ES 2 582 427 B1
19 OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA 11
21
Núme o de publicación: 2 582 427
Núme o de solici ud: 201500205
51 In . CI.:
A61K 31/505 (2006.01)
12 PATENTE DE INVENCIÓN B1
54 Tí ulo: Uso de la ec oína o sus de i ados como agen es an iin laman o ios y/o an ioxidan es en
en e medades causadas po la o macion de ag egados p o eicos
73 Ti ula /es:
UNIVERSIDAD DE SEVILLA (100.0%)
Vice ec o ado de T ans e encia Tecnológica.
Paseo de las Delicias s/n. Pabellón de B asil
41013 Se illa (Se illa) ES
72 In en o /es:
SALVADOR DE LARA, Manuel;
GARCÍA VALERO, Rosa;
ARGANDOÑA BERTRAN , Mon se a ;
VIZUETE CHACÓN , Ma ía Luisa;
VITORICA FERRÁNDEZ, F ancisco Ja ie ;
NIETO GUTIÉRREZ , Joaquín y
VARGAS MACÍAS, Ca men
22 Fecha de p esen ación:
10.03.2015
43 Fecha de publicación de la solici ud:
12.09.2016
Fecha de concesión:
06.07.2017
45 Fecha de publicación de la concesión:
13.07.2017
57 Resumen:
Uso de la ec oína o sus de i ados como agen es
an iin lama o ios y/o an ioxidan es en en e medades
causadas po la o mación de ag egados p o eicos.
La in ención p opone el uso de la ec oína y sus
de i ados como agen es an iag egan es y/o
an ioxidan es en células, p e e iblemen e neu onales.
La ec oína y sus de i ados se p oponen así como
compues os de u ilidad en la elabo ación de
medicamen os pa a la p e ención y/o a amien o de
la mue e celula causada po daño oxida i o y/o la
o mación de ag egados p o eicos, p e e iblemen e
in lamación en espues a a dichos ag egados, más
p e e iblemen e pa a la p e ención y/o a amien o de
en e medades neu odegene a i as, ales como
Alzheime . La in ención ambién p opo ciona las
concen aciones óp imas de ales compues os, así
como una posible ía de adminis ación.
Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP 11/1986.
A iso:
USO
DE
LA
ECTOINA
0
SUS
DERIVADOS
COMO
AGENTES
ANTIINFLAMATORIOS
Y/0
ANTIOXIDANTES
EN
ENFERMEDADES
CAUSADAS
POR
LA
FORMACION
DE
AGREGADOS
PROTEICOS
5
DESCRIPCION
La
p esen e
in enciOn
se
e ie e
al
uso
de
la
ec oina
y
sus
de i ados
como
agen es
an iag egan es
y
an ioxidan es
en
celulas.
Pa icula men e
es os
compues os
se
p oponen
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn
de
en e medades
causadas
po
la
10
o maci6n
de
ag egados
p o eicos,
p e e iblemen e
en e medades
neu odegene a i as,
las
cuales
cu san
con
da io
oxida i o
e
in lamaciOn
debida
a
la
o maciOn
de
dichos
ag egados.
Po
an o,
la
in encion
se
encuad a
en
el
campo
de
la
biomedicina
y
la
neu ologia.
15
ESTADO
DE
LA
TECNICA
Los
solu os
compa ibles
son
peque ias
moleculas
o ganicas
que
se
acumulan
en
la
mayo ia
de
los
o ganismos
ex emO ilos
en
espues a
a
di e en es
es eses
(es es
osmO ico,
e mico,
e c.).
Se
pos ula
que
el
e ec o
p o ec o
i
n
i
o
de
es as
moleculas
20
es
debido
a
su
capacidad
de
es abiliza
a
las p o einas
celula es.
En e
es as
moleculas
se
encuen a
la
ec oina
y
su
de i ado
hid oxilado,
la
hid oxiec oina.
Debido
a
su
na u aleza
bioes abilizado a
ambas
moleculas
se
come cializan
como
componen es
de
cosme icos,
undamen almen e
en
c emas
an i-en ejecimien o,
c emas
sola es,
champus,
e c.
Ac ualmen e
exis en
mas
de
200
p oduc os
de
25
cosme ica
en
el
me cado
que
con ienen
ec oina
y
algunos
de
ellos
solo
se
encuen an
de
yen a
en
a macias.
Ademas,
las
ec oinas
ambien
se
come cializan
en
soluciones
bioes abilizado as
pa a
la
p o ecciOn
de
enzimas
en
ensayos
de
labo a o io,
po
ejemplo,
en
ki s
pa a
PCR,
inmunoensayos,
soluciones
de
an icue pos,
soluciones
de
enzimas
como
pe oxidasa
y
os a asa
alcalina,
e c.,
ademas
de
p esen a
po enciales
30
aplicaciones
en
el
campo
de
la
biomedicina
(US8765691B2).
El
nOme o
de
en e medades
asociadas
a
una
o maci6n
p o eica
inco ec a,
donde
el
esul ado
del
plegamien o
anOmalo
es
una
es uc u a
ib ila
di e en e
Ilamada
"amiloide",
es
cada
ez
mayo .
Den o
de
es as
en e medades
un
subg upo
impo an e
35
son
las
en e medades
neu odegene a i as
como
la
en e medad
de
Alzheime ,
la
de
ES 2 582 427 B1
2
Hun ing on,
la
de
Pa kinson,
las
ence alopa as
espongi o mes,
la
escle osis
la e al
amio o ica
(ELA)
y
la
polineu opa ia
amiloido ica
amilia .
Du an e
muchos
albs
se
ha
es udiado
el
papel
de
la
in lamacion
en
la
en e medad
de
5
Alzheime
(Mo ales
I,
Guzman-Ma inez
L,
Ce da-T oncoso
C,
Fa as
GA,
Maccioni
RB,
2014.
Neu oin lamma ion
in
he
pa hogenesis
o
Alzheime 's
disease.
A
a ional
amewo k
o
he
sea ch o
no el
he apeu ic
app oaches.
F on
Cell
Neu osci.,
22;8:112).
Es a
in lamacion
apa ece
en
espues a
a
una
se ie
de
se iales
que
incluyen
lesiones, in ecci6n,
agen es
oxida i os
y
de e minados g ados
de
oligome izaciOn
de
10
la
p o eina
Tau
y
6
amiloide.
Pa ece
se
que
la
espues a
neu oin lama o ia
se
ac i a
en las
a eas
ci cundan es
a
la
o maci6n
de
la
placa
senil
y
libe a
se iales
p oin lama o ias
como
las
ci oquinas.
Conc e amen e,
den o
del
sis ema
inmune,
las
celulas
de
la
mic oglia
po
un
lado
agoci an
y
deg adan
el
6
amiloide
(Lee
CV.,
Land e h
GE.,
2010,
The
ole
o
mic oglia
in
amyloid
clea ance om
he
AD
b ain.
J
15
Neu al
T ansm.,
117: 949-960),
ac uando
como
un
sis ema
de
epa acion,
pe o
po
o o
lado,
pueden
se
esponsables
de
la
des uccion
de
ejidos
y
de
la
mue e
neu onal.
Asi,
en
unciOn del
balance
en e
se iales
ac i ado as
e
inhibi o ias,
la
mic oglia
pa icipa a
mas
en
la
inducciOn
de
la
mue e
neu onal
( a o eciendo
la
en e medad)
o
en
la
disminuci6n
de
los
ag egados
6
amiloide
(inhibiendo
el
desa ollo
20
de
la
en e medad).
Es
muy
in e esan e
esal a
que
la
agoci osis
del
6
amiloide
i
n
i
o
se
inhibe
cuando
es an
p esen es
ci oquinas p oin lama o ias
(Koenigsknech -Talboo
J.,
Land e h
GE.,
2005,
Mic oglial
phagocy osis
induced
by
ib illa
be a-amyloid
and
Ig
Gs
a e
di e en ially
egula ed
by
p oin lamma o y
cy okines,
J,
Neu osci.,
25:
8240—
8249).
Es
mas,
se ha
obse ado
una
mejo ia
en
la
pa ologia
del
Alzheime
en
a ones
25
cuando,
al
a a los
con
agen es
an iin lama o ios,
se
obse O
una
mejo a
de
la
espues a
agoci a ia
al
6 amiloide
(Heneka
MT.,
e
a
l
.
,
2005,
Acu e
ea men
wi h
he
PPARgamma
agonis
piogli azone
and
ibup o en
educes
glial
in lamma ion
and
Abe a1-42Ie els
in
APPV717I
ansgenic
mice,
B ain,
128:
442-453).
30
Po
o o
lado
exis en
nume osas
e idencias
que
elacionan
el
es es
oxida i o
y
las
en e medades
que
cu san
con
neu odegene aci6n,
como
la
en e medad
de Alzheime
o
la
en e medad
de
Pa kinson
(Ande sen
JK.,
2004,
Oxida i e
s ess
in
neu odegene a ion:
cause
o
consequence?,
Na
Med.,
10
Suppl:
S18-25).
De
hecho,
se
ha
elacionado
el
es es
oxida i o
con
la
al e acion
del
p ocesamien o
no mal de
la
35
p o eina
p ecu so a
del
6-amiloide
(APP)
(Mul haup
G.,
e
a
l
. ,
2002,
Possible
mechanisms
o
APP-media ed
oxida i e
s ess
in
Alzheime 's
disease,
F ee
Radic.
ES 2 582 427 B1
3
Biol.
Med.,
33:
45-51) o
la
os o ilacion
de
Tau
(Me
lo
S.,
e
a
l
. ,
2007,
Mi ochond ial
oxida i e
s ess
causes
hype phospho yla ion
o
au,
PLoS
ONE
2:
e536), p o einas
in imamen e
ligadas
a
la
en e medad
de
Alzheime ;
o
la
oligome izaciOn
de
la
a-
sinucleina
(Es e es
AR.,
e
a
l
. ,
2009,
Oxida i e S ess
in ol emen
in
alpha-synuclein
5
oligome iza ion
in
Pa kinsons
disease
cyb ids
An ioxid
Redox
Signal,
11:
439-448),
elacionada
con
la
en e medad
de
Pa kinson.
O o
hecho
a
ene
en
cuen a
es
que
el
a amien o
clinico
del
es es
oxida i o
educe
la
incidencia
y
la
se e idad
de
la
en e medad
de
Alzheime
(Es e es
AR.,
e
a
l
.
,
2009,
Oxida i e S ess
in ol emen
in
alpha-synuclein
oligome iza ion
in
Pa kinsons
disease
cyb ids,
An ioxid
Redox
Signal,
10
11:
439-448).
De
hecho,
hay
abajos
que
indican
el
uso
de
los
an ioxidan es
como
una
de
las
mejo es
e apias
p e en i as
pa a
es a
en e medad
(Zhao
B.,
2009,
Na u al
an ioxidan s
p o ec
neu ons
in
Alzheime 's
disease
and
Pa kinson's
disease,
Neu ochem.
Res.,
34:
630-638).
15
Todo
es o
sugie e
que una
molecula
con
p opiedades
an iag egan es
que,
adicionalmen e,
disminuya
el clan°
oxida i o,
se a
una
buena
candida a
como
a maco
en e
a
en e medades
neu odegene a i as
como
el
Alzheime
o
el
Pa kinson,
en
las
que
an o
el
es es
oxida i o
como
la
in lamaciOn
de i ada
de
la
ag egaci6n
p o eica
se
han
pos ulado
como
mecanismos
asociados
a
su
pa ologia.
20
La
p incipal
mani es aciOn
de
la
en e medad
de
Alzheime
y
o as
en e medades
neu odegene a i as
es
la
mue e
neu onal,
lo
que
p o oca
demencia
y
o as
al e aciones.
Se
pos ula
que
es a
neu odegene aciOn
iene
un
o igen
a iple,
en
el
que
pa icipan
di e en es
p ocesos
como
la
ag egacion
p o eica,
el
es es
oxida i o,
o
25
la
espues a
in lama o ia,
en e
o os,
y
que,
a
su
ez,
pueden
es a in e conec ados.
Debido
a
es a
e iologia
mUl iple
y
compleja,
las
al e na i as
a macolOgicas
de
p e encion
y
e apia
de
es e
ipo
de
en e medades
se
pod ian
abo da
con
mas
exi o
median e
la
u ilizaciOn
de
a macos que
ac uen
al
ni el
de
a ias
de
es as dis unciones
de
o ma
simul anea.
Asimismo,
es
deseable
encon a
la
concen acion
Op ima
de
30
ales
a macos,
la
cual
pe mi a
una
p e enciOn
y
a amien o
e ec i os
de
las
en e medades
neu odegene a i as
sin
Ilega
a
p o oca
oxicidad celula o
isula .
Po
p e e iblemen e
ales
a macos
han
de
se
capaces
de
a a esa
la
ba e a
hema oence alica
pa a
que,
as
su
adminis aci6n,
puedan
eje ce
su
e ec o
en
el
a ea
a ec ada.
35
ES 2 582 427 B1
4
DESCRIPCION
DE
LA
INVENCION
La
p esen e
in enciOn
p opone
el
uso de
la
ec oina
y
sus
de i ados
como
agen es
an iag egan es y
an ioxidan es
en
celulas,
p e e iblemen e neu onales.
La
ec oina
y
5
sus
de i ados
se
p oponen
como
compues os
de
u ilidad
en
la
p e encion
y/o
a amien o
de
la
mue e
celula ,
p e e iblemen e
mue e
neu onal,
mas
p e e iblemen e
en
en e medades
neu odegene a i as,
ales
como
la
en e medad
de
Alzheime ,
las
cuales
cu san
con
p ocesos
de
dem
oxida i o y
de
in lamaciOn
debida
a
la
o maci6n
de
ag egados
p o eicos.
10
En
la
p esen e
in enciOn
se demues a
que
la
ec oina
y
sus
de i ados
educen
la
mue e
neu onal
causada
po
es es oxida i o
en
un
modelo
neu onal
humano,
lo
que
p ueba
que
poseen
ac i idad
an ioxidan e
"in
i o"
(ejemplo
1,
Fig.
1).
Po
o o
lado,
se
demues a,
en
un
modelo
in lama o io
de
celulas
neu onales
de
mic oglia
de
a 6n
15
N13,
que
la
ec oina
iene
un
e ec o
p e en i o
de
la
in lamacion
de i ada
de
la
ag egaci6n
p o eica.
Es o
es
debido
a
que
la
ec oina
impide
que
los
mon6me os
de
13
amiloide
se
ag eguen
en
las
o mas
oligo ne icas
que
causan
la
espues a
in lama o ia
(ejemplo
2,
Fig.
2
y
3).
20
Ademas,
en
la
p esen e
in enciOn
se
demues a
"in
i o",
u ilizando
a ones
a
los
que
se
les
ha
inoculado ec oina
po
ia
pa en e al
en
el
pe i oneo,
que
es a
molecula
a a iesa
la
ba e a
hema oence alica
(BH),
ya
que
se
han
de ec ado
median e
HPLC
concen aciones
de
ec oina
en
di e en es
ejidos
del ce eb o
de
los
a ones
inoculados,
mien as
que
no
se
ha
de ec ado
en
los
a ones
con ol
(ejemplo
3,
Fig.
4).
25
En
esumen,
la
p esen e
in encion
demues a
que
la
ec oina
y
sus de i ados
poseen
un
e ec o
p o ec o
en e
al
dano
oxida i o
en
celulas
neu onales,
y
ade nas se
ha
comp obado
que,
e i ando
la
o maciOn
de
los
oligome os
p o eicos
esponsables
de
la
inducciOn
de
in lamaciOn,
p oducen
adicionalmen e
un
e ec o
p e en i o
de
la
30
in lamaciOn
neu onal.
Como
se
ha
mencionado
an e io men e,
en
algunas
en e medades
neu odegene a i as
como
Alzheime ,
Pa kinson,
ence alopa ias
espongi o mes
o
Hun ing on,
la
neu odegene acion
iene
un
o igen
mill iple,
en
el
que
pa icipan
di e en es
p ocesos
ales
como
la
ag egaci6n
p o eica,
el
es es
oxida i o
o
la
espues a
in lama o ia,
en e
o os,
y
que,
a
su
ez,
pueden
es a
in e conec ados.
35
El
hecho de
que
la
ec oina
y sus
de i ados
posean
a ias
p opiedades
de
o ma
simul anea
ales
como
(i)
an ioxidan e,
(ii)
an iag egan e,
Ile ando
asi
a
cabo
la
(iii)
ES 2 582 427 B1
5

p e enciOn
de
la
in lamaciOn inducida
en
espues a
a
ag egados
p o eicos,
y
(i )
que
sean
capaces
de
a a esa
la
ba e a
hema oence alica,
consiguiendo
Ilega
asi
a
las
egiones
ce eb ales
donde
eje ce an
su
e ec o
e apeu ico,
les
hacen buenos
candida os
pa a
se
u ilizados
an o
en
la
p o ilaxis
como
en
el
a amien o
de
es e
ipo
5
de
en e medades
u
o as
ambien
mul i ac o iales
en e
cuyas
causas
se
encuen en
las
an e io men e
mencionadas.
La
ec oina
y sus
de i ados
se
p oponen,
po
an o,
en
la
p esen e
in encion
como
compues os
an iag egan es
y
an ioxidan es
U iles
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn
10
de
en e medades
causadas
po
la
ag egacion
p o eica
en
las
celulas
o
que
cu san con
la
misma
como
son,
po
ejemplo
aunque
sin
limi a nos,
las
en e medades
neu odegene a i as.
Po
odo
ello,
en un
p ime
aspec o
la
p esen e
in enciOn
se
e ie e
al
uso
de
un
15
compues o
seleccionado
de
en e
ec oina
o
un
de i ado
de
ec oina
de
la
O mula
gene al
(I)
6
(II):
R
3
R
3
C
-
R
4
)
H
N
(
C
-
R
4
I
n
R
i
/
N
R
2
/
N
R
R
1
2
(I)
20
Donde:
R1
se
selecciona
de
en e
H
o
alquilo
(C1-C4),
R2
se
selecciona
de
en e
H,
-COOH,
-000-alquilo
(C1-C4)
o
—CONHR5;
donde
R3
se
selecciona
de
en e
H,
alquilo
(C1-C4),
un
aminoacido,
un
dipep ido o
un
ipep ido;
p e e iblemen e
R2
es
H
o
—COOH;
R3
y
R4
son
iguales
o
di e en es
y
se
selecciona de
en e
H
u
OH,
y
25
n
es un
alo
de
1,
2
O
3,
o
cualquie a
de
sus
sales
a maceu icamen e
acep ables,
pa a
la
elabo acion
de
un
medicamen o
pa a
el
a amien o
y/o
p e encion
del
deo
oxida i o
y
la
in lamacion
debida
a
la
ag egaci6n
p o eica
en
celulas.
0
al e na i amen e,
la
p esen e
in enciOn
30
se
e ie e
a
dicho
compues o
pa a
su
uso
como
medicamen o
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn
del
deo
oxida i o
y
la
in lamaciOn
debida
a
la
ag egacion
p o eica
en
ES 2 582 427 B1
6
celulas.
De
aho a
en
adelan e
se
ha d
e e encia
a
es e
medicamen o
como
"medicamen o
de
la
in enciOn".
Es e
compues o
seleccionado
de
en e
ec oina
o
un
de i ado
de
ec oina
de
la
o mula
5
gene al
(I)
6
(II)
es
po
an o
el
p incipio
ac i o
comp endido
en
el
medicamen o
de
la
in encion.
En
una
ealizaciOn
p e e ida,
n
es
2
y
cada
R3
es
de
mane a
independien e
H
u
OH.
En
una
ealizaciOn
mas
p e e ida,
Ri
es
H.
En
una
ealizacion
aun
mas
p e e ida,
R1
10
es
H
o
—CH3.
En
una
ealizacion
aim
mas
p e e ida,
R1
es
-CH3.
En
una
ealizaciOn
mas
p e e ida
el
compues o
es
la
ec oina.
En
o a
ealizacion
p e e ida
el
compues o
es
la
hid oxiec oina.
15
El
e mino
"ec oinas"
engloba
a
dos
compues os
e ahid opi imidinicos
ciclicos:
la
ec oina
(acid°
1,4,5,6- e ahid o-2-me il-4-pi imidinoca boxilico)
y
su
de i ado
hid oxilado,
la
hid oxiec oina
(acid°
1,4,5,6- e ahid o-5-hid oxi-2-me il-4-
pi imidinoca boxilico).
Ambas,
ec oina
e
hid oxiec oina,
son
jun o
con
la
be aina, los
solu os
compa ibles
mayo i a iamen e
sin e izados
po
bac e ias
halo ilas
G am
20
nega i as
he e O o as
y
ambien
po un amplio
nume o
de
bac e ias
G am
posi i as
halO ilas
mode adas
y
halo ole an es.
La
hid oxiec oina
suele
se
mas
comUn
en
bac e ias halo ilas
G am
posi i as
como
B
e
i
b
a
c
e
i
u
m
li
n
e
n
s
o
M
a
i
no
c
o
cc
u
s
h
a
l
o
p
h
il
u
s
,
aunque
ecuen emen e
es
sin e izado
en
can idades
meno es
jun o
a
la
ec oina en
mic oo ganismos
p oduc o es de
la
misma.
25
El
e mino
"alquilo"
se
e ie e,
en
la
p esen e
in enciOn,
a
cadenas
hid oca bonadas
sa u adas,
lineales
o
ami icadas,
que
ienen
de
1
a
4
a omos
de
ca bono,
po
ejemplo,
me ilo,
e ilo,
n-p opilo,
i-p opilo,
n-bu ilo,
e c-bu ilo,
sec-bu ilo,
e c.
P e e iblemen e
el
g upo
alquilo
iene
en e
1
y
2
a omos
de
ca bono
y
mas
30
p e e iblemen e
es
me ilo.
Po
"aminoacido"
se
en ienden
las
o mas
es e eisOme a, po
ejemplo
o mas
D
y
L
de
los
siguien es
compues os:
aspa agina,
a ginina,
acid°
aspa ico,
glu amina,
acid°
glu amico,
6-alanina,
y-aminobu i a o,
NE-ace ilisina,
Noace ilo ni ina,
Ny-
35
ace ildiaminobu i a o,
Na-ace ildiaminobu i a o,
his idina,
isoleucina,
leucina,
me ionina,
enilalanina,
se ina,
eonina
y
i osina.
Son
p e e en es
L-aminoacidos.
Los
ES 2 582 427 B1
7
5
es os
aminoacido
se
de i an
de
los
co espondien es
aminoacidos.
Son
p e e en es
los
siguien es es os
aminoacido:
Gly,
Ala,
Se ,
Th ,
Val,
(3-Ala,
y-aminobu i a o,
Asp,
Glu,
Asn,
Gin,
NE-ace illisina,
No-ace ilo ni ina,
Ny-ace ildiaminobu i a o,
Na-
ace ildiam
inobu i a o.
Los
es os
di-
o
ipep ido
son
amidas
de
acid°,
segim
su
na u aleza
quimica,
y
se
descomponen
en
la
hid olisis
en
dos
o
es
aminoacidos.
Los
aminoacidos
en
el
es o
di-
o
ipep ido
es an
enlazados
en e
Si
median e
enlaces
de
amida.
10
Las
sales,
compa ibles
desde
el
pun o
de
is a
isiolOgico,
del
compues o
de
la
o mula
(I)
o
(II),
son,
a
modo
de
ejemplo,
sales
alcalinas,
alcalino e eas
o
amOnicas,
como
sales
de
Na,
K,
Mg,
Ca,
ie ilamina
o
is-(2-hid oxi-e il)-amina.
O as
sales,
compa ibles
desde
el
pun o
de
is a
isiolOgico,
del
compues o
de
la
o mula
(I)
o
(II)
se p oducen
median e
eacci6n
con
acidos
ino ganicos,
como
acid°
clo hid ico,
acid°
15
sul U ico
y
acid°
os o ico,
o
con
acidos
o ganicos
ca boxilicos
o
sul onicos,
como
acid°
ace ic°,
acid°
ci ic°,
acid°
benzoico,
acid°
maleico,
acid°
uma ico,
acid°
a a ic°
y
acid°
p- oluenosul Onico.
Los
compues os
de
la
o mula
(I)
o
(II),
en
los
que
se
p esen an
g upos
basicos
y
acidos,
como
g upos
ca boxilo
o
amino
en
el
mismo
nume o,
o man
sales
in e nas.
20
Se
en iende
como
"celula"
a
la
unidad
mo ologica
y
uncional
de
odo
se
i o.
Den o
del
alcance
de
la
p esen e
in encion
se
incluyen
las
celulas
p oceden es
de
cualquie
ejido
del
o ganismo,
p e e iblemen e
celulas
del
sis ema
ne ioso
incluyendo
celulas
gliales
y
neu onas,
mas
p e e iblemen e
las
celulas
a
las
que
se
e ie e
la
p esen e
25
in encion
son
celulas
neu onales.
Las
"celulas
neu onales"
son
aquellas
celulas
ne iosas
cuya
p incipal
unci6n
es
la
exci abilidad
elec ica
de
su
memb ana
plasma ica.
Es an
especializadas
en
la
ecepcion
de
es imulos
y
la
conducci6n
del
impulso
ne ioso
en
o ma
de
po encial
de
accion,
en e
ellas
o
con
o os
ipos
celula es.
Es as
celulas
conducen
se iales
a
a es
del
axon, p olongacion
que
se
30
ex iende
desde
el
cue po
de
la
neu ona
hacia
ue a,
y
eciben
in o maciOn
a
a es
de
las
dend i as,
amas
de
la
celula
que
se
di igen
hacia
el
soma
o
cue po
neu onal.
Como
se
puede
ap ecia en
los
ejemplos
desc i os
mas
adelan e,
la
ec oina
eje ce
un
e ec o
an iag egan e,
impidiendo p og esi amen e
la
oligome izacion
pep idica
35
esponsable
de
desencadena
una
espues a
in lama o ia
en
las
celulas,
p e e iblemen e
neu onas,
en
pa ologias
asociadas
a
la
o macion
de
ag egados
ES 2 582 427 B1
8
p o eicos,
como
po
ejemplo
en
en e medades
neu odegene a i as.
Es
deci ,
la
ec o na eje ce
como
un
agen e
p e en i o
de
la
in lamaciOn
al
e i a
la
ag egaci6n
pep idica.
Po
ello,
en una
ealizaciOn
p e e ida,
el
medicamen o
al
que
se
e ie e
la
p esen e
in enciOn
es
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn,
mas
p e e iblemen e
5
p e encion,
de
la
in lamaciOn
que
se
p oduce
en
las
celulas,
p e e iblemen e
neu onales,
coma
consecuencia
de
la
o maci6n
de
ag egados
p o eicos
en
dichas
celulas.
Se
en iende
pa
"ag egados
p o eicos"
o
"ag egados
pep ldicos"
los
dep6si os
o
10
ag upaciones
p o eicas
que
se
o man
po
oligome izacion
de
p o einas
o
pep idos
esul an es
de un
inco ec o
plegamien o
o
p ocesamien o
p o eico,
po ejemplo
de
la
p o eina
p ecu so a
del
13-amiloide
(APP)
o de
la a-sinucleina.
Tales
deposi os
o
ag egados
son,
po ejemplo
aunque
sin
limi a nos,
ib as
o
placas
de
amiloide,
o illos
neu o ib ila es,
cue pos
de
inclusiOn,
e c.
Es os
ag egados
p o eicos
son
oxicos
y
15
es an
implicados
en
nume osas
en e medades
ales
como
las
en e medades
neu odegene a i as
incluyendo
Alzheime ,
Pa kinson,
Hun ing on,
ence alopa ias
espongi o mes,
escle osis
la e al
amio o ica
(ELA),
polineu opa ia
amiloidO ica
amilia
y
o as
no
neu odegene a i as
ales
coma
las
amiloidosis
sis emicas
y
las
amiloidosis
localizadas
como
la
diabe es
ipo
II.
Me odos
pa a
de ec a
la
p esencia
de
20
dichos
ag egados
p o eicos
celula es
son
comunmen e
conocidos
en
el
es ado
de
la
ecnica,
ales
coma
ecnicas
de
luo escencia
o
lase
de
mul i o ones.
Se
en iende
pa
"neu oin lamaciOn" o
"in lamacion
en
celulas
neu onales"
la
espues a
in lama o ia
o iginada
en
el
sis ema
ne ioso
cen al as
su i
una
lesiOn
Ile ando
a
25
una
acumulaciOn
y
ac i aciOn
de
celulas
gliales,
pa icula men e
as oci os y
mic oglia
en
la
zona
a ec ada.
Asimismo,
en
los
ejemplos
desc i os
mas
adelan e
se
demues a
que
an o
la
ec oina
como
sus
de i ados,
pa icula men e
la
hid oxiec oina,
p o egen
de
la
mue e
neu onal
30
p o ocada
po
clan°
oxida i o.
Se
en iende
po
"es es oxida i o"
o
"clan° oxida i o"
la
condicion
de
ci o oxicidad
que
es
consecuencia
de
un
desequilib io
en e
la
p oducci6n
de
adicales
lib es
y
la
capacidad
de
la
celula
de de ende se
con a
ellos,
pa
lo
que
es a
causada
pa un
inc emen o
en
la
o maci6n
de
dichos
adicales
lib es
o
pa
una
disminucion
de
los
agen es
que
ac Uan
coma
an ioxidan es,
o
pa
ambos
35
mo i os
conjun amen e.
Como
se
ha
mencionado
an e io men e,
se
ha
elacionado
el
es es
oxida i o
can
la
al e acion
del
p ocesamien o
no mal
de
la
p o eina
p ecu so a
ES 2 582 427 B1
9
la
iabilidad
celula
median e
el
es
WST-1
(Roche).
Pa a
ello
se
ealize)
una
cu a
de
concen aciones
c ecien es
de
cada uno
de
los
compues os
y
un
blanco
po
iplicado
en
es
expe imen os
independien es.
Ademas
se
de e mine)
la
oxicidad
in inseca
de
la
maxima
concen aci6n de
los
compues os
a
e alua .
5
La
medida
de
la
ac i idad
neu op o ec o a
se
ealizO
sob e
celulas
neu onales
humanas
some idas
a
es es
oxida i o
con
el
sis ema
xan ina/xan ina
oxidasa
(XX0),
ya
que
la
XXO
p oduce
aniones
supe 6xido
que
eaccionan
con
lipidos,
p o einas,
ca bohid a os
y
DNA
en
el
in e io
de
las
celulas
y
con
componen es
de
la
ma iz
10
ex acelula ,
esul ando
Oxico
pa a
es as.
Tambien
p oduce
pe Oxido
de
hid Ogeno
que,
en
p esencia
de
hie o,
o ma
adicales
hid oxilo
al amen e
Oxicos
pa a
las
celulas,
p o ocando
pe oxidacion
lipidica
y
mu aciones
en
el
DNA.
Todo
es o
p oduce
dans°
celula
y,
en
ul imo
e mino,
la
mue e
de
las
celulas.
De
es a
o ma
un
compues o
neu op o ec o impedi d
o
educi a
el
po cen aje
de
la
mue e
celula
15
p oducida
po
es e
ag eso .
Una
ez
some idas
las
celulas
a
es es
oxida i o
median e
XXO
y
cada
uno
de
los
compues os
a
e alua ,
pa a
pode
de e mina
el
e ec o
neu op o ec o
de
cada
uno
se
de e min6
la
iabilidad
celula
cuan i icando
la
ac i idad
me abolica
median e
el
es
20
WST-1
(Roche).
Es e
me odo
es a
basado
en
la
capacidad
de
las
celulas
de
ob ene
la
ene gia
necesa ia
pa a
man ene
sus
unciones
me abolicas
y
el
c ecimien o
celula .
Po
es e
mo i o,
las
celulas
que
es en
me abOlicamen e
ac i as
( i as)
educi an
las
sales
de
e azolium
a
o mazan median e
el
sis ema
succina o-
e azolium
educ asa
(de
la
cadena
espi a o ia
mi ocond ial)
y
el
o mazan
o mado
25
puede
se
de ec ado
colo ime icamen e,
mien as
que
en
las
celulas
muy
da iadas
o
mue as
no
se
p oduci a
es a
eacci6n.
P e iamen e
se
de e min6
la
concen acion
de
XXO
que
p oduce
la
mue e
del
50
%
de
las
celulas,
que
co esponde
con
la
concen aciOn
le al
50
(LC50),
siendo
es e
el
30
pa ame o
usado
pa a
induci
la
mue e
celula .
Se
ensaya on
los
compues os
Ec oina
e
Hid oxiec oina
a
concen aciones
de
3,
1,
0,2;
0,1;
0,02;
0,01;
0,002;
0,001
y
0,0001
mM
jun o
con
XXO
a
concen acion
igual
a
su
LC50
en
es
ensayos
po
iplicado.
Ademas
se
incluyo
un
con ol
posi i o
de
35
neu op o eccion
alidado
en
es e sis ema,
como
con ol
del
ensayo.
ES 2 582 427 B1
16

Los
esul ados
de
neu op o ecciOn
de
los
compues os
se
mues an
en
la
Figu a
1,
en
la
que
se
ep esen a
el
po cen aje
de
mue e
celula
ob enida
pa a
cada
concen acion
de
los
compues os
ec oina
e
hid oxiec oina
e e ida
a
la
mue e
p oducida
po
la
XXO.
5
Los
esul ados
mues an
un
compo amien o
de
p o eccion
simila
pa a
ambos
compues os,
consiguiendo
la
mayo
p o eccion
en e
0,001
y
0,01
mM
y
siendo
es a
de
39%+15%
(medias+SD),
aunque
el
ango
en
el
que
se
obse e)
p o ecci6n
e a
bas an e
ex enso,
(0,001
a
1
mM).
Pa a
el
con ol posi i o
de
p o ecciOn
se
ob u o
una
p o ecciOn
del
60%+20%
(da o
no
mos ado).
10
15
Los
compues os
se
ensaya on
has a
una
concen acion
maxima
de
3
mM,
concen aci6n
a
la
que
se
empez6
a
de ec a has a
un
10%
mas
de
oxicidad
que
con
)0(0,
po
lo
que
la
maxima
dosis
ole ada
(MTD,
concen acion
a
la
que
no
se
p oduce
mue e
celula )
es aba
po
debajo
de
3
mM.
Es os
esul ados
indican
que
an o
la
ec oina
como
la
hid oxiec oina
p o egen
de
la
mue e
neu onal
causada
po
da io
oxida i o,
po
lo
que
se
con o man
como
buenos
candida os
como
agen es
an ioxidan es
y
neu op o ec o es.
20
EJEMPLO
2.
EVALUACION
DE
LA
ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA
Y
NEUROPROTECTORA
DE LA
ECTOiNA
EN
LINEAS
NEURONALES
DE
RATON.
A)
Ac i idad
p e en i a
de
la
in lamaciOn
p oducida
po
la
aq eqacion
p o eica.
25
Los
cul i os
de
celulas
neu onales
N13
de
mic oglia
de
a an
se
u iliza on
como
modelo
celula
pa a
es udia
la
in lamacion.
En
es as
celulas
se
puede
induci
un
p oceso
in lama o io
incubandolas
con
di e en es
agen es
in lama o ios
y
pos e io men e
cuan i ica
la
exp esiOn
del
gen
que
codi ica el
ac o
de
nec osis
umo al
(" umo
nec osis
ac o ",
TNFa),
una
ci oquina
mul i uncional,
cuya
exp esion
30
suele
induci se
en
p ocesos
in lama o ios.
Dicha
ci oquina
es a
enca gada
del
con ol
de
la
p oli e acion
celula
(median e
la
degene aci6n
celula ),
jugando
un papel
c i ic°
en
las
pa ogenesis
de
en e medades
elacionadas
con
las
in lamaciones
c onicas. Si
es as
celulas
in lamadas
se
incuban
en
p esencia
de
agen es
an iin lama o ios
e ec i os,
se
obse a ia
una
disminuciOn
de
la
exp esiOn
de
TNFa,
po
lo
que
si e
35
como
indicado
de
la
educci6n
de
la
in lamacion.
ES 2 582 427 B1
17
En
es e
caso,
pa a
analiza
el
e ec o
de
la
ec oina
en
dicho
modelo
de
in lamaciOn
neu onal,
se
u iliza on
dos
agen es
induc o es
de
la
in lamaciOn,
LPS
o
ADDL,
con
mecanismos
de
acciOn
di e en es.
El
LPS
es un
lipopolisaca ido
bac e iano
y
el
ADDL
("Amyloid-be a
De i ed
Di usible
Ligands")
es un
oligOme o
soluble
que
se o ma
a
5
pa i
de
la
ag egaciOn
de
monome os
de
be a-amiloide.
En
es e
caso,
el
ADDL
se
sin e izO
a
pa i
de
la
ag egaciOn
de
be a-amiloide
a i icial,
ob eniendose
un p oduc o
que
p oduce
un
e ec o
in lama o io
muy
simila
al
que
se
p oduce
du an e
la
en e medad
de
Alzheime .
10
Las
celulas
de
la
lima
neu onal
N13
de
mic oglia
de
a an
se
incuba on
du an e
3
ho as
con
LPS
(0,01pg/m1)
o
con
oligOme os
de
13
amiloide
(ADDL)
5
pM
pa a
induci
la
in lamaciOn
en
las
mismas.
Como
con ol
de
a amien o
an iin lama o io
se
p e-
incuba on
celulas
en
p esencia
de
cO cuma
20
pM
du an e
90
minu os
y
se
incuba on
pos e io men e
en
p esencia
de
cada
uno
de
los
agen es
in lama o ios
LPS
o
ADDL
15
du an e
3
ho as.
Pa
o o lado,
ambien
se
incuba on
celulas
con
monOme os
de
13
amiloide
a i icial
5
pM
oligome izados
en
p esencia
de
ec oina.
En
es e
caso
se
ensaya on
a ias
concen aciones
de
ec oina
(0,01;
0,1; 1;
10
y
100
mM).
Una
ez
inalizados
los
di e en es a amien os,
se
ecogie on
las
celulas,
se
aislo
el
ARN
o al
y
se
ob u o
el
ADNc
median e
e o anscipciOn.
Pos e io men e
se
midie on
los
20
ni eles
de
exp esi6n
de
TNFa
po
qPCR
pa a
obse a
el
e ec o
en
la
in lamaciOn
celula
de
los
di e en es a amien os.
Los
esul ados
ob enidos
mues an
que
a
concen aciones
bajas
de
ec oina
(en e
0,01-1
mM)
comienza
a
obse a se
una meno
in lamacion
celula
que
es
•25
p ac icamen e
nula
a
concen aciones
mas
ele adas
(10
y
100
mM)
(Figu a
2).
Es
deci ,
que
el
p oceso
de
oligome izaciOn
de
be a-amiloide
en
p esencia
de
ec oina
no
se
p oduce
o
se
p oduce
pa cialmen e,
ya
que
a
disminuyendo
su
capacidad
de
induci
in lamaciOn
cuando
la concen aciOn
de
ec oina
a
aumen ando.
Es os
esul ados
sugie en
que
la
ec oina,
debido
a
su
e ec o
an iag egan e,
impide
30
p og esi amen e
la
oligome izacion
de
los
mon6me os
de
be a-amiloide.
Es
deci ,
la
ec oina
puede
eje ce
como
agen e
p e en i o
de
la
in lamaciOn
al
e i a
la
ag egaciOn
de
los
monOme os
del
be a-amiloide
pa a
o ma
ADDL.
B)
Con i macion
del
mecanismo
de
acci6n
de
la
ec oina
en
la
p e enciOn
de
la
35
in lamaciOn
po
W
e
s
e
n
-
B
l
o
.
ES 2 582 427 B1
18
El
ensayo
an e io
se
epi iO
pe o
u ilizando
una
soluciOn
de
monOme os
de
13
amiloide
a i icial
de
una
concen aciOn
diez
eces
meno
(0,5
pM),
ya
que
la
concen acion
esul an e es e
mas
p 6xima
a
la
isiolOgica.
Es a
solucion
se
oligome izo
en
p esencia
o
no
de
ec oina
a
dis in as
concen aciones
(0,01
y
0,1
mM)
y,
pos e io men e,
se
5
u iliza on
alicuo as
pa a
incuba
las
celulas
y
(i)
medi
la
exp esiOn
de
TNFa
median e
qPCR
(Figu a
3A)
y
ambien
pa a
ealiza
(ii)
un
analisis
de
la
o maciOn
de
oligene os
ADDL
median e
Wes e n-Blo .
Pa a
ello,
alicuo as
de
3
pl
de
las
soluciones
de
mon6me os
de
6
amiloide
oligome izado
o
no
en
p esencia
de
ec oina
se
co ie on
en
un
gel
de
poliac ilamida
en
g adien e
10-20
%
(ply)
y
pos e io men e
se
ans i ie on
a
10
una
memb ana
de
poli luo u o
de
inilideno
(PVDF).
Pos e io men e
la
memb ana
ue
incubada
con
el
an icue po
p ima io
6e10
y
el
e elado
pos e io
se
ealize)
median e
quimioluminiscencia
(Figu a
3B).
El
obje i o
del
ensayo
ue
obse e
Si,
e ec i amen e,
la
meno
in lamaci6n
obse ada
e a
debida
al
e ec o
an iag egan e
de
la
ec oina.
15
Los
esul ados
mues an
de
nue o
que con o me
a
aumen ando
la
concen acion
de
ec oina
se
p oduce
meno
in lamaciOn (Figu a
3A).
Es e
hecho
se
co elaciona
con
una
mayo
acumulaciOn
de
oligOme os
de
bajo
peso
molecula
(monOme os,
dime os,
ime os,
e c),
y
po
lo
an o,
una
meno
p opo cion
de
oligOme os
de
ele ado
peso
molecula ,
que
son
los
causan es
de
la
in lamaciOn (Figu a
3B).
Es o
indica
que
las
20
mues as
incubadas
con
mayo
concen aci6n
de
ec oina
poseen
meno
p opo ci6n
de
oligo ne os
de
ele ado
peso
molecula ,
lo
que
e i a
que
es os
induzcan
in lamaci6n
en
las
celulas
N13
a adas.
EJEMPLO
3.
ENSAYOS
I
N
V
I
V
O
.
PASO
A
TRAVES
DE
LA
BARRERA
25
HEMATOENCEFALICA
Pa a
comp oba
si
la
ec oina
e a
una
molecule
capaz
de
a a esa
la
ba e a
hema oence alica,
se
ealize)
un
ensayo
i
n
i
o
u ilizando
a ones
C57
w
inoculados
con
ec oina
y
di e en es
iempos
de
exposicion
pa a,
pos e io men e,
de ec a
po
30
HPLC
la
p esencia
o
ausencia
de
ec oina.
Pa a
el
ensayo
se
u iliza on
8
a ones
C57
w
(edad:
3
meses)
que
ue on
inyec ados
en
la
zona
pe i oneal
con
6
mg
ec oina
en
PBS/ a on
(200-250
mg/Kg).
Los
iempos
ensayados
ue on
30
min,
3
ho as
y
24
ho as.
Se
u iliza on
2
a ones
po
cada
iempo
35
ensayado
y 2 a ones
a
los
que
se
les
inocule)
onicamen e
con
PBS,
conside ados
como
mues as
con ol.
P e iamen e
a
la
ex accion
del
ce eb o,
cada
a On
se
ES 2 582 427 B1
19
pe undio
con
PBS
pa a
e i a
la
con aminaciOn
del
mismo
con
sang e
ci culan e
que
con iene
ec oina.
Pos e io men e,
se
p ocedi6
a
la
ex acci6n
del
ce eb o
de
cada
a 6n
y a
la
sepa aci6n
de
las
di e en es
acciones:
co eza,
hipocampo
y
es o.
La
co eza
y
el
hipocampo
son
las
zonas
en
las
que
se
localiza
la
pa ologia
p oducida
po
5
el
Alzheime .
Cada
accion
de
ce eb o
se
homogeneizo
en un
Douce's
u ilizando
una
soluciOn
de
PBS
que
con enia
inhibido es
de
p o easas
y os a asas.
Pos e io men e,
la
mues a
se
ul acen i ug6
pa a
ob ene
la
acci6n
de
p o einas solubles
(S1)
y
el
sob enadan e
se
ex ajo
con
una
solucion
de
me anol:clo o o mo:agua
(10:5:4)
median e
el
p o ocolo
modi icado
de
Bligh
y
Dye
(1959)
pa a
la
ob enciOn
de
la
10
acci6n
que
con enia
ec oina.
Las
mues as
ob enidas se
analiza on
median e
HPLC
u ilizando
una
soluciOn
de
ec oina
come cial
como
con ol.
Los
esul ados
mues an
la
p esencia
de
ec oina,
an o
en
co eza e
hipocampo
como
en
el
es o
de
ce eb o,
en
aquellos
a ones
que
ue on
inoculados
an o
a
30
minu os,
15
como
a
las
3 h
y
a
las
24
h
de
exposici6n.
Sin
emba go,
no
se
de ec o
ec oina
en
aquellos a ones
que
no
ue on
inoculados
con
la
misma
( a ones
con ol).
En
la
igu a
4
sOlo
se
mues an
los
esul ados
ob enidos
en
ejido
de
co eza.
ES 2 582 427 B1
20
5
REIVINDICACIONES
1.
Uso
de
un
compues o
seleccionado
de
en e
ec oina
o
un
de i ado
de
ec oina
de
la
O mula gene al
(I)
0
(II):
R3
R3
C-R4
HN---€C-R4
In
/N
R2
/N
R
R1
2
(I)
(II)
donde:
R1
se
selecciona
de
en e
H
o
alquilo
(C1-C4);
10
R2
se
selecciona
de
en e
H,
-COOH,
-000-alquilo
(C1-C4)
o
—CONHR5;
donde
R5
se
selecciona
de
en e
H,
alquilo
(C1-C4),
un
aminoacido,
un
dipep ido
o
un
ipep ido;
R3
y
R4
son
iguales
o
di e en es
y
se
selecciona de
en e
H
u
OH,
y
n
es un
alo
de
1,
2
6
3,
15
o
cualquie a
de
sus
sales
a maceu icamen e
acep ables,
pa a
la
elabo acion
de
un
medicamen o
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn
del
da io
oxida i o
y
la
in lamaciOn
debida
a
la
ag egaci6n
p o eica
en
celulas.
20
2.
Uso
segOn
la
ei indicacion
1,
donde
n
es
2
y
cada
R3
es
de
mane a
independien e
H
u
OH.
3.
Uso
segun
cualquie a
de
las
ei indicaciones
1
o
2,
donde
R4
es
H.
25
4.
Uso
segun
cualquie a
de
las
ei indicaciones
1
a
3,
donde
R1
es
H
o
—CH3.
5.
Uso
segOn
la
ei indicacion
4,
donde
R1
es
-CH3.
6.
Uso
segun
la
ei indicacion
1,
donde
el
compues o
es
la
ec oina.
7.
Uso
segun
la
ei indicaciOn
1,
donde
el
compues o
es
la
hid oxiec oina.
30
ES 2 582 427 B1
21

8.
Uso
segUn
cualquie a
de
las
ei indicaciones
1
a
7
pa a
el
a amien o
y/o
p e enciOn
de
en e medades
p oducidas
po
la
o maci6n de
ag egados
p o eicos.
9.
Uso
segun
la
ei indicaciOn
8
donde
la
en e medad
es
amiloidosis neu opa ica,
5
sis e nica
y/o
localizada.
10.
Uso
seg .ln
la
ei indicaciOn
8
donde
la
en e medad
es
una
en emnedad
neu odegene a i a.
10
11.
Uso
seg :In
la
ei indicacion
10
donde
la
en e medad
se
selecciona
de
la
lis a
que
consis e
en
Alzheime ,
Pa kinson,
Hun ing on, ence alopa ias
espongi o mes,
escle osis
la e al
amio O ica
(ELA)
y
polineu opa ia
amiloidO ica
amilia .
15
12.
Uso
segiin
la
ei indicaciOn 11
donde
la
en e medad
es Alzheime .
13.
Uso
segOn
cualquie a
de
las
ei indicaciones
1
a
12
donde
la
concen aciOn
de
co npues o
es
in e io
a
10
mM.
14.
Uso
segun
la
ei indicacion
13,
donde
la
concen aciOn
de
compues o
es
in e io
a
20
3
mM.
15.
Uso
segOn
la
ei indicaciOn
14
donde
la
concen aci6n de
compues o
se
encuen a
en
un
ango
de
en e
0,0001
y
1
mM.
25
16.
Uso
segOn
la
ei indicaciOn
15
donde
la
concen acion
de
compues o
se
encuen a
en
un
ango
de
en e
0,001
y
1
mM.
30
17.
Uso
segOn
la
ei indicacion
16
donde
la
concen acion
de
compues o
se
encuen a
en
un
ango
de
en e
0,001
y
0,1
mM.
18.
Uso segun
cualquie a
de
las
ei indicaciones
1
a
17
donde
el
medicamen o
es a
o nnulado
pa a
su
adminis aciOn
pe i oneal.
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