scieee Science in your language
[es] (orig)

Papel de la NADPH oxidasa en el efecto modulador de la L-carnitina en la nefropatía hipertensiva

Blanca Lobato, Antonio Jesús · 2015

Abstract

La hipertensión arterial (HTA), definida como una elevación crónica de los valores normales de presión arterial, es el problema de salud más común en las sociedades desarrolladas, constituyendo uno de los factores de riesgo cardiovascular más relevantes. Además del sistema cardiovascular, la HTA afecta a otros órganos vitales como el riñón; de hecho, una de las principales consecuencias de la HTA es la pérdida progresiva de la función renal. Estudios recientes sugieren que la hipertensión es causa y consecuencia de las enfermedades renales, estando la presencia de fallo renal asociada al desarrollo de enfermedades cardiovasculares. La nefropatía hipertensiva, por tanto, se define como un trastorno dañino del riñón causado por una elevación continuada de los valores de presión arterial. Así, el incremento en la presión sanguínea sistémica conduce a un aumento de la presión glomerular, provocándose un estiramiento de la pared de los vasos, daño endotelial y un aumento en la filtración glomerular de proteínas. Estos procesos, a su vez, provocan cambios en las células mesangiales y tubulares proximales, resultando en última instancia en una sustitución del tejido funcional por tejido conectivo no funcional; esto es, provocándose una fibrosis. Por otro lado, uno de los factores más importantes en la progresión del fallo renal crónico es la activación del sistema renina-angiotensina (SRA), no solo por su efecto sobre la elevación de la presión sanguínea, sino también por favorecer los procesos de proliferación celular, inflamación y acumulación de matriz extracelular que acompañan a la nefropatía hipertensiva. Numerosos estudios demuestran que la angiotensina II (Ang II) tiene un papel fundamental en el daño funcional y estructural del riñón derivado de la hipertensión arterial, a través del efecto que realiza sobre el estrés oxidativo y la participación de la enzima NADPH oxidasa. Así, en la actualidad está aceptado que la Ang II genera estrés oxidativo en el riñón a través del receptor tipo I de la Ang II (AT1), mediando la generación de hipertensión arterial y el desarrollo de un daño renal progresivo. Además, nuestro grupo de investigación ha demostrado previamente los efectos antioxidantes y antifibróticos de la L-carnitina (LC) en modelos animales con hipertensión arterial (HTA) y fibrosis (cardiaca y renal), estando la enzima NADPH oxidasa involucrada en estos efectos beneficiosos de la LC. Resulta de gran interés determinar cómo modula la LC las diferentes isoformas de la NADPH oxidasa, y qué vías de señalización celular están implicadas al respecto. Nuestra hipótesis de trabajo es que la LC modula la actividad/expresión de la NADPH oxidasa en un contexto de HTA y fibrosis (con un aumento de estrés oxidativo subyacente), actuando de forma específica sobre una o varias isoformas y regulando las vías de señalización intracelular responsables de las acciones patológicas de la enzima. Por todo lo anterior, el objetivo general de esta tesis doctoral es demostrar el papel de la NADPH oxidasa en el efecto modulador de la L-carnitina (LC) en un modelo in vitro de nefropatía hipertensiva (creando un fenotipo hipertensivo y otro fibrótico mediante la estimulación de células NRK-52E con angiotensina II (Ang II) y factor de crecimiento transformante beta (TGFß), respectivamente), evaluando las vías de señalización implicadas. Nuestros resultados mostraron, que la LC reduce el estrés oxidativo inducido por la Ang II a través de la activación de la enzima NADPH oxidasa, modulando la expresión y actividad de dicha enzima y reduciendo los niveles de nitrosilación de proteínas y la cantidad de H2O2 generado. El aumento en la producción de O2.- inducido por Ang II es mediado por NOX1 y NOX2. NOX4 podría generar parte del H2O2 detectado, aunque la mayoría provendría de la dismutación del O2.- previamente generado por las otras isoformas. Por otro lado, el efecto antioxidante de la LC no se debería a una acción directa sobre las isoformas de la NADPH oxidasa presentes en las células NRK-52E, sino que este compuesto ejercería más bien su efecto actuando como scavenger de ERO. Además, el incremento de la actividad NADPH oxidasa inducida por Ang II en la línea celular NRK-52E, parece estar mediado por las vías de señalización de PI3K/Akt, p38 MAPK, ERK1/2, PKC y el complejo NF-kB. Por otro lado, el efecto inhibidor de la actividad NADPH oxidasa por parte de la LC se llevaría a cabo mediante la modulación de las quinasas Akt y PKC, y del complejo NF-kB. Por otro lado, el TGFß genera un fenotipo profibrótico caracterizado por un aumento del estrés oxidativo generado por la NADPH oxidasa y por un aumento en la activación de la vía de las proteínas Smad. Además, tanto en el modelo in vivo como in vitro, la inducción del fenotipo fibrótico con L-NAME o TGFß, respectivamente, reduce la capacidad de degradar colágeno, favoreciendo la aparición de fibrosis. Nuestra molécula en estudio, la LC, reduce el estrés oxidativo generado por la NADPH oxidasa, modulando también la vía de las proteínas Smad. En la misma línea, es capaz de normalizar el balance entre las proteínas MMP y TIMP, evitando de este modo la acumulación de colágeno y el desarrollo de fibrosis. En conclusión, nuestro estudio desvela algunos de los mecanismos de acción de la LC que podrían ser responsables de sus acciones beneficiosas frente a la nefropatía hipertensiva. De este modo, la L-carnitina protege al riñón del daño estructural y funcional derivado del exceso de estrés oxidativo y fibrosis, a través de diversos mecanismos que consiguen regular la expresión y actividad de la enzima NADPH oxidasa.

Read accessible full text

Papel de la NADPH oxidasa en el efecto modulador de la L-carnitina en la nefropatía hipertensiva

Author: Blanca Lobato, Antonio Jesús
Year: 2015
Source: https://idus.us.es/bitstreams/148392fb-ee8e-4093-873d-8d07a4fe9a84/download
PAPEL DE LA NADPH OXIDASA EN EL
EFECTO MODULADOR DE LA L-CARNITINA
EN LA NEFROPATÍA HIPERTENSIVA
Tesis Doc o al
ANTONIO JESÚS BLANCA LOBATO
Di ec o es
CARMEN MARÍA VÁZQUEZ CUETO
ALFONSO MATE BARRERO
ELISA REVILLA TORRES
Se illa, 2014
CARMEN MARÍA VÁZQUEZ CUETO, Ca ed á ica del Depa amen o de Fisiología
de la Uni e sidad de Se illa; ALFONSO MATE BARRERO, P o eso Ti ula del
Depa amen o de Fisiología de la Uni e sidad de Se illa; y ELISA REVILLA TORRES
P o eso a Ti ula del Depa amen o de Fisiología de la Uni e sidad de Se illa,
INFORMAN
Que la Tesis i ulada PAPEL DE LA NADPH OXIDASA EN EL EFECTO
MODULADOR DE LA L-CARNITINA EN LA NEFROPATÍA HIPERTENSIVA
,
p esen ada
po el Ldo. ANTONIO JESÚS BLANCA LOBATO pa a op a al g ado de doc o po la
Uni e sidad de Se illa, ha sido ealizada bajo nues a di ección en el Depa amen o de
Fisiología de la Uni e sidad de Se illa y, conside ándola concluida, au o izan su
p esen ación a in de que pueda se de endida an e el ibunal co espondien e.
Y pa a que así cons e, i man la p esen e en Se illa, a 10 de No iemb e de 2014
Fdo.: D a. Ca men Mª Vázquez Cue o Fdo.: D . Al onso Ma e Ba e o
Fdo.: D a. Elisa Re illa To es
Es e abajo de in es igación ha sido sub encionado po las ayudas:
- FIS PS09/01395 del Fondo de In es igación Sani a ia, Minis e io de Sanidad y Consumo
(Ins i u o de Salud Ca los III).
- PI-0034/2008 de la Conseje ía de Salud de la Jun a de Andalucía.
- PI-0060/2012 de la Conseje ía de Salud de la Jun a de Andalucía.
Du an e su ealización el au o ha dis u ado de con a os de apoyo de pe sonal de
in es igación sub encionados po Fondo de In es igación Sani a ia, Minis e io de Sanidad
y Consumo (Ins i u o de Salud Ca los III) (FIS PS09/01395), y po la Jun a de Andalucia
(PI-0060/2012).

A MIS QUERIDOS PADRES
A MI HERMANA
i
RESULTADOS
1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR
ANGIOTENSINA II: ESTUDIO DE LA NADPH OXIDASA ........................................................ 71
1.1. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN
SUPERÓXIDO
.................................................................................................................... 71
1.1.1. Ensayo concen ación- espues a pa a angio ensina II
........................................... 71
1.1.2. Ensayo iempo- espues a pa a angio ensina II
....................................................... 72
1.2. CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO EN
RESPUESTA A LA ANGIOTENSINA II
............................................................................... 72
1.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE LA LÍNEA NRK-
52E
..................................................................................................................................... 74
1.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD NADPH OXIDASA
................. 74
1.4.1. Ensayo concen ación- espues a pa a la L-ca ni ina
............................................ 74
1.4.2. E ec o de la L-ca ni ina sob e la ac i idad nadph oxidasa es imulada po
angio ensina II
................................................................................................................. 75
1.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II ............................................................
76
1.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LOS NIVELES DE NITROSILACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II .....................................
77
1.7. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LAS ISOFORMAS
NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON
ANGIOTENSINA II .............................................................................................................
78
1.8. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN PROTEICA DE LAS
ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN CÉLULAS
ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II ...........................................................................
80
1.9. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA
INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Y H2O2 ........................
82
2. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR INVOLUCRADAS EN LA REGULACIÓN DE LA
ACTIVIDAD NAPDH OXIDASA POR L-CARNITINA ............................................................ 93
2.1. EFECTO DE LA WORTMANINA, SB203580, PD98059 Y BIS I SOBRE LA ACTIVIDAD
NADPH OXIDASA
. .............................................................................................................. 93

2.1.1. E ec o de la wo manina, SB203580, PD98059 y BIS I sob e la ac i idad NADPH
oxidasa inducida po angio ensina II
................................................................................ 93
2.1.2. E ec o de la wo manina, SB203580, PD98059 Y BIS I sob e la ac i idad NADPH
oxidasa en células a adas con angio ensina II y L-ca ni ina
........................................... 94
2.2. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II Y LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN
DE LAS PROTEÍNAS AKT, p38 MAPK Y ERK1/2
................................................................. 96
2.2.1. Ciné ica de la os o ilación de la p o eína Ak inducida po angio ensina II
............. 96
2.2.2.
E ec o de la L-ca ni ina sob e la os o ilación de la p o eína Ak en células
es imuladas con angio ensina II
....................................................................................... 97
2.2.3. Ciné ica de la os o ilación de la p o eína p38 MAPK inducida po angio ensina II
........................................................................................................................................ 99
2.2.4. E ec o de la L-ca ni ina sob e la os o ilación de la p o eína p38 MAPK en células
a adas con angio ensina II
........................................................................................... 100
2.2.5.
Ciné ica de la os o ilación de la p o eína ERK1/2 inducida po angio ensina II ...... 101
2.2.6. E ec o de la L-ca ni ina sob e la os o ilación de la p o eína ERK1/2 en células
a adas con angio ensina II ........................................................................................... 102
2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA QUINASA C
(PKC) EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II
......................................... 103
2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL NF-ΚB HACIA EL
NÚCLEO
........................................................................................................................... 104
2.4.1. Ciné ica de la anslocación del complejo NF-kB inducida po angio ensina II ......
104
2.4.2. E ec o de la L-ca ni ina sob e la anslocación del complejo NF-KB hacia el núcleo
en células a adas con angio ensina II .......................................................................... 104
2.4.3. E ec o de la L-ca ni ina en la os o ilación de α-IkB inducida po angio ensina II
.. 106
3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LOS MECANISMOS FIBRÓTICOS INDUCIDOS
POR TGFβ. ESTUDIO DE LA NADPH OXIDASA, PROTEÍNAS SMAD Y
METALOPROTEINASAS. ................................................................................................. 107
3.1. EFECTO DEL TGFβ SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO.
CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE O2.- EN RESPUESTA A TGFβ.
....................... 107
3.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD NADPH OXIDASA EN
CÉLULAS ESTIMULADAS CON TGFβ
............................................................................. 108
3.2.1. Ensayo concen ación- espues a pa a la L-ca ni ina
........................................... 108
i
3.2.2. E ec o de la L-ca ni ina sob e la ac i idad NADPH oxidasa es imulada po TGFβ
...................................................................................................................................... 109
3.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LAS ISOFORMAS
NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA
.............................................................. 110
3.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE CTGF
(MARCADOR DE FIBROSIS) INDUCIDA POR TGFβ
....................................................... 113
3.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA
SMAD2 INDUCIDA POR TGFβ
......................................................................................... 114
3.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL SISTEMA DE DEGRADACIÓN DE
COLÁGENO
.................................................................................................................... 115
3.6.1. Es udios in i o
................................................................................................... 115
3.6.1.1. E ec o de la L-ca ni ina en la exp esión génica de MMP-9 en co eza enal de
a as hipe ensas
...................................................................................................... 115
3.6.1.2. E ec o de la L-ca ni ina en la exp esión génica de TIMP-1 en co eza enal de
a as hipe ensas
...................................................................................................... 116
3.6.1.3. E ec o de la L-ca ni ina en el a io MMP-9/TIMP-1 en co eza enal de a as
hipe ensas.
.............................................................................................................. 117
3.6.2. Es udios in i o
................................................................................................... 118
3.6.2.1. E ec o de la L-ca ni ina en la exp esión génica de MMP9 en células NRK-52E
................................................................................................................................. 118
3.6.2.2. E ec o de la L-ca ni ina en la exp esión génica de TIMP-1 en células NRK-52E
................................................................................................................................. 119
3.6.2.3. E ec o de la L-ca ni ina en el a io MMP-9/TIMP-1 en células NRK-52E
........ 120
DISCUSIÓN
1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR
ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA NADPH OXIDASA: RUTAS DE SEÑALIZACIÓN
IMPLICADAS ........................................................................................................................ 123
1.1 EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR
ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA NADPH OXIDASA
................................................. 123
1.2 RUTAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN EL EFECTO DE LA L-CARNITINA
SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA
NADPH OXIDASA
............................................................................................................. 129
2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTADO FIBRÓTICO INDUCIDO POR TGFβ131
CONCLUSIONES ................................................................................................................. 135
BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 139
ii
ABREVIATURAS
(e)NOS: (endo elial) óxido ní ico sin asa
AA: ácido a aquidónico
Ace il CoA: ace il coenzima A
ADN: ácido desoxi ibonucleico
ARN: ácido ibonucleico
AT1: ecep o ipo I de la angio ensina II
ATP: adenosín i os a o
BH4: e ahid obiop e ina
BIS I: bisindolilmaleimida I
CAT: ca alasa
CoA: coenzima A
cPLA2: os olipasa A2 ci osólica
CTGF: ac o de c ecimien o de ejido
conjun i o
DAG: diacilglice ol
DMSO: dime ilsul óxido
DPI: di enil-eno-iodonio
DTT: di io ei ol
DUOX: oxidasa dual
EDTA: ácido e ilendiamino e aacé ico
EGTA: ácido e ilenglicol-bis-(2-aminoe il)-
e aacé ico
ERK: quinasa ac i ada po señales
ex acelula es
ERO: especies eac i as de oxígeno
ET-1: Endo elina 1
FAD: la ín adenín dinucleó ido
GADPH: glice aldehído-3- os a o
deshid ogenasa
GDP: guanosín di os a o
GEF: ac o de in e cambio de
nucleó idos de guanina
GPx: Glu a ión pe oxidasa
GR: Glu a ión educ asa
GTP: guanosín i os a o
HNE: 4-hid oxi-2-nonenal
HTA: hipe ensión a e ial
HUVEC: células endo eliales de ena
umbilical humana
IGF-1: ac o de c ecimien o insulínico
ipo I
IkB: inhibido de kappa B
LC: L-ca ni ina
L-NAME: N ⍵-ni o-L-a ginina me il és e
hid oclo u o
MAPK: p o eína quinasa ac i ada po
mi ógenos
MMP: me alop o einasas de la ma iz
ex acelula
MOPS: ácido 3-(N-mo olino)
p opanosul ónico
iii
MPO: mielope oxidasa
NADPH: nico amín adenín dinucleó ido
os a o
NF-kB: ac o de ac i ación nuclea
kappa B
NO: óxido ní ico
NOX: NADPH oxidasa
NOXA1:
nox ac i a o 1
NOXO1:
nox o ganize 1
N 2: ac o elacionado al ac o nuclea
e i oidal 2
OCTN:
o ganic ca ion anspo e s no el
OXI: oxipu inol
PAK: quinasa ac i ada po p21
PCR: eacción en cadena de la
polime asa
PDGF: ac o de c ecimien o de i ado de
plaque as
PI3K: os oinosi ol 3- os a o quinasa
PI3P: os a idilinosi ol 3- os a o
PKC: p o eína quinasa C
PLC: os olipasa C
PLD: os olipasa D
PMSF: luo u o de enilme ilsul onilo
PPAR: ecep o ac i ado de la
p oli e ación de pe oxisomas
RASMC: células de músculo liso de ao a
de a a
ROT: o enona
SDS: dodecilsul a o sódico
SFB: sue o e al bo ino
SHR:
spon aneusly hype ensi e a s
( a as gené icamen e hipe ensas)
siRNA: ARN de in e e encia
Smad: small mo he s agains
decapen aplegic
SOD: supe óxido dismu asa
SRA: sis ema enina-angio ensina
S c: i osina quinasa S c
TGFβ: ac o de c ecimien o
ans o man e β
TIMP: inhibido isula endógeno de
me alop o einasas
TNFα: ac o de nec osis umo al α
TβRI/ALK5: ecep o de TGFβ ipo I
TβRII: ecep o de TGFβ ipo II
URL: unidades ela i as de luz
VSMC: células de músculo liso ascula
XDH: xan ina deshid ogenasa
XO: xan ina oxidasa
α-SMA: α-ac ina de músculo liso
ix
LISTADO DE REACTIVOS Y ANTICUERPOS
- 2-ace il eno iazina
(Sigma-Ald ich, España)
.................................................. A . 175226
- Ácido 3-(N-mo olino) p opanosul ónico (MOPS)
(USB, Alemania)
..................................
.............................................................................................................................
A . 19256
- Ácido acé ico
(Pan eac, España)
............................................................. A . 11008.1102
- Ácido clo híd ico (HCL)
(Pan eac, España)
.................................................... A . 141020
- Ácido e ilendiamino e aacé ico (EDTA)
(Sigma-Ald ich, España)
....................................
............................................................................................................................. A . E1644
- Ácido e ilenglicol-bis-(2-aminoe il)- e aacé ico (EGTA)
(Sigma-Ald ich, España)
...........
............................................................................................................................. A . E4378
- Ac ilamida/Bisac ilamida al 30%
(Bio-Rad Labo a o ies)
................................. A . 67784
- Aga osa es ánda baja EEO
(Ecogen, España)
............................................ A . AG0120
- Agua-DEPC
(In i ogen, España)
.................................................................. A . AM9906
-
Ame sham ECL P ime Wes e n Blo ing De ec ion eagen
(GE Heal hca e Li e
Science, España)
.......................................................................................... A . RPN2232
- Amonio pe sul a o (APS)
(Sigma-Ald ich, España)
.......................................... A . A3678
-
Amplex ed hyd ogen/pe oxidase assay ki
(In i ogen, España)
.....................................
............................................................................................................................ A A22188
- Angio ensina II
(Sigma-Ald ich, España)
.......................................................... A . A9525
- An icue po an i-Ak
(Cell signaling, USA) ...........................................................
A . 9272
- An icue po an i-ERK1/2
(San a C uz Bio echnology, España)
...........................................
...................................................................................................................... A . sc-135900
- An icue po an i-mouse IgG-HRP
(San a C uz Bio echnology, España) ...........................
.......................................................................................................................... A . sc-2031
- An icue po an i-ni o osina
(Millipo e, Alemania)
............................................ A . 05-233
- An icue po an i-NOX1
(San a C uz Bio echnology, España)
...................... A . sc-25545

x
- An icue po an i-NOX2
(Epi omics, USA)
......................................................... A . 5653-1
- An icue po an i-NOX4
(San a C uz Bio echnology, España)
...................... A . sc-30141
- An icue po an i-p38 MAPK
(Cell signaling, USA) ...............................................
A . 9212
- An icue po an i-p65 NF-kB
(San a C uz Bio echnology, España)
.....................................
............................................................................................................................ A . sc-372
- An icue po an i-p-Ak
(Cell signaling , USA) .....................................................
A . 92715
- An icue po an i-p-p38 MAPK
(Cell signaling, USA) ..........................................
A . 92115
- An icue po an i-p-Smad2
(San a C uz Bio echnology, España) .......................................
...................................................................................................................... A . sc-101801
- An icue po an i- abbi IgG-HRP
(San a C uz Bio echnology, España)
.............................
.......................................................................................................................... A . sc-2030
- An icue po an i-α-IkB
(San a C uz Bio echnology, España)
.......................... A . sc-8404
- An icue po an i-β-ac ina
(Sigma-Ald ich, España)
............................................ A . A5441
- An icue po p-ERK1/2
(San a C uz Bio echnology, España)
......................... A . sc-81492
- Ap o inina
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................ A . A-1153
- Azul de b omo enol
(Sigma-Ald ich, España)
................................................. A . B-8026
- Benzamidina
(Sigma-Ald ich, España)
............................................................. A . B6506
-
Bio-Rad P o ein Assay
(Reac i o de B ad o d)
(Bio-Rad Labo a o ies, USA)
.................
........................................................................................................................ A . 500-0006
- Bisindolilmaleimida I (BIS I)
(Sigma-Ald ich, España)
...................................... A . B6292
-
Blo ing-G ade Blocke
(Bio-Rad Labo a o ies)
........................................... A . 170-6404
- Clo o o mo
(Sigma-Ald ich, España)
.............................................................. A . C-2432
- Clo u o cálcico (CaCl2)
(Sigma-Ald ich, España)
............................................ A . C3881
- Clo u o magnésico (MgCl2)
(Sigma-Ald ich, España)
...................... A . MM1058335000
- Clo u o po ásico (KCl)
(Sigma-Ald ich, España) ..............................................
A . P4504
- Clo u o sódico (NaCl)
(Pan eac, España)
...................................................... A . 211939
xi
- Cóc el inhibido de os a asas
(Sigma-Ald ich, España)
.................................. A . P0044
- Cóc el inhibido de p o easas
(Roche, USA)
........................................ A . 11697498001
- Deoxicola o sódico
(Sigma-Ald ich, España)
................................................... A . D6750
- di enil-eno-iodonio (DPI)
(Sigma-Ald ich, España)
.......................................... A . D2926
- Dime ilsul óxido (DMSO)
(Sigma-Ald ich, España)
........................................ A . 276855
- Di io ei ol
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................ A . D-0632
- Dodecilsul a o sódico (SDS)
(Sigma-Ald ich, España)
....................................... A .
3771
-
Dulbecco,s Modi ied Eagle,s Medium
(DMEM) 1X
(In i ogen, España) ........................
......................................................................................................................
A . 12491-015
-
Dulbecco,s phospha e bu e ed saline
(DPBS) 1X
(In i ogen, España) ..........................
......................................................................................................................
A . 14190-250
- E anol absolu o
(Pan eac, España)
....................................................... A . 141086.1214
-
Fas S a SYBR G een Mas e (Roche, Alemania)
.......................... A . 7504673514001
- Fluo u o de enilme ilsul onilo
(Sigma-Ald ich, España)
................................... A . P7626
- Fluo u o de sodio
(Sigma-Ald ich, España)
.................................................... A . 201154
- Fo maldehído
(Pan eac, España)
.......................................................... A . 131328.1211
- Fos a o po ásico monobásico (KH2PO4)
(Pan eac, España)
......................... A . 141509
- ɣ-globulina bo ina
(Bio-Rad Labo a o ies, USA)
......................................... A . 500-0005
- Glice ol
(Sigma-Ald ich, España)
.................................................................... A . G-5516
- Glicina
(Sigma-Ald ich, España)
..................................................................... A . G-8898
- gp91 ds- a
(Anaspec, USA)
............................................................................. A . 63818
- HEPES
(Sigma-Ald ich, España)
..................................................................... A . H3375
- Isop opanol
(Sigma-Ald ich, España)
............................................................... A . I-9516
- Ki
High-Capaci y cDNA A chi e (Applied Biosys ems, España) ......................................
.........................................................................................................................
A . 4322171
- L-ca ni ina
(Roig Fa ma)
.............................................................................. A . 32183-25
- Leupep ina
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................ A . L2884
xii
-
Lipo ec amine 2000 T ans ec ion Reagen
(In i ogen, España)
......................................
........................................................................................................................ A .11668019
- Lucigenina
(Sigma-Ald ich, España)
............................................................... A . M-8010
- Ma cado de pesos molecula es
(Bio-Rad Labo a o ies, USA)
.................... A .161-073
- Memb ana de ni ocelulosa
(Bio-Rad Labo a o ies)
.................................... A . 162-0115
- Me anol
(Pan eac, España)
................................................................... A . 131091.1214
- N ⍵-ni o-L-a ginina me il és e hid oclo u o (L-NAME)
(Sigma-Ald ich, España)
............
............................................................................................................................ A . N5751
- Nonide P-40
(Sigma-Ald ich, España)
............................................................ A . NP40S
- Op i-MEM I Reduced Se um Medium (1X)
(In i ogen, España)
......................................
....................................................................................................................... A . 31985062
- O o anada o de sodio
(Sigma-Ald ich, España)
............................................. A . S6508
- Oxipu inol
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................. A . O6861
- PD98059
(Sigma-Ald ich, España)
..................................................................... A . P215
- Penicilina/es ep omicina 100X
(In i ogen, España) ................................
A . 15070-063
-
PKC kinase ac i i y ki (Enzo Li e Sciences, USA)
............................. A . ADI-EKS-420A
-
Ponceau S
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................ A . P3504
-
Red-Sa e nucleic acid s aining solu ion (In on Bio echnology, Co ea)
............................
............................................................................................................................. A . 21141
- Ro enona
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................. A . R8875
- Saca osa
(Me ck, Alemania) ...........................................................................
A . 107654
- SB203580
(Sigma-Ald ich, España)
................................................................. A . S8307
-
Silence Selec ed Nega i e Con ol siRNA (Applied Biosys ems, España)
......................
......................................................................................................................... A . 4390844
-
Silence Selec ed p e-designed siRNA o NOX2 (Applied Biosys ems, España) ............
......................................................................................................................... A . 4390771
xiii
-
Silence Selec ed p e-designed siRNA o NOX4 (Applied Biosys ems, España)
............
......................................................................................................................... A . 4390771
- Sue o e al bo ino (SFB)
(In i ogen, España)
............................................ A . 244-0096
- Supe óxido dismu asa (SOD)
(Sigma-Ald ich, España)
................................... A . S5751
- Tampón de mues a,
Laemmli 2x concen a e
(Sigma-Ald ich, España)
..........................
........................................................................................................................... A . S-3401
- TEMED
(Bio-Rad Labo a o ies, USA)
.......................................................... A . 161-0800
- TGFβ
(R&D Biosys ems, USA)
.................................................................. A . 240-B-002
- T ipsina-EDTA (1X)
(In i ogen, España)
................................................... A . 25300054
- T is-hid oxime il-animome ano (T izma®, T is)
(Sigma-Ald ich, España)
.........................
............................................................................................................................ A . T-1358
- TRIzol®
(In i ogen, España)
...................................................................... A . 15596018
- Tween-20
(Sigma-Ald ich, España)
.................................................................. A . P1379
- Wo manina
(Sigma-Ald ich, España)
.............................................................. A . W1628
- β-glice ol os a o
(Sigma-Ald ich, España)
....................................................... A . G5422
- β-me cap oe anol
(Bio-Rad Labo a o ies)
................................................... A . 161-0710
- β-Nico inamín adenín dinucleó ido os a o educido (NADPH)
(Sigma-Ald ich, España)
.
........................................................................................................................... A . N-6505
xx

INTRODUCCIÓN
3
In oducción
1. NEFROPATÍA HIPERTENSIVA
La hipe ensión a e ial (HTA), de inida como una ele ación c ónica de los alo es
no males de p esión a e ial, es el p oblema de salud más común en las sociedades
desa olladas, cons i uyendo uno de los ac o es de iesgo ca dio ascula más
ele an es.1,2 Además del sis ema ca dio ascula , la HTA a ec a a o os ó ganos i ales
como el iñón; de hecho, una de las p incipales consecuencias de la HTA es la pé dida
p og esi a de la unción enal.3 Es udios ecien es sugie en que la hipe ensión es causa y
consecuencia de las en e medades enales, es ando la p esencia de allo enal asociada al
desa ollo de en e medades ca dio ascula es.4
La ne opa ía hipe ensi a, po an o, se de ine como un as o no dañino del iñón
causado po una ele ación con inuada de los alo es de p esión a e ial.5 Así, el
inc emen o en la p esión sanguínea sis émica conduce a un aumen o de la p esión
glome ula , p o ocándose un es i amien o de la pa ed de los asos, daño endo elial y un
aumen o en la il ación glome ula de p o eínas. Es os p ocesos, a su ez, p o ocan
cambios en las células mesangiales y ubula es p oximales, esul ando en úl ima ins ancia
en una sus i ución del ejido uncional po ejido conec i o no uncional; es o es,
p o ocándose una ib osis.6
Po o o lado, uno de los ac o es más impo an es en la p og esión del allo enal
c ónico es la ac i ación del sis ema enina-angio ensina (SRA), no solo po su e ec o sob e
la ele ación de la p esión sanguínea, sino ambién po a o ece los p ocesos de
p oli e ación celula , in lamación y acumulación de ma iz ex acelula que acompañan a la
ne opa ía hipe ensi a. Nume osos es udios demues an que la angio ensina II (Ang II)
iene un papel undamen al en el daño uncional y es uc u al del iñón de i ado de la
hipe ensión a e ial, a a és del e ec o que ealiza sob e el es és oxida i o y la
pa icipación de la enzima NADPH oxidasa. Así, en la ac ualidad es á acep ado que la Ang
II gene a es és oxida i o en el iñón a a és del ecep o ipo I de la Ang II (AT1),
mediando la gene ación de hipe ensión a e ial y el desa ollo de un daño enal
p og esi o.6-9
4
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
1.1. ESTRÉS OXIDATIVO
1.1.1. CONCEPTO DE ESTRÉS OXIDATIVO. ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO
(ERO)
El es és oxida i o se de ine como un desequilib io en e la o mación de las
especies eac i as de oxígeno (ERO) y los mecanismos de de ensa an ioxidan es,
enómeno que pa icipa en mul i ud de p ocesos pa ológicos.10
En gene al, los adicales lib es son especies químicas con un elec ón
desapa eado, siendo moléculas al amen e eac i as. La o mación de adicales lib es en
cadena lide a el daño a ejidos y sis emas biológicos. La g an mayo ía de es os adicales
lib es son p incipalmen e adicales de oxígeno y o as ERO. En e es as especies eac i as
se encuen an: anión supe óxido (O2.-), pe óxido de hid ógeno (H2O2), adical hid oxilo
(OH.), óxido ní ico (NO), pe oxini i o (ONOO-), ácido hipoclo oso (HOCl) y oxígeno
single e (1O2)11,12 (Figu a 1). Las ERO ienen un al o po encial dele é eo pa a la in eg idad
de las células, po lo cual deben de se neu alizadas po el sis ema de de ensa
an ioxidan e. En los sis emas biológicos, exis en sis emas enzimá icos y no enzimá icos
que p o egen a la célula de los e ec os pe judiciales del es és oxida i o. En e las enzimas
an ioxidan es que pa icipan en la eliminación de las ERO se encuen an la supe óxido
dismu asa (SOD), que con ie e el anión supe óxido en pe óxido de hid ógeno, y las
enzimas ca alasa (CAT) y glu a ión pe oxidasa (GPX), las cuales ca alizan la
descomposición del pe óxido de hid ógeno en agua. También la enzima glu a ión
educ asa (GR) es de i al impo ancia, ya que gene a glu a ión educido (GSH) a pa i de
glu a ión oxidado (GSSG), siendo aquél necesa io pa a la acción de la GPX (Figu a 1).
En e los an ioxidan es endógenos no enzimá icos des acan p incipalmen e el glu a ión, y
las i aminas A, C, E en e o os.13,14
5
In oducción
Figu a 1: Me abolismo de las especies eac i as de oxígeno (ERO). CAT, ca alasa; Cl-, clo u o;
GPX, glu a ión pe oxidasa; GR, glu a ión educ asa; GSH, glu a ión educido; GSSG, glu a ión
oxidado; H2O, agua; H2O2, pe óxido de hid ógeno; HOCl, ácido hipoclo oso; MPO,
mielope oxidasa; NO, óxido ní ico; NOS, óxido ní ico sin asa; O2, oxígeno molecula ; O2.-,
anión supe óxido; 1O2, oxígeno single e; OH., adical hid oxilo; ONOO-, pe oxini i o; SOD,
supe óxido dismu asa.
1.1.1.1. FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO
Las ERO pa icipan y con ibuyen en una amplia a iedad de unciones y
mecanismos esenciales pa a la célula. Así, o man pa e del sis ema inespecí ico de
de ensa en e a bac e ias u o os mic oo ganismos, ac úan como senso es de la p esión
de oxígeno, y pa icipan en el desa ollo y mig ación de las células de la muscula u a lisa,
en la modulación de la unción endo elial ( egulando el ono ascula ), en la exp esión de
las ci oquinas p oin lama o ias y en la modi icación de la ma iz ex acelula , en e
o os.9,10,15
Las ERO ambién pueden ac ua como segundos mensaje os (p incipalmen e el
anión supe óxido y el pe óxido de hid ógeno), ampli icando las señales de ansducción de
H202
OH.
02.-
H2O
CAT
HOCl
1O2
O2.-
NADPH oxidasa
Xan ina oxidasa
NOS
Lipooxigenasas
Ciclooxigenasas
Cadena anspo ado a de e-
Ci oc omo P450
MPO
H202
1O2
SOD
ONOO-
+ NO
02
GPX
GR
GSSG
GSH
O2+ Cl-
H2O2
H2O

6
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
a ios ecep o es de memb ana. Así, po ejemplo, el anión supe óxido es imula la
ac i ación de la enzima guanila o ciclasa, o mando GMPc, que es un po en e mensaje o
secunda io, además de ac ua como mensaje o in acelula esencial en la acción p eso a
de la Ang II.15,16 Po o o lado, el pe óxido de hid ógeno pa icipa en ías de señalización
que egulan p ocesos de mig ación y di e enciación celula , así como en ías de
señalización in oluc adas en p ocesos de hipe o ia, modulando la ac i ación de p o eínas
MAPK (p o eínas quinasas ac i adas po mi ógeno) ales como p38 MAPK (p o eína
quinasa p38 ac i ada po mi ógeno) y ERK1/2 (p o eínas quinasas eguladas po señales
ex acelula es 1 y 2).17
1.1.1.2. FUENTES ENZIMÁTICAS PRODUCTORAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE
OXÍGENO
En las células exis en muchas uen es enzimá icas p oduc o as de especies
eac i as de oxígeno. En e ellas, cabe des aca :
a) La enzima xan ina oxidasa. Se encuen a localizada en el ci osol, en la supe icie
ex e na de la memb ana celula (con p edominio en las egiones de con ac o in e celula ) y
en esículas in acelula es. Es una me alo la op o eína que puede es a en dos o mas
in e con e ibles y di e en es en e sí, denominadas xan ina deshid ogenasa (XDH) y
xan ina oxidasa (XO). De es as dos o mas, solo la segunda gene a anión supe óxido po
oxidación de la hipoxan ina a xan ina, y de la xan ina a ácido ú ico (p ocesos que equie en
la educción de oxígeno molecula ) (Figu a 2). Po an o, la ac i ación en exceso de XO
puede aumen a la gene ación de las ERO, siendo és a la causa de muchas en e medades
que cu san con daño en la unción ascula .18,19
Figu a 2: Reacciones ca alizadas po la xan ina oxidasa. H2O, agua; H2O2, pe óxido de
hid ógeno; O2, oxígeno molecula ; O2.-, anión supe óxido.
7
In oducción
b) La enzima
óxido ní ico sin asa
(NOS) desacoplada. La NOS se localiza en
ca eolas del sa colema, úbulos T de ca diomioci os, mi ocond ia y e ículo endoplásmico.
En condiciones isiológicas, es a enzima, en p esencia de co ac o es como la L-a ginina y
la e ahid obiop e ina (BH4), p oduce NO. Aho a bien, en si uaciones ad e sas, puede
llega a su i un p oceso de “desacoplamien o” po de iciencia de BH4 o L-a ginina. En
es as condiciones, la NOS educe el oxígeno molecula y gene a anión supe óxido (Figu a
1). Además, hay que ene en cuen a que el pe oxini i o, o mado po la unión en e el
anión supe óxido y el óxido ní ico (Figu a 1), puede oxida a la BH4, colabo ando en el
p oceso de desacoplamien o. El inc emen o en la p oducción de anión supe óxido, así
como el aumen o en la gene ación de pe oxini i o, o man pa e de la isiopa ología de
muchas en e medades ca dio ascula es.19-21
c) La cadena espi a o ia mi ocond ial. La p oducción de ERO en la mi ocond ia es
impo an e pa a el con ol del me abolismo y de la ansducción de señales, en e o as
unciones. Más del 95% del O2 consumido po las células es educido po 4 elec ones
pa a gene a 2 moléculas de agua median e los complejos enzimá icos (I-IV) de la cadena
mi ocond ial. En meno medida, es e lujo de elec ones es di igido hacia la gene ación de
anión supe óxido (Figu a 1). Los complejos que más anión supe óxido gene an en la
cadena espi a o ia mi ocond ial son el complejo I (NADH deshid ogenasa) y el complejo III
(ubiquinona-ci oc omo c educ asa). La mayo ía del supe óxido gene ado es ápidamen e
dismu ado a pe óxido de hid ógeno po la enzima supe óxido dismu asa22-24 (Figu a 1).
d) La enzima ci oc omo P450. Se encuen a localizada en las memb anas
plasmá ica, mi ocond ial y del e ículo endoplásmico, gene ando anión supe óxido y
adicales hid oxilo19,25,26 (Figu a 1).
e) Las enzimas lipooxigenasas, ciclooxigenasas y mielope oxidasa (MPO). La
enzima MPO gene a HOCl a pa i de Cl- y H2O2, localizándose en los g ánulos p ima ios
de neu ó ilos. Las enzimas ciclooxigenasas y lipooxigenasas gene an anión
supe óxido23,26-28 (Figu a 1).
) La enzima NADPH oxidasa. Po su impo ancia en el con ex o del p esen e
es udio, dedica emos el apa ado 1.2 a la desc ipción de allada de es a enzima gene ado a
de especies eac i as de oxígeno. Los cambios en la egulación de es a enzima pueden
8
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
induci un aumen o del es és oxida i o de especial ele ancia en la iniciación y p og esión
de en e medades ca dio ascula es y enales.
1.1.2. ESTRÉS OXIDATIVO: CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS RENALES
En de e minadas condiciones pa ológicas, el inc emen o en la gene ación de ERO
y/o la depleción del sis ema an ioxidan e p oducen un aumen o de es és oxida i o que
esul a, como hemos comen ado, en un daño en el ejido. Las ERO ienen un e ec o
dele é eo sob e lípidos, p o eínas y ácidos nucleicos. La pe oxidación lipídica es
pa icula men e dañina, al i acompañada de una libe ación adicional de sus ancias
eac i as, con modi icación de las es uc u as celula es. Po su pa e, especies eac i as
como el pe oxini i o pueden eacciona con esiduos de p o eínas, p o ocando la apa ición
de ni o i osina. A con inuación, las p o eínas oxidadas se inac i an y se uel en más
suscep ibles a se eliminadas po p o eólisis. Po úl imo, las ERO ambién a acan a odos
los componen es de la molécula de ADN, pudiendo p o oca modi icaciones pe manen es
en el ma e ial gené ico.29-33
Todos es os mecanismos dañinos pa a la célula han sido implicados en la
pa ogénesis de muchas en e medades, incluyendo al e aciones enales como
glome ulone i is, allo enal agudo, allo enal p og esi o y ne i is úbulo-in e s icial. Po
o o lado, hay que ene en cuen a la especial ulne abilidad del iñón an e el daño po
es és oxida i o, debido al al o con enido en ácidos g asos poliinsa u ados de cadena la ga
que exis e en e los lípidos enales.10,34
Exis en dis in as en e medades que inducen es és oxida i o en el iñón,
con ibuyendo a la en e medad enal. En e es as en e medades se encuen an la
hipe coles e olemia, el sínd ome me abólico, la
diabe es melli us
o la hipe ensión. En
conc e o, y como ya se ha señalado, la hipe ensión a e ial se conside a una de las
mayo es causas de desa ollo de allo enal, siendo el egulado cla e en el desa ollo de
es a pa ología el es és oxida i o.34
Po o o lado, el SRA juega un papel esencial en la egulación de p ocesos
isiológicos y isiopa ológicos en el iñón. La Ang II p oduce es és oxida i o en el iñón a
9
In oducción
a és de la sob eexp esión de la enzima NADPH oxidasa a lo la go de la ne ona, con la
consecuen e gene ación de anión supe óxido. Así, el aumen o de la pe oxidación lipídica
en pacien es hipe ensos con en e medad eno ascula , se elaciona con un aumen o del
es és oxida i o p oducido po la ac i ación del sis ema SRA y los consiguien es e ec os
sis émicos de la Ang II.9,35
1.2. NADPH OXIDASA
1.2.1. ASPECTOS GENERALES
La enzima
nico inamida adenina dinucleó ido os a o oxidasa
(NADPH oxidasa) es
un complejo mul ienzimá ico que ca aliza la p oducción de anión supe óxido, median e la
ans e encia de un elec ón p oceden e de una molécula de NADPH has a el oxígeno
molecula . Todas las iso o mas de la NADPH oxidasa poseen una se ie de p opiedades
es uc u ales comunes: si io de unión a NADPH, si io de unión a
la ina adenina
dinucleó ido
(FAD), 6 dominios ansmemb ana conse ados, y 4 his idinas al amen e
conse adas asociadas a g upos hemo.36,37
La enzima NADPH oxidasa in e iene en nume osas unciones, en e las que
des acan: señalización celula , mediación de e ec os ho monales, egulación de la
ac i idad de canales iónicos, senso de O2, di e enciación de adipoci os, exp esión génica,
ep oducción, p oli e ación celula , senescencia, apop osis y sis ema de de ensa.37-39
La p ime a NADPH oxidasa desc i a ue la agocí ica, siendo és a un componen e
cla e en la inmunidad inna a. El componen e ca alí ico de la NADPH oxidasa agocí ica
(NADPH oxidasa “clásica”) se denomina gp91phox y se localiza en memb anas
in acelula es y en la memb ana plasmá ica. Sin emba go, gp91phox ambién se ha
encon ado en o as células no agocí icas, ales como las ascula es, ca diacas, enales,
neu onas, mioci os y hepa oci os, pasándose a llama a NOX2. En es os casos, la
localización subcelula de NOX2 a a depende del ipo de célula (Sedeek, Hebe ,
Kennedy, Bu ns, & Touyz, 2009).
Es udios pos e io es han demos ado la exis encia de p o eínas homólogas a
gp91phox en o os ipos celula es no agocí icos, desc ibiéndose de es e modo las 7
16
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
NOX4, como Poldip2 y TKS (que inducen un aumen o de ac i idad de NOX4).64 También
exis en abajos que han p opues o un papel inhibi o io de NOXA1 sob e NOX4.55
Según la li e a u a ecien e, el H2O2 pa ece se el p oduc o p incipal de NOX4,
aunque la bioquímica del p oceso no se conoce muy bien. Puede que se p oduzca una
ápida dismu ación del anión supe óxido a pe óxido de hid ógeno as se libe ado po
NOX4. O os au o es p oponen que la disociación del anión supe óxido de NOX4 es más
len a que en o as iso o mas de gp91phox, pe mi iendo la dismu ación hacia H2O2 an es de
se libe ada po NOX4. En es e sen ido, se ha p opues o un mecanismo po el cual NOX4
p oduce p e e encialmen e H2O2 median e la implicación de un esiduo al amen e
conse ado en el lazo E de NOX4, que p omo e ía la ápida dismu ación de anión
supe óxido an es de sali de la enzima64-66. Sea como ue e, NOX4 libe a H2O2 al medio
ex acelula cuando se encuen a localizada en la memb ana ex acelula . Cuando es á
localizada en memb anas de es uc u as in acelula es, la libe ación de H2O2 se p oduce
hacia el lumen de es os o gánulos45,67 (Figu a 7).
Figu a 7: NOX4. GDP, guanosín di os a o; H2O2, pe óxido de hid ógeno; NOX4, NADPH
oxidasa 4; O2, oxígeno molecula ; O2.-, anión supe óxido; p22phox, ci oc omo b-245; RAC1,
GTPasa.

17
In oducción
La iso o ma NOX5 gene a anión supe óxido y pe óxido de hid ógeno en espues a
a inc emen os de los ni eles in acelula es de calcio. Posee un dominio calmodulina en la
egión amino e minal, en la cual se localizan 4 si ios de unión a calcio, no necesi ando
o as subunidades pa a su ac i ación (Figu a 8). El dominio ca boxi e minal p esen a si ios
de unión a FAD y NADPH.64,68
Debido a su localización en las memb anas de o gánulos celula es, ales como el
e ículo endoplásmico, se ha desc i o la p oducción de ERO hacia el lumen de dichos
o gánulos.48 Po o o lado, NOX5 ambién gene a ERO hacia el medio ex acelula cuando
NOX5 es á p esen e en la memb ana plasmá ica (Figu a 8), aunque en meno p opo ción
que cuando se localiza in acelula men e.48,49
Figu a 8: NOX5. H2O2, pe óxido de hid ógeno; NOX5, NADPH oxidasa 5; O2.-, anión
supe óxido.
Po úl imo, DUOX1 y DUOX2 no equie en subunidades egulado as pa a su
uncionamien o, pudiendo se ac i adas di ec amen e po calcio. P oducen pe óxido de
hid ógeno,36,58 exis iendo es udios que mues an que DUOX1 y DUOX2 p oducen H2O2
hacia el medio ex acelula 69 (Figu a 9).
.-
18
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Figu a 9: DUOX1/2. DUOX1/2, Dual oxidasa 1/2; DUOXA 1/2, ac o 1/2 de madu ación de
DUOX; y H2O2, pe óxido de hid ógeno.
1.2.2.3. DIFERENCIAS ENTRE LA NADPH OXIDASA FAGOCÍTICA Y NO FAGOCÍTICA
Aunque la NADPH oxidasa agocí ica y la no agocí ica son simila es en e sí,
p esen an impo an es di e encias uncionales en e ellas. Así, la NADPH agocí ica no
p oduce anión supe óxido en condiciones basales, ya que en eposo es á comple amen e
inac i a, como hemos señalado; po el con a io, la no agocí ica cons a de una ac i idad
cons i u i a basal mode ada. O o aspec o di e encial se halla en la o ma y can idad de
anión supe óxido p oducido: las células agocí icas libe an más can idad de supe óxido y
mucho más ápidamen e que las no agocí icas, que alcanzan su p oducción máxima
desde minu os has a ho as.70,71
Po o a pa e, las células agocí icas gene an anión supe óxido hacia el espacio
ex acelula pa a su unción mic obicida. Mien as an o, las no agocí icas gene an anión
supe óxido an o hacia el medio ex acelula como hacia el in acelula , in e iniendo en
p ocesos de señalización celula .52 En cuan o a la u ilización del donado de elec ones
como sus a o, si bien en ambos casos pueden usa NADPH, la NADPH oxidasa no
agocí ica puede u iliza NADH.72,73
19
In oducción
1.2.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH
OXIDASA
Como hemos is o, la ac i ación de la NADPH oxidasa (ya sea en su o ma
agocí ica o no agocí ica) es á modulada e in oluc a no malmen e el ensamblaje de
componen es ci osólicos y del ci oc omo b558 unido a memb ana. Las ías de señalización
que p o ocan la ac i ación de la NADPH oxidasa no es án comple amen e de inidas,
exis iendo ías que ac i an los dos p ocesos necesa ios pa a la ac i ación de la NADPH
oxidasa, a sabe : 1) la anslocación de los componen es ci osólicos a la memb ana, y 2) la
ac i ación y anslocación de RAC.
1.2.3.1. PAPEL DE LA VÍA DE FOSFATIDILINOSITOL 3-QUINASA (PI3K) EN LA
ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA
PI3K es una enzima quinasa capaz de os o ila moléculas de os a idilinosi ol (PI)
en os a idilinosi ol 3- os a o (PI3P) que ac úa como molécula de señalización.74
Cuando un es ímulo se une a su ecep o , acoplado a p o eínas G imé icas,
p o oca en úl ima ins ancia la ac i ación de PI3K, lo que conlle a una acumulación de
PI3P y la subsiguien e ac i ación de Ak y GEFs ( ac o es de in e cambio de nucleó ido de
guanina). Ak os o ila a p47phox, y GEF p o oca el paso de GDP a GTP en la p o eína
RAC. A con inuación, RAC ac i a a p67phox, y además ac i a a PAK (quinasa ac i ada po
p21), que os o ila a p47phox, p o ocando inalmen e la ac i ación de la NADPH oxidasa75
(Figu a 10).
20
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Figu a 10: Mecanismo de ac i ación de la NADPH oxidasa mediado po PI3K. Ak , p o eína
quinasa B; GDP, guanosín di os a o; GEF, ac o de in e cambio de nucleó ido de guanina;
GTP, guanosín i os a o; NOX2, NADPH oxidasa 2; p22phox, ci oc omo b-245; p47phox, ac o
ci osólico 1 de neu ó ilos; p67phox, ac o ci osólico 2 de neu ó ilos; PAK, quinasa ac i ada
po p21; Pi, os a o ino gánico; PI, os a idil inosi ol; PI3K, os a idilinosi ol 3-quinasa; PI3P,
os a idilinosi ol 3- os a o; RAC2, GTPasa.
1.2.3.2. PAPEL DE LAS PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENO (MAPK)
EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA
Las MAPK son p o eínas in oluc adas en la egulación de la p oli e ación,
di e enciación y supe i encia celula . Den o de es a amilia de p o eínas quinasas
encon amos 2 g upos impo an es: 1) Quinasas eguladas po señales ex acelula es 1 y 2
(ERK1/2), y 2) la amilia p o eína quinasa p38 ac i ada po mi ógeno (p38 MAPK).76
Las quinasas ERK1/2 y p38 MAPK han sido ambién desc i as como mediado as de
la ac i ación de la NADPH oxidasa, es ando in oluc adas en la os o ilación de los
componen es ci osólicos de es a enzima. Además, ambién son dianas pa a las especies
eac i as de oxígeno, es deci , que pueden ac ua como dianas y ambién como
PI
PI3P
PI
PI3P
21
In oducción
modulado as de és as. Exis en es udios que sugie en que ambas p o eínas ac úan
ac i ando a la os olipasa A2 ci osólica (cPLA2). De es e modo, se libe a ácido a aquidónico
que inalmen e conduce a la ac i ación de la NADPH oxidasa77 (Figu a 11).
Figu a 11: Mecanismo de ac i ación de la NADPH oxidasa mediado po p38 MAPK y ERK1/2.
cPLA2, os olipasa A2 ci osólica; ERK1/2, quinasas eguladas po señales ex acelula es 1 y 2;
GTP, guanosín i os a o; NOX2, NADPH oxidasa 2; p22phox, ci oc omo b-245; p38 MAPK,
p o eína quinasa p38 ac i ada po mi ógeno; p47phox, ac o ci osólico 1 de neu ó ilos;
p67phox, ac o ci osólico 2 de neu ó ilos; RAC2, GTPasa.
1.2.3.3. PAPEL DE LA PROTEÍNA QUINASA C (PKC) EN LA ACTIVACIÓN DE LA
NADPH OXIDASA
La p o eína quinasa C (PKC) es una p o eína quinasa que pa icipa en la ac i ación
de la NADPH oxidasa, an o en células agocí icas como no agocí icas, median e la
os o ilación de p47phox.78

22
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
En la ac i ación de la NADPH oxidasa po es a ía, la llegada del es ímulo y la
unión a su ecep o p o oca la ac i ación de la p o eína os olipasa C (PLC) mediada po
p o eínas G. Es o p o oca una libe ación de diacilglice ol (DAG), lle ando consigo la
ac i ación de la PKC que, al igual que Ak y PAK en la ía PI3K, es capaz de os o ila a la
subunidad p47phox y ac i a de es e modo la enzima75,79 (Figu a 12).
La ac i ación de las iso o mas con encionales de la PKC es dependien e de calcio,
es ando el lujo de calcio y la PKC in e elacionados en los p ocesos de ac i ación de la
NADPH oxidasa. Es o es de i al impo ancia, ya que el calcio, jun o con la PKC, ac i a a
la pequeña GTPasa RAC (Figu a 12), lo cual es imp escindible pa a la ac i ación de la
NADPH oxidasa, como señalamos an e io men e78,80 (Figu a 10).
Figu a 12: Mecanismo de ac i ación de la NADPH oxidasa mediado po PKC. Ca2+, calcio;
DAG, diacilglice ol; GDP, guanosín di os a o; GTP, guanosín i os a o; NOX1/2, NADPH
oxidasa 1/2; p22phox, ci oc omo b-245; p47phox, ac o ci osólico 1 de neu ó ilos; p67phox,
ac o ci osólico 2 de neu ó ilos; PKC, p o eína quinasa C; PLC, os olipasa C; RAC, GTPasa.
23
In oducción
1.2.3.4. PAPEL DEL FACTOR NUCLEAR KAPPA B (NF-kB) EN LA ACTIVACIÓN DE LA
NADPH OXIDASA
El ac o de ansc ipción NF-kB es un he e odíme o cuyo mecanismo de ac i ación
engloba al complejo de subunidades p50/p65. Es e complejo se si úa en el ci osol, siendo
egulado median e una in e acción con una amilia de p o eínas denominada IkB (inhibido
de kappa B). La ac i ación po es ímulos ex acelula es induce la os o ilación de IkB a
a és de quinasas especí icas. Es a os o ilación p o oca ápidamen e que IkB se
ubiqui ine y se deg ade. Es a eliminación de IkB p o oca que el complejo NF-kB (p50/p65)
quede lib e y se ansloque hacia el in e io del núcleo celula , pa icipando en la
modulación de la ansc ipción génica81 (Figu a 13).
NF-kB pa ece es a in oluc ado no solo en la egulación ansc ipcional de los
componen es de la NADPH oxidasa, ya que exis en es udios que elacionan es e sis ema
con la modulación de la ac i idad de la enzima. Así, en di e en es ensayos u ilizando
inhibido es de NF-kB, sis emas de sob eexp esión de IkB o deleción del gen que codi ica
pa a la subunidad p65, se obse a en odos los casos la pé dida de la ac i idad NADPH
oxidasa. Además, el aumen o en la ac i idad del complejo (p50/p65) es di ec amen e
p opo cional a un inc emen o en la p oducción de especies eac i as de oxígeno.82,83
Todos es os es udios apoyan el papel egulado de es e ac o nuclea en la ac i idad de la
enzima NADPH oxidasa.
24
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Figu a 13: Mecanismo de ac i ación de la NADPH oxidasa mediado po NF-kB. GTP, guanosín
i os a o; IkB, inhibido de kappa B; NF-kB, ac o nuclea kappa B; NOX2, NADPH oxidasa 2;
p22phox, ci oc omo b-245; p47phox, ac o ci osólico 1 de neu ó ilos; p67phox, ac o ci osólico
2 de neu ó ilos; RAC2, GTPasa.
1.2.3.5. ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA MEDIADA POR ANGIOTENSINA II
La NADPH oxidasa es ac i ada y egulada po di e sas moléculas y ac o es, en e
ellos la Ang II. Así, la Ang II es un po en e es imulado de la enzima, aumen ando la
p oducción de anión supe óxido. A pesa de que el mecanismo de señalización median e
el cual la Ang II ac i a la NADPH oxidasa no se conoce con exac i ud, pa ece se que las
ías de las p o eínas PI3K, PKC y MAPK es án in oluc adas.84
Pa a ac i a a la NADPH oxidasa, la Ang II se une a su ecep o AT1, que es á
acoplado a p o eínas G, p oduciéndose a a és de es e sis ema la ac i ación de la PLC. A
con inuación, y como hemos is o an e io men e (Figu a 12), se p oduce una libe ación de
DAG que ac i a ía a la PKC, os o ilando y p o ocando la anslocación de p47phox y, po
25
In oducción
an o, la ac i ación de la oxidasa.75,85,86 Además, la es imulación de AT1 puede ac i a a
PI3K, la cual, como ya sabemos, p omue e la ac i ación de la p o eína Ak , que a su ez
os o ila a p47phox87,88 (Figu a 10). Po o o lado, la Ang II ambién puede ac i a a la
p o eína S c (p o eína i osina quinasa que in e acciona con ecep o es localizados en la
supe icie celula , pa icipando en ías in acelula es de ansducción de señales), la cual
p omue e la ac i ación de la os olipasa D (PLD); se libe a así ácido os a ídico (PA) que,
jun o con el ácido a aquidónico (AA) gene ado po cPLA2, in e iene en la o mación de
leuco ienos, que son ambién lípidos ac i ado es de la NADPH oxidasa (Figu a 14). En la
o mación del AA es án in oluc adas las p o eínas ERK1/2 y p38 MAPK, como se indicó con
an e io idad75,77 (Figu a 11).
Teniendo en cuen a lo indicado an e io men e, pa ece que exis e un modelo
bi ásico de ac i ación de la NADPH oxidasa mediada po Ang II. En p ime luga , se
p oduce una ac i ación de la NADPH oxidasa mediada po PKC (1); además, la acción de
las p o eínas S c y EGF, jun o con la ac uación de PI3K p o oca una ue e ac i ación de
RAC (2), p olongándose así la gene ación de anión supe óxido. Pos e io men e, hab ía
una segunda ase independien e de PKC, en la cual la ac uación de RAC es imula ía la
ac i idad de la p o eína PAK (3), sus i uyendo és a a PKC como quinasa pa a os o ila a
p47phox y ac i a consecuen emen e a la enzima NADPH oxidasa75 (Figu a 14).
32
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Figu a 16: Es uc u a química de la L-ca ni ina
La LC se sin e iza endógenamen e a pa i de los aminoácidos lisina y me ionina,
siendo los p incipales luga es de sín esis el iñón, el hígado y el ce eb o. Una ez
sin e izada, la LC se anspo a po la ci culación, llegando a los ejidos a a és de
p o eínas anspo ado as denominadas
o ganic ca ion anspo e s no el
(OCTN). OCTN2
es el anspo ado de al a a inidad de LC de mane a dependien e de sodio, y media la
abso ción in es inal y la eabso ción enal de LC pa a man ene su concen ación en los
ejidos y en la sang e ci culan e.107
La LC cumple a ias unciones de i al impo ancia pa a la célula, en e las que
des acan: el ing eso de ácidos g asos de cadena la ga al in e io de la mi ocond ia desde
el ci osol, pa a su me abolización median e el p oceso de la be a-oxidación; el anspo e
ácidos o gánicos ac i ados de cadena media y co a desde los pe oxisomas has a la
mi ocond ia, pa a su inco po ación al ciclo de K ebs; y la modulación de la a io
ace ilcoenzima A/coenzima A (Ace ilCoA/CoA), educiendo los e ec os óxicos de los
g upos acilos de cadena co a (p. ej., ace ilo) median e su anspo e al ex e io
mi ocond ial en o ma de ace ilca ni ina.106,108,109

33
In oducción
2.2. DEFICIENCIAS
Los allos en la homeos asis de LC pueden induci complicaciones en
de e minadas en e medades y si uaciones, como la diabe es melli us, obesidad,
ca diomiopa ía, malnu ición y hemodiálisis, en e o as. Clásicamen e, se es ablecen dos
ipos de de iciencia de LC: p ima ia y secunda ia.110
La de iciencia p ima ia de LC es causada po una mu ación ecesi a en el gen
slc22a5
, que codi ica pa a la p o eína anspo ado a OCTN2. La al a de ac i idad de
OCTN2 conduce a un dé ici en la eabso ción enal de LC, que esul a en una pé dida de
la misma po ía u ina ia. Es o hace que disminuyan los ni eles plasmá icos y la
acumulación in acelula de LC.111
La de iciencia secunda ia de LC cu sa igualmen e con un aumen o en la
eliminación de LC en la o ina y una acumulación de ácidos o gánicos. Es a de iciencia
puede se causada po una e apia a macológica, po desó denes me abólicos, die a
pob e, malabso ción de LC o en pacien es some idos a hemodiálisis, en e o os.110
2.3. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES Y ANTIFIBRÓTICAS
2.3.1. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES
Exis en muchos es udios, ealizados an o en modelos celula es como animales,
que mues an la capacidad de la LC pa a p o ege a la célula en e a una lesión oxida i a.
Incluso se ha desc i o a la LC como una molécula capaz de neu aliza ERO como O2.- y
H2O2, es deci , que pod ía ac ua como
sca enge
de es as moléculas.112 La LC pa ece se
un agen e an ioxidan e e ec i o en e al es ado de es és oxida i o inducido po pe óxido
de hid ógeno en HUVEC (células endo eliales de ena umbilical humana)113, y ambién en
células de neu oblas oma y hepa oci os.114
También se ha demos ado que la LC p o ege al sis ema enzimá ico endógeno de
de ensa an ioxidan e, incluyendo la ac i idad de las enzimas GPX, CAT y SOD (apa ado
1.1.1); es a acción p o ec o a se ha desc i o an o en modelos celula es, en un es udio
34
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
ealizado en células ubula es p oximales humanas,115 como en modelos animales de a as
hipe ensas116 y en a as a adas con e anol.117
En el co azón de a as hipe ensas, la LC es ablece la ac i idad de las enzimas
an ioxidan es y la capacidad an ioxidan e o al del plasma, al iempo que disminuye la
pe oxidación lipídica.118 Igualmen e, se ha obse ado que la LC inhibe la gene ación de las
ERO in acelula es y disminuye el g ado de pe oxidación lipídica en células HK-2 (línea
celula de úbulo p oximal de iñón humano) con oxicidad inducida po pe óxido de
hid ógeno.115
Po o o lado, la LC ambién se ha de inido como una molécula cuyas p opiedades
an ioxidan es no malizan las al e aciones del es ado oxida i o asociado a la edad.119,120
Nues o g upo de in es igación ha pues o de mani ies o que la ac i idad
an ioxidan e de LC en a as hipe ensas es á mediada po una modulación de ac o es de
ansc ipción implicados en el desa ollo del es és oxida i o, en e ellos el NF-kB
(apa ado 1.2.3.4), el N 2 ( ac o elacionado al ac o nuclea e i oidal 2), y el PPARα
( ecep o ac i ado de la p oli e ación de pe oxisomas al a), p o ocando de es e modo una
bajada en la p oducción de O2.-.116
2.3.2. PROPIEDADES ANTIFIBRÓTICAS
Se ha demos ado que la LC p esen e e ec os bene iciosos en e a la ib osis
gene ada en di e en es pa ologías. En conc e o, exis en es udios ealizados en iñón que
señalan que la LC eje ce un e ec o an i ib ó ico a a és del PPARɣ en a as hipe ensas121
y ambién en a as a adas con ciclospo ina (induc o a de ib osis), exis iendo una
sup esión de la exp esión de TGFβ po pa e de la LC.122
También se ha obse ado un e ec o an i ib ó ico de la LC asociado a la
hipe ensión a e ial a ni el ca diaco.123,124 Igualmen e, en in es igaciones ealizadas en
a as a adas con e aclo u o de ca bono, se obse ó una inhibición en la ib osis hepá ica
as el a amien o con LC.125
Po o o lado, hay au o es que mues an e ec os an i ib ó icos de la LC de i ados
de su acción a ni el de los sis emas de deg adación de colágeno. En conc e o, en a as
35
In oducción
que p esen aban ib osis enal in e s icial inducida po cispla ino, la LC eje ció su
capacidad an i ib ó ica modulando la elación en e MMP-9 y TIMP-3.126
2.4. APLICACIONES TERAPÉUTICAS
Ac ualmen e, la adminis ación a macológica de la LC es á ap obada en España
pa a el a amien o de isquemia miocá dica (aguda y c ónica), mioca diopa ías p oducidas
po ad iamicina y an idep esi os icíclicos, miopa ías y ca diomiopa ías p oducidas po
ca encia de LC, y pé didas de LC du an e el a amien o hemodialí ico.
Además de lo an e io , exis en muchos es udios que mues an los e ec os
bene iciosos de la LC en di e en es pa ologías. Así, se ha demos ado sus e ec os sob e la
diabe es ipo II, siendo la LC capaz de mejo a la disposición de glucosa mediada po
insulina.127,128 En pacien es con cánce , la suplemen ación con LC p oduce una mejo a en
la a iga, dep esión y calidad del sueño, mani es aciones ípicas en es os en e mos.129
Igualmen e, se han demos ado los e ec os bene iciosos de la LC en en e medades
neu odegene a i as. En modelos expe imen ales de Pa kinson, en los cuales se u iliza
me an e amina pa a gene a daño mi ocond ial, la LC mejo ó la os o ilación oxida i a
mi ocond ial y p e ino el aumen o en los ni eles de pe oxini i os inducido po la
adminis ación del á maco130 Los és e es de LC, como la ace il-L-ca ni ina, pa ecen
educi la p og esión de la en e medad de Alzheime , exis iendo es udios que ecomiendan
la adminis ación de LC en las ases emp anas de es a en e medad y ambién en la
demencia ascula .131,132 O os au o es p oponen el uso de la LC pa a el a amien o de la
miopa ía mi ocond ial y la ence alomiopa ía, un g upo de en e medades ca ac e izadas po
una degene ación p og esi a y debilidad an o neu ológica como muscula .133
Po o o lado, se ha demos ado el e ec o bene icioso de la LC en la en e medad
co ona ia y en la insu iciencia ca diaca y enal. La LC al e a la apop osis, el mayo
de e minan e de la miopa ía del músculo esquelé ico, en un modelo animal de insu iciencia
ca diaca 134. Además, hay au o es que mues an que la LC p o ege al mioca dio con a la
lesión p oducida po la isquemia- epe usión.135
36
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
2.5. MECANISMO DE ACCIÓN
Se han ealizado algunos es udios, en di e en es con ex os, pa a a a de desci a
las ías de señalización po la cuales la LC o sus de i ados ealizan sus e ec os
bene iciosos. Así, el de i ado de la LC de cadena co a, la ace il-L-ca ni ina, pa ece ac i a
la ía PI3K/Ak en neu onas co icales p ima ias, p o egiendo a es as neu onas del es és
oxida i o y neu o oxicidad p o ocado po 4-hid oxi-2-nonenal.136 O o es udio ealizado en
la línea celula de mioblas os L6, mues a que la ace il-L-ca ni ina mejo a el anspo e de
glucosa en células es imuladas con TNF-al a ( ac o de nec osis umo al al a) a a és de
una modulación de Ak .137 Asimismo, o o de i ado de cadena co a de LC, la p opionil-L-
ca ni ina, p o oca en células endo eliales la ac i ación de PI3K y Ak , induciendo la
ac i ación de la
óxido ní ico sin asa endo elial
(eNOS) y, po an o, a o eciendo la
o mación de óxido ní ico.138
También exis en es udios que mues an que la LC es capaz de modula la
ac i ación de las MAP quinasas p38 MAPK y ERK1/2. En es udios ealizados en la línea
celula GL261 (células de glioblas oma), la LC es capaz de educi la p oli e ación de es as
células a a és de la ía de p38 MAPK.139 En o os es udios ealizados sob e ib oblas os
ca diacos, la LC ue capaz de modula la os o ilación de ERK p e iamen e inducida po
Ang II.140 Igualmen e, o os au o es mues an que la os o ilación de ERK1/2, mediada po
la ace il-L-ca ni ina y el ácido al a-ácido lipoico, juega un papel undamen al en su acción
neu op o ec o a en neu onas que p esen an neu o oxicidad y es és oxida i o p o ocado
po 4-hid oxi-2-nonenal.136
Pese a odo lo an e io , a día de hoy no son muchos los es udios exis en es que
desc iban los mecanismos y ías de señalización po los cuales la LC eje ce sus e ec os
bene iciosos, po ello es a esis doc o al p e ende disce ni dichos p ocesos en un con ex o
de es és oxida i o y ib osis, en el cual la enzima NADPH oxidasa iene i al impo ancia.
HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

39
Hipó esis y Obje i os
1. HIPÓTESIS
Nues o g upo de in es igación ha demos ado p e iamen e los e ec os
an ioxidan es y an i ib ó icos de la L-ca ni ina (LC) en modelos animales con hipe ensión
a e ial (HTA) y ib osis (ca diaca y enal), es ando la enzima NADPH oxidasa in oluc ada
en es os e ec os bene iciosos de la LC.116,121,123 Resul a de g an in e és de e mina cómo
modula la LC las di e en es iso o mas de la NADPH oxidasa, y qué ías de señalización
celula es án implicadas al espec o. Nues a hipó esis de abajo es que la LC modula la
ac i idad/exp esión de la NADPH oxidasa en un con ex o de HTA y ib osis (con un
aumen o de es és oxida i o subyacen e), ac uando de o ma especí ica sob e una o a ias
iso o mas y egulando las ías de señalización in acelula esponsables de las acciones
pa ológicas de la enzima.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO GENERAL
El obje i o gene al de es a esis doc o al es demos a el papel de la NADPH
oxidasa en el e ec o modulado de la L-ca ni ina (LC) en un modelo
in i o
de ne opa ía
hipe ensi a (c eando un eno ipo hipe ensi o y o o ib ó ico median e la es imulación de
células NRK-52E con angio ensina II (Ang II) y ac o de c ecimien o ans o man e be a
(TGFβ), espec i amen e), e aluando las ías de señalización implicadas.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1) Es udia los e ec os de la Ang II y de la LC sob e la ac i idad/exp esión de la enzima
NADPH oxidasa, los ni eles de ni osilación de p o eínas (ma cado de es és oxida i o) y
la p oducción de pe óxido de hid ógeno.
2) Iden i ica las iso o mas de la NADPH oxidasa in oluc adas en su acción oxidan e sob e
las células NRK-52E, median e el uso de inhibido es moléculas de in e e encia (siRNA)
especí icos.
40
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
3) Es udia los mecanismos molecula es y ías de señalización in acelula implicados en
los e ec os de la Ang II y de la LC: ía de PI3K/Ak , ía de la PKC, ía de p38 MAPK, ía
de ERK1/2 y sis ema NF-kB.
4) E alua los e ec os de la LC sob e la ac i idad y exp esión de la NADPH oxidasa
inducidas po TGFβ.
5) Es udia los e ec os de la LC sob e la ac i ación de la ía de las p o eínas Smad y sob e
la exp esión de CTGF dependien es de TGFβ.
6) Analiza los e ec os de la LC sob e el sis ema de deg adación de colágeno, ealizando
pa a ello expe imen os an o
in i o
e
in i o
.
MATERIALES Y MÉTODOS
48
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Pa a la ob ención de ARN, se añade di ec amen e TRIzol® a las células en cul i o,
y se p ocede a aisla el ARN según el p o ocolo es ablecido po la casa come cial
(apa ado 3.5.1).
2. MODELO EXPERIMENTAL
IN VIVO
2.1. ANIMALES Y TRATAMIENTOS
Los es udios
in i o
se han ealizado en a as macho pe enecien es a la cepa
Wis a , con una edad comp endida en e las 8-10 semanas y p oceden es del Cen o de
P oducción y Expe imen ación Animal de la Uni e sidad de Se illa. Todos los
p ocedimien os cumplen con la no ma i a en igo a ni el in e nacional, nacional y
au onómico ela i a a la p o ección de los animales u ilizados pa a ines cien í icos
1
.
Las a as ue on di ididas alea o iamen e en 4 g upos expe imen ales: 1) a as
con ol (g upo C); 2) a as a adas con 400 mg de L-ca ni ina/kg de peso/día (g upo LC);
3) a as a adas con 25 mg de L-NAME
2
/kg de peso/día (g upo LN); y 4) a as a adas
simul áneamen e con L-NAME y LC (g upo LNLC). Los a amien os con LC se
man u ie on 12 semanas, mien as que el a amien o con L-NAME comenzó dos semanas
más a de que el de LC, man eniéndose po an o du an e 10 semanas. Du an e el pe iodo
expe imen al, los animales se man u ie on en condiciones es ánda (23 ± 1ºC, ciclos de 12
ho as luz/12 ho as oscu idad), y se alimen a on
ad libi um
con pienso come cial (Panlab,
S.L.) y con lib e acceso al agua de bebida (en la cual iba disuel o el a amien o, en su
caso).
1
Di ec i a 2010/63/UE del Pa lamen o Eu opeo y del Consejo de 22 de sep iemb e de 2010; en la Ley 32/2007, de 7 de no iemb e, pa a
el cuidado de los animales en su explo ación, anspo e, expe imen ación y sac i icio; Ley 6/2013, de 11 de junio, de modi icación de la
Ley 32/2007; Real Dec e o 53/2013, de 1 de eb e o, po el que se es ablecen las no mas básicas aplicables pa a la p o ección de los
animales u ilizados en expe imen ación y o os ines cien í icos, incluida la docencia; y no ma i a au onómica de desa ollo del RD
53/2013.
2
Compues o que p oduce asocons icción g acias a la inhibición de la enzima óxido ní ico sin asa (NOS), con la consecuen e
disminución en la sín esis de óxido ní ico (NO), siendo és e una de las p incipales sus ancias asodila ado as del o ganismo.

49
Ma e iales y Mé odos
2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS
T as las 12 semanas de a amien o, las a as se some en a un ayuno de 12 ho as,
as lo cual son anes esiadas con pen o bi al (50 mg/kg i.p.). Una ez sac i icados los
animales, se ex aen los iñones, eliminándose la cápsula ex e na con ayuda de dos
pinzas. Los iñones se la an en sue o isiológico ío (NaCl 0,9% p/ , 4ºC), se secan en
papel de il o y se disecciona la co eza enal, sepa ándola de la médula enal. La co eza
se congela po inme sión en ni ógeno líquido, y se conse a a -80ºC has a la ealización
de los es udios de exp esión génica.
3. TÉCNICAS MOLECULARES
3.1. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
La concen ación de p o eínas en los homogeneizados de cul i o celula de NRK-
52E, ob enidos según se desc ibe en el apa ado 1.2.3.2, se ha de e minado siguiendo el
mé odo desc i o po B ad o d,141 u ilizando el eac i o
Bio-Rad P o ein Assay
con un pa ón
de γ-globulina. El mé odo se basa en la eacción de las p o eínas con es e eac i o,
esul ando un complejo colo eado cuya in ensidad es p opo cional a la concen ación de
p o eínas de la mues a.
La écnica consis e en incuba , en una mic oplaca ELISA, 5 µL de los
homogeneizados (p e iamen e diluidos en agua bides ilada), o del pa ón de γ-globulina
(con di e en es diluciones es ablecidas pa a p epa a una cu a pa ón a pa i de una
solución mad e de 1,47 µg/µL), con 250 µL del eac i o
Bio-Rad
(el cual se diluye con agua
bides ilada y se il a a a és de un papel Wha man nº1 jus o an es de su uso), du an e 10
minu os a empe a u a ambien e, agi ándose al inicio y al inal de es e pe iodo con ayuda
de un agi ado de placas. Las mues as se ensayan po iplicado, y los es ánda es po
duplicado. T anscu ido es e iempo, se leen las abso bancias a 595 nm en un lec o de
placas (ASYS UVM340). Finalmen e, a pa i de los alo es de abso bancia ob enidos de
cada mues a, se calculan las co espondien es concen aciones median e in e polación en
la cu a pa ón.
50
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
3.2. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO
Se u iliza una écnica basada en un p oceso de quimioluminiscencia, en el cual el
anión supe óxido (p oduc o de la eacción ca alizada po la enzima NADPH oxidasa) oxida
a moléculas de lucigenina, en una eacción que libe a o ones de luz que son egis ados
en un luminóme o de ubo (
BERTHOLD Junio LB 9509
).
En un ubo de polies i eno pa a luminóme o, se añaden, po duplicado, 10 µL de
mues a (con enien emen e diluida con DPBS 1X pa a que es os 10 µL sean
equi alen es a 5 µg de p o eínas o ales); en el o o ex emo del ubo, sin mezcla lo con la
mues a, se añaden 10 µL de NADPH 3 mM (disuel o en DPBS 1X). Po úl imo, se añaden
280 µL de lucigenina 5,3 µM (disuel a en DPBS 1X y p o egida de la luz). La adición de
es e úl imo eac i o pe mi e la mezcla de odos los componen es y, po an o, el inicio de la
eacción (la cual se lle a a cabo a 37ºC). Se oman medidas de URL (unidades ela i as
de luz) en el luminóme o a los 4 minu os de iniciada la eacción.
3.2.1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FUENTES CELULARES DE ANIÓN SUPERÓXIDO
La pa icipación de las di e en es uen es enzimá icas p oduc o as de anión
supe óxido en los homogeneizados p o eicos de células NRK-52E, se ha analizado,
siguiendo el p o ocolo que acabamos de desc ibi , en p esencia y ausencia de inhibido es
especí icos de dichas uen es, a sabe : di enil-eno-iodonio (DPI), o enona y oxipu inol. El
DPI es un inhibido de la p oducción de especies eac i as de oxígeno po el conjun o de
las la op o eínas celula es. La o enona ac úa inhibiendo la cadena mi ocond ial de
elec ones, mien as que el oxipu inol inhibe a la enzima xan ina oxidasa. Todos los
inhibido es se p eincuban (a una concen ación de 0,1 mM) con la mues a du an e 5
minu os a 37ºC.
Po o o lado, ambién se analiza el e ec o de la enzima supe óxido dismu asa
(SOD) sob e la p oducción de anión supe óxido en es os homogeneizados p o eicos (la
de e minación se ealiza en las mismas condiciones an e io es, p eincubando en es e caso
las mues as con 100 U/mL de SOD). La SOD es una enzima que con ie e el anión
supe óxido en pe óxido de hid ógeno (apa ado 1.1.1 de la sección In oducción), que no
iene ninguna eac i idad con la lucigenina; es o pe mi e con i ma la especi icidad del
mé odo, desca ándose que las lec u as del luminóme o co espondan a o a especie
eac i a de oxígeno di e en e al anión supe óxido.
51
Ma e iales y Mé odos
3.2.2. CARACTERIZACIÓN DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULARES
INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO
El es udio de las ías de señalización in acelula es que pa icipan en la p oducción
de O2.-, se ealiza siguiendo el mismo p o ocolo desc i o, en p esencia y ausencia en es e
caso de inhibido es especí icos de di e en es ías de señalización. En conc e o, se ha
u ilizado wo manina (inhibido de la ía PI3K/Ak ), SB203580 (inhibido de p38 MAPK),
PD98059 (inhibido de MEK-1 ( ía ERK1/2)) y bisindolilmaleimida I (BIS I, inhibido de
PKC), a una concen ación de 1 µM en odos los casos. Las células se p eincuban du an e
1 minu o a 37ºC con es os inhibido es, adicionándose a con inuación Ang II y/o LC según
lo desc i o en el apa ado 1.2.2.
3.2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA
INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO
Pa a lle a a cabo es e expe imen o, se han u ilizado inhibido es especí icos de las
iso o mas NOX2 (gp91 ds- a ), y NOX1 (2-ace il eno iazina), ambos a una concen ación
de 50 µM. Las células se p eincuban du an e 30 minu os a 37ºC con es os inhibido es,
adicionándose a con inuación Ang II y/o LC según lo desc i o en el apa ado 1.2.2.
3.3. ENSAYO DE CITOTOXICIDAD
En es e ensayo, el ojo neu o es cap ado po las células, especí icamen e po los
lisosomas y endosomas. A medida que las células pie den iabilidad po acción de la
molécula en es udio (en nues o caso la LC), el colo an e se libe a al medio ya que solo las
células iables son capaces de e ene el colo an e en su in e io , midiéndose la can idad
de ojo neu o que pe manece den o de las células as la exposición a LC.
3.3.1. REACTIVOS
a) Disolución mad e de ojo neu o. 0,1 g amos de ojo neu o en 10 mL de DPBS 1X.
b) Disolución de abajo de ojo neu o. 100 µL de disolución mad e de ojo neu o po cada
10 mL de medio de cul i o.
c) Ácido acé ico:e anol:agua (1:49:50).
52
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
d) Fo mol-Ca2+. 50 mM de CaCl2 en 500 mL de agua des ilada y au ocla ada. Una ez
disuel o, añadi 14 mL de o maldehído (35%).
3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
En p ime luga , se cen i uga la disolución de abajo de ojo neu o du an e 10
minu os a 400 g. Las células se siemb an en placas de 96 pocillos (35.000 células/cm2,
con obje o de que a las 24 ho as es én con luen es), es imulándose con LC (0-5-100 mM)
du an e 24 ho as. T anscu ido es e iempo, se e i a el medio de cul i o y se añaden en
cada pocillo 100 µL de disolución de abajo de ojo neu o, incubándose du an e 3 ho as a
37ºC (al mic oscopio, se deben obse a las células eñidas y la ausencia de c is ales en el
pocillo). Pasadas las 3 ho as, se e i a la solución de abajo de ojo neu o olcando la
placa, y a con inuación se ijan las células con 200 µL de o mol-Ca2+ du an e 2 minu os.
Se e i a en onces la solución de o mol-Ca2+, y se añaden 200 µL de la solución de ácido
acé ico/e anol/agua pa a ex ae el colo an e de las células. T as incuba du an e 20
minu os a empe a u a ambien e, en un agi ado o bi al de placas, se lee inalmen e la
abso bancia a 540 nm. Los esul ados se exp esan en % con espec o a la abso bancia
medida en las células con oles, de o ma que a mayo abso bancia, mayo iabilidad
celula .
3.4. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PERÓXIDO DE
HIDRÓGENO
3.4.1. REACTIVOS
El ki u ilizado,
Amplex
®
Red Hyd ogen Pe oxide/Pe oxidase Assay Ki ,
u iliza el
eac i o
Amplex
®
Red
(10-ace il-3,7-dihid oxy enoxazina) pa a de ec a pe óxido de
hid ógeno. En p esencia de pe oxidasa, el
Amplex
®
Red
eacciona con H2O2 con una
es equiome ía 1:1, o iginando un p oduc o ojo luo escen e, la eso u ina. És a iene una
exci ación y emisión máximas a 571 nm y 585 nm, espec i amen e, y posee un coe icien e
de ex inción al o (58000 ± 5000 cm-1 M-1), po lo que se puede ealiza el ensayo median e
luo escencia o espec o o ome ía.
53
Ma e iales y Mé odos
Tabla 2: Reac i os necesa ios pa a la de e minación de pe óxido de hid ógeno
3.4.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
En p ime luga , se p epa a una cu a es ánda diluyendo la solución de abajo de
H2O2 (20 mM) en ampón de eacción 1X has a ob ene concen aciones desde 0 a 10 µM
de H2O2. A con inuación, se diluyen las mues as (dilución 1/2), (ob enidas según se
desc ibe en el apa ado 1.2.3.1) en ampón de eacción 1X, y se ca gan 50 µL de las
mues as o es ánda es (po iplicado en ambos casos) en pocillos de una placa ELISA.
Po o o lado, se mezclan 50 µL de
Amplex
®
Red
10 mM (diluido
ex empo áneamen e en DMSO), 100 µL de HRP 10 U/mL y 4,85 mL de ampón de
eacción 1X, pa a ob ene la solución de abajo de 100 µM de
Amplex
®
Red
y 0,2 U/mL de
HRP. Se añade 50 µL de la solución de abajo a las mues as o es ánda es, y se incuba
30 minu os a empe a u a ambien e y p o egido de la luz. A con inuación, se p ocede a
medi la abso bancia a 560 nm, exp esándose los esul ados ob enidos en µM de H2O2.
3.5. CUANTIFICACIÓN DEL ARNm
3.5.1. EXTRACCIÓN DE ARN
El mé odo clásico de ex acción de ARN se basa en la di e en e solubilidad de las
biomoléculas (ARN, ADN, p o eínas y lípidos) en disol en es o gánicos ( ales como enol y
clo o o mo). Du an e odo el p oceso, se debe p ocu a abaja con ma e ial es é il y oma
las debidas p ecauciones pa a e i a la deg adación del ARN po pa e de las enzimas
ibonucleasas (ARNasas).
Se añade 1 mL de TRIzol® en los ascos o placas de cul i o, pasando
inmedia amen e a ecupe a es e olumen en ubos de 2 mL de capacidad, los cuales se
dejan eposa 5 minu os a empe a u a ambien e. Pasado es e iempo, se añaden 200 µL
REACTIVO
CONCENTRACIÓN
Amplex® Red
10 mM
Tampón de eacción
1X
Ho se adish pe oxidase (HRP)
10 U/mL
Pe óxido de hid ógeno
20 mM
DMSO

54
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
de clo o o mo, se agi a igo osamen e y se deja eposa 5 minu os a empe a u a
ambien e. Pos e io men e, se ealiza una cen i ugación a 12000 g du an e 15 minu os a
4ºC, pa a la sepa ación de las dis in as ases. Se ecupe a cuidadosamen e la ase acuosa
supe io , que con iene el ARN, y se deposi a en el in e io de mic o ubos de 1,5 mL de
capacidad. A con inuación, se añaden 500 µL de isop opanol, mezclando po in e sión, y
se incuba du an e 10 minu os a empe a u a ambien e. T anscu ido es e iempo, se
cen i uga a 12000 g du an e 10 minu os a 4ºC. Se elimina el sob enadan e, y se la a el
p ecipi ado de ARN con 1 mL de e anol al 75%, agi ando en un agi ado de ubos ipo
ó ex du an e 20 segundos. El p ecipi ado de ARN se ecupe a cen i ugando a 8000 g
du an e 5 minu os a 4ºC, y eliminando de nue o el sob enadan e. Se deja seca el ARN
bajo la luz de un lexo que apo e el calo necesa io pa a e apo a comple amen e los
es os de e anol. Una ez seco el p ecipi ado de ARN, se añaden 35 µL de agua es é il y
lib e de ARNasas (H2O-DEPC), y se deja 10 minu os a empe a u a ambien e,
esuspendiéndose inalmen e con ayuda de una mic opipe a au omá ica.
3.5.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN E INTEGRIDAD DEL ARN
La concen ación del ARN se ha medido po espec o o ome ía ul a iole a con el
espec o o óme o
NANODROP 2000 UV-Vis
(The mo Scien i ic), empleando 1 µL de
olumen de mues a. Los ácidos nucleicos abso ben a 260 nm, po lo que midiendo a es a
longi ud de onda ob enemos la concen ación del ARN (según la ap oximación: 1 unidad
de abso bancia = 40 µg/mL de ARN). Teniendo en cuen a que las p o eínas abso ben a
280 nm, ambién se calcula la elación A260/A280 pa a conoce el g ado de pu eza,
debiéndose ob ene un alo ce cano a 2.
Po o o lado, hay que comp oba la in eg idad del ARN pa a asegu a que no ha
su ido deg adación du an e su ex acción. Pa a ello, se ealiza una elec o o esis en gel
de aga osa al 2% p e io ma caje con b omu o de e idio, el cual pe mi e la isualización del
ARN bajo una uen e de luz ul a iole a. Si el ARN no es á deg adado, se deben obse a
dos bandas que co esponden con los ARN ibosómicos 28s y 18s.
55
Ma e iales y Mé odos
3.5.3. RETROTRANSCRIPCIÓN
La e o ansc ipción es el mecanismo po el cual se ob iene, omando ARN como
molde, una molécula de ADN denominada ADN complemen a io (ADNc). Pa a lle a a
cabo es e p ocedimien o, se ha u ilizado un ki suminis ado po Applied Biosys ems
(High-
Capaci y cDNA A chi e ki )
. De cada mues a se oman olúmenes equi alen es a 2 µg de
ARN en ubos lib es de ARNasas, añadiendo H2O-DEPC has a comple a un olumen de
50 µL en cada ubo. A con inuación, se desna u aliza el ARN calen ando du an e 10
minu os a 65ºC, u ilizando un e mociclado (
Biome a
®
T G adien
). Se ap o echa es e
iempo pa a p epa a la mezcla de eacción que se compone de: Tampón RT 10X,
Random p ime s
10X, mezcla de desoxinucleó idos 25X,
Mul isc ibeTM RT
(50 U/µL) y H2O-
DEPC. T anscu ido el iempo, se colocan los ubos inmedia amen e a 4ºC pa a e i a la
ena u alización del ARN. Finalmen e, a cada ubo de ARN se añaden 50 µL de la mezcla
eac i a, y se lle an al e mociclado , el cual iene p og amadas unas condiciones de
e o ansc ipción p e iamen e es ablecidas (en nues o caso, 10 minu os a 25ºC seguidos
de 2 ho as a 37ºC).
3.5.4. PCR A TIEMPO REAL
La p incipal ca ac e ís ica de la PCR a iempo eal es que el análisis de los
p oduc os se ealiza du an e el p oceso de ampli icación, median e la cuan i icación de
luo escencia. Pa a ello, se u ilizan e mociclado es que son capaces de ampli ica y
de ec a luo escencia simul áneamen e. En es e abajo se ha u ilizado el e mociclado a
iempo eal
Ligh Cycle ® 480 De ec ion Sys em
(Roche Diagnos ics), ubicado en el Cen o
de In es igación, Tecnología e Inno ación de la Uni e sidad de Se illa (
CITIUS
), que
con iene un bloque de 96 pocillos con un luo íme o acoplado. La señal de luo escencia,
que es p opo cional a la can idad de p oduc o de PCR ampli icado, puede gene a se con
colo an es luo escen es como el
SYBR
®
G een I
.
Tabla 3: Componen es de la mezcla de eacción
COMPONENTES DE LA REACCIÓN
CONCENTRACIÓN/CANTIDAD
VOLUMEN (µL)
Fas S a SYBR® G een Mas e
2X
10
Cebado es especí icos (sen ido y an isen ido)
300 nM
0,6 (po cada cebado )
Agua bides ilada au ocla ada
7,8
56
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
En la siguien e abla se mues an los cebado es u ilizados pa a la ampli icación de
secuencias especí icas de ADNc, en unción del gen analizado.
Tabla 4: Cebado es u ilizados en los es udios de PCR a iempo eal
Una ez p epa ada la mezcla de eacción según la abla 3, se añaden 19 µL de
és a a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, y as ello 1 µL de ADNc (po duplicado). Una
ez ca gada la placa, se in oduce en el e mociclado , que se p og ama al y como se si
indica en la abla 5.
Tabla 5: Condiciones expe imen ales del e mociclado pa a la ealización de una PCR a
iempo eal
Pa a el análisis cuan i a i o de los p oduc os de la PCR, se ha empleado un
mé odo de cuan i icación ela i o, exp esando cada gen de es udio en unción de un gen
cons i u i o, que es un gen exp esado en un ni el idén ico en odas las mues as
analizadas. El gen empleado a al e ec o ha sido el co espondien e a la enzima
glice aldehído-3- os a o deshid ogenasa (GADPH). La cuan i icación se ealiza median e el
CEBADOR
SECUENCIA SENTIDO (5´-3´)
SECUENCIA ANTISENTIDO (5´-3´)
NOX1
TTCACCAATTCCCAGGATTGAAGTGGATGGTC
GACCTGTCACGATGTCAGTGGCCTTGTCAA
NOX2
CCCTTTGGTACAGCCAGTGAAGAT
CAATCCCACGTCCCACTAACATCA
NOX4
TTGCTTTTGTATCTTC
CTTACCTTCGTCACAG
CTGF
TAGCAAGAGCTGGGTGTGTG
TTCACTTGCCACAAGCTGTC
MMP-9
TCGAAGGCGACCTCAAGTG
TTCGGTGTAGCTTTGGATCCA
TIMP-1
CGCAGCGAGGAGGTTTCTCAT
GGCAGTGATGTGCAAATTTCC
GADPH
GCCAAAAGGGTCATCATCTCCGC
GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG
PROCESO
CONDICIONES
CICLOS
Ac i ación SYBR® G een I
50
º
C, 2 minu os
Desna u alización inicial
95
º
C, 10 minu os
Desna u alización
95
º
C, 15 segundos
40
Hib idación/elongación
60
º
C, 1 minu o
57
Ma e iales y Mé odos
mé odo 2-ΔΔC .
“
C
”
se de ine como el ciclo en el cual la cu a de ampli icación se dis ingue
del uido de ondo y es dependien e de la can idad inicial de ADN.
3.6. WESTERN BLOTTING
La écnica de
Wes e n blo ing
pe mi e la sepa ación de p o eínas según su peso
molecula median e elec o o esis en geles de poliac ilamida en condiciones
desna u alizan es (SDS-PAGE), y su iden i icación g acias al empleo de an icue pos
especí icos.
3.6.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS
Se mezclan olúmenes iguales de los homogeneizados p o eicos de las células
NRK-52E (equi alen es a la can idad de p o eína p e iamen e op imizada pa a la
de e minación de la p o eína en es udio) y de ampón de mues a 2X. La mezcla se hie e
a 95ºC du an e 5 minu os, pa a desna u aliza las p o eínas. T anscu ido es e iempo, se
colocan inmedia amen e en hielo has a la ealización de la elec o o esis.
3.6.2. ELECTROFORESIS
La elec o o esis de p o eínas se ealiza en geles de poliac ilamida, cuyo g ado de
polime ización pe mi e ob ene di e en es amaños de po o po el cual mig an las
p o eínas, lo que pe mi e la ca ac e ización de la p o eína de in e és.
El gel de elec o o esis se compone de dos ipos de geles: un gel concen ado
(que concen a odas las p o eínas en un de e minado luga ) y un gel sepa ado (cuya
unción es la de sepa a las p o eínas según su peso molecula ). En nues o caso
u ilizamos geles p epa ados en g adien e de concen ación (4-20%),
Mini-p o ean TGXTM
p ecas gels
(Bio-Rad Labo a o ies). Una ez colocado el gel en la cube a de
elec o o esis, se sepa an los peines y se ie e ampón de elec o o esis 1X (p e iamen e
diluido a pa i de ampón de elec o o esis 10X, Tabla 6) has a que los pocillos queden
sume gidos. Las mues as se ca gan en los pocillos, y se incluye ambién en uno de ellos
un ma cado de peso molecula (el cual pe mi i á iden i ica los dis in os pesos molecula es
de las co espondien es p o eínas al inal del p oceso). Finalmen e, se llena la cube a con
64
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
A (4ºC). Pos e io men e se incuba 15 minu os y se cen i uga du an e 10 minu os a 3000 g,
siendo el sob enadan e el ex ac o ci oplasmá ico.
El
pelle
ob enido se la a añadiendo ampón B (4ºC) y se cen i uga de nue o
du an e 10 minu os a 3000 g. El
pelle
esul an e se esuspende en 100 µL de ampón C
(4ºC), y se incuba 30 minu os, cen i ugándose pos e io men e 30 minu os a 15000 g. El
sob enadan e ob enido en onces co esponde al ex ac o nuclea .
Pa a inaliza , se de ec a median e
Wes e n blo ing
la subunidad p65 del sis ema
NF-kB en los ex ac os ci osólicos y nuclea es bajo las mismas condiciones.
La composición de los ampones A, B y C se mues an en las ablas 13, 14 y 15
espec i amen e.
Tabla 13: Composición ampón A
Tabla 14: Composición ampón B
REACTIVOS
CONCENTRACIÓN
HEPES
5 mM
MgCl2
1,5 mM
KCl
10 mM
Nonide P-40
0,5%
DTT
0,5 mM
NaF
50 mM
Inhibido de p o easas
10%
REACTIVOS
CONCENTRACIÓN
HEPES
5 mM
MgCl2
1,5 mM
KCl
10 mM
DTT
0,5 mM
NaF
50 mM
Inhibido de p o easas
10%

65
Ma e iales y Mé odos
Tabla 15: Composición ampón C
3.8.2. ESTUDIO DEL GRADO DE FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA α-IkB.
Pa a empeza , se ob ienen las acciones ci osólicas y nuclea es u ilizando el
p ocedimien o y ampones desc i os en el apa ado 3.8.1. A con inuación, se de ec a
median e
Wes e n blo ing
el g ado de os o ilación de la p o eína α-IkB.
3.9. TRANSFECCIÓN CON LÍPIDOS CATIÓNICOS PARA EL
SILENCIAMIENTO DE GENES
La u ilización de ARN de in e e encia (siRNA) nos p opo ciona una po en e
he amien a pa a el es udio de la unción celula de muchos genes, que podemos
“silencia ” a olun ad. Pa a ello, se u ilizan lípidos ca iónicos que pe mi en in oduci el
siRNA al in e io celula . Es a écnica se basa en el p oceso po el cual el ARN de doble
cadena puede induci un silenciamien o especí ico en euca io as. El p oceso de
silenciamien o se inicia cuando un ARN de doble cadena la go es p ocesado a pequeños
agmen os de ARN (21-26 nucleó idos) median e la enzima endo ibonucleasa
Dice
.
Es as moléculas pequeñas de ARN (siRNA) sup imen la exp esión del gen diana median e
el co e en dos mi ades del ARN mensaje o a a és del complejo RISC (complejo de
silenciamien o inducido po ARN). Las dos mi ades del ARNm son pos e io men e
deg adadas po la maquina ia celula , lo que conlle a la sup esión de la exp esión del gen.
REACTIVOS
CONCENTRACIÓN
HEPES
20 mM
MgCl2
1,5 mM
Glice ol
25%
NaCl
0,5 M
DTT
0,5 mM
EDTA
0,5 mM
NaF
50 mM
Inhibido de p o easas
10%
66
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
3.9.1. REACTIVOS
REACTIVOS
siRNA NOX2, siNOX4
Sc amble
Medio de ans ección Op i-MEM®
Lipo ec amina® 2000
DMEM 1X
Tabla 16: Reac i os necesa ios pa a la ans ección con lípidos ca iónicos pa a el
silenciamien o de genes
3.9.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
P e iamen e, se siemb an 15.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos pa a ob ene ,
pasadas 24 ho as, una con luencia del 50-60%. Pa a inicia el expe imen o, en p ime
luga se p epa an dos ipos de mic o ubos eppendo lib es de ARNasas: los que lle an el
siRNA del gen en es udio, y los que lle an la lipo ec amina. En los mic o ubos con siRNA,
en un olumen inal de 200 µL, se p epa an las concen aciones de siRNA (10 nM pa a
siNOX2 y 17,5 nM pa a siNOX4) en medio
Op i-MEM®
.
Po o a pa e, en los mic o ubos eppendo con lipo ec amina, se añaden en odos
los casos 5 µL de lipo ec amina en medio
Op i-MEM®
has a llega a un olumen inal de
200 µL. Cada mic o ubo se agi a le emen e con mucho cuidado y se deja incuba 5
minu os a empe a u a ambien e.
Pasado es e iempo, se une el con enido de ambos mic o ubos (siRNA y
lipo ec amina), ag egando el siRNA a la lipo ec amina con mucho cuidado y pipe eando
a iba y abajo pa a mezcla . T as es o, se incuba du an e 20 minu os a empe a u a
ambien e.
Po o o lado, se la an las placas con las células 3 eces con DPBS 1X y se
ag egan a cada pocillo 600 µL de DMEM 1X sin sue o ni an ibió ico. A con inuación, se
ag egan los 400 µL de mezcla siRNA-lipo ec amina con mucho cuidado y en pequeñas
go as. A con inuación se incuban a 37ºC, 5% CO2 du an e 24 ho as pa a pe mi i que se
ealice la ans ección.
67
Ma e iales y Mé odos
Pasadas las 24 ho as, se la an las células con DPBS 1X 3 eces, y se ag ega
medio de cul i o comple o con an ibió ico y sue o. Pa a ensayos de exp esión génica, las
células se incuban du an e 48 ho as; pa a los análisis con p o eínas (exp esión p o eica y
ac i idad), du an e 72 ho as.
En pa alelo, y en las mismas condiciones que el siRNA, se u iliza como con ol un
sc amble
, que es una secuencia deso denada que no p o oca deg adación ninguna del
ARNm.
4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Los esul ados es án exp esados como media ± e o es ánda . La compa ación
en e las di e en es condiciones expe imen ales se ha ealizado u ilizando el es de
ANOVA, y en aquellos casos que han mos ado signi icación es adís ica, se ha aplicado el
es de Tukey, conside ándose di e encias es adís icamen e signi ica i as pa a alo es de
p<0,05. Se ha u ilizado el so wa e es adís ico
IBM SPSS S a is ics 20
.
68
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
RESULTADOS

71
Resul ados
0
50
100
150
200
250
C 0,1 1 10 100
1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO
INDUCIDO POR ANGIOTENSINA II: ESTUDIO DE LA NADPH
OXIDASA
1.1. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN
SUPERÓXIDO
1.1.1. ENSAYO CONCENTRACIÓN-RESPUESTA PARA ANGIOTENSINA II
La incubación de las células NRK-52E con Ang II du an e 24 ho as, a
concen aciones desde 0,1 a 100 nM, inc emen ó signi ica i amen e la p oducción de anión
supe óxido, duplicándose ap oximadamen e los alo es basales al u iliza la concen ación
más al a de Ang II (Figu a 18). En is a de es os esul ados, se eligió la concen ación 100
nM de Ang II pa a ealiza los expe imen os pos e io es.
Figu a 18: Inducción de la p oducción de anión supe óxido (O2.-) po angio ensina II (Ang II):
ensayo concen ación- espues a. Tiempo de incubación = 24 ho as. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ±e o es ánda de 4 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C.
***
***
***
P oducción de O2.- (%)
Ang II (nM)
***
***
***
72
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
1.1.2. ENSAYO TIEMPO-RESPUESTA PARA ANGIOTENSINA II
La máxima p oducción de anión supe óxido, como consecuencia de la es imulación
con Ang II 100 nM, iene luga a pa i de 1 ho a, man eniéndose cons an e has a las 24
ho as de es imulación (Figu a 19). Po consiguien e, el iempo de es imulación de 24 ho as
ue elegido pa a la ealización de los expe imen os pos e io es, excep o en los casos
indicados.
Figu a 19: Inducción de la p oducción de anión supe óxido (O2.-) po angio ensina II (Ang II):
ensayo iempo- espues a. C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la
media ± e o es ánda de 4 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001
compa ado con C.
1.2. CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE PRODUCCIÓN DE ANIÓN
SUPERÓXIDO EN RESPUESTA A LA ANGIOTENSINA II
Pa a ca ac e iza la uen e enzimá ica de anión supe óxido (O2.-) en espues a a la
es imulación con Ang II, se analizó la gene ación de O2.- en células NRK-52E en p esencia
de di e en es inhibido es, al y como se desc ibe en el apa ado 3.2.1. de la sección
Ma e iales y Mé odos
. El a amien o con DPI inhibió comple amen e el aumen o en la
P oducción de O2.- (%)
P oducción de O2.- (%)
***
***
***
***
Ang II (100 nM)
73
Resul ados
p oducción de O2.- inducido po Ang II, no así el oxipu inol y la o enona, que ue on
ine ec i os (Figu a 20). Po an o, podemos iden i ica a la enzima NADPH oxidasa como
uen e del anión supe óxido o mado en nues as condiciones expe imen ales.
Po o o lado, la gene ación de O2.- inducida po Ang II en células NRK-52E ue
comple amen e inhibida en p esencia de SOD (Figu a 20), lo que nos indica que el O2.- es
la especie eac i a de oxígeno de ec ada po la lucigenina.
Figu a 20: Ca ac e ización de la uen e de anión supe óxido (O2.-) en células NRK-52E a adas
con angio ensina II (Ang II). Las células ue on a adas con 100 nM de Ang II du an e 24 ho as,
sola (Ang II) o en combinación con 0,1 mM de oxipu inol (OXI), o enona (ROT), DPI (DPI), o
100 U/mL de enzima supe óxido dismu asa (SOD). C = células con oles sin es imula . El
his og ama ep esen a la media±e o es ánda de 3 expe imen os independien es.
Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con C; ###p<0,001 compa ado con
Ang II.
0
50
100
150
200
250
C Ang II OXI ROT DPI SOD
***
P oducción de O2.- (%)
Ang II (100 nM, 24h)
***
**
###
###
80
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
CLC Ang II ALC
Fi
Figu a 26: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la exp esión génica de las iso o mas NOX1 (A),
NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células a adas con angio ensina II (Ang II).
Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II
más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 4 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con C; #p<0,05,
##p<0,01, ###p<0,001 compa ado con Ang II.
1.8. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN PROTEICA DE
LAS ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN
CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II
La LC a enuó el inc emen o en la exp esión p o eica de NOX1 y NOX2 p o ocado
po la es imulación con Ang II du an e 24 ho as (Figu as 27A y 27B). Po o o lado, la LC
ambién no malizó los ni eles de exp esión p o eica de NOX4, que se encon aban
disminuidos as la incubación de las células con Ang II (Figu as 27C). En los 3 casos, la
adición de LC en células con oles no p o ocó cambio alguno en la exp esión p o eica
(Figu as 27A, 27B y 27C).
***
C
Exp esión génica ela i a NOX4
###
##

81
Resul ados
0
20
40
60
80
100
120
140
160
CLC Ang II ALC
0
20
40
60
80
100
120
140
160
CLC Ang II ALC
NOX1
β-ac ina
A
NOX2
β-ac ina
B
###
**
#
Exp esión p o eica NOX1 (%)
***
###
###
Exp esión p o eica NOX2 (%)
82
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
20
40
60
80
100
120
140
CLC Ang II ALC
Figu a 27: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la exp esión p o eica de las iso o mas NOX1 (A),
NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células a adas con angio ensina II (Ang II).
Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II
más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 4 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con C; #p<0,05,
##p<0,01, ###p<0,001 compa ado con Ang II.
1.9. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA
INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Y H2O2
Pa a analiza las iso o mas de la NADPH oxidasa implicadas en el es és oxida i o
p o ocado po Ang II, así como en el e ec o inhibi o io de la LC, hemos empleado
inhibido es especí icos de las di e en es iso o mas de la NADPH oxidasa; asimismo,
hemos ealizado es udios de silenciamien o de genes, al y como se de alla a con inuación.
C
NOX4
β-ac ina
Exp esión p o eica NOX4 (%)
***
##
###
83
Resul ados
El uso del inhibido especí ico de NOX2, gp91 ds- a , p odujo una disminución
signi ica i a en la p oducción celula de anión supe óxido inducida po Ang II, al compa a
es os alo es con los ob enidos en células no es imuladas y con aquellas es imuladas con
Ang II en ausencia del inhibido . La p oducción de anión supe óxido en células
p eincubadas con LC y a adas con Ang II no se io modi icada po la p esencia del
inhibido de NOX2 (Figu a 28).
Figu a 28: E ec o del inhibido de NOX2 (gp91 ds- a ) sob e la ac i idad NADPH oxidasa en
p esencia de L-ca ni ina (LC) y angio ensina II (Ang II). Las células ue on a adas du an e 24
ho as con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas
células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la
misma. C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda
de 4 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado
con C; ##p<0,01, ###p<0,001 compa ado con Ang II.
El silenciamien o de la iso o ma NOX2 p odujo, como e a de espe a , una
educción de ap oximadamen e el 90% en la exp esión p o eica de es a iso o ma (Figu a
29A). So p enden emen e, la exp esión p o eica de NOX1 y NOX4 ue ambién modi icada
po es a manipulación de NOX2. Así, la exp esión p o eica de NOX1 aumen ó en odos los
g upos de células a excepción de las células con oles (Figu a 29B), mien as que la
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C Ang II ALC C Ang II ALC
Ac i idad NADPH oxidasa (%)
##
**
###
##
###
***
gp91 ds- a (50 µM, 30 min)
84
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
50
100
150
200
250
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
exp esión de NOX4 solo se io aumen ada en el g upo de células es imuladas po Ang II
(compa ando siemp e con espec o al g upo celula equi alen e sin silenciamien o) (Figu a
29 C).
A
***
***
###
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
&&&
+++
#
#
#
***
&&
#
Exp esión p o eica NOX1 (%)
B
siNOX2 (10 nM)
Sc amble (10 nM)
Exp esión p o eica NOX2 (%)
###
**
##
***
***
###
###
###
NOX2
β-ac ina
NOX1
β-ac ina
*
**
*
++
siNOX2 (10 nM)
Sc amble (10 nM)
85
Resul ados
0
20
40
60
80
100
120
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
Figu a 29: E ec o del silenciamien o de NOX2 sob e la exp esión p o eica de las iso o mas
NOX2 (A), NOX1 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa. Las células ue on a adas du an e 24
ho as con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC
(LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30
minu os con la misma. C = células con oles sin es imula . Todas las condiciones se a a on
con un
sc amble
(S c) o con el siRNA de NOX2, según se de alla en el apa ado 3.9 de la
sección
Ma e iales y Mé odos
. El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3
expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001
compa ado con C+S c; #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 compa ado con Ang II+S c; &&p<0,01,
&&&p<0,001 compa ado con LC+S c; ++p<0,01, +++p<0,001 compa ado con ALC+S c.
β-ac ina
siNOX2 (10 nM)
Sc amble (10 nM)
C
Exp esión p o eica NOX4 (%)
###
###
###
NOX4
***
###
###
###

86
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
A con inuación, de e minamos el e ec o del silenciamien o de NOX2 sob e la
p oducción de anión supe óxido. Los esul ados mos a on que dicho silenciamien o
p odujo un aumen o signi ica i o en la p oducción de anión supe óxido en odas las
condiciones expe imen ales, a excepción de las células no a adas (siemp e compa ando
con los co espondien es g upos sin silenciamien o de la p o eína) (Figu a 30).
C
Figu a 30: E ec o del silenciamien o de NOX2 sob e la ac i idad NADPH oxidasa. Las células
ue on a adas du an e 24 ho as con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de
LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e
una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin es imula . Todas las
condiciones se a a on con un
sc amble
(S c) o con el siRNA de NOX2. El his og ama
ep esen a la media±e o es ánda de 3 expe imen os independien es. Signi icación
es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C+S c; #p<0,05, ###p<0,001 compa ado con Ang II+S c;
&&&p<0,001 compa ado con LC+S c; +++p<0,001 compa ado con ALC+S c.
0
50
100
150
200
250
300
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
###
###
siNOX2 (10 nM)
Sc amble (10 nM)
Ac i idad NADPH oxidasa (%)
***
***
#
&&&
###
###
***
***
+++
###
87
Resul ados
Con espec o a la p oducción de H2O2, sólo las células a adas con LC mos a on
un aumen o de es e pa áme o al compa a con su g upo sin silenciamien o (Figu a 31).
Figu a 31: E ec o del silenciamien o de NOX2 sob e la p oducción de H2O2. Las células ue on
a adas du an e 24 ho as con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC
(ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una
p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin es imula . Todas las
condiciones se a a on con un
sc amble
(S c) o con el siRNA de NOX2. El his og ama
ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os independien es. Signi icación
es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C+S c; ###p<0,001 compa ado con Ang II+S c;
&&&p<0,001 compa ado con LC+S c; +++p<0,001 compa ado con ALC+S c.
0
1
2
3
4
5
6
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
siNOX2 (10 nM)
Sc amble (10 nM)
P oducción de H2O2 (µM)
###
###
###
***
***
***
***
&&&
+++
88
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Po lo que espec a al uso del inhibido de NOX1 (2-ace il eno iazina), és e sí
disminuyó signi ica i amen e la p oducción de anión supe óxido an o en condiciones
basales como as la es imulación con Ang II en ausencia y en p esencia de LC (Figu a
32).
Figu a 32: E ec o del inhibido de NOX1 (2-ace il eno iazina) sob e la ac i idad NADPH oxidasa
en p esencia L-ca ni ina (LC) y angio ensina II (Ang II). Las células ue on a adas du an e 24
ho as con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas
células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la
misma. C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda
de 4 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C;
###p<0,001 compa ado con Ang II; +++p<0,001 compa ado con ALC.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
C Ang II ALC C Ang II ALC
###
***
***
+++
2-ace il eno iazina
(50 µM, 30 min)
Ac i idad NADPH oxidasa (%)
***
###
###
###
***
89
Resul ados
El silenciamien o de NOX4 edujo la exp esión génica de es a p o eína
ap oximadamen e un 50% en los cua o g upos expe imen ales de células (Figu a 33A),
aumen ando la exp esión génica de NOX1 (Figu a 33B) y NOX2 (Figu a 33C) en los
g upos a ados con LC.
Exp esión génica ela i a NOX4
***
###
***
***
***
***
+++
&&&
siNOX4 (17,5 nM)
Sc amble (17,5 nM)
siNOX4 (17,5 nM)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC
Sc amble (17,5 nM)
###
A
B
Exp esión génica ela i a NOX1
Exp esión génica ela i a NOX1
##
##
**
**
**
**
&&
++
##
96
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
C15 30 45
2.2. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II Y LA L-CARNITINA SOBRE LA
FOSFORILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS AKT, p38 MAPK Y ERK1/2
2.2.1. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA AKT INDUCIDA POR
ANGIOTENSINA II
La incubación de las células NRK-52E con Ang II inc emen ó la os o ilación de la
p o eína Ak después de 15, 30 y 45 minu os de es imulación (Figu a 38).
Figu a 38: Fos o ilación iempo-dependien e de la p o eína Ak inducida po angio ensina II
(Ang II). C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media±e o es ánda
de 3 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01 compa ado con C.
Ak
p-Ak
**
**
**
Ra io p-Ak /Ak (%)
Ang II 100 nM (minu os)

97
Resul ados
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
C Ang II ALC
2.2.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA
AKT EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II
T as ija el iempo de incubación con Ang II (15 minu os) pa a ob ene una
os o ilación óp ima de Ak , es imulamos las células NRK-52E en p esencia y ausencia de
LC. Como puede obse a se en la Figu a 39, la incubación con LC no p oduce una
educción en la os o ilación de Ak inducida po Ang II.
Figu a 39: E ec o de la angio ensina II (Ang II) y de la L-ca ni ina (LC) sob e la os o ilación de
la p o eína Ak . Las células ue on a adas du an e 15 min con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100
nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05 compa ado con C.
*
*
Ra io p-Ak /Ak (%)
Ak
p-Ak
98
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Po o o lado, obse amos cómo las células incubadas únicamen e con LC ambién
p esen a on un aumen o de la os o ilación de la p o eína Ak , os o ilación que no ue
inhibida en p esencia de wo manina (Figu a 40).
Figu a 40: E ec o de la L-ca ni ina (LC) y de la wo manina (W) sob e la os o ilación de la
p o eína Ak . Las células ue on a adas con 1 mM de LC du an e 15 minu os, sola (LC) o en
combinación con 1 µM de wo manina (LC+W). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05 compa ado con C.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CLC LC+W
p-Ak
*
*
Ra io p-Ak /Ak (%)
Ak
99
Resul ados
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
C15 30 45
2.2.3. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA p38 MAPK INDUCIDA POR
ANGIOTENSINA II
La incubación de las células NRK-52E con Ang II inc emen ó la os o ilación de la
p o eína p38 MAPK a los 15 minu os de es imulación. Pasado es e iempo, la p o eína
uel e a des os o ila se, como se demues a en las mediciones ealizadas a los 30
minu os y a los 45 de es imulación con Ang II (Figu a 41).
Figu a 41: Fos o ilación iempo-dependien e de la p o eína p38 MAPK inducida po
angio ensina II (Ang II). C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ±
e o es ánda de 3 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05 compa ado
con C.
Ang II 100 nM (minu os)
*
Ra io p-p38 /p38 (%)
p38
p-p38
100
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
C Ang II ALC
2.2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA
p38 MAPK EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II
Una ez de inido el iempo de incubación con Ang II (15 minu os) pa a ob ene la
máxima os o ilación de p38 MAPK, es imulamos las células NRK-52E en p esencia y
ausencia de LC, obse ándose que la incubación con LC no p e ino la os o ilación de p38
MAPK inducida po la Ang II (Figu a 42).
Figu a 42: E ec o de la angio ensina II (Ang II) y de la L-ca ni ina (LC) sob e la os o ilación de
la p o eína p38 MAPK. Las células ue on a adas du an e 15 min con 100 nM de Ang II (Ang
II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05 compa ado con C.
Ra io p-p38 /p38 (%)
*
*
p-p38
p38
101
Resul ados
2.2.5. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA ERK1/2 INDUCIDA POR
ANGIOTENSINA II
La incubación de las células NRK-52E con Ang II inc emen ó la os o ilación de la
p o eína ERK1/2 as 15 minu os de es imulación. Es a os o ilación ue aumen ando con el
iempo, alcanzándose el máximo as 45 minu os de es imulación (Figu a 43).
Figu a 43: Fos o ilación iempo-dependien e de la p o eína p-ERK1/2 po angio ensina II (Ang II).
C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3
expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con
C; &p<0,05, &&p <0,01 compa ado con Ang II 45 min.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
C15 30 45
Ra io p-ERK1/2 /ERK1/2 (%)
Ang II 100 nM (minu os)
p-ERK1/2
ERK1/2
**
&&
***
&

102
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
2.2.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA
ERK1/2 EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II
T as ija en 45 minu os la exposición de las células a Ang II pa a la ob ención de
una máxima os o ilación de la p o eína ERK1/2, es imulamos las células NRK-52E en
p esencia y ausencia de LC. Al igual que en los casos an e io es (Figu as 39 y 42), la
incubación con LC no modi icó la os o ilación de ERK1/2 inducida po la Ang II (Figu a 44).
Figu a 44: E ec o de la angio ensina II (Ang II) y de la L-ca ni ina (LC) sob e la os o ilación de
la p o eína ERK1/2. Las células ue on a adas du an e 45 min con 100 nM de Ang II (Ang II) o
100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles sin
es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con C.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
C Ang II ALC
***
**
Ra io p-ERK1/2 /ERK1/2 (%)
p-ERK1/2
ERK1/2
103
Resul ados
2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA
QUINASA C (PKC) EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II
La adición de Ang II a la línea celula NRK-52E indujo un aumen o (1,5 eces) de la
ac i idad de la PKC con espec o a las células no es imuladas. El a amien o con LC ue
capaz de es au a la ac i idad de es a p o eína has a alo es simila es a aquellos
ob enidos en células no es imuladas. Las células a adas únicamen e con LC no
mos a on cambio alguno en la ac i idad PKC con espec o a los alo es basales
obse ados en las células con oles (Figu a 45).
Figu a 45: E ec o de la angio ensina II (Ang II) y de la L-ca ni ina (LC) sob e la ac i idad de la
p o eína PKC. Las células ue on a adas du an e 30 minu os con 100 nM de Ang II (Ang II),
100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con
LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células
con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 4 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C; ###p<0,001 compa ado
con Ang II.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
CLC Ang II ALC
***
###
###
Ac i idad PKC ela i a (%)
104
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL NF-ΚB
HACIA EL NÚCLEO
2.4.1. CINÉTICA DE LA TRANSLOCACIÓN DEL COMPLEJO NF-kB INDUCIDA POR
ANGIOTENSINA II
La p esencia de Ang II en las células NRK-52E iplicó la asa de anslocación de
la p o eína NF-kB hacia el núcleo as 40 minu os de exposición. La anslocación ambién
se es imula a los 20 minu os, si bien en meno medida. Pasados los 40 minu os de
incubación, es e aumen o en la anslocación de NF-kB desapa ece (Figu a 46).
Figu a 46: T anslocación iempo-dependien e de la p o eína NF-kB inducida po angio ensina II
(Ang II). C = células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda
de 3 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05, ***p<0,001 compa ado
con C; #<p0,05, ##<p0,01 compa ado con Ang II 40 min.
0
50
100
150
200
250
300
350
C20 40 60
Ang II 100 nM (minu os)
***
#
##
*
NÚCLEO
CITOSOL
NF-kB núcleo/NF-kB ci osol (%)
105
Resul ados
2.4.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL COMPLEJO
NF-KB HACIA EL NÚCLEO EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II
En la Figu a 47 se mues a cómo la LC es capaz de inhibi la anslocación de la
p o eína NF-kB al in e io inducida po Ang II. Po el con a io, la adición de LC a células
con oles no modi ica la anslocación de la p o eína con espec o a los alo es obse ados
en las células sin es imula .
Figu a 47: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la anslocación del complejo NF-kB inducida po
angio ensina II (Ang II). Las células ue on a adas du an e 40 minu os con 100 nM de Ang II
(Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células
a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. El
his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 4 expe imen os independien es.
Signi icación es adís ica: **p<0,01 compa ado con C; ##p<0,01 compa ado con Ang II.
0
50
100
150
200
250
C LC Ang II ALC
**
##
##
Ra io NF-kB núcleo/NF-kB ci osol (%)
NÚCLEO
CITOSOL
112
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
Figu a 52: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la exp esión génica de las iso o mas NOX1 (A),
NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células a adas con TGFβ. Las células ue on
a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC
(TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una
p eincubación de 30 minu os con la misma. El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda
de 4 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C;
###p<0,001 compa ado con TGFβ.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
CLC TGFβTLC
C
Exp esión génica ela i a NOX4
###
###
###
***

113
Resul ados
3.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE
CTGF (MARCADOR DE FIBROSIS) INDUCIDA POR TGFβ
El TGFβ indujo la exp esión génica de la p o eína CTGF ( ac o de c ecimien o de
ejido conec i o), aumen ándola casi 2 eces, con i mándose así que las células han
adqui ido un eno ipo ib ó ico as se expues as a TGFβ (apa ado 1.3.1 de la sección
In oducción
). La LC con a es ó es e inc emen o en la exp esión de CTGF. Po o o lado,
la adminis ación de LC en células no a adas no p o ocó ningún cambio en la exp esión
génica del ma cado de ib osis es udiado (Figu a 53).
Figu a 53: E ec o de la L-ca ni ina (LC) y TGFβ en la exp esión génica de CTGF. Las células
ue on a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1
mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se ealizó
adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. El his og ama ep esen a la
media ± e o es ánda de 4 expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001
compa ado con C; ###p<0,001 compa ado con TGFβ.
0
0,5
1
1,5
2
2,5
CLC TGFβTLC
###
###
***
Exp esión génica ela i a CTGF
114
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
3.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA
PROTEÍNA SMAD2 INDUCIDA POR TGFβ
Las células de la línea celula NRK-52E es imuladas con TGFβ mos a on un
aumen o signi ica i o de la os o ilación de la p o eína Smad2 al compa a lo con el g upo
con ol, un e ec o que ue inhibido median e la p eincubación con LC (Figu a 54).
Figu a 54: E ec o de la L-ca ni ina (LC) en la os o ilación de la p o eína Smad2 inducida po
TGFβ. Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL
de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con LC, se
ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células con oles
sin es imula . El his og ama ep esen a la media ±e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: ***p<0,001 compa ado con C; ###p<0,001 compa ado
con TGFβ.
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
CLC TGFβTLC
***
###
###
Ra io p-Smad2/β-ac ina (%)
β-ac ina
p-Smad2
115
Resul ados
3.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL SISTEMA DE DEGRADACIÓN
DE COLÁGENO
3.6.1. ESTUDIOS IN VIVO
3.6.1.1. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MMP-9 EN
CORTEZA RENAL DE RATAS HIPERTENSAS
El a amien o de los animales con L-NAME (sus ancia induc o a de hipe ensión
po depleción de óxido ní ico; apa ado 2.1. de la sección
Ma e iales y Mé odos
) edujo la
exp esión génica de la MMP-9 (apa ado 1.3.3. de la sección
In oducción
) en un 60%,
al e ación que ue co egida en las a as hipe ensas a adas con LC. La adminis ación de
LC a a as con oles no p o ocó ningún cambio en la exp esión génica de es a
me alop o einasa de la ma iz ex acelula (Figu a 55).
Figu a 55: E ec o de la L-ca ni ina (LC) en la exp esión génica de MMP-9 en co eza enal de
a as hipe ensas. Las a as ue on a adas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC), con 25
mg de L-NAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = a as con oles
no mo ensas. El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01 compa ado con C; ##p<0,01 compa ado con
LN.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
CLC LN LNLC
Exp esión génica ela i a MMP-9
**
##
##
116
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
0,5
1
1,5
2
2,5
CLC LN LNLC
3.6.1.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE TIMP-1 EN
CORTEZA RENAL DE RATAS HIPERTENSAS
La exp esión de TIMP-1 (apa ado 1.3.3. de la sección
In oducción
) se io
aumen ada as el a amien o con L-NAME (1,8 eces); es e aumen o ue con a es ado
po la LC has a llega a los ni eles de exp esión p opios de a as con oles. Como ocu ió
an e io men e, la adminis ación de LC a a as con oles no p o ocó ningún cambio en la
exp esión génica de TIMP-1 (Figu a 56).
Figu a 56: E ec o de la L-ca ni ina (LC) en la exp esión génica de TIMP-1 en co eza enal
de a as hipe ensas. Las a as ue on a adas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC),
con 25 mg de L-NAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = a as
con oles no mo ensas. El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3
expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05 compa ado con C;
#p<0,05, ##p<0,01 compa ado con LN.
Exp esión génica ela i a TIMP-1
*
##
#
117
Resul ados
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
CLC LN LNLC
3.6.1.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN EL RATIO MMP-9/TIMP-1 EN CORTEZA
RENAL DE RATAS HIPERTENSAS.
A ni el de co eza enal el a amien o con L-NAME en a as p odujo una
disminución en la elación MMP-9/TIMP-1. El a amien o con LC e ie e es e descenso,
alcanzándose alo es semejan es a mues as con oles (Figu a 57).
Figu a 57: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e el a io MMP-9/TIMP-1 de co eza enal de a as
hipe ensas. Las a as ue on a adas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC), con 25 mg de L-
NAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = a as con oles no mo ensas. El
his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os independien es.
Signi icación es adís ica: **p<0,01 compa ado con C; ##p<0,01 compa ado con LN.
Ra io MMP-9/TIMP-1
##
**
##

118
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
3.6.2. ESTUDIOS IN VITRO
3.6.2.1. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MMP9 EN
CÉLULAS NRK-52E
El a amien o con TGFβ no modi icó la exp esión génica de MMP-9. Sin emba go,
las células que ue on a adas con LC en p esencia o ausencia de TGFβ, sí mos a on una
disminución signi ica i a de la exp esión génica de es a p o eína (Figu a 58).
Figu a 58: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la exp esión génica de MMP-9 en células a adas
con TGFβ. Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10
ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas con
LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células
con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01, ***p<0,001 compa ado con C; ##p<0,01,
###p<0,001 compa ado con TGFβ.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
CLC TGFβTLC
Exp esión génica ela i a MMP-9
***
**
##
###
119
Resul ados
3.6.2.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE TIMP-1 EN
CÉLULAS NRK-52E
El a amien o con TGFβ aumen ó la exp esión génica de TIMP-1. Po el con a io,
las células que ue on a adas con LC, ya uese en p esencia o ausencia de TGFβ,
mos a on una disminución de la exp esión génica de es e inhibido (Figu a 59).
Figu a 59: E ec o de la L-ca ni ina (LC) sob e la exp esión génica de TIMP-1 en células
a adas con TGFβ. Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ
(TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células
a adas con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C =
células con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3
expe imen os independien es. Signi icación es adís ica: *p<0,05, **p<0,01 compa ado con C;
###p<0,001 compa ado con TGFβ.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
CLC TGFβTLC
Exp esión génica ela i a TIMP-1
**
###
###
*
*
120
Tesis Doc o al An onio Jesús Blanca Loba o
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
CLC TGFβTLC
3.6.2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN EL RATIO MMP-9/TIMP-1 EN CÉLULAS NRK-
52E
En la línea celula NRK-52E, el a amien o con TGFβ p odujo una disminución en
el cocien e MMP-9/TIMP-1. El a amien o con LC e ie e es e descenso, alcanzándose
alo es semejan es a los ob enidos en condiciones con oles (Figu a 60).
Figu a 60: E ec o de la L-ca ni ina (LC) y del TGFβ sob e el a io MMP-9/TIMP-1 en la línea
celula NRK-52E. Las células ue on a adas du an e 24 ho as con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ),
10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células a adas
con LC, se ealizó adicionalmen e una p eincubación de 30 minu os con la misma. C = células
con oles sin es imula . El his og ama ep esen a la media ± e o es ánda de 3 expe imen os
independien es. Signi icación es adís ica: **p<0,01 compa ado con C; #p<0,05, ##p<0,01
compa ado con TGFβ.
Ra io MMP-9/TIMP-1
**
##
#
DISCUSIÓN