“Implicación del sis ema GSTT1 en la pa ogénesis de la
hepa i is inmune de no o”
TESIS DOCTORAL
ANTONIO JESÚS POZO BORREGO
Se illa, 2019
D. ANTONIO NÚÑEZ ROLDÁN, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE
SEVILLA Y JEFE DEL SERVICIO DE INMUNOLOGÍA DEL HOSPITAL
UNIVERSITARIO VIRGEN DEL ROCÍO
CERTIFICA:
Que el abajo de in es igación que lle a po í ulo: “Implicación del
sis ema GSTT1 en e donan e y ecep o en la pa ogénesis de la hepa i is
inmune de no o”, ha sido ealizado bajo su di ección po el licenciado D.
ANTONIO JESÚS POZO BORREGO, y eúne las condiciones necesa ias pa a
se leído y de endido como esis pa a op a al í ulo de Doc o po la
Uni e sidad de Se illa.
Pa a que cons e a los e ec os opo unos, expide la p esen e ce i icación
en Se illa, a 22 de oc ub e de 2019.
Fdo.: D . An onio Núñez Roldán
DIRECTOR DE LA TESIS
TUTOR DE LA TESIS
Dª ISABEL AGUILERA GARCÍA, DOCTORA EN BIOLOGÍA E INVESTIGADORA
DEL INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE SEVILLA
CERTIFICA:
Que el abajo de in es igación que lle a po í ulo: “Implicación del
sis ema GSTT1 en e donan e y ecep o en la pa ogénesis de la hepa i is
inmune de no o”, ha sido ealizado bajo su di ección po el licenciado D.
ANTONIO JESÚS POZO BORREGO, y eúne las condiciones necesa ias pa a
se leído y de endido como esis pa a op a al í ulo de Doc o po la
Uni e sidad de Se illa.
Pa a que cons e a los e ec os opo unos, expide la p esen e ce i icación
en Se illa, a 22 de oc ub e de 2019.
Fdo.: D a. Isabel Aguile a Ga cía
DIRECTORA DE LA TESIS

FINANCIACIÓN
______________________________________________________________________
El doc o ando du an e el anscu so de la p esen e esis doc o al
ha sido bene icia io de una beca PIF (Pe sonal In es igado en
Fo mación) del V plan p opio de la US.
Ab e ia u as
alo-TPH: T asplan e de p ogeni o es hema opoyé icos alogénico
APC: Célula p esen ado a de an ígenos
CD107a: P o eína de memb ana asociada a lisosomas 1
dNTPS: nucleó idos
DMSO: Dime ilsul óxido
DN: Lin oci os T dobles nega i os (CD4-CD8-)
EICH: En e medad inje o con a huésped
EICHc: En e medad inje o con a huésped c ónica
ELISA: Enzimoinmunoanálisis de adso ción
GSTT1: Glu a ión S- ans e asa T1
HIdn: Hepa i is inmune de no o
HLA: An ígeno leucoci a io humano
HUVR: Hospi al Uni e si a io Vi gen del Rocío
IC50: Concen ación inhibi o ia máxima media
Ig: Inmunoglobulina
IFN: In e e ón
IL: In e leukina
mHags: Sis emas meno es de his ocompa ibilidad
MHC: Complejo mayo de his ocompa ibilidad
pb: Pa es de bases
PBMC: Células mononuclea es de sang e pe i é ica
PCR: Reacción en cadena de la polime asa
SFB: Sue o e al bo ino
SNP: Polimo ismo de un solo nucleó ido
TTO: T a amien o
Tx: T asplan e
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3.1.7. Análisis ac i ación CD107a .............................................................................................. 90
3.1.8. Conclusión ....................................................................................................................... 90
3.2. Análisis global esul ados hepa i is inmune de no o .............................................................. 90
3.2.1. Je a quía .......................................................................................................................... 90
3.2.2. Análisis poblacional CD4-CD8- ......................................................................................... 91
3.2.3. Análisis de ac i ación global ........................................................................................... 92
3.2.4. Población CD8+ ................................................................................................................ 92
3.2.5. Población CD4+ ................................................................................................................ 93
3.2.6. Población CD4-CD8- ......................................................................................................... 94
3.2.7. Conside aciones inales................................................................................................... 95
DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 98
CONCLUSIONES ..................................................................................................................................... 106
BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................ 110
ANEXO ................................................................................................................................................... 123
IgG subclass p o ile among an i-Glu a hione S- ans e ase T1 an ibodies in pos - ansplan de
no o immune hepa i is ......................................................................................................................... 125

INTRODUCCIÓN
______________________________________________________________________
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In oducción
1. His o ia del asplan e hepá ico
Aunque bas an e menos mi i icado que el co azón, el hígado es sin emba go el ó gano noble
po excelencia. Además, el hígado es como ó gano, emendamen e más complejo que el
co azón o el iñón. Su asplan e, mucho más abajoso y complicado, además de po supues o
an i al como el ca diaco, si bien con bas an e menos li e a u a que és e. Es el asplan e que
equie e un equipo mul idisciplina io más nume oso y mejo conjun ado.
La his o ia del asplan e hepá ico a indisolublemen e ligada a la de un ci ujano
no eame icano nacido en Iowa: Thomas S a zl. Ve dade o an eceso de los “T ansplan
Su geons”, que undamen almen e en el mundo anglosajón cons i uyen hoy una e dade a
especialidad, ue uno de los p ime os ci ujanos en hace asplan es enales al inicio de los
sesen a. P epa ó una écnica expe imen al de asplan es en animales que alidó has a la
saciedad y el 1 de Ma zo de 1963, casi cinco años an es de que Ba na d se a e ie a con el
co azón, lle ó a cabo el p ime asplan e de hígado en el Ve e an’s Hospi al de Den e ,
Colo ado.
El ecep o se ía un niño de 3 años a ec o de una es echez congéni a de las ías bilia es que
acaba p oduciendo la des ucción del hígado (a esia bilia ), al que implan a el ó gano de o o
niño allecido como consecuencia de un umo ce eb al. Como el mismo S a zl desc ibie a
g á icamen e, la in e ención comenzó en un clima de con ianza que sin emba go acabó en
agedia. El niño mue e a las cinco ho as de acaba el asplan e. Dos meses después, el 5 de
Mayo ealiza el segundo en un homb e de 48 años con un cánce de hígado, que ecibe en es e
caso el ó gano de un pacien e de 55 años con un umo ce eb al. El pacien e i e 22 días, pe o
mue e po una embolia pulmona con un hígado no mal.
En e 1963 y 1967, en F ancia (Demi leau en No iemb e de 1963), Ingla e a (Roy Calne) y los
Es ados Unidos se hicie on a ias decenas de asplan es hepá icos con esul ados di e sos,
pe o ninguno alcanzó el año de supe i encia. La his o ia del asplan e de hígado es á plagada
de nume osos in en os en odo el mundo du an e los sesen a y los se en a, pe o con unos
esul ados muy pob es, que en las mejo es manos apenas supone una supe i encia al año de
un 30% de los pacien es. No es has a 1967 cuando iene luga el p ime asplan e con
supe i encia p olongada ealizado en la Uni e sidad de Colo ado a una niña de un año y
medio de edad. Los abajos ealizados po S a zl a pa i de es e momen o, así como los de
Calne y Williams pe mi ie on que la mejo ía de esul ados ue a al que lo que se conside aba
un a amien o expe imen al, pasa a a se una al e na i a e apéu ica.
Hay que espe a a los ochen a pa a que las mejo as de odo ipo: qui ú gicas, de anes esia, de
manejo de la coagulación, pe o sob e odo de inmunosup esión con el descub imien o de la
ciclospo ina en 1980 lle en a una e dade a explosión de la écnica. Una con e encia de
consenso celeb ada bajo los auspicios de los NIH no eame icanos en Be hesda (Ma yland) en
Junio de 1983 supone la decla ación del asplan e hepá ico como de u ilidad e apéu ica
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demos ada y su e dade a di usión po odo el mundo. La supe i encia al año pasa del 30%
al 70% y sigue mejo ando en las siguien es décadas.
En España ue on los doc o es Ca les Ma ga i y Edua do Jau ie a en el hospi al de Bell i ge
de l’Hospi ale , Ba celona, en 1984 quienes hicie on con éxi o la p ime a ope ación. Hoy se
e ec úa en 24 hospi ales de odo el es ado y son más de mil los en e mos que anualmen e
eciben un asplan e hepá ico en nues o país, con di e encia el que más ealiza del mundo en
elación a su población.
2. An eceden es de la hepa i is inmune de no o
La hepa i is inmune de no o es una pa ología desc i a inicialmen e en asplan e pediá ico a
inales de los años 90 como una dis unción a día del inje o asociada a una se ie de
ca ac e ís icas se ológicas e his ológicas compa ibles con una hepa i is au oinmune, a pesa de
que los pacien es no habían desa ollado hepa i is au oinmune an es del asplan e. En e las
ca ac e ís icas desc i as inicialmen e podemos menciona : ele ación de enzimas hepá icas
(amino ans e asas), exis encia de au oan icue pos, ele ada concen ación de IgG en sue o y
p esencia de un denso in il ado lin oci a io en la zona po al (Ke ka N y col., 1998).
Más a de ue desc i a en adul os po di e sos g upos (Jones DE y col., 1999; Heneghan MA y
col., 2001). En sus es udios iniciales, el g upo del Hospi al G ego io Ma añón desc ibió la
p esencia de un an icue po a ípico, con un pa ón de inmuno luo escencia indi ec a que
eco daba a los an icue pos an imic osomales de hígado/ iñon de ipo 1 (an i-LKM1) y po
an o los denomina on an icue pos an i LKM a ípicos (He nández-Albúja A, Salcedo M y col.,
1997; Salcedo M y col., 2002).
En el año 2001, nues o g upo iden i icó la diana an igénica de los an icue pos an e io men e
ci ados. Se a aba de una enzima me abolizado a de á macos, de ase II, implicada en la
p o ección en e a compues os óxicos, denominada Glu a ión S T ans e asa The a 1 (GSTT1).
De al o ma que los an icue pos an i-LKM1 a ípicos pasa on a denomina se an i-GSTT1
(Aguile a I y col., 2001).
Pos e io men e en 2004 es udiamos una g an coho e de pacien es asplan ados de hígado
en el Hospi al Vi gen del Rocío y con i mamos que es a pa ología ocu e cuando los donan es
ienen una o dos copias del alelo posi i o pa a GSTT1 y los ecep o es ca ecen de es e gen, lo
que se denomina alelo nulo, y que es a incompa ibilidad gené ica es eque ida pa a que se
desa olle hepa i is inmune de no o, siemp e p ecedida po la p oducción de an icue pos an i-
GSTT1 (Aguile a I y col., 2004). Es os esul ados ue on con i mados a ios años más a de po
el g upo del Hospi al Rod íguez Ma añón (Rod íguez-Mahou M y col., 2007).
En el año 2011 inculamos po p ime a ez la inmunoposi i idad de C4d en biopsias hepá icas
con alo- eac i idad donan e-especí ica no elacionada con an icue pos an i-HLA DSA ni con
incompa ibilidad ABO (Aguile a I y col., 2011).
Cabe des aca la impo ancia que adquie e la e apia inmunosup eso a inicial adminis ada a
los pacien es. La e apia combinada de ac olimus con mico enola o mo e ilo p esen a un

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e ec o p o ec o en compa ación con la e apia combinada de ciclospo ina jun o con
mico enola o mo e ilo. Es e e ec o p o ec o educe la p obabilidad de p oduci an icue pos y
po an o e i a la p og esión de la pa ología (Aguile a I y col., 2011).
3. Complejo p incipal de his ocompa ibilidad (HLA)
Los lin oci os T sólo pueden econoce an ígenos p esen ados po células p esen ado as de
an ígenos especializadas (APC, del ac ónimo inglés An igen P esen ing Cells). La a ea de
p esen a an ígenos co e a ca go de p o eínas especí icas que son codi icadas po el complejo
mayo de his ocompa ibilidad (MHC, del ac ónimo inglés Majo Hiscompa ibili y Complex).
Es a especi icidad de los lin oci os T con as a con la de los lin oci os B y sus p oduc os
sec e ados, los an icue pos, que pueden econoce an ígenos an o solubles como asociados a
células.
En un p incipio el sis ema MHC humano (HLA, del ac ónimo inglés Human Leukocy e An igen)
ue descubie o como un locus ex endido con un al o con enido de genes sumamen e
polimó icos. Aho a sabemos que las unciones isiológicas de las moléculas del sis ema HLA es
la p esen ación de pép idos a los lin oci os T. De hecho, sus ecep o es de memb ana o TCR
(del ac ónimo inglés T-Cell ecep o ), en ealidad son especí icos en e a complejos o mados
po pép idos de an ígenos ex años y moléculas HLA p opias.
La in o mación gené ica pa a la codi icación de las moléculas HLA se encuen a en el b azo
co o del c omosoma 6 (6p21.31-6p21.32) con un al o con enido de genes que es án en
desequilib io de ligamien o (Imagen 1). Su exp esión se ealiza de o ma codominan e, es
deci , cada pe sona exp esa los alelos del HLA he edados de ambos pad es. Es a ca ac e ís ica
hace posible que se ele e al máximo el núme o de moléculas HLA disponibles pa a eje ce su
unción isiológica. Es impo an e des aca que las moléculas HLA de un indi iduo no
disc iminan en e los pép idos ex años, es deci , los de i ados de an ígenos mic obianos, y los
de i ados del p opio suje o (an ígenos p opios).
Exis en dos ipos p incipales de p oduc os génicos del MHC, las moléculas de clase I y las de
clase II, con es uc u as dis in as pe o homólogas. Las moléculas del MHC de clase I p esen an
pép idos y son econocidos po los lin oci os T CD8+, mien as que las moléculas MHC de clase
II p esen an pép idos a los lin oci os T CD4+.
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Imagen 1. Dis ibución de los genes HLA en el b azo co o del c omosoma 6. Tomada de Inmunología celula y
molecula . 8ª Edición. Abul K. Abbas, And ew Lich man y Shi Pillai. Edi o ial Else ie Saunde s.
La egión de clase I codi ica a los genes de la cadena pesada de las moléculas clásicas de clase I
(A, B y Cw) así como de los genes no clásicos como HLA-E, F, G, MICA y MICB. La molécula HLA
de clase I o almen e ensamblada es un he e odíme o que cons a de una cadena α, una β2-
mic oglobulina y un pép ido an igénico unido (Imagen 2). La exp esión es able de las
moléculas de clase I sob e la supe icie celula equie e la p esencia de los es componen es.
Los pép idos p esen ados po es e ipo de moléculas ienen una longi ud media de unos 9
aminoácidos (aa).Todos los indi iduos he e ocigo os exp esan seis moléculas HLA de clase I
di e en es y se p esen an de o ma cons i u i a en odas las células nucleadas del o ganismo.
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Imagen 2. Es uc u a de una molécula MHC de clase I. Tomada de Inmunología celula y molecula . 8ª Edición. Abul
K. Abbas, And ew Lich man y Shi Pillai. Edi o ial Else ie Saunde s.
Po o o lado, la egión de clase II con iene los genes que codi ican las moléculas α y β de los
es ipos clásicos de moléculas HLA de clase II (DQ, DR y DP). La molécula HLA de clase II
o almen e ensamblada es un he e odíme o que cons a de una cadena α, una cadena β y un
pép ido an igénico unido (Imagen 3). Al igual que ocu ía con las moléculas HLA de clase I, la
exp esión es able de las moléculas de clase II sob e la supe icie celula equie e la p esencia
de los es componen es del he e odíme o. Los pép idos p esen ados po es e ipo de
moléculas ienen una longi ud media de 12 a 14 aa.
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Imagen 3. Es uc u a de una molécula MHC de clase II. Tomada de Inmunología celula y molecula . 8ª Edición. Abul
K. Abbas, And ew Lich man y Shi Pillai. Edi o ial Else ie Saunde s.
Es as moléculas HLA de clase II sólo se exp esan en las APC, como los mac ó agos, lin oci os B y
células dend í icas. La p esen ación de pép idos median e HLA clase II a los lin oci os T CD4+
í genes, a a ac i a los y és os con ibui án a la madu ación de o os ipos celula es, como los
lin oci os B, desencadenando la conocida como espues a humo al (Inmunología celula y
molecula , 8ª Edición. Abul K. Abbas, And ew H. Lich man y Shi Pillai. Edi o ial Else ie
Saunde s).
Al con a io del o igen endógeno de los pép idos unidos a moléculas de clase I, los agmen os
an igénicos unidos a moléculas de clase II de i an de an ígenos de o igen exógeno. En es e
úl imo caso, las moléculas ex acelula es son in e nalizadas po endoci osis. Los endosomas se
usionan con lisosomas y su con enido es dige ido pa cialmen e. Los agmen os esul an es se
unen a las moléculas de clase II y e o nan a la supe icie celula donde se án p esen ados. Po
el con a io, los pép idos p esen ados po las moléculas HLA de clase I son los agmen os
esul an es de la deg adación p o eínica lle ada a cabo po el p o easoma. No obs an e, y
debido a la impo ancia que iene es a ca ac e ís ica en la madu ación y pos e io ac i ación
de los lin oci os CD4+ y CD8+, el p ocesamien o del an ígeno se explica á con de alle en el
siguien e apa ado.
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Ac ualmen e, se ecomienda usa la e minología NK-like T cells. En gene al, se necesi a ía
hace una ca ac e ización eno ípica y uncional mucho más p o unda pa a llega a en ende el
mecanismo de adap ación de es as células a p ocesos an impo an es como en ejecimien o,
au oinmunidad, in lamación y espues a a an ígenos i ales o umo ales.
Un aumen o en la exp esión de ma cado es de NK en lin oci os CD8+ se ha asociado con
imunosenescencia y con ac i ación c ónica del sis ema inmune (Ta azona R y col., 2000).
6. An eceden es de la eo ía humo al del asplan e
Desde la década de los 50 del pasado siglo XX, se plan ea una de las cues iones más
con o e idas en el mundo del asplan e: ¿Los echazos de los inje os son p oducidos po
células o po an icue pos?
Bien es cie o, que los an icue pos son p oducidos po células, po lo que en es e sen ido se ía
co ec o deci que odos los echazos son celula es. Pe o la p incipal di e encia en e la eo ía
celula y humo al es si el daño al inje o se gene a p incipalmen e po la acción de los
an icue pos o po el e ec o di ec o que eje cen los lin oci os T CD8+ ci o óxicos, en e o os
ipos celula es (Te asaki PI, 2003).
Du an e más de 40 años, ue ampliamen e acep ada como co ec a la eo ía celula que
p opuso Si Pe e Medawa , has a el pun o de que ue conside ada casi un dogma de la
inmunología del asplan e. No obs an e, Go e ue el p ime o en mos a en modelos
animales, que a ones asplan ados podían llega a p oduci an icue pos di igidos en e a
an ígenos del locus H-2 de his ocompa ibilidad cuando exis ían incompa ibilidades en e
donan e y ecep o (Go e PA, 1956).
G acias a es os es udios, se lle ó a cabo un es ue zo in e nacional de colabo ación en el que se
p e endía encon a an icue pos di igidos en e a los an ígenos del sis ema HLA humano. El
papel que pueden llega a alcanza es os an icue pos en la dis unción del inje o quedó
pa en e en los asplan es enales en los que el ecep o enía ya an icue pos p e o mados
en e al HLA del inje o, despe ando el conocido como echazo hipe agudo (Pa el R y
Te asaki PI, 1969; Te asaki PI y Cai J, 2005). Pos e io men e se ha obse ado el papel que
juegan es os an icue pos en o o ipo de asplan es, ales como el de pulmón (F os AE y col.,
1996; Sco nik JV y col., 1999) y co azón (Higuchi ML y col., 1989).
Po o o lado, un g an núme o de publicaciones han con i mado la asociación exis en e en e
la p esencia de depósi os de C4d en biopsias de iñón, como ma cado de echazo humo al en
si uaciones de echazo mediado po an icue pos (Feu ch HE y col., 1998; C espo M y col., 2001;
Wa schinge B y Pascual M, 2002).

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7. Sis emas meno es de his ocompa ibilidad
En el asplan e de p ogeni o es hema opoyé icos (TPH) HLA-idén ico, se pueden da
si uaciones en las que exis a dispa idad gené ica en p o eínas polimó icas en e donan e y
ecep o capaces de despe a una espues a inmuni a ia que puede desencadena una
en e medad inje o con a huésped (EICH), ya sea aguda o c ónica. Es as p o eínas se
denominan an ígenos meno es de his ocompa ibilidad (mHags) (Simpson E, y col., 2002). Los
mHags se han iden i icado adicionalmen e como pép idos disc e os que son econocidos po
las células T del donan e as el alo-TPH (T asplan e de p ogeni o es hema opoyé ico
alogénico). Es os pép idos pod án se p esen ados an o po HLA de clase I como de clase II
obse ándose espues a an o en los lin oci os T CD4+ como CD8+.
La exis encia de es os mHags se debe a que exis en a iaciones indi iduales en la secuencia del
ADN, es imadas en un 0,1% en el genoma humano, que pueden p o oca que en e donan es y
ecep o es HLA idén icos, haya un g an núme o de genes codi ican es en los que di ie an. Es as
a iaciones de la secuencia de ADN, conocidas como polimo ismos gené icos, pueden ene o
no consecuencias biológicas selec i as y deben de ec a se en al menos el 1% de los indi iduos
de una población. En la p ác ica, pa a que un locus sea conside ado polimó ico, el alelo más
común de dicho locus debe ene una ecuencia poblacional meno del 99% y, de acue do con
la ley de Ha dy-Weinbe g, al menos un 2% de la población debe se he e ocigo a pa a ese
locus. Es os ca ac e es suelen se es ables y se ansmi en po he encia mendeliana simple y
cons i uyen una exp esión de la di e sidad gené ica en e indi iduos de la misma especie. Las
p ime as a iaciones gené icamen e de e minadas se halla on en p o eínas de los e i oci os,
denominados po ello an ígenos de g upos sanguíneos.
Los polimo ismos pueden i desde la modi icación de una sola base (SNP, single nucleo ide
polymo phism), has a cambios en núme o y/o amaño en la unidad de epe ición, siendo la
más común en el alo-TPH la deleción de la secuencia codi ican e pa a una p o eína.
Como ejemplo de mHags cuyo polimo ismo se debe a un SNP, se han desc i o en la li e a u a
las p o eínas HA-1, HA-2, HA-3 y HA-8. Todas ellas es án codi icadas po genes au osómicos
con polimo ismos de un solo nucleó ido que son econocidos po las células del donan e en el
o ganismo huésped as el alo-TPH (den Hann JM y col., 1995; B ickne AG y col., 2001;
Spie ings E y col., 2003; den Haan JM y col., 1998). Cada SNP es capaz de gene a un an ígeno
lo su icien emen e inmunogénico como pa a consegui que los lin oci os T del donan e lo
econozcan en las células del ecep o cuya consecuencia clínica se ía la apa ición de EICH.
O o ejemplo de mHags son los de i ados de p o eínas del c omosoma Y. Es as p o eínas son
di e en es en cie os aminoácidos dependiendo de si son codi icadas po el c omosoma Y o po
el c omosoma X, cuyos p oduc os génicos mues an una iden idad en e el 91 y el 99%. Pues
bien, es os an ígenos son capaces de despe a una espues a ipo T en las células de los
donan es di igida con a las células del ecep o cuando hay una incompa ibilidad sexual en e
ambos (D muje / R a ón), inc emen ándose el iesgo de padece EICH si se compa a con
o as combinaciones sexuales de donan e- ecep o (Kollman C y col., 2001). Algunos ejemplos
de p o eínas ligadas al c omosoma Y capaces de despe a la espues a inmune celula en es e
con ex o de alo-TPH son DBY (Dead-box 3, Y-linked), UTY (Ubiqui ously ansc ibed
e a icopep ide epea gene on Y ch omosome), ZFY (Zinc Finge P o ein, Y-linked), RPS4Y
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(Ribosomal P o ein S4, Y-linked) y EIF1AY (Euka yo ic ansla ion ini ia ion ac o 1A, Y-linked)
(Wang W y col., 1995; Vog MH y col., 2002; Skale sky H y col., 2003; Randolph SS y col., 2004).
No obs an e, ambién se ha desc i o una espues a humo al ligada a es as p o eínas. De
hecho, es á bien es ablecido que un 50% de ecep o es a ones que eciben una in usión de
células de donan es muje es, pueden llega a desa olla an icue pos di igidos en e a
p o eínas del c omosoma Y, en conc e o en e a la p o eína DBY, (Miklos DB y col., 2004) que
es án elacionados con el desa ollo de EICH c ónica (Miklos DB y col., 2005).
Una p o eína suscep ible de se es udiada en el con ex o de SNP asociado al desa ollo de EICH
es el caso de la Glu a ión S- ans e asa P1 (GSTP1), donde un cambio en un solo nucleó ido
p oduce un polimo ismo en la posición 105 de isoleucina (Ile) po alina (Val). La dis ibución
del alelo mayo i a io Ile/Ile en la población caucásica es del 42-69%, mien as que la ecuencia
en homocigosis Val/Val es del 10% y en he e ocigosis Ile/Val del 35% (Gao Y y col., 2009). La
dispa idad en e donan e y ecep o pa a la GSTP1 no se ha es udiado en el con ex o de EICH
as el alo-TPH, pe o exis en o os polimo ismos del ipo SNP que se han asociado a EICH,
ales como IL-17 (Espinoza JL y col., 2011) o el ecep o de IL-23 (We mke M y col., 2010).
Po o o lado, exis en nume osos ejemplos de mHags p oceden es de la deleción comple a de
la pa e codi ican e de la p o eína. Debido a que el sis ema inmune de ese indi iduo se ía
homocigo o pa a la deleción, p esumiblemen e su sis ema no ha ap endido a ole a la
p o eína codi icada po ese gen, po lo que pod á llega a econoce la como un alo-an ígeno
(Mu a a M y col., 2003).
No obs an e, pa a que la deleción de una p o eína sea conside ada como mHag po encial,
debe cumpli cie os c i e ios (McCa ol SA y col., 2009), la deleción del alelo debe ene una
ecuencia en la población supe io al 10% y es indispensable que la localización na u al de la
p o eína delecionada es é asociada a uno o más ejidos en los que se desa olle EICH. Po lo
que, algunas p o eínas que cumplen es as ca ac e ís icas son la UDP-glicosil ans e asa 2B17
(UGT2B17) y 2B28 (UGT2B28), OR51A2 (p o eínas de ecep o es ol a i os), LCE3C (La e
Co ni ied En elop) y enzimas me abolizado as de á macos de la amilia de las Glu a ión-S-
ans e asas GSTMI y GSTT1, las cuales p esen an el alelo nulo en un 50% y 20% de la
población caucásica, espec i amen e.
Aunque es e ipo de deleciones se han es udiado ampliamen e en su posible elación con
di e sos ipos de cánce (Economopoulos KP y Se gen anis TN, 2010; Zhang ZJ y col., 2011;
Nadeau G y col., 2011), en el caso de la p o eína UGT2B17, cuya deleción es á p esen e en el
12% de la población caucásica, se ha demos ado que la dispa idad gené ica en e donan e y
ecep o as el alo-TPH, puede llega a despe a el econocimien o po pa e de los lin oci os
T del donan e como alo-an ígenos, lo que pod ía llega a desencadena la EICH (Te aku a S y
col., 2007). Incluso se ha demos ado la espues a inmune humo al en un pacien e que
desa olló an icue pos an i-UGT2B17 (McCa oll SA y col., 2009). Po an o, ya hemos
obse ado la impo ancia que pueden llega a ene los an icue pos di igidos en e a mHags
en el con ex o del alo-TPH.
De en e es os mHags, el mejo es udiado po nues o g upo en el asplan e de ó ganos
sólidos es el o mado po el sis ema GSTT1 que a con inuación explica emos con de alle.
35
8. An icue pos an i-GSTT1 en el asplan e de ó ganos sólidos
El sis ema menos de his ocompa ibilidad más ampliamen e es udiado en nues o g upo es el
o mado po la p o eína Glu a ión S-T ans e asa T1 (GSTT1).
La GSTT1 es una enzima ci osólica que ac úa en la ase II de la de oxi icación de á macos.
Tiene 29 kDa de peso molecula y su localización es muy a iada, pe o des acan el hígado,
iñón, e i oci os, pa a i oides y p ós a a como ejidos en los que se exp esa en mayo g ado.
En la población caucásica exis e un 20% de pe sonas que p esen an geno ipo nulo pa a la
GSTT1, es deci , son homocigo os pa a la deleción del gen y po an o no la exp esan, mien as
que el 80% es an e de la población, bien sean he e ocigo os u homocigo os pa a el gen
sil es e, sí exp esan es a p o eína.
Imagen 6. Es uc u a e cia ia de la p o eína GSTT1.
Nues o g upo ha desc i o p e iamen e, an o en asplan e enal (Aguile a I y col., 2005;
Aguile a I y col., 2008) como en hepá ico (Aguile a I y col., 2001; Aguile a I y col., 2004), que en
el momen o en el que el sis ema inmune de un ecep o nulo ecibe un inje o posi i o pa a la
GSTT1 puede desa olla an icue pos an i-GSTT1. Dichos an icue pos, p eceden al desa ollo
de la hepa i is inmune (HI) de no o, en el caso del asplan e hepá ico, y del echazo mediado
po an icue pos, en el caso del asplan e enal. Es as en e medades pueden desencadena la
pé dida de la uncionalidad del inje o si no se adminis a el a amien o adecuado,
consis en e en es e oides.
En el caso de la HI de no o, la p ime a ez que se desc ibió ue hace algunos años como una
nue a o ma de dis unción del inje o en niños some idos a asplan e hepá ico debido a o as
indicaciones que no implicaban la hepa i is au oinmune. Los c i e ios mínimo de diagnós ico
de la HI de no o, aco dados en Ban , incluyen que exis an in il ados lin oci a ios en las
egiones po ales, p esencia signi ica i a de an icue pos, que en nues o caso se án di igidos
en e a la p o eína GSTT1, hipe gammaglobulinemia y exclusión diagnós ica de o os ipos de
hepa i is como la i al o la de i ada de á macos (Ban Wo king G oup).
36
A lo la go de es os años y as habe analizado ap oximadamen e 700 asplan es, en e
enales y hepá icos, nues o g upo ha demos ado que la p oducción de an icue pos an i-
GSTT1 sólo ocu e bajo la si uación de incompa ibilidad gené ica donan e GSTT1-posi i o /
ecep o GSTT1-nulo. En el es o de combinaciones (donan e-posi i o / ecep o -posi i o;
donan e-nulo / ecep o -nulo y donan e-nulo / ecep o -posi i o) no se han encon ado
an icue pos. De hecho, hemos obse ado que los únicos pacien es que se diagnos ican de HI
de no o son aquellos a los que les hemos de ec ado an icue pos an i-GSTT1. Nues o g upo ha
desc i o, además, la p esencia de depósi os de C4d en las á eas po ales de biopsias hepá icas
de pacien es incompa ibles asplan ados de hígado diagnos icados de HI de no o, lo que
apoya ía la hipó esis del papel pa ogénico de los an icue pos an i-GSTT1, aunque se
desconocen los mecanismos (Aguile a I y col., 2011).
Imagen 7. Iden i icación del pa ón p oducido median e inmuno luo escencia indi ec a (IFI) po los an icue pos an i-
GSTT1 en hígado de a a, p esen es en el sue o pos - asplan e de un pacien e GSTT1-nulo que ecibió un hígado
GSTT1-posi i o (dilución del sue o 1:80).
Es os an icue pos ambién se han encon ado en el sue o de las pe sonas no asplan adas con
geno ipo GSTT1-nulo, que han sido some idas a ans usiones p oceden es de donan es
GSTT1- posi i os, o en muje es emba azadas de e os GSTT1-posi i os (Wichmann I y col.,
2006). En el p ime caso es debido a que la p o eína se exp esa en la memb ana de los
e i oci os, lo que p o oca que cuando el sis ema inmune del pacien e se pone en con ac o
con la p o eína, gene a una espues a en e a ella mediada po lin oci os B. En el caso de las
muje es GSTT1-nulas que ienen hijos GSTT1-posi i os, es a ci cuns ancia puede epe i se al
en a en con ac o las células del sis ema inmuni a io de la u u a mad e con la p o eína
exp esada po el e o.
37
Si bien es cie o que no odos los casos de pacien es GSTT1-nulos que se ponen en con ac o
con la p o eína llegan a desa olla una espues a inmuni a ia en e a és a, con es as
e idencias podemos pone de mani ies o el al o g ado de inmunogenicidad que p esen a es a
p o eína.

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS
______________________________________________________________________
41
Hipó esis
Pensamos que pa a el desa ollo de la en e medad se equie en dos pila es undamen ales:
 Po un lado, la p esencia de lin oci os B alo-especí icos en e a GSTT1, los cuales:
 P oducen an icue pos GSTT1-especí icos. No se conoce si es os an icue pos
ienen un papel pa ogénico ya que el an ígeno diana se localiza en el
ci oplasma celula , aunque se desconoce si en de e minadas si uaciones se
exp esa en supe icie. O o concep o undamen al es la ace a de los lin oci os
B como células p esen ado as de an ígeno. Además, es as células son
impo an es en el man enimien o de la espues a inmuni a ia p olongada en
el iempo.
 Po o o lado la p esencia de lin oci os T alo-especí icos en e a GSTT1, los cuales:
 C eemos que son los esponsables de p o oca el daño isula con el
consiguien e acaso del inje o.
Obje i os
Dilucida los mecanismos isiopa ológicos implicados en el desa ollo de la hepa i is inmune de
no o:
1. Explo a la dis ibución celula de la p o eína GSTT1 y es udia la implicación de los
an icue pos GSTT1 especí icos en el acaso del ó gano asplan ado.
2. De e mina la p esencia de lin oci os T alo-especí icos en e a la p o eína GSTT1.
3. Dilucida el papel que desempeñan los lin oci os T alo-especí icos de GSTT1 en el
echazo del inje o.

49
Mé odos
1. Ex acción de ADN a pa i de mues as de sang e pe i é ica
T as ecopila las mues as de sang e pe i é ica de odos los pa icipan es en el es udio,
ealizamos la ex acción de ADN usando el siguien e mé odo come cial:
1.1. Sis ema MagNA Pu e Compac (Roche, Mannheim, Alemania)
Con es a ecnología, el ADN se une selec i amen e a bolas pa amagné icas en p esencia de
sales cao ópicas mien as que el es o de los con aminan es son eliminados de la mues a. El
ADN pu i icado se eluye de la solución con las bolas pa amagné icas bajo condiciones de baja
salinidad y quedando lis o pa a se usado en pos e io es aplicaciones con una concen ación
ap oximada de 40-50 ng/µl.
2. Ca ac e ización gené ica de nues a población de es udio a endiendo a un sis ema meno
de his ocompa ibilidad (mHags)
2.1. Reacción en cadena de la polime asa (PCR)
Pa a conoce la dis ibución gené ica de los dis in os alelos que es udia emos en la población
an o de asplan ados como en la de sus donan es, lle amos a cabo la eacción en cadena de
la polime asa (PCR), cuyo obje i o es la ob ención de un g an núme o de copias de un
agmen o de ADN pa icula , pa iendo de un mínimo.
El undamen o de dicha écnica, desa ollada en 1986 po Ka y Mullis (Mullis K y col., 1986), es
usa la p opiedad na u al de las enzimas ADN polime asas pa a eplica heb as de ADN cuando
es án en p esencia de una secuencia molde o cebado , capaz de se i le de inicio, y de los
nucleó idos (dNTPS; New England Biolabs, Ipswich, Ingla e a) necesa ios pa a lle a a cabo
dicha eplicación. Pa a ello, emplea ciclos de al as y bajas empe a u as al e nadas pa a
sepa a las heb as de ADN ecién o madas en e sí as cada ase de eplicación, y a
con inuación, deja que uel an a uni se las polime asas pa a que uel an a duplica las.
Los cambios de empe a u a se ealizan en el e mociclado , y oscilan en e los 55 y los 95 °C,
po lo que se hace imp escindible el uso de ADN polime asas e moes ables, como es la Taq
polime asa (New England Biolabs, Ipswich, Ingla e a). Dicha Taq polime asa, pa a ac ua
óp imamen e, necesi a un ambien e salino especí ico gene ado po una solución amponan e
especí ica suminis ada po la misma casa come cial (New England Biolabs, Ipswich,
Ingla e a).
El p oceso de PCR consis e, po lo gene al, en una se ie de 30 a 45 cambios epe idos de
empe a u a llamados ciclos, consis iendo cada uno de ellos en 2 o 3 pasos a di e en es
empe a u as. Las empe a u as usadas y el iempo aplicado en cada ciclo dependen de g an
a iedad de pa áme os, en e los que des aca la empe a u a óp ima de unión de los
50
cebado es, así como la longi ud del ADN que se desea ampli ica . De al o ma que las
condiciones ue on las siguien es:
 Paso 1- Desna u alización inicial, 94°C du an e 5 minu os.
 Paso 2- 40 ciclos con 3 pasos cada ciclo:
 Desna u alización, 94°C du an e 30 segundos.
 Unión al cebado , du an e 45 segundos.
 Ex ensión, 72°C du an e 1 minu o.
 Paso 3- Ex ensión inal, 72°C du an e 5 minu os.
Imagen 8. En es e g á ico se esquema izan los dis in os p ocesos po los que pasa el ADN en un ciclo en el
e mociclado , donde se al e nan p ocesos de desna u alización del ADN, unión del cebado y ex ensión po la
enzima Taq polime asa.
2.2. Elec o o esis en gel de aga osa
Los dis in os p oduc os de ampli icación ue on some idos a elec o o esis ho izon al en gel de
aga osa 2%, lle ándose a cabo a un ol aje cons an e de 180 ol ios du an e ap oximadamen e
30 minu os.
51
2.3. Relación de los cebado es usados
2.3.1. Geno ipo de la Glu a ión S- ans e asa T1 (GSTT1)
Pa a lle a a cabo el geno ipado en la p o eína GSTT1, se usa on el cebado GSTT1 o wa d (o
cebado sen ido) con la secuencia 5´-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3´, y el cebado GSTT1
e e se (o cebado an isen ido) 5´TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3´. Como con ol in e no de
la eacción ecu imos a la ampli icación del gen K-Ras, haciendo uso del cebado o wa d o
sen ido: 5´-GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG-3´ y el cebado e e se o an isen ido: 5´-TAG
CTG TAT CGT CAA GGC AC-3´. La empe a u a óp ima de unión al cebado pa a ambas
ampli icaciones es de 58°C.
Reac i os
Can idad
ADN (35-50 ng/µl)
2 µl
Solución amponan e 10X
5 µl
DNTPs
0.4 µl
GSTT1 o wa d
0.2 µl
GSTT1 e e se
0.2 µl
K-Ras o wa d
0.2 µl
K-Ras e e se
0.2 µl
Taq polime asa
0.2 µl
Agua c.s.p.
50 µl
Si la mues a analizada es posi i a pa a GSTT1, ya sea homocigo a o he e ocigo a, apa ece á
una banda de 498 pa es de bases, además de la debida a la ampli icación de K-Ras que se á de
en o no a 190 pa es de bases. En cambio, si es homocigo a nula, sólo apa ece á la banda
co espondien e a la ampli icación de K-Ras (Pemble S y Col., 1994).
Imagen 9. Obse amos cómo en es a elec o o esis ho izon al, en los ca iles 1 y 2 los pacien es pa ecen se GSTT1-
nulos, ya que sólo se obse a la banda de 190 pb co espondien e a la ampli icación del con ol in e no de eacción,
el K-Ras. En cambio en los ca iles 3, 4, 5, 6, 7 y 8 los pacien es son GSTT1 posi i os po p esen a una banda de 498
pb.
52
Pa a dis ingui en e los pacien es con geno ipo posi i o, los que e an homocigo os (+/+) de los
he e ocigo os (+/-), ealizamos una segunda PCR- Con es a PCR lo que conseguimos ampli ica
es p ecisamen e la secuencia delecionada. Pa a ello, los cebado es usados ue on GSTT1-Null
Fo wa d 5´-GGA TTA CAG TTG TGA GCC ACG GTA-3´y GSTT1-Null Re e se 5´-ACA CCG GGG TGG
TTG AT-3´. El p og ama del e mociclado usado ue un poco dis in o al p og ama gene al
an es explicado (Nai o M y col., 2006):
 Paso 1- Desna u alización inicial, 95°C du an e 10 minu os.
 Paso 2- 35 ciclos con 3 pasos cada ciclo:
 Desna u alización, 95°C du an e 1 minu o.
 Unión al cebado , 59° du an e 1 minu o.
 Ex ensión, 72°C du an e 1 minu o.
 Paso 3- Ex ensión inal, 72°C du an e 5 minu os.
Reac i os
Can idad
ADN (35-50 ng/µl)
2 µl
Solución amponan e
10X
5 µl
DNTPs
0.4 µl
GSTT1-Null o wa d
0.2 µl
GSTT1-Null e e se
0.2 µl
Taq polime asa
0.2 µl
Agua c.s.p.
50 µl
Si as la elec o o esis en gel de aga osa de 2% con i mamos la ampli icación de un p oduc o
de 580 pa es de bases ap oximadamen e, esos pacien es se án nulos pa a la GSTT1. Si en
cambio no se ampli ica nada, el pacien e se á GSTT1 posi i o.
3. Ob ención de mues as de sue o de los pacien es asplan ados hepá icos
De los pacien es incluidos en el es udio ob u imos mues as de sue o, conside ando
imp escindible que los sue os ue an ecogidos a dis in os iempos pos - asplan e, de al
o ma que se oma on de o ma se iada desde el p ime mes pos - asplan e has a comple a
un seguimien o mensual mínimo de 9 meses o has a el momen o de exi us del pacien e.
También ob u imos mues as de sue o en si uación p e- asplan e.
4. De e minación de an icue pos an i-GSTT1 median e es de ELISA
4.1. De e minación de an icue pos an i-GSTT1 de iso ipo IgG o al
Pa a de e mina la p esencia y í ulo de los an icue pos p esen es en las mues as de sue o y
plasma de los pacien es asplan ados de hígado, usamos el es ELISA (enzimoinmunoanálisis
de adso ción) come cialziado po Biomedal (Se illa, España) que es á cebado con la p o eína
53
humana ecombinan e GSTT1. Es e es un ensayo inmunoc oma og á ico diseñado pa a la
de ección de an icue pos di igidos con a la GSTT1 en sue os humanos ya que as a ias
incubaciones y la ados, e mina p oduciéndose una eacción colo imé ica que se elaciona de
o ma no lineal con la can idad de an icue pos an i-GSTT1 p esen e en los pocillos.
El p o ocolo empleado en es e caso ue el ma cado po el ab ican e. En esumen, la écnica
consis e en una incubación de 1 ho a en e la p o eína ecombinan e y la dilución 1:100 del
sue o de es udio. T as los la ados co espondien es, se p ocedió a lle a a cabo una segunda
incubación, pe o es a ez, con el an icue po secunda io an i-humano IgG comple a, conjugado
con os a asa alcalina (AP). De es e modo, al añadi le el sus a o c omogénico que el ab ican e
suminis a, se p oduce una eacción colo imé ica con la AP y, as analiza la señal
espec o o omé icamen e, a una longi ud de onda de 405 nm, ob enemos el í ulo b u o de
an icue pos. Todo el p oceso debe ealiza se po duplicado y el alo inal se á la media de
ambos menos el alo de abso bancia ob enido po el blanco. Usando las ecomendaciones del
ab ican e, omamos como alo es posi i os aquellos en los que la abso bancia media a 405
nm e a supe io a 1 y nega i os aquellos en los que la abso bancia no alcanza a el alo 0.5. La
zona cuyos alo es oscilan en e 0.5 y 1 es conside ada zona g is, cuyos esul ados deben se
analizados con p ecaución y a endiendo a posibles alo es posi i os o nega i os en mues as
pos e io es en el iempo a la analizada.
4.2. De e minación de las dis in as subclases de an icue pos an i-GSTT1
G acias al expe imen o an e io podemos de e mina si nues a población de pacien es posee
an icue pos IgG especí icos en e a la p o eína GSTT1, pe o no somos capaces de disce ni la
subclase de dichos an icue pos. Pa a ello lle amos a cabo el mismo expe imen o, pe o usando
es a ez unos an icue pos secunda ios especí icos de cada subclase, de al o ma que ha emos
un ba ido sob e las cua o posibilidades: an icue po monoclonal secunda io an i-humano
hecho en a ón di igido en e a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 odos ellos conjugados con os a asa
alcalina (AbCam, Camb idge, Reino Unido).
En es e caso, y debido a que hemos cambiado las condiciones del ki come cial, ajus a emos
las abso bancias ob enidas en cada una de las subclases en unción del alo mayo ob enido,
pa a ello, las equipa a emos al alo máximo en p opo ción an o po 1. Conside a emos que
los an icue pos an i-GSTT1 son posi i os pa a un iso ipo de e minado si el alo ajus ado en
an o po 1 es supe io a 0.33, ya que dicho alo se á 3 eces in e io al alo máximo.

54
5. Explo ación de la dis ibución celula de la p o eína GSTT1
Con el obje i o de es udia la localización celula de nues a p o eína de in e és, hemos usado
la línea celula HepaRG. És a p ocede de un hepa oca cinoma humano adqui ida
come cialmen e (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU). Es as células son p ogeni o es
bipo enciales, lo cual les pe mi e di e encia se en hepa oci os y colangioci os ( a io 1:1). Pa a
consegui dicha di e enciación en los dos ipos celula es mencionados an e io men e, se lle ó
a cabo el siguien e p o ocolo de abajo (Ce ec y Col., 2007):
 4 días con medio William´s E comple o.
 14 días con medio William´s E comple o suplemen ado al 1,7% con DMSO.
5.1. Ca ac e ización línea celula HepaRG
Con obje o de e i ica la co ec a di e enciación de nues a línea celula en hepa oci os y
colangioci os, empleamos pelle de células di e enciadas y cul i adas du an e 81 días (5x105
células ap oximadamen e). Pa a ello u ilizamos la écnica de wes e n blo . Dicha écnica
cons a de los siguien es de pasos:
 Lisis celula
 Cuan i icación del ex ac o
 P epa ación de gel de p o eína
 T ans e encia a memb ana de ni ocelulosa
 Inmunoblo
5.1.1. Lisis celula
Añadi cóc el de inhibido de p o easas (Sigma Ald ich, MI, EEUU) a la concen ación adecuada
(1 µl de inhibido de p o easas en 100 µl de bu e de lisis). A pa i de es e momen o odo el
p oceso se ealiza en hielo. Pa a un bo ón de células de ap oximadamen e 50 µl, añadi 100-
500 µl de bu e de lisis NP-40. Machaca du an e 1 minu o con una a illa y deja du an e 30
minu os en hielo. Repe imos el paso an e io . A con inuación, cen i uga a 4°C, 12000 pm
du an e 30 minu os. Seguidamen e, ecoge el sob enadan e con cuidado y pasa a un ubo
nue o. Finalmen e, gua da en el congelado a -20°C.
5.1.2. Cuan i icación de p o eínas
Pa a la cuan i icación de p o eína usamos el ki “Pie ce BCA P o ein Assay Ki ” (The mo Fishe
Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) siguiendo las ins ucciones del ab ican e.
5.1.3. P epa ación gel de p o eína
Coloca dos c is ales limpios con en la cube a de sujeción con las dos i as g ises a los lados.
P epa a e in oduci en los c is ales con ayuda de una pipe a Pas eu el “ esol ing gel” al 10%
con cuidado de no o ma bu bujas. Cub i con e anol pa a e i a que el gel quede en con ac o
con el ai e y deja polime iza du an e 15 minu os. Pasado ese iempo, e i a el e anol y la a
el gel unas 2-3 eces con agua des ilada. A con inuación, p epa a y ca ga el “s acking gel” al
4% y coloca el peine pa a que se o men los pocillos de ca ga. Deja polime iza du an e 15
minu os. T anscu ido ese iempo, qui a el peine, la a el gel unas 2-3 eces con agua
55
des ilada. Pos e io men e, coloca el gel en la cube a de elec o o esis y añadi “ unning
bu e ”. P epa a la mues a, pa a la cual, mezcla la mues a de p o eína con el bu e de
ca ga en p opo ción 1:1, calen a la mues a en agua hi iendo du an e 3 minu os. Ca ga el
ma cado de peso molecula y la mues a. Finalmen e, co e el gel a 200 V du an e una ho a.
5.1.4. T ans e encia a memb ana de ni ocelulosa
Pone dos esponji as bien empapadas en bu e de ans e encia en una cube a mediana po
cada gel ob enido. Rellena o a cube a con bu e de ans e encia, pone 2 papeles de il o 1
una memb ana de ni ocelulosa, po cada gel, pa a que empapen. Qui a los c is ales con
cuidado pa a e i a ompe los geles. De nue o, ellena o a cube a mayo con bu e de
ans e encia. Saca los c is ales de la cube a de donde hemos ealizado la elec o o esis y
coloca los en la cube a mayo con bu e de ans e encia. Sob e una placa aguje eada coloca
una esponji a. A con inuación, pone un papel de il o y sob e él se coloca el gel.
Pos e io men e, pone la memb ana de ni ocelulosa y p esiona sua emen e con una a illa
de id io pa a qui a las bu bujas. Po úl imo, coloca o o papel de il o, o a esponji a y
ce a la es uc u a. In oduci la placa en la es uc u a de ans e encia y posiciona la sob e el
agi ado magné ico. Pone hielo en la es uc u a de ans e encia y un imán, con obje o de
ac i a la agi ación de mane a sua e. Realiza la ans e encia a 100 V du an e una ho a. T as
inaliza la ans e encia, desmon a la es uc u a, ecoge la memb ana, co a en i as y
conse a a -20°C.
5.1.5. Inmunoblo
Incuba du an e 1 ho a a empe a u a ambien e en agi ación sua e, las i as con la solución de
bloqueo pa a bloquea los an icue pos inespecí icos. T as el bloqueo inicial, incuba las i as
con el an icue po p ima io diluido en solución de bloqueo a la concen ación deseada, du an e
1 ho a a empe a u a ambien e y en agi ación sua e. En nues o caso, se u iliza on los
an icue pos:
 Rabbi an i-human HNF-4α (1:100) (AbCam, Camb idge, Reino Unido).
 Rabbi an i-human CK19 (1:10000) (AbCam, Camb idge, Reino Unido).
 Rabbi an i-human ALDOB (1:250) (AbCam, Camb idge, Reino Unido).
 Rabbi an i-human β-ac ina (1:10000) (AbCam, Camb idge, Reino Unido).
T anscu ido ese iempo, ealiza es la ados de 10 minu os en agi ación con TTBS. A
con inuación, añadi el an icue po secunda io disuel o en solución de bloqueo y deja du an e
una ho a a empe a u a ambien e en agi ación sua e. En nues o caso, se usó el an icue po
goa an i- abbi IgG (H-L) (1:20000) (AbCam, Camb idge, Reino Unido). Pos e io men e, ol e
a epe i los 3 la ados. Pa a el e elado, se u ilizó el eac i o de de ección de Wes e n Blo ing
GE Heal hca e Li e SciencesTM Ame shamTM ECL Selec TM (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham,
MA, EEUU) siguiendo las ins ucciones del ab ican e. Finalmen e, la señal se egis ó usando el
sis ema ImageQuan LAS 4000 mini.
En es a imagen podemos obse a los esul ados pa a los dis in os ma cado es ensayados po
wes e n blo . El ma cado HNF-4α es ca ac e ís ico de células HepaRG di e enciadas en
hepa oci os, el ma cado CK19 es especí ico de células HepaRG di e enciadas en colangioci os,
56
mien as que el ma cado ALDOB apa ece en ambos ipos celula es. Como con ol in e no
usamos el ma cado β-ac ina. Podemos ap ecia posi i idad en odos los ma cado es
u ilizados, lo cual con i ma la di e enciación en los dos ipos celula es posibles (hepa oci os y
colangioci os).
Figu a 1. Resul ados de la ca ac e ización celula de la línea celula HepaRG median e wes e n blo .
6. Es udio de la dis ibución celula de la p o eína GSTT1
Aunque se conoce que la p o eína GSST1 iene una exp esión ci oplasmá ica, decidimos
es udia la exp esión de dicha p o eína a ni el de supe icie. El obje i o de es o es de e mina
si la p o eína llega a exp esa se en supe icie pa a ac ua como diana y pone en ma cha los
mecanismos esponsables de la espues a T. Pa a ello se idea on dos abo dajes expe imen ales
dis in os: inmunoci oquímica y ci ome ía de lujo.
6.1. Inmunoci oquímica
Inicialmen e, la línea celula HepaRG se cul i ó sob e cub es (p e iamen e es e ilizados) en
placa de cul i o o mada po 12 pocillos es é il (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU).
Las células se deja on c ece has a que se expandie on y ocupa on la supe icie del cub e. A
con inuación, omamos los cub es con las células y los pasamos a una nue a placa de 12
pocillos no es é il pa a la a con PBS. Pos e io men e, ijamos las células con me anol
p e iamen e en iado a -20°C du an e 6 minu os. Seguidamen e, algunos cub es ue on
pe meabilizados con solución de i ón 0,5% en PBS du an e 10 min pa a usa los como
compa a i a con los cub es de células sin pe meabiliza . Realizamos 3 la ados con PBS.
Llegados a es e pun o, incubamos con el an icue po p ima io (sue o de pacien es con la
en e medad y que p esen an an icue pos an i-GSTT1, cuyo í ulo había sido e aluado
p e iamen e, a una dilución (1:20)) du an e 45 min. T as la incubación, la amos 3 eces con
PBS e incubamos con el an icue po secunda io (mouse an i-human IgG FITC (Jackson
ImmunoResea ch Eu ope L d, Camb idge, Reino Unido), dilución (1:100), du an e 30 minu os
en oscu idad. Pos e io men e, la amos 3 eces con PBS, añadimos medio de mon aje con DAPI
(The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) y mon amos el cub e sob e un po a.
57
6.2. Inmunoci oquímica in i o
Inicialmen e, cogemos los cub es con las células y los pasamos a una nue a placa de 12
pocillos no es é il pa a la a con PBS-BSA 0,1% en agi ación sua e. Seguidamen e,
descomplemen a los sue os a 56°C du an e 30 minu os. A con inuación, ealizamos un
coma caje con los an icue pos p ima ios du an e 2 ho as en agi ación sua e:
 Sue o de pacien es con la en e medad y que p esen an an icue pos an i-GSTT1, cuyo
í ulo había sido e aluado p e iamen e, a una dilución (1:20).
 Ma cado de memb ana mouse an i-human CD81 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham,
MA, EEUU), dilución (1:50).
T anscu ido el iempo de incubación, la a las células 3 eces con PBS-BSA 0,1% en agi ación
sua e. Pos e io men e, ijamos las células en me anol ío a -20°C du an e 6 minu os. De
nue o, ealizamos 3 la ados con PBS-BSA 0,1% en agi ación sua e. Llegados a es e pun o,
incubamos con los an icue pos secunda ios, dilución (1:300) du an e 30 minu os en oscu idad
y agi ación sua e:
 Goa an i-human IgG TRITC (Jackson ImmunoResea ch Eu ope L d, Camb idge, Reino
Unido).
 Goa an i-mouse IgG FITC (Jackson ImmunoResea ch Eu ope L d, Camb idge, Reino
Unido).
Finalmen e, la a 3 eces con PBS-BSA 0,1% en agi ación sua e, añadimos medio de mon aje
con DAPI (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) y mon amos el cub e sob e un po a.
6.3. Ci ome ía de lujo
Inicialmen e, le an amos las células con ipsina-EDTA (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA,
EEUU). Añadimos sue o e al bo ino (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) pa a
bloquea el e ec o de la ipsina. Seguidamen e, la amos las células con DPBS e incubamos con
LIVE/DEAD® Fixable Yellow Dead Cell S ain Ki (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU)
según las ins ucciones del ab ican e. A con inuación, la amos las células con 1 ml de DPBS
(The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) y ealizamos el ma caje con los an icue pos
p ima ios a la dilución ecomendada po el ab ican e du an e 30 minu os:
 Rabbi an i-human GSTT1 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU).
 Mouse an i-human CD81 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU).
T anscu ido el iempo de incubación, la amos las células con 1 ml de DPBS (The mo Fishe
Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU) y ealizamos el ma caje con los an icue pos secunda ios a la
dilución ecomendada po el ab ican e du an e 30 minu os en oscu idad:
1. Goa an i- abbi Alexa Fluo 568 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU).
2. Goa an i-mouse Alexa Fluo 488 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, MA, EEUU).
Finalmen e, se hace un la ado con 1 ml de DPBS ío y esuspendemos el pelle celula en un
olumen inal de 500 µl de DPBS. La adquisición se lle ó a cabo en un ci óm e o BD
LSRIIFo essa (BD Biosciences, CA, EEUU) y pa a el análisis de da os se u ilizó el so wa e

RESULTADOS
______________________________________________________________________
67
Resul ados
En es e apa ado amos a de alla los di e en es esul ados ob enidos pa a esponde a las
cues iones plan eadas en los obje i os.
OBJETIVO 1. Explo a la dis ibución celula de la p o eína GSTT1 y es udia la implicación de
los an icue pos GSTT1 especí icos en el acaso del ó gano asplan ado.
A con inuación, se mues an los esul ados conseguidos en el es udio de la dis ibución celula
de la p o eína GSTT1 median e los dos abo dajes expe imen ales lle ados a cabo,
inmunoci oquímica y ci ome ía de lujo.
1.1. Inmunoci oquímica
Teniendo en cuen a que la p o eína GSTT1 se localiza a ni el ci oplasmá ico, pa a lle a a cabo
sus unciones como enzima de oxi icado a, al y como se obse a en las imágenes A y B (Figu a
2), donde las células HepaRG di e enciadas se pe meabiliza on. T as los expe imen os
ealizados, podemos de e mina que un bajo núme o de células p esen an dicha p o eína a
ni el de la supe icie celula . Es o apa ece e idenciado en las imágenes C y D (Figu a 2), donde
el pa ón de inmuno luo escencia en células que no han sido pe meabilizadas es cla amen e
dis in o al que encon amos en las imágenes A y B cuyas células ue on pe meabilizadas.
Además, las imágenes E y F (Figu a 2) apoyan lo explicado an e io men e, ya que en es e caso
al usa los ma cado es CD81 ( e de) y GSTT1 ( ojo) en células no pe meabilizadas, se ap ecia
un e ue zo de colo ana anjado co espondien e al coma caje CD81/GSTT1 en algunas zonas
de la memb ana celula . Es os esul ados se án pos e io men e co obo ados, g acias a los
expe imen os ealizados median e ci ome ía de lujo.
68
Figu a 2. En es a igu a obse amos los esul ados ob enidos a endiendo a las di e en es condiciones
expe imen ales que hemos ealizado. En las imágenes A y B, obse amos la localización ci oplasmá ica de la
p o eína GSTT1 en células HepaRG di e enciadas (hepa oci os y colangioci os) que ue on ijadas y pe meabilizadas.
En las imágenes C y D, podemos ap ecia un pa ón o almen e dis in o al an e io . En es e caso, la p o eína GSTT1
se si úa a ni el de la memb ana celula ya que las células no ue on pe meabilizadas. Po úl imo, las imágenes E y F,
mues an el coma caje de los ma cado es CD81 y GSTT1 en células no pe meabilizadas.
69
1.2. Es udio de la exp esión de GSTT1 median e ci ome ía de lujo
Pa a es e es udio se u iliza on HepaRG di e enciadas (hepa oci os y colangioci os) que ue on
ma cadas con GSTT1 y el ma cado de memb ana CD81. Respec o a la je a quía u ilizada en el
análisis de los da os, inicialmen e hemos omado una población o al de células, a
con inuación se seleccionan los single es (desca ando de es a o ma los doble es celula es),
seguidamen e aco amos la población de células i as g acias al ma cado de iabilidad y
inalmen e egis amos la población doble posi i a pa a los ma cado es de es udio CD81 y
GSTT1. Los esul ados mues an que de la población o al de es udio, el 0,2% es doble posi i a
pa a ambos ma cado es CD81/GSTT1 (Figu a 3). Po an o, a pesa de que la p o eína GSTT1
iene exp esión ci oplasmá ica, g acias a es os esul ados podemos conclui que dicha p o eína
ambién se puede localiza en la supe icie celula de o ma débil. Es o ea i ma los esul ados
ob enidos an e io men e median e inmunoci oquímica.
Figu a 3. Je a quía de ma cado es u ilizada y esul ados del es udio de exp esión de la p o eína GSTT1 en la
memb ana celula median e ci ome ía de lujo.
Con obje o de comp oba si los an icue pos an i-GSTT1 son ac i ado es de complemen o y po
an o pueden ene un papel pa ogénico, se de e mina on las subclases de IgG de es os
an icue pos.
43,5%
94,5%
0,2%
43,5%

70
1.3. De e minación de las dis in as subclases de an icue pos an i-GSTT1
En la siguien e abla obse amos la dis ibución de las dis in as subclases IgG de los
an icue pos an i-GSTT1 en los sue os de pacien es ensayados po ELISA. Se es udia on
e ospec i amen e 57 mues as de sue o de 18 pacien es:
 12 de ellos p esen aban an icue pos an i-GSTT1 y desa olla on la en e medad (en
ojo)
 6 de ellos p esen aban an icue pos an i-GSTT1, pe o no desa olla on la en e medad
(en neg o).
Lo más des acable de los esul ados es la p esencia mayo i a ia de las subclases IgG1-GSTT1 e
IgG4-GSTT1, aunque ambién se encon a on azas de o as subclases (IgG2-GSTT1 e IgG3-GSTT1).
Los pacien es expe imen a on cambios en las subclases de an icue pos IgG-GSTT1 y algunas de
ellas llega on a se inde ec ables como ocu ió con IgG1-GSTT1 en los pacien es 3 y 6, o IgG4-GSTT1
en el pacien e 2. La mayo ía de los pacien es p esen an las dos subclases mayo i a ias de
inmunoglobulinas (IgG1-GSTT1 e IgG4-GSTT1), aunque ambién se ha obse ado una si uación en la
cual sólo se de ec a una subclase de inmunoglobulina en odas las mues as analizadas
du an e la e olución del mismo pacien e, po ejemplo IgG1-GSTT1 en los pacien es 5 y 8, o IgG4-
GSTT1 en los pacien es 7, 14 y 15.
En p incipio no se obse a un pa ón di e enciable en e el g upo de pacien es diagnos icados
de HI de no o (pacien es de 1 a 12) espec o al g upo de pacien es que no llegan a desa olla
la en e medad (pacien es de 13 a 18).
71
Subclases de IgG en los an icue pos an i-
GSTT1
Ra io
Pacien e
Fecha de la mues a (Años
pos -Tx)
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
IgG1/IgG4
Biopsia hepá ica en el
diagnós ico
1
5 meses
0,361
0
0
0,36
1
7 meses
0,324
0
0
0,273
1.19
IgG4+/CD138+
12 meses
0,237
0
0
0
-
2
1,5
2,369
0
0
0,978
2.42
No disponible
7,5
0,649
0
0
0,154
4.21
10
0,556
0
0
0
-
3
7
0,133
*
*
0,252
0.53
10
0
*
*
0,249
-
4
2
0,5
0
0
0,257
1.94
No disponible
6,5
1,31
0
0
1,506
0.87
8,5
0,072
0
0
0,222
0.32
9
0,456
0
0
0,643
0.71
5
1
0,112
*
*
0
> 1
IgG4-/CD138 débil
5,5
0,116
0
0
0
-
6,5
0,168
0
0
0
-
6
4,5
0,236
*
*
0,593
0.40
6,5
0,163
0
0
0,551
0.30
8
0,333
*
*
0,713
0.47
10
0
0
0
0,924
-
12
0
0
0
0,875
-
7
1,5
0,163
0
0
1,526
0,107
IgG4+/CD138+
4
0
0
0
1,204
-
5,5
0,254
*
*
1,235
0,206
8
0
0
0
1,118
-
8
2,5
2,521
0
0
0
>1
IgG4-/CD138-
4
0,385
0
0
0
-
10
0,891
0
0
0
-
10,5
0,853
0
0
0
-
9
1
2,387
0
0
0,605
3.95
2
0,575
0
0
0,28
2.05
IgG4+/CD138+
2,5
0,904
*
0
0,203
4.45
10
4,5
0,111
0
0
0,136
0.82
5
0,117
0
0
0,209
0.56
11
2,5
0,178
0
0
0,076
2.34
IgG4-/CD138+
4
0,208
0
0
0,083
2.50
5
0,223
0
0
0,171
1.30
12
P e-Tx
2,017
*
*
1,754
1.15
1
0,493
*
*
2,47
0.20
IgG4+/CD138+
2
0,263
0
0
1,309
0.20
3
1,935
0
0
3,095
0.62
13
2
0,235
0
0
0,567
0.59
3
0,183
*
0
0,524
0.35
4
1,522
0
0
1,813
0.84
6
0
0
0
0,564
-
11
0,243
0
0
0,972
0.25
14
P e-Tx
0
0
*
1,068
-
1,5
0
0
0
0,897
-
2,5
0
*
0
0,316
-
5,5
0
0
*
0,553
-
15
2
0
0
0
0,168
-
2,5
0
0
0
0,203
-
4
0
*
0
1,308
-
IgG4-/CD138+
16
15
0,415
0
0
0,229
1.81
17
3
0,124
0
0
0,28
0.44
4
0,067
0
0
0,447
0.15
IgG4-/CD138+
18
16
0,711
0
0
0,625
1,14
Tabla 3. En la siguien e abla apa ecen los dis in os pacien es de asplan e hepá ico ensayados con
incompa ibilidad GSTT1 (donan e posi i o/ ecep o nulo) que con ienen an icue pos an i-GSTT1 en sue o. Pacien es
nume ados en ojo: pacien es diagnos icados con hepa i is inmune de no o; pacien es nume ados en neg o:
pacien es sin Hepa i is Inmune de no o. Los pacien es 12 y 15 enían an icue pos an i-GSTT1 an es del asplan e
hepá ico, debido a emba azo o ans usión. * Indica pequeñas can idades de la subclase ma cada. El a io IgG1-
GSTT1/IgG4-GSTT1 se ha calculado cuando ha sido posible ya que hay muchas mues as con una sola subclase.
72
En es a igu a obse amos los ni eles de las dis in as subclases de IgG encon ados pa a cada
mues a de sue o en odos los pacien es diagnos icados con hepa i is inmune de no o. Se
puede ap ecia como luc úan dichos ni eles con o me e oluciona la en e medad.
Figu a 4. En la siguien e igu a apa ecen las subclases IgG-GSTT1 encon adas en mues as de sue o de odos los
pacien es con hepa i is inmune de no o. Las mues as más ce canas a la echa de diagnós ico se ma can en ojo. Las
p opo ciones de las dis in as subclases así como la i ulación de los an icue pos luc úan du an e el seguimien o.
IgG4 es la más abundan e en la mayo ía de los casos jun o con la IgG1. Las o as dos subclases apenas son
ep esen a i as y desapa ecen con el iempo.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
5 7
mon hs pos -Tx
Pa ien 1
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
Pacien e 1
Pacien e 3
Pacien e 2
Pacien e 4
Pacien e 5
Pacien e 6
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Meses pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Pacien e 7
Pacien e 8
Pacien e 9
Pacien e 10
Pacien e 11
Pacien e 12
Años pos -Tx
Años pos -Tx
Años pos -Tx
73
En la siguien e igu a obse amos los ni eles de las dis in as subclases de IgG encon ados pa a
cada mues a de sue o en odos los pacien es que no han desa ollado hepa i is inmune de
no o. Se puede ap ecia como luc úan dichos ni eles du an e el seguimien o.
Figu a 5. En la siguien e igu a apa ecen las subclases IgG-GSTT1 encon adas en mues as de sue o de odos los
pacien es que no han desa ollado hepa i is inmune de no o. Las p opo ciones de las dis in as subclases así como la
i ulación de los an icue pos luc úan du an e el seguimien o. IgG4 es la más abundan e en las mues as ce canas al
pos -Tx a eces acompañada de IgG1. IgG1 p edomina en dos mues as (pacien es 16 y 18) después de un la go
seguimien o. IgG2 e IgG3 son p ác icamen e ausen es.
0
0,5
1
1,5
2
Pacien e 13
2 3 4 6 11
Años pos -Tx
0
0,5
1
1,5
Pacien e 14
P e-Tx 1,5 2,5 5,5
Años pos -Tx
0
0,5
1
1,5
Pacien e 15
2 2,5 4
Años pos -Tx
0
0,2
0,4
0,6
Pacien e 16
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
15
Años pos -Tx
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Pacien e 17
3 4
Años pos -Tx
0
0,2
0,4
0,6
0,8
Pacien e 18
16
Años pos -Tx
80
También, se analiza on las dis in as subpoblaciones a pa i de los esul ados pen áme o+CD8+
y pen áme o-CD8+ ob enidos an e io men e espec o de la población CD3+.
A pa i de los esul ados pen áme o+CD8+, se puede ap ecia como en odos los casos la
subpoblación CD56- (T con encionales) es mayo i a ia ( ep esen ada en e de y azul) en e a
la subpoblación CD56+, que incluye células T CD8+CD45RO+ y células T CD8+CD45RO-
( ep esen adas en ojo y iole a espec i amen e). Si se suman es as poblaciones no
con encionales, los pacien es sin la en e medad (P11 y 12) p esen an alo es supe io es al
30% mien as que los pacien es con la en e medad (P1, P3 y P5) p esen an alo es en e el
14,8% y el 20,7%. Po an o, el po cen aje de lin oci os T con encionales es más al o en el
g upo de pacien es con la en e medad.
Los lin oci os T con encionales son mayo i a iamen e lin oci os de memo ia en 4 de los
pacien es, al igual que los lin oci os CD8+CD56+ que ambién son p edominan emen e
lin oci os memo ia (Figu a 11).
Figu a 11. En es a igu a se ep esen an las dis in as subpoblaciones pen áme os+CD8+ a endiendo a los
ma cado es CD56 y CD45RO.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
P1 P3 P5 P11 P12
Subpoblaciones Pen áme o+CD8+
Pen áme o+ CD8+ CD56+
CD45RO-
Pen áme o+ CD8+ CD56-
CD45RO-
Pen áme o+ CD8+ CD56+
CD45RO+
Pen áme o+ CD8+ CD56-
CD45RO+

81
Respec o a los esul ados pen áme o-CD8+, como en el caso an e io la subpoblación
CD8+CD56- p edomina sob e la subpoblación CD8+CD56+. Po o o lado, a di e encia de los
alo es egis ados en los esul ados pen áme o+CD8+, los lin oci os con encionales son
mayo i a iamen e no memo ia en 3 de los 5 pacien es, al igual que los lin oci os CD8+CD56+ en
los que p edomina la población no memo ia en odos los pacien es.
Figu a 12. En es a igu a se ep esen an las dis in as subpoblaciones pen áme os-CD8+ a endiendo a los ma cado es
CD56 y CD45RO.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
P1 P3 P5 P11 P12
Subpoblaciones Pen áme o-CD8+
Pen áme o- CD8+ CD56+
CD45RO-
Pen áme o- CD8+ CD56-
CD45RO-
Pen áme o- CD8+ CD56+
CD45RO+
Pen áme o- CD8+ CD56-
CD45RO+
82
2.1.5. Es udio e áme os
2.1.6. Pacien es
En la siguien e abla se esal an en azul los pacien es incluidos en es e apa ado del es udio y
sus ca ac e ís icas.
Pacien e
Edad
al Tx
Tx
En e medad
p ima ia
Te apia inducción
Diagnós ico
HIdn
TTO
Fecha
ex acción
células
GRUPO 1
1
46
6-5-99
C Alcohólica
CYA, MMF, EST
6 AÑOS
PRED
2
67
10-4-12
CVHC
CYA, MMF, EST
9M
PRED
08/06/15
3
46
7-5-07
Au oinmune-like
CYA, MMF, EST
32M
PRED
15/08/11
04/02/15
4
47
2-7-00
CVHC
CYA, EST, BAS
24M
PRED, AZA
13/02/17
5
49
18-9-03
Alcohólica
CYA, MMF, EST
21M
PRED
21/10/15
6
46
2-11-01
C Alcohólica+CVHC
CYA, EST, BAS
33M
PRED
11/01/16
GRUPO 2
7
44
13-10-03
C Alcoholica
TAC, MMF, EST
No
8
52
8-04-01
CVHB+HCC
CYA, MMF, EST
No
9
39
23-11-96
C. Alcohólica+CVHB
CYA, AZA, EST
No
GRUPO 3
10
63
12-7-06
C Alcohólica+HCC
TAC, DAC
No
06/03/12
11
58
12-2-09
CVHB
TAC, MMF, EST
No
11/01/17
12
52
18-1-09
CVHC
TAC, MMF, EST
No
17/10/16
13
60
24-8-13
C Alcohólica
TAC, MMF, EST
No
03/06/15
14
61
17-07-13
CVHC+HCC
CYA, MMF,EST
No
09/12/15
15
61
10-4-13
CVHB
TAC, BAS, EST
No
30/10/15
16
50
19-4-11
CVHC+HCC
CYA, MMF, EST
No
GRUPO 4
CONTROL
17
63
16-02-11
C Alcohólica
MMF, EST
No
18
53
2009
CVHC
CYA, MMF, EST
No
19
45
10-10-01
CBP
TAC, MMF, EST
No
20
54
21-01-05
CVHC
TAC, MMF, EST
No
Tabla 6. En es a abla se ep esen an las ca ac e ís icas de los dis in os pacien es incluidos en el es udio. El g upo 1
es á o mado po pacien es que p esen an la incompa ibilidad GSTT1 (donan e posi i o / ecep o nulo), poseen
an icue pos en e a la p o eína GSTT1 y además han desa ollado la en e medad (Hepa i is inmune de no o). Los
pacien es del g upo 3 únicamen e p esen an la incompa ibilidad GSTT1, ca ecen de an icue pos y no ienen la
en e medad. El g upo 4 lo cons i uyen pacien es asplan ados de hígado con geno ipo GSTT1+, u ilizados como
con oles.
CYA: ciclospo ina A; MMF: mo e il mico enola e; EST: es e oides; BAS: basilisimab; DAC: daclizumab; PRED:
p ednisona; AZA: aza iop ina; HVC: hepa i is po i us C; HCC: hepa oca cinoma.
2.1.7. Je a quía
La je a quía u ilizada es simila a la empleada pa a el es udio de los pen áme os. Sin emba go,
en luga de analiza los ma cado es pen áme o y CD8, es udiamos los ma cado es e áme o y
CD4.
83
2.1.8. Resul ados
Sin emba go, en cuan o a los esul ados ob enidos con los e áme os, no se ha encon ado
ninguna población de lin oci os T CD4+ alo-especí ica en e a la p o eína GSTT1 en ninguno de
los pacien es ensayados.
G upo HIdn
Pacien e
Te áme o ensayado
% Población CD3+
Te áme o+ CD4+
1
2
DRB1*01(LLED)
0
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
3
DRB1*01 (LLED)
4
DRB1*01 (LLED)
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
5
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
6
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
3
10
DRB1*01 (LLED)
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
11
DRB1*01 (LLED)
12
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
13
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
14
DRB1*01 (LLED)
DRB1*15(ESVA)
15
DRB1*07(AVGE)
DRB1*07(GDFT)
DRB1*15(ESVA)
Tabla 7. Resul ados del es udio de e áme os.
84
OBJETIVO 3. Dilucida el papel que desempeñan los lin oci os T alo-especí icos de GSTT1 en el
echazo del inje o
3.1. Resul ados ac i ación pép idos GSTT1
3.1.1. Pacien es
En la siguien e abla se ma can en g is los pacien es incluidos en es e apa ado del es udio y
sus ca ac e ís icas.
Pacien e
Edad
al Tx
Tx
En e medad
p ima ia
Te apia inducción
Diagnós ico
HIdn
TTO
Fecha
ex acción
células
GRUPO 1
1
46
6-5-99
C Alcohólica
CYA, MMF, EST
6 AÑOS
PRED
2
67
10-4-12
CVHC
CYA, MMF, EST
9M
PRED
08/06/15
3
46
7-5-07
Au oinmune-like
CYA, MMF, EST
32M
PRED
18/05/16
4
47
2-7-00
CVHC
CYA, EST, BAS
24M
PRED, AZA
5
49
18-9-03
Alcohólica
CYA, MMF, EST
21M
PRED
17/02/16
6
46
2-11-01
C Alcohólica+CVHC
CYA, EST, BAS
33M
PRED
03/11/15
GRUPO 2
7
44
13-10-03
C Alcoholica
TAC, MMF, EST
No
20/06/18
8
52
8-04-01
CVHB+HCC
CYA, MMF, EST
No
15/01/18
9
39
23-11-96
C. Alcohólica+CVHB
CYA, AZA, EST
No
03/10/17
GRUPO 3
10
63
12-7-06
C Alcohólica+HCC
TAC, DAC
No
06/10/17
11
58
12-2-09
CVHB
TAC, MMF, EST
No
17/09/17
12
52
18-1-09
CVHC
TAC, MMF, EST
No
13
60
24-8-13
C Alcohólica
TAC, MMF, EST
No
14
61
17-07-13
CVHC+HCC
CYA, MMF,EST
No
15
61
10-4-13
CVHB
TAC, BAS, EST
No
16
50
19-4-11
CVHC+HCC
CYA, MMF, EST
No
18/05/18
GRUPO 4
CONTROL
17
63
16-02-11
C Alcohólica
MMF, EST
No
28/10/16
18
53
2009
CVHC
CYA, MMF, EST
No
23/11/15
19
45
10-10-01
CBP
TAC, MMF, EST
No
08/05/15
20
54
21-01-05
CVHC
TAC, MMF, EST
No
11/12/15
Tabla 8. En es a abla se ep esen an las ca ac e ís icas de los dis in os pacien es incluidos en el es udio. El g upo 1
es á o mado po pacien es que p esen an la incompa ibilidad GSTT1 (donan e posi i o / ecep o nulo), poseen
an icue pos en e a la p o eína GSTT1 y además han desa ollado la en e medad (Hepa i is inmune de no o). El
g upo 2 es á compues o po pacien es con la incompa ibilidad GSTT1, ienen an icue pos en e a dicha p o eína,
pe o no han desa ollado la en e medad. Los pacien es del g upo 3 únicamen e p esen an la incompa ibilidad
GSTT1, ca ecen de an icue pos y no ienen la en e medad. El g upo 4 lo cons i uyen pacien es asplan ados de
hígado con geno ipo GSTT1+, u ilizados como con oles.
CYA: ciclospo ina A; MMF: mo e il mico enola e; EST: es e oides; BAS: basilisimab; DAC: daclizumab; PRED:
p ednisona; AZA: aza iop ina; HVC: hepa i is po i us C; HCC: hepa oca cinoma.
3.1.2. Je a quía
A con inuación, se p esen a la je a quía u ilizada pa a el análisis de los esul ados. En dicha
je a quía se obse a cómo hemos seleccionado las dis in as poblaciones de in e és pa a
pos e io men e analiza su ac i ación a endiendo a los ma cado es de ac i ación es udiados.
85
Inicialmen e a endiendo a los pa áme os de complejidad (SSC) y de amaño (FSC) hemos
omado la población lin oci a ia. Pos e io men e, se seleccionan los single es (desca ando de
es a o ma los doble es celula es). A con inuación, designamos la población de células i as y
seguidamen e aco amos la población CD3+CD56-. A pa i de la población an e io ,
dis inguimos las subpoblaciones CD8+, CD4+, CD4+CD8+ y CD4-CD8- (Figu a 13). Finalmen e
analizamos los ma cado es de ac i ación de las subpoblaciones ci adas an e io men e. A modo
de ejemplo en es a igu a se ep esen an los esul ados ob enidos con células del pacien e 3.
Figu a 13. En es a igu a se ep esen a la je a quía de ma cado es u ilizada en el es udio de es imulación con
pép idos de GSTT1. Se obse an los esul ados ob enidos del pacien e 3.
3.1.3. Resul ados
En la siguien e abla se mues an los esul ados de ac i ación ob enidos.
71,3%
99,9%
77,5%
94,5%
19,9%
0,6%
4,8%
73,5%

86
G upo
Pacien es
Poblaciones
Ac i ación
IFN-y
IL-4
IL-10
CD107a
1
2
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
*
*
*
*
CD4-CD8-
0
0
0,3
0
3
CD8+
0
0,5
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0,8
0
0
CD4-CD8-
0
3,5
0
0
5
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
*
*
*
*
CD4-CD8-
0
2,2
0
0
6
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
5,9
0
0
1,9
2
7
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
0
0
0
8
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
0
0,8
0
9
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
*
*
*
*
CD4-CD8-
0
0
0
0
3
10
CD8+
0
0
0,3
0
CD4+
0
0
0,4
0
CD4+CD8+
0
0
0,5
0
CD4-CD8-
0
0
0
0
11
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
*
*
*
*
CD4-CD8-
0
0
0
0
16
CD8+
0
0,4
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
1,2
0
0
4
17
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
*
*
*
*
CD4-CD8-
0
0
0
0
18
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
0
0
0
19
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
0
0
0
20
CD8+
0
0
0
0
CD4+
0
0
0
0
CD4+CD8+
0
0
0
0
CD4-CD8-
0
0
0
0
Tabla 9. En la siguien e abla se mues an los po cen ajes de ac i ación ob enidos pa a cada molécula de ac i ación
en las dis in as poblaciones de los es g upos de pacien es es udiados. Los alo es (*) indican la escasez de e en os
pa a pode analiza dicha población.
87
Todos los pacien es con HI de no o p esen an ac i ación en alguna población de lin oci os T, si
bien llama la a ención que no son las poblaciones con encionales CD4+ o CD8+ sino sob e odo,
las DN CD4-CD8-. Todos ellos p esen an ac i ación de las células DN, bien ía IFN-y (pacien e 6),
ía IL-4 (pacien es 3 y 5) o ía IL-10 (pacien e 2), con alo es al os, eniendo en cuen a las
condiciones de inmunosup esión en las que se encuen an los pacien es y que epe cu en en
la baja eac i idad de las células. También se obse a ac i ación de las células DN en el g upo 2
(pacien e 8), ía IL-10 y en el g upo 3 (pacien e 16) ía IL-4. En meno g ado, ambién se
obse a ac i ación de los lin oci os CD4+CD8+ dobles posi i os, en pacien e 3 ía IL-4 y en
pacien e 10 ía IL-10. Los alo es egis ados pa a el ma cado CD107a (p o eína de memb ana
asociada a lisosomas 1) nos indican que ha habido deg anulación celula , lo cual coincide con
la ac i ación de o os ma cado es es udiados (Figu a 14). Sin emba go, el habe encon ado
ac i ación pa a el ma cado CD107a en un único pacien e se debe a que las condiciones de
incubación u ilizadas pa a ese ma cado no ue on óp imas.
Figu a 14. En es a igu a se ep esen an los alo es de ac i ación egis ados en las dis in as subpoblaciones
es udiadas de cada g upo de pacien es.
A con inuación, a endiendo a los da os de ac i ación lin oci a ia se mues a la p opo ción de
pacien es en an o po 1 de las dis in as poblaciones en unción del ma cado de ac i ación
es udiado.
0
1
2
3
4
5
6
7
2 3 5 6 8 101116 2 3 5 6 8 101116 23568101116 2 3 5 6 8 101116
% células ac i adas
CD4+ CD8+ CD4+CD8+ CD4-CD8-
Es imulación median e pép idos
INFγ
IL-4
IL-10
CD107a
88
3.1.4. Análisis ac i ación IFN-y
Figu a 15. En es a igu a se obse an los alo es de ac i ación egis ados de IFN-γ en las dis in as subpoblaciones
es udiadas de cada g upo de pacien es. Los da os se han ep esen ado en an o po 1.
 Población CD4-CD8-
Se ap eció ac i ación en 1 pacien e (25%) del g upo 1.
3.1.5. Análisis ac i ación IL-4
Figu a 16. En es a igu a se obse an los alo es de ac i ación egis ados de IL-4 en las dis in as subpoblaciones
es udiadas de cada g upo de pacien es. Los da os se han ep esen ado en an o po 1.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
IFN-y
G upo 1
G upo 2
G upo 3
G upo 4
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
IL-4
G upo 1
G upo 2
G upo 3
G upo 4
89
 Población CD8+
Obse amos ac i ación en 1 pacien e (25%) del g upo 1 y en 1 pacien e (33%) del g upo 3.
 Población CD4+CD8+
En es e caso, se de ec ó ac i ación en 1 pacien e (25%) del g upo 1.
 Población CD4-CD8-
Hemos egis ado ac i ación en 2 pacien es (50%) del g upo 1 y en 1 pacien e (33%) del g upo
3.
3.1.6. Análisis ac i ación IL-10
Figu a 17. En es a igu a se obse an los alo es de ac i ación egis ados de IL-10 en las dis in as subpoblaciones
es udiadas de cada g upo de pacien es. Los da os se han ep esen ado en an o po 1.
 Población CD8+
Obse amos ac i ación en 1 pacien e (33%) del g upo 3.
 Población CD4+
Hallamos ac i ación en 1 pacien e (33%) del g upo 3.
 Población CD4+CD8+
Encon amos ac i ación en 1 pacien e (33%) del g upo 3.
 Población CD4-CD8-
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
IL-10
G upo 1
G upo 2
G upo 3
G upo 4
96
en condiciones de incompa ibilidad gené ica donan e/ ecep o pa a el gen de la GSTT1, sino
ambién su capacidad de ac i a se po dis in as ías cuando son expues os a su an ígeno.
Hemos encon ado que, además de las poblaciones clásicas CD4+ y CD8+, exis en o as
subpoblaciones dobles posi i as CD4+CD8+ y dobles nega i as CD4-CD8-, es as úl imas desc i as
como egulado as, cuya impo ancia en echazo/ ole ancia del inje o no es á bien es ablecida.
So p enden emen e, las células DN alo-especí icas pa a GSTT1 apa ecen muy ep esen adas
en los pacien es es udiados po lo que end emos que alo a en el u u o qué papel es án
jugando en la hepa i is inmune de no o, ya econocida como un p oceso de echazo,
denominado echazo ico en células plasmá icas.

DISCUSIÓN
______________________________________________________________________
100
Discusión
En es e apa ado amos a discu i los di e en es esul ados ob enidos, siguiendo el mismo
o den que es ablecimos pa a los obje i os al inicio del es udio.
Obje i o 1. Explo a la dis ibución celula de la p o eína GSTT1 y es udia la implicación de los
an icue pos GSTT1 especí icos en el acaso del ó gano asplan ado.
Cuando nues o g upo desc ibió que odos los pacien es con hepa i is “au oinmune” de no o
es aban en condiciones de incompa ibilidad pa a los alelos de la GSTT1 con su donan e y que
odos p esen aban an icue pos especí icos pa a es e an ígeno exp esado solo en el inje o,
empezamos a suge i la idea de que se a aba de un echazo y no de un p oceso au oinmune
de no o (Aguile a I, y col., 2001).
En la úl ima ac ualización de los c i e ios de Ban , as eunión de los expe os en Ba celona
en el año 2016, se conside a como un echazo mediado po an icue pos denominado “plasma
cell- ich ejec ion” basado en la incompa ibilidad GSTT1 con mención a los an icue pos an i-
GSTT1 pe o sin conside a los aún equisi o imp escindible has a que o os g upos lo aliden
(Deme is AJ y col., 2016).
A pesa de que GSTT1 se a a de una p o eína ci oplasmá ica, hemos podido demos a que
puede localiza se en la memb ana celula . Aunque únicamen e el 0,2% del o al de células
es udiadas p esen a on doble ma caje GSTT1/ma cado de memb ana, no hay que ol ida que
es ás células se encon aban en unas condiciones isiológicas óp imas.
Desde nues o pun o de is a, un ambien e de al o es és oxida i o p o oca ía en las células
hepá icas mayo i a ias, los hepa oci os, un aumen o en la exp esión de las enzimas
de oxi icado as, en e ellas GSTT1. De es a o ma un mayo núme o de células hepá icas
p esen a á la p o eína a ni el de la memb ana celula , pe mi iendo su econocimien o po
pa e de los an icue pos an i-GSTT1 especí icos, los cuáles a a és de mecanismos como la
ac i ación del sis ema del complemen o, p o oca án daño isula con el consiguien e echazo
del inje o.
Dada la eno me ele ancia que han adqui ido los an icue pos an i-GSTT1 en nues a pa ología,
decidimos es udia las dis in as subclases de IgG de es os an icue pos p esen es en el sue o de
los pacien es. Encon amos que las subclases IgG1 e IgG4 ue on las únicas subclases
ep esen a i as en odos los pacien es, independien emen e de que hubiesen desa ollado la
pa ología (Aguile a I y col., 2016).
El hecho de habe encon ado ni eles ele ados de an icue pos an i-GSTT1 especí icos de la
subclase IgG4 en la mayo ía de los pacien es de es udio esul a muy llama i o, ya que a pesa
de se un an icue po desc i o como no ijado de complemen o, es á subclase es á elacionada
con di e sas pa ologías, especialmen e de na u aleza au oinmune, como po ejemplo la
101
panc ea i is au oinmune ipo 1 (Deshpande V y col., 2011; Okazaki K y col., 2011). Po an o, no
es á cla o el papel que juega es á subclase de an icue po en nues a pa ología de es udio.
Sin emba go, el papel de la alo- eac i idad humo al en el asplan e hepá ico aún no es á
escla ecido. Desde los inicios del asplan e hepá ico, el hígado ha sido conside ado como un
ó gano inmunológicamen e p i ilegiado con esis encia ela i a al echazo (Calne RY, Binns
RM, Milla d PR y col., 1967).
La capacidad ole ogénica del hígado no solo se limi a a la alo-inmunidad celula , sino que
ambién pa ece ex ende se a la in lamación mediada po an icue pos. Se han p opues o a ios
mecanismos esponsables de con e i es as p opiedades ole ogénicas al hígado. Es p obable
que múl iples ías ac úen coo dinadamen e pa a e i a el echazo del inje o (Cheng EY y
Te asaki PI, 2015). En e los mecanismos que se pos ulan podemos menciona la posibilidad
del hígado de sec e a an ígenos HLA de clase I solubles (Da ies HFS, Polla d SG y Calne RY,
1989). Además, el hígado iene una eno me capacidad pa a abso be o neu aliza alo-
an icue pos di igidos con a an ígenos HLA (Gugenheim J, Amo osa L, Gigou M y col., 1990). La
in lamación mediada po alo-an icue pos puede ocu i en el inje o hepá ico, pa icula men e
en p esencia de an icue pos donan e-especí icos an i-HLA de clase II (Cheng EY, 2017).
Muy ecien emen e se ha desc i o un nue o an ígeno implicado en el echazo agudo del
inje o enal (S ee s y col, 2019). Se a a del gen LIMS1. La si uación a ni el gené ico es muy
simila a lo que ocu e con la GSTT1, donde el ecep o es po ado de alelos delecionados en
homocigosis y ecibe un ó gano de un donan e que iene al menos un alelo no mal. La
simili ud a más allá dado que se a a de una p o eína ci oplasmá ica, exp esada en las células
epi eliales de los úbulos enales. Po an o, la g an p egun a sin esol e en ambos casos sigue
siendo en qué momen o y bajo qué condiciones es as p o eínas quedan expues as en la
memb ana plasmá ica pa a que pueda se econocida y se desencadene el echazo mediado
po an icue pos. Cu iosamen e, los an icue pos an i-LIMS1 pe enecen a las subclases IgG2 e
IgG3, jus o lo con a io de lo que hemos desc i o pa a GSTT1.
Obje i o 2. De e mina la p esencia de lin oci os T alo-especí icos en e a la p o eína GSTT1
En nues a hipó esis plan eamos que la espues a celula T juega un papel muy impo an e en
el desa ollo de la pa ología y pos e io echazo del inje o. El echazo mediado po células T
apa ece ampliamen e desc i o en la bibliog a ía como po ejemplo en el asplan e enal
(Hallo an PF, 2010; Randhawa P, 2015; Balaha M y col., 2019).
Debemos menciona que la ecnología empleada en nues o abo daje expe imen al, a pesa
se ampliamen e u ilizada en mul i ud de abajos cien í icos (Mon i P y col., 2008; Giuliani L y
col., 2009; F eed BM y col., 2011) p esen a una eno me complejidad écnica. En nues o caso,
algunas de las combinaciones HLA clase II-pép ido no pudie on se sin e izadas como
e áme o.
A pesa de ello, as analiza los esul ados ob enidos podemos de e mina que an o
pacien es del g upo 1 (pacien es con la pa ología) como pacien es del g upo 3 (pacien es que
sólo mues an la condición de iesgo) p esen an eac i idad en clase I con el pen áme o A*01.

102
Es o concue da con nues a hipó esis, ya que los pacien es del g upo 3, al ca ece de
an icue pos an i-GSTT1, no disponen de lin oci os B alo-especí icos que ac úen como células
p esen ado as de an ígeno, a pesa de p esen a lin oci os T alo-especí icos. Po an o, hemos
conseguido demos a la p esencia de lin oci os T alo-especí icos en e a una secuencia
especí ica de la p o eína diana en combinación con una molécula MHC conc e a en células de
pacien es.
Obje i o 3. Dilucida el papel que desempeñan los lin oci os T especí icos de GSTT1 en el
echazo del inje o.
Las células T memo ia cons i uyen el mayo impedimen o pa a la supe i encia del asplan e
a la go plazo. Si las células T egulado as pueden o no con ola las con inúa siendo un enigma.
Hay nume osas e e encias en la li e a u a en las que se ealiza una de e minación de
ac i ación lin oci a ia en e a pép idos, ya sean i ales (Ke n F y col., 2000; Roque-Cuélla MC y
col., 2011), donde los iempos de incubación son más co os (6 ho as), o pép idos p oceden es
de p o eínas humanas (Kalache S y col., 2008; Ma Y y col., 2006), en los que se amplían
conside ablemen e esas incubaciones (48 ho as-una semana).
En el es udio de es imulación median e pép idos de GSTT1 se ap ecia que la ac i ación se
concen a p incipalmen e en los g upos 1 y 3. Al analiza los da os ob enidos, no se obse ó
ac i ación en ninguna de las u as clásicas mediadas po IFN-γ (Tc1 y Th1). Sin emba go, se
egis ó ac i idad ía IFN-γ en la subpoblación CD4-CD8- co espondien e a pacien es del g upo
1.
En cuan o a la libe ación de IL-4, se de ec ó ac i ación de la u a Tc2 en pacien es del g upo 1 y
del g upo 3. Además, an o la subpoblación CD4-CD8- de pacien es del g upo 1 y del g upo 3
como la subpoblación CD4+CD8+ de pacien es del g upo 1 mos a on ac i idad ía IL-4.
Respec o a la ci oquina IL-10, es e ma cado se egis ó en la subpoblación CD8+ de pacien es
del g upo 3. También se de ec ó en la subpoblación CD4+ de pacien es del g upo 3, en las
subpoblaciones CD4-CD8- de pacien es del g upo 1 y del g upo 2, así como en la subpoblación
CD4+CD8+ de pacien es del g upo 3. En un es udio ealizado po Villani y col., obse a on que la
subpoblación CD4-CD8- p esen aba un inc emen o de la exp esión de IL-10 al se es imulada
po el pa ási o T ypanosoma c uzi (en su o ma pa asi a ia humana de ipomas igo e) (Villani
FN y col., 2010) y en la subpoblación CD4+CD8+. Los abajos de Eljaa a i y col., apo an da os
simila es en un g upo de pacien es con en e medad inje o con a huésped. T as la
es imulación con una línea celula lin oblas oide inmo alizada po in ección del i us de
Eps ein-Ba , la subpoblación CD4+CD8+ p oduce mayo es ni eles de IL-10 (Eljaa a i A y col.,
2013).
Como hemos mencionado an e io men e, se egis ó ac i ación en la subpoblación CD4-CD8-
(DN). Se a a de un g upo celula muy in e esan e cuya p opo ción es á desc i o en la
li e a u a que no supe a el 5% de la población o al lin oci a ia, aunque noso os hemos
encon ado pacien es con p opo ciones supe io es a es e núme o que an de 5,2 a 14,1% del
o al.
103
El modo de acción de las células T DN y su con ibución a la ole ancia de mane a an ígeno-
especí ica ha sido es udiado en a ios escena ios, sob e odo en modelos mu inos de
en e medades au oinmunes como la diabe es. Las células DN pueden elimina no solo
lin oci os T especí icos sino ambién lin oci os B ac i ados p esen ado es del an ígeno a ín
(Zhang ZX y col., 2006). Se ha demos ado que la IL-10 limi a la expansión de DN
inmuno egulado as en a ones diabé icos, hecho que es á asociado a una mayo asa de
apop osis en es as células (Hillhouse EE y col., 2010).
Las células T DN exhiben un po encial inmuno egulado que es único y especí ico de an ígeno.
Es e papel se desc ibió po p ime a ez hace 30 años cuando (S obe S y col., 1989) clona on
DN de a ón y pos e io men e demos a on su ac i idad sup eso a en un cul i o mix o
lin oci a io. Ese mismo año, en piel humana, se iden i ica on es as células (G oh V y col., 1989).
Años más a de (Zhang ZX y col., 2000) ue on los p ime os en demos a la capacidad de DN
de p omo e ole ancia a inje os con incompa ibilidad MHC de o ma an ígeno-especí ica.
Pos e io men e, es e mismo g upo demos ó que las T egulado as DN sup imen de o ma
e icaz a las células T CD4+CD8+ e ec o as y las CD8+ memo ia, pe o son incapaces de sup imi
las CD4+ memo ia (Su Y y col., 2014). Desde en onces, se ha is o que la capacidad sup eso a
de las DN se ex iende a células NK (He KM y col., 2007; Su Y y col., 2012), lin oci os B (Zhang ZX
y col., 2006; Ma Y y col., 2008; Hillhouse EE y col., 2010; Fo d McIn y e MS y col., 2011) y
células dend í icas (Gao JF y col., 2011).
En el con ex o de en e medad de inje o con a huésped, se ha is o que los ni eles de células
CD4-CD8- CD45RO+ se co elacionan con más se e idad en EICH c ónica. Se documen a on
ni eles bajos en el momen o del diagnós ico de EICHc, momen o en el que los ni eles de BAFF
en sue o y las células B aumen a on. Es os esul ados apoyan la idea de que los lin oci os T DN
ienen el po encial de elimina lin oci os B, eje ciendo así una acción inmuno egulado a, de
o ma que si los ni eles se man ienen al os se pod ía p e eni el comienzo de EICHc (Hillhouse
EE y col., 2019).
Noso os hemos cuan i icado el núme o de células DN espec o al o al de células CD3+CD56-
de sang e pe i é ica en es os pacien es, aunque la mues a no co esponde al momen o del
diagnós ico sino a mues as ex aídas años después en pacien es que eciben no solo
inmunosup esión es anda izada sino que además, a aquellos diagnos icados con hepa i is
inmune de no o se les adminis a e apia adicional con consis e en es e oides. Incluso en es as
condiciones de inmunosup esión, obse amos ni eles más al os de DN en la mayo ía de
pacien es espec o a lo desc i o pa a la población sana. Además, algunas de es as células
an ígeno-especí icas se ac i an bajo es ímulo de la GSTT1 in i o po lo que cabe pensa que,
en condiciones isiológicas, es án eje ciendo su acción sup eso a en e a o as células
an ígeno-especí icas p esen es en los pacien es.
Las células DN p o ienen mayo i a iamen e de células CD4+. Es a nue a u a de di e enciación
desc i a po (Zhao X y col., 2016) es capaz de inclina la balanza hacia una espues a egulado a
en ez de una espues a des a o able. La combinación de sus ca ac e ís icas eno ípicas y su
p opiedad egulado a especi ica de an ígeno en e a di e en es ipos celula es, ha impulsado
a los in es igado es a examina el papel que pueden ene en a ios modelos de en e medad y
104
su po encial e apéu ico. Se ha es udiado en los ámbi os de ole ancia al inje o,
en e medades au oinmunes y EICH.
Dichas células ue on aisladas y ca ac e izadas en humanos en 2005 (Fishe K y col.) y se ha
is o que compa en muchas de las p opiedades de sus homólogas mu inas, incluyendo la
sec eción de IFN-γ y la adquisición del alo-an ígeno de las APCs del donan e, seguido de
econocimien o y mue e de células T CD8+ ac i adas, especí icas pa a el mismo alo-an ígeno.
La mayo pa e de los conocimien os sob e el papel de DN humanas en ole ancia en
asplan e p o iene de es udios con pacien es asplan ados de médula ósea en los que se
obse ó una co elación in e sa en e la ecuencia de DN ci culan es y la g a edad de EICH
(McI e Z y col., 2008).
Es as células pueden p esen a a ias unciones. Po un lado, pueden ac ua como célula
inmuno egulado a, lle ando a cabo la sup esión de lin oci os T an o CD4+ como CD8+ a
a és de los sis emas Fas/FasL o g anzima/pe o ina. Po o o lado, pueden p omo e la
espues a inmuni a ia libe ando ci oquinas p opias de los lin oci os T CD4+ colabo ado es
como po ejemplo: IL-17, IL-4, IFN-γ y TNF-α (D´Acquis o F y C omp on T, 2011; Hillhouse EE y
Lesage S, 2013; X Lu y col., 2016).
Po úl imo, a endiendo al análisis de ac i ación global espec o al ma cado memo ia CD45RO,
hemos de ec ado que den o de las dis in as poblaciones de es udio que se ac i an al
es imula con los pép idos de GSTT1 (CD8+, CD4+ y CD4-CD8-) exis e una subpoblación e ec o a
no memo ia (CD45RO-). Es a subpoblación pod ía co esponde a las denominadas células
Tem a (Células T e ec o as memo ia RA+), aunque hab ía pa a con i ma lo en u u os es udios,
incluyendo el ma cado RA. Es a subpoblación celula se encuen a en una e apa del ciclo de
di e enciación muy a anzada, po lo que exp esan ma cado es de senescencia. El e ec o de un
es ímulo an igénico p ologando en el iempo, como se ía la exposición al an ígeno GSTT1 en
pacien es asplan ados, p o oca la di e enciación hacia es e es adio celula , po ejemplo en
in ecciones c ónicas po ci omegalo i us. En e sus unciones des aca la libe ación de g andes
can idades de IFN-γ, como mecanismo de espues a ápida a e-in ecciones. Además, es ás
células p esen an un iempo de ida media muy co o, ya que su asa de ecambio es á
es ablecida en o no a 20 días (Macallan DC y col., 2004; Willinge T y col., 2005; Mahnke YD y
col., 2013; La bi A y Fulop T, 2014; Ve ma K y col., 2017; Tian Y y col., 2017; Ma in MD y
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Rock o d, IL, USA) we e added a 1:500 dilu ion
du ing 1 h a oom empe -a u e. Visualiza ion o he
immuno eac ion was comple ed wi h 3,30 -
diaminobenzidine (DAB) as he pe oxidase
ch omogenic subs a e. The slides we e hen
coun e s ained wi h hema oxylin and moun ed wi h
di-n-bu yl ph hala e in xylene (BHD Labo a o ies,
Poole, UK).
Resul s
Cha ac e is ics o he pa ien s
Eigh een pa ien s wi h he GSTT1 misma ch
(dono +/ ecipien -) we e selec ed due o hei
condi ion o GSTT1 an ibody p oduce s. Twel e o
hem had been diagnosed wi h de no o IH (pa ien s
1–12, Table 1) and six had been no (pa ien s 13–18,
Table 1). Ini ial immunosupp es-sion consis ed o
cyclospo ine A (Sandimmune o Neo al)—excep o
pa ien 17 ha had ac olimus ins ead— s e oids and
ei he aza hiop ine o mo e- il mycophenola e.
Biopsy indings we e impo an o diffe en ial
diagnosis o de no o IH, bu his o-logical signs we e
equen ly no dis inc i e enough and, in ou hospi al,
he ul ima e diagnosis elied on he assessmen o
GSTT1 dono / ecipien misma ch, de ec ion o
speci ic GSTT1 an ibodies, and a good esponse o
s e oid ea men . Mos o he 12 pa ien s wi h
GSTT1 an ibody-associa ed hepa i is (de no o IH)
we e diagnosed be ween he i s and he second yea
pos - ansplan ; mean 19.7 mon hs (8–35). Pa ien s 3,
6, and 10 ha e been excluded om his es ima e
because he eal ime o onse was no known due o
lack o medical
GSTT1 subclasses and de no o immune hepa i is
eco ds o a ailabili y o ea lie biopsy/se um
samples (Table 1).
IgG subclass cha ac e iza ion o
Glu a hione S- ans e ase T1 an ibodies
Dis ibu ion o he IgG-GSTT1 an ibody subclasses is
shown in Table 2. Fi y-six se um samples om 18
pa ien s we e e ospec i ely s udied. The
p edominan sub ypes we e IgG1-GSTT1 and IgG4-
GSTT1, al hough aces o o he subclasses we e also
ound. Appa en ly, he e we e no ob i-
ous diffe ences in he subclass epe oi e be ween he
g oup o pa ien s diagnosed wi h de no o IH and
hose ha did no de elop he disease. Se um IgG-
GSTT1 an ibody subclasses change o e ime and
e en ually disappea as i happened wi h
IgG1-GSTT1 in pa ien s 3, 6, and 7, o IgG4-GSTT1 in
pa ien s 1 and 2 (Table 2, Fig. 1). A hi d si ua-
ion was obse ed in which only one subclass could
be de ec ed in all he samples o he same pa ien ;
o ins ance, pa ien s 5 and 8 only had IgG1-GSTT1 o
pa ien s 14 and 15 wi h only IgG4-GSTT1 (Table 2,
Fig. 1). The ac ha pa ien s 12 and 14
(bo h emales) displayed high i e s o an ibodies in
hei p e- ansplan se um samples can be explained
by sensi izing e en s such as ans usions and
p egnancies (5).
IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 a io a diagnosis o de no o IH
Conside ing ha he i s symp oms o de no o IH
usually appea wi hin he i s 2 y a e he ansplan
and occasionally du ing he hi d yea bu ne e
beyond ha da e, we aimed o analyze
he IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 a io in se um samples
om close o he ime o diagnos ic
biopsies o a compa able ime poin s in he pa ien s
wi hou he disease. Those pa ien s whose ea ly pos -
ansplan se um samples we e no a ailable (3, 6, 10,
16, and 18) we e excluded
om he analysis. Se um IgG1-GSTT1 was highe
han IgG4-GSTT1 a he ime o diagnosis in 7 o 9
pa ien s (Fig. 2). When we looked a he a io
in he non-diagnosed g oup o pa ien s, we
obse ed ha se um IgG1-GSTT1 le el was ne e
highe han IgG4-GSTT1 in compa able ea ly pos -
ansplan samples (Fig. 2).
IgG4-exp essing plasma cells in li e biopsy
Immunohis ochemis y s udies we e pe o med in 10
a ailable biopsies, 5 o hem coinciding wi h de no o
IH diagnosis. Biopsies om pa ien s wi h de no o IH
showed signi ican ly highe numbe o IgG4-
exp essing plasma cells han hose wi hou
213

Aguile a e al.
A
B
Fig. 1. An i-GSTT1 ab le els o he IgG1
(A) and IgG4 (B) subclasses in se um
samples o 18 pa ien s included in his
s udy: 1–12 wi h de no o IH and 13–18
wi hou de no o IH. Samples o he same
pa ien ha e been p ocessed oge he in
he same ELISA assay so ha changes in
ab- i e s can be compa ed. P esence bu
no i e o an i-GSTT1 ab is impo an
o diagnosis.
A B
Fig. 2. (A) An i-GSTT1 IgG subclass p o ile a he ime o diagnosis in nine pa ien s wi h de no o IH and simila ime poin samples in
pa ien s who did no de elop he disease. (B) Pe cen ages o IgG1 and IgG4 a e shown. In gene al, he pa ien s wi h de no o IH ha e IgG1
as he majo subclass wi h he excep ion o pa ien s 7 and 12 whe eas among he non-diagnosed pa ien s, IgG4 is he mos abundan
subclass. No e ha pa ien s 3, 6, 10, 16 and 18 a e no included in his g aphic due o he ac ha de no o IH is diagnosed wi hin he i s 3
y and he i s samples om hese pa ien s we e ob ained la e han 4.5 y pos - ansplan .
he disease (mean 28.52 s. 5.55 cells/hp ), al hough
he e was one IgG4 nega i e biopsy and one wi h
e y low numbe o IgG4 + cells/hp among he
pa ien s wi h he disease (pa ien s 5 and 8,
espec i ely). This esul is consis en wi h he
absence o IgG4-GSTT1 in se um samples ex ac ed
a ound he same ime (Table 2).
Rep esen a i e immunos aining o biopsies
om 4 pa ien s wi h de no o IH is shown
in Fig. 3. Two o hem a e diagnos ic biopsies
(pa ien s 1 and 12), a hi d one was ob ained 5 mon hs
p io o de no o IH and was in o med as ch onic
hepa i is (pa ien 7) and he las one co esponds o an
acu e ejec ion episode, 11 mon hs be o e de no o IH
diagnosis (pa ien 9). The esul s show diffe en
deg ees o IgG4-posi i e cells, which a e de ailed in
Table 1. The mean alues a y om 1.6 o 142.5
IgG4 + cells/ hp in he po al a eas. Two addi ional
biopsies om pa ien s wi h he GSTT1 misma ch and
214
GSTT1 subclasses and de no o immune hepa i is
Fig. 3. On he le pa o he igu e IgG4-
posi i e plasma cells in po al a eas o
li e biopsies in pa ien s wi h de no o IH:
P1 and P12 a e diagnos ic biopsies; P7
was in o med as ch onic hepa i is 5
mon hs p io o de no o IH diagnosis; P9
co esponds o an acu e ejec ion episode
10 mon hs a e he ansplan and 11
mon hs be o e de no o IH. On he igh
pa o he igu e, he same biopsies
s ained wi h CD138. In P12 he
memb ane o he hepa ocy es (CD138 is
also exp essed in no mal hepa ocy es) is
also s ained. In all he cases CD138+
plasma cells we e abundan in he po al
a eas.
GSTT1 an ibodies bu wi h a diagnosis o ch onic
ejec ion we e also es ed. Pa ien s 15 and 17 had
mean alues o 8.3 and 2.8 IgG4 + cells/hp in he
po al a eas (no shown). Immunologic s aining o
plasma cells wi h CD138 showed massi e plasma
cell in il a ion in all he biopsies analyzed excep
one.
Discussion
In he p esen s udy, we ha e analyzed he possible
ole o he IgG subclasses among speci ic GSTT1
an ibodies in de no o IH. To cla i y his issue, a
g oup o 18 pa ien s was s udied, 12 wi h a
diagnosis o de no o IH and 6 ha did no de elop
he disease. We ound ha IgG1-GSTT1 and IgG4-
GSTT1 we e basically he only subclasses ep-
esen ed in all he pa ien s, ega dless o de no o
IH s a us, while he o he subclasses we e p ac i-cally
absen . Con a y o ou expec a ions, he e we e no
ob ious diffe ences in he subclass epe - oi e
be ween de no o IH and non-de no o IH pa ien s, bu
he e was one dispa i y in he p opo -
ion o IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 a he ime o diag-
nosis wi h highe le els o IgG1 in se en o he
pa ien s diagnosed wi h de no o IH as opposed o
none in he non-diagnosed pa ien s. A simila si u-
a ion has been al eady desc ibed in pa ien s wi h
215
Aguile a e al.
an i hy oid pe oxidase (TPO) an ibodies ha
de eloped ch onic hy oidi is o hypo hy oidism,
bo h wi h highe le els o an i-TPO IgG1 (6, 7). IgG1
a e complemen ixing an ibodies, and i was no
su p ising hei possible in ol emen in a
pa hological p ocess. Howe e , he inding o IgG4-
GSTT1 an ibodies highly ep esen ed in mos o he
pa ien s was comple ely unexpec ed and gene a ed
many ques ions abou hei ole as dono -speci ic
an ibodies.
These esul s led us o in es iga e a possible ela-
ionship wi h IgG4- ela ed diseases. E en hough
IgG4-GSTT1 a e alloan ibodies, de no o IH has many
pheno ypic simila i ies wi h an au oimmune
p ocess and, in gene al e ms, IgG4- ela ed dis-eases
a e conside ed au oimmune diseases. I was emp ing
o analyze simila i ies wi h o he s udies al hough he
majo i y o hem belong in o he ield o
au oimmuni y and much less is known in he con ex
o ansplan a ion. IgG4- ela ed disease is a sys emic
in lamma o y p ocess cha ac e ized by a dense
lymphoplasmacy ic in il a e wi h p esence o IgG4-
bea ing plasma cells, s o i o m ib osis, and equen
ele a ion o se um IgG4 le els. Two ypes o wha
was o iginally de ined as “au oim-mune panc ea i is”
ha e now been ecognized as wo diffe en en i ies,
being ype 1 a p o o ypical mani es a ion o IgG4-
ela ed disease (8, 9). IgG4 iso ype is p esen in
heal hy human se um in 3–5% o he o al IgG
amoun , does no ix complemen , and is able o c oss
he placen al ba ie (10).
Al hough IgG4 has been conside ed du ing he pas
15 y a benign an ibody wi h an an i-in lamma- o y
ole, his concep has been ca e ully e iewed and a
la ge numbe o IgG4- ela ed diseases ha e been
epo ed in he li e a u e (11, 12). In ac , he e was a
symposium held in Bos on whe e in e na ional
expe s se up a consensus guideline o he diagnosis
o IgG4- ela ed diseases (13). In gene al, mos o he
publica ions e e o IgG4 as se um o issue
immunoglobulins wi h unknown an igen speci ici y,
bu he e a e o he epo s whe e an igen-speci ic
IgG4 a e desc ibed. In a pionee epo abou ende-
mic pemphigus oliaceus, deposi ion o IgG4 on skin
lesions was obse ed and passi e ans e o IgG4
agains cell adhesion desmoglein om he pa ien s o
mice igge ed he disease (14). ADAMTS13 (a
disin eg in-like and me allop o ease wi h h om-
bospondin ype 1 mo i ) an ibodies a e in ol ed in
h ombocy openic pu pu a, wi h IgG4 ollowed by
IgG1 subclasses leading he immune esponse (15).
Pe haps, he mos impo an e idence comes om a
diso de called myas henia g a is, in which 15% o
he pa ien s ha e an i-MuSK (muscle-speci ic kinase)
an ibodies mos ly o he IgG4 subclass. Expe imen s
in mice ha e e ealed ha MuSK IgG4
induce se e e muscle weakness in he mice upon pas-
si e ans e o IgG4 bu no IgG1-3 an ibodies (16).
In pa ien s wi h MuSK, myas henia g a is subclass
swi ch om IgG4 o IgG1 was obse ed in a pa ien
going in o clinical emission (17).
In he ansplan se ing, e y li le is known abou
he ole o IgG4-speci ic an ibodies. In kid-ney
ansplan a ion, a ecen s udy has shown ha an i-
endo helial cell an ibodies o he IgG2 and IgG4
subclasses we e en iched in pa ien s wi h kid-ney
ejec ion (18). Rega ding li e ansplan a ion, wo
epo s ha e linked de no o AIH o se um IgG4 (19)
and IgG4-posi i e cells in a subg oup o pa ien s wi h
a mo e agg essi e o m o PCH (20). The au ho s
sugges ed ha IgG4-posi i e PCH p obably
ep esen s a diso de dis inc om IgG4-nega i e
PCH. We ha e a simila dicho omy in ou g oup o
GSTT1-associa ed de no o IH, in which he majo i y
o pa ien s a e posi i e o
IgG4-GSTT1, bu wo pa ien s only display IgG1-
GSTT1. The possibili y ha p esence/absence
o IgG4-GSTT1 an ibodies migh designa e a clinical
subg oup is in iguing, bu we ha e no obse ed
clea diffe ences in disease se e i y o in pa ien s’
ou come. P olonged exposu e o an an igen is one o
he causes leading o a pe sis en IgG4- es ic ed
esponse. In his sense, he GSTT1 p o ein is con-
s i u i ely exp essed in he dono li e and will
always be ecognized as o eign by he ecipien ’s
immunological machine y. In ac , he ea men o
de no o IH has o be main ained h oughou li e. This
is o ou knowledge he i s desc ip ion o an igen-
speci ic IgG4 alloan ibodies in li e ansplan a ion,
bu he mechanisms leading o de no o IH a e s ill
un esol ed. We ha e ound ha IgG1 has a s ong
p esence among GSTT1 an i-bodies and migh ha e a
ole in he ini ia ion o he immune esponse. The
inding o excep ionally high le els o IgG4 agains a
dono -speci ic an igen as he GSTT1 was comple ely
unexpec ed and is e y in iguing, bu hei possible
ole in de no o IH emains unknown.
Acknowledgemen s
This s udy was suppo ed by he Spanish Minis y o Econ-
omy, Ins i u o de Salud Ca los III, g an s 10/2332 and 11/ 857,
and he Andalusian go e nmen , g an s 07-CTS-02886 and PI-
0332-2007 om which MJ Ma inez was a p edoc- o al ellow.
I Aguile a is a esea che om he Nicolas Mona des p og am.
Au ho s’ con ibu ions
Isabel Aguile a designed he s udy, analyzed he da a, and
w o e he manusc ip . Ma ıa Jose Ma ınez-B a o and An onio
Jesus Pozo-Bo ego pe o med he expe imen s and analyzed
he da a. Jose Manuel Sousa p o ided
216
samples, clinical eco ds, and analyzed he da a. An onio
Nunez~-Roldan ob ained unding and con ibu ed o w i e he
manusc ip .
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