Implicación del sistema GSTT1 en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo

“Implicación del sistema GSTT1 en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo” TESIS DOCTORAL ANTONIO JESÚS POZO BORREGO Sevilla, 2019 D. ANTONIO NÚÑEZ ROLDÁN, CATEDRÁTICO DE LA UNIVERSIDAD DE SEVILLA Y JEFE DEL SERVICIO DE INMUNOLOGÍA DEL HOSPITAL UNIVERSITARIO VIRGEN DEL ROCÍO CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título: “Implicación del sistema GSTT1 entre donante y receptor en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo”, ha sido realizado bajo su dirección por el licenciado D. ANTONIO JESÚS POZO BORREGO, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expide la presente certificación en Sevilla, a 22 de octubre de 2019. Fdo.: Dr. Antonio Núñez Roldán DIRECTOR DE LA TESIS TUTOR DE LA TESIS Dª ISABEL AGUILERA GARCÍA, DOCTORA EN BIOLOGÍA E INVESTIGADORA DEL INSTITUTO DE BIOMEDICINA DE SEVILLA CERTIFICA: Que el trabajo de investigación que lleva por título: “Implicación del sistema GSTT1 entre donante y receptor en la patogénesis de la hepatitis inmune de novo”, ha sido realizado bajo su dirección por el licenciado D. ANTONIO JESÚS POZO BORREGO, y reúne las condiciones necesarias para ser leído y defendido como tesis para optar al título de Doctor por la Universidad de Sevilla. Para que conste a los efectos oportunos, expide la presente certificación en Sevilla, a 22 de octubre de 2019. Fdo.: Dra. Isabel Aguilera García DIRECTORA DE LA TESIS FINANCIACIÓN ______________________________________________________________________ El doctorando durante el transcurso de la presente tesis doctoral ha sido beneficiario de una beca PIF (Personal Investigador en Formación) del V plan propio de la US. Abreviaturas alo-TPH: Trasplante de progenitores hematopoyéticos alogénico APC: Célula presentadora de antígenos CD107a: Proteína de membrana asociada a lisosomas 1 dNTPS: nucleótidos DMSO: Dimetilsulfóxido DN: Linfocitos T dobles negativos (CD4-CD8-) EICH: Enfermedad injerto contra huésped EICHc: Enfermedad injerto contra huésped crónica ELISA: Enzimoinmunoanálisis de adsorción GSTT1: Glutatión S-transferasa T1 HIdn: Hepatitis inmune de novo HLA: Antígeno leucocitario humano HUVR: Hospital Universitario Virgen del Rocío IC50: Concentración inhibitoria máxima media Ig: Inmunoglobulina IFN: Interferón IL: Interleukina mHags: Sistemas menores de histocompatibilidad MHC: Complejo mayor de histocompatibilidad pb: Pares de bases PBMC: Células mononucleares de sangre periférica PCR: Reacción en cadena de la polimerasa SFB: Suero fetal bovino SNP: Polimorfismo de un solo nucleótido TTO: Tratamiento Tx: Trasplante 16 3.1.7. Análisis activación CD107a .............................................................................................. 90 3.1.8. Conclusión ....................................................................................................................... 90 3.2. Análisis global resultados hepatitis inmune de novo .............................................................. 90 3.2.1. Jerarquía .......................................................................................................................... 90 3.2.2. Análisis poblacional CD4-CD8- ......................................................................................... 91 3.2.3. Análisis de activación global ........................................................................................... 92 3.2.4. Población CD8+ ................................................................................................................ 92 3.2.5. Población CD4+ ................................................................................................................ 93 3.2.6. Población CD4-CD8- ......................................................................................................... 94 3.2.7. Consideraciones finales................................................................................................... 95 DISCUSIÓN ............................................................................................................................................. 98 CONCLUSIONES ..................................................................................................................................... 106 BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................................ 110 ANEXO ................................................................................................................................................... 123 IgG subclass profile among anti-Glutathione S-transferase T1 antibodies in post-transplant de novo immune hepatitis ......................................................................................................................... 125 INTRODUCCIÓN ______________________________________________________________________ 20 Introducción 1. Historia del trasplante hepático Aunque bastante menos mitificado que el corazón, el hígado es sin embargo el órgano noble por excelencia. Además, el hígado es como órgano, tremendamente más complejo que el corazón o el riñón. Su trasplante, mucho más trabajoso y complicado, además de por supuesto tan vital como el cardiaco, si bien con bastante menos literatura que éste. Es el trasplante que requiere un equipo multidisciplinario más numeroso y mejor conjuntado. La historia del trasplante hepático va indisolublemente ligada a la de un cirujano norteamericano nacido en Iowa: Thomas Starzl. Verdadero antecesor de los “Transplant Surgeons”, que fundamentalmente en el mundo anglosajón constituyen hoy una verdadera especialidad, fue uno de los primeros cirujanos en hacer trasplantes renales al inicio de los sesenta. Preparó una técnica experimental de trasplantes en animales que validó hasta la saciedad y el 1 de Marzo de 1963, casi cinco años antes de que Barnard se atreviera con el corazón, llevó a cabo el primer trasplante de hígado en el Veteran’s Hospital de Denver, Colorado. El receptor sería un niño de 3 años afecto de una estrechez congénita de las vías biliares que acaba produciendo la destrucción del hígado (atresia biliar), al que implanta el órgano de otro niño fallecido como consecuencia de un tumor cerebral. Como el mismo Starzl describiera gráficamente, la intervención comenzó en un clima de confianza que sin embargo acabó en tragedia. El niño muere a las cinco horas de acabar el trasplante. Dos meses después, el 5 de Mayo realiza el segundo en un hombre de 48 años con un cáncer de hígado, que recibe en este caso el órgano de un paciente de 55 años con un tumor cerebral. El paciente vive 22 días, pero muere por una embolia pulmonar con un hígado normal. Entre 1963 y 1967, en Francia (Demirleau en Noviembre de 1963), Inglaterra (Roy Calne) y los Estados Unidos se hicieron varias decenas de trasplantes hepáticos con resultados diversos, pero ninguno alcanzó el año de supervivencia. La historia del trasplante de hígado está plagada de numerosos intentos en todo el mundo durante los sesenta y los setenta, pero con unos resultados muy pobres, que en las mejores manos apenas supone una supervivencia al año de un 30% de los pacientes. No es hasta 1967 cuando tiene lugar el primer trasplante con supervivencia prolongada realizado en la Universidad de Colorado a una niña de un año y medio de edad. Los trabajos realizados por Starzl a partir de este momento, así como los de Calne y Williams permitieron que la mejoría de resultados fuera tal que lo que se consideraba un tratamiento experimental, pasara a ser una alternativa terapéutica. Hay que esperar a los ochenta para que las mejoras de todo tipo: quirúrgicas, de anestesia, de manejo de la coagulación, pero sobre todo de inmunosupresión con el descubrimiento de la ciclosporina en 1980 lleven a una verdadera explosión de la técnica. Una conferencia de consenso celebrada bajo los auspicios de los NIH norteamericanos en Bethesda (Maryland) en Junio de 1983 supone la declaración del trasplante hepático como de utilidad terapéutica 21 demostrada y su verdadera difusión por todo el mundo. La supervivencia al año pasa del 30% al 70% y sigue mejorando en las siguientes décadas. En España fueron los doctores Carles Margarit y Eduardo Jaurrieta en el hospital de Bellvitge de l’Hospitalet, Barcelona, en 1984 quienes hicieron con éxito la primera operación. Hoy se efectúa en 24 hospitales de todo el estado y son más de mil los enfermos que anualmente reciben un trasplante hepático en nuestro país, con diferencia el que más realiza del mundo en relación a su población. 2. Antecedentes de la hepatitis inmune de novo La hepatitis inmune de novo es una patología descrita inicialmente en trasplante pediátrico a finales de los años 90 como una disfunción tardía del injerto asociada a una serie de características serológicas e histológicas compatibles con una hepatitis autoinmune, a pesar de que los pacientes no habían desarrollado hepatitis autoinmune antes del trasplante. Entre las características descritas inicialmente podemos mencionar: elevación de enzimas hepáticas (aminotransferasas), existencia de autoanticuerpos, elevada concentración de IgG en suero y presencia de un denso infiltrado linfocitario en la zona portal (Kerkar N y col., 1998). Más tarde fue descrita en adultos por diversos grupos (Jones DE y col., 1999; Heneghan MA y col., 2001). En sus estudios iniciales, el grupo del Hospital Gregorio Marañón describió la presencia de un anticuerpo atípico, con un patrón de inmunofluorescencia indirecta que recordaba a los anticuerpos antimicrosomales de hígado/riñon de tipo 1 (anti-LKM1) y por tanto los denominaron anticuerpos anti LKM atípicos (Hernández-Albújar A, Salcedo M y col., 1997; Salcedo M y col., 2002). En el año 2001, nuestro grupo identificó la diana antigénica de los anticuerpos anteriormente citados. Se trataba de una enzima metabolizadora de fármacos, de fase II, implicada en la protección frente a compuestos tóxicos, denominada Glutatión S Transferasa Theta 1 (GSTT1). De tal forma que los anticuerpos anti-LKM1 atípicos pasaron a denominarse anti-GSTT1 (Aguilera I y col., 2001). Posteriormente en 2004 estudiamos una gran cohorte de pacientes trasplantados de hígado en el Hospital Virgen del Rocío y confirmamos que esta patología ocurre cuando los donantes tienen una o dos copias del alelo positivo para GSTT1 y los receptores carecen de este gen, lo que se denomina alelo nulo, y que esta incompatibilidad genética es requerida para que se desarrolle hepatitis inmune de novo, siempre precedida por la producción de anticuerpos antiGSTT1 (Aguilera I y col., 2004). Estos resultados fueron confirmados varios años más tarde por el grupo del Hospital Rodríguez Marañón (Rodríguez-Mahou M y col., 2007). En el año 2011 vinculamos por primera vez la inmunopositividad de C4d en biopsias hepáticas con alo-reactividad donante-específica no relacionada con anticuerpos anti-HLA DSA ni con incompatibilidad ABO (Aguilera I y col., 2011). Cabe destacar la importancia que adquiere la terapia inmunosupresora inicial administrada a los pacientes. La terapia combinada de tacrolimus con micofenolato mofetilo presenta un 22 efector protector en comparación con la terapia combinada de ciclosporina junto con micofenolato mofetilo. Este efecto protector reduce la probabilidad de producir anticuerpos y por tanto evita la progresión de la patología (Aguilera I y col., 2011). 3. Complejo principal de histocompatibilidad (HLA) Los linfocitos T sólo pueden reconocer antígenos presentados por células presentadoras de antígenos especializadas (APC, del acrónimo inglés Antigen Presenting Cells). La tarea de presentar antígenos corre a cargo de proteínas específicas que son codificadas por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC, del acrónimo inglés Major Hiscompatibility Complex). Esta especificidad de los linfocitos T contrasta con la de los linfocitos B y sus productos secretados, los anticuerpos, que pueden reconocer antígenos tanto solubles como asociados a células. En un principio el sistema MHC humano (HLA, del acrónimo inglés Human Leukocyte Antigen) fue descubierto como un locus extendido con un alto contenido de genes sumamente polimórficos. Ahora sabemos que las funciones fisiológicas de las moléculas del sistema HLA es la presentación de péptidos a los linfocitos T. De hecho, sus receptores de membrana o TCR (del acrónimo inglés T-Cell receptor), en realidad son específicos frente a complejos formados por péptidos de antígenos extraños y moléculas HLA propias. La información genética para la codificación de las moléculas HLA se encuentra en el brazo corto del cromosoma 6 (6p21.31-6p21.32) con un alto contenido de genes que están en desequilibrio de ligamiento (Imagen 1). Su expresión se realiza de forma codominante, es decir, cada persona expresa los alelos del HLA heredados de ambos padres. Esta característica hace posible que se eleve al máximo el número de moléculas HLA disponibles para ejercer su función fisiológica. Es importante destacar que las moléculas HLA de un individuo no discriminan entre los péptidos extraños, es decir, los derivados de antígenos microbianos, y los derivados del propio sujeto (antígenos propios). Existen dos tipos principales de productos génicos del MHC, las moléculas de clase I y las de clase II, con estructuras distintas pero homólogas. Las moléculas del MHC de clase I presentan péptidos y son reconocidos por los linfocitos T CD8+, mientras que las moléculas MHC de clase II presentan péptidos a los linfocitos T CD4+. 23 Imagen 1. Distribución de los genes HLA en el brazo corto del cromosoma 6. Tomada de Inmunología celular y molecular. 8ª Edición. Abul K. Abbas, Andrew Lichtman y Shiv Pillai. Editorial Elsevier Saunders. La región de clase I codifica a los genes de la cadena pesada de las moléculas clásicas de clase I (A, B y Cw) así como de los genes no clásicos como HLA-E, F, G, MICA y MICB. La molécula HLA de clase I totalmente ensamblada es un heterodímero que consta de una cadena α, una β2microglobulina y un péptido antigénico unido (Imagen 2). La expresión estable de las moléculas de clase I sobre la superficie celular requiere la presencia de los tres componentes. Los péptidos presentados por este tipo de moléculas tienen una longitud media de unos 9 aminoácidos (aa).Todos los individuos heterocigotos expresan seis moléculas HLA de clase I diferentes y se presentan de forma constitutiva en todas las células nucleadas del organismo. 24 Imagen 2. Estructura de una molécula MHC de clase I. Tomada de Inmunología celular y molecular. 8ª Edición. Abul K. Abbas, Andrew Lichtman y Shiv Pillai. Editorial Elsevier Saunders. Por otro lado, la región de clase II contiene los genes que codifican las moléculas α y β de los tres tipos clásicos de moléculas HLA de clase II (DQ, DR y DP). La molécula HLA de clase II totalmente ensamblada es un heterodímero que consta de una cadena α, una cadena β y un péptido antigénico unido (Imagen 3). Al igual que ocurría con las moléculas HLA de clase I, la expresión estable de las moléculas de clase II sobre la superficie celular requiere la presencia de los tres componentes del heterodímero. Los péptidos presentados por este tipo de moléculas tienen una longitud media de 12 a 14 aa. 25 Imagen 3. Estructura de una molécula MHC de clase II. Tomada de Inmunología celular y molecular. 8ª Edición. Abul K. Abbas, Andrew Lichtman y Shiv Pillai. Editorial Elsevier Saunders. Estas moléculas HLA de clase II sólo se expresan en las APC, como los macrófagos, linfocitos B y células dendríticas. La presentación de péptidos mediante HLA clase II a los linfocitos T CD4+ vírgenes, va a activarlos y éstos contribuirán a la maduración de otros tipos celulares, como los linfocitos B, desencadenando la conocida como respuesta humoral (Inmunología celular y molecular, 8ª Edición. Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman y Shiv Pillai. Editorial Elsevier Saunders). Al contrario del origen endógeno de los péptidos unidos a moléculas de clase I, los fragmentos antigénicos unidos a moléculas de clase II derivan de antígenos de origen exógeno. En este último caso, las moléculas extracelulares son internalizadas por endocitosis. Los endosomas se fusionan con lisosomas y su contenido es digerido parcialmente. Los fragmentos resultantes se unen a las moléculas de clase II y retornan a la superficie celular donde serán presentados. Por el contrario, los péptidos presentados por las moléculas HLA de clase I son los fragmentos resultantes de la degradación proteínica llevada a cabo por el proteasoma. No obstante, y debido a la importancia que tiene esta característica en la maduración y posterior activación de los linfocitos CD4+ y CD8+, el procesamiento del antígeno se explicará con detalle en el siguiente apartado. 32 Actualmente, se recomienda usar la terminología NK-like T cells. En general, se necesitaría hacer una caracterización fenotípica y funcional mucho más profunda para llegar a entender el mecanismo de adaptación de estas células a procesos tan importantes como envejecimiento, autoinmunidad, inflamación y respuesta a antígenos virales o tumorales. Un aumento en la expresión de marcadores de NK en linfocitos CD8+ se ha asociado con imunosenescencia y con activación crónica del sistema inmune (Tarazona R y col., 2000). 6. Antecedentes de la teoría humoral del trasplante Desde la década de los 50 del pasado siglo XX, se plantea una de las cuestiones más controvertidas en el mundo del trasplante: ¿Los rechazos de los injertos son producidos por células o por anticuerpos? Bien es cierto, que los anticuerpos son producidos por células, por lo que en este sentido sería correcto decir que todos los rechazos son celulares. Pero la principal diferencia entre la teoría celular y humoral es si el daño al injerto se genera principalmente por la acción de los anticuerpos o por el efecto directo que ejercen los linfocitos T CD8+ citotóxicos, entre otros tipos celulares (Terasaki PI, 2003). Durante más de 40 años, fue ampliamente aceptada como correcta la teoría celular que propuso Sir Peter Medawar, hasta el punto de que fue considerada casi un dogma de la inmunología del trasplante. No obstante, Gorer fue el primero en mostrar en modelos animales, que ratones trasplantados podían llegar a producir anticuerpos dirigidos frente a antígenos del locus H-2 de histocompatibilidad cuando existían incompatibilidades entre donante y receptor (Gorer PA, 1956). Gracias a estos estudios, se llevó a cabo un esfuerzo internacional de colaboración en el que se pretendía encontrar anticuerpos dirigidos frente a los antígenos del sistema HLA humano. El papel que pueden llegar a alcanzar estos anticuerpos en la disfunción del injerto quedó patente en los trasplantes renales en los que el receptor tenía ya anticuerpos preformados frente al HLA del injerto, despertando el conocido como rechazo hiperagudo (Patel R y Terasaki PI, 1969; Terasaki PI y Cai J, 2005). Posteriormente se ha observado el papel que juegan estos anticuerpos en otro tipo de trasplantes, tales como el de pulmón (Frost AE y col., 1996; Scornik JV y col., 1999) y corazón (Higuchi ML y col., 1989). Por otro lado, un gran número de publicaciones han confirmado la asociación existente entre la presencia de depósitos de C4d en biopsias de riñón, como marcador de rechazo humoral en situaciones de rechazo mediado por anticuerpos (Feutch HE y col., 1998; Crespo M y col., 2001; Watschinger B y Pascual M, 2002). 33 7. Sistemas menores de histocompatibilidad En el trasplante de progenitores hematopoyéticos (TPH) HLA-idéntico, se pueden dar situaciones en las que exista disparidad genética en proteínas polimórficas entre donante y receptor capaces de despertar una respuesta inmunitaria que puede desencadenar una enfermedad injerto contra huésped (EICH), ya sea aguda o crónica. Estas proteínas se denominan antígenos menores de histocompatibilidad (mHags) (Simpson E, y col., 2002). Los mHags se han identificado tradicionalmente como péptidos discretos que son reconocidos por las células T del donante tras el alo-TPH (Trasplante de progenitores hematopoyético alogénico). Estos péptidos podrán ser presentados tanto por HLA de clase I como de clase II observándose respuesta tanto en los linfocitos T CD4+ como CD8+. La existencia de estos mHags se debe a que existen variaciones individuales en la secuencia del ADN, estimadas en un 0,1% en el genoma humano, que pueden provocar que entre donantes y receptores HLA idénticos, haya un gran número de genes codificantes en los que difieran. Estas variaciones de la secuencia de ADN, conocidas como polimorfismos genéticos, pueden tener o no consecuencias biológicas selectivas y deben detectarse en al menos el 1% de los individuos de una población. En la práctica, para que un locus sea considerado polimórfico, el alelo más común de dicho locus debe tener una frecuencia poblacional menor del 99% y, de acuerdo con la ley de Hardy-Weinberg, al menos un 2% de la población debe ser heterocigota para ese locus. Estos caracteres suelen ser estables y se transmiten por herencia mendeliana simple y constituyen una expresión de la diversidad genética entre individuos de la misma especie. Las primeras variaciones genéticamente determinadas se hallaron en proteínas de los eritrocitos, denominados por ello antígenos de grupos sanguíneos. Los polimorfismos pueden ir desde la modificación de una sola base (SNP, single nucleotide polymorphism), hasta cambios en número y/o tamaño en la unidad de repetición, siendo la más común en el alo-TPH la deleción de la secuencia codificante para una proteína. Como ejemplo de mHags cuyo polimorfismo se debe a un SNP, se han descrito en la literatura las proteínas HA-1, HA-2, HA-3 y HA-8. Todas ellas están codificadas por genes autosómicos con polimorfismos de un solo nucleótido que son reconocidos por las células del donante en el organismo huésped tras el alo-TPH (den Hann JM y col., 1995; Brickner AG y col., 2001; Spierings E y col., 2003; den Haan JM y col., 1998). Cada SNP es capaz de generar un antígeno lo suficientemente inmunogénico como para conseguir que los linfocitos T del donante lo reconozcan en las células del receptor cuya consecuencia clínica sería la aparición de EICH. Otro ejemplo de mHags son los derivados de proteínas del cromosoma Y. Estas proteínas son diferentes en ciertos aminoácidos dependiendo de si son codificadas por el cromosoma Y o por el cromosoma X, cuyos productos génicos muestran una identidad entre el 91 y el 99%. Pues bien, estos antígenos son capaces de despertar una respuesta tipo T en las células de los donantes dirigida contra las células del receptor cuando hay una incompatibilidad sexual entre ambos (D mujer / R varón), incrementándose el riesgo de padecer EICH si se compara con otras combinaciones sexuales de donante-receptor (Kollman C y col., 2001). Algunos ejemplos de proteínas ligadas al cromosoma Y capaces de despertar la respuesta inmune celular en este contexto de alo-TPH son DBY (Dead-box 3, Y-linked), UTY (Ubiquitously transcribed tetratricopeptide repeat gene on Y chromosome), ZFY (Zinc Finger Protein, Y-linked), RPS4Y 34 (Ribosomal Protein S4, Y-linked) y EIF1AY (Eukaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked) (Wang W y col., 1995; Vogt MH y col., 2002; Skaletsky H y col., 2003; Randolph SS y col., 2004). No obstante, también se ha descrito una respuesta humoral ligada a estas proteínas. De hecho, está bien establecido que un 50% de receptores varones que reciben una infusión de células de donantes mujeres, pueden llegar a desarrollar anticuerpos dirigidos frente a proteínas del cromosoma Y, en concreto frente a la proteína DBY, (Miklos DB y col., 2004) que están relacionados con el desarrollo de EICH crónica (Miklos DB y col., 2005). Una proteína susceptible de ser estudiada en el contexto de SNP asociado al desarrollo de EICH es el caso de la Glutatión S-transferasa P1 (GSTP1), donde un cambio en un solo nucleótido produce un polimorfismo en la posición 105 de isoleucina (Ile) por valina (Val). La distribución del alelo mayoritario Ile/Ile en la población caucásica es del 42-69%, mientras que la frecuencia en homocigosis Val/Val es del 10% y en heterocigosis Ile/Val del 35% (Gao Y y col., 2009). La disparidad entre donante y receptor para la GSTP1 no se ha estudiado en el contexto de EICH tras el alo-TPH, pero existen otros polimorfismos del tipo SNP que se han asociado a EICH, tales como IL-17 (Espinoza JL y col., 2011) o el receptor de IL-23 (Wermke M y col., 2010). Por otro lado, existen numerosos ejemplos de mHags procedentes de la deleción completa de la parte codificante de la proteína. Debido a que el sistema inmune de ese individuo sería homocigoto para la deleción, presumiblemente su sistema no ha aprendido a tolerar la proteína codificada por ese gen, por lo que podrá llegar a reconocerla como un alo-antígeno (Murata M y col., 2003). No obstante, para que la deleción de una proteína sea considerada como mHag potencial, debe cumplir ciertos criterios (McCarrol SA y col., 2009), la deleción del alelo debe tener una frecuencia en la población superior al 10% y es indispensable que la localización natural de la proteína delecionada esté asociada a uno o más tejidos en los que se desarrolle EICH. Por lo que, algunas proteínas que cumplen estas características son la UDP-glicosiltransferasa 2B17 (UGT2B17) y 2B28 (UGT2B28), OR51A2 (proteínas de receptores olfativos), LCE3C (Late Cornified Envelop) y enzimas metabolizadoras de fármacos de la familia de las Glutatión-Stransferasas GSTMI y GSTT1, las cuales presentan el alelo nulo en un 50% y 20% de la población caucásica, respectivamente. Aunque este tipo de deleciones se han estudiado ampliamente en su posible relación con diversos tipos de cáncer (Economopoulos KP y Sergentanis TN, 2010; Zhang ZJ y col., 2011; Nadeau G y col., 2011), en el caso de la proteína UGT2B17, cuya deleción está presente en el 12% de la población caucásica, se ha demostrado que la disparidad genética entre donante y receptor tras el alo-TPH, puede llegar a despertar el reconocimiento por parte de los linfocitos T del donante como alo-antígenos, lo que podría llegar a desencadenar la EICH (Terakura S y col., 2007). Incluso se ha demostrado la respuesta inmune humoral en un paciente que desarrolló anticuerpos anti-UGT2B17 (McCarroll SA y col., 2009). Por tanto, ya hemos observado la importancia que pueden llegar a tener los anticuerpos dirigidos frente a mHags en el contexto del alo-TPH. De entre estos mHags, el mejor estudiado por nuestro grupo en el trasplante de órganos sólidos es el formado por el sistema GSTT1 que a continuación explicaremos con detalle. 35 8. Anticuerpos anti-GSTT1 en el trasplante de órganos sólidos El sistema menos de histocompatibilidad más ampliamente estudiado en nuestro grupo es el formado por la proteína Glutatión S-Transferasa T1 (GSTT1). La GSTT1 es una enzima citosólica que actúa en la fase II de la detoxificación de fármacos. Tiene 29 kDa de peso molecular y su localización es muy variada, pero destacan el hígado, riñón, eritrocitos, paratiroides y próstata como tejidos en los que se expresa en mayor grado. En la población caucásica existe un 20% de personas que presentan genotipo nulo para la GSTT1, es decir, son homocigotos para la deleción del gen y por tanto no la expresan, mientras que el 80% restante de la población, bien sean heterocigotos u homocigotos para el gen silvestre, sí expresan esta proteína. Imagen 6. Estructura terciaria de la proteína GSTT1. Nuestro grupo ha descrito previamente, tanto en trasplante renal (Aguilera I y col., 2005; Aguilera I y col., 2008) como en hepático (Aguilera I y col., 2001; Aguilera I y col., 2004), que en el momento en el que el sistema inmune de un receptor nulo recibe un injerto positivo para la GSTT1 puede desarrollar anticuerpos anti-GSTT1. Dichos anticuerpos, preceden al desarrollo de la hepatitis inmune (HI) de novo, en el caso del trasplante hepático, y del rechazo mediado por anticuerpos, en el caso del trasplante renal. Estas enfermedades pueden desencadenar la pérdida de la funcionalidad del injerto si no se administra el tratamiento adecuado, consistente en esteroides. En el caso de la HI de novo, la primera vez que se describió fue hace algunos años como una nueva forma de disfunción del injerto en niños sometidos a trasplante hepático debido a otras indicaciones que no implicaban la hepatitis autoinmune. Los criterios mínimo de diagnóstico de la HI de novo, acordados en Banff, incluyen que existan infiltrados linfocitarios en las regiones portales, presencia significativa de anticuerpos, que en nuestro caso serán dirigidos frente a la proteína GSTT1, hipergammaglobulinemia y exclusión diagnóstica de otros tipos de hepatitis como la viral o la derivada de fármacos (Banff Working Group). 36 A lo largo de estos años y tras haber analizado aproximadamente 700 trasplantes, entre renales y hepáticos, nuestro grupo ha demostrado que la producción de anticuerpos antiGSTT1 sólo ocurre bajo la situación de incompatibilidad genética donante GSTT1-positivo / receptor GSTT1-nulo. En el resto de combinaciones (donante-positivo / receptor-positivo; donante-nulo / receptor-nulo y donante-nulo / receptor-positivo) no se han encontrado anticuerpos. De hecho, hemos observado que los únicos pacientes que se diagnostican de HI de novo son aquellos a los que les hemos detectado anticuerpos anti-GSTT1. Nuestro grupo ha descrito, además, la presencia de depósitos de C4d en las áreas portales de biopsias hepáticas de pacientes incompatibles trasplantados de hígado diagnosticados de HI de novo, lo que apoyaría la hipótesis del papel patogénico de los anticuerpos anti-GSTT1, aunque se desconocen los mecanismos (Aguilera I y col., 2011). Imagen 7. Identificación del patrón producido mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) por los anticuerpos antiGSTT1 en hígado de rata, presentes en el suero post-trasplante de un paciente GSTT1-nulo que recibió un hígado GSTT1-positivo (dilución del suero 1:80). Estos anticuerpos también se han encontrado en el suero de las personas no trasplantadas con genotipo GSTT1-nulo, que han sido sometidas a transfusiones procedentes de donantes GSTT1positivos, o en mujeres embarazadas de fetos GSTT1-positivos (Wichmann I y col., 2006). En el primer caso es debido a que la proteína se expresa en la membrana de los eritrocitos, lo que provoca que cuando el sistema inmune del paciente se pone en contacto con la proteína, genera una respuesta frente a ella mediada por linfocitos B. En el caso de las mujeres GSTT1-nulas que tienen hijos GSTT1-positivos, esta circunstancia puede repetirse al entrar en contacto las células del sistema inmunitario de la futura madre con la proteína expresada por el feto. 37 Si bien es cierto que no todos los casos de pacientes GSTT1-nulos que se ponen en contacto con la proteína llegan a desarrollar una respuesta inmunitaria frente a ésta, con estas evidencias podemos poner de manifiesto el alto grado de inmunogenicidad que presenta esta proteína. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS ______________________________________________________________________ 41 Hipótesis Pensamos que para el desarrollo de la enfermedad se requieren dos pilares fundamentales:  Por un lado, la presencia de linfocitos B alo-específicos frente a GSTT1, los cuales:  Producen anticuerpos GSTT1-específicos. No se conoce si estos anticuerpos tienen un papel patogénico ya que el antígeno diana se localiza en el citoplasma celular, aunque se desconoce si en determinadas situaciones se expresa en superficie. Otro concepto fundamental es la faceta de los linfocitos B como células presentadoras de antígeno. Además, estas células son importantes en el mantenimiento de la respuesta inmunitaria prolongada en el tiempo.  Por otro lado la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a GSTT1, los cuales:  Creemos que son los responsables de provocar el daño tisular con el consiguiente fracaso del injerto. Objetivos Dilucidar los mecanismos fisiopatológicos implicados en el desarrollo de la hepatitis inmune de novo: 1. Explorar la distribución celular de la proteína GSTT1 y estudiar la implicación de los anticuerpos GSTT1 específicos en el fracaso del órgano trasplantado. 2. Determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la proteína GSTT1. 3. Dilucidar el papel que desempeñan los linfocitos T alo-específicos de GSTT1 en el rechazo del injerto. 49 Métodos 1. Extracción de ADN a partir de muestras de sangre periférica Tras recopilar las muestras de sangre periférica de todos los participantes en el estudio, realizamos la extracción de ADN usando el siguiente método comercial: 1.1. Sistema MagNA Pure Compact (Roche, Mannheim, Alemania) Con esta tecnología, el ADN se une selectivamente a bolas paramagnéticas en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son eliminados de la muestra. El ADN purificado se eluye de la solución con las bolas paramagnéticas bajo condiciones de baja salinidad y quedando listo para ser usado en posteriores aplicaciones con una concentración aproximada de 40-50 ng/µl. 2. Caracterización genética de nuestra población de estudio atendiendo a un sistema menor de histocompatibilidad (mHags) 2.1. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) Para conocer la distribución genética de los distintos alelos que estudiaremos en la población tanto de trasplantados como en la de sus donantes, llevamos a cabo la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), cuyo objetivo es la obtención de un gran número de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mínimo. El fundamento de dicha técnica, desarrollada en 1986 por Kary Mullis (Mullis K y col., 1986), es usar la propiedad natural de las enzimas ADN polimerasas para replicar hebras de ADN cuando están en presencia de una secuencia molde o cebador, capaz de servirle de inicio, y de los nucleótidos (dNTPS; New England Biolabs, Ipswich, Inglaterra) necesarios para llevar a cabo dicha replicación. Para ello, emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación, y a continuación, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas para que vuelvan a duplicarlas. Los cambios de temperatura se realizan en el termociclador, y oscilan entre los 55 y los 95 °C, por lo que se hace imprescindible el uso de ADN polimerasas termoestables, como es la Taq polimerasa (New England Biolabs, Ipswich, Inglaterra). Dicha Taq polimerasa, para actuar óptimamente, necesita un ambiente salino específico generado por una solución tamponante específica suministrada por la misma casa comercial (New England Biolabs, Ipswich, Inglaterra). El proceso de PCR consiste, por lo general, en una serie de 30 a 45 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos, consistiendo cada uno de ellos en 2 o 3 pasos a diferentes temperaturas. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parámetros, entre los que destaca la temperatura óptima de unión de los 50 cebadores, así como la longitud del ADN que se desea amplificar. De tal forma que las condiciones fueron las siguientes:  Paso 1Desnaturalización inicial, 94°C durante 5 minutos.  Paso 240 ciclos con 3 pasos cada ciclo:  Desnaturalización, 94°C durante 30 segundos.  Unión al cebador, durante 45 segundos.  Extensión, 72°C durante 1 minuto.  Paso 3Extensión final, 72°C durante 5 minutos. Imagen 8. En este gráfico se esquematizan los distintos procesos por los que pasa el ADN en un ciclo en el termociclador, donde se alternan procesos de desnaturalización del ADN, unión del cebador y extensión por la enzima Taq polimerasa. 2.2. Electroforesis en gel de agarosa Los distintos productos de amplificación fueron sometidos a electroforesis horizontal en gel de agarosa 2%, llevándose a cabo a un voltaje constante de 180 voltios durante aproximadamente 30 minutos. 51 2.3. Relación de los cebadores usados 2.3.1. Genotipo de la Glutatión S-transferasa T1 (GSTT1) Para llevar a cabo el genotipado en la proteína GSTT1, se usaron el cebador GSTT1 forward (o cebador sentido) con la secuencia 5´-TTC CTT ACT GGT CCT CAC ATC TC-3´, y el cebador GSTT1 reverse (o cebador antisentido) 5´TCA CCG GAT CAT GGC CAG CA-3´. Como control interno de la reacción recurrimos a la amplificación del gen K-Ras, haciendo uso del cebador forward o sentido: 5´-GTA CTG GTG GAG TAT TTG ATA GTG-3´ y el cebador reverse o antisentido: 5´-TAG CTG TAT CGT CAA GGC AC-3´. La temperatura óptima de unión al cebador para ambas amplificaciones es de 58°C. Reactivos Cantidad ADN (35-50 ng/µl) 2 µl Solución tamponante 10X 5 µl DNTPs 0.4 µl GSTT1 forward 0.2 µl GSTT1 reverse 0.2 µl K-Ras forward 0.2 µl K-Ras reverse 0.2 µl Taq polimerasa 0.2 µl Agua c.s.p. 50 µl Si la muestra analizada es positiva para GSTT1, ya sea homocigota o heterocigota, aparecerá una banda de 498 pares de bases, además de la debida a la amplificación de K-Ras que será de en torno a 190 pares de bases. En cambio, si es homocigota nula, sólo aparecerá la banda correspondiente a la amplificación de K-Ras (Pemble S y Col., 1994). Imagen 9. Observamos cómo en esta electroforesis horizontal, en los carriles 1 y 2 los pacientes parecen ser GSTT1nulos, ya que sólo se observa la banda de 190 pb correspondiente a la amplificación del control interno de reacción, el K-Ras. En cambio en los carriles 3, 4, 5, 6, 7 y 8 los pacientes son GSTT1 positivos por presentar una banda de 498 pb. 52 Para distinguir entre los pacientes con genotipo positivo, los que eran homocigotos (+/+) de los heterocigotos (+/-), realizamos una segunda PCRCon esta PCR lo que conseguimos amplificar es precisamente la secuencia delecionada. Para ello, los cebadores usados fueron GSTT1-Null Forward 5´-GGA TTA CAG TTG TGA GCC ACG GTA-3´y GSTT1-Null Reverse 5´-ACA CCG GGG TGG TTG AT-3´. El programa del termociclador usado fue un poco distinto al programa general antes explicado (Naito M y col., 2006):  Paso 1Desnaturalización inicial, 95°C durante 10 minutos.  Paso 235 ciclos con 3 pasos cada ciclo:  Desnaturalización, 95°C durante 1 minuto.  Unión al cebador, 59° durante 1 minuto.  Extensión, 72°C durante 1 minuto.  Paso 3Extensión final, 72°C durante 5 minutos. Reactivos Cantidad ADN (35-50 ng/µl) 2 µl Solución tamponante 10X 5 µl DNTPs 0.4 µl GSTT1-Null forward 0.2 µl GSTT1-Null reverse 0.2 µl Taq polimerasa 0.2 µl Agua c.s.p. 50 µl Si tras la elecroforesis en gel de agarosa de 2% confirmamos la amplificación de un producto de 580 pares de bases aproximadamente, esos pacientes serán nulos para la GSTT1. Si en cambio no se amplifica nada, el paciente será GSTT1 positivo. 3. Obtención de muestras de suero de los pacientes trasplantados hepáticos De los pacientes incluidos en el estudio obtuvimos muestras de suero, considerando imprescindible que los sueros fueran recogidos a distintos tiempos post-trasplante, de tal forma que se tomaron de forma seriada desde el primer mes post-trasplante hasta completar un seguimiento mensual mínimo de 9 meses o hasta el momento de exitus del paciente. También obtuvimos muestras de suero en situación pre-trasplante. 4. Determinación de anticuerpos anti-GSTT1 mediante test de ELISA 4.1. Determinación de anticuerpos anti-GSTT1 de isotipo IgG total Para determinar la presencia y título de los anticuerpos presentes en las muestras de suero y plasma de los pacientes trasplantados de hígado, usamos el test ELISA (enzimoinmunoanálisis de adsorción) comercialziado por Biomedal (Sevilla, España) que está cebado con la proteína 53 humana recombinante GSTT1. Este es un ensayo inmunocromatográfico diseñado para la detección de anticuerpos dirigidos contra la GSTT1 en sueros humanos ya que tras varias incubaciones y lavados, termina produciéndose una reacción colorimétrica que se relaciona de forma no lineal con la cantidad de anticuerpos anti-GSTT1 presente en los pocillos. El protocolo empleado en este caso fue el marcado por el fabricante. En resumen, la técnica consiste en una incubación de 1 hora entre la proteína recombinante y la dilución 1:100 del suero de estudio. Tras los lavados correspondientes, se procedió a llevar a cabo una segunda incubación, pero esta vez, con el anticuerpo secundario anti-humano IgG completa, conjugado con fosfatasa alcalina (AP). De este modo, al añadirle el sustrato cromogénico que el fabricante suministra, se produce una reacción colorimétrica con la AP y, tras analizar la señal espectrofotométricamente, a una longitud de onda de 405 nm, obtenemos el título bruto de anticuerpos. Todo el proceso debe realizarse por duplicado y el valor final será la media de ambos menos el valor de absorbancia obtenido por el blanco. Usando las recomendaciones del fabricante, tomamos como valores positivos aquellos en los que la absorbancia media a 405 nm era superior a 1 y negativos aquellos en los que la absorbancia no alcanzara el valor 0.5. La zona cuyos valores oscilan entre 0.5 y 1 es considerada zona gris, cuyos resultados deben ser analizados con precaución y atendiendo a posibles valores positivos o negativos en muestras posteriores en el tiempo a la analizada. 4.2. Determinación de las distintas subclases de anticuerpos anti-GSTT1 Gracias al experimento anterior podemos determinar si nuestra población de pacientes posee anticuerpos IgG específicos frente a la proteína GSTT1, pero no somos capaces de discernir la subclase de dichos anticuerpos. Para ello llevamos a cabo el mismo experimento, pero usando esta vez unos anticuerpos secundarios específicos de cada subclase, de tal forma que haremos un barrido sobre las cuatro posibilidades: anticuerpo monoclonal secundario anti-humano hecho en ratón dirigido frente a IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 todos ellos conjugados con fosfatasa alcalina (AbCam, Cambridge, Reino Unido). En este caso, y debido a que hemos cambiado las condiciones del kit comercial, ajustaremos las absorbancias obtenidas en cada una de las subclases en función del valor mayor obtenido, para ello, las equipararemos al valor máximo en proporción tanto por 1. Consideraremos que los anticuerpos anti-GSTT1 son positivos para un isotipo determinado si el valor ajustado en tanto por 1 es superior a 0.33, ya que dicho valor será 3 veces inferior al valor máximo. 54 5. Exploración de la distribución celular de la proteína GSTT1 Con el objetivo de estudiar la localización celular de nuestra proteína de interés, hemos usado la línea celular HepaRG. Ésta procede de un hepatocarcinoma humano adquirida comercialmente (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Estas células son progenitores bipotenciales, lo cual les permite diferenciarse en hepatocitos y colangiocitos (ratio 1:1). Para conseguir dicha diferenciación en los dos tipos celulares mencionados anteriormente, se llevó a cabo el siguiente protocolo de trabajo (Cerec y Col., 2007):  4 días con medio William´s E completo.  14 días con medio William´s E completo suplementado al 1,7% con DMSO. 5.1. Caracterización línea celular HepaRG Con objeto de verificar la correcta diferenciación de nuestra línea celular en hepatocitos y colangiocitos, empleamos pellet de células diferenciadas y cultivadas durante 81 días (5x105 células aproximadamente). Para ello utilizamos la técnica de western blot. Dicha técnica consta de los siguientes de pasos:  Lisis celular  Cuantificación del extracto  Preparación de gel de proteína  Transferencia a membrana de nitrocelulosa  Inmunoblot 5.1.1. Lisis celular Añadir cóctel de inhibidor de proteasas (Sigma Aldrich, MI, EEUU) a la concentración adecuada (1 µl de inhibidor de proteasas en 100 µl de buffer de lisis). A partir de este momento todo el proceso se realiza en hielo. Para un botón de células de aproximadamente 50 µl, añadir 100500 µl de buffer de lisis NP-40. Machacar durante 1 minuto con una varilla y dejar durante 30 minutos en hielo. Repetimos el paso anterior. A continuación, centrifugar a 4°C, 12000 rpm durante 30 minutos. Seguidamente, recoger el sobrenadante con cuidado y pasar a un tubo nuevo. Finalmente, guardar en el congelador a -20°C. 5.1.2. Cuantificación de proteínas Para la cuantificación de proteína usamos el kit “Pierce BCA Protein Assay Kit” (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. 5.1.3. Preparación gel de proteína Colocar dos cristales limpios con en la cubeta de sujeción con las dos tiras grises a los lados. Preparar e introducir en los cristales con ayuda de una pipeta Pasteur el “resolving gel” al 10% con cuidado de no formar burbujas. Cubrir con etanol para evitar que el gel quede en contacto con el aire y dejar polimerizar durante 15 minutos. Pasado ese tiempo, retirar el etanol y lavar el gel unas 2-3 veces con agua destilada. A continuación, preparar y cargar el “stacking gel” al 4% y colocar el peine para que se formen los pocillos de carga. Dejar polimerizar durante 15 minutos. Transcurrido ese tiempo, quitar el peine, lavar el gel unas 2-3 veces con agua 55 destilada. Posteriormente, colocar el gel en la cubeta de electroforesis y añadir “running buffer”. Preparar la muestra, para la cual, mezclar la muestra de proteína con el buffer de carga en proporción 1:1, calentar la muestra en agua hirviendo durante 3 minutos. Cargar el marcador de peso molecular y la muestra. Finalmente, correr el gel a 200 V durante una hora. 5.1.4. Transferencia a membrana de nitrocelulosa Poner dos esponjitas bien empapadas en buffer de transferencia en una cubeta mediana por cada gel obtenido. Rellenar otra cubeta con buffer de transferencia, poner 2 papeles de filtro 1 una membrana de nitrocelulosa, por cada gel, para que empapen. Quitar los cristales con cuidado para evitar romper los geles. De nuevo, rellenar otra cubeta mayor con buffer de transferencia. Sacar los cristales de la cubeta de donde hemos realizado la electroforesis y colocarlos en la cubeta mayor con buffer de transferencia. Sobre una placa agujereada colocar una esponjita. A continuación, poner un papel de filtro y sobre él se coloca el gel. Posteriormente, poner la membrana de nitrocelulosa y presionar suavemente con una varilla de vidrio para quitar las burbujas. Por último, colocar otro papel de filtro, otra esponjita y cerrar la estructura. Introducir la placa en la estructura de transferencia y posicionarla sobre el agitador magnético. Poner hielo en la estructura de transferencia y un imán, con objeto de activar la agitación de manera suave. Realizar la transferencia a 100 V durante una hora. Tras finalizar la transferencia, desmontar la estructura, recoger la membrana, cortar en tiras y conservar a -20°C. 5.1.5. Inmunoblot Incubar durante 1 hora a temperatura ambiente en agitación suave, las tiras con la solución de bloqueo para bloquear los anticuerpos inespecíficos. Tras el bloqueo inicial, incubar las tiras con el anticuerpo primario diluido en solución de bloqueo a la concentración deseada, durante 1 hora a temperatura ambiente y en agitación suave. En nuestro caso, se utilizaron los anticuerpos:  Rabbit anti-human HNF-4α (1:100) (AbCam, Cambridge, Reino Unido).  Rabbit anti-human CK19 (1:10000) (AbCam, Cambridge, Reino Unido).  Rabbit anti-human ALDOB (1:250) (AbCam, Cambridge, Reino Unido).  Rabbit anti-human β-actina (1:10000) (AbCam, Cambridge, Reino Unido). Transcurrido ese tiempo, realizar tres lavados de 10 minutos en agitación con TTBS. A continuación, añadir el anticuerpo secundario disuelto en solución de bloqueo y dejar durante una hora a temperatura ambiente en agitación suave. En nuestro caso, se usó el anticuerpo goat anti-rabbit IgG (H-L) (1:20000) (AbCam, Cambridge, Reino Unido). Posteriormente, volver a repetir los 3 lavados. Para el revelado, se utilizó el reactivo de detección de Western Blotting GE Healthcare Life SciencesTM AmershamTM ECL SelectTM (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) siguiendo las instrucciones del fabricante. Finalmente, la señal se registró usando el sistema ImageQuant LAS 4000 mini. En esta imagen podemos observar los resultados para los distintos marcadores ensayados por western blot. El marcador HNF-4α es característico de células HepaRG diferenciadas en hepatocitos, el marcador CK19 es específico de células HepaRG diferenciadas en colangiocitos, 56 mientras que el marcador ALDOB aparece en ambos tipos celulares. Como control interno usamos el marcador β-actina. Podemos apreciar positividad en todos los marcadores utilizados, lo cual confirma la diferenciación en los dos tipos celulares posibles (hepatocitos y colangiocitos). Figura 1. Resultados de la caracterización celular de la línea celular HepaRG mediante western blot. 6. Estudio de la distribución celular de la proteína GSTT1 Aunque se conoce que la proteína GSST1 tiene una expresión citoplasmática, decidimos estudiar la expresión de dicha proteína a nivel de superficie. El objetivo de esto es determinar si la proteína llega a expresarse en superficie para actuar como diana y poner en marcha los mecanismos responsables de la respuesta T. Para ello se idearon dos abordajes experimentales distintos: inmunocitoquímica y citometría de flujo. 6.1. Inmunocitoquímica Inicialmente, la línea celular HepaRG se cultivó sobre cubres (previamente esterilizados) en placa de cultivo formada por 12 pocillos estéril (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Las células se dejaron crecer hasta que se expandieron y ocuparon la superficie del cubre. A continuación, tomamos los cubres con las células y los pasamos a una nueva placa de 12 pocillos no estéril para lavar con PBS. Posteriormente, fijamos las células con metanol previamente enfriado a -20°C durante 6 minutos. Seguidamente, algunos cubres fueron permeabilizados con solución de tritón 0,5% en PBS durante 10 min para usarlos como comparativa con los cubres de células sin permeabilizar. Realizamos 3 lavados con PBS. Llegados a este punto, incubamos con el anticuerpo primario (suero de pacientes con la enfermedad y que presentan anticuerpos anti-GSTT1, cuyo título había sido evaluado previamente, a una dilución (1:20)) durante 45 min. Tras la incubación, lavamos 3 veces con PBS e incubamos con el anticuerpo secundario (mouse anti-human IgG FITC (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Cambridge, Reino Unido), dilución (1:100), durante 30 minutos en oscuridad. Posteriormente, lavamos 3 veces con PBS, añadimos medio de montaje con DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) y montamos el cubre sobre un porta. 57 6.2. Inmunocitoquímica in vivo Inicialmente, cogemos los cubres con las células y los pasamos a una nueva placa de 12 pocillos no estéril para lavar con PBS-BSA 0,1% en agitación suave. Seguidamente, descomplementar los sueros a 56°C durante 30 minutos. A continuación, realizamos un comarcaje con los anticuerpos primarios durante 2 horas en agitación suave:  Suero de pacientes con la enfermedad y que presentan anticuerpos anti-GSTT1, cuyo título había sido evaluado previamente, a una dilución (1:20).  Marcador de membrana mouse anti-human CD81 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU), dilución (1:50). Transcurrido el tiempo de incubación, lavar las células 3 veces con PBS-BSA 0,1% en agitación suave. Posteriormente, fijamos las células en metanol frío a -20°C durante 6 minutos. De nuevo, realizamos 3 lavados con PBS-BSA 0,1% en agitación suave. Llegados a este punto, incubamos con los anticuerpos secundarios, dilución (1:300) durante 30 minutos en oscuridad y agitación suave:  Goat anti-human IgG TRITC (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Cambridge, Reino Unido).  Goat anti-mouse IgG FITC (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd, Cambridge, Reino Unido). Finalmente, lavar 3 veces con PBS-BSA 0,1% en agitación suave, añadimos medio de montaje con DAPI (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) y montamos el cubre sobre un porta. 6.3. Citometría de flujo Inicialmente, levantamos las células con tripsina-EDTA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Añadimos suero fetal bovino (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) para bloquear el efecto de la tripsina. Seguidamente, lavamos las células con DPBS e incubamos con LIVE/DEAD® Fixable Yellow Dead Cell Stain Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) según las instrucciones del fabricante. A continuación, lavamos las células con 1 ml de DPBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) y realizamos el marcaje con los anticuerpos primarios a la dilución recomendada por el fabricante durante 30 minutos:  Rabbit anti-human GSTT1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU).  Mouse anti-human CD81 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Transcurrido el tiempo de incubación, lavamos las células con 1 ml de DPBS (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU) y realizamos el marcaje con los anticuerpos secundarios a la dilución recomendada por el fabricante durante 30 minutos en oscuridad: 1. Goat anti-rabbit Alexa Fluor 568 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). 2. Goat anti-mouse Alexa Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EEUU). Finalmente, se hace un lavado con 1 ml de DPBS frío y resuspendemos el pellet celular en un volumen final de 500 µl de DPBS. La adquisición se llevó a cabo en un citómtero BD LSRIIFortessa (BD Biosciences, CA, EEUU) y para el análisis de datos se utilizó el software RESULTADOS ______________________________________________________________________ 67 Resultados En este apartado vamos a detallar los diferentes resultados obtenidos para responder a las cuestiones planteadas en los objetivos. OBJETIVO 1. Explorar la distribución celular de la proteína GSTT1 y estudiar la implicación de los anticuerpos GSTT1 específicos en el fracaso del órgano trasplantado. A continuación, se muestran los resultados conseguidos en el estudio de la distribución celular de la proteína GSTT1 mediante los dos abordajes experimentales llevados a cabo, inmunocitoquímica y citometría de flujo. 1.1. Inmunocitoquímica Teniendo en cuenta que la proteína GSTT1 se localiza a nivel citoplasmático, para llevar a cabo sus funciones como enzima detoxificadora, tal y como se observa en las imágenes A y B (Figura 2), donde las células HepaRG diferenciadas se permeabilizaron. Tras los experimentos realizados, podemos determinar que un bajo número de células presentan dicha proteína a nivel de la superficie celular. Esto aparece evidenciado en las imágenes C y D (Figura 2), donde el patrón de inmunofluorescencia en células que no han sido permeabilizadas es claramente distinto al que encontramos en las imágenes A y B cuyas células fueron permeabilizadas. Además, las imágenes E y F (Figura 2) apoyan lo explicado anteriormente, ya que en este caso al usar los marcadores CD81 (verde) y GSTT1 (rojo) en células no permeabilizadas, se aprecia un refuerzo de color anaranjado correspondiente al comarcaje CD81/GSTT1 en algunas zonas de la membrana celular. Estos resultados serán posteriormente corroborados, gracias a los experimentos realizados mediante citometría de flujo. 68 Figura 2. En esta figura observamos los resultados obtenidos atendiendo a las diferentes condiciones experimentales que hemos realizado. En las imágenes A y B, observamos la localización citoplasmática de la proteína GSTT1 en células HepaRG diferenciadas (hepatocitos y colangiocitos) que fueron fijadas y permeabilizadas. En las imágenes C y D, podemos apreciar un patrón totalmente distinto al anterior. En este caso, la proteína GSTT1 se sitúa a nivel de la membrana celular ya que las células no fueron permeabilizadas. Por último, las imágenes E y F, muestran el comarcaje de los marcadores CD81 y GSTT1 en células no permeabilizadas. 69 1.2. Estudio de la expresión de GSTT1 mediante citometría de flujo Para este estudio se utilizaron HepaRG diferenciadas (hepatocitos y colangiocitos) que fueron marcadas con GSTT1 y el marcador de membrana CD81. Respecto a la jerarquía utilizada en el análisis de los datos, inicialmente hemos tomado una población total de células, a continuación se seleccionan los singletes (descartando de esta forma los dobletes celulares), seguidamente acotamos la población de células vivas gracias al marcador de viabilidad y finalmente registramos la población doble positiva para los marcadores de estudio CD81 y GSTT1. Los resultados muestran que de la población total de estudio, el 0,2% es doble positiva para ambos marcadores CD81/GSTT1 (Figura 3). Por tanto, a pesar de que la proteína GSTT1 tiene expresión citoplasmática, gracias a estos resultados podemos concluir que dicha proteína también se puede localizar en la superficie celular de forma débil. Esto reafirma los resultados obtenidos anteriormente mediante inmunocitoquímica. Figura 3. Jerarquía de marcadores utilizada y resultados del estudio de expresión de la proteína GSTT1 en la membrana celular mediante citometría de flujo. Con objeto de comprobar si los anticuerpos anti-GSTT1 son activadores de complemento y por tanto pueden tener un papel patogénico, se determinaron las subclases de IgG de estos anticuerpos. 43,5% 94,5% 0,2% 43,5% 70 1.3. Determinación de las distintas subclases de anticuerpos anti-GSTT1 En la siguiente tabla observamos la distribución de las distintas subclases IgG de los anticuerpos anti-GSTT1 en los sueros de pacientes ensayados por ELISA. Se estudiaron retrospectivamente 57 muestras de suero de 18 pacientes:  12 de ellos presentaban anticuerpos anti-GSTT1 y desarrollaron la enfermedad (en rojo)  6 de ellos presentaban anticuerpos anti-GSTT1, pero no desarrollaron la enfermedad (en negro). Lo más destacable de los resultados es la presencia mayoritaria de las subclases IgG1-GSTT1 e IgG4-GSTT1, aunque también se encontraron trazas de otras subclases (IgG2-GSTT1 e IgG3-GSTT1). Los pacientes experimentaron cambios en las subclases de anticuerpos IgG-GSTT1 y algunas de ellas llegaron a ser indetectables como ocurrió con IgG1-GSTT1 en los pacientes 3 y 6, o IgG4-GSTT1 en el paciente 2. La mayoría de los pacientes presentan las dos subclases mayoritarias de inmunoglobulinas (IgG1-GSTT1 e IgG4-GSTT1), aunque también se ha observado una situación en la cual sólo se detecta una subclase de inmunoglobulina en todas las muestras analizadas durante la evolución del mismo paciente, por ejemplo IgG1-GSTT1 en los pacientes 5 y 8, o IgG4GSTT1 en los pacientes 7, 14 y 15. En principio no se observa un patrón diferenciable entre el grupo de pacientes diagnosticados de HI de novo (pacientes de 1 a 12) respecto al grupo de pacientes que no llegan a desarrollar la enfermedad (pacientes de 13 a 18). 71 Subclases de IgG en los anticuerpos antiGSTT1 Ratio Paciente Fecha de la muestra (Años post-Tx) IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 IgG1/IgG4 Biopsia hepática en el diagnóstico 1 5 meses 0,361 0 0 0,36 1 7 meses 0,324 0 0 0,273 1.19 IgG4+/CD138+ 12 meses 0,237 0 0 0 - 2 1,5 2,369 0 0 0,978 2.42 No disponible 7,5 0,649 0 0 0,154 4.21 10 0,556 0 0 0 - 3 7 0,133 * * 0,252 0.53 10 0 * * 0,249 - 4 2 0,5 0 0 0,257 1.94 No disponible 6,5 1,31 0 0 1,506 0.87 8,5 0,072 0 0 0,222 0.32 9 0,456 0 0 0,643 0.71 5 1 0,112 * * 0 > 1 IgG4-/CD138 débil 5,5 0,116 0 0 0 - 6,5 0,168 0 0 0 - 6 4,5 0,236 * * 0,593 0.40 6,5 0,163 0 0 0,551 0.30 8 0,333 * * 0,713 0.47 10 0 0 0 0,924 - 12 0 0 0 0,875 - 7 1,5 0,163 0 0 1,526 0,107 IgG4+/CD138+ 4 0 0 0 1,204 - 5,5 0,254 * * 1,235 0,206 8 0 0 0 1,118 - 8 2,5 2,521 0 0 0 >1 IgG4-/CD1384 0,385 0 0 0 - 10 0,891 0 0 0 - 10,5 0,853 0 0 0 - 9 1 2,387 0 0 0,605 3.95 2 0,575 0 0 0,28 2.05 IgG4+/CD138+ 2,5 0,904 * 0 0,203 4.45 10 4,5 0,111 0 0 0,136 0.82 5 0,117 0 0 0,209 0.56 11 2,5 0,178 0 0 0,076 2.34 IgG4-/CD138+ 4 0,208 0 0 0,083 2.50 5 0,223 0 0 0,171 1.30 12 Pre-Tx 2,017 * * 1,754 1.15 1 0,493 * * 2,47 0.20 IgG4+/CD138+ 2 0,263 0 0 1,309 0.20 3 1,935 0 0 3,095 0.62 13 2 0,235 0 0 0,567 0.59 3 0,183 * 0 0,524 0.35 4 1,522 0 0 1,813 0.84 6 0 0 0 0,564 - 11 0,243 0 0 0,972 0.25 14 Pre-Tx 0 0 * 1,068 - 1,5 0 0 0 0,897 - 2,5 0 * 0 0,316 - 5,5 0 0 * 0,553 - 15 2 0 0 0 0,168 - 2,5 0 0 0 0,203 - 4 0 * 0 1,308 - IgG4-/CD138+ 16 15 0,415 0 0 0,229 1.81 17 3 0,124 0 0 0,28 0.44 4 0,067 0 0 0,447 0.15 IgG4-/CD138+ 18 16 0,711 0 0 0,625 1,14 Tabla 3. En la siguiente tabla aparecen los distintos pacientes de trasplante hepático ensayados con incompatibilidad GSTT1 (donante positivo/receptor nulo) que contienen anticuerpos anti-GSTT1 en suero. Pacientes numerados en rojo: pacientes diagnosticados con hepatitis inmune de novo; pacientes numerados en negro: pacientes sin Hepatitis Inmune de novo. Los pacientes 12 y 15 tenían anticuerpos anti-GSTT1 antes del trasplante hepático, debido a embarazo o transfusión. * Indica pequeñas cantidades de la subclase marcada. El ratio IgG1GSTT1/IgG4-GSTT1 se ha calculado cuando ha sido posible ya que hay muchas muestras con una sola subclase. 72 En esta figura observamos los niveles de las distintas subclases de IgG encontrados para cada muestra de suero en todos los pacientes diagnosticados con hepatitis inmune de novo. Se puede apreciar como fluctúan dichos niveles conforme evoluciona la enfermedad. Figura 4. En la siguiente figura aparecen las subclases IgG-GSTT1 encontradas en muestras de suero de todos los pacientes con hepatitis inmune de novo. Las muestras más cercanas a la fecha de diagnóstico se marcan en rojo. Las proporciones de las distintas subclases así como la titulación de los anticuerpos fluctúan durante el seguimiento. IgG4 es la más abundante en la mayoría de los casos junto con la IgG1. Las otras dos subclases apenas son representativas y desaparecen con el tiempo. 0 0,1 0,2 0,3 0,4 5 7 months post-Tx Patient 1 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 Paciente 1 Paciente 3 Paciente 2 Paciente 4 Paciente 5 Paciente 6 Años post-Tx Años post-Tx Años post-Tx Años post-Tx Años post-Tx Años post-Tx Meses post-Tx Años post-Tx Años post-Tx Paciente 7 Paciente 8 Paciente 9 Paciente 10 Paciente 11 Paciente 12 Años post-Tx Años post-Tx Años post-Tx 73 En la siguiente figura observamos los niveles de las distintas subclases de IgG encontrados para cada muestra de suero en todos los pacientes que no han desarrollado hepatitis inmune de novo. Se puede apreciar como fluctúan dichos niveles durante el seguimiento. Figura 5. En la siguiente figura aparecen las subclases IgG-GSTT1 encontradas en muestras de suero de todos los pacientes que no han desarrollado hepatitis inmune de novo. Las proporciones de las distintas subclases así como la titulación de los anticuerpos fluctúan durante el seguimiento. IgG4 es la más abundante en las muestras cercanas al post-Tx a veces acompañada de IgG1. IgG1 predomina en dos muestras (pacientes 16 y 18) después de un largo seguimiento. IgG2 e IgG3 son prácticamente ausentes. 0 0,5 1 1,5 2 Paciente 13 2 3 4 6 11 Años post-Tx 0 0,5 1 1,5 Paciente 14 Pre-Tx 1,5 2,5 5,5 Años post-Tx 0 0,5 1 1,5 Paciente 15 2 2,5 4 Años post-Tx 0 0,2 0,4 0,6 Paciente 16 IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 15 Años post-Tx 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Paciente 17 3 4 Años post-Tx 0 0,2 0,4 0,6 0,8 Paciente 18 16 Años post-Tx 80 También, se analizaron las distintas subpoblaciones a partir de los resultados pentámero+CD8+ y pentámero-CD8+ obtenidos anteriormente respecto de la población CD3+. A partir de los resultados pentámero+CD8+, se puede apreciar como en todos los casos la subpoblación CD56- (T convencionales) es mayoritaria (representada en verde y azul) frente a la subpoblación CD56+, que incluye células T CD8+CD45RO+ y células T CD8+CD45RO- (representadas en rojo y violeta respectivamente). Si se suman estas poblaciones no convencionales, los pacientes sin la enfermedad (P11 y 12) presentan valores superiores al 30% mientras que los pacientes con la enfermedad (P1, P3 y P5) presentan valores entre el 14,8% y el 20,7%. Por tanto, el porcentaje de linfocitos T convencionales es más alto en el grupo de pacientes con la enfermedad. Los linfocitos T convencionales son mayoritariamente linfocitos de memoria en 4 de los pacientes, al igual que los linfocitos CD8+CD56+ que también son predominantemente linfocitos memoria (Figura 11). Figura 11. En esta figura se representan las distintas subpoblaciones pentámeros+CD8+ atendiendo a los marcadores CD56 y CD45RO. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% P1 P3 P5 P11 P12 Subpoblaciones Pentámero+CD8+ Pentámero+ CD8+ CD56+ CD45ROPentámero+ CD8+ CD56CD45ROPentámero+ CD8+ CD56+ CD45RO+ Pentámero+ CD8+ CD56CD45RO+ 81 Respecto a los resultados pentámero-CD8+, como en el caso anterior la subpoblación CD8+CD56predomina sobre la subpoblación CD8+CD56+. Por otro lado, a diferencia de los valores registrados en los resultados pentámero+CD8+, los linfocitos convencionales son mayoritariamente no memoria en 3 de los 5 pacientes, al igual que los linfocitos CD8+CD56+ en los que predomina la población no memoria en todos los pacientes. Figura 12. En esta figura se representan las distintas subpoblaciones pentámeros-CD8+ atendiendo a los marcadores CD56 y CD45RO. 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% P1 P3 P5 P11 P12 Subpoblaciones Pentámero-CD8+ PentámeroCD8+ CD56+ CD45ROPentámeroCD8+ CD56CD45ROPentámeroCD8+ CD56+ CD45RO+ PentámeroCD8+ CD56CD45RO+ 82 2.1.5. Estudio tetrámeros 2.1.6. Pacientes En la siguiente tabla se resaltan en azul los pacientes incluidos en este apartado del estudio y sus características. Paciente Edad al Tx Tx Enfermedad primaria Terapia inducción Diagnóstico HIdn TTO Fecha extracción células GRUPO 1 1 46 6-5-99 C Alcohólica CYA, MMF, EST 6 AÑOS PRED 2 67 10-4-12 CVHC CYA, MMF, EST 9M PRED 08/06/15 3 46 7-5-07 Autoinmune-like CYA, MMF, EST 32M PRED 15/08/11 04/02/15 4 47 2-7-00 CVHC CYA, EST, BAS 24M PRED, AZA 13/02/17 5 49 18-9-03 Alcohólica CYA, MMF, EST 21M PRED 21/10/15 6 46 2-11-01 C Alcohólica+CVHC CYA, EST, BAS 33M PRED 11/01/16 GRUPO 2 7 44 13-10-03 C Alcoholica TAC, MMF, EST No 8 52 8-04-01 CVHB+HCC CYA, MMF, EST No 9 39 23-11-96 C. Alcohólica+CVHB CYA, AZA, EST No GRUPO 3 10 63 12-7-06 C Alcohólica+HCC TAC, DAC No 06/03/12 11 58 12-2-09 CVHB TAC, MMF, EST No 11/01/17 12 52 18-1-09 CVHC TAC, MMF, EST No 17/10/16 13 60 24-8-13 C Alcohólica TAC, MMF, EST No 03/06/15 14 61 17-07-13 CVHC+HCC CYA, MMF,EST No 09/12/15 15 61 10-4-13 CVHB TAC, BAS, EST No 30/10/15 16 50 19-4-11 CVHC+HCC CYA, MMF, EST No GRUPO 4 CONTROL 17 63 16-02-11 C Alcohólica MMF, EST No 18 53 2009 CVHC CYA, MMF, EST No 19 45 10-10-01 CBP TAC, MMF, EST No 20 54 21-01-05 CVHC TAC, MMF, EST No Tabla 6. En esta tabla se representan las características de los distintos pacientes incluidos en el estudio. El grupo 1 está formado por pacientes que presentan la incompatibilidad GSTT1 (donante positivo / receptor nulo), poseen anticuerpos frente a la proteína GSTT1 y además han desarrollado la enfermedad (Hepatitis inmune de novo). Los pacientes del grupo 3 únicamente presentan la incompatibilidad GSTT1, carecen de anticuerpos y no tienen la enfermedad. El grupo 4 lo constituyen pacientes trasplantados de hígado con genotipo GSTT1+, utilizados como controles. CYA: ciclosporina A; MMF: mofetil micofenolate; EST: esteroides; BAS: basilisimab; DAC: daclizumab; PRED: prednisona; AZA: azatioprina; HVC: hepatitis por virus C; HCC: hepatocarcinoma. 2.1.7. Jerarquía La jerarquía utilizada es similar a la empleada para el estudio de los pentámeros. Sin embargo, en lugar de analizar los marcadores pentámero y CD8, estudiamos los marcadores tetrámero y CD4. 83 2.1.8. Resultados Sin embargo, en cuanto a los resultados obtenidos con los tetrámeros, no se ha encontrado ninguna población de linfocitos T CD4+ alo-específica frente a la proteína GSTT1 en ninguno de los pacientes ensayados. Grupo HIdn Paciente Tetrámero ensayado % Población CD3+ Tetrámero+ CD4+ 1 2 DRB1*01(LLED) 0 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 3 DRB1*01 (LLED) 4 DRB1*01 (LLED) DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 5 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 6 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 3 10 DRB1*01 (LLED) DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 11 DRB1*01 (LLED) 12 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 13 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) 14 DRB1*01 (LLED) DRB1*15(ESVA) 15 DRB1*07(AVGE) DRB1*07(GDFT) DRB1*15(ESVA) Tabla 7. Resultados del estudio de tetrámeros. 84 OBJETIVO 3. Dilucidar el papel que desempeñan los linfocitos T alo-específicos de GSTT1 en el rechazo del injerto 3.1. Resultados activación péptidos GSTT1 3.1.1. Pacientes En la siguiente tabla se marcan en gris los pacientes incluidos en este apartado del estudio y sus características. Paciente Edad al Tx Tx Enfermedad primaria Terapia inducción Diagnóstico HIdn TTO Fecha extracción células GRUPO 1 1 46 6-5-99 C Alcohólica CYA, MMF, EST 6 AÑOS PRED 2 67 10-4-12 CVHC CYA, MMF, EST 9M PRED 08/06/15 3 46 7-5-07 Autoinmune-like CYA, MMF, EST 32M PRED 18/05/16 4 47 2-7-00 CVHC CYA, EST, BAS 24M PRED, AZA 5 49 18-9-03 Alcohólica CYA, MMF, EST 21M PRED 17/02/16 6 46 2-11-01 C Alcohólica+CVHC CYA, EST, BAS 33M PRED 03/11/15 GRUPO 2 7 44 13-10-03 C Alcoholica TAC, MMF, EST No 20/06/18 8 52 8-04-01 CVHB+HCC CYA, MMF, EST No 15/01/18 9 39 23-11-96 C. Alcohólica+CVHB CYA, AZA, EST No 03/10/17 GRUPO 3 10 63 12-7-06 C Alcohólica+HCC TAC, DAC No 06/10/17 11 58 12-2-09 CVHB TAC, MMF, EST No 17/09/17 12 52 18-1-09 CVHC TAC, MMF, EST No 13 60 24-8-13 C Alcohólica TAC, MMF, EST No 14 61 17-07-13 CVHC+HCC CYA, MMF,EST No 15 61 10-4-13 CVHB TAC, BAS, EST No 16 50 19-4-11 CVHC+HCC CYA, MMF, EST No 18/05/18 GRUPO 4 CONTROL 17 63 16-02-11 C Alcohólica MMF, EST No 28/10/16 18 53 2009 CVHC CYA, MMF, EST No 23/11/15 19 45 10-10-01 CBP TAC, MMF, EST No 08/05/15 20 54 21-01-05 CVHC TAC, MMF, EST No 11/12/15 Tabla 8. En esta tabla se representan las características de los distintos pacientes incluidos en el estudio. El grupo 1 está formado por pacientes que presentan la incompatibilidad GSTT1 (donante positivo / receptor nulo), poseen anticuerpos frente a la proteína GSTT1 y además han desarrollado la enfermedad (Hepatitis inmune de novo). El grupo 2 está compuesto por pacientes con la incompatibilidad GSTT1, tienen anticuerpos frente a dicha proteína, pero no han desarrollado la enfermedad. Los pacientes del grupo 3 únicamente presentan la incompatibilidad GSTT1, carecen de anticuerpos y no tienen la enfermedad. El grupo 4 lo constituyen pacientes trasplantados de hígado con genotipo GSTT1+, utilizados como controles. CYA: ciclosporina A; MMF: mofetil micofenolate; EST: esteroides; BAS: basilisimab; DAC: daclizumab; PRED: prednisona; AZA: azatioprina; HVC: hepatitis por virus C; HCC: hepatocarcinoma. 3.1.2. Jerarquía A continuación, se presenta la jerarquía utilizada para el análisis de los resultados. En dicha jerarquía se observa cómo hemos seleccionado las distintas poblaciones de interés para posteriormente analizar su activación atendiendo a los marcadores de activación estudiados. 85 Inicialmente atendiendo a los parámetros de complejidad (SSC) y de tamaño (FSC) hemos tomado la población linfocitaria. Posteriormente, se seleccionan los singletes (descartando de esta forma los dobletes celulares). A continuación, designamos la población de células vivas y seguidamente acotamos la población CD3+CD56-. A partir de la población anterior, distinguimos las subpoblaciones CD8+, CD4+, CD4+CD8+ y CD4-CD8- (Figura 13). Finalmente analizamos los marcadores de activación de las subpoblaciones citadas anteriormente. A modo de ejemplo en esta figura se representan los resultados obtenidos con células del paciente 3. Figura 13. En esta figura se representa la jerarquía de marcadores utilizada en el estudio de estimulación con péptidos de GSTT1. Se observan los resultados obtenidos del paciente 3. 3.1.3. Resultados En la siguiente tabla se muestran los resultados de activación obtenidos. 71,3% 99,9% 77,5% 94,5% 19,9% 0,6% 4,8% 73,5% 86 Grupo Pacientes Poblaciones Activación IFN-y IL-4 IL-10 CD107a 1 2 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ * * * * CD4-CD80 0 0,3 0 3 CD8+ 0 0,5 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0,8 0 0 CD4-CD80 3,5 0 0 5 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ * * * * CD4-CD80 2,2 0 0 6 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD85,9 0 0 1,9 2 7 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 0 0 0 8 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 0 0,8 0 9 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ * * * * CD4-CD80 0 0 0 3 10 CD8+ 0 0 0,3 0 CD4+ 0 0 0,4 0 CD4+CD8+ 0 0 0,5 0 CD4-CD80 0 0 0 11 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ * * * * CD4-CD80 0 0 0 16 CD8+ 0 0,4 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 1,2 0 0 4 17 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ * * * * CD4-CD80 0 0 0 18 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 0 0 0 19 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 0 0 0 20 CD8+ 0 0 0 0 CD4+ 0 0 0 0 CD4+CD8+ 0 0 0 0 CD4-CD80 0 0 0 Tabla 9. En la siguiente tabla se muestran los porcentajes de activación obtenidos para cada molécula de activación en las distintas poblaciones de los tres grupos de pacientes estudiados. Los valores (*) indican la escasez de eventos para poder analizar dicha población. 87 Todos los pacientes con HI de novo presentan activación en alguna población de linfocitos T, si bien llama la atención que no son las poblaciones convencionales CD4+ o CD8+ sino sobre todo, las DN CD4-CD8-. Todos ellos presentan activación de las células DN, bien vía IFN-y (paciente 6), vía IL-4 (pacientes 3 y 5) o vía IL-10 (paciente 2), con valores altos, teniendo en cuenta las condiciones de inmunosupresión en las que se encuentran los pacientes y que repercuten en la baja reactividad de las células. También se observa activación de las células DN en el grupo 2 (paciente 8), vía IL-10 y en el grupo 3 (paciente 16) vía IL-4. En menor grado, también se observa activación de los linfocitos CD4+CD8+ dobles positivos, en paciente 3 vía IL-4 y en paciente 10 vía IL-10. Los valores registrados para el marcador CD107a (proteína de membrana asociada a lisosomas 1) nos indican que ha habido degranulación celular, lo cual coincide con la activación de otros marcadores estudiados (Figura 14). Sin embargo, el haber encontrado activación para el marcador CD107a en un único paciente se debe a que las condiciones de incubación utilizadas para ese marcador no fueron óptimas. Figura 14. En esta figura se representan los valores de activación registrados en las distintas subpoblaciones estudiadas de cada grupo de pacientes. A continuación, atendiendo a los datos de activación linfocitaria se muestra la proporción de pacientes en tanto por 1 de las distintas poblaciones en función del marcador de activación estudiado. 0 1 2 3 4 5 6 7 2 3 5 6 8 101116 2 3 5 6 8 101116 23568101116 2 3 5 6 8 101116 % células activadas CD4+ CD8+ CD4+CD8+ CD4-CD8Estimulación mediante péptidos INFγ IL-4 IL-10 CD107a 88 3.1.4. Análisis activación IFN-y Figura 15. En esta figura se observan los valores de activación registrados de IFN-γ en las distintas subpoblaciones estudiadas de cada grupo de pacientes. Los datos se han representado en tanto por 1.  Población CD4-CD8Se apreció activación en 1 paciente (25%) del grupo 1. 3.1.5. Análisis activación IL-4 Figura 16. En esta figura se observan los valores de activación registrados de IL-4 en las distintas subpoblaciones estudiadas de cada grupo de pacientes. Los datos se han representado en tanto por 1. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 IFN-y Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 IL-4 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 89  Población CD8+ Observamos activación en 1 paciente (25%) del grupo 1 y en 1 paciente (33%) del grupo 3.  Población CD4+CD8+ En este caso, se detectó activación en 1 paciente (25%) del grupo 1.  Población CD4-CD8Hemos registrado activación en 2 pacientes (50%) del grupo 1 y en 1 paciente (33%) del grupo 3. 3.1.6. Análisis activación IL-10 Figura 17. En esta figura se observan los valores de activación registrados de IL-10 en las distintas subpoblaciones estudiadas de cada grupo de pacientes. Los datos se han representado en tanto por 1.  Población CD8+ Observamos activación en 1 paciente (33%) del grupo 3.  Población CD4+ Hallamos activación en 1 paciente (33%) del grupo 3.  Población CD4+CD8+ Encontramos activación en 1 paciente (33%) del grupo 3.  Población CD4-CD80 0,2 0,4 0,6 0,8 1 IL-10 Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 96 en condiciones de incompatibilidad genética donante/receptor para el gen de la GSTT1, sino también su capacidad de activarse por distintas vías cuando son expuestos a su antígeno. Hemos encontrado que, además de las poblaciones clásicas CD4+ y CD8+, existen otras subpoblaciones dobles positivas CD4+CD8+ y dobles negativas CD4-CD8-, estas últimas descritas como reguladoras, cuya importancia en rechazo/tolerancia del injerto no está bien establecida. Sorprendentemente, las células DN alo-específicas para GSTT1 aparecen muy representadas en los pacientes estudiados por lo que tendremos que valorar en el futuro qué papel están jugando en la hepatitis inmune de novo, ya reconocida como un proceso de rechazo, denominado rechazo rico en células plasmáticas. DISCUSIÓN ______________________________________________________________________ 100 Discusión En este apartado vamos a discutir los diferentes resultados obtenidos, siguiendo el mismo orden que establecimos para los objetivos al inicio del estudio. Objetivo 1. Explorar la distribución celular de la proteína GSTT1 y estudiar la implicación de los anticuerpos GSTT1 específicos en el fracaso del órgano trasplantado. Cuando nuestro grupo describió que todos los pacientes con hepatitis “autoinmune” de novo estaban en condiciones de incompatibilidad para los alelos de la GSTT1 con su donante y que todos presentaban anticuerpos específicos para este antígeno expresado solo en el injerto, empezamos a sugerir la idea de que se trataba de un rechazo y no de un proceso autoinmune de novo (Aguilera I, y col., 2001). En la última actualización de los criterios de Banff, tras reunión de los expertos en Barcelona en el año 2016, se considera como un rechazo mediado por anticuerpos denominado “plasma cell-rich rejection” basado en la incompatibilidad GSTT1 con mención a los anticuerpos antiGSTT1 pero sin considerarlos aún requisito imprescindible hasta que otros grupos lo validen (Demetris AJ y col., 2016). A pesar de que GSTT1 se trata de una proteína citoplasmática, hemos podido demostrar que puede localizarse en la membrana celular. Aunque únicamente el 0,2% del total de células estudiadas presentaron doble marcaje GSTT1/marcador de membrana, no hay que olvidar que estás células se encontraban en unas condiciones fisiológicas óptimas. Desde nuestro punto de vista, un ambiente de alto estrés oxidativo provocaría en las células hepáticas mayoritarias, los hepatocitos, un aumento en la expresión de las enzimas detoxificadoras, entre ellas GSTT1. De esta forma un mayor número de células hepáticas presentará la proteína a nivel de la membrana celular, permitiendo su reconocimiento por parte de los anticuerpos anti-GSTT1 específicos, los cuáles a través de mecanismos como la activación del sistema del complemento, provocarán daño tisular con el consiguiente rechazo del injerto. Dada la enorme relevancia que han adquirido los anticuerpos anti-GSTT1 en nuestra patología, decidimos estudiar las distintas subclases de IgG de estos anticuerpos presentes en el suero de los pacientes. Encontramos que las subclases IgG1 e IgG4 fueron las únicas subclases representativas en todos los pacientes, independientemente de que hubiesen desarrollado la patología (Aguilera I y col., 2016). El hecho de haber encontrado niveles elevados de anticuerpos anti-GSTT1 específicos de la subclase IgG4 en la mayoría de los pacientes de estudio resulta muy llamativo, ya que a pesar de ser un anticuerpo descrito como no fijador de complemento, está subclase está relacionada con diversas patologías, especialmente de naturaleza autoinmune, como por ejemplo la 101 pancreatitis autoinmune tipo 1 (Deshpande V y col., 2011; Okazaki K y col., 2011). Por tanto, no está claro el papel que juega está subclase de anticuerpo en nuestra patología de estudio. Sin embargo, el papel de la alo-reactividad humoral en el trasplante hepático aún no está esclarecido. Desde los inicios del trasplante hepático, el hígado ha sido considerado como un órgano inmunológicamente privilegiado con resistencia relativa al rechazo (Calne RY, Binns RM, Millard PR y col., 1967). La capacidad tolerogénica del hígado no solo se limita a la alo-inmunidad celular, sino que también parece extenderse a la inflamación mediada por anticuerpos. Se han propuesto varios mecanismos responsables de conferir estas propiedades tolerogénicas al hígado. Es probable que múltiples vías actúen coordinadamente para evitar el rechazo del injerto (Cheng EY y Terasaki PI, 2015). Entre los mecanismos que se postulan podemos mencionar la posibilidad del hígado de secretar antígenos HLA de clase I solubles (Davies HFS, Pollard SG y Calne RY, 1989). Además, el hígado tiene una enorme capacidad para absorber o neutralizar aloanticuerpos dirigidos contra antígenos HLA (Gugenheim J, Amorosa L, Gigou M y col., 1990). La inflamación mediada por alo-anticuerpos puede ocurrir en el injerto hepático, particularmente en presencia de anticuerpos donante-específicos anti-HLA de clase II (Cheng EY, 2017). Muy recientemente se ha descrito un nuevo antígeno implicado en el rechazo agudo del injerto renal (Steers y col, 2019). Se trata del gen LIMS1. La situación a nivel genético es muy similar a lo que ocurre con la GSTT1, donde el receptor es portador de alelos delecionados en homocigosis y recibe un órgano de un donante que tiene al menos un alelo normal. La similitud va más allá dado que se trata de una proteína citoplasmática, expresada en las células epiteliales de los túbulos renales. Por tanto, la gran pregunta sin resolver en ambos casos sigue siendo en qué momento y bajo qué condiciones estas proteínas quedan expuestas en la membrana plasmática para que pueda ser reconocida y se desencadene el rechazo mediado por anticuerpos. Curiosamente, los anticuerpos anti-LIMS1 pertenecen a las subclases IgG2 e IgG3, justo lo contrario de lo que hemos descrito para GSTT1. Objetivo 2. Determinar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a la proteína GSTT1 En nuestra hipótesis planteamos que la respuesta celular T juega un papel muy importante en el desarrollo de la patología y posterior rechazo del injerto. El rechazo mediado por células T aparece ampliamente descrito en la bibliografía como por ejemplo en el trasplante renal (Halloran PF, 2010; Randhawa P, 2015; Balaha M y col., 2019). Debemos mencionar que la tecnología empleada en nuestro abordaje experimental, a pesar ser ampliamente utilizada en multitud de trabajos científicos (Monti P y col., 2008; Giuliani L y col., 2009; Freed BM y col., 2011) presenta una enorme complejidad técnica. En nuestro caso, algunas de las combinaciones HLA clase II-péptido no pudieron ser sintetizadas como tetrámero. A pesar de ello, tras analizar los resultados obtenidos podemos determinar que tanto pacientes del grupo 1 (pacientes con la patología) como pacientes del grupo 3 (pacientes que sólo muestran la condición de riesgo) presentan reactividad en clase I con el pentámero A*01. 102 Esto concuerda con nuestra hipótesis, ya que los pacientes del grupo 3, al carecer de anticuerpos anti-GSTT1, no disponen de linfocitos B alo-específicos que actúen como células presentadoras de antígeno, a pesar de presentar linfocitos T alo-específicos. Por tanto, hemos conseguido demostrar la presencia de linfocitos T alo-específicos frente a una secuencia específica de la proteína diana en combinación con una molécula MHC concreta en células de pacientes. Objetivo 3. Dilucidar el papel que desempeñan los linfocitos T específicos de GSTT1 en el rechazo del injerto. Las células T memoria constituyen el mayor impedimento para la supervivencia del trasplante a largo plazo. Si las células T reguladoras pueden o no controlarlas continúa siendo un enigma. Hay numerosas referencias en la literatura en las que se realiza una determinación de activación linfocitaria frente a péptidos, ya sean virales (Kern F y col., 2000; Roque-Cuéllar MC y col., 2011), donde los tiempos de incubación son más cortos (6 horas), o péptidos procedentes de proteínas humanas (Kalache S y col., 2008; Ma Y y col., 2006), en los que se amplían considerablemente esas incubaciones (48 horas-una semana). En el estudio de estimulación mediante péptidos de GSTT1 se aprecia que la activación se concentra principalmente en los grupos 1 y 3. Al analizar los datos obtenidos, no se observó activación en ninguna de las rutas clásicas mediadas por IFN-γ (Tc1 y Th1). Sin embargo, se registró actividad vía IFN-γ en la subpoblación CD4-CD8correspondiente a pacientes del grupo 1. En cuanto a la liberación de IL-4, se detectó activación de la ruta Tc2 en pacientes del grupo 1 y del grupo 3. Además, tanto la subpoblación CD4-CD8de pacientes del grupo 1 y del grupo 3 como la subpoblación CD4+CD8+ de pacientes del grupo 1 mostraron actividad vía IL-4. Respecto a la citoquina IL-10, este marcador se registró en la subpoblación CD8+ de pacientes del grupo 3. También se detectó en la subpoblación CD4+ de pacientes del grupo 3, en las subpoblaciones CD4-CD8de pacientes del grupo 1 y del grupo 2, así como en la subpoblación CD4+CD8+ de pacientes del grupo 3. En un estudio realizado por Villani y col., observaron que la subpoblación CD4-CD8presentaba un incremento de la expresión de IL-10 al ser estimulada por el parásito Trypanosoma cruzi (en su forma parasitaria humana de tripomastigote) (Villani FN y col., 2010) y en la subpoblación CD4+CD8+. Los trabajos de Eljaafari y col., aportan datos similares en un grupo de pacientes con enfermedad injerto contra huésped. Tras la estimulación con una línea celular linfoblastoide inmortalizada por infección del virus de Epstein-Barr, la subpoblación CD4+CD8+ produce mayores niveles de IL-10 (Eljaafari A y col., 2013). Como hemos mencionado anteriormente, se registró activación en la subpoblación CD4-CD8- (DN). Se trata de un grupo celular muy interesante cuya proporción está descrito en la literatura que no supera el 5% de la población total linfocitaria, aunque nosotros hemos encontrado pacientes con proporciones superiores a este número que van de 5,2 a 14,1% del total. 103 El modo de acción de las células T DN y su contribución a la tolerancia de manera antígenoespecífica ha sido estudiado en varios escenarios, sobre todo en modelos murinos de enfermedades autoinmunes como la diabetes. Las células DN pueden eliminar no solo linfocitos T específicos sino también linfocitos B activados presentadores del antígeno afín (Zhang ZX y col., 2006). Se ha demostrado que la IL-10 limita la expansión de DN inmunoreguladoras en ratones diabéticos, hecho que está asociado a una mayor tasa de apoptosis en estas células (Hillhouse EE y col., 2010). Las células T DN exhiben un potencial inmunoregulador que es único y específico de antígeno. Este papel se describió por primera vez hace 30 años cuando (Strober S y col., 1989) clonaron DN de ratón y posteriormente demostraron su actividad supresora en un cultivo mixto linfocitario. Ese mismo año, en piel humana, se identificaron estas células (Groh V y col., 1989). Años más tarde (Zhang ZX y col., 2000) fueron los primeros en demostrar la capacidad de DN de promover tolerancia a injertos con incompatibilidad MHC de forma antígeno-específica. Posteriormente, este mismo grupo demostró que las T reguladoras DN suprimen de forma eficaz a las células T CD4+CD8+ efectoras y las CD8+ memoria, pero son incapaces de suprimir las CD4+ memoria (Su Y y col., 2014). Desde entonces, se ha visto que la capacidad supresora de las DN se extiende a células NK (He KM y col., 2007; Su Y y col., 2012), linfocitos B (Zhang ZX y col., 2006; Ma Y y col., 2008; Hillhouse EE y col., 2010; Ford McIntyre MS y col., 2011) y células dendríticas (Gao JF y col., 2011). En el contexto de enfermedad de injerto contra huésped, se ha visto que los niveles de células CD4-CD8CD45RO+ se correlacionan con más severidad en EICH crónica. Se documentaron niveles bajos en el momento del diagnóstico de EICHc, momento en el que los niveles de BAFF en suero y las células B aumentaron. Estos resultados apoyan la idea de que los linfocitos T DN tienen el potencial de eliminar linfocitos B, ejerciendo así una acción inmunoreguladora, de forma que si los niveles se mantienen altos se podría prevenir el comienzo de EICHc (Hillhouse EE y col., 2019). Nosotros hemos cuantificado el número de células DN respecto al total de células CD3+CD56de sangre periférica en estos pacientes, aunque la muestra no corresponde al momento del diagnóstico sino a muestras extraídas años después en pacientes que reciben no solo inmunosupresión estandarizada sino que además, a aquellos diagnosticados con hepatitis inmune de novo se les administra terapia adicional con consiste en esteroides. Incluso en estas condiciones de inmunosupresión, observamos niveles más altos de DN en la mayoría de pacientes respecto a lo descrito para la población sana. Además, algunas de estas células antígeno-específicas se activan bajo estímulo de la GSTT1 in vitro por lo que cabe pensar que, en condiciones fisiológicas, están ejerciendo su acción supresora frente a otras células antígeno-específicas presentes en los pacientes. Las células DN provienen mayoritariamente de células CD4+. Esta nueva ruta de diferenciación descrita por (Zhao X y col., 2016) es capaz de inclinar la balanza hacia una respuesta reguladora en vez de una respuesta desfavorable. La combinación de sus características fenotípicas y su propiedad reguladora especifica de antígeno frente a diferentes tipos celulares, ha impulsado a los investigadores a examinar el papel que pueden tener en varios modelos de enfermedad y 104 su potencial terapéutico. Se ha estudiado en los ámbitos de tolerancia al injerto, enfermedades autoinmunes y EICH. Dichas células fueron aisladas y caracterizadas en humanos en 2005 (Fisher K y col.) y se ha visto que comparten muchas de las propiedades de sus homólogas murinas, incluyendo la secreción de IFN-γ y la adquisición del alo-antígeno de las APCs del donante, seguido de reconocimiento y muerte de células T CD8+ activadas, específicas para el mismo alo-antígeno. La mayor parte de los conocimientos sobre el papel de DN humanas en tolerancia en trasplante proviene de estudios con pacientes trasplantados de médula ósea en los que se observó una correlación inversa entre la frecuencia de DN circulantes y la gravedad de EICH (McIver Z y col., 2008). Estas células pueden presentar varias funciones. Por un lado, pueden actuar como célula inmunorreguladora, llevando a cabo la supresión de linfocitos T tanto CD4+ como CD8+ a través de los sistemas Fas/FasL o granzima/perforina. Por otro lado, pueden promover la respuesta inmunitaria liberando citoquinas propias de los linfocitos T CD4+ colaboradores como por ejemplo: IL-17, IL-4, IFN-γ y TNF-α (D´Acquisto F y Crompton T, 2011; Hillhouse EE y Lesage S, 2013; X Lu y col., 2016). Por último, atendiendo al análisis de activación global respecto al marcador memoria CD45RO, hemos detectado que dentro de las distintas poblaciones de estudio que se activan al estimular con los péptidos de GSTT1 (CD8+, CD4+ y CD4-CD8-) existe una subpoblación efectora no memoria (CD45RO-). Esta subpoblación podría corresponder a las denominadas células Temra (Células T efectoras memoria RA+), aunque habría para confirmarlo en futuros estudios, incluyendo el marcador RA. Esta subpoblación celular se encuentra en una etapa del ciclo de diferenciación muy avanzada, por lo que expresan marcadores de senescencia. El efecto de un estímulo antigénico prologando en el tiempo, como sería la exposición al antígeno GSTT1 en pacientes trasplantados, provoca la diferenciación hacia este estadio celular, por ejemplo en infecciones crónicas por citomegalovirus. Entre sus funciones destaca la liberación de grandes cantidades de IFN-γ, como mecanismo de respuesta rápida a re-infecciones. Además, estás células presentan un tiempo de vida media muy corto, ya que su tasa de recambio está establecida en torno a 20 días (Macallan DC y col., 2004; Willinger T y col., 2005; Mahnke YD y col., 2013; Larbi A y Fulop T, 2014; Verma K y col., 2017; Tian Y y col., 2017; Martin MD y Badovinac VP, 2018). 112 Bibliografía Aguilera I, Sousa JM, Gavilan F, Bernardos A, Wichmann I and Nuñez-Roldan A. Antibodies against Glutathione S-transferase T1 (GSTT1) in patients with de novo immune hepatitis following liver transplantation. Clin Exp Immunol 2001; 37:3968-3969. Aguilera I, Sousa JM, Gavilan F, Bernardos A, Wichmann I and Nuñez-Roldan A. Glutathione-Stransferase T1 mismatch constitutes a risk factor for de novo immune hepatitis after liver transplantation. Liver Transpl 2004; 10:1166-1172. Aguilera I, Wichmann I, Gentil MA, Gonzalez-Escribano MF and Nuñez-Roldan A. Alloimmune response against donor Glutathione-S-transferase T1 antigen in renal transplant recipients. 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However, not all the patients were included in the same ELISA plate; therefore, the titers cannot be compared among them. These secondary antibodies have been used in previous studies with serum samples from hematopoietic stemcell-transplanted patients, and they all work well in this ELISA assay. Immunohistochemistry for IgG4-expressing plasma cell detection Three-micrometer-thick sections of formalin-fixed, paraffin-embedded biopsy samples were deparaffinized and rehydrated. For antigen retrieval, slides were heated in a microwave for 20 min in a citrate buffer (10 mM citric acid and 0.05% Tween-20, pH 6.0), cooled, and rinsed in distilled water. Sec-tions were processed with EnVision+System-HRP (DAB) following manufacturer’s instructions (Dako North America Inc, CA, USA). Mouse monoclonal antihuman IgG4 antibodies (HP6025, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA) were added at 1:500 dilution during 1 h at room temper-ature. Visualization of the immunoreaction was completed with 3,30 - diaminobenzidine (DAB) as the peroxidase chromogenic substrate. The slides were then counterstained with hematoxylin and mounted with di-n-butyl phthalate in xylene (BHD Laboratories, Poole, UK). Results Characteristics of the patients Eighteen patients with the GSTT1 mismatch (donor+/recipient-) were selected due to their condition of GSTT1 antibody producers. Twelve of them had been diagnosed with de novo IH (patients 1–12, Table 1) and six had been not (patients 13–18, Table 1). Initial immunosuppres-sion consisted of cyclosporine A (Sandimmune or Neoral)—except for patient 17 that had tacrolimus instead— steroids and either azathioprine or mofe-til mycophenolate. Biopsy findings were important for differential diagnosis of de novo IH, but histo-logical signs were frequently not distinctive enough and, in our hospital, the ultimate diagnosis relied on the assessment of GSTT1 donor/recipient mismatch, detection of specific GSTT1 antibodies, and a good response to steroid treatment. Most of the 12 patients with GSTT1 antibody-associated hepatitis (de novo IH) were diagnosed between the first and the second year post-transplant; mean 19.7 months (8–35). Patients 3, 6, and 10 have been excluded from this estimate because the real time of onset was not known due to lack of medical GSTT1 subclasses and de novo immune hepatitis records or availability of earlier biopsy/serum samples (Table 1). IgG subclass characterization of Glutathione S-transferase T1 antibodies Distribution of the IgG-GSTT1 antibody subclasses is shown in Table 2. Fifty-six serum samples from 18 patients were retrospectively studied. The predominant subtypes were IgG1-GSTT1 and IgG4GSTT1, although traces of other subclasses were also found. Apparently, there were not obvious differences in the subclass repertoire between the group of patients diagnosed with de novo IH and those that did not develop the disease. Serum IgGGSTT1 antibody subclasses change over time and eventually disappear as it happened with IgG1-GSTT1 in patients 3, 6, and 7, or IgG4-GSTT1 in patients 1 and 2 (Table 2, Fig. 1). A third situation was observed in which only one subclass could be detected in all the samples of the same patient; for instance, patients 5 and 8 only had IgG1-GSTT1 or patients 14 and 15 with only IgG4-GSTT1 (Table 2, Fig. 1). The fact that patients 12 and 14 (both females) displayed high titers of antibodies in their pre-transplant serum samples can be explained by sensitizing events such as transfusions and pregnancies (5). IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 ratio at diagnosis of de novo IH Considering that the first symptoms of de novo IH usually appear within the first 2 yr after the transplant and occasionally during the third year but never beyond that date, we aimed to analyze the IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 ratio in serum samples from close to the time of diagnostic biopsies or at comparable time points in the patients without the disease. Those patients whose early posttransplant serum samples were not available (3, 6, 10, 16, and 18) were excluded from the analysis. Serum IgG1-GSTT1 was higher than IgG4-GSTT1 at the time of diagnosis in 7 of 9 patients (Fig. 2). When we looked at the ratio in the non-diagnosed group of patients, we observed that serum IgG1-GSTT1 level was never higher than IgG4-GSTT1 in comparable early posttransplant samples (Fig. 2). IgG4-expressing plasma cells in liver biopsy Immunohistochemistry studies were performed in 10 available biopsies, 5 of them coinciding with de novo IH diagnosis. Biopsies from patients with de novo IH showed significantly higher number of IgG4expressing plasma cells than those without 213 Aguilera et al. A B Fig. 1. Anti-GSTT1 ab levels of the IgG1 (A) and IgG4 (B) subclasses in serum samples of 18 patients included in this study: 1–12 with de novo IH and 13–18 without de novo IH. Samples of the same patient have been processed together in the same ELISA assay so that changes in ab-titers can be compared. Presence but not titer of anti-GSTT1 ab is important for diagnosis. A B Fig. 2. (A) Anti-GSTT1 IgG subclass profile at the time of diagnosis in nine patients with de novo IH and similar time point samples in patients who did not develop the disease. (B) Percentages of IgG1 and IgG4 are shown. In general, the patients with de novo IH have IgG1 as the major subclass with the exception of patients 7 and 12 whereas among the non-diagnosed patients, IgG4 is the most abundant subclass. Note that patients 3, 6, 10, 16 and 18 are not included in this graphic due to the fact that de novo IH is diagnosed within the first 3 yr and the first samples from these patients were obtained later than 4.5 yr post-transplant. the disease (mean 28.52 vs. 5.55 cells/hpf), although there was one IgG4 negative biopsy and one with very low number of IgG4 + cells/hpf among the patients with the disease (patients 5 and 8, respectively). This result is consistent with the absence of IgG4-GSTT1 in serum samples extracted around the same time (Table 2). Representative immunostaining of biopsies from 4 patients with de novo IH is shown in Fig. 3. Two of them are diagnostic biopsies (patients 1 and 12), a third one was obtained 5 months prior to de novo IH and was informed as chronic hepatitis (patient 7) and the last one corresponds to an acute rejection episode, 11 months before de novo IH diagnosis (patient 9). The results show different degrees of IgG4-positive cells, which are detailed in Table 1. The mean values vary from 1.6 to 142.5 IgG4 + cells/ hpf in the portal areas. Two additional biopsies from patients with the GSTT1 mismatch and 214 GSTT1 subclasses and de novo immune hepatitis Fig. 3. On the left part of the figure IgG4positive plasma cells in portal areas of liver biopsies in patients with de novo IH: P1 and P12 are diagnostic biopsies; P7 was informed as chronic hepatitis 5 months prior to de novo IH diagnosis; P9 corresponds to an acute rejection episode 10 months after the transplant and 11 months before de novo IH. On the right part of the figure, the same biopsies stained with CD138. In P12 the membrane of the hepatocytes (CD138 is also expressed in normal hepatocytes) is also stained. In all the cases CD138+ plasma cells were abundant in the portal areas. GSTT1 antibodies but with a diagnosis of chronic rejection were also tested. Patients 15 and 17 had mean values of 8.3 and 2.8 IgG4 + cells/hpf in the portal areas (not shown). Immunologic staining for plasma cells with CD138 showed massive plasma cell infiltration in all the biopsies analyzed except one. Discussion In the present study, we have analyzed the possible role of the IgG subclasses among specific GSTT1 antibodies in de novo IH. To clarify this issue, a group of 18 patients was studied, 12 with a diagnosis of de novo IH and 6 that did not develop the disease. We found that IgG1-GSTT1 and IgG4GSTT1 were basically the only subclasses represented in all the patients, regardless of de novo IH status, while the other subclasses were practi-cally absent. Contrary to our expectations, there were no obvious differences in the subclass reper-toire between de novo IH and non-de novo IH patients, but there was one disparity in the proportion of IgG1-GSTT1/IgG4-GSTT1 at the time of diagnosis with higher levels of IgG1 in seven of the patients diagnosed with de novo IH as opposed to none in the non-diagnosed patients. A similar situation has been already described in patients with 215 Aguilera et al. antithyroid peroxidase (TPO) antibodies that developed chronic thyroiditis or hypothyroidism, both with higher levels of anti-TPO IgG1 (6, 7). IgG1 are complement fixing antibodies, and it was not surprising their possible involvement in a pathological process. However, the finding of IgG4GSTT1 antibodies highly represented in most of the patients was completely unexpected and generated many questions about their role as donor-specific antibodies. These results led us to investigate a possible relationship with IgG4-related diseases. Even though IgG4-GSTT1 are alloantibodies, de novo IH has many phenotypic similarities with an autoimmune process and, in general terms, IgG4-related dis-eases are considered autoimmune diseases. It was tempting to analyze similarities with other studies although the majority of them belong into the field of autoimmunity and much less is known in the context of transplantation. IgG4-related disease is a systemic inflammatory process characterized by a dense lymphoplasmacytic infiltrate with presence of IgG4bearing plasma cells, storiform fibrosis, and frequent elevation of serum IgG4 levels. Two types of what was originally defined as “autoim-mune pancreatitis” have now been recognized as two different entities, being type 1 a prototypical manifestation of IgG4related disease (8, 9). IgG4 isotype is present in healthy human serum in 3–5% of the total IgG amount, does not fix complement, and is able to cross the placental barrier (10). Although IgG4 has been considered during the past 15 yr a benign antibody with an anti-inflamma-tory role, this concept has been carefully reviewed and a large number of IgG4-related diseases have been reported in the literature (11, 12). In fact, there was a symposium held in Boston where international experts set up a consensus guideline for the diagnosis of IgG4-related diseases (13). In general, most of the publications refer to IgG4 as serum or tissue immunoglobulins with unknown antigen specificity, but there are other reports where antigen-specific IgG4 are described. In a pioneer report about endemic pemphigus foliaceus, deposition of IgG4 on skin lesions was observed and passive transfer of IgG4 against cell adhesion desmoglein from the patients to mice triggered the disease (14). ADAMTS13 (a disintegrin-like and metalloprotease with thrombospondin type 1 motif) antibodies are involved in thrombocytopenic purpura, with IgG4 followed by IgG1 subclasses leading the immune response (15). Perhaps, the most important evidence comes from a disorder called myasthenia gravis, in which 15% of the patients have anti-MuSK (muscle-specific kinase) antibodies mostly of the IgG4 subclass. Experiments in mice have revealed that MuSK IgG4 induce severe muscle weakness in the mice upon passive transfer of IgG4 but not IgG1-3 antibodies (16). In patients with MuSK, myasthenia gravis subclass switch from IgG4 to IgG1 was observed in a patient going into clinical remission (17). In the transplant setting, very little is known about the role of IgG4-specific antibodies. In kid-ney transplantation, a recent study has shown that antiendothelial cell antibodies of the IgG2 and IgG4 subclasses were enriched in patients with kid-ney rejection (18). Regarding liver transplantation, two reports have linked de novo AIH to serum IgG4 (19) and IgG4-positive cells in a subgroup of patients with a more aggressive form of PCH (20). The authors suggested that IgG4-positive PCH probably represents a disorder distinct from IgG4-negative PCH. We have a similar dichotomy in our group of GSTT1-associated de novo IH, in which the majority of patients are positive for IgG4-GSTT1, but two patients only display IgG1GSTT1. The possibility that presence/absence of IgG4-GSTT1 antibodies might designate a clinical subgroup is intriguing, but we have not observed clear differences in disease severity or in patients’ outcome. Prolonged exposure to an antigen is one of the causes leading to a persistent IgG4-restricted response. In this sense, the GSTT1 protein is constitutively expressed in the donor liver and will always be recognized as foreign by the recipient’s immunological machinery. In fact, the treatment for de novo IH has to be maintained throughout life. This is to our knowledge the first description of antigenspecific IgG4 alloantibodies in liver transplantation, but the mechanisms leading to de novo IH are still unresolved. We have found that IgG1 has a strong presence among GSTT1 anti-bodies and might have a role in the initiation of the immune response. The finding of exceptionally high levels of IgG4 against a donor-specific antigen as the GSTT1 was completely unexpected and is very intriguing, but their possible role in de novo IH remains unknown. Acknowledgements This study was supported by the Spanish Ministry of Economy, Instituto de Salud Carlos III, grants 10/2332 and 11/ 857, and the Andalusian government, grants 07-CTS-02886 and PI0332-2007 from which MJ Martinez was a predoc-toral fellow. I Aguilera is a researcher from the Nicolas Monardes program. Authors’ contributions Isabel Aguilera designed the study, analyzed the data, and wrote the manuscript. Marıa Jose Martınez-Bravo and Antonio Jesus Pozo-Borrego performed the experiments and analyzed the data. Jose Manuel Sousa provided 216 samples, clinical records, and analyzed the data. Antonio Nunez~-Roldan obtained funding and contributed to write the manuscript. References 1. KERKAR N, HADZIC N, DAVIES ET et al. De-novo autoim-mune hepatitis after liver transplantation. Lancet 1998: 351: 409. 2. AGUILERA I, WICHMANN I, SOUSA JM et al. Antibodies against Glutathione S-transferase T1 (GSTT1) in patients with de novo immune hepatitis following liver transplantation. Clin Exp Immunol 2001: 126: 535. 3. A I,S JM,G F,B A,W GUILERA OUSA AVILAN ERNARDOS ICHI, N ~ -R A. Glutathione S-transferase T1 MANN UNEZ OLDAN mismatch constitutes a risk factor for de novo immune hepatitis after liver transplantation. Liver Transpl 2004: 10: 1166. 4. 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