceamos el tejido, pero para obtener una dispersión a nivel de célula, se incubó el tejido en un tubo de 15ml con 1 ml de solución de digestión que contenía proteasas (pronase, Calbiochem) a una concentración de 4mg/ml. Esta solución fue previamente filtrada con un filtro de 0,22µm para mantener las condiciones de esterilidad. Se dejó incubar en el baño a 37ºC durante 10 minutos. A continuación se detuvo la digestión añadiéndole 4ml de HBSS. Para limpiar el homogenado celular se centrifugó a 800x g durante 5 minutos a 4ºC. Para una mayor limpieza, tras desechar el sobrenadante, se resuspendió en 6ml de HBSS y se repitieron las mismas condiciones de centrifugado. Tras esto, se descartó el sobrenadante y el pellet se resuspendió en 2ml de medio de cultivo, siendo la composición de éste: 44 MATERIALES Y MÉTODOS Seguidamente, para evitar acúmulos, se dispersaron mecánicamente las células con ayuda de una jeringa y aguja de 20 gauges, pasándolas a través de ésta al menos 10 veces. Para el recuento de células fueron retirados 10 µl que fueron mezclados a su vez con 10µl de azul de tripano (Trypan Blue, Sigma), producto que tiñe las células muertas. Se contaron teñidas con “tripan blue” con contador de células (marca), obteniéndose normalmente suspensiones en torno a un total de 4x105 células/ml. 1.3.2 Cultivo Las células se sembraron en placas de 35mm (marca) previamente tratados con colágeno tipo I (marca). El tratamiento de las placas se realizaba del siguiente modo: Se preparaba una dilución 1:10 del colágeno en agua estéril con la que se cubrían completamente la superficie de las placas, dejándose durante 24 horas a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se le retiraba el colágeno y se dejaba secar en condiciones de esterilidad. •DMEN (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) (GIBCO) •1% Penicilina/Estreptomicina (10000 U/ml) (BioWhittaker) •10% Suero fetal de ternero (GIBCO) inactivado 30 min a 65ºC. •Factor de crecimiento epidérmico (EGF) (Sigma Aldrich) Medio de cultivo - plexo coroideo- 51 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 10. Clonación de las isoformas M1 y M23 de AQP4 en pEGFP-N1. En el esquema se muestra la estructura de las construcciones pEGFP-N1-AQP4M1 y pEGFP-N1-AQP4M23 sucesivamente. El plásmido pEGFP-N1 codifica una variante de la GFP nativa, optimizada para obtener una mayor expresión y fluorescencia más brillante en células de mamíferos. La región MCS se encuentra entre el promotor CMV y la secuencia codificante de EGFP, así los genes clonados en el MCS se expresarán fusionados por el extremo N-terminal a la proteína EGFP. Representación de los plásmidos que se desarrollaron, donde se muestra la clonación de las isoformas M1 y M23 por separado en el vector pEGFP-N1. El vector posee un gen de resistencia a kanamicina, importante para la selección de colonias bacterianas que portan el plásmido, y también un gen de resistencia a neomicina. Para la clonación de las isoformas M1 y M23 de AQP4 se usaron técnicas básicas de biología molecular entre las que se incluyen: purificación de fragmento de ADN desde geles de agarosa con el kit QIAEX II (QIAGEN, Alemania); reacciones de ligación con T4 ligasa (Promega, EE.UU.), transformación de células competentes E. coli DH5α, extracción de ADN (mini-prep y maxi-prep (QIAGEN)) de colonias transformantes, análisis y confirmación de las construcciones por enzimas de restricción y secuenciación. 52 MATERIALES Y MÉTODOS 2.2 Transfecciones de cultivos celulares de HEK 293 Las transfecciones en líneas celulares se realizaron mediante lipofección (Lipofectamine 2000, Invitrogen) (Figura 11). El día anterior a la transfección, al cultivo se le sustituía el medio por el mismo sin suero ni antibióticos, ya que el suero afecta a la actividad de la lipofectamina y los antibióticos pueden dañar la célula por los poros que produce en la membrana plasmática. Para la formación de los complejos plásmidolipofectamina se realizaron en medio OPTI-MEM (Gibco), usando los volúmenes indicados por el fabricante. La mezcla se homogeneizó y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente (t.a.). Esta mezcla se añadió gota a gota en la placa que contenía el cultivo. Las placas se incubaron a 37ºC durante 6 h. Transcurrido este tiempo, se le sustituía el medio por el DMEN completo. Figura 11. Proceso de lipotransfección. 53 MATERIALES Y MÉTODOS 2.3 Cultivos estables HEK293-pEGFP-N1-AQP4 Mediante el procedimiento de transfección, se obtiene un cultivo transitorio, pero el interés final era tener un cultivo estable. Para ello, en el primer pase de las células se sembraron a una dilución elevada (1:30), de este modo las células crecerían lo suficientemente dispersas como para poder seleccionarlas. Tras unos 4 días de crecimiento, se procedía a picar las colonias formadas de la siguiente manera: En las condiciones máximas de esterilidad, bajo una lupa (Olympus SZX10), con una pipeta P10, se iban retirando colonias aisladas y estas se sembraban directamente en placa de 24 pocillos (Nunc) con medio DMEN completo más geneticina (20 mg/ml) (G418, Gibco). La placa se incubaba a 37ºC. Los cultivos estables se realizaron con las transfecciones del clon pEGFP-N1-AQP4, construcción que lleva asociada al gen de interés el gen para la proteína fluorescente, EGFP (Enhanced Green Fluorescent Protein). Esta simultaneidad de expresión nos permitirá ver bajo el microscopio invertido de fluorescencia (Olympus IX-71) con el filtro FITC (Fluorescein isothiocyanate) qué células de las que hemos seleccionado expresan la AQP4, ya que al microscopio se verán verdes. Transcurridos al menos 4 días, se verificaba la pureza de los cultivos seleccionados bajo el microscopio y se seleccionaban como candidatas definitivas para el cultivo estable, sembrándolas en una nueva placa de un tamaño mayor. 54 MATERIALES Y MÉTODOS 2.4 Western Blot 2.4.1 Extracción de proteínas Tras los diferentes tratamientos a los que fueron expuestos las células, las proteínas se extrajeron del siguiente modo: Las células eran lavadas con PBS frío a pH 7.4 y se recogían en 1ml de PBS 1x con ayuda de un recolector (cell scraper, Sarstedt). Las células resuspendidas se recogían en un eppendorf y se centrifugaban durante 5 min a 300 x g a 4ºC. Para la extracción de proteínas del plexo coroideo, también se realizaba un paso de centrifugación para eliminar los restos de PBS presente en la muestra. Los pellets obtenidos eran resuspendidos en un tampón de extracción de proteínas. En el caso del tejido, para una mejor disgregación, se pipeteaba repetidas veces hasta dejar de apreciar a simple vista la morfología membranosa. Tras 5 min en hielo las muestras se homogenizaban con un vórtex durante 10 segundos y se centrifugaba a velocidad máxima (Eppendorf, 5415R) a 4ºC durante 15 min. Finalmente se recogía el sobrenadante y conservaba a -20ºC hasta su uso. La concentración de proteínas se determinaba por el método Bradford utilizando el kit comercial Biorad Protein Assay (Biorad, EEUU). 2.4.2 Electroforesis SDS-PAGE, transferencia e inmunodetección Para el análisis de proteínas por western blot se usaron 20 µg de proteínas totales. En primer lugar se desnaturalizaban sometiéndolas a choque térmico de 95ºC durante 5 min en tampón de carga, para correrlas 55 MATERIALES Y MÉTODOS en un gel de poliacrilamida al 10% bajo condiciones desnaturalizantes y reductoras (SDS-PAGE) utilizando el sistema Mini-protean (Biorad). La electroforesis se realizó a 150mV en la misma solución de carga (ver abajo su composición). Los geles se transferían a membranas PVDF (polifluoruro de vinilideno; Hybond-P; Amersham Biosciences, EEUU), previamente activadas con metanol, en un sistema de transferencia semi-seca (Sigma) durante 2 horas a 52,8 mA y utilizando una solución de transferencia, cuya composición se indica a continuación. Tras la transferencia las membranas se pasaban a 0.1% Tween 20 en PBS (PBTw 0.1%) y se bloqueaban durante 2 horas en solución bloqueante cuya composición se describe abajo, para luego ser incubadas durante toda la noche a 4ºC con el anticuerpo primario a dilución óptima (Tabla). Tras la incubación con el anticuerpo 1º las membranas se lavaban 4 veces en PBTw 0.1% durante al menos 5 min e incubaban 1 hora a t.a. en solución bloqueante con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa a la dilución óptima (Tabla). Finalmente, se hacían 4 lavados de 5 min en PBTw 0.1% y se procedía al revelado por quimioluminiscencia utilizando el kit ECL PLUS Western Blot Detection System (GE Healthcare, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. La fluorescencia emitida se detectaba mediante el lector Typhoon 9400 Variable Mode Imagen y se cuantificaba utilizando el programa Image J (NIH). 56 MATERIALES Y MÉTODOS 2.5 Análisis de expresión de ARN mensajeros 2.5.1 Extracción de ARN total Los estudios de expresión génica se llevaron a cabo mediante la extracción de ARN total de los tejidos o células en cultivos primarios de PC. La cantidad de material dependió del experimento y del tipo de muestra. El tratamiento del material, tanto en la disgregación como en el procesado para la extracción de ARNm fue diferente según el caso: Cultivo primario de plexo coroideo Se añadía 1 ml de TRIzol (Invitrogen) al cultivo celular y las células se levantaban de la placa con la ayuda de un scraper. Una vez resuspendidas, el homogeneizado se recogía con una pipeta de la placa y se pasaba a un tubo eppendorf libre de ARNasa. A continuación se incubaba durante 5 minutos a •Tampón de extracción de proteínas:50 mM HEPES pH 7.3 (ajustado con KOH), 5 mM EDTA pH 8, 250 mM NaCl, 5 mM DTT, y 0.2 % NP-40. Se le añadía justo antes de la extracción de proteínas, un cocktail de inhibidores de proteínas (Sigma) a una concentración final de 1/100, ortovanadato sódico (Na3VO4) y fluoruro de fenilmetil sulfonilo (PMSF) a una concentración final de 1mM. •Tampón de carga:62.5 mM Tris-HCl pH 6.8, 10% glicerol, 2% SDS, 100 mM DTT y 0.004% Bromophenol blue. •Tampón de electroforesis:25mM Tris, 192mM glicina y 0.1% SDS. •Solución de transferencia:25 mM Tris, 192 mM glicina y metanol al 20 % (v/v). •Solución bloqueante: 5% (p/v) leche desnatada en polvo (Central Lechera Asturiana, España) en PBTw-0.1% Soluciones utilizadas 57 MATERIALES Y MÉTODOS t.a. Con el fin de separar las proteínas se añade 200 μl de cloroformo por cada ml de TRIzol. Se agitaba vigorosamente y dejaba 2-3 minutos a t.a. A continuación la mezcla se centrifugaba a no más de 12000 x g 15 min a 4ºC. Tras la centrifugación se podía observar tres fases bien diferenciadas, de las cuales se recogía cuidadosamente la fase superior acuosa y pasaba a un eppendorf limpio. Se añadían 500 μl de isopropanol para precipitar el ARN (500 μl/ml de TRIzol), agitándolo suavemente e incubando 10 minutos a t.a. y terminar centrifugando a 12000 x g 10 minutos a 4°C. El pellet de ARN se lavaba con etanol 75% frio y se centrifuga a 7500 x g, y se deja secar en hielo para resuspenderlo finalmente en agua desionizada libre de ARNasa. Plexo coroideo El instrumental utilizado para la cirugía y disección se trató previamente con etanol 70% y con RNaseZap (Ambion). Las soluciones utilizadas se trataron con Dietilpirocarbonato (DEPC, Sigma) para inhibir las ARNasas. Los PC se recolectaban en un eppendorf libre de ARNasas, se congelaban inmediatamente en nitrógeno líquido y se guardaban a -80ºC hasta realizar la extracción del ARN. La extracción se realizó mediante el kit RNeasy Micro Kit (Qiagen). A la muestra se le añadía 350μl de solución de lisis RLT (Qiagen) con 3,5μl de βmercaptoetanol (Sigma) y se homogenizaba en el politrón (Pro Scientific, Inc-02-07075). La extracción se continuaba según las indicaciones del fabricante. La cantidad de ARNm se cuantificó midiendo la densidad óptica a 260 nm en el NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, EE.UU.). Las muestras se guardaban a -80°C hasta su utilización. 58 MATERIALES Y MÉTODOS 2.5.2 Retrotranscripción La transcripción inversa siempre se inició con 5 μg de ARN en el caso de las células, previamente tratado con DNasa I (Roche, Alemania) a fin de eliminar el ADN genómico contaminante. En el caso del plexo partimos de 1 μg a causa de la poca cantidad obtenida. La retrotranscripción se llevó a cabo usando el kit SuperScript II RNase Hreverse transcriptase (Invitrogen). El ARN se incubaba con una mezcla de 50 ng de Random Hexamers y 1mM de dNTPs, durante 5 min a 65°C. Posteriormente se añadía a la mezcla 5mM MgCl2, 10mM DTT, 40U de inhibidor de RNasas y 50U de la enzima SuperScript II. Esta mezcla se incubaba a 25°C durante 15 min, después a 42°C durante 50 min y por último se inactivaban las enzimas incubando a 72°C durante 15 min. Se llevaba a cabo un paso opcional de eliminación de ARN añadiendo 1 μl de ARNasaH e incubando a 37ºC durante 20 min. El ADN complementario (ADNc) obtenido se conservaba a -20ºC hasta su uso. 2.5.3 PCR cuantitativa o en tiempo real (PCRq) La amplificación del ADN en una reacción de PCRq tiene tres fases bien diferenciadas: exponencial, lineal y de meseta. La monitorización de dichas fases en tiempo real es posible mediante el empleo de fluorocromos como el SYBR Green (Applied-Biosystems); esta molécula se intercala en el surco menor de la doble hélice de ADN y fluoresce cuando es irradiada con luz ultravioleta. 59 MATERIALES Y MÉTODOS Figura 12. Dibujo que muestra el proceso de unión del SYBR Green a las nuevas cadenas de ADN sintetizadas. La cuantificación por PCR a tiempo real se basa en el hecho de que, durante la fase exponencial de la reacción, la cantidad de ADN amplificado es directamente proporcional a la cantidad de ADN molde inicial. El parámetro principal que nos va a permitir la cuantificación es el denominado “Ct” (Threshold Cycle), el ciclo en el cual comienza a detectarse la amplificación del ADN. Las reacciones de PCR cuantitativa se realizaron utilizando el sistema “ABI Prism 7000 y 7500 Sequence Detection System” (Applied-Biosystems, Inglaterra). El protocolo optimizado de PCR, según las recomendaciones del fabricante, consistió en una primera fase de 10 min a 95°C y una segunda con 45 ciclos de 15 seg de desnaturalización a 95°C y 1 min de amplificación a 60°C. Los oligonucleótidos se diseñaron con el programa “Primer Express” Versión 2.0 (Applied-Biosystems). Cada pareja de oligonucleótidos fueron diseñados para generar un amplicón de no más de 150-200 nucleótidos, tal y como recomienda el fabricante para una óptima eficiencia de la reacción. En la Tabla 5 se muestra un listado de los oligonucleótidos utilizados para la amplificación de los diferentes genes analizados por PCRq. 60 MATERIALES Y MÉTODOS Las reacciones de PCR se realizaron por triplicado en un volumen total de 30 μl que contenía 15 μl de Master mix SYBR Green (Applied-Biosystems), 150-300nM de oligonucleótidos específicos y 0,1-1 μl de ADNc. Tras el protocolo de amplificación, se incluyó un paso adicional que consistió en un aumento progresivo de la temperatura de 60 a 95°C para obtener la “curva de disociación”. Con este protocolo se obtiene la temperatura de disociación o Tm (Temperature of melting) del fragmento de ADN amplificado. La curva de disociación permite, por un lado, comprobar si la Tm obtenida se corresponde con el valor teórico para el amplicón y, por otro, diferenciar los productos específicos de la amplificación de los primerdimers. En todos los experimentos realizados se comprobó que las curvas de disociación mostrasen un pico único de fluorescencia y que coincidiera con el valor teórico de la Tm para cada fragmento amplificado. Tabla 5. Oligonucleótidos diseñados para la PCRq. En la tabla se muestran las secuencias de los oligonucleótidos sense y antisense diseñados para la PCR cuantitativa. Para el análisis de los resultados se empleó el método de cuantificación relativa. No obstante, siempre se determinó la eficiencia de Gen Sense 5’ 3’ Antisense 5’ 3’ AQP4 (m) GCGGTGGGGTAAGTGTGGA TTCTCCACGGTCAATGTCA AQP4 (r) TGGCAGGTGCACTTTACGAGT CAGCTTTGCTGAAGGCTTCCT AQP1 (m) TTCACTTGGCCGCAATGA CCAGCTGCAGAGTGCCAAT AQP1 (r) CCATTGACCACTGGCATAGTACA AGTGTCCTGACCTGTGAAGTGAGTA AQP9 (m) GGAAAACTGCTCGTCGTAGG CCCAGGTTTCTGGAGTCAAA 18s (m) AACGAGACTCTGGCATGCTAA GCCACTTGTCCCTCTAAGAAGT HPRT (r) AGTCCCAGCGTCGTGATTAG CCATCTCCTTCATGACATCTCG α4 INTEG GGCAAGGAAGTTCCAGGTTACAT ATGCTTCCTGTAATCACGTCAGAA CYCLO ATGGCAAATGCTGGACCAAA CATGTCGTCCCAGTTGGTAACA β-ACTIN AGGCCAACCGTGAAAAGATG GCCTGGATGGCTACGTACATG 67 MATERIALES Y MÉTODOS Los roedores fueron suministrados y estabulados por el Animalario de la Universidad de Sevilla y por el Servicio de Producción y Experimentación Animal del Instituto de Biomedicina de Sevilla (IBiS). La estabulación se realizó en jaulas ventiladas, con temperatura constante (22±1ºC), con ciclos alternantes de luz-oscuridad de 12 h, y con libre acceso al alimento y al agua. Para el manejo experimental y su posterior sacrificio los animales fueron anestesiados mediante inyección intraperitoneal de tiobarbital (B/Braun), a una dosis eutanásica de 200 mg/kg en el caso de las ratas, o mediante dislocación cervical en el caso de los ratones. Ambas drogas fueron suministradas por la Farmacia del Hospital Virgen del Rocío. Todos los animales fueron manipulados y tratados de acuerdo a la guía de cuidados de animales de laboratorio del Consejo Comunitario Europeo (86/609/EEC). Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité Ético de Investigación con Animales de la Universidad de Sevilla. 4.1 PCR convencional para genotipado de ratones 4.1.1 Ratones hidrocefálicos hop gait (hyh) El genotipado de los ratones hidrocefálicos se realizó mediante una PCR estándar, seguida de una digestión enzimática (L.F. Bátiz et al.). En primer lugar se realizaba la PCR para amplificar la secuencia del gen Napa, obteniéndose tanto en homocigotos para la mutación como en silvestres, un fragmento de ADN del mismo tamaño (108 pb). Para poder discernir entre un genotipo u otro, era necesario realizar una restricción de la secuencia amplificada por PCR con la enzima de restricción BspHI, ya que la secuencia 68 MATERIALES Y MÉTODOS que reconoce esta enzima se ve modificada en la mutación, realizándose únicamente el corte en el gen silvestre (Figura 7). L.F.Bátiz et al. Figura 15. Procedimiento de genotipado en ratones hidrocefálicos hop gait (hyh). 69 MATERIALES Y MÉTODOS 4.1.2 Ratones AQP1-KO El genotipado de los ratones se realizó mediante PCR estándar, usando cebadores o “primers” específicos (Ma et al, 1998) que permiten identificar a los ratones homocigotos KO (-/-) por la amplificación de una banda de 460 pares de bases, a los homocigotos (+/+) por una banda de 530 pb y a los heterocigotos (+/-) mediante la amplificación de las dos bandas respectivas. 4.2 Exposición de ratones a hipoxia e hipercapnia Los animales se sometieron a hipoxia crónica del 10% de O2 usando cámaras herméticas (COY Laboratory Products INC) (Figura 16). La cámara se compone de una caja estanca de metacrilato, que dispone de una esclusa con doble puerta, que permite la entrada y salida de jaulas de animales sin que se alteren las condiciones en el interior del equipo. También dispone de un sensor de O2 que permite la monitorización continua de los niveles de este gas. Este sensor regula la inyección tanto de N2, para disminuir la presión parcial de O2, como de aire para aumentarla; consiguiéndose así mantener estables los niveles requeridos de hipoxia. Para controlar la temperatura y evitar que aumente en el interior de la cámara se dispone de aire acondicionado en la habitación, permaneciendo la temperatura a 22±1°C. La humedad relativa del aire se mantiene entre el 70-80% por dos sistemas; uno que produce condensación de agua mediante enfriamiento y otro que permite la recirculación del aire por unas columnas de gel de sílice (Panreac, España). Los niveles de CO2 en la cámara permanecen por debajo 70 MATERIALES Y MÉTODOS del 0,1% mediante un sistema que filtra el aire por columnas de Sodasorb (Grace lab., Francia). Los animales controles mantenidos en normoxia (21% de oxígeno) se sometieron a las mismas condiciones en la cámara de hipoxia, siendo la única variación la de los niveles de oxígeno. Figura 16. Cámara de hipoxia. Fotografía de la cámara de hipoxia utilizada para someter a los animales a un tratamiento crónico de hipoxia, pudiendo controlar estables variables como la humedad. 4.3 Obtención de tejidos Los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical, mientras que a las ratas se les administró una dosis eutanásica de tiobarbital seguido del uso de la guillotina. Para la obtención del plexo coroideo, se extraía el cerebro completo y se pasaba a una placa con PBS 1x frio. Con la ayuda de un bisturí y unas pinzas, se realizaba un corte para separar el cerebelo, desechándose. Otro corte era realizado sagitalmente, dividiendo el cerebro en dos y que 71 MATERIALES Y MÉTODOS permitía acceder directamente al ventrículo lateral como se indica en la Figura 17. Con la ayuda de unas pinzas se accedía al ventrículo donde se encuentra el plexo coroideo, siendo extraído con sumo cuidado pinzando en el lugar de anclaje de éste. El plexo era conservado en nitrógeno líquido y luego a -80ºC en el caso de que se fuera a utilizar en experimentos de ARN o proteínas, o se conservaban en PBS frío para ser utilizado inmediatamente en técnicas inmunohistoquímicas o cultivo primario. Figura 17. Fotografía de cerebro de rata. En las imágenes se muestra indicado los lugares de corte para dejar el ventrículo lateral a la vista y así poder acceder fácilmente al plexo coroideo. 72 MATERIALES Y MÉTODOS 5. Técnicas inmunológicas 5.1 Inmunohistoquímica Esta técnica fue utilizada para verificar la presencia de AQP1 en el plexo coroideo. Para ello, se extrajeron PC de ratones silvestres y KO para AQP1 de la línea de ratones AQP1-KO. Para este ensayo inmunohistoquímico fue necesario bloquear previamente la enzima peroxidasa endógena del tejido, lo cual se realiza por incubación del tejido durante 30 minutos con peróxido de hidrógeno (Fluka) al 0,4% en PBS 1x. A continuación se bloquea durante una hora con una solución PBS 1x con 10% de suero bovino (Gibco), 0,1% de BSA (albúmina sérica bovina) y 0.3% de Tritón X100 (Sigma). Se incuba el tejido con anticuerpo primario policlonal de conejo anti-AQP1 (Tabla 8) toda la noche a 4ºC, seguido del anticuerpo secundario anti-conejo biotinilado (1:1, Kit Dako System-HRP DAB) durante 2 horas a t.a. En el paso siguiente se produce la unión de los complejos de avidina-biotina-peroxidasa al secundario biotinilado para amplificar la señal. Seguidamente se procede al revelado de 3 minutos mediante la reacción de la peroxidasa con un sustrato cromogénico, la diaminobencidina (DAB), apareciendo un precipitado marrón allá donde exista expresión de AQP1. 5.2 Inmunofluorescencia indirecta Se realizaron ensayos de inmunofluorescencia sobre plexos coroideos, para el estudio de localización de AQP1 y 4. Este ensayo se realizaba el mismo día que se extraían los plexos. Se incubaban durante 10 min en 73 MATERIALES Y MÉTODOS paraformaldehido (PFA) (Sigma) al 4% para fijar el tejido. Seguidamente se lavaron 3 veces en PBS 1x durante 5 min, continuando con el bloqueo con una solución de PBS 1x con 5% de BSA durante 1 hora a t.a. Se incubaron con los anticuerpos primarios de AQP1 y 4 (Tabla 8); y el suero de paciente NMO-IgG+ y NMO-IgG -, durante toda la noche a 4ºC. Al día siguiente, se lavaban los tejidos con 0.1% de Tritón X-100 (Sigma), 3 veces durante 5 min cada una. De este modo, a la vez que se lavaba el tejido también se permeabilizaba, paso que hasta ahora era prescindible debido a que las acuaporinas son proteínas de membrana y se puede ver afectada su detección. Sin embargo, para la detección de proteínas como TTR (transtiretina), e-cadherina es necesario permeabilizar el tejido. Tras la permeabilización, se realizaba un nuevo bloqueo con solución PBS1x con 5% de BSA y 0,1% Tritón X-100 durante 1 hora a t.a. Seguidamente se incubaba con el anticuerpo primario de e-cadherina y TTR (tabla 8) durante toda la noche a 4ºC. Al dia siguiente se lavaba con PBS1x, 3 veces, 5 min. A continuación, se incubaba con el anticuerpo secundario correspondiente (Tabla 9) en solución de bloqueo durante 1 hora a t.a.. Transcurrido este tiempo, se lavaban los tejidos 3 veces con PBS 1x. Por último se incubaba con dapi (4 ',6-diamino-2-fenilindol, 1:1000) durante 10 min a t.a. y se procedía a montar los tejidos sobre portas con solución Dako (S302380Dako). 5.3 Inmunofluorescencia indirecta – Método de diagnóstico Una vez puesto a punto el cultivo estable con la proteína de interés sobreexpresándose, estas preparaciones se empleaban en los ensayo de 74 MATERIALES Y MÉTODOS inmunofluorescencia para la detección de anticuerpos. En el caso de la detección de anticuerpos anti-AQP4 (NMO-IgG) en suero de pacientes, este ensayo servía como diagnóstico para la neuromielitis óptica (NMO), debido a la exclusiva presencia de anticuerpos anti-AQP4 en estos pacientes. En el caso de AQP1, su detección, se usó con interés más descriptivo que clínico. Las células se sembraban en placas con pocillos de 15,6 mm de diámetro con cubres tratados con Poly-L-lysine solution (Sigma) al 10%. Se dejaban durante 24 horas creciendo en medio DMEN completo, y se pasaba a realizar la inmunofluorescencia. Transcurridas las 24 horas, las células se lavaban con PBS 1x una sola vez, a continuación se fijaban con paraformaldehído (Sigma) al 3% durante 5 min a t.a. Se hace una fijación rápida para afectar lo menos posible a las proteínas de membrana. Se realizaban 3 lavados con PBS 1x seguidos del bloqueo con 5% BSA (albúmina sérica bovina), 10% FBS (suero bovino fetal) en PBS 1x, durante 45 min a t.a. A continuación, se incubaba con el anticuerpo primario, que en este caso era el suero de paciente (1:50), durante 1 hora a t.a. Como control positivo se utilizaba un suero de paciente con anticuerpos anti-AQP4 (NMO-IgG) previamente ya confirmado por el Hospital Clinic de Barcelona, y como control negativo se utilizó un suero de paciente con esclerosis múltiple y por tanto sin anticuerpos NMO-IgG. Las muestras se lavaban con PBS 1x 3 veces, 5 min, y se pasaba a incubar con el anticuerpo secundario Alexa fluor antihuman (Tabla 9) durante 30 min a t.a. De nuevo, se lavaban las muestras con PBS 1x 3 veces. Por último se incubaban las muestras con DAPI (Tabla 9), marcaje fluorescente nuclear durante 10 min a t.a. Los cubres eran montados en cubres con solución Dako (S302380, Dako) y tras dejar secar pasaban a analizarse al microscopio de fluorescencia (Olympus DX-61). 75 MATERIALES Y MÉTODOS En el caso de la detección de anticuerpos anti-AQP1, se realizó el mismo protocolo, a excepción del control positivo, que se utilizó un anticuerpo primario comercial (tabla 8) y se dejó incubar durante 24 horas a 4ºC. 5.3.1 Optimización del método de diagnóstico Este ensayo, al tener interés clínico, fue mejorado para que los resultados se obtuviesen con la mayor rapidez posible (Figura 10). Para ello, una vez fueron fijadas las células, éstas se congelaron a -80ºC inmersa en una solución de 10% DMSO (dimetilsulfóxido, Sigma) en PBS 1x. De este modo, siempre que se recibía una muestra de paciente, en el mismo día era posible tener un resultado cualitativo, y dos para uno cuantitativo. Figura 18. Diagrama resumen de la mejora del método de diagnóstico. 76 MATERIALES Y MÉTODOS 6. Procesamiento de muestras de pacientes Tanto para los ensayos de detección de anticuerpos en suero de pacientes anti-AQP4 (NMO-IgG) como para la detección de la proteína de AQP1 y AQP4 en muestras de líquido cefalorraquídeo, contábamos con la colaboración de neurólogos y neurocirujanos del Hospital Universitario Virgen del Rocío (HUVR) para la recogida de muestras de pacientes. Las muestras se recogían cumpliendo todos los requisitos necesarios para ser registradas en el Biobanco perteneciente al HUVR, mediante la cumplimentación del consentimiento informado definido por este organismo (Figura 11). En el caso de las muestras para la detección de NMO-IgG, se recibían extracciones de sangre en tubos vacutainer, con activador de la coagulación y gel separador de suero. Mediante una centrifugación a 500g durante 15 min a 4ºC, se obtenía el suero, y era rápidamente conservado a -80ºC. Las muestras recogidas pertenecían a pacientes que presentaban algún tipo de enfermedad neurológica, siendo las más frecuentes la de pacientes con esclerosis múltiple (Tabla 6) Las muestras de líquido cefalorraquídeo se recibían en tubos sin ningún tipo de tratamiento. Estas muestras se centrifugaban en las mismas condiciones que antes se ha descrito y se descartaba los restos de tejido presentes en la muestra. Igualmente, se conservaban a -80ºC. Las muestras eran clasificadas según el tipo de hidrocefalia que padeciese el paciente (Tabla 7), discriminándose entre hidrocefalia obstructiva, comunicante o sin hidrocefalia. 83 MATERIALES Y MÉTODOS Diagnóstico Tipo de hidrocefalia Nº pacientes Género F/M Media edad +/- sd Hidrocefalia Obstructiva 14 9/5 51,4 +/- 18,6 Comunicante 56 30/26 57,42 +/- 18,64 No hidrocefalia No hidrocefalia 15 6/9 53,07 +/- 17,81 Tabla 7. Variables demográficas y clínicas de pacientes en el estudio de la hidrocefalia. Tabla con la información demográfica y clínica de las muestras de suero utilizadas en los ensayos relacionados con la hidrocefalia. En la tabla se muestran las diferentes muestras de líquido cefalorraquídeo clasificadas en función de la presencia de hidrocefalia o no, y el subtipo en caso de presentarse. 8.3 Anticuerpos primarios Antígeno Origen Tipo Dilución Compañía Ref. AQP4 Conejo Poli 1:1000 Abcam ab46182 AQP4 Conejo Poli 1:1000 Alpha Diagnostics AQP41-A AQP1 Conejo Poli 1:10000 Abcam ab15080 β-actina Ratón Mono 1:10000 Abcam ab6276 G6PDH Conejo Poli 1:1000 Abcam ab993 TTR Oveja Poli 1:500 Abcam ab9015 e-cadherina Ratón Mono 1:300 BD Bioscience 610181 AQP1 Ratón Mono 1:500 Abcam ab117970 Natalizumab Mono 1:10 Tysabri ID: 3753128 Tabla 8. Listado de anticuerpos primarios utilizados. 84 MATERIALES Y MÉTODOS 8.4 Anticuerpos secundarios Antígeno Reactividad Origen Dilución Compañía Ref. IgG H&L (HRP) Humano Pollo 1:30000 Abcam Ab6864 IgG H&L (HRP) Conejo Cabra 1:5000 Pierce 31460 Alexa 635 IgG Ratón Cabra 1:400 Invitrogen A31340 Alexa 488 IgG Ratón Mono 1:200 Invitrogen A21202 Alexa 568 IgG Cabra Mono 1:400 Invitrogen A11057 Alexa 568 IgG Humano Cabra 1:1000 Invitrogen A21090 Dapi Todos Químico 1:1000 Invitrogen D1306 Tabla 9. Listado de anticuerpos secundarios y marcadores RESULTADOS 88 RESULTADOS RESULTADOS Los resultados que se presentan en el presente trabajo abordan la implicación de diversos miembros de la familia de las AQPs en el desarrollo de dos enfermedades neurológicas, la neuromielitis óptica y la hidrocefalia. En la neuromielitis óptica, basados en trabajos previos que aportan observaciones clínicas y patológicas que indican la participación directa de los anticuerpos anti-AQP4 en el desarrollo y diagnóstico de la NMO (Lennon y col., 2004; Lucchinetti et al., 2002; Nakamura y col., 2005; Pittock et al., 2006) quisimos estudiar en mayor profundidad el papel desempeñado por las AQPs en la etiología de la enfermedad y su uso clínico como marcador biológico en el diagnóstico de esta enfermedad. En la hidrocefalia por otra parte, donde la participación de AQP1 había sido también propuesta para explicar el origen de ésta patología (Filippidis y col., 2011; Kalani et al., 2012; Wang y col., 2011), quisimos ahondar en entender si existe relación fisiopatológica entre la expresión de AQPs cerebrales y la hidrocefalia, analizando muestras de líquido cefalorraquídeo de pacientes hidrocefálicos y haciendo uso de dos modelos animales de los que disponíamos, el KO (-/-) de AQP1 y el ratón “hop gait” genéticamente hidrocefálico (Batiz y col., 2006; Bronson y Lane, 1990). 89 RESULTADOS 1. Desarrollo de un sistema de diagnóstico para la Neuromielitis óptica Con el fin de poder establecer en nuestro laboratorio un sistema de diagnóstico para la neuromielitis óptica, se desarrollaron técnicas para la detección de anticuerpos anti-AQP4 humanos (NMO-IgG), mediante la sobreexpresión de AQP4 humana en células, que servirían como antígeno para detectar mediante técnicas de inmunofluorescencia los anticuerpos presentes en suero de pacientes potencialmente afectados por la enfermedad y como controles sueros de pacientes que pertenecían a un amplio espectro de enfermedades neurológicas y voluntarios sanos. 1.1 Detección de anticuerpos anti-AQP4 El cDNA que codifica para la proteína de AQP4 humana en sus isoformas M1 y M23, fue clonado en el vector de expresión pCMV6 el cual codifica también por la expresión de una proteína fluorescente verde llamada EGFP, por “enhanced Green fluorescent protein”, bajo el mismo promotor del inserto (AQP4). De este modo, al expresarse la proteína de AQP4, a su vez se expresará también la proteína EGFP, evidenciándose su expresión por la presencia de un color verde que se detectará al microscopio de fluorescencia. En la puesta a punto inicial de detección de anticuerpos anti-AQP4 se hizo uso de una muestra de suero de un paciente positivo para NMO y que tenía anticuerpos anti AQP4, confirmados por el Hospital Clinic de Barcelona, centro de referencia en España para este diagnóstico. Como se aprecia en la figura 20, la señal verde (EGFP) “in situ” indica la expresión de AQP4, que coincide con el marcaje rojo producido por 90 RESULTADOS el anticuerpo secundario-fluorescente, que reconoce a la IgG del suero del paciente unida a la proteína de AQP4 expresada. En esta figura se puede observar claramente, además, los OAPs (“ortogonal array proteins”) arreglo ortogonal típico formado por la sobrexpresión de la isoforma M23 de AQP4. Figura 20. Colocalización de AQP4 y EGFP mediante detección con anticuerpos anti AQP4 presentes en el suero de paciente NMO positivo. La sobrexpresión de pCMV6-N-EGFP-AQP4 se muestra mediante fluorescencia de color verde (A). Inmunofluorescencia indirecta que muestra la presencia de anticuerpos anti AQP4 en la muestra de suero de paciente (B). Colocalización de las señales de sobrexpresión de AQP4 y de la detección de anticuerpos (C y D). 91 RESULTADOS La puesta a punto del ensayo de diagnóstico se amplió haciendo una exploración de muestras pertenecientes a controles sanos y otras enfermedades de carácter neurodegenerativo para así comprobar la eficiencia del método desarrollado. A su vez, mediante el programa informático Image J, se cuantificó la señal de fluorescencia obtenida, expresada en píxeles. La observación al microscopio de fluorescencia (Figura 21a), mostró que únicamente las muestras de pacientes con NMO, presentaban niveles de fluorescencia apreciables comparables al control positivo, a diferencia del resto de muestras que no presentaron ningún tipo de marcaje. En la Figura 21b se corroboró este resultado mediante la cuantificación de la fluorescencia, encontrándose diferencias estadísticamente significativas cuando se compararon los niveles de fluorescencia de las muestras de controles positivos para la NMO con respecto a la detectada en el control negativo. 92 RESULTADOS Figura 21. Fotos de microscopia fluorescente y cuantificación de la fluorescencia en muestras de pacientes. Inmunofluorescencia indirecta para la detección de anticuerpos anti-AQP4 (A) y cuantificación con image-J de la fluorescencia en muestras de pacientes con Neuromielitis óptica (NMO), esclerosis múltiple (EM), mielitis longitudinal extensa (MLE) y controles sanos (CS). (*p<0.05 y **p<0.01) (B). 1.2 Verificación del método de diagnóstico Con la ayuda del Dr. Albert Sáiz, neurólogo de referencia del Hospital Clinic de Barcelona, experto en el diagnóstico de Neuromielitis óptica en el país, obtuvimos muestras de sueros de pacientes ya analizadas en ese 99 RESULTADOS Figura 26. Marcaje producido por el suero de paciente con tratamiento de natalizumab. Inmunofluorescencia indirecta anti-AQP4 de muestra NMO+ y suero de pacientes tratados con natalizumab (A). Cuantificación de la fluorescencia de muestras NMO+ (verde), NMO- (gris) y suero de pacientes tratados con natalizumab (naranja). **p≤0.01, ***p≤0.001 (B). 100 RESULTADOS Para confirmar que estos resultados se debían a efectos producidos por la presencia de Natalizumab en el suero de los pacientes se procedió a repetir el ensayo inmunológico pero utilizando Tysabri directamente como anticuerpo primario, en vez de usar el suero de los pacientes. Tysabri es un producto comercial que contiene el mismo principio activo presente en el tratamiento genérico conocido como natalizumab. Los resultados (figura x), mostraron gran similitud entre el patrón de marcaje mostrado por el suero de un paciente que estaba bajo tratamiento con natalizumab y el producido por Tysabri. En ambos casos se observó un marcaje específico de membrana, pero sin relación con la sobrexpresión de EGFP-AQP4. Se observó marcaje de todas las células mientras que la sobreexpresión de EGFP-AQP4, en esta ocasión abarcaba menos del 50% del total de células en el campo. 101 RESULTADOS Figura 27. Detección de natalizumab en suero frente al comercial. Inmunofluorescencia indirecta que muestra el marcaje producido por el suero de paciente con tratamiento de natalizumab y el natalizumab comercial (Tysabri). Una vez verificada la interferencia del natalizumab en el diagnóstico y comprobar que el marcaje no correspondía a AQP4, se pasó a buscar cual era el antígeno responsable por esta señal (falsa positiva) que observábamos. El natalizumab, es un anticuerpo monoclonal que interacciona con integrinas, glicoproteínas de membrana que participan en la unión de la célula con la matriz extracelular o con otras células. En nuestros cultivos se usaron células HEK293 (células embrionarias de riñón humano), las cuales expresan de forma constitutiva un tipo de integrina, la integrina alfa 4. La presencia de esta integrina se confirmó, mediante el estudio de la expresión por PCR cuantitativa en cultivos de HEK293 sin transfectar y transfectados con AQP4-M23 y con un vector vacío (p3T). Como se observa en la Figura 28, 102 RESULTADOS se detectó expresión de la integrina en los diferentes casos de células HEK analizadas, comprobándose que la expresión constitutiva de ésta integrina no se veía afectada al ser las células transfectadas con otros genes. Figura 28. PCR cuantitativa de ITGα4. Se muestran los niveles de expresión de ITGα4 en cultivo celular HEK293 sin transfectar y transfectada con los genes de AQP4-M23 y p3T. Así, el marcaje de membrana que presentan algunas muestras de sueros de pacientes con EM, es debido al tratamiento de natalizumab, y al reconocimiento por este anticuerpo monoclonal de las integrinas que se encuentran en la membrana de las células HEK293 usadas para el ensayo. 2. Presencia de anticuerpos anti-AQP1 en suero de pacientes con desordenes que se incluyen dentro del síndrome de la NMO (NMOSD) Varios estudios han descrito la presencia de anticuerpos anti-AQP1 en suero de pacientes clasificados como dentro del espectro clínico de la NMO. Utilizando ensayos de inmunofluorescencia (Long et al., 2014b) o mediante 103 RESULTADOS técnicas de ELISA y radioinmunoprecipitación (Tzartos et al., 2013), estos autores detectan la presencia de AQP1. Sin embargo, las inconsistencias encontradas en ambos trabajos y la falta de reproducibilidad de dichos resultados por otros autores (Schanda et al., 2015), han añadido muchos interrogantes a la posibilidad de una verdadera relación entre la presencia de anticuerpos anti-AQP1 y el espectro clínico de la NMO En este apartado se muestran los resultados de diversos análisis, de inmunofluorescencia indirecta en células transfectadas con AQP1 y ensayos de ELISA, realizados con las muestras de suero recolectadas y previamente analizadas para la detección de anti NMO-IgG, y ahora usadas para la detección de anticuerpos anti-AQP1. 2.1 Detección de anticuerpos anti-AQP1 por inmunofluorescencia El ensayo se realizó siguiendo el protocolo ya puesto a punto para la detección de anticuerpos anti-AQP4, pero ahora utilizando células HEK293 a las que se les transfectó el clon pCMV6-AQP1-EGFP para así obtener un cultivo celular que sobreexpresaba AQP1 y EGFP simultáneamente. Se analizaron todos los sueros recolectados hasta la fecha y se compararon con los resultados obtenidos en la detección de anticuerpos anti-AQP4. Los resultados (Figura 29) mostraron que los sueros pertenecientes a pacientes del espectro NMO (NMOSD) (A’) presentaban un marcaje similar al control negativo (B’). Por el contrario, la detección de anticuerpos anti-AQP4 en los mismos sueros realizada paralelamente mostró una intensa señal en las muestras de suero de pacientes NMO+. 104 RESULTADOS Figura 29. Inmunofluorescencia de AQP1 y AQP4 con suero de pacientes sobre células no permeabilizadas. Comparación de la señal de AQP1 y AQP4 con el ensayo de inmunodetección hecho usando células sin permeabilizar tal como se describió para el diagnóstico de AQP4. Expresión de AQP1-EGFP (A,B).Expresión de AQP4-EGFP (C,D). Suero de paciente NMOSD positivo (A’,C’). Suero de paciente NMOSD negativo (B’,D’). Tras los resultados negativos obtenidos, el ensayo de inmunofluorescencia fue repetido, pero esta vez siguiendo las condiciones de permeabilización del tejido descritas previamente (Long, Youming et al., 2014) por autores que confirman la presencia de anticuerpos anti-AQP1 en 105 RESULTADOS el suero de pacientes con NMOSD. Este protocolo, a diferencia del anterior, permeabiliza las células, disminuyendo considerablemente la especificidad y sensibilidad de la técnica. Como se puede apreciar en la Figura 29, se observa mucho marcaje, tanto en las células que sobreexpresan AQP1, como en las que expresan AQP4, así como también en las que no expresan ninguna de estas proteínas. El resultado fue similar en las muestras pertenecientes a pacientes con NMOSD (A’, C’), como en las muestras de pacientes que no pertenecían al NMOSD (B’, D’). Esta señal de fluorescencia que se detecta es por tanto inespecífica, debida a la unión de componentes del suero a la célula que se desconocen. 106 RESULTADOS Figura 29. Inmunofluorescencia de AQP1 y AQP4 con suero de pacientes sobre células permeabilizadas. Comparación de la señal de AQP1 y AQP4 con el ensayo de inmunodetección hecho usando células permeabilizadas. Expresión de AQP1-EGFP (A,B).Expresión de AQP4-EGFP (C,D). Suero de paciente NMOSD positivo (A’,C’). Suero de paciente NMOSD negativo (B’,D’). 107 RESULTADOS Figura x. Inmunofluorescencia de AQP1 con Ac comercial y suero. Inmunofluorescencia de AQP1 sin permeabilizar donde se muestra el marcaje del Ac comercial de AQP1 frente a los sueros de paciente. 108 RESULTADOS 2.2 Detección de anticuerpos anti-AQP1 por ELISA Aceptando la posibilidad de que los anticuerpos anti-AQP1 estuvieran presentes en el suero pero fueran difíciles de detectar debido a su baja concentración y a la poca sensibilidad de la técnica inmunofluorescente, las muestras se analizaron entonces usando un método de mayor sensibilidad como es el ELISA. Los resultados (Figura 30) evidenciaron en algunas muestras la presencia significativa de anticuerpos anti-AQP1. Sin embargo, las muestras con niveles de anticuerpos más altos no solo se encontraban en el grupo NMOSD, también muestras de EM presentaron niveles elevados. Del grupo NMOSD, únicamente 2 sueros que pertenecían a pacientes con neuritis óptica de repetición (NOr.) y 3 de pacientes con mielitis longitudinal extensa (MLE) dieron valores positivos para anti-AQP1. En el grupo de NMOSD negativo, destacaron como positivas 3 muestras de pacientes con esclerosis múltiple (EM). La significancia estadística de los datos se halló por comparación a la media más la desviación típica (línea punteada en la Figura 30), del valor del anticuerpo obtenido en controles sanos, determinado por triplicado. 115 RESULTADOS Figura 35. Análisis de expresión de AQP1 en plexo coroideo de ratón. LA expresión de AQP1 en plexo coroideo de ratones C57J fue analizado por Western Blot tras exponer los animales a condiciones de hipoxia durante 24 y 48 horas. Mediante inmunohistoquímica analizamos la expresión de AQP1 en las células del plexo coroideo, evidenciándose como era de esperar una localización de membrana de esta proteína (Figura 36). 116 RESULTADOS Figura 36. Detección de AQP1 en plexo coroideo. Las fotografías muestran imágenes de microscopía de fluorescencia del plexo coroideo de ratón wild type de la línea C57J, procesado para la detección inmunohistoquímica de AQP1 (verde) y el marcador específico de plexo TTR (rojo). 5. Detección de AQP4 en plexo coroideo de ratón Los trabajos publicados hasta la fecha destacan el papel de AQP1 en la producción y regulación de LCR en los plexos coroideos (Day y col., 2014; Papadopoulos y Verkman, 2013), sin embargo poco se conoce del papel de AQP4 en este proceso. Aunque la idea prevalente en el campo es que AQP4 no juega ningún papel en la producción de LCR, estudios previos muestran expresión de AQP4 en el plexo coroideo (Mobasheri et al., 2007; Speake et al., 2003; Suzuki et al., 2013; Venero et al., 1999) y junto a los resultados obtenidos en el análisis de ARNm en el apartado anterior, quisimos analizar de forma específica si existe expresión de esta proteína en el tejido en cuestión. 117 RESULTADOS Analizamos la expresión de la proteína mediante las técnicas de western blot e inmunofluorescencia. Como se muestra en la Figura 37a, el análisis de la expresión de AQP4 en diferentes muestras: controles, cultivos celulares de HEK293 sin transfectar y transfectadas con las dos isoformas de AQP4 (M1 y M23); corteza de cerebro de ratón y por último cultivos primarios de plexo coroideo, dejó claro que si hay expresión de la proteína. En la Figura 37b, se muestran los resultados de detección de AQP4 en plexo coroideo de ratón por inmunofluorescencia indirecta, donde se puede apreciar que AQP4 (rojo) presenta una distribución homogénea en el citoplasma, y no de membrana como muestra el control e-cadherina (verde). Figura 37. Expresión de AQP4 en plexo coroideo. La figura muestra la presencia de AQP4 a nivel de proteína en el plexo coroideo. Los niveles de expresión de AQP4 fueron analizados mediante western blot entre muestras de diferentes cultivos pertenecientes a HEK293 sin transfectar, HEK293 transfectada con AQP4-M1 y M23, corteza de ratón y cultivo primario de plexo coroideo de rata (n=4) (A). Mediante inmunofluorescencia indirecta sobre plexo coroideo de ratón se detectaron las proteínas AQP4 (rojo) y e-cadherina (verde) como control (B). 118 RESULTADOS 6. Exploración de acuaporinas en otras áreas del cerebro de ratón Una producción excesiva o una reabsorción reducida del LCR llevarán a una situación de hidrocefalia, la cual pudiera estar asociada a una expresión alterada o una disfunción de las AQPs presentes en la interfase entre el SNC y los compartimentos donde se encuentra el LCR. Como ya se indicó en la introducción de esta tesis son varias las AQPs que a día de hoy han sido localizadas en el cerebro de mamíferos y pudieran ser relevantes en el contexto del presente trabajo. Quisimos entonces explorar la expresión de las acuaporinas 4 y 9, que junto con AQP1 son las que se expresan principalmente en el SNC, y analizar la expresión de estas tres proteínas en diferentes secciones del cerebro. Para ello, se aislaron zonas específicas tales como epéndima, corteza, plexo coroideo y estriado, en las cuales la presencia de AQPs ha sido descrita previamente en la literatura. Los ratones se expusieron a hipoxia durante 48 horas y la expresión de las AQPs fue analizada por PCR cuantitativa. Como se observa en la Figura 38a, AQP1 se expresa únicamente en plexo coroideo y como se mostró anteriormente en el apartado 2 de resultados, aquí nuevamente se confirmó una mayor expresión en condiciones de hipoxia. La expresión de AQP4 sin embargo, se encontró en los 4 tejidos analizados (Figura 38b). Claras diferencias en la expresión de esta proteína por hipoxia se observaron en el plexo coroideo y la corteza, siendo estas diferencias estadísticamente significativas solo en la corteza. Curiosamente se observó además que la hipoxia aumenta la expresión de la proteína en el plexo coroideo, mientras que la reduce en la corteza. Por último, los resultados mostraron (Figura 38c) que AQP9 se expresa en todos los tejidos y que la hipoxia aumenta su expresión en todos ellos, aunque las diferencias solo fueron estadísticamente significativas en el estriado. 119 RESULTADOS Figura 38. Análisis en distintas zonas del cerebro de la expresión de AQP1, AQP4 y AQP9 por RTPCRq bajo condiciones de hipoxia. Los ratones (n=4) se mantuvieron en hipoxia al 10% de O2 durante 48 h. Las gráficas muestran el análisis por RT-qPCR de AQP1 (A), AQP4 (B) y AQP9 (C) en los cuatro tejidos estudiados: epéndima, plexo coroideo, estriado y corteza, * p≤0,05. 120 RESULTADOS 7. Estudio de AQPs en cerebro del ratón mutante hyh (hydrocephalus hop gait) El ratón mutante hyh, como se ha descrito en la introducción, es un ratón que presenta una mutación puntual que afecta a la expresión de la proteína α-SNAP, que le produce una acumulación de LCR en los ventrículos acompañada de una estenosis en el acueducto de Silvio, desarrollando una hidrocefalia severa. Este ratón presenta un fenotipo hidrocefálico que se asemeja en algunos aspectos a la hidrocefalia congénita en humanos tales como en el aumento de la presión intracraneal, aumento del volumen de LCR, estenosis, entre otros, y es por ello que haya sido seleccionado como modelo en el estudio de la relación entre la hidrocefalia y la expresión de acuaporinas. Al igual que en el apartado anterior, se analizó la expresión de las acuaporinas más abundantes en el SNC: AQP1, AQP4 y AQP9 en tejidos como el plexo coroideo, corteza, epéndima y estriado. Se usaron ratones hyh entre 15 y 25 días de edad y como controles se usaron los de genotipo silvestre (wild type) de la misma línea. Los niveles de expresión de AQPs fueron analizados mediante PCR cuantitativa. Como se observa en la Figura 39a, AQP1 únicamente se expresa en plexo coroideo, sin encontrarse diferencias significativas entre el ratón control y el hyh. La expresión de AQP4 (Figura 39b), mostró ser mayor en epéndima, estriado y corteza de ratones wt, siendo estadísticamente significativos estas diferencias solo en epéndima y estriado. En el plexo coroideo, los niveles de AQP4 fueron más elevadas en ratones hyh, con una diferencia estadísticamente significativa 10 veces mayor en hyh que en el 121 RESULTADOS wt. La expresión de AQP9 (Figura 39c), al igual que AQP4 también se vio aumentada en epéndima, estriado y corteza en ratones wt respecto a hyh, siendo las diferencias estadísticamente significativas únicamente en el epéndima. En plexo coroideo a diferencia del apartado anterior, AQP9 sin embargo, no es detectada. 122 RESULTADOS Figura 39. Análisis de expresión de AQP1, AQP4 y AQP9 por RT-PCRq en ratones hop gait.. Para el análisis se utilizaron 4 ratones silvestres y 4 ratones con hidrocefalia (hyh). Las gráficas muestran el análisis por RT-qPCR de AQP1 (A), AQP4 (B) y AQP9 (C), en los tejidos: epéndima, plexo coroideo, estriado y corteza. . * p≤0,05. DISCUSIÓN 131 DISCUSIÓN HEK era el origen de la señal. El análisis más cuidadoso de los sueros de pacientes tratados con natalizumab mostró que si los pacientes habían detenido el tratamiento de natalizumab mas allá de 6 meses previos a la obtención del suero, dejaban de presentar ese patrón confuso de marcaje y los niveles de fluorescencia que mostraban eran muy similares a los del suero control negativo, indicando que los niveles de natalizumab en sangre disminuían durante largos periodos de tiempo (6 meses al menos), haciéndose indetectables por el ensayo de diagnóstico. Si bien las células HEK ofrecen propiedades muy favorables para los ensayos de CBA aquí usados, tales como alta eficiencia de transfección y niveles de expresión de AQP4 humana, una desventaja de usar estas células en ensayos de NMO también se pone de manifiesto en el presente trabajo: concretamente que la expresión constitutiva de integrinas en la membrana celular produce la unión de los anticuerpos que componen el natalizumab, siendo estos reconocidos por anticuerpos anti-IgG humano dando lugar a una falsa señal para el diagnóstico de NMO. Sería importante realizar una exploración de esta reactividad cruzada del natalizumab en diferentes líneas celulares para así poder mejorar el sistema de diagnóstico. Por otro lado, una respuesta similar a la reactividad cruzada observada con el natalizumab, también podría ser producido por otras inmunoterapias que actualmente se aplican a este tipo de enfermedades autoinmunes, lo que puede conducir a falsos positivos en el diagnóstico. A la vista de estos resultados cabe mencionar, que algunos de los efectos secundarios adversos de algunas inmunoterapias pudieran deberse a la unión de anticuerpos del fármaco a antígenos endógenos del cuerpo humano no descritos aún (Sanchez Gomar y col., 2014). Por último además, es importante destacar el valor que tiene 132 DISCUSIÓN hacer diagnósticos claros que ayuden a dirigir con rapidez y acierto las terapias ya que concretamente en el caso de natalizumab, este tipo de tratamiento es efectivo en pacientes con EM, pero al contrario en pacientes con NMO, se ha observado como el natalizumab puede producir recaídas severas, lesiones en el cuerpo calloso, discapacidad cognitiva, en definitiva, un empeoramiento de la enfermedad (Barnett et al., 2012; Jacob y col., 2012; Kitley et al., 2014a). 4. AQP1 como biomarcador de la NMOSD Además de AQP4, en los astrocitos del SNC humano se ha detectado alta expresión de AQP1 (Misu et al., 2013; Satoh et al., 2007). Concretamente se ha visto que AQP1 se encuentra sobreexpresado en áreas propensas a desarrollar lesiones típicas de la NMO (Misu et al., 2013). Esta premisa ha llevado a pensar en AQP1 como un posible biomarcador de la NMOSD a causa de la seronegatividad para AQP4 encontrada en muchos sueros de pacientes que pertenecen a este grupo. Para el estudio de la implicación de AQP1 en la enfermedad, analizamos de nuevo las muestras en busca de anticuerpos anti-AQP1. Para ello, en primer lugar pusimos a punto la misma técnica (CBA) que tan buen resultado nos dio para la detección de anticuerpos anti-AQP4, pero ahora para detectar anti-AQP4. Tras el análisis de las 181 muestras ya analizadas para AQP4 no detectamos anticuerpos anti-AQP1 en ninguna de las muestras analizadas. En nuestro método, en el cual las células no se fijan ni permeabilizan hasta el final del ensayo para así mantener la proteína de AQP lo más conservada posible en la membrana y así el epítopo inmune, suponiendo que sea similar al de 133 DISCUSIÓN AQP4 y esté localizado en los lazos extramembrana de las células (Iorio y col., 2013), no se detectó presencia de IgG anti-AQP1. Un único trabajo en la literatura (Long et al., 2014b) detecta anticuerpos anti-AQP1 usando un método similar al nuestro (CBA) aquí descrito. Estos autores sin embargo, solo consiguen detectar los anticuerpos anti-AQP1 realizando un pretratamiento de las HEK-AQP4 con Triton X-100 (Long et al., 2014b), mientras que no los detectan en ausencia de permeabilización. Por ello, repetimos el mismo ensayo, pero esta vez siguiendo al detalle las condiciones establecidas por el grupo de Long y col (2014), realizando el pretratamiento de las células con Triton X-100. En nuestro caso, no obtuvimos ningún suero positivo en la detección de antiAQP1, pero lo que si observamos fue un intenso marcaje inespecífico en todas las muestras analizadas probablemente debido a múltiples uniones inespecíficas que resultan de la unión de IgG séricas a proteínas u otros elementos del interior celular accesibles a consecuencia de la permeabilización con el tritón. Un estudio previo (Tzartos et al., 2013), también ha mostrado presencia de anticuerpos anti-AQP1 mediante las técnicas ELISA y RIPA, y no con el método de CBA. En nuestro caso, la detección de anticuerpos antiAQP1 con ELISA ha ciertamente mostrado resultados positivos en algunos sueros, pero estos no corresponden exclusivamente a muestras del espectro clínico de NMO. Como muestra la Figura 30, muestras de pacientes con EM también mostraron niveles significativos de anticuerpos anti-AQP1, descartándolos como marcadores que puedan ser usados para el diagnóstico o como diana terapéutica de la enfermedad; al menos de 134 DISCUSIÓN momento y dada la sensibilidad de las técnicas de las que disponemos en la actualidad. 5. Papel de las acuaporinas en la hidrocefalia en humanos AQP1, que se encuentra altamente expresada en la membrana apical del plexo coroideo, hace una contribución sustancial a la producción de LCR y es una posible diana terapéutica en el tratamiento de trastornos de la circulación del LCR. AQP4, sin embargo, se expresa en la membrana basolateral del epéndima ventricular y juega un papel importante en la homeostasis del agua cerebral. En nuestros análisis de proteína de AQP1 y AQP4 en líquido cefalorraquídeo humano vimos como en los casos de hidrocefalia, los niveles de ambas proteínas eran mayores tanto en los casos de hidrocefalia comunicante como en la obstructiva. En el caso de AQP1, aunque los valores resultan bastante heterogéneos, donde mayor número de proteína se detectó en el LCR fue en los pacientes con hidrocefalia comunicante, seguido de los pacientes con hidrocefalia obstructiva. Es posible que esto ocurra porque ante condiciones de hidrocefalia, el aumento de LCR en el ventrículo produce un incremento de la presión intracraneal, la cual puede desencadenar una respuesta reguladora para detener la producción de LCR, y por ello, la expresión de AQP1 se vea reducida (Paul y col., 2011). Sumado a esto puede ocurrir que para favorecer aún más la reducción de la tasa de producción de LCR, a la vez que la expresión de AQP1 es reducida, la proteína ya expresada en la membrana, sea desechada hacia el interior del ventrículo, siendo esta proteína la detectada por nosotros mediante ELISA. En el caso de AQP4, también 135 DISCUSIÓN detectamos mayores niveles de proteína en pacientes con hidrocefalia respecto a los controles, lo que hace pensar que al igual que en AQP1, la expresión de la proteína se ve reducida. En algunos estudios se ha visto que en modelos animales que desarrollan hidrocefalia, la expresión de AQP4 aumenta en el epéndima, de esta forma permite aumentar la reabsorción de LCR como respuesta reguladora de la homeostasis (Feng y col., 2009; Filippidis y col., 2012). Sin embargo, a su vez se sucede otro evento, ya que al aumentar el volumen de LCR, como consecuencia, las paredes del ventrículo se expanden induciendo la denudación de células ependimarias (Dominguez-Pinos y col., 2005). Esta denudación ependimaria está íntimamente relacionada con AQP4, ya que ésta participa en la estabilidad de la pared mediante la regulación de la conexina-43, que dan lugar a las uniones GAP, por lo que, ante una situación de dilatación ventricular, las uniones gap se ven afectadas junto a AQP4, siendo vertidas al LCR (Castaneyra-Ruiz et al., 2013; Dominguez-Pinos et al., 2005). Este suceso agravaría la situación de hidrocefalia, y podría contribuir a que una hidrocefalia comunicante desemboque en una obstructiva. Por eso, en nuestros datos se observa como la hidrocefalia obstructiva presenta los mayores niveles de AQP4, indicando posiblemente el punto de máxima denudación del epéndima. 6. Influencia de la hipoxia en aquaporinas del plexo coroideo Son numerosos los trabajos que describen en diferentes modelos animales de hidrocefalia como esta está asociada a una diminución de los niveles de oxígeno en el cerebro (Del Bigio y col., 2012; Dombrowski y col., 136 DISCUSIÓN 2008). Esta hipoxia, puede tener efectos en la expresión de AQP1 en cerebro, como ya se ha descrito en trabajos previos del laboratorio donde se muestra como la hipoxia afecta a la expresión de AQP1 al alza (AbreuRodriguez y col., 2011). En nuestro caso, tras poner a ratones bajo condiciones de hipoxia, vimos como en los plexos coroideos, la expresión de AQP1 mostraba una tendencia en el aumento de su expresión alcanzando su pico a las 48 horas, a excepción del cultivo primario de plexo coroideo que no mostraba diferencia alguna. En lo referente a si AQP1 ve incrementada o disminuida su expresión en condiciones de hidrocefalia, a día de hoy está bastante discutida, ya que mientras unos autores ven como la hidrocefalia provoca la reducción de la expresión de AQP1 y con ello la presión intracraneal y la producción de LCR, otros o no encuentran variación alguna u observan una sobrexpresión de la proteína (Kalani et al., 2012). De todos modos, la mayoría apunta a que ante una situación de hidrocefalia, AQP1 ve reducida su expresión en plexo coroideo como mecanismo protector que permita disminuir la presión intracraneal y la producción de LCR. Por ello, aunque la hidrocefalia pueda producir una situación de hipoxia, y esto provocar el aumento de la expresión de AQP1, pueden activarse otros mecanismo en el organismo que como consecuencia tenga la regulación a la baja para que deje de participar en la producción del LCR, o como por ejemplo, tal y como ocurre al incrementar la presión intracraneal, agentes neuroendocrinos del tipo péptidos natriuréticos, son reclutados, siendo capaces de reducir el transporte de agua en plexo coroideo al activando a cGMP que permite bloquear a AQP1 (Paul et al., 2011). 137 DISCUSIÓN 7. Papel de las acuaporinas en cerebro Para una aportar una visión más global del papel que pueden tener las acuaporinas en el SNC se analizaron diferentes áreas del cerebro y la expresión de las acuaporinas que se expresan en ellos. Se analizaron en ratones bajo condiciones de hipoxia y en la línea de ratón hidrocefálico hyh como veremos en el siguiente apartado. AQP1 tal y como venimos comentando en el apartado anterior sigue mostrando ese aumento de su expresión bajo condiciones de hipoxia siendo registrado su presencia únicamente en plexo coroideo. Sin embargo, AQP4 es detectada en todos los tejidos analizados mostrando una tendencia principalmente a aumentar su expresión en condiciones de hipoxia, al igual que ocurre en la formación de edemas, donde la situación de hipoxia creada favorece su expresión y participa aumentando el paso de agua en la lesión (Kaur y col., 2006). En condiciones de hidrocefalia, el entorno hipóxico creado puede inducir la expresión de AQP4, favoreciendo la reabsorción de agua, contribuyendo a la regulación homeostática. En el caso de AQP9, es detectada en todos los tejidos y mostró un aumento de expresión en todos, lo cual coincide con la literatura, donde se observa que ante algún daño cerebral que lleve asociado una hipoxia como un edema, AQP9 ve aumentada su expresión (Higashida y col., 2011). 138 DISCUSIÓN 8. Papel de AQPs en ratón hidrocefálico hyh En el caso de los ratones de fenotipo hidrocefálico hyh, tras realizar un análisis similar al de la hipoxia, se observó un patrón de expresión en las acuaporinas diferente, alejando a la hipoxia como protagonista en la etiología de la enfermedad, aunque no por ello no desempeñe algún papel. En el caso de AQP1, en este caso, en los ratones hyh la expresión es menor, lo cual concuerda con muchos de los estudios antes mencionado en el que indicaban que ante una situación de hidrocefalia, como mecanismo regulador, se inhibe la expresión de AQP1 o se bloquea su función, para que así no participe en la producción de LCR (Kalani et al., 2012). En el caso de AQP4, vemos como por lo general la expresión disminuye en los ratones hyh, a excepción del plexo coroideo, donde la expresión aumenta notablemente. En una situación de hidrocefalia, lo descrito hasta ahora es que AQP4 en epéndima aumenta su expresión para poder absorber el exceso de líquido acumulado en el ventrículo, sin embargo, en este modelo animal de hidrocefalia, el epéndima sufre una denudación que comienza en los primeros días de vida y acaba al alcanzar la semana de haber nacido. Con esta denudación del tejido ependimario, es arrastrado con ello AQP4, perdiendo a su vez la capacidad de regulación homeostática necesaria para solventar esa acumulación de LCR en el ventrículo (Roales-Bujan y col., 2012). Esto puede explicar la elevada diferencia registrada en plexo coroideo, ya que podría estar sobreexpresándose en este tejido para así poder realizar la función perdida en el epéndima. En el caso de AQP9, a diferencia de la hipoxia, en condiciones de hidrocefalia disminuye la expresión, lo cual puede ser debido a un mecanismo regulador para no favorecer la entrada de agua al cerebro. 139 DISCUSIÓN 9. AQP4 en plexo coroideo Hasta ahora, en el plexo coroideo, siempre se ha destacado el papel exclusivo de AQP1 en su función colaboradora en la producción de LCR. Sin embargo, ya son varios los estudios que empiezan a darle cabida a AQP4 en este tejido, que, aunque no presenta los mismos niveles de expresión que AQP1, sin embargo, si se encuentra presente (Mobasheri et al., 2007; Speake et al., 2003; Suzuki et al., 2013; Venero et al., 1999). En nuestros resultados, tanto, por imnunihistoquímica, western blot y PCR cuantitativa, hemos demostrado su presencia tanto a nivel de ARN como de proteína, aunque bien es cierto, que cuando intentamos localizar su ubicación, el marcaje que nos presentó fue a nivel citoplasmático y no de membrana como uno podría esperar. Estos resultados resultan coherentes con los obtenidos respecto a los análisis de expresión en condiciones e hipoxia y en ratones hyh, ya que como hemos mencionado anteriormente ante situaciones de hipoxia AQP4 tiende a sobreexpresarse, y en ratones hyh existe un aumento de expresión muy notable respecto al control wt, pudiendo ser debido a la compensación por la pérdida de AQP4 dispuesta en el tejido ependimario.