Papel de la NADPH oxidasa en el efecto modulador de la L-carnitina en la nefropatía hipertensiva

PAPEL DE LA NADPH OXIDASA EN EL EFECTO MODULADOR DE LA L-CARNITINA EN LA NEFROPATÍA HIPERTENSIVA Tesis Doctoral ANTONIO JESÚS BLANCA LOBATO Directores CARMEN MARÍA VÁZQUEZ CUETO ALFONSO MATE BARRERO ELISA REVILLA TORRES Sevilla, 2014 CARMEN MARÍA VÁZQUEZ CUETO, Catedrática del Departamento de Fisiología de la Universidad de Sevilla; ALFONSO MATE BARRERO, Profesor Titular del Departamento de Fisiología de la Universidad de Sevilla; y ELISA REVILLA TORRES Profesora Titular del Departamento de Fisiología de la Universidad de Sevilla, INFORMAN Que la Tesis titulada PAPEL DE LA NADPH OXIDASA EN EL EFECTO MODULADOR DE LA L-CARNITINA EN LA NEFROPATÍA HIPERTENSIVA , presentada por el Ldo. ANTONIO JESÚS BLANCA LOBATO para optar al grado de doctor por la Universidad de Sevilla, ha sido realizada bajo nuestra dirección en el Departamento de Fisiología de la Universidad de Sevilla y, considerándola concluida, autorizan su presentación a fin de que pueda ser defendida ante el tribunal correspondiente. Y para que así conste, firman la presente en Sevilla, a 10 de Noviembre de 2014 Fdo.: Dra. Carmen Mª Vázquez Cueto Fdo.: Dr. Alfonso Mate Barrero Fdo.: Dra. Elisa Revilla Torres Este trabajo de investigación ha sido subvencionado por las ayudas: - FIS PS09/01395 del Fondo de Investigación Sanitaria, Ministerio de Sanidad y Consumo (Instituto de Salud Carlos III). - PI-0034/2008 de la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía. - PI-0060/2012 de la Consejería de Salud de la Junta de Andalucía. Durante su realización el autor ha disfrutado de contratos de apoyo de personal de investigación subvencionados por Fondo de Investigación Sanitaria, Ministerio de Sanidad y Consumo (Instituto de Salud Carlos III) (FIS PS09/01395), y por la Junta de Andalucia (PI-0060/2012). A MIS QUERIDOS PADRES A MI HERMANA iv RESULTADOS 1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR ANGIOTENSINA II: ESTUDIO DE LA NADPH OXIDASA ........................................................ 71 1.1. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO .................................................................................................................... 71 1.1.1. Ensayo concentración-respuesta para angiotensina II ........................................... 71 1.1.2. Ensayo tiempo-respuesta para angiotensina II ....................................................... 72 1.2. CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO EN RESPUESTA A LA ANGIOTENSINA II ............................................................................... 72 1.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA VIABILIDAD CELULAR DE LA LÍNEA NRK52E ..................................................................................................................................... 74 1.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD NADPH OXIDASA ................. 74 1.4.1. Ensayo concentración-respuesta para la L-carnitina ............................................ 74 1.4.2. Efecto de la L-carnitina sobre la actividad nadph oxidasa estimulada por angiotensina II ................................................................................................................. 75 1.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA PRODUCCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II ............................................................ 76 1.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LOS NIVELES DE NITROSILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II ..................................... 77 1.7. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LAS ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II ............................................................................................................. 78 1.8. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN PROTEICA DE LAS ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II ........................................................................... 80 1.9. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Y H2O2 ........................ 82 2. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULAR INVOLUCRADAS EN LA REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD NAPDH OXIDASA POR L-CARNITINA ............................................................ 93 2.1. EFECTO DE LA WORTMANINA, SB203580, PD98059 Y BIS I SOBRE LA ACTIVIDAD NADPH OXIDASA . .............................................................................................................. 93 v 2.1.1. Efecto de la wortmanina, SB203580, PD98059 y BIS I sobre la actividad NADPH oxidasa inducida por angiotensina II ................................................................................ 93 2.1.2. Efecto de la wortmanina, SB203580, PD98059 Y BIS I sobre la actividad NADPH oxidasa en células tratadas con angiotensina II y L-carnitina ........................................... 94 2.2. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II Y LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS AKT, p38 MAPK Y ERK1/2 ................................................................. 96 2.2.1. Cinética de la fosforilación de la proteína Akt inducida por angiotensina II ............. 96 2.2.2. Efecto de la L-carnitina sobre la fosforilación de la proteína Akt en células estimuladas con angiotensina II ....................................................................................... 97 2.2.3. Cinética de la fosforilación de la proteína p38 MAPK inducida por angiotensina II ........................................................................................................................................ 99 2.2.4. Efecto de la L-carnitina sobre la fosforilación de la proteína p38 MAPK en células tratadas con angiotensina II ........................................................................................... 100 2.2.5. Cinética de la fosforilación de la proteína ERK1/2 inducida por angiotensina II ...... 101 2.2.6. Efecto de la L-carnitina sobre la fosforilación de la proteína ERK1/2 en células tratadas con angiotensina II ........................................................................................... 102 2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA QUINASA C (PKC) EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II ......................................... 103 2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL NF-ΚB HACIA EL NÚCLEO ........................................................................................................................... 104 2.4.1. Cinética de la translocación del complejo NF-kB inducida por angiotensina II ...... 104 2.4.2. Efecto de la L-carnitina sobre la translocación del complejo NF-KB hacia el núcleo en células tratadas con angiotensina II .......................................................................... 104 2.4.3. Efecto de la L-carnitina en la fosforilación de α-IkB inducida por angiotensina II .. 106 3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LOS MECANISMOS FIBRÓTICOS INDUCIDOS POR TGFβ. ESTUDIO DE LA NADPH OXIDASA, PROTEÍNAS SMAD Y METALOPROTEINASAS. ................................................................................................. 107 3.1. EFECTO DEL TGFβ SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO. CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE O2.- EN RESPUESTA A TGFβ. ....................... 107 3.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD NADPH OXIDASA EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON TGFβ ............................................................................. 108 3.2.1. Ensayo concentración-respuesta para la L-carnitina ........................................... 108 vi 3.2.2. Efecto de la L-carnitina sobre la actividad NADPH oxidasa estimulada por TGFβ ...................................................................................................................................... 109 3.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE LAS ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA .............................................................. 110 3.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE CTGF (MARCADOR DE FIBROSIS) INDUCIDA POR TGFβ ....................................................... 113 3.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA SMAD2 INDUCIDA POR TGFβ ......................................................................................... 114 3.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL SISTEMA DE DEGRADACIÓN DE COLÁGENO .................................................................................................................... 115 3.6.1. Estudios in vivo ................................................................................................... 115 3.6.1.1. Efecto de la L-carnitina en la expresión génica de MMP-9 en corteza renal de ratas hipertensas ...................................................................................................... 115 3.6.1.2. Efecto de la L-carnitina en la expresión génica de TIMP-1 en corteza renal de ratas hipertensas ...................................................................................................... 116 3.6.1.3. Efecto de la L-carnitina en el ratio MMP-9/TIMP-1 en corteza renal de ratas hipertensas. .............................................................................................................. 117 3.6.2. Estudios in vitro ................................................................................................... 118 3.6.2.1. Efecto de la L-carnitina en la expresión génica de MMP9 en células NRK-52E ................................................................................................................................. 118 3.6.2.2. Efecto de la L-carnitina en la expresión génica de TIMP-1 en células NRK-52E ................................................................................................................................. 119 3.6.2.3. Efecto de la L-carnitina en el ratio MMP-9/TIMP-1 en células NRK-52E ........ 120 DISCUSIÓN 1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA NADPH OXIDASA: RUTAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS ........................................................................................................................ 123 1.1 EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA NADPH OXIDASA ................................................. 123 1.2 RUTAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN EL EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO GENERADO POR ANGIOTENSINA II A TRAVÉS DE LA NADPH OXIDASA ............................................................................................................. 129 2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTADO FIBRÓTICO INDUCIDO POR TGFβ131 CONCLUSIONES ................................................................................................................. 135 BIBLIOGRAFÍA ..................................................................................................................... 139 vii ABREVIATURAS (e)NOS: (endotelial) óxido nítrico sintasa AA: ácido araquidónico Acetil CoA: acetil coenzima A ADN: ácido desoxirribonucleico ARN: ácido ribonucleico AT1: receptor tipo I de la angiotensina II ATP: adenosín trifosfato BH4: tetrahidrobiopterina BIS I: bisindolilmaleimida I CAT: catalasa CoA: coenzima A cPLA2: fosfolipasa A2 citosólica CTGF: factor de crecimiento de tejido conjuntivo DAG: diacilglicerol DMSO: dimetilsulfóxido DPI: difenil-eno-iodonio DTT: ditiotreitol DUOX: oxidasa dual EDTA: ácido etilendiaminotetraacético EGTA: ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil)- tetraacético ERK: quinasa activada por señales extracelulares ERO: especies reactivas de oxígeno ET-1: Endotelina 1 FAD: flavín adenín dinucleótido GADPH: gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa GDP: guanosín difosfato GEF: factor de intercambio de nucleótidos de guanina GPx: Glutatión peroxidasa GR: Glutatión reductasa GTP: guanosín trifosfato HNE: 4-hidroxi-2-nonenal HTA: hipertensión arterial HUVEC: células endoteliales de vena umbilical humana IGF-1: factor de crecimiento insulínico tipo I IkB: inhibidor de kappa B LC: L-carnitina L-NAME: N ⍵-nitro-L-arginina metil éster hidrocloruro MAPK: proteína quinasa activada por mitógenos MMP: metaloproteinasas de la matriz extracelular MOPS: ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico viii MPO: mieloperoxidasa NADPH: nicotamín adenín dinucleótido fosfato NF-kB: factor de activación nuclear kappa B NO: óxido nítrico NOX: NADPH oxidasa NOXA1: nox activator 1 NOXO1: nox organizer 1 Nrf2: factor relacionado al factor nuclear eritroidal 2 OCTN: organic cation transporters novel OXI: oxipurinol PAK: quinasa activada por p21 PCR: reacción en cadena de la polimerasa PDGF: factor de crecimiento derivado de plaquetas PI3K: fosfoinositol 3-fosfato quinasa PI3P: fosfatidilinositol 3-fosfato PKC: proteína quinasa C PLC: fosfolipasa C PLD: fosfolipasa D PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo PPAR: receptor activador de la proliferación de peroxisomas RASMC: células de músculo liso de aorta de rata ROT: rotenona SDS: dodecilsulfato sódico SFB: suero fetal bovino SHR: spontaneusly hypertensive rats (ratas genéticamente hipertensas) siRNA: ARN de interferencia Smad: small mothers against decapentaplegic SOD: superóxido dismutasa SRA: sistema renina-angiotensina Src: tirosina quinasa Src TGFβ: factor de crecimiento transformante β TIMP: inhibidor tisular endógeno de metaloproteinasas TNFα: factor de necrosis tumoral α TβRI/ALK5: receptor de TGFβ tipo I TβRII: receptor de TGFβ tipo II URL: unidades relativas de luz VSMC: células de músculo liso vascular XDH: xantina deshidrogenasa XO: xantina oxidasa α-SMA: α-actina de músculo liso ix LISTADO DE REACTIVOS Y ANTICUERPOS - 2-acetilfenotiazina (Sigma-Aldrich, España) .................................................. Art. 175226 - Ácido 3-(N-morfolino) propanosulfónico (MOPS) (USB, Alemania) .................................. ............................................................................................................................. Art. 19256 - Ácido acético (Panreac, España) ............................................................. Art. 11008.1102 - Ácido clorhídrico (HCL) (Panreac, España) .................................................... Art. 141020 - Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (Sigma-Aldrich, España) .................................... ............................................................................................................................. Art. E1644 - Ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil)-tetraacético (EGTA) (Sigma-Aldrich, España) ........... ............................................................................................................................. Art. E4378 - Acrilamida/Bisacrilamida al 30% (Bio-Rad Laboratories) ................................. Art. 67784 - Agarosa estándar baja EEO (Ecogen, España) ............................................ Art. AG0120 - Agua-DEPC (Invitrogen, España) .................................................................. Art. AM9906 - Amersham ECL Prime Western Blotting Detection reagent (GE Healthcare Life Science, España) .......................................................................................... Art. RPN2232 - Amonio persulfato (APS) (Sigma-Aldrich, España) .......................................... Art. A3678 - Amplex red hydrogen/peroxidase assay kit (Invitrogen, España) ..................................... ............................................................................................................................ Art A22188 - Angiotensina II (Sigma-Aldrich, España) .......................................................... Art. A9525 - Anticuerpo anti-Akt (Cell signaling, USA) ........................................................... Art. 9272 - Anticuerpo anti-ERK1/2 (Santa Cruz Biotechnology, España) ........................................... ...................................................................................................................... Art. sc-135900 - Anticuerpo anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, España) ........................... .......................................................................................................................... Art. sc-2031 - Anticuerpo anti-nitrotrosina (Millipore, Alemania) ............................................ Art. 05-233 - Anticuerpo anti-NOX1 (Santa Cruz Biotechnology, España) ...................... Art. sc-25545 x - Anticuerpo anti-NOX2 (Epitomics, USA) ......................................................... Art. 5653-1 - Anticuerpo anti-NOX4 (Santa Cruz Biotechnology, España) ...................... Art. sc-30141 - Anticuerpo anti-p38 MAPK (Cell signaling, USA) ............................................... Art. 9212 - Anticuerpo anti-p65 NF-kB (Santa Cruz Biotechnology, España) ..................................... ............................................................................................................................ Art. sc-372 - Anticuerpo anti-p-Akt (Cell signaling , USA) ..................................................... Art. 92715 - Anticuerpo anti-p-p38 MAPK (Cell signaling, USA) .......................................... Art. 92115 - Anticuerpo anti-p-Smad2 (Santa Cruz Biotechnology, España) ....................................... ...................................................................................................................... Art. sc-101801 - Anticuerpo anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology, España) ............................. .......................................................................................................................... Art. sc-2030 - Anticuerpo anti-α-IkB (Santa Cruz Biotechnology, España) .......................... Art. sc-8404 - Anticuerpo anti-β-actina (Sigma-Aldrich, España) ............................................ Art. A5441 - Anticuerpo p-ERK1/2 (Santa Cruz Biotechnology, España) ......................... Art. sc-81492 - Aprotinina (Sigma-Aldrich, España) ................................................................ Art. A-1153 - Azul de bromofenol (Sigma-Aldrich, España) ................................................. Art. B-8026 - Benzamidina (Sigma-Aldrich, España) ............................................................. Art. B6506 - Bio-Rad Protein Assay (Reactivo de Bradford) (Bio-Rad Laboratories, USA) ................. ........................................................................................................................ Art. 500-0006 - Bisindolilmaleimida I (BIS I) (Sigma-Aldrich, España) ...................................... Art. B6292 - Blotting-Grade Blocker (Bio-Rad Laboratories) ........................................... Art. 170-6404 - Cloroformo (Sigma-Aldrich, España) .............................................................. Art. C-2432 - Cloruro cálcico (CaCl2) (Sigma-Aldrich, España) ............................................ Art. C3881 - Cloruro magnésico (MgCl2) (Sigma-Aldrich, España) ...................... Art. MM1058335000 - Cloruro potásico (KCl) (Sigma-Aldrich, España) .............................................. Art. P4504 - Cloruro sódico (NaCl) (Panreac, España) ...................................................... Art. 211939 xi - Cóctel inhibidor de fosfatasas (Sigma-Aldrich, España) .................................. Art. P0044 - Cóctel inhibidor de proteasas (Roche, USA) ........................................ Art. 11697498001 - Deoxicolato sódico (Sigma-Aldrich, España) ................................................... Art. D6750 - difenil-eno-iodonio (DPI) (Sigma-Aldrich, España) .......................................... Art. D2926 - Dimetilsulfóxido (DMSO) (Sigma-Aldrich, España) ........................................ Art. 276855 - Ditiotreitol (Sigma-Aldrich, España) ................................................................ Art. D-0632 - Dodecilsulfato sódico (SDS) (Sigma-Aldrich, España) ....................................... Art. 3771 - Dulbecco,s Modified Eagle,s Medium (DMEM) 1X (Invitrogen, España) ........................ ...................................................................................................................... Art. 12491-015 - Dulbecco,s phosphate buffered saline (DPBS) 1X (Invitrogen, España) .......................... ...................................................................................................................... Art. 14190-250 - Etanol absoluto (Panreac, España) ....................................................... Art. 141086.1214 - FastStart SYBR Green Master (Roche, Alemania) .......................... Art. 7504673514001 - Fluoruro de fenilmetilsulfonilo (Sigma-Aldrich, España) ................................... Art. P7626 - Fluoruro de sodio (Sigma-Aldrich, España) .................................................... Art. 201154 - Formaldehído (Panreac, España) .......................................................... Art. 131328.1211 - Fosfato potásico monobásico (KH2PO4) (Panreac, España) ......................... Art. 141509 - ɣ-globulina bovina (Bio-Rad Laboratories, USA) ......................................... Art. 500-0005 - Glicerol (Sigma-Aldrich, España) .................................................................... Art. G-5516 - Glicina (Sigma-Aldrich, España) ..................................................................... Art. G-8898 - gp91 ds-tat (Anaspec, USA) ............................................................................. Art. 63818 - HEPES (Sigma-Aldrich, España) ..................................................................... Art. H3375 - Isopropanol (Sigma-Aldrich, España) ............................................................... Art. I-9516 - Kit High-Capacity cDNA Archive (Applied Biosystems, España) ...................................... ......................................................................................................................... Art. 4322171 - L-carnitina (Roig Farma) .............................................................................. Art. 32183-25 - Leupeptina (Sigma-Aldrich, España) ................................................................ Art. L2884 xii - Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, España) ...................................... ........................................................................................................................ Art.11668019 - Lucigenina (Sigma-Aldrich, España) ............................................................... Art. M-8010 - Marcador de pesos moleculares (Bio-Rad Laboratories, USA) .................... Art.161-073 - Membrana de nitrocelulosa (Bio-Rad Laboratories) .................................... Art. 162-0115 - Metanol (Panreac, España) ................................................................... Art. 131091.1214 - N ⍵-nitro-L-arginina metil éster hidrocloruro (L-NAME) (Sigma-Aldrich, España) ............ ............................................................................................................................ Art. N5751 - Nonidet P-40 (Sigma-Aldrich, España) ............................................................ Art. NP40S - Opti-MEM I Reduced Serum Medium (1X) (Invitrogen, España) ...................................... ....................................................................................................................... Art. 31985062 - Ortovanadato de sodio (Sigma-Aldrich, España) ............................................. Art. S6508 - Oxipurinol (Sigma-Aldrich, España) ................................................................. Art. O6861 - PD98059 (Sigma-Aldrich, España) ..................................................................... Art. P215 - Penicilina/estreptomicina 100X (Invitrogen, España) ................................ Art. 15070-063 - PKC kinase activity kit (Enzo Life Sciences, USA) ............................. Art. ADI-EKS-420A - Ponceau S (Sigma-Aldrich, España) ................................................................ Art. P3504 - Red-Safe nucleic acid staining solution (Intron Biotechnology, Corea) ............................ ............................................................................................................................. Art. 21141 - Rotenona (Sigma-Aldrich, España) ................................................................. Art. R8875 - Sacarosa (Merck, Alemania) ........................................................................... Art. 107654 - SB203580 (Sigma-Aldrich, España) ................................................................. Art. S8307 - Silencer Selected Negative Control siRNA (Applied Biosystems, España) ...................... ......................................................................................................................... Art. 4390844 - Silencer Selected pre-designed siRNA for NOX2 (Applied Biosystems, España) ............ ......................................................................................................................... Art. 4390771 xiii - Silencer Selected pre-designed siRNA for NOX4 (Applied Biosystems, España) ............ ......................................................................................................................... Art. 4390771 - Suero fetal bovino (SFB) (Invitrogen, España) ............................................ Art. 244-0096 - Superóxido dismutasa (SOD) (Sigma-Aldrich, España) ................................... Art. S5751 - Tampón de muestra, Laemmli 2x concentrate (Sigma-Aldrich, España) .......................... ........................................................................................................................... Art. S-3401 - TEMED (Bio-Rad Laboratories, USA) .......................................................... Art. 161-0800 - TGFβ (R&D Biosystems, USA) .................................................................. Art. 240-B-002 - Tripsina-EDTA (1X) (Invitrogen, España) ................................................... Art. 25300054 - Tris-hidroximetil-animometano (Trizma®, Tris) (Sigma-Aldrich, España) ......................... ............................................................................................................................ Art. T-1358 - TRIzol® (Invitrogen, España) ...................................................................... Art. 15596018 - Tween-20 (Sigma-Aldrich, España) .................................................................. Art. P1379 - Wortmanina (Sigma-Aldrich, España) .............................................................. Art. W1628 - β-glicerolfosfato (Sigma-Aldrich, España) ....................................................... Art. G5422 - β-mercaptoetanol (Bio-Rad Laboratories) ................................................... Art. 161-0710 - β-Nicotinamín adenín dinucleótido fosfato reducido (NADPH) (Sigma-Aldrich, España) . ........................................................................................................................... Art. N-6505 xx INTRODUCCIÓN 3 Introducción 1. NEFROPATÍA HIPERTENSIVA La hipertensión arterial (HTA), definida como una elevación crónica de los valores normales de presión arterial, es el problema de salud más común en las sociedades desarrolladas, constituyendo uno de los factores de riesgo cardiovascular más relevantes.1,2 Además del sistema cardiovascular, la HTA afecta a otros órganos vitales como el riñón; de hecho, una de las principales consecuencias de la HTA es la pérdida progresiva de la función renal.3 Estudios recientes sugieren que la hipertensión es causa y consecuencia de las enfermedades renales, estando la presencia de fallo renal asociada al desarrollo de enfermedades cardiovasculares.4 La nefropatía hipertensiva, por tanto, se define como un trastorno dañino del riñón causado por una elevación continuada de los valores de presión arterial.5 Así, el incremento en la presión sanguínea sistémica conduce a un aumento de la presión glomerular, provocándose un estiramiento de la pared de los vasos, daño endotelial y un aumento en la filtración glomerular de proteínas. Estos procesos, a su vez, provocan cambios en las células mesangiales y tubulares proximales, resultando en última instancia en una sustitución del tejido funcional por tejido conectivo no funcional; esto es, provocándose una fibrosis.6 Por otro lado, uno de los factores más importantes en la progresión del fallo renal crónico es la activación del sistema renina-angiotensina (SRA), no solo por su efecto sobre la elevación de la presión sanguínea, sino también por favorecer los procesos de proliferación celular, inflamación y acumulación de matriz extracelular que acompañan a la nefropatía hipertensiva. Numerosos estudios demuestran que la angiotensina II (Ang II) tiene un papel fundamental en el daño funcional y estructural del riñón derivado de la hipertensión arterial, a través del efecto que realiza sobre el estrés oxidativo y la participación de la enzima NADPH oxidasa. Así, en la actualidad está aceptado que la Ang II genera estrés oxidativo en el riñón a través del receptor tipo I de la Ang II (AT1), mediando la generación de hipertensión arterial y el desarrollo de un daño renal progresivo.6-9 4 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 1.1. ESTRÉS OXIDATIVO 1.1.1. CONCEPTO DE ESTRÉS OXIDATIVO. ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO (ERO) El estrés oxidativo se define como un desequilibrio entre la formación de las especies reactivas de oxígeno (ERO) y los mecanismos de defensa antioxidantes, fenómeno que participa en multitud de procesos patológicos.10 En general, los radicales libres son especies químicas con un electrón desapareado, siendo moléculas altamente reactivas. La formación de radicales libres en cadena lidera el daño a tejidos y sistemas biológicos. La gran mayoría de estos radicales libres son principalmente radicales de oxígeno y otras ERO. Entre estas especies reactivas se encuentran: anión superóxido (O2.-), peróxido de hidrógeno (H2O2), radical hidroxilo (OH.), óxido nítrico (NO), peroxinitrito (ONOO-), ácido hipocloroso (HOCl) y oxígeno singlete (1O2)11,12 (Figura 1). Las ERO tienen un alto potencial deletéreo para la integridad de las células, por lo cual deben de ser neutralizadas por el sistema de defensa antioxidante. En los sistemas biológicos, existen sistemas enzimáticos y no enzimáticos que protegen a la célula de los efectos perjudiciales del estrés oxidativo. Entre las enzimas antioxidantes que participan en la eliminación de las ERO se encuentran la superóxido dismutasa (SOD), que convierte el anión superóxido en peróxido de hidrógeno, y las enzimas catalasa (CAT) y glutatión peroxidasa (GPX), las cuales catalizan la descomposición del peróxido de hidrógeno en agua. También la enzima glutatión reductasa (GR) es de vital importancia, ya que genera glutatión reducido (GSH) a partir de glutatión oxidado (GSSG), siendo aquél necesario para la acción de la GPX (Figura 1). Entre los antioxidantes endógenos no enzimáticos destacan principalmente el glutatión, y las vitaminas A, C, E entre otros.13,14 5 Introducción Figura 1: Metabolismo de las especies reactivas de oxígeno (ERO). CAT, catalasa; Cl-, cloruro; GPX, glutatión peroxidasa; GR, glutatión reductasa; GSH, glutatión reducido; GSSG, glutatión oxidado; H2O, agua; H2O2, peróxido de hidrógeno; HOCl, ácido hipocloroso; MPO, mieloperoxidasa; NO, óxido nítrico; NOS, óxido nítrico sintasa; O2, oxígeno molecular; O2.-, anión superóxido; 1O2, oxígeno singlete; OH., radical hidroxilo; ONOO-, peroxinitrito; SOD, superóxido dismutasa. 1.1.1.1. FUNCIONES BIOLÓGICAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO Las ERO participan y contribuyen en una amplia variedad de funciones y mecanismos esenciales para la célula. Así, forman parte del sistema inespecífico de defensa frente a bacterias u otros microorganismos, actúan como sensores de la presión de oxígeno, y participan en el desarrollo y migración de las células de la musculatura lisa, en la modulación de la función endotelial (regulando el tono vascular), en la expresión de las citoquinas proinflamatorias y en la modificación de la matriz extracelular, entre otros.9,10,15 Las ERO también pueden actuar como segundos mensajeros (principalmente el anión superóxido y el peróxido de hidrógeno), amplificando las señales de transducción de H202 OH. 02.- H2O CAT HOCl 1O2 O2.- NADPH oxidasa Xantina oxidasa NOS Lipooxigenasas Ciclooxigenasas Cadena transportadora de eCitocromo P450 MPO H202 1O2 SOD ONOO- + NO 02 GPX GR GSSG GSH O2+ ClH2O2 H2O 6 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato varios receptores de membrana. Así, por ejemplo, el anión superóxido estimula la activación de la enzima guanilato ciclasa, formando GMPc, que es un potente mensajero secundario, además de actuar como mensajero intracelular esencial en la acción presora de la Ang II.15,16 Por otro lado, el peróxido de hidrógeno participa en vías de señalización que regulan procesos de migración y diferenciación celular, así como en vías de señalización involucradas en procesos de hipertrofia, modulando la activación de proteínas MAPK (proteínas quinasas activadas por mitógeno) tales como p38 MAPK (proteína quinasa p38 activada por mitógeno) y ERK1/2 (proteínas quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2).17 1.1.1.2. FUENTES ENZIMÁTICAS PRODUCTORAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS DE OXÍGENO En las células existen muchas fuentes enzimáticas productoras de especies reactivas de oxígeno. Entre ellas, cabe destacar: a) La enzima xantina oxidasa. Se encuentra localizada en el citosol, en la superficie externa de la membrana celular (con predominio en las regiones de contacto intercelular) y en vesículas intracelulares. Es una metaloflavoproteína que puede estar en dos formas interconvertibles y diferentes entre sí, denominadas xantina deshidrogenasa (XDH) y xantina oxidasa (XO). De estas dos formas, solo la segunda genera anión superóxido por oxidación de la hipoxantina a xantina, y de la xantina a ácido úrico (procesos que requieren la reducción de oxígeno molecular) (Figura 2). Por tanto, la activación en exceso de XO puede aumentar la generación de las ERO, siendo ésta la causa de muchas enfermedades que cursan con daño en la función vascular.18,19 Figura 2: Reacciones catalizadas por la xantina oxidasa. H2O, agua; H2O2, peróxido de hidrógeno; O2, oxígeno molecular; O2.-, anión superóxido. 7 Introducción b) La enzima óxido nítrico sintasa (NOS) desacoplada. La NOS se localiza en caveolas del sarcolema, túbulos T de cardiomiocitos, mitocondria y retículo endoplásmico. En condiciones fisiológicas, esta enzima, en presencia de cofactores como la L-arginina y la tetrahidrobiopterina (BH4), produce NO. Ahora bien, en situaciones adversas, puede llegar a sufrir un proceso de “desacoplamiento” por deficiencia de BH4 o L-arginina. En estas condiciones, la NOS reduce el oxígeno molecular y genera anión superóxido (Figura 1). Además, hay que tener en cuenta que el peroxinitrito, formado por la unión entre el anión superóxido y el óxido nítrico (Figura 1), puede oxidar a la BH4, colaborando en el proceso de desacoplamiento. El incremento en la producción de anión superóxido, así como el aumento en la generación de peroxinitrito, forman parte de la fisiopatología de muchas enfermedades cardiovasculares.19-21 c) La cadena respiratoria mitocondrial. La producción de ERO en la mitocondria es importante para el control del metabolismo y de la transducción de señales, entre otras funciones. Más del 95% del O2 consumido por las células es reducido por 4 electrones para generar 2 moléculas de agua mediante los complejos enzimáticos (I-IV) de la cadena mitocondrial. En menor medida, este flujo de electrones es dirigido hacia la generación de anión superóxido (Figura 1). Los complejos que más anión superóxido generan en la cadena respiratoria mitocondrial son el complejo I (NADH deshidrogenasa) y el complejo III (ubiquinona-citocromo c reductasa). La mayoría del superóxido generado es rápidamente dismutado a peróxido de hidrógeno por la enzima superóxido dismutasa22-24 (Figura 1). d) La enzima citocromo P450. Se encuentra localizada en las membranas plasmática, mitocondrial y del retículo endoplásmico, generando anión superóxido y radicales hidroxilo19,25,26 (Figura 1). e) Las enzimas lipooxigenasas, ciclooxigenasas y mieloperoxidasa (MPO). La enzima MPO genera HOCl a partir de Cly H2O2, localizándose en los gránulos primarios de neutrófilos. Las enzimas ciclooxigenasas y lipooxigenasas generan anión superóxido23,26-28 (Figura 1). f) La enzima NADPH oxidasa. Por su importancia en el contexto del presente estudio, dedicaremos el apartado 1.2 a la descripción detallada de esta enzima generadora de especies reactivas de oxígeno. Los cambios en la regulación de esta enzima pueden 8 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato inducir un aumento del estrés oxidativo de especial relevancia en la iniciación y progresión de enfermedades cardiovasculares y renales. 1.1.2. ESTRÉS OXIDATIVO: CONSECUENCIAS PATOLÓGICAS RENALES En determinadas condiciones patológicas, el incremento en la generación de ERO y/o la depleción del sistema antioxidante producen un aumento de estrés oxidativo que resulta, como hemos comentado, en un daño en el tejido. Las ERO tienen un efecto deletéreo sobre lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. La peroxidación lipídica es particularmente dañina, al ir acompañada de una liberación adicional de sustancias reactivas, con modificación de las estructuras celulares. Por su parte, especies reactivas como el peroxinitrito pueden reaccionar con residuos de proteínas, provocando la aparición de nitrotirosina. A continuación, las proteínas oxidadas se inactivan y se vuelven más susceptibles a ser eliminadas por proteólisis. Por último, las ERO también atacan a todos los componentes de la molécula de ADN, pudiendo provocar modificaciones permanentes en el material genético.29-33 Todos estos mecanismos dañinos para la célula han sido implicados en la patogénesis de muchas enfermedades, incluyendo alteraciones renales como glomerulonefritis, fallo renal agudo, fallo renal progresivo y nefritis túbulo-intersticial. Por otro lado, hay que tener en cuenta la especial vulnerabilidad del riñón ante el daño por estrés oxidativo, debido al alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga que existe entre los lípidos renales.10,34 Existen distintas enfermedades que inducen estrés oxidativo en el riñón, contribuyendo a la enfermedad renal. Entre estas enfermedades se encuentran la hipercolesterolemia, el síndrome metabólico, la diabetes mellitus o la hipertensión. En concreto, y como ya se ha señalado, la hipertensión arterial se considera una de las mayores causas de desarrollo de fallo renal, siendo el regulador clave en el desarrollo de esta patología el estrés oxidativo.34 Por otro lado, el SRA juega un papel esencial en la regulación de procesos fisiológicos y fisiopatológicos en el riñón. La Ang II produce estrés oxidativo en el riñón a 9 Introducción través de la sobreexpresión de la enzima NADPH oxidasa a lo largo de la nefrona, con la consecuente generación de anión superóxido. Así, el aumento de la peroxidación lipídica en pacientes hipertensos con enfermedad renovascular, se relaciona con un aumento del estrés oxidativo producido por la activación del sistema SRA y los consiguientes efectos sistémicos de la Ang II.9,35 1.2. NADPH OXIDASA 1.2.1. ASPECTOS GENERALES La enzima nicotinamida adenina dinucleótido fosfato oxidasa (NADPH oxidasa) es un complejo multienzimático que cataliza la producción de anión superóxido, mediante la transferencia de un electrón procedente de una molécula de NADPH hasta el oxígeno molecular. Todas las isoformas de la NADPH oxidasa poseen una serie de propiedades estructurales comunes: sitio de unión a NADPH, sitio de unión a flavina adenina dinucleótido (FAD), 6 dominios transmembrana conservados, y 4 histidinas altamente conservadas asociadas a grupos hemo.36,37 La enzima NADPH oxidasa interviene en numerosas funciones, entre las que destacan: señalización celular, mediación de efectos hormonales, regulación de la actividad de canales iónicos, sensor de O2, diferenciación de adipocitos, expresión génica, reproducción, proliferación celular, senescencia, apoptosis y sistema de defensa.37-39 La primera NADPH oxidasa descrita fue la fagocítica, siendo ésta un componente clave en la inmunidad innata. El componente catalítico de la NADPH oxidasa fagocítica (NADPH oxidasa “clásica”) se denomina gp91phox y se localiza en membranas intracelulares y en la membrana plasmática. Sin embargo, gp91phox también se ha encontrado en otras células no fagocíticas, tales como las vasculares, cardiacas, renales, neuronas, miocitos y hepatocitos, pasándose a llamar a NOX2. En estos casos, la localización subcelular de NOX2 va a depender del tipo de célula (Sedeek, Hebert, Kennedy, Burns, & Touyz, 2009). Estudios posteriores han demostrado la existencia de proteínas homólogas a gp91phox en otros tipos celulares no fagocíticos, describiéndose de este modo las 7 16 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato NOX4, como Poldip2 y TKS (que inducen un aumento de actividad de NOX4).64 También existen trabajos que han propuesto un papel inhibitorio de NOXA1 sobre NOX4.55 Según la literatura reciente, el H2O2 parece ser el producto principal de NOX4, aunque la bioquímica del proceso no se conoce muy bien. Puede que se produzca una rápida dismutación del anión superóxido a peróxido de hidrógeno tras ser liberado por NOX4. Otros autores proponen que la disociación del anión superóxido de NOX4 es más lenta que en otras isoformas de gp91phox, permitiendo la dismutación hacia H2O2 antes de ser liberada por NOX4. En este sentido, se ha propuesto un mecanismo por el cual NOX4 produce preferencialmente H2O2 mediante la implicación de un residuo altamente conservado en el lazo E de NOX4, que promovería la rápida dismutación de anión superóxido antes de salir de la enzima64-66. Sea como fuere, NOX4 libera H2O2 al medio extracelular cuando se encuentra localizada en la membrana extracelular. Cuando está localizada en membranas de estructuras intracelulares, la liberación de H2O2 se produce hacia el lumen de estos orgánulos45,67 (Figura 7). Figura 7: NOX4. GDP, guanosín difosfato; H2O2, peróxido de hidrógeno; NOX4, NADPH oxidasa 4; O2, oxígeno molecular; O2.-, anión superóxido; p22phox, citocromo b-245; RAC1, GTPasa. 17 Introducción La isoforma NOX5 genera anión superóxido y peróxido de hidrógeno en respuesta a incrementos de los niveles intracelulares de calcio. Posee un dominio calmodulina en la región aminoterminal, en la cual se localizan 4 sitios de unión a calcio, no necesitando otras subunidades para su activación (Figura 8). El dominio carboxiterminal presenta sitios de unión a FAD y NADPH.64,68 Debido a su localización en las membranas de orgánulos celulares, tales como el retículo endoplásmico, se ha descrito la producción de ERO hacia el lumen de dichos orgánulos.48 Por otro lado, NOX5 también genera ERO hacia el medio extracelular cuando NOX5 está presente en la membrana plasmática (Figura 8), aunque en menor proporción que cuando se localiza intracelularmente.48,49 Figura 8: NOX5. H2O2, peróxido de hidrógeno; NOX5, NADPH oxidasa 5; O2.-, anión superóxido. Por último, DUOX1 y DUOX2 no requieren subunidades reguladoras para su funcionamiento, pudiendo ser activadas directamente por calcio. Producen peróxido de hidrógeno,36,58 existiendo estudios que muestran que DUOX1 y DUOX2 producen H2O2 hacia el medio extracelular69 (Figura 9). .- 18 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Figura 9: DUOX1/2. DUOX1/2, Dual oxidasa 1/2; DUOXA 1/2, factor 1/2 de maduración de DUOX; y H2O2, peróxido de hidrógeno. 1.2.2.3. DIFERENCIAS ENTRE LA NADPH OXIDASA FAGOCÍTICA Y NO FAGOCÍTICA Aunque la NADPH oxidasa fagocítica y la no fagocítica son similares entre sí, presentan importantes diferencias funcionales entre ellas. Así, la NADPH fagocítica no produce anión superóxido en condiciones basales, ya que en reposo está completamente inactiva, como hemos señalado; por el contrario, la no fagocítica consta de una actividad constitutiva basal moderada. Otro aspecto diferencial se halla en la forma y cantidad de anión superóxido producido: las células fagocíticas liberan más cantidad de superóxido y mucho más rápidamente que las no fagocíticas, que alcanzan su producción máxima desde minutos hasta horas.70,71 Por otra parte, las células fagocíticas generan anión superóxido hacia el espacio extracelular para su función microbicida. Mientras tanto, las no fagocíticas generan anión superóxido tanto hacia el medio extracelular como hacia el intracelular, interviniendo en procesos de señalización celular.52 En cuanto a la utilización del donador de electrones como sustrato, si bien en ambos casos pueden usar NADPH, la NADPH oxidasa no fagocítica puede utilizar NADH.72,73 19 Introducción 1.2.3. VÍAS DE SEÑALIZACIÓN IMPLICADAS EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA Como hemos visto, la activación de la NADPH oxidasa (ya sea en su forma fagocítica o no fagocítica) está modulada e involucra normalmente el ensamblaje de componentes citosólicos y del citocromo b558 unido a membrana. Las vías de señalización que provocan la activación de la NADPH oxidasa no están completamente definidas, existiendo vías que activan los dos procesos necesarios para la activación de la NADPH oxidasa, a saber: 1) la translocación de los componentes citosólicos a la membrana, y 2) la activación y translocación de RAC. 1.2.3.1. PAPEL DE LA VÍA DE FOSFATIDILINOSITOL 3-QUINASA (PI3K) EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA PI3K es una enzima quinasa capaz de fosforilar moléculas de fosfatidilinositol (PI) en fosfatidilinositol 3-fosfato (PI3P) que actúa como molécula de señalización.74 Cuando un estímulo se une a su receptor, acoplado a proteínas G triméricas, provoca en última instancia la activación de PI3K, lo que conlleva una acumulación de PI3P y la subsiguiente activación de Akt y GEFs (factores de intercambio de nucleótido de guanina). Akt fosforila a p47phox, y GEF provoca el paso de GDP a GTP en la proteína RAC. A continuación, RAC activa a p67phox, y además activa a PAK (quinasa activada por p21), que fosforila a p47phox, provocando finalmente la activación de la NADPH oxidasa75 (Figura 10). 20 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Figura 10: Mecanismo de activación de la NADPH oxidasa mediado por PI3K. Akt, proteína quinasa B; GDP, guanosín difosfato; GEF, factor de intercambio de nucleótido de guanina; GTP, guanosín trifosfato; NOX2, NADPH oxidasa 2; p22phox, citocromo b-245; p47phox, factor citosólico 1 de neutrófilos; p67phox, factor citosólico 2 de neutrófilos; PAK, quinasa activada por p21; Pi, fosfato inorgánico; PI, fosfatidil inositol; PI3K, fosfatidilinositol 3-quinasa; PI3P, fosfatidilinositol 3-fosfato; RAC2, GTPasa. 1.2.3.2. PAPEL DE LAS PROTEÍNAS QUINASAS ACTIVADAS POR MITÓGENO (MAPK) EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA Las MAPK son proteínas involucradas en la regulación de la proliferación, diferenciación y supervivencia celular. Dentro de esta familia de proteínas quinasas encontramos 2 grupos importantes: 1) Quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2 (ERK1/2), y 2) la familia proteína quinasa p38 activada por mitógeno (p38 MAPK).76 Las quinasas ERK1/2 y p38 MAPK han sido también descritas como mediadoras de la activación de la NADPH oxidasa, estando involucradas en la fosforilación de los componentes citosólicos de esta enzima. Además, también son dianas para las especies reactivas de oxígeno, es decir, que pueden actuar como dianas y también como PI PI3P PI PI3P 21 Introducción moduladoras de éstas. Existen estudios que sugieren que ambas proteínas actúan activando a la fosfolipasa A2 citosólica (cPLA2). De este modo, se libera ácido araquidónico que finalmente conduce a la activación de la NADPH oxidasa77 (Figura 11). Figura 11: Mecanismo de activación de la NADPH oxidasa mediado por p38 MAPK y ERK1/2. cPLA2, fosfolipasa A2 citosólica; ERK1/2, quinasas reguladas por señales extracelulares 1 y 2; GTP, guanosín trifosfato; NOX2, NADPH oxidasa 2; p22phox, citocromo b-245; p38 MAPK, proteína quinasa p38 activada por mitógeno; p47phox, factor citosólico 1 de neutrófilos; p67phox, factor citosólico 2 de neutrófilos; RAC2, GTPasa. 1.2.3.3. PAPEL DE LA PROTEÍNA QUINASA C (PKC) EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA La proteína quinasa C (PKC) es una proteína quinasa que participa en la activación de la NADPH oxidasa, tanto en células fagocíticas como no fagocíticas, mediante la fosforilación de p47phox.78 22 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato En la activación de la NADPH oxidasa por esta vía, la llegada del estímulo y la unión a su receptor provoca la activación de la proteína fosfolipasa C (PLC) mediada por proteínas G. Esto provoca una liberación de diacilglicerol (DAG), llevando consigo la activación de la PKC que, al igual que Akt y PAK en la vía PI3K, es capaz de fosforilar a la subunidad p47phox y activar de este modo la enzima75,79 (Figura 12). La activación de las isoformas convencionales de la PKC es dependiente de calcio, estando el flujo de calcio y la PKC interrelacionados en los procesos de activación de la NADPH oxidasa. Esto es de vital importancia, ya que el calcio, junto con la PKC, activa a la pequeña GTPasa RAC (Figura 12), lo cual es imprescindible para la activación de la NADPH oxidasa, como señalamos anteriormente78,80 (Figura 10). Figura 12: Mecanismo de activación de la NADPH oxidasa mediado por PKC. Ca2+, calcio; DAG, diacilglicerol; GDP, guanosín difosfato; GTP, guanosín trifosfato; NOX1/2, NADPH oxidasa 1/2; p22phox, citocromo b-245; p47phox, factor citosólico 1 de neutrófilos; p67phox, factor citosólico 2 de neutrófilos; PKC, proteína quinasa C; PLC, fosfolipasa C; RAC, GTPasa. 23 Introducción 1.2.3.4. PAPEL DEL FACTOR NUCLEAR KAPPA B (NF-kB) EN LA ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA El factor de transcripción NF-kB es un heterodímero cuyo mecanismo de activación engloba al complejo de subunidades p50/p65. Este complejo se sitúa en el citosol, siendo regulado mediante una interacción con una familia de proteínas denominada IkB (inhibidor de kappa B). La activación por estímulos extracelulares induce la fosforilación de IkB a través de quinasas específicas. Esta fosforilación provoca rápidamente que IkB se ubiquitine y se degrade. Esta eliminación de IkB provoca que el complejo NF-kB (p50/p65) quede libre y se transloque hacia el interior del núcleo celular, participando en la modulación de la transcripción génica81 (Figura 13). NF-kB parece estar involucrado no solo en la regulación transcripcional de los componentes de la NADPH oxidasa, ya que existen estudios que relacionan este sistema con la modulación de la actividad de la enzima. Así, en diferentes ensayos utilizando inhibidores de NF-kB, sistemas de sobreexpresión de IkB o deleción del gen que codifica para la subunidad p65, se observa en todos los casos la pérdida de la actividad NADPH oxidasa. Además, el aumento en la actividad del complejo (p50/p65) es directamente proporcional a un incremento en la producción de especies reactivas de oxígeno.82,83 Todos estos estudios apoyan el papel regulador de este factor nuclear en la actividad de la enzima NADPH oxidasa. 24 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Figura 13: Mecanismo de activación de la NADPH oxidasa mediado por NF-kB. GTP, guanosín trifosfato; IkB, inhibidor de kappa B; NF-kB, factor nuclear kappa B; NOX2, NADPH oxidasa 2; p22phox, citocromo b-245; p47phox, factor citosólico 1 de neutrófilos; p67phox, factor citosólico 2 de neutrófilos; RAC2, GTPasa. 1.2.3.5. ACTIVACIÓN DE LA NADPH OXIDASA MEDIADA POR ANGIOTENSINA II La NADPH oxidasa es activada y regulada por diversas moléculas y factores, entre ellos la Ang II. Así, la Ang II es un potente estimulador de la enzima, aumentando la producción de anión superóxido. A pesar de que el mecanismo de señalización mediante el cual la Ang II activa la NADPH oxidasa no se conoce con exactitud, parece ser que las vías de las proteínas PI3K, PKC y MAPK están involucradas.84 Para activar a la NADPH oxidasa, la Ang II se une a su receptor AT1, que está acoplado a proteínas G, produciéndose a través de este sistema la activación de la PLC. A continuación, y como hemos visto anteriormente (Figura 12), se produce una liberación de DAG que activaría a la PKC, fosforilando y provocando la translocación de p47phox y, por 25 Introducción tanto, la activación de la oxidasa.75,85,86 Además, la estimulación de AT1 puede activar a PI3K, la cual, como ya sabemos, promueve la activación de la proteína Akt, que a su vez fosforila a p47phox87,88 (Figura 10). Por otro lado, la Ang II también puede activar a la proteína Src (proteína tirosina quinasa que interacciona con receptores localizados en la superficie celular, participando en vías intracelulares de transducción de señales), la cual promueve la activación de la fosfolipasa D (PLD); se libera así ácido fosfatídico (PA) que, junto con el ácido araquidónico (AA) generado por cPLA2, interviene en la formación de leucotrienos, que son también lípidos activadores de la NADPH oxidasa (Figura 14). En la formación del AA están involucradas las proteínas ERK1/2 y p38 MAPK, como se indicó con anterioridad75,77 (Figura 11). Teniendo en cuenta lo indicado anteriormente, parece que existe un modelo bifásico de activación de la NADPH oxidasa mediada por Ang II. En primer lugar, se produce una activación de la NADPH oxidasa mediada por PKC (1); además, la acción de las proteínas Src y EGF, junto con la actuación de PI3K provoca una fuerte activación de RAC (2), prolongándose así la generación de anión superóxido. Posteriormente, habría una segunda fase independiente de PKC, en la cual la actuación de RAC estimularía la actividad de la proteína PAK (3), sustituyendo ésta a PKC como quinasa para fosforilar a p47phox y activar consecuentemente a la enzima NADPH oxidasa75 (Figura 14). 32 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Figura 16: Estructura química de la L-carnitina La LC se sintetiza endógenamente a partir de los aminoácidos lisina y metionina, siendo los principales lugares de síntesis el riñón, el hígado y el cerebro. Una vez sintetizada, la LC se transporta por la circulación, llegando a los tejidos a través de proteínas transportadoras denominadas organic cation transporters novel (OCTN). OCTN2 es el transportador de alta afinidad de LC de manera dependiente de sodio, y media la absorción intestinal y la reabsorción renal de LC para mantener su concentración en los tejidos y en la sangre circulante.107 La LC cumple varias funciones de vital importancia para la célula, entre las que destacan: el ingreso de ácidos grasos de cadena larga al interior de la mitocondria desde el citosol, para su metabolización mediante el proceso de la beta-oxidación; el transporte ácidos orgánicos activados de cadena media y corta desde los peroxisomas hasta la mitocondria, para su incorporación al ciclo de Krebs; y la modulación de la ratio acetilcoenzima A/coenzima A (AcetilCoA/CoA), reduciendo los efectos tóxicos de los grupos acilos de cadena corta (p. ej., acetilo) mediante su transporte al exterior mitocondrial en forma de acetilcarnitina.106,108,109 33 Introducción 2.2. DEFICIENCIAS Los fallos en la homeostasis de LC pueden inducir complicaciones en determinadas enfermedades y situaciones, como la diabetes mellitus, obesidad, cardiomiopatía, malnutrición y hemodiálisis, entre otras. Clásicamente, se establecen dos tipos de deficiencia de LC: primaria y secundaria.110 La deficiencia primaria de LC es causada por una mutación recesiva en el gen slc22a5 , que codifica para la proteína transportadora OCTN2. La falta de actividad de OCTN2 conduce a un déficit en la reabsorción renal de LC, que resulta en una pérdida de la misma por vía urinaria. Esto hace que disminuyan los niveles plasmáticos y la acumulación intracelular de LC.111 La deficiencia secundaria de LC cursa igualmente con un aumento en la eliminación de LC en la orina y una acumulación de ácidos orgánicos. Esta deficiencia puede ser causada por una terapia farmacológica, por desórdenes metabólicos, dieta pobre, malabsorción de LC o en pacientes sometidos a hemodiálisis, entre otros.110 2.3. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES Y ANTIFIBRÓTICAS 2.3.1. PROPIEDADES ANTIOXIDANTES Existen muchos estudios, realizados tanto en modelos celulares como animales, que muestran la capacidad de la LC para proteger a la célula frente a una lesión oxidativa. Incluso se ha descrito a la LC como una molécula capaz de neutralizar ERO como O2.- y H2O2, es decir, que podría actuar como scavenger de estas moléculas.112 La LC parece ser un agente antioxidante efectivo frente al estado de estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno en HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana)113, y también en células de neuroblastoma y hepatocitos.114 También se ha demostrado que la LC protege al sistema enzimático endógeno de defensa antioxidante, incluyendo la actividad de las enzimas GPX, CAT y SOD (apartado 1.1.1); esta acción protectora se ha descrito tanto en modelos celulares, en un estudio 34 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato realizado en células tubulares proximales humanas,115 como en modelos animales de ratas hipertensas116 y en ratas tratadas con etanol.117 En el corazón de ratas hipertensas, la LC restablece la actividad de las enzimas antioxidantes y la capacidad antioxidante total del plasma, al tiempo que disminuye la peroxidación lipídica.118 Igualmente, se ha observado que la LC inhibe la generación de las ERO intracelulares y disminuye el grado de peroxidación lipídica en células HK-2 (línea celular de túbulo proximal de riñón humano) con toxicidad inducida por peróxido de hidrógeno.115 Por otro lado, la LC también se ha definido como una molécula cuyas propiedades antioxidantes normalizan las alteraciones del estado oxidativo asociado a la edad.119,120 Nuestro grupo de investigación ha puesto de manifiesto que la actividad antioxidante de LC en ratas hipertensas está mediada por una modulación de factores de transcripción implicados en el desarrollo del estrés oxidativo, entre ellos el NF-kB (apartado 1.2.3.4), el Nrf2 (factor relacionado al factor nuclear eritroidal 2), y el PPARα (receptor activador de la proliferación de peroxisomas alfa), provocando de este modo una bajada en la producción de O2.-.116 2.3.2. PROPIEDADES ANTIFIBRÓTICAS Se ha demostrado que la LC presente efectos beneficiosos frente a la fibrosis generada en diferentes patologías. En concreto, existen estudios realizados en riñón que señalan que la LC ejerce un efecto antifibrótico a través del PPARɣ en ratas hipertensas121 y también en ratas tratadas con ciclosporina (inductora de fibrosis), existiendo una supresión de la expresión de TGFβ por parte de la LC.122 También se ha observado un efecto antifibrótico de la LC asociado a la hipertensión arterial a nivel cardiaco.123,124 Igualmente, en investigaciones realizadas en ratas tratadas con tetracloruro de carbono, se observó una inhibición en la fibrosis hepática tras el tratamiento con LC.125 Por otro lado, hay autores que muestran efectos antifibróticos de la LC derivados de su acción a nivel de los sistemas de degradación de colágeno. En concreto, en ratas 35 Introducción que presentaban fibrosis renal intersticial inducida por cisplatino, la LC ejerció su capacidad antifibrótica modulando la relación entre MMP-9 y TIMP-3.126 2.4. APLICACIONES TERAPÉUTICAS Actualmente, la administración farmacológica de la LC está aprobada en España para el tratamiento de isquemia miocárdica (aguda y crónica), miocardiopatías producidas por adriamicina y antidepresivos tricíclicos, miopatías y cardiomiopatías producidas por carencia de LC, y pérdidas de LC durante el tratamiento hemodialítico. Además de lo anterior, existen muchos estudios que muestran los efectos beneficiosos de la LC en diferentes patologías. Así, se ha demostrado sus efectos sobre la diabetes tipo II, siendo la LC capaz de mejorar la disposición de glucosa mediada por insulina.127,128 En pacientes con cáncer, la suplementación con LC produce una mejora en la fatiga, depresión y calidad del sueño, manifestaciones típicas en estos enfermos.129 Igualmente, se han demostrado los efectos beneficiosos de la LC en enfermedades neurodegenerativas. En modelos experimentales de Parkinson, en los cuales se utiliza metanfetamina para generar daño mitocondrial, la LC mejoró la fosforilación oxidativa mitocondrial y previno el aumento en los niveles de peroxinitritos inducido por la administración del fármaco130 Los ésteres de LC, como la acetil-L-carnitina, parecen reducir la progresión de la enfermedad de Alzheimer, existiendo estudios que recomiendan la administración de LC en las fases tempranas de esta enfermedad y también en la demencia vascular.131,132 Otros autores proponen el uso de la LC para el tratamiento de la miopatía mitocondrial y la encefalomiopatía, un grupo de enfermedades caracterizadas por una degeneración progresiva y debilidad tanto neurológica como muscular.133 Por otro lado, se ha demostrado el efecto beneficioso de la LC en la enfermedad coronaria y en la insuficiencia cardiaca y renal. La LC altera la apoptosis, el mayor determinante de la miopatía del músculo esquelético, en un modelo animal de insuficiencia cardiaca 134. Además, hay autores que muestran que la LC protege al miocardio contra la lesión producida por la isquemia-reperfusión.135 36 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 2.5. MECANISMO DE ACCIÓN Se han realizado algunos estudios, en diferentes contextos, para tratar de descifrar las vías de señalización por la cuales la LC o sus derivados realizan sus efectos beneficiosos. Así, el derivado de la LC de cadena corta, la acetil-L-carnitina, parece activar la vía PI3K/Akt en neuronas corticales primarias, protegiendo a estas neuronas del estrés oxidativo y neurotoxicidad provocado por 4-hidroxi-2-nonenal.136 Otro estudio realizado en la línea celular de mioblastos L6, muestra que la acetil-L-carnitina mejora el transporte de glucosa en células estimuladas con TNF-alfa (factor de necrosis tumoral alfa) a través de una modulación de Akt.137 Asimismo, otro derivado de cadena corta de LC, la propionil-Lcarnitina, provoca en células endoteliales la activación de PI3K y Akt, induciendo la activación de la óxido nítrico sintasa endotelial (eNOS) y, por tanto, favoreciendo la formación de óxido nítrico.138 También existen estudios que muestran que la LC es capaz de modular la activación de las MAP quinasas p38 MAPK y ERK1/2. En estudios realizados en la línea celular GL261 (células de glioblastoma), la LC es capaz de reducir la proliferación de estas células a través de la vía de p38 MAPK.139 En otros estudios realizados sobre fibroblastos cardiacos, la LC fue capaz de modular la fosforilación de ERK previamente inducida por Ang II.140 Igualmente, otros autores muestran que la fosforilación de ERK1/2, mediada por la acetil-L-carnitina y el ácido alfa-ácido lipoico, juega un papel fundamental en su acción neuroprotectora en neuronas que presentan neurotoxicidad y estrés oxidativo provocado por 4-hidroxi-2-nonenal.136 Pese a todo lo anterior, a día de hoy no son muchos los estudios existentes que describan los mecanismos y vías de señalización por los cuales la LC ejerce sus efectos beneficiosos, por ello esta tesis doctoral pretende discernir dichos procesos en un contexto de estrés oxidativo y fibrosis, en el cual la enzima NADPH oxidasa tiene vital importancia. HIPÓTESIS Y OBJETIVOS 39 Hipótesis y Objetivos 1. HIPÓTESIS Nuestro grupo de investigación ha demostrado previamente los efectos antioxidantes y antifibróticos de la L-carnitina (LC) en modelos animales con hipertensión arterial (HTA) y fibrosis (cardiaca y renal), estando la enzima NADPH oxidasa involucrada en estos efectos beneficiosos de la LC.116,121,123 Resulta de gran interés determinar cómo modula la LC las diferentes isoformas de la NADPH oxidasa, y qué vías de señalización celular están implicadas al respecto. Nuestra hipótesis de trabajo es que la LC modula la actividad/expresión de la NADPH oxidasa en un contexto de HTA y fibrosis (con un aumento de estrés oxidativo subyacente), actuando de forma específica sobre una o varias isoformas y regulando las vías de señalización intracelular responsables de las acciones patológicas de la enzima. 2. OBJETIVOS 2.1. OBJETIVO GENERAL El objetivo general de esta tesis doctoral es demostrar el papel de la NADPH oxidasa en el efecto modulador de la L-carnitina (LC) en un modelo in vitro de nefropatía hipertensiva (creando un fenotipo hipertensivo y otro fibrótico mediante la estimulación de células NRK-52E con angiotensina II (Ang II) y factor de crecimiento transformante beta (TGFβ), respectivamente), evaluando las vías de señalización implicadas. 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Estudiar los efectos de la Ang II y de la LC sobre la actividad/expresión de la enzima NADPH oxidasa, los niveles de nitrosilación de proteínas (marcador de estrés oxidativo) y la producción de peróxido de hidrógeno. 2) Identificar las isoformas de la NADPH oxidasa involucradas en su acción oxidante sobre las células NRK-52E, mediante el uso de inhibidores moléculas de interferencia (siRNA) específicos. 40 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 3) Estudiar los mecanismos moleculares y vías de señalización intracelular implicados en los efectos de la Ang II y de la LC: vía de PI3K/Akt, vía de la PKC, vía de p38 MAPK, vía de ERK1/2 y sistema NF-kB. 4) Evaluar los efectos de la LC sobre la actividad y expresión de la NADPH oxidasa inducidas por TGFβ. 5) Estudiar los efectos de la LC sobre la activación de la vía de las proteínas Smad y sobre la expresión de CTGF dependientes de TGFβ. 6) Analizar los efectos de la LC sobre el sistema de degradación de colágeno, realizando para ello experimentos tanto in vivo e in vitro . MATERIALES Y MÉTODOS 48 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Para la obtención de ARN, se añade directamente TRIzol® a las células en cultivo, y se procede a aislar el ARN según el protocolo establecido por la casa comercial (apartado 3.5.1). 2. MODELO EXPERIMENTAL IN VIVO 2.1. ANIMALES Y TRATAMIENTOS Los estudios in vivo se han realizado en ratas macho pertenecientes a la cepa Wistar, con una edad comprendida entre las 8-10 semanas y procedentes del Centro de Producción y Experimentación Animal de la Universidad de Sevilla. Todos los procedimientos cumplen con la normativa en vigor a nivel internacional, nacional y autonómico relativa a la protección de los animales utilizados para fines científicos 1 . Las ratas fueron divididas aleatoriamente en 4 grupos experimentales: 1) ratas control (grupo C); 2) ratas tratadas con 400 mg de L-carnitina/kg de peso/día (grupo LC); 3) ratas tratadas con 25 mg de L-NAME 2 /kg de peso/día (grupo LN); y 4) ratas tratadas simultáneamente con L-NAME y LC (grupo LNLC). Los tratamientos con LC se mantuvieron 12 semanas, mientras que el tratamiento con L-NAME comenzó dos semanas más tarde que el de LC, manteniéndose por tanto durante 10 semanas. Durante el periodo experimental, los animales se mantuvieron en condiciones estándar (23 ± 1ºC, ciclos de 12 horas luz/12 horas oscuridad), y se alimentaron ad libitum con pienso comercial (Panlab, S.L.) y con libre acceso al agua de bebida (en la cual iba disuelto el tratamiento, en su caso). 1 Directiva 2010/63/UE del Parlamento Europeo y del Consejo de 22 de septiembre de 2010; en la Ley 32/2007, de 7 de noviembre, para el cuidado de los animales en su explotación, transporte, experimentación y sacrificio; Ley 6/2013, de 11 de junio, de modificación de la Ley 32/2007; Real Decreto 53/2013, de 1 de febrero, por el que se establecen las normas básicas aplicables para la protección de los animales utilizados en experimentación y otros fines científicos, incluida la docencia; y normativa autonómica de desarrollo del RD 53/2013. 2 Compuesto que produce vasoconstricción gracias a la inhibición de la enzima óxido nítrico sintasa (NOS), con la consecuente disminución en la síntesis de óxido nítrico (NO), siendo éste una de las principales sustancias vasodilatadoras del organismo. 49 Materiales y Métodos 2.2. PROCESADO DE LAS MUESTRAS Tras las 12 semanas de tratamiento, las ratas se someten a un ayuno de 12 horas, tras lo cual son anestesiadas con pentorbital (50 mg/kg i.p.). Una vez sacrificados los animales, se extraen los riñones, eliminándose la cápsula externa con ayuda de dos pinzas. Los riñones se lavan en suero fisiológico frío (NaCl 0,9% p/v, 4ºC), se secan en papel de filtro y se disecciona la corteza renal, separándola de la médula renal. La corteza se congela por inmersión en nitrógeno líquido, y se conserva a -80ºC hasta la realización de los estudios de expresión génica. 3. TÉCNICAS MOLECULARES 3.1. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS La concentración de proteínas en los homogeneizados de cultivo celular de NRK52E, obtenidos según se describe en el apartado 1.2.3.2, se ha determinado siguiendo el método descrito por Bradford,141 utilizando el reactivo Bio-Rad Protein Assay con un patrón de γ-globulina. El método se basa en la reacción de las proteínas con este reactivo, resultando un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional a la concentración de proteínas de la muestra. La técnica consiste en incubar, en una microplaca ELISA, 5 µL de los homogeneizados (previamente diluidos en agua bidestilada), o del patrón de γ-globulina (con diferentes diluciones establecidas para preparar una curva patrón a partir de una solución madre de 1,47 µg/µL), con 250 µL del reactivo Bio-Rad (el cual se diluye con agua bidestilada y se filtra a través de un papel Whatman nº1 justo antes de su uso), durante 10 minutos a temperatura ambiente, agitándose al inicio y al final de este periodo con ayuda de un agitador de placas. Las muestras se ensayan por triplicado, y los estándares por duplicado. Transcurrido este tiempo, se leen las absorbancias a 595 nm en un lector de placas (ASYS UVM340). Finalmente, a partir de los valores de absorbancia obtenidos de cada muestra, se calculan las correspondientes concentraciones mediante interpolación en la curva patrón. 50 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 3.2. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Se utiliza una técnica basada en un proceso de quimioluminiscencia, en el cual el anión superóxido (producto de la reacción catalizada por la enzima NADPH oxidasa) oxida a moléculas de lucigenina, en una reacción que libera fotones de luz que son registrados en un luminómetro de tubo ( BERTHOLD Junior LB 9509 ). En un tubo de poliestireno para luminómetro, se añaden, por duplicado, 10 µL de muestra (convenientemente diluida con DPBS 1X para que estos 10 µL sean equivalentes a 5 µg de proteínas totales); en el otro extremo del tubo, sin mezclarlo con la muestra, se añaden 10 µL de NADPH 3 mM (disuelto en DPBS 1X). Por último, se añaden 280 µL de lucigenina 5,3 µM (disuelta en DPBS 1X y protegida de la luz). La adición de este último reactivo permite la mezcla de todos los componentes y, por tanto, el inicio de la reacción (la cual se lleva a cabo a 37ºC). Se toman medidas de URL (unidades relativas de luz) en el luminómetro a los 4 minutos de iniciada la reacción. 3.2.1. CARACTERIZACIÓN DE LAS FUENTES CELULARES DE ANIÓN SUPERÓXIDO La participación de las diferentes fuentes enzimáticas productoras de anión superóxido en los homogeneizados proteicos de células NRK-52E, se ha analizado, siguiendo el protocolo que acabamos de describir, en presencia y ausencia de inhibidores específicos de dichas fuentes, a saber: difenil-eno-iodonio (DPI), rotenona y oxipurinol. El DPI es un inhibidor de la producción de especies reactivas de oxígeno por el conjunto de las flavoproteínas celulares. La rotenona actúa inhibiendo la cadena mitocondrial de electrones, mientras que el oxipurinol inhibe a la enzima xantina oxidasa. Todos los inhibidores se preincuban (a una concentración de 0,1 mM) con la muestra durante 5 minutos a 37ºC. Por otro lado, también se analiza el efecto de la enzima superóxido dismutasa (SOD) sobre la producción de anión superóxido en estos homogeneizados proteicos (la determinación se realiza en las mismas condiciones anteriores, preincubando en este caso las muestras con 100 U/mL de SOD). La SOD es una enzima que convierte el anión superóxido en peróxido de hidrógeno (apartado 1.1.1 de la sección Introducción), que no tiene ninguna reactividad con la lucigenina; esto permite confirmar la especificidad del método, descartándose que las lecturas del luminómetro correspondan a otra especie reactiva de oxígeno diferente al anión superóxido. 51 Materiales y Métodos 3.2.2. CARACTERIZACIÓN DE LAS VÍAS DE SEÑALIZACIÓN INTRACELULARES INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO El estudio de las vías de señalización intracelulares que participan en la producción de O2.-, se realiza siguiendo el mismo protocolo descrito, en presencia y ausencia en este caso de inhibidores específicos de diferentes vías de señalización. En concreto, se ha utilizado wortmanina (inhibidor de la vía PI3K/Akt), SB203580 (inhibidor de p38 MAPK), PD98059 (inhibidor de MEK-1 (vía ERK1/2)) y bisindolilmaleimida I (BIS I, inhibidor de PKC), a una concentración de 1 µM en todos los casos. Las células se preincuban durante 1 minuto a 37ºC con estos inhibidores, adicionándose a continuación Ang II y/o LC según lo descrito en el apartado 1.2.2. 3.2.3. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Para llevar a cabo este experimento, se han utilizado inhibidores específicos de las isoformas NOX2 (gp91 ds-tat), y NOX1 (2-acetilfenotiazina), ambos a una concentración de 50 µM. Las células se preincuban durante 30 minutos a 37ºC con estos inhibidores, adicionándose a continuación Ang II y/o LC según lo descrito en el apartado 1.2.2. 3.3. ENSAYO DE CITOTOXICIDAD En este ensayo, el rojo neutro es captado por las células, específicamente por los lisosomas y endosomas. A medida que las células pierden viabilidad por acción de la molécula en estudio (en nuestro caso la LC), el colorante se libera al medio ya que solo las células viables son capaces de retener el colorante en su interior, midiéndose la cantidad de rojo neutro que permanece dentro de las células tras la exposición a LC. 3.3.1. REACTIVOS a) Disolución madre de rojo neutro. 0,1 gramos de rojo neutro en 10 mL de DPBS 1X. b) Disolución de trabajo de rojo neutro. 100 µL de disolución madre de rojo neutro por cada 10 mL de medio de cultivo. c) Ácido acético:etanol:agua (1:49:50). 52 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato d) Formol-Ca2+. 50 mM de CaCl2 en 500 mL de agua destilada y autoclavada. Una vez disuelto, añadir 14 mL de formaldehído (35%). 3.3.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL En primer lugar, se centrifuga la disolución de trabajo de rojo neutro durante 10 minutos a 400 g. Las células se siembran en placas de 96 pocillos (35.000 células/cm2, con objeto de que a las 24 horas estén confluentes), estimulándose con LC (0-5-100 mM) durante 24 horas. Transcurrido este tiempo, se retira el medio de cultivo y se añaden en cada pocillo 100 µL de disolución de trabajo de rojo neutro, incubándose durante 3 horas a 37ºC (al microscopio, se deben observar las células teñidas y la ausencia de cristales en el pocillo). Pasadas las 3 horas, se retira la solución de trabajo de rojo neutro volcando la placa, y a continuación se fijan las células con 200 µL de formol-Ca2+ durante 2 minutos. Se retira entonces la solución de formol-Ca2+, y se añaden 200 µL de la solución de ácido acético/etanol/agua para extraer el colorante de las células. Tras incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, en un agitador orbital de placas, se lee finalmente la absorbancia a 540 nm. Los resultados se expresan en % con respecto a la absorbancia medida en las células controles, de forma que a mayor absorbancia, mayor viabilidad celular. 3.4. DETERMINACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO 3.4.1. REACTIVOS El kit utilizado, Amplex ® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit, utiliza el reactivo Amplex ® Red (10-acetil-3,7-dihidroxyfenoxazina) para detectar peróxido de hidrógeno. En presencia de peroxidasa, el Amplex ® Red reacciona con H2O2 con una estequiometría 1:1, originando un producto rojo fluorescente, la resorufina. Ésta tiene una excitación y emisión máximas a 571 nm y 585 nm, respectivamente, y posee un coeficiente de extinción alto (58000 ± 5000 cm-1 M-1), por lo que se puede realizar el ensayo mediante fluorescencia o espectrofotometría. 53 Materiales y Métodos Tabla 2: Reactivos necesarios para la determinación de peróxido de hidrógeno 3.4.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL En primer lugar, se prepara una curva estándar diluyendo la solución de trabajo de H2O2 (20 mM) en tampón de reacción 1X hasta obtener concentraciones desde 0 a 10 µM de H2O2. A continuación, se diluyen las muestras (dilución 1/2), (obtenidas según se describe en el apartado 1.2.3.1) en tampón de reacción 1X, y se cargan 50 µL de las muestras o estándares (por triplicado en ambos casos) en pocillos de una placa ELISA. Por otro lado, se mezclan 50 µL de Amplex ® Red 10 mM (diluido extemporáneamente en DMSO), 100 µL de HRP 10 U/mL y 4,85 mL de tampón de reacción 1X, para obtener la solución de trabajo de 100 µM de Amplex ® Red y 0,2 U/mL de HRP. Se añade 50 µL de la solución de trabajo a las muestras o estándares, y se incuba 30 minutos a temperatura ambiente y protegido de la luz. A continuación, se procede a medir la absorbancia a 560 nm, expresándose los resultados obtenidos en µM de H2O2. 3.5. CUANTIFICACIÓN DEL ARNm 3.5.1. EXTRACCIÓN DE ARN El método clásico de extracción de ARN se basa en la diferente solubilidad de las biomoléculas (ARN, ADN, proteínas y lípidos) en disolventes orgánicos (tales como fenol y cloroformo). Durante todo el proceso, se debe procurar trabajar con material estéril y tomar las debidas precauciones para evitar la degradación del ARN por parte de las enzimas ribonucleasas (ARNasas). Se añade 1 mL de TRIzol® en los frascos o placas de cultivo, pasando inmediatamente a recuperar este volumen en tubos de 2 mL de capacidad, los cuales se dejan reposar 5 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se añaden 200 µL REACTIVO CONCENTRACIÓN Amplex® Red 10 mM Tampón de reacción 1X Horseradish peroxidase (HRP) 10 U/mL Peróxido de hidrógeno 20 mM DMSO 54 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato de cloroformo, se agita vigorosamente y se deja reposar 5 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, se realiza una centrifugación a 12000 g durante 15 minutos a 4ºC, para la separación de las distintas fases. Se recupera cuidadosamente la fase acuosa superior, que contiene el ARN, y se deposita en el interior de microtubos de 1,5 mL de capacidad. A continuación, se añaden 500 µL de isopropanol, mezclando por inversión, y se incuba durante 10 minutos a temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo, se centrifuga a 12000 g durante 10 minutos a 4ºC. Se elimina el sobrenadante, y se lava el precipitado de ARN con 1 mL de etanol al 75%, agitando en un agitador de tubos tipo vórtex durante 20 segundos. El precipitado de ARN se recupera centrifugando a 8000 g durante 5 minutos a 4ºC, y eliminando de nuevo el sobrenadante. Se deja secar el ARN bajo la luz de un flexo que aporte el calor necesario para evaporar completamente los restos de etanol. Una vez seco el precipitado de ARN, se añaden 35 µL de agua estéril y libre de ARNasas (H2O-DEPC), y se deja 10 minutos a temperatura ambiente, resuspendiéndose finalmente con ayuda de una micropipeta automática. 3.5.2. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN E INTEGRIDAD DEL ARN La concentración del ARN se ha medido por espectrofotometría ultravioleta con el espectrofotómetro NANODROP 2000 UV-Vis (Thermo Scientific), empleando 1 µL de volumen de muestra. Los ácidos nucleicos absorben a 260 nm, por lo que midiendo a esta longitud de onda obtenemos la concentración del ARN (según la aproximación: 1 unidad de absorbancia = 40 µg/mL de ARN). Teniendo en cuenta que las proteínas absorben a 280 nm, también se calcula la relación A260/A280 para conocer el grado de pureza, debiéndose obtener un valor cercano a 2. Por otro lado, hay que comprobar la integridad del ARN para asegurar que no ha sufrido degradación durante su extracción. Para ello, se realiza una electroforesis en gel de agarosa al 2% previo marcaje con bromuro de etidio, el cual permite la visualización del ARN bajo una fuente de luz ultravioleta. Si el ARN no está degradado, se deben observar dos bandas que corresponden con los ARN ribosómicos 28s y 18s. 55 Materiales y Métodos 3.5.3. RETROTRANSCRIPCIÓN La retrotranscripción es el mecanismo por el cual se obtiene, tomando ARN como molde, una molécula de ADN denominada ADN complementario (ADNc). Para llevar a cabo este procedimiento, se ha utilizado un kit suministrado por Applied Biosystems (HighCapacity cDNA Archive kit) . De cada muestra se toman volúmenes equivalentes a 2 µg de ARN en tubos libres de ARNasas, añadiendo H2O-DEPC hasta completar un volumen de 50 µL en cada tubo. A continuación, se desnaturaliza el ARN calentando durante 10 minutos a 65ºC, utilizando un termociclador ( Biometra ® T Gradient ). Se aprovecha este tiempo para preparar la mezcla de reacción que se compone de: Tampón RT 10X, Random primers 10X, mezcla de desoxinucleótidos 25X, MultiscribeTM RT (50 U/µL) y H2ODEPC. Transcurrido el tiempo, se colocan los tubos inmediatamente a 4ºC para evitar la renaturalización del ARN. Finalmente, a cada tubo de ARN se añaden 50 µL de la mezcla reactiva, y se llevan al termociclador, el cual tiene programadas unas condiciones de retrotranscripción previamente establecidas (en nuestro caso, 10 minutos a 25ºC seguidos de 2 horas a 37ºC). 3.5.4. PCR A TIEMPO REAL La principal característica de la PCR a tiempo real es que el análisis de los productos se realiza durante el proceso de amplificación, mediante la cuantificación de fluorescencia. Para ello, se utilizan termocicladores que son capaces de amplificar y detectar fluorescencia simultáneamente. En este trabajo se ha utilizado el termociclador a tiempo real Light Cycler® 480 Detection System (Roche Diagnostics), ubicado en el Centro de Investigación, Tecnología e Innovación de la Universidad de Sevilla ( CITIUS ), que contiene un bloque de 96 pocillos con un fluorímetro acoplado. La señal de fluorescencia, que es proporcional a la cantidad de producto de PCR amplificado, puede generarse con colorantes fluorescentes como el SYBR ® Green I . Tabla 3: Componentes de la mezcla de reacción COMPONENTES DE LA REACCIÓN CONCENTRACIÓN/CANTIDAD VOLUMEN (µL) FastStart SYBR® Green Master 2X 10 Cebadores específicos (sentido y antisentido) 300 nM 0,6 (por cada cebador) Agua bidestilada autoclavada 7,8 56 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato En la siguiente tabla se muestran los cebadores utilizados para la amplificación de secuencias específicas de ADNc, en función del gen analizado. Tabla 4: Cebadores utilizados en los estudios de PCR a tiempo real Una vez preparada la mezcla de reacción según la tabla 3, se añaden 19 µL de ésta a cada pocillo de la placa de 96 pocillos, y tras ello 1 µL de ADNc (por duplicado). Una vez cargada la placa, se introduce en el termociclador, que se programa tal y como se si indica en la tabla 5. Tabla 5: Condiciones experimentales del termociclador para la realización de una PCR a tiempo real Para el análisis cuantitativo de los productos de la PCR, se ha empleado un método de cuantificación relativo, expresando cada gen de estudio en función de un gen constitutivo, que es un gen expresado en un nivel idéntico en todas las muestras analizadas. El gen empleado a tal efecto ha sido el correspondiente a la enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GADPH). La cuantificación se realiza mediante el CEBADOR SECUENCIA SENTIDO (5´-3´) SECUENCIA ANTISENTIDO (5´-3´) NOX1 TTCACCAATTCCCAGGATTGAAGTGGATGGTC GACCTGTCACGATGTCAGTGGCCTTGTCAA NOX2 CCCTTTGGTACAGCCAGTGAAGAT CAATCCCACGTCCCACTAACATCA NOX4 TTGCTTTTGTATCTTC CTTACCTTCGTCACAG CTGF TAGCAAGAGCTGGGTGTGTG TTCACTTGCCACAAGCTGTC MMP-9 TCGAAGGCGACCTCAAGTG TTCGGTGTAGCTTTGGATCCA TIMP-1 CGCAGCGAGGAGGTTTCTCAT GGCAGTGATGTGCAAATTTCC GADPH GCCAAAAGGGTCATCATCTCCGC GGATGACCTTGCCCACAGCCTTG PROCESO CONDICIONES CICLOS Activación SYBR® Green I 50 º C, 2 minutos Desnaturalización inicial 95 º C, 10 minutos Desnaturalización 95 º C, 15 segundos 40 Hibridación/elongación 60 º C, 1 minuto 57 Materiales y Métodos método 2-ΔΔCt. “ Ct ” se define como el ciclo en el cual la curva de amplificación se distingue del ruido de fondo y es dependiente de la cantidad inicial de ADN. 3.6. WESTERN BLOTTING La técnica de Western blotting permite la separación de proteínas según su peso molecular mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE), y su identificación gracias al empleo de anticuerpos específicos. 3.6.1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS Se mezclan volúmenes iguales de los homogeneizados proteicos de las células NRK-52E (equivalentes a la cantidad de proteína previamente optimizada para la determinación de la proteína en estudio) y de tampón de muestra 2X. La mezcla se hierve a 95ºC durante 5 minutos, para desnaturalizar las proteínas. Transcurrido este tiempo, se colocan inmediatamente en hielo hasta la realización de la electroforesis. 3.6.2. ELECTROFORESIS La electroforesis de proteínas se realiza en geles de poliacrilamida, cuyo grado de polimerización permite obtener diferentes tamaños de poro por el cual migran las proteínas, lo que permite la caracterización de la proteína de interés. El gel de electroforesis se compone de dos tipos de geles: un gel concentrador (que concentra todas las proteínas en un determinado lugar) y un gel separador (cuya función es la de separar las proteínas según su peso molecular). En nuestro caso utilizamos geles preparados en gradiente de concentración (4-20%), Mini-protean TGXTM precast gels (Bio-Rad Laboratories). Una vez colocado el gel en la cubeta de electroforesis, se separan los peines y se vierte tampón de electroforesis 1X (previamente diluido a partir de tampón de electroforesis 10X, Tabla 6) hasta que los pocillos queden sumergidos. Las muestras se cargan en los pocillos, y se incluye también en uno de ellos un marcador de peso molecular (el cual permitirá identificar los distintos pesos moleculares de las correspondientes proteínas al final del proceso). Finalmente, se llena la cubeta con 64 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato A (4ºC). Posteriormente se incuba 15 minutos y se centrifuga durante 10 minutos a 3000 g, siendo el sobrenadante el extracto citoplasmático. El pellet obtenido se lava añadiendo tampón B (4ºC) y se centrifuga de nuevo durante 10 minutos a 3000 g. El pellet resultante se resuspende en 100 µL de tampón C (4ºC), y se incuba 30 minutos, centrifugándose posteriormente 30 minutos a 15000 g. El sobrenadante obtenido entonces corresponde al extracto nuclear. Para finalizar, se detecta mediante Western blotting la subunidad p65 del sistema NF-kB en los extractos citosólicos y nucleares bajo las mismas condiciones. La composición de los tampones A, B y C se muestran en las tablas 13, 14 y 15 respectivamente. Tabla 13: Composición tampón A Tabla 14: Composición tampón B REACTIVOS CONCENTRACIÓN HEPES 5 mM MgCl2 1,5 mM KCl 10 mM Nonidet P-40 0,5% DTT 0,5 mM NaF 50 mM Inhibidor de proteasas 10% REACTIVOS CONCENTRACIÓN HEPES 5 mM MgCl2 1,5 mM KCl 10 mM DTT 0,5 mM NaF 50 mM Inhibidor de proteasas 10% 65 Materiales y Métodos Tabla 15: Composición tampón C 3.8.2. ESTUDIO DEL GRADO DE FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA α-IkB. Para empezar, se obtienen las fracciones citosólicas y nucleares utilizando el procedimiento y tampones descritos en el apartado 3.8.1. A continuación, se detecta mediante Western blotting el grado de fosforilación de la proteína α-IkB. 3.9. TRANSFECCIÓN CON LÍPIDOS CATIÓNICOS PARA EL SILENCIAMIENTO DE GENES La utilización de ARN de interferencia (siRNA) nos proporciona una potente herramienta para el estudio de la función celular de muchos genes, que podemos “silenciar” a voluntad. Para ello, se utilizan lípidos catiónicos que permiten introducir el siRNA al interior celular. Esta técnica se basa en el proceso por el cual el ARN de doble cadena puede inducir un silenciamiento específico en eucariotas. El proceso de silenciamiento se inicia cuando un ARN de doble cadena largo es procesado a pequeños fragmentos de ARN (21-26 nucleótidos) mediante la enzima endorribonucleasa Dicer . Estas moléculas pequeñas de ARN (siRNA) suprimen la expresión del gen diana mediante el corte en dos mitades del ARN mensajero a través del complejo RISC (complejo de silenciamiento inducido por ARN). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que conlleva la supresión de la expresión del gen. REACTIVOS CONCENTRACIÓN HEPES 20 mM MgCl2 1,5 mM Glicerol 25% NaCl 0,5 M DTT 0,5 mM EDTA 0,5 mM NaF 50 mM Inhibidor de proteasas 10% 66 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 3.9.1. REACTIVOS REACTIVOS siRNA NOX2, siNOX4 Scramble Medio de transfección Opti-MEM® Lipofectamina® 2000 DMEM 1X Tabla 16: Reactivos necesarios para la transfección con lípidos catiónicos para el silenciamiento de genes 3.9.2. PROTOCOLO EXPERIMENTAL Previamente, se siembran 15.000 células/cm2 en placas de 6 pocillos para obtener, pasadas 24 horas, una confluencia del 50-60%. Para iniciar el experimento, en primer lugar se preparan dos tipos de microtubos eppendorf libres de ARNasas: los que llevan el siRNA del gen en estudio, y los que llevan la lipofectamina. En los microtubos con siRNA, en un volumen final de 200 µL, se preparan las concentraciones de siRNA (10 nM para siNOX2 y 17,5 nM para siNOX4) en medio Opti-MEM® . Por otra parte, en los microtubos eppendorf con lipofectamina, se añaden en todos los casos 5 µL de lipofectamina en medio Opti-MEM® hasta llegar a un volumen final de 200 µL. Cada microtubo se agita levemente con mucho cuidado y se deja incubar 5 minutos a temperatura ambiente. Pasado este tiempo, se une el contenido de ambos microtubos (siRNA y lipofectamina), agregando el siRNA a la lipofectamina con mucho cuidado y pipeteando arriba y abajo para mezclar. Tras esto, se incuba durante 20 minutos a temperatura ambiente. Por otro lado, se lavan las placas con las células 3 veces con DPBS 1X y se agregan a cada pocillo 600 µL de DMEM 1X sin suero ni antibiótico. A continuación, se agregan los 400 µL de mezcla siRNA-lipofectamina con mucho cuidado y en pequeñas gotas. A continuación se incuban a 37ºC, 5% CO2 durante 24 horas para permitir que se realice la transfección. 67 Materiales y Métodos Pasadas las 24 horas, se lavan las células con DPBS 1X 3 veces, y se agrega medio de cultivo completo con antibiótico y suero. Para ensayos de expresión génica, las células se incuban durante 48 horas; para los análisis con proteínas (expresión proteica y actividad), durante 72 horas. En paralelo, y en las mismas condiciones que el siRNA, se utiliza como control un scramble , que es una secuencia desordenada que no provoca degradación ninguna del ARNm. 4. ANÁLISIS ESTADÍSTICO Los resultados están expresados como media ± error estándar. La comparación entre las diferentes condiciones experimentales se ha realizado utilizando el test de ANOVA, y en aquellos casos que han mostrado significación estadística, se ha aplicado el test de Tukey, considerándose diferencias estadísticamente significativas para valores de p<0,05. Se ha utilizado el software estadístico IBM SPSS Statistics 20 . 68 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato RESULTADOS 71 Resultados 0 50 100 150 200 250 C 0,1 1 10 100 1. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL ESTRÉS OXIDATIVO INDUCIDO POR ANGIOTENSINA II: ESTUDIO DE LA NADPH OXIDASA 1.1. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II SOBRE LA PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO 1.1.1. ENSAYO CONCENTRACIÓN-RESPUESTA PARA ANGIOTENSINA II La incubación de las células NRK-52E con Ang II durante 24 horas, a concentraciones desde 0,1 a 100 nM, incrementó significativamente la producción de anión superóxido, duplicándose aproximadamente los valores basales al utilizar la concentración más alta de Ang II (Figura 18). En vista de estos resultados, se eligió la concentración 100 nM de Ang II para realizar los experimentos posteriores. Figura 18: Inducción de la producción de anión superóxido (O2.-) por angiotensina II (Ang II): ensayo concentración-respuesta. Tiempo de incubación = 24 horas. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ±error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C. *** *** *** Producción de O2.- (%) Ang II (nM) *** *** *** 72 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 1.1.2. ENSAYO TIEMPO-RESPUESTA PARA ANGIOTENSINA II La máxima producción de anión superóxido, como consecuencia de la estimulación con Ang II 100 nM, tiene lugar a partir de 1 hora, manteniéndose constante hasta las 24 horas de estimulación (Figura 19). Por consiguiente, el tiempo de estimulación de 24 horas fue elegido para la realización de los experimentos posteriores, excepto en los casos indicados. Figura 19: Inducción de la producción de anión superóxido (O2.-) por angiotensina II (Ang II): ensayo tiempo-respuesta. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C. 1.2. CARACTERIZACIÓN DE LA FUENTE DE PRODUCCIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO EN RESPUESTA A LA ANGIOTENSINA II Para caracterizar la fuente enzimática de anión superóxido (O2.-) en respuesta a la estimulación con Ang II, se analizó la generación de O2.- en células NRK-52E en presencia de diferentes inhibidores, tal y como se describe en el apartado 3.2.1. de la sección Materiales y Métodos . El tratamiento con DPI inhibió completamente el aumento en la Producción de O2.- (%) Producción de O2.- (%) *** *** *** *** Ang II (100 nM) 73 Resultados producción de O2.- inducido por Ang II, no así el oxipurinol y la rotenona, que fueron inefectivos (Figura 20). Por tanto, podemos identificar a la enzima NADPH oxidasa como fuente del anión superóxido formado en nuestras condiciones experimentales. Por otro lado, la generación de O2.- inducida por Ang II en células NRK-52E fue completamente inhibida en presencia de SOD (Figura 20), lo que nos indica que el O2.- es la especie reactiva de oxígeno detectada por la lucigenina. Figura 20: Caracterización de la fuente de anión superóxido (O2.-) en células NRK-52E tratadas con angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas con 100 nM de Ang II durante 24 horas, sola (Ang II) o en combinación con 0,1 mM de oxipurinol (OXI), rotenona (ROT), DPI (DPI), o 100 U/mL de enzima superóxido dismutasa (SOD). C = células controles sin estimular. El histograma representa la media±error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con Ang II. 0 50 100 150 200 250 C Ang II OXI ROT DPI SOD *** Producción de O2.- (%) Ang II (100 nM, 24h) *** ** ### ### 80 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 CLC Ang II ALC Fi Figura 26: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la expresión génica de las isoformas NOX1 (A), NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células tratadas con angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 comparado con Ang II. 1.8. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN PROTEICA DE LAS ISOFORMAS NOX1, NOX2 Y NOX4 DE LA NADPH OXIDASA EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II La LC atenuó el incremento en la expresión proteica de NOX1 y NOX2 provocado por la estimulación con Ang II durante 24 horas (Figuras 27A y 27B). Por otro lado, la LC también normalizó los niveles de expresión proteica de NOX4, que se encontraban disminuidos tras la incubación de las células con Ang II (Figuras 27C). En los 3 casos, la adición de LC en células controles no provocó cambio alguno en la expresión proteica (Figuras 27A, 27B y 27C). *** C Expresión génica relativa NOX4 ### ## 81 Resultados 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CLC Ang II ALC 0 20 40 60 80 100 120 140 160 CLC Ang II ALC NOX1 β-actina A NOX2 β-actina B ### ** # Expresión proteica NOX1 (%) *** ### ### Expresión proteica NOX2 (%) 82 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 20 40 60 80 100 120 140 CLC Ang II ALC Figura 27: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la expresión proteica de las isoformas NOX1 (A), NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células tratadas con angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 comparado con Ang II. 1.9. CARACTERIZACIÓN DE LAS ISOFORMAS DE LA NADPH OXIDASA INVOLUCRADAS EN LA FORMACIÓN DE ANIÓN SUPERÓXIDO Y H2O2 Para analizar las isoformas de la NADPH oxidasa implicadas en el estrés oxidativo provocado por Ang II, así como en el efecto inhibitorio de la LC, hemos empleado inhibidores específicos de las diferentes isoformas de la NADPH oxidasa; asimismo, hemos realizado estudios de silenciamiento de genes, tal y como se detalla a continuación. C NOX4 β-actina Expresión proteica NOX4 (%) *** ## ### 83 Resultados El uso del inhibidor específico de NOX2, gp91 ds-tat, produjo una disminución significativa en la producción celular de anión superóxido inducida por Ang II, al comparar estos valores con los obtenidos en células no estimuladas y con aquellas estimuladas con Ang II en ausencia del inhibidor. La producción de anión superóxido en células preincubadas con LC y tratadas con Ang II no se vio modificada por la presencia del inhibidor de NOX2 (Figura 28). Figura 28: Efecto del inhibidor de NOX2 (gp91 ds-tat) sobre la actividad NADPH oxidasa en presencia de L-carnitina (LC) y angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; ##p<0,01, ###p<0,001 comparado con Ang II. El silenciamiento de la isoforma NOX2 produjo, como era de esperar, una reducción de aproximadamente el 90% en la expresión proteica de esta isoforma (Figura 29A). Sorprendentemente, la expresión proteica de NOX1 y NOX4 fue también modificada por esta manipulación de NOX2. Así, la expresión proteica de NOX1 aumentó en todos los grupos de células a excepción de las células controles (Figura 29B), mientras que la 0 20 40 60 80 100 120 140 160 C Ang II ALC C Ang II ALC Actividad NADPH oxidasa (%) ## ** ### ## ### *** gp91 ds-tat (50 µM, 30 min) 84 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 50 100 150 200 250 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC expresión de NOX4 solo se vio aumentada en el grupo de células estimuladas por Ang II (comparando siempre con respecto al grupo celular equivalente sin silenciamiento) (Figura 29 C). A *** *** ### 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC &&& +++ # # # *** && # Expresión proteica NOX1 (%) B siNOX2 (10 nM) Scramble (10 nM) Expresión proteica NOX2 (%) ### ** ## *** *** ### ### ### NOX2 β-actina NOX1 β-actina * ** * ++ siNOX2 (10 nM) Scramble (10 nM) 85 Resultados 0 20 40 60 80 100 120 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC Figura 29: Efecto del silenciamiento de NOX2 sobre la expresión proteica de las isoformas NOX2 (A), NOX1 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. Todas las condiciones se trataron con un scramble (Src) o con el siRNA de NOX2, según se detalla en el apartado 3.9 de la sección Materiales y Métodos . El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C+Src; #p<0,05, ##p<0,01, ###p<0,001 comparado con Ang II+Src; &&p<0,01, &&&p<0,001 comparado con LC+Src; ++p<0,01, +++p<0,001 comparado con ALC+Src. β-actina siNOX2 (10 nM) Scramble (10 nM) C Expresión proteica NOX4 (%) ### ### ### NOX4 *** ### ### ### 86 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato A continuación, determinamos el efecto del silenciamiento de NOX2 sobre la producción de anión superóxido. Los resultados mostraron que dicho silenciamiento produjo un aumento significativo en la producción de anión superóxido en todas las condiciones experimentales, a excepción de las células no tratadas (siempre comparando con los correspondientes grupos sin silenciamiento de la proteína) (Figura 30). C Figura 30: Efecto del silenciamiento de NOX2 sobre la actividad NADPH oxidasa. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. Todas las condiciones se trataron con un scramble (Src) o con el siRNA de NOX2. El histograma representa la media±error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C+Src; #p<0,05, ###p<0,001 comparado con Ang II+Src; &&&p<0,001 comparado con LC+Src; +++p<0,001 comparado con ALC+Src. 0 50 100 150 200 250 300 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC ### ### siNOX2 (10 nM) Scramble (10 nM) Actividad NADPH oxidasa (%) *** *** # &&& ### ### *** *** +++ ### 87 Resultados Con respecto a la producción de H2O2, sólo las células tratadas con LC mostraron un aumento de este parámetro al comparar con su grupo sin silenciamiento (Figura 31). Figura 31: Efecto del silenciamiento de NOX2 sobre la producción de H2O2. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. Todas las condiciones se trataron con un scramble (Src) o con el siRNA de NOX2. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C+Src; ###p<0,001 comparado con Ang II+Src; &&&p<0,001 comparado con LC+Src; +++p<0,001 comparado con ALC+Src. 0 1 2 3 4 5 6 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC siNOX2 (10 nM) Scramble (10 nM) Producción de H2O2 (µM) ### ### ### *** *** *** *** &&& +++ 88 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Por lo que respecta al uso del inhibidor de NOX1 (2-acetilfenotiazina), éste sí disminuyó significativamente la producción de anión superóxido tanto en condiciones basales como tras la estimulación con Ang II en ausencia y en presencia de LC (Figura 32). Figura 32: Efecto del inhibidor de NOX1 (2-acetilfenotiazina) sobre la actividad NADPH oxidasa en presencia L-carnitina (LC) y angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas durante 24 horas con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con Ang II; +++p<0,001 comparado con ALC. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 C Ang II ALC C Ang II ALC ### *** *** +++ 2-acetilfenotiazina (50 µM, 30 min) Actividad NADPH oxidasa (%) *** ### ### ### *** 89 Resultados El silenciamiento de NOX4 redujo la expresión génica de esta proteína aproximadamente un 50% en los cuatro grupos experimentales de células (Figura 33A), aumentando la expresión génica de NOX1 (Figura 33B) y NOX2 (Figura 33C) en los grupos tratados con LC. Expresión génica relativa NOX4 *** ### *** *** *** *** +++ &&& siNOX4 (17,5 nM) Scramble (17,5 nM) siNOX4 (17,5 nM) 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CLC Ang II ALC C LC Ang II ALC Scramble (17,5 nM) ### A B Expresión génica relativa NOX1 Expresión génica relativa NOX1 ## ## ** ** ** ** && ++ ## 96 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 C15 30 45 2.2. EFECTO DE LA ANGIOTENSINA II Y LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LAS PROTEÍNAS AKT, p38 MAPK Y ERK1/2 2.2.1. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA AKT INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II La incubación de las células NRK-52E con Ang II incrementó la fosforilación de la proteína Akt después de 15, 30 y 45 minutos de estimulación (Figura 38). Figura 38: Fosforilación tiempo-dependiente de la proteína Akt inducida por angiotensina II (Ang II). C = células controles sin estimular. El histograma representa la media±error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01 comparado con C. Akt p-Akt ** ** ** Ratio p-Akt/Akt (%) Ang II 100 nM (minutos) 97 Resultados 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 C Ang II ALC 2.2.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA AKT EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II Tras fijar el tiempo de incubación con Ang II (15 minutos) para obtener una fosforilación óptima de Akt, estimulamos las células NRK-52E en presencia y ausencia de LC. Como puede observarse en la Figura 39, la incubación con LC no produce una reducción en la fosforilación de Akt inducida por Ang II. Figura 39: Efecto de la angiotensina II (Ang II) y de la L-carnitina (LC) sobre la fosforilación de la proteína Akt. Las células fueron tratadas durante 15 min con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05 comparado con C. * * Ratio p-Akt/Akt (%) Akt p-Akt 98 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Por otro lado, observamos cómo las células incubadas únicamente con LC también presentaron un aumento de la fosforilación de la proteína Akt, fosforilación que no fue inhibida en presencia de wortmanina (Figura 40). Figura 40: Efecto de la L-carnitina (LC) y de la wortmanina (W) sobre la fosforilación de la proteína Akt. Las células fueron tratadas con 1 mM de LC durante 15 minutos, sola (LC) o en combinación con 1 µM de wortmanina (LC+W). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05 comparado con C. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CLC LC+W p-Akt * * Ratio p-Akt/Akt (%) Akt 99 Resultados 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 C15 30 45 2.2.3. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA p38 MAPK INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II La incubación de las células NRK-52E con Ang II incrementó la fosforilación de la proteína p38 MAPK a los 15 minutos de estimulación. Pasado este tiempo, la proteína vuelve a desfosforilarse, como se demuestra en las mediciones realizadas a los 30 minutos y a los 45 de estimulación con Ang II (Figura 41). Figura 41: Fosforilación tiempo-dependiente de la proteína p38 MAPK inducida por angiotensina II (Ang II). C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05 comparado con C. Ang II 100 nM (minutos) * Ratio p-p38 /p38 (%) p38 p-p38 100 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 C Ang II ALC 2.2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA p38 MAPK EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II Una vez definido el tiempo de incubación con Ang II (15 minutos) para obtener la máxima fosforilación de p38 MAPK, estimulamos las células NRK-52E en presencia y ausencia de LC, observándose que la incubación con LC no previno la fosforilación de p38 MAPK inducida por la Ang II (Figura 42). Figura 42: Efecto de la angiotensina II (Ang II) y de la L-carnitina (LC) sobre la fosforilación de la proteína p38 MAPK. Las células fueron tratadas durante 15 min con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05 comparado con C. Ratio p-p38 /p38 (%) * * p-p38 p38 101 Resultados 2.2.5. CINÉTICA DE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA ERK1/2 INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II La incubación de las células NRK-52E con Ang II incrementó la fosforilación de la proteína ERK1/2 tras 15 minutos de estimulación. Esta fosforilación fue aumentando con el tiempo, alcanzándose el máximo tras 45 minutos de estimulación (Figura 43). Figura 43: Fosforilación tiempo-dependiente de la proteína p-ERK1/2 por angiotensina II (Ang II). C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; &p<0,05, &&p <0,01 comparado con Ang II 45 min. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 C15 30 45 Ratio p-ERK1/2 /ERK1/2 (%) Ang II 100 nM (minutos) p-ERK1/2 ERK1/2 ** && *** & 102 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 2.2.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA ERK1/2 EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II Tras fijar en 45 minutos la exposición de las células a Ang II para la obtención de una máxima fosforilación de la proteína ERK1/2, estimulamos las células NRK-52E en presencia y ausencia de LC. Al igual que en los casos anteriores (Figuras 39 y 42), la incubación con LC no modificó la fosforilación de ERK1/2 inducida por la Ang II (Figura 44). Figura 44: Efecto de la angiotensina II (Ang II) y de la L-carnitina (LC) sobre la fosforilación de la proteína ERK1/2. Las células fueron tratadas durante 45 min con 100 nM de Ang II (Ang II) o 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 C Ang II ALC *** ** Ratio p-ERK1/2 /ERK1/2 (%) p-ERK1/2 ERK1/2 103 Resultados 2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA ACTIVIDAD DE LA PROTEINA QUINASA C (PKC) EN CÉLULAS ESTIMULADAS CON ANGIOTENSINA II La adición de Ang II a la línea celular NRK-52E indujo un aumento (1,5 veces) de la actividad de la PKC con respecto a las células no estimuladas. El tratamiento con LC fue capaz de restaurar la actividad de esta proteína hasta valores similares a aquellos obtenidos en células no estimuladas. Las células tratadas únicamente con LC no mostraron cambio alguno en la actividad PKC con respecto a los valores basales observados en las células controles (Figura 45). Figura 45: Efecto de la angiotensina II (Ang II) y de la L-carnitina (LC) sobre la actividad de la proteína PKC. Las células fueron tratadas durante 30 minutos con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con Ang II. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 CLC Ang II ALC *** ### ### Actividad PKC relativa (%) 104 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 2.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL NF-ΚB HACIA EL NÚCLEO 2.4.1. CINÉTICA DE LA TRANSLOCACIÓN DEL COMPLEJO NF-kB INDUCIDA POR ANGIOTENSINA II La presencia de Ang II en las células NRK-52E triplicó la tasa de translocación de la proteína NF-kB hacia el núcleo tras 40 minutos de exposición. La translocación también se estimula a los 20 minutos, si bien en menor medida. Pasados los 40 minutos de incubación, este aumento en la translocación de NF-kB desaparece (Figura 46). Figura 46: Translocación tiempo-dependiente de la proteína NF-kB inducida por angiotensina II (Ang II). C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05, ***p<0,001 comparado con C; #<p0,05, ##<p0,01 comparado con Ang II 40 min. 0 50 100 150 200 250 300 350 C20 40 60 Ang II 100 nM (minutos) *** # ## * NÚCLEO CITOSOL NF-kB núcleo/NF-kB citosol (%) 105 Resultados 2.4.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA TRANSLOCACIÓN DEL COMPLEJO NF-KB HACIA EL NÚCLEO EN CÉLULAS TRATADAS CON ANGIOTENSINA II En la Figura 47 se muestra cómo la LC es capaz de inhibir la translocación de la proteína NF-kB al interior inducida por Ang II. Por el contrario, la adición de LC a células controles no modifica la translocación de la proteína con respecto a los valores observados en las células sin estimular. Figura 47: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la translocación del complejo NF-kB inducida por angiotensina II (Ang II). Las células fueron tratadas durante 40 minutos con 100 nM de Ang II (Ang II), 100 nM de Ang II más 1 mM de LC (ALC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01 comparado con C; ##p<0,01 comparado con Ang II. 0 50 100 150 200 250 C LC Ang II ALC ** ## ## Ratio NF-kB núcleo/NF-kB citosol (%) NÚCLEO CITOSOL 112 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato Figura 52: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la expresión génica de las isoformas NOX1 (A), NOX2 (B) y NOX4 (C) de la NADPH oxidasa en células tratadas con TGFβ. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con TGFβ. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 CLC TGFβTLC C Expresión génica relativa NOX4 ### ### ### *** 113 Resultados 3.4. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA EXPRESIÓN GÉNICA DE CTGF (MARCADOR DE FIBROSIS) INDUCIDA POR TGFβ El TGFβ indujo la expresión génica de la proteína CTGF (factor de crecimiento de tejido conectivo), aumentándola casi 2 veces, confirmándose así que las células han adquirido un fenotipo fibrótico tras ser expuestas a TGFβ (apartado 1.3.1 de la sección Introducción ). La LC contrarrestó este incremento en la expresión de CTGF. Por otro lado, la administración de LC en células no tratadas no provocó ningún cambio en la expresión génica del marcador de fibrosis estudiado (Figura 53). Figura 53: Efecto de la L-carnitina (LC) y TGFβ en la expresión génica de CTGF. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. El histograma representa la media ± error estándar de 4 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con TGFβ. 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CLC TGFβTLC ### ### *** Expresión génica relativa CTGF 114 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 3.5. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE LA FOSFORILACIÓN DE LA PROTEÍNA SMAD2 INDUCIDA POR TGFβ Las células de la línea celular NRK-52E estimuladas con TGFβ mostraron un aumento significativo de la fosforilación de la proteína Smad2 al compararlo con el grupo control, un efecto que fue inhibido mediante la preincubación con LC (Figura 54). Figura 54: Efecto de la L-carnitina (LC) en la fosforilación de la proteína Smad2 inducida por TGFβ. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ±error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: ***p<0,001 comparado con C; ###p<0,001 comparado con TGFβ. 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 CLC TGFβTLC *** ### ### Ratio p-Smad2/β-actina (%) β-actina p-Smad2 115 Resultados 3.6. EFECTO DE LA L-CARNITINA SOBRE EL SISTEMA DE DEGRADACIÓN DE COLÁGENO 3.6.1. ESTUDIOS IN VIVO 3.6.1.1. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MMP-9 EN CORTEZA RENAL DE RATAS HIPERTENSAS El tratamiento de los animales con L-NAME (sustancia inductora de hipertensión por depleción de óxido nítrico; apartado 2.1. de la sección Materiales y Métodos ) redujo la expresión génica de la MMP-9 (apartado 1.3.3. de la sección Introducción ) en un 60%, alteración que fue corregida en las ratas hipertensas tratadas con LC. La administración de LC a ratas controles no provocó ningún cambio en la expresión génica de esta metaloproteinasa de la matriz extracelular (Figura 55). Figura 55: Efecto de la L-carnitina (LC) en la expresión génica de MMP-9 en corteza renal de ratas hipertensas. Las ratas fueron tratadas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC), con 25 mg de L-NAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = ratas controles normotensas. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01 comparado con C; ##p<0,01 comparado con LN. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CLC LN LNLC Expresión génica relativa MMP-9 ** ## ## 116 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 0,5 1 1,5 2 2,5 CLC LN LNLC 3.6.1.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE TIMP-1 EN CORTEZA RENAL DE RATAS HIPERTENSAS La expresión de TIMP-1 (apartado 1.3.3. de la sección Introducción ) se vio aumentada tras el tratamiento con L-NAME (1,8 veces); este aumento fue contrarrestado por la LC hasta llegar a los niveles de expresión propios de ratas controles. Como ocurrió anteriormente, la administración de LC a ratas controles no provocó ningún cambio en la expresión génica de TIMP-1 (Figura 56). Figura 56: Efecto de la L-carnitina (LC) en la expresión génica de TIMP-1 en corteza renal de ratas hipertensas. Las ratas fueron tratadas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC), con 25 mg de L-NAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = ratas controles normotensas. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05 comparado con C; #p<0,05, ##p<0,01 comparado con LN. Expresión génica relativa TIMP-1 * ## # 117 Resultados 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 CLC LN LNLC 3.6.1.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN EL RATIO MMP-9/TIMP-1 EN CORTEZA RENAL DE RATAS HIPERTENSAS. A nivel de corteza renal el tratamiento con L-NAME en ratas produjo una disminución en la relación MMP-9/TIMP-1. El tratamiento con LC revierte este descenso, alcanzándose valores semejantes a muestras controles (Figura 57). Figura 57: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre el ratio MMP-9/TIMP-1 de corteza renal de ratas hipertensas. Las ratas fueron tratadas con 400 mg de LC /kg de peso/día (LC), con 25 mg de LNAME /kg de peso/día (LN) o con L-NAME y LC (LNLC). C = ratas controles normotensas. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01 comparado con C; ##p<0,01 comparado con LN. Ratio MMP-9/TIMP-1 ## ** ## 118 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 3.6.2. ESTUDIOS IN VITRO 3.6.2.1. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE MMP9 EN CÉLULAS NRK-52E El tratamiento con TGFβ no modificó la expresión génica de MMP-9. Sin embargo, las células que fueron tratadas con LC en presencia o ausencia de TGFβ, sí mostraron una disminución significativa de la expresión génica de esta proteína (Figura 58). Figura 58: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la expresión génica de MMP-9 en células tratadas con TGFβ. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01, ***p<0,001 comparado con C; ##p<0,01, ###p<0,001 comparado con TGFβ. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 CLC TGFβTLC Expresión génica relativa MMP-9 *** ** ## ### 119 Resultados 3.6.2.2. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN LA EXPRESIÓN GÉNICA DE TIMP-1 EN CÉLULAS NRK-52E El tratamiento con TGFβ aumentó la expresión génica de TIMP-1. Por el contrario, las células que fueron tratadas con LC, ya fuese en presencia o ausencia de TGFβ, mostraron una disminución de la expresión génica de este inhibidor (Figura 59). Figura 59: Efecto de la L-carnitina (LC) sobre la expresión génica de TIMP-1 en células tratadas con TGFβ. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: *p<0,05, **p<0,01 comparado con C; ###p<0,001 comparado con TGFβ. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 CLC TGFβTLC Expresión génica relativa TIMP-1 ** ### ### * * 120 Tesis Doctoral Antonio Jesús Blanca Lobato 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 CLC TGFβTLC 3.6.2.3. EFECTO DE LA L-CARNITINA EN EL RATIO MMP-9/TIMP-1 EN CÉLULAS NRK52E En la línea celular NRK-52E, el tratamiento con TGFβ produjo una disminución en el cociente MMP-9/TIMP-1. El tratamiento con LC revierte este descenso, alcanzándose valores semejantes a los obtenidos en condiciones controles (Figura 60). Figura 60: Efecto de la L-carnitina (LC) y del TGFβ sobre el ratio MMP-9/TIMP-1 en la línea celular NRK-52E. Las células fueron tratadas durante 24 horas con 10 ng/mL de TGFβ (TGFβ), 10 ng/mL de TGFβ más 1 mM de LC (TLC) o 1 mM de LC (LC). En aquellas células tratadas con LC, se realizó adicionalmente una preincubación de 30 minutos con la misma. C = células controles sin estimular. El histograma representa la media ± error estándar de 3 experimentos independientes. Significación estadística: **p<0,01 comparado con C; #p<0,05, ##p<0,01 comparado con TGFβ. Ratio MMP-9/TIMP-1 ** ## # DISCUSIÓN