Uso de la ectoína o sus derivados como agentes antiinflamantorios y/o antioxidantes en enfermedades causadas por la formacion de agregados proteicos

ES 2 582 427 B1 19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 21 Número de publicación: 2 582 427 Número de solicitud: 201500205 51 Int. CI.: A61K 31/505 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 54 Título: Uso de la ectoína o sus derivados como agentes antiinflamantorios y/o antioxidantes en enfermedades causadas por la formacion de agregados proteicos 73 Titular/es: UNIVERSIDAD DE SEVILLA (100.0%) Vicerrectorado de Transferencia Tecnológica. Paseo de las Delicias s/n. Pabellón de Brasil 41013 Sevilla (Sevilla) ES 72 Inventor/es: SALVADOR DE LARA, Manuel; GARCÍA VALERO, Rosa; ARGANDOÑA BERTRAN , Montserrat; VIZUETE CHACÓN , María Luisa; VITORICA FERRÁNDEZ, Francisco Javier; NIETO GUTIÉRREZ , Joaquín y VARGAS MACÍAS, Carmen 22 Fecha de presentación: 10.03.2015 43 Fecha de publicación de la solicitud: 12.09.2016 Fecha de concesión: 06.07.2017 45 Fecha de publicación de la concesión: 13.07.2017 57 Resumen: Uso de la ectoína o sus derivados como agentes antiinflamatorios y/o antioxidantes en enfermedades causadas por la formación de agregados proteicos. La invención propone el uso de la ectoína y sus derivados como agentes antiagregantes y/o antioxidantes en células, preferiblemente neuronales. La ectoína y sus derivados se proponen así como compuestos de utilidad en la elaboración de medicamentos para la prevención y/o tratamiento de la muerte celular causada por daño oxidativo y/o la formación de agregados proteicos, preferiblemente inflamación en respuesta a dichos agregados, más preferiblemente para la prevención y/o tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, tales como Alzheimer. La invención también proporciona las concentraciones óptimas de tales compuestos, así como una posible vía de administración. Se puede realizar consulta prevista por el art. 37.3.8 LP 11/1986. Aviso: USO DE LA ECTOINA 0 SUS DERIVADOS COMO AGENTES ANTIINFLAMATORIOS Y/0 ANTIOXIDANTES EN ENFERMEDADES CAUSADAS POR LA FORMACION DE AGREGADOS PROTEICOS 5 DESCRIPCION La presente invenciOn se refiere al uso de la ectoina y sus derivados como agentes antiagregantes y antioxidantes en celulas. Particularmente estos compuestos se proponen para el tratamiento y/o prevenciOn de enfermedades causadas por la 10 formaci6n de agregados proteicos, preferiblemente enfermedades neurodegenerativas, las cuales cursan con dario oxidativo e inflamaciOn debida a la formaciOn de dichos agregados. Por tanto, la invencion se encuadra en el campo de la biomedicina y la neurologia. 15 ESTADO DE LA TECNICA Los solutos compatibles son pequefias moleculas organicas que se acumulan en la mayoria de los organismos extremOfilos en respuesta a diferentes estreses (estres osmOtico, termico, etc.). Se postula que el efecto protector i n v i vo de estas moleculas 20 es debido a su capacidad de estabilizar a las proteinas celulares. Entre estas moleculas se encuentra la ectoina y su derivado hidroxilado, la hidroxiectoina. Debido a su naturaleza bioestabilizadora ambas moleculas se comercializan como componentes de cosmeticos, fundamentalmente en cremas anti-envejecimiento, cremas solares, champus, etc. Actualmente existen mas de 200 productos de 25 cosmetica en el mercado que contienen ectoina y algunos de ellos solo se encuentran de yenta en farmacias. Ademas, las ectoinas tambien se comercializan en soluciones bioestabilizadoras para la protecciOn de enzimas en ensayos de laboratorio, por ejemplo, en kits para PCR, inmunoensayos, soluciones de anticuerpos, soluciones de enzimas como peroxidasa y fosfatasa alcalina, etc., ademas de presentar potenciales 30 aplicaciones en el campo de la biomedicina (US8765691B2). El nOmero de enfermedades asociadas a una formaci6n proteica incorrecta, donde el resultado del plegamiento anOmalo es una estructura fibrilar diferente Ilamada "amiloide", es cada vez mayor. Dentro de estas enfermedades un subgrupo importante 35 son las enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Alzheimer, la de ES 2 582 427 B1 2 Huntington, la de Parkinson, las encefalopaffas espongiformes, la esclerosis lateral amiotrofica (ELA) y la polineuropatia amiloidotica familiar. Durante muchos albs se ha estudiado el papel de la inflamacion en la enfermedad de 5 Alzheimer (Morales I, Guzman-Martinez L, Cerda-Troncoso C, Fartas GA, Maccioni RB, 2014. Neuroinflammation in the pathogenesis of Alzheimer's disease. A rational framework for the search of novel therapeutic approaches. Front Cell Neurosci., 22;8:112). Esta inflamacion aparece en respuesta a una serie de setiales que incluyen lesiones, infecci6n, agentes oxidativos y determinados grados de oligomerizaciOn de 10 la proteina Tau y 6 amiloide. Parece ser que la respuesta neuroinflamatoria se activa en las areas circundantes a la formaci6n de la placa senil y libera seriales proinflamatorias como las citoquinas. Concretamente, dentro del sistema inmune, las celulas de la microglia por un lado fagocitan y degradan el 6 amiloide (Lee CV., Landreth GE., 2010, The role of microglia in amyloid clearance from the AD brain. J 15 Neural Transm., 117: 949-960), actuando como un sistema de reparacion, pero por otro lado, pueden ser responsables de la destruccion de tejidos y de la muerte neuronal. Asi, en funciOn del balance entre setiales activadoras e inhibitorias, la microglia participara mas en la inducciOn de la muerte neuronal (favoreciendo la enfermedad) o en la disminuci6n de los agregados 6 amiloide (inhibiendo el desarrollo 20 de la enfermedad). Es muy interesante resaltar que la fagocitosis del 6 amiloide i n v i v o se inhibe cuando estan presentes citoquinas proinflamatorias (Koenigsknecht-Talboo J., Landreth GE., 2005, Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and Ig Gs are differentially regulated by proinflammatory cytokines, J, Neurosci., 25: 8240— 8249). Es mas, se ha observado una mejoria en la patologia del Alzheimer en ratones 25 cuando, al tratarlos con agentes antiinflamatorios, se observO una mejora de la respuesta fagocitaria al 6 amiloide (Heneka MT., e t a l . , 2005, Acute treatment with the PPARgamma agonist pioglitazone and ibuprofen reduces glial inflammation and Abeta1-42Ievels in APPV717I transgenic mice, Brain, 128: 442-453). 30 Por otro lado existen numerosas evidencias que relacionan el estres oxidativo y las enfermedades que cursan con neurodegeneraci6n, como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson (Andersen JK., 2004, Oxidative stress in neurodegeneration: cause or consequence?, Nat Med., 10 Suppl: S18-25). De hecho, se ha relacionado el estres oxidativo con la alteracion del procesamiento normal de la 35 proteina precursora del 6-amiloide (APP) (Multhaup G., e t a l . , 2002, Possible mechanisms of APP-mediated oxidative stress in Alzheimer's disease, Free Radic. ES 2 582 427 B1 3 Biol. Med., 33: 45-51) o la fosforilacion de Tau (Me lov S., e t a l . , 2007, Mitochondrial oxidative stress causes hyperphosphorylation of tau, PLoS ONE 2: e536), proteinas intimamente ligadas a la enfermedad de Alzheimer; o la oligomerizaciOn de la asinucleina (Esteves AR., e t a l . , 2009, Oxidative Stress involvement in alpha-synuclein 5 oligomerization in Parkinsons disease cybrids Antioxid Redox Signal, 11: 439-448), relacionada con la enfermedad de Parkinson. Otro hecho a tener en cuenta es que el tratamiento clinico del estres oxidativo reduce la incidencia y la severidad de la enfermedad de Alzheimer (Esteves AR., e t a l . , 2009, Oxidative Stress involvement in alpha-synuclein oligomerization in Parkinsons disease cybrids, Antioxid Redox Signal, 10 11: 439-448). De hecho, hay trabajos que indican el uso de los antioxidantes como una de las mejores terapias preventivas para esta enfermedad (Zhao B., 2009, Natural antioxidants protect neurons in Alzheimer's disease and Parkinson's disease, Neurochem. Res., 34: 630-638). 15 Todo esto sugiere que una molecula con propiedades antiagregantes que, adicionalmente, disminuya el clan° oxidativo, serta una buena candidata como farmaco frente a enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer o el Parkinson, en las que tanto el estres oxidativo como la inflamaciOn derivada de la agregaci6n proteica se han postulado como mecanismos asociados a su patologia. 20 La principal manifestaciOn de la enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas es la muerte neuronal, lo que provoca demencia y otras alteraciones. Se postula que esta neurodegeneraciOn tiene un origen rratiple, en el que participan diferentes procesos como la agregacion proteica, el estres oxidativo, o 25 la respuesta inflamatoria, entre otros, y que, a su vez, pueden estar interconectados. Debido a esta etiologia mUltiple y compleja, las alternativas farmacolOgicas de prevencion y terapia de este tipo de enfermedades se podrian abordar con mas exito mediante la utilizaciOn de farmacos que actuen al nivel de varias de estas disfunciones de forma simultanea. Asimismo, es deseable encontrar la concentracion Optima de 30 tales farmacos, la cual permita una prevenciOn y tratamiento efectivos de las enfermedades neurodegenerativas sin Ilegar a provocar toxicidad celular o tisular. Por preferiblemente tales farmacos han de ser capaces de atravesar la barrera hematoencefalica para que, tras su administraci6n, puedan ejercer su efecto en el area afectada. 35 ES 2 582 427 B1 4 DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invenciOn propone el uso de la ectoina y sus derivados como agentes antiagregantes y antioxidantes en celulas, preferiblemente neuronales. La ectoina y 5 sus derivados se proponen como compuestos de utilidad en la prevencion y/o tratamiento de la muerte celular, preferiblemente muerte neuronal, mas preferiblemente en enfermedades neurodegenerativas, tales como la enfermedad de Alzheimer, las cuales cursan con procesos de dem oxidativo y de inflamaciOn debida a la formaci6n de agregados proteicos. 10 En la presente invenciOn se demuestra que la ectoina y sus derivados reducen la muerte neuronal causada por estres oxidativo en un modelo neuronal humano, lo que prueba que poseen actividad antioxidante "in vitro" (ejemplo 1, Fig. 1). Por otro lado, se demuestra, en un modelo inflamatorio de celulas neuronales de microglia de rat6n 15 N13, que la ectoina tiene un efecto preventivo de la inflamacion derivada de la agregaci6n proteica. Esto es debido a que la ectoina impide que los mon6meros de 13 amiloide se agreguen en las formas oligornericas que causan la respuesta inflamatoria (ejemplo 2, Fig. 2 y 3). 20 Ademas, en la presente invenciOn se demuestra "in vivo", utilizando ratones a los que se les ha inoculado ectoina por via parenteral en el peritoneo, que esta molecula atraviesa la barrera hematoencefalica (BH), ya que se han detectado mediante HPLC concentraciones de ectoina en diferentes tejidos del cerebro de los ratones inoculados, mientras que no se ha detectado en los ratones control (ejemplo 3, Fig. 4). 25 En resumen, la presente invencion demuestra que la ectoina y sus derivados poseen un efecto protector frente al dano oxidativo en celulas neuronales, y adernas se ha comprobado que, evitando la formaciOn de los oligomeros proteicos responsables de la inducciOn de inflamaciOn, producen adicionalmente un efecto preventivo de la 30 inflamaciOn neuronal. Como se ha mencionado anteriormente, en algunas enfermedades neurodegenerativas como Alzheimer, Parkinson, encefalopatias espongiformes o Huntington, la neurodegeneracion tiene un origen milltiple, en el que participan diferentes procesos tales como la agregaci6n proteica, el estres oxidativo o la respuesta inflamatoria, entre otros, y que, a su vez, pueden estar interconectados. 35 El hecho de que la ectoina y sus derivados posean varias propiedades de forma simultanea tales como (i) antioxidante, (ii) antiagregante, Ilevando asi a cabo la (iii) ES 2 582 427 B1 5 prevenciOn de la inflamaciOn inducida en respuesta a agregados proteicos, y (iv) que sean capaces de atravesar la barrera hematoencefalica, consiguiendo Ilegar asi a las regiones cerebrales donde ejercerfan su efecto terapeutico, les hacen buenos candidatos para ser utilizados tanto en la profilaxis como en el tratamiento de este tipo 5 de enfermedades u otras tambien multifactoriales entre cuyas causas se encuentren las anteriormente mencionadas. La ectoina y sus derivados se proponen, por tanto, en la presente invencion como compuestos antiagregantes y antioxidantes Utiles para el tratamiento y/o prevenciOn 10 de enfermedades causadas por la agregacion proteica en las celulas o que cursan con la misma como son, por ejemplo aunque sin limitarnos, las enfermedades neurodegenerativas. Por todo ello, en un primer aspecto la presente invenciOn se refiere al uso de un 15 compuesto seleccionado de entre ectoina o un derivado de ectoina de la fOrmula general (I) 6 (II): R 3 R 3 C - R 4 ) H N ( C - R 4 I n R i / N \ R 2 / N \ R R 1 2 (I) 20 Donde: R1 se selecciona de entre H o alquilo (C1-C4), R2 se selecciona de entre H, -COOH, -000-alquilo (C1-C4) o —CONHR5; donde R3 se selecciona de entre H, alquilo (C1-C4), un aminoacido, un dipeptido o un tripeptido; preferiblemente R2 es H o —COOH; R3 y R4 son iguales o diferentes y se selecciona de entre H u OH, y 25 n es un valor de 1, 2 O 3, o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento y/o prevencion del deo oxidativo y la inflamacion debida a la agregaci6n proteica en celulas. 0 alternativamente, la presente invenciOn 30 se refiere a dicho compuesto para su uso como medicamento para el tratamiento y/o prevenciOn del deo oxidativo y la inflamaciOn debida a la agregacion proteica en ES 2 582 427 B1 6 celulas. De ahora en adelante se hard referencia a este medicamento como "medicamento de la invenciOn". Este compuesto seleccionado de entre ectoina o un derivado de ectoina de la formula 5 general (I) 6 (II) es por tanto el principio activo comprendido en el medicamento de la invencion. En una realizaciOn preferida, n es 2 y cada R3 es de manera independiente H u OH. En una realizaciOn mas preferida, Ri es H. En una realizacion aun mas preferida, R1 10 es H o —CH3. En una realizacion aim mas preferida, R1 es -CH3. En una realizaciOn mas preferida el compuesto es la ectoina. En otra realizacion preferida el compuesto es la hidroxiectoina. 15 El termino "ectoinas" engloba a dos compuestos tetrahidropirimidinicos ciclicos: la ectoina (acid° 1,4,5,6-tetrahidro-2-metil-4-pirimidinocarboxilico) y su derivado hidroxilado, la hidroxiectoina (acid° 1,4,5,6-tetrahidro-5-hidroxi-2-metil-4pirimidinocarboxilico). Ambas, ectoina e hidroxiectoina, son junto con la betaina, los solutos compatibles mayoritariamente sintetizados por bacterias halofilas Gram 20 negativas heterOtrofas y tambien por un amplio numero de bacterias Gram positivas halOfilas moderadas y halotolerantes. La hidroxiectoina suele ser mas comUn en bacterias halofilas Gram positivas como B r e v i b a c t e r i u m li n e n s o M a r i no c o cc u s h a l o p h il u s , aunque frecuentemente es sintetizado en cantidades menores junto a la ectoina en microorganismos productores de la misma. 25 El termino "alquilo" se refiere, en la presente invenciOn, a cadenas hidrocarbonadas saturadas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 4 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, terc-butilo, sec-butilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 2 atomos de carbono y mas 30 preferiblemente es metilo. Por "aminoacido" se entienden las formas estereisOmera, por ejemplo formas D y L de los siguientes compuestos: asparagina, arginina, acid° aspartico, glutamina, acid° glutamico, 6-alanina, y-aminobutirato, NE-acetilisina, Noacetilornitina, Ny35 acetildiaminobutirato, Na-acetildiaminobutirato, histidina, isoleucina, leucina, metionina, fenilalanina, serina, treonina y tirosina. Son preferentes L-aminoacidos. Los ES 2 582 427 B1 7 5 restos aminoacido se derivan de los correspondientes aminoacidos. Son preferentes los siguientes restos aminoacido: Gly, Ala, Ser, Thr, Val, (3-Ala, y-aminobutirato, Asp, Glu, Asn, Gin, NE-acetillisina, No-acetilornitina, Ny-acetildiaminobutirato, Naacetildiam inobutirato. Los restos dio tripeptido son amidas de acid°, segim su naturaleza quimica, y se descomponen en la hidrolisis en dos o tres aminoacidos. Los aminoacidos en el resto dio tripeptido estan enlazados entre Si mediante enlaces de amida. 10 Las sales, compatibles desde el punto de vista fisiolOgico, del compuesto de la formula (I) o (II), son, a modo de ejemplo, sales alcalinas, alcalinoterreas o amOnicas, como sales de Na, K, Mg, Ca, trietilamina o tris-(2-hidroxi-etil)-amina. Otras sales, compatibles desde el punto de vista fisiolOgico, del compuesto de la formula (I) o (II) se producen mediante reacci6n con acidos inorganicos, como acid° clorhidrico, acid° 15 sulfUrico y acid° fosforico, o con acidos organicos carboxilicos o sulfonicos, como acid° acetic°, acid° citric°, acid° benzoico, acid° maleico, acid° fumarico, acid° tartaric° y acid° p-toluenosulfOnico. Los compuestos de la formula (I) o (II), en los que se presentan grupos basicos y acidos, como grupos carboxilo o amino en el mismo numero, forman sales internas. 20 Se entiende como "celula" a la unidad morfologica y funcional de todo ser vivo. Dentro del alcance de la presente invencion se incluyen las celulas procedentes de cualquier tejido del organismo, preferiblemente celulas del sistema nervioso incluyendo celulas gliales y neuronas, mas preferiblemente las celulas a las que se refiere la presente 25 invencion son celulas neuronales. Las "celulas neuronales" son aquellas celulas nerviosas cuya principal funci6n es la excitabilidad electrica de su membrana plasmatica. Estan especializadas en la recepcion de estimulos y la conducci6n del impulso nervioso en forma de potencial de accion, entre ellas o con otros tipos celulares. Estas celulas conducen sefiales a traves del axon, prolongacion que se 30 extiende desde el cuerpo de la neurona hacia fuera, y reciben informaciOn a traves de las dendritas, ramas de la celula que se dirigen hacia el soma o cuerpo neuronal. Como se puede apreciar en los ejemplos descritos mas adelante, la ectoina ejerce un efecto antiagregante, impidiendo progresivamente la oligomerizacion peptidica 35 responsable de desencadenar una respuesta inflamatoria en las celulas, preferiblemente neuronas, en patologias asociadas a la formacion de agregados ES 2 582 427 B1 8 proteicos, como por ejemplo en enfermedades neurodegenerativas. Es decir, la ectorna ejerce como un agente preventivo de la inflamaciOn al evitar la agregaci6n peptidica. Por ello, en una realizaciOn preferida, el medicamento al que se refiere la presente invenciOn es para el tratamiento y/o prevenciOn, mas preferiblemente 5 prevencion, de la inflamaciOn que se produce en las celulas, preferiblemente neuronales, coma consecuencia de la formaci6n de agregados proteicos en dichas celulas. Se entiende par "agregados proteicos" o "agregados peptldicos" los dep6sitos o 10 agrupaciones proteicas que se forman por oligomerizacion de proteinas o peptidos resultantes de un incorrecto plegamiento o procesamiento proteico, por ejemplo de la proteina precursora del 13-amiloide (APP) o de la a-sinucleina. Tales depositos o agregados son, por ejemplo aunque sin limitarnos, fibras o placas de amiloide, ovillos neurofibrilares, cuerpos de inclusiOn, etc. Estos agregados proteicos son toxicos y 15 estan implicados en numerosas enfermedades tales como las enfermedades neurodegenerativas incluyendo Alzheimer, Parkinson, Huntington, encefalopatias espongiformes, esclerosis lateral amiotrofica (ELA), polineuropatia amiloidOtica familiar y otras no neurodegenerativas tales coma las amiloidosis sistemicas y las amiloidosis localizadas como la diabetes tipo II. Metodos para detectar la presencia de 20 dichos agregados proteicos celulares son comunmente conocidos en el estado de la tecnica, tales coma tecnicas de fluorescencia o laser de multifotones. Se entiende par "neuroinflamaciOn" o "inflamacion en celulas neuronales" la respuesta inflamatoria originada en el sistema nervioso central tras sufrir una lesiOn Ilevando a 25 una acumulaciOn y activaciOn de celulas gliales, particularmente astrocitos y microglia en la zona afectada. Asimismo, en los ejemplos descritos mas adelante se demuestra que tanto la ectoina como sus derivados, particularmente la hidroxiectoina, protegen de la muerte neuronal 30 provocada por clan° oxidativo. Se entiende por "estres oxidativo" o "clan° oxidativo" la condicion de citotoxicidad que es consecuencia de un desequilibrio entre la producci6n de radicales libres y la capacidad de la celula de defenderse contra ellos, par lo que esta causada par un incremento en la formaci6n de dichos radicales libres o par una disminucion de los agentes que actUan coma antioxidantes, o par ambos 35 motivos conjuntamente. Como se ha mencionado anteriormente, se ha relacionado el estres oxidativo can la alteracion del procesamiento normal de la proteina precursora ES 2 582 427 B1 9 la viabilidad celular mediante el test WST-1 (Roche). Para ello se realize) una curva de concentraciones crecientes de cada uno de los compuestos y un blanco por triplicado en tres experimentos independientes. Ademas se determine) la toxicidad intrinseca de la maxima concentraci6n de los compuestos a evaluar. 5 La medida de la actividad neuroprotectora se realizO sobre celulas neuronales humanas sometidas a estres oxidativo con el sistema xantina/xantina oxidasa (XX0), ya que la XXO produce aniones super6xido que reaccionan con lipidos, proteinas, carbohidratos y DNA en el interior de las celulas y con componentes de la matriz 10 extracelular, resultando tOxico para estas. Tambien produce perOxido de hidrOgeno que, en presencia de hierro, forma radicales hidroxilo altamente tOxicos para las celulas, provocando peroxidacion lipidica y mutaciones en el DNA. Todo esto produce dans° celular y, en ultimo termino, la muerte de las celulas. De esta forma un compuesto neuroprotector impedird o reducira el porcentaje de la muerte celular 15 producida por este agresor. Una vez sometidas las celulas a estres oxidativo mediante XXO y cada uno de los compuestos a evaluar, para poder determinar el efecto neuroprotector de cada uno se determin6 la viabilidad celular cuantificando la actividad metabolica mediante el test 20 WST-1 (Roche). Este metodo esta basado en la capacidad de las celulas de obtener la energia necesaria para mantener sus funciones metabolicas y el crecimiento celular. Por este motivo, las celulas que esten metabOlicamente activas (vivas) reduciran las sales de tetrazolium a formazan mediante el sistema succinatotetrazolium reductasa (de la cadena respiratoria mitocondrial) y el formazan formado 25 puede ser detectado colorimetricamente, mientras que en las celulas muy datiadas o muertas no se producira esta reacci6n. Previamente se determin6 la concentracion de XXO que produce la muerte del 50 % de las celulas, que corresponde con la concentraciOn letal 50 (LC50), siendo este el 30 parametro usado para inducir la muerte celular. Se ensayaron los compuestos Ectoina e Hidroxiectoina a concentraciones de 3, 1, 0,2; 0,1; 0,02; 0,01; 0,002; 0,001 y 0,0001 mM junto con XXO a concentracion igual a su LC50 en tres ensayos por triplicado. Ademas se incluyo un control positivo de 35 neuroproteccion validado en este sistema, como control del ensayo. ES 2 582 427 B1 16 Los resultados de neuroprotecciOn de los compuestos se muestran en la Figura 1, en la que se representa el porcentaje de muerte celular obtenida para cada concentracion de los compuestos ectoina e hidroxiectoina referida a la muerte producida por la XXO. 5 Los resultados muestran un comportamiento de proteccion similar para ambos compuestos, consiguiendo la mayor proteccion entre 0,001 y 0,01 mM y siendo esta de 39%+15% (medias+SD), aunque el rango en el que se observe) protecci6n era bastante extenso, (0,001 a 1 mM). Para el control positivo de protecciOn se obtuvo una protecciOn del 60%+20% (dato no mostrado). 10 15 Los compuestos se ensayaron hasta una concentracion maxima de 3 mM, concentraci6n a la que se empez6 a detectar hasta un 10% mas de toxicidad que con )0(0, por lo que la maxima dosis tolerada (MTD, concentracion a la que no se produce muerte celular) estaba por debajo de 3 mM. Estos resultados indican que tanto la ectoina como la hidroxiectoina protegen de la muerte neuronal causada por dario oxidativo, por lo que se conforman como buenos candidatos como agentes antioxidantes y neuroprotectores. 20 EJEMPLO 2. EVALUACION DE LA ACTIVIDAD ANTIINFLAMATORIA Y NEUROPROTECTORA DE LA ECTOiNA EN LINEAS NEURONALES DE RATON. A) Actividad preventiva de la inflamaciOn producida por la aqreqacion proteica. 25 Los cultivos de celulas neuronales N13 de microglia de ratan se utilizaron como modelo celular para estudiar la inflamacion. En estas celulas se puede inducir un proceso inflamatorio incubandolas con diferentes agentes inflamatorios y posteriormente cuantificar la expresiOn del gen que codifica el factor de necrosis tumoral ("tumor necrosis factor", TNFa), una citoquina multifuncional, cuya expresion 30 suele inducirse en procesos inflamatorios. Dicha citoquina esta encargada del control de la proliferacion celular (mediante la degeneraci6n celular), jugando un papel critic° en las patogenesis de enfermedades relacionadas con las inflamaciones cronicas. Si estas celulas inflamadas se incuban en presencia de agentes antiinflamatorios efectivos, se observaria una disminuciOn de la expresiOn de TNFa, por lo que sirve 35 como indicador de la reducci6n de la inflamacion. ES 2 582 427 B1 17 En este caso, para analizar el efecto de la ectoina en dicho modelo de inflamaciOn neuronal, se utilizaron dos agentes inductores de la inflamaciOn, LPS o ADDL, con mecanismos de acciOn diferentes. El LPS es un lipopolisacarido bacteriano y el ADDL ("Amyloid-beta Derived Diffusible Ligands") es un oligOmero soluble que se forma a 5 partir de la agregaciOn de monomeros de beta-amiloide. En este caso, el ADDL se sintetizO a partir de la agregaciOn de beta-amiloide artificial, obteniendose un producto que produce un efecto inflamatorio muy similar al que se produce durante la enfermedad de Alzheimer. 10 Las celulas de la lima neuronal N13 de microglia de ratan se incubaron durante 3 horas con LPS (0,01pg/m1) o con oligOmeros de 13 amiloide (ADDL) 5 pM para inducir la inflamaciOn en las mismas. Como control de tratamiento antiinflamatorio se preincubaron celulas en presencia de cOrcuma 20 pM durante 90 minutos y se incubaron posteriormente en presencia de cada uno de los agentes inflamatorios LPS o ADDL 15 durante 3 horas. Par otro lado, tambien se incubaron celulas con monOmeros de 13 amiloide artificial 5 pM oligomerizados en presencia de ectoina. En este caso se ensayaron varias concentraciones de ectoina (0,01; 0,1; 1; 10 y 100 mM). Una vez finalizados los diferentes tratamientos, se recogieron las celulas, se aislo el ARN total y se obtuvo el ADNc mediante retrotranscipciOn. Posteriormente se midieron los 20 niveles de expresi6n de TNFa por qPCR para observar el efecto en la inflamaciOn celular de los diferentes tratamientos. Los resultados obtenidos muestran que a concentraciones bajas de ectoina (entre 0,01-1 mM) comienza a observarse una menor inflamacion celular que es •25 practicamente nula a concentraciones mas elevadas (10 y 100 mM) (Figura 2). Es decir, que el proceso de oligomerizaciOn de beta-amiloide en presencia de ectoina no se produce o se produce parcialmente, ya que va disminuyendo su capacidad de inducir inflamaciOn cuando la concentraciOn de ectoina va aumentando. Estos resultados sugieren que la ectoina, debido a su efecto antiagregante, impide 30 progresivamente la oligomerizacion de los mon6meros de beta-amiloide. Es decir, la ectoina puede ejercer como agente preventivo de la inflamaciOn al evitar la agregaciOn de los monOmeros del beta-amiloide para formar ADDL. B) Confirmacion del mecanismo de acci6n de la ectoina en la prevenciOn de la 35 inflamaciOn por W e s t e r n - B l o t . ES 2 582 427 B1 18 El ensayo anterior se repitiO pero utilizando una soluciOn de monOmeros de 13 amiloide artificial de una concentraciOn diez veces menor (0,5 pM), ya que la concentracion resultante este mas pr6xima a la fisiolOgica. Esta solucion se oligomerizo en presencia o no de ectoina a distintas concentraciones (0,01 y 0,1 mM) y, posteriormente, se 5 utilizaron alicuotas para incubar las celulas y (i) medir la expresiOn de TNFa mediante qPCR (Figura 3A) y tambien para realizar (ii) un analisis de la formaciOn de oligeneros ADDL mediante Western-Blot. Para ello, alicuotas de 3 pl de las soluciones de mon6meros de 6 amiloide oligomerizado o no en presencia de ectoina se corrieron en un gel de poliacrilamida en gradiente 10-20 % (ply) y posteriormente se transfirieron a 10 una membrana de polifluoruro de vinilideno (PVDF). Posteriormente la membrana fue incubada con el anticuerpo primario 6e10 y el revelado posterior se realize) mediante quimioluminiscencia (Figura 3B). El objetivo del ensayo fue observer Si, efectivamente, la menor inflamaci6n observada era debida al efecto antiagregante de la ectoina. 15 Los resultados muestran de nuevo que conforme va aumentando la concentracion de ectoina se produce menor inflamaciOn (Figura 3A). Este hecho se correlaciona con una mayor acumulaciOn de oligOmeros de bajo peso molecular (monOmeros, dimeros, trimeros, etc), y por lo tanto, una menor proporcion de oligOmeros de elevado peso molecular, que son los causantes de la inflamaciOn (Figura 3B). Esto indica que las 20 muestras incubadas con mayor concentraci6n de ectoina poseen menor proporci6n de oligorneros de elevado peso molecular, lo que evita que estos induzcan inflamaci6n en las celulas N13 tratadas. EJEMPLO 3. ENSAYOS I N V I V O . PASO A TRAVES DE LA BARRERA 25 HEMATOENCEFALICA Para comprobar si la ectoina era una molecule capaz de atravesar la barrera hematoencefalica, se realize) un ensayo i n v i v o utilizando ratones C57 wt inoculados con ectoina y diferentes tiempos de exposicion para, posteriormente, detectar por 30 HPLC la presencia o ausencia de ectoina. Para el ensayo se utilizaron 8 ratones C57 wt (edad: 3 meses) que fueron inyectados en la zona peritoneal con 6 mg ectoina en PBS/raton (200-250 mg/Kg). Los tiempos ensayados fueron 30 min, 3 horas y 24 horas. Se utilizaron 2 ratones por cada tiempo 35 ensayado y 2 ratones a los que se les inocule) onicamente con PBS, considerados como muestras control. Previamente a la extraccion del cerebro, cada ratOn se ES 2 582 427 B1 19 perfundio con PBS para evitar la contaminaciOn del mismo con sangre circulante que contiene ectoina. Posteriormente, se procedi6 a la extracci6n del cerebro de cada rat6n y a la separaci6n de las diferentes fracciones: corteza, hipocampo y resto. La corteza y el hipocampo son las zonas en las que se localiza la patologia producida por 5 el Alzheimer. Cada fraccion de cerebro se homogeneizo en un Douce's utilizando una soluciOn de PBS que contenia inhibidores de proteasas y fosfatasas. Posteriormente, la muestra se ultracentrifug6 para obtener la fracci6n de proteinas solubles (S1) y el sobrenadante se extrajo con una solucion de metanol:cloroformo:agua (10:5:4) mediante el protocolo modificado de Bligh y Dyer (1959) para la obtenciOn de la 10 fracci6n que contenia ectoina. Las muestras obtenidas se analizaron mediante HPLC utilizando una soluciOn de ectoina comercial como control. Los resultados muestran la presencia de ectoina, tanto en corteza e hipocampo como en el resto de cerebro, en aquellos ratones que fueron inoculados tanto a 30 minutos, 15 como a las 3 h y a las 24 h de exposici6n. Sin embargo, no se detecto ectoina en aquellos ratones que no fueron inoculados con la misma (ratones control). En la figura 4 sOlo se muestran los resultados obtenidos en tejido de corteza. ES 2 582 427 B1 20 5 REIVINDICACIONES 1. Uso de un compuesto seleccionado de entre ectoina o un derivado de ectoina de la fOrmula general (I) 0 (II): R3 R3 C-R4 HN---€C-R4 In /N R2 /N R R1 2 (I) (II) donde: R1 se selecciona de entre H o alquilo (C1-C4); 10 R2 se selecciona de entre H, -COOH, -000-alquilo (C1-C4) o —CONHR5; donde R5 se selecciona de entre H, alquilo (C1-C4), un aminoacido, un dipeptido o un tripeptido; R3 y R4 son iguales o diferentes y se selecciona de entre H u OH, y n es un valor de 1, 2 6 3, 15 o cualquiera de sus sales farmaceuticamente aceptables, para la elaboracion de un medicamento para el tratamiento y/o prevenciOn del datio oxidativo y la inflamaciOn debida a la agregaci6n proteica en celulas. 20 2. Uso segOn la reivindicacion 1, donde n es 2 y cada R3 es de manera independiente H u OH. 3. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde R4 es H. 25 4. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde R1 es H o —CH3. 5. Uso segOn la reivindicacion 4, donde R1 es -CH3. 6. Uso segun la reivindicacion 1, donde el compuesto es la ectoina. 7. Uso segun la reivindicaciOn 1, donde el compuesto es la hidroxiectoina. 30 ES 2 582 427 B1 21 8. Uso segUn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para el tratamiento y/o prevenciOn de enfermedades producidas por la formaci6n de agregados proteicos. 9. Uso segun la reivindicaciOn 8 donde la enfermedad es amiloidosis neuropatica, 5 sisternica y/o localizada. 10. Uso segt.ln la reivindicaciOn 8 donde la enfermedad es una enfemnedad neurodegenerativa. 10 11. Uso segt:In la reivindicacion 10 donde la enfermedad se selecciona de la lista que consiste en Alzheimer, Parkinson, Huntington, encefalopatias espongiformes, esclerosis lateral amiotrOfica (ELA) y polineuropatia amiloidOtica familiar. 15 12. Uso segiin la reivindicaciOn 11 donde la enfermedad es Alzheimer. 13. Uso segOn cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la concentraciOn de cornpuesto es inferior a 10 mM. 14. Uso segun la reivindicacion 13, donde la concentraciOn de compuesto es inferior a 20 3 mM. 15. Uso segOn la reivindicaciOn 14 donde la concentraci6n de compuesto se encuentra en un rango de entre 0,0001 y 1 mM. 25 16. Uso segOn la reivindicaciOn 15 donde la concentracion de compuesto se encuentra en un rango de entre 0,001 y 1 mM. 30 17. Uso segOn la reivindicacion 16 donde la concentracion de compuesto se encuentra en un rango de entre 0,001 y 0,1 mM. 18. Uso segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17 donde el medicamento esta fornnulado para su administraciOn peritoneal. ES 2 582 427 B1 22 ES 2 582 427 B1 23 ES 2 582 427 B1 24 ES 2 582 427 B1 25