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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
ESPAÑA
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Núme o de publicación: 2 268 913
21
Núme o de solici ud: 200301407
51
In . Cl.:
C12Q 1/10 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
12
PATENTE DE INVENCIÓN B1
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Fecha de p esen ación: 11.03.2002
43
Fecha de publicación de la solici ud: 16.03.2007
Fecha de la concesión: 30.01.2008
45
Fecha de anuncio de la concesión: 16.03.2008
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Fecha de publicación del olle o de la pa en e:
16.03.2008
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Núme o de la solici ud inicial: 200200600
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Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa
Pabellón de B asil
Paseo de las Delicias, s/n
41012 Se illa, ES
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In en o /es: Paloma es Folia, José Ca los;
To es Sánchez, Ma ía José;
Paloma es Quesada, Ma ía Concepción;
To es Rueda, An onio;
San os Rosa, F ancisco y
Azna Ma ín, Ja ie
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Agen e: No cons a
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Tí ulo: Mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de Lac obacillus plan a um median e la eacción
en cadena de la polime asa en iempo eal.
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Resumen:
Mé odo pa a le de ección e iden i icación ápida de Lac o-
bacillus plan a um median e la eacción en cadena de la
polime asa en iempo eal.
El mé odo comp ende (i) p epa a un conjun o de ubos
con eniendo cada ubo una mezcla de eacción especí ica
pa a la bac e ia a de ec a (L. plan a um), (ii) p og ama n
apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli ica-
ciones de ácido nucleico e comp ende un e mociclado ,
una uen e de luz y un senso pa a ob ene un conjun o de
señales, (iii) in e p e a las señales ob enidas, y (i ) de e -
mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de dicha
bac e ia en las mues as ensayadas, median e el empleo
de oligonucleó idos (iniciado es y sondas ma cadas) es-
pecí icos pa a dicha bac e ia. De in e és especial en la
indus ia ag o-alimen a ia y de dis ibución de alimen os,
pa a la de ección de bac e ias que de e io an alimen os
ales como Lac obacillus plan a um.
A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP.
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Ven a de ascículos: O icina Española de Pa en es y Ma cas. Pº de la Cas ellana, 75 – 28071 Mad id
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DESCRIPCIÓN
Mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de Lac obacillus plan a um median e la eacción en cadena de la
polime asa en iempo eal.
Campo de la in ención
La in ención se elaciona, en gene al, con la de ección e iden i icación de bac e ias que de e io an alimen os, ales
como Lac obacillus plan a um, median e la eacción en cadena de la polime asa en iempo eal.
An eceden es de la in ención
La de ección de bac e ias que de e io an alimen os, ales como Lac obacillus plan a um (L. plan a um) iene mu-
cho in e és en la indus ia ag oalimen a ia, an o la p oduc o a como la dis ibuido a de p oduc os alimen icios (ma e-
ias p imas y/o p oduc os elabo ados), po lo que se han desc i o di e sos mé odos pa a su de ección e iden i icación.
El Código Alimen a io Español es ablece una no ma i a en la que, pa a cada alimen o, se especi ican los mic oo -
ganismos cuya p esencia debe se de ec ada, así como las écnicas ecomendadas pa a es os análisis. En gene al, es as
écnicas u ilizan me odologías con encionales basadas en el cul i o del mic oo ganismo, que equie en el p e-en ique-
cimien o en caldo du an e 24-48 ho as, el sub-cul i o en medios selec i os du an e o as 24-48 ho as, y, inalmen e,
ealiza una iden i icación bioquímica y de se o ipación, lo que equie e o as 24-48 ho as; es deci , en o al deben
anscu i en e 72 y 96 ho as an es de ob ene un esul ado. Po o a pa e, dicha me odología basada en el cul i o
del mic oo ganismo no es o almen e iable ya que muchos mic oo ganismos son di íciles de cul i a y, más aún, de
cuan i ica , y, po el iempo que emplea, equie e la gos pe íodos de almacenamien o de las ma e ias p imas y de los
p oduc os elabo ados, con su co espondien e impac o en los cos es y posible disminución de compe i i idad an o
a ni el nacional como in e nacional. Lo mismo ocu e con las emp esas de dis ibución, en especial con las g andes
supe icies, que deben almacena g andes can idades de p oduc os, algunos de ellos pe ecede os, así como con las
emp esas de hos ele ía que, en nume osas ocasiones, se en pe judicadas po el e aso en el con ol de los alimen os
que si en. Po es os mo i os, exis e la necesidad de aumen a la sensibilidad y al mismo iempo la iabilidad y api-
dez en la de ección de los mic oo ganismos que pueden llega a de e io a los alimen os, en pa icula , los alimen os
p ocesados.
En algunos casos se á necesa io sólo aumen a la sensibilidad del mé odo pa a de ec a de o ma iable y ápida
la p esencia o ausencia del mic oo ganismo, mien as que, en o os casos se á necesa io, además, cuan i ica los
mic oo ganismos e en ualmen e p esen es con el in de es ablece los lími es de concen ación a pa i de los cuales la
p esencia del mic oo ganismo puede ep esen a un p oblema pa a la es abilidad del p oduc o alimen icio.
En compa ación con los mé odos de cul i o de mic oo ganismos adicionales, las écnicas molecula es, espe-
cialmen e la eacción en cadena de la polime asa (PCR) [Saiki, R.K., e al., 1988. Science 239: 487-491] se es án
e elando como un mé odo ácil, sensible y en ajoso en su elación cos o-bene icio pa a de ec a la p esencia de
mic oo ganismos. Es os mé odos es án desplazando ápidamen e a los mé odos con encionales en el diagnós ico de
múl iples en e medades, aunque en el á ea alimen icia es án desa ollando sus p ime os a ances con un alo única-
men e cuali a i o.
Exis e la necesidad de dispone de un mé odo ápido, que p opo cione esul ados en menos de 24 ho as, p eciso
y iable, que pe mi a la de ección cuali a i a y, si se desea, cuan i a i a, de mic oo ganismos con aminan es e en ual-
men e p esen es en una mues a de ensayo, y que pe mi a de ec a e iden i ica indi idual o simul áneamen e uno o
más de dichos mic oo ganismos.
Es e obje i o puede ob ene se median e el empleo de una eacción en cadena de la polime asa en iempo eal (PCR
en iempo eal), que comp ende ampli ica el núme o de copias de un agmen o del genoma de un mic oo ganismo y
la de ección del p oduc o ob enido en cada paso de la eacción, empleando pa a ello un apa a o e mociclado ápido
con de ección a iempo eal que inco po a una conexión a un o denado en el que se encuen a el so wa e necesa io
pa a el con ol de odos los p ocesos paso a paso. Se a a de una écnica ecien e cuya p incipal ca ac e ís ica eside
en que la ampli icación y el análisis ocu en en el mismo ubo de eacción y se ob iene in o mación du an e odo el
iempo en que anscu e la écnica sin necesidad de ene que u iliza isó opos o geles de elec o o esis, lo que pe mi e
educi el iempo de de ección de ácidos nucleicos de 5 ho as a 20 minu os.
Compendio de la in ención
La in ención se en en a, en gene al, con el p oblema de desa olla un mé odo ápido, p eciso y iable, que pe mi a
de ec a e iden i ica , bac e ias causan es del de e io o de alimen os, ales como L. plan a um, basado en el empleo de
écnicas molecula es.
La solución p opo cionada po es a in ención se basa en el diseño y desa ollo de una se ie de eac i os (oligo-
nucleó idos iniciado es y sondas especí icos) que, en de e minadas condiciones de eacción, pe mi en ampli ica un
agmen o del genoma especí ico de L. plan a um, y de ec a la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en una mues a
de ensayo median e PCR en iempo eal.
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B e emen e, el mé odo p opo cionado po es a in ención pa a de ec a e iden i ica L. plan a um en una mues a
de ensayo, median e PCR en iempo eal, comp ende la ex acción del ADN e en ualmen e p esen e en dicha mues a
de ensayo, la ampli icación de una secuencia de inida de ese ADN median e PCR y la de ección con inua de los
p oduc os ampli icados. Pa a ealiza dicha ampli icación y de ección es necesa io u iliza una se ie de eac i os y
oligonucleó idos (iniciado es y sondas) especí icos. Po an o, pa a ampli ica y de ec a dicho mic oo ganismo se ha
diseñado, po una pa e, una pa eja de iniciado es que pe mi en ampli ica una secuencia de nucleó idos diana p esen e
en el genoma bac e iano que se desea pone de mani ies o, y, po o a pa e, una pa eja de sondas que pe mi en
iden i ica con ce eza dicha secuencia diana, siendo dichas sondas complemen a ias a una egión p esen e en los
p oduc os de ampli icación y es ando ma cadas, una de ellas, con un luo ó o o y la o a con un colo an e que cap u a la
ene gía libe ada po el luo ó o o y la emi e a su ez en o a longi ud de onda de ec able po el sis ema. El e mociclado
ápido con de ección a iempo eal, en cada paso de la eacción ealiza la duplicación del agmen o de ADN median e
los iniciado es y una polime asa e mo esis en e y a cada uno de los dos agmen os esul an es se unen las sondas.
Es as sondas adhe idas al agmen o de ADN emi i án ene gía a una de e minada longi ud de onda al se exci adas.
Es e p oceso (unión de los iniciado es, duplicación del agmen o de ADN, unión de las sondas, de ección ene gía
emi ida) se epi e un núme o de e minado de eces, ípicamen e unas 30 eces, ob eniéndose al inal g an can idad del
p oduc o ampli icado. Con odas las medidas ealizadas, se ealiza un análisis es adís ico que de e mina el ipo de ADN
ampli icado, po ejemplo, median e análisis de la Tempe a u a de Hib idación (Tm) y, si se desea, la concen ación del
mismo.
Pa a la pues a en p ác ica del mé odo p opo cionado po es a in ención, se equie e un e mociclado ápido a
iempo eal, el cual, en una ealización pa icula , es á unido a un sis ema de de ección po luo escencia, lo que pe mi e
la moni o ización en iempo eal del p oceso de ampli icación as cada ciclo. Además, el análisis del p oduc o inal de
PCR se ealiza una ez e minado el p oceso de ampli icación sin necesidad de ninguna manipulación. Su in eg ación
jun o con un o denado pe mi e diseña los p og amas de ampli icación, de ección y análisis de los p oduc os.
Un mé odo como el p opo cionado po es a in ención p esen a la en aja de que pe mi e la de ección e iden i ica-
ción ápida, ípicamen e en menos de 24 ho as, p ecisa y iable, de L. plan a um, en una mues a de ensayo, así como
la cuan i icación de los mic oo ganismos e en ualmen e p esen es en dicha mues a de ensayo
Un obje o de es a in ención lo cons i uye un mé odo pa ada de ección e iden i icación de L. plan a um, median-
e PCR en iempo eal. Los oligonucleó idos (iniciado es y sondas ma cadas) u ilizados en la ealización de dicho
mé odo, así como los ki s que los con ienen cons i uyen obje os adicionales de es a in ención.
Desc ipción de allada de la in ención
La in ención p opo ciona un mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de L. plan a um, en una o más
mues as de ensayo, median e la eacción en cadena de la polime asa (PCR) en iempo eal, en adelan e mé odo de la
in ención, que comp ende:
a) ex ae el ADN p esen e en dicha mues a o mues as de ensayo;
b) p epa a un conjun o de ubos con eniendo cada ubo una mezcla de eacción especí ica pa a dicha bac e ia a
de ec a e iden i ica , comp endiendo cada mezcla de eacción los eac i os necesa ios pa a la ampli icación
enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica ;
c) p og ama un apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli icaciones de ácido nucleico que com-
p ende (i) un e mociclado que incluye un elemen o que con iene una plu alidad de o i icios en los que
se in oducen dichos ubos que con ienen la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN
e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica , (ii) una uen e de luz óp icamen e acoplada a dicho
e mociclado y adap ada pa a dis ibui luz sob e dicha plu alidad de o i icios, y (iii) un senso adap ado
pa a de ec a simul áneamen e la luz emi ida desde dicha plu alidad de o i icios, con el in de ob ene un
conjun o de señales;
d) in e p e a dichas señales; y
e) de e mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensaya-
das;
ca ac e izado po que
i) la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación especí ica de L. plan a um
comp ende un pa de iniciado es iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, una sonda iden i icada
como SEQ. ID. Nº: 3 unida a un luo ó o o y una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 4 unida a un
colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda
di e en e; y
ii) la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensayadas se de e mina po la apa-
ición de una cu a de usión especí ica de cada p oduc o ampli icado, ob eniéndose dicha cu a de usión
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po hib idación de las sondas especí icas pa a la iden i icación de dicha bac e ia con el p oduc o de ampli-
icación ob enido en cada ubo, y, si se desea, de e mina la empe a u a de usión ca ac e ís ica de cada
p oduc o ampli icado.
El mé odo p opo cionado po es a in ención pe mi e de ec a , iden i ica y, si se desea, cuan i ica , bac e ias cau-
san es del de e io o de alimen os, ales como L. plan a um, en una o más mues as de ensayo, median e PCR en iempo
eal. La mues a de ensayo puede se cualquie mues a que con iene ADN en la que se desea conoce la posible con-
aminación po dicha bac e ia. En una ealización pa icula , dicha mues a de ensayo es una mues a de un p oduc o
alimen icio, po ejemplo, una mues a de una ma e ia p ima u ilizada en la p oducción de alimen os o una mues a de
un p oduc o alimen icio p ocesado.
An es de pone en con ac o el ADN de las bac e ias e en ualmen e p esen es en dicha mues a o mues as de
ensayo a analiza con la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN, se p ocede a ex ae la o alidad
o pa e del ADN p esen e en las mues as de ensayo. La ex acción del ADN se puede ealiza median e mé odos
con encionales, incluyendo aquéllos que no p ecisan una pu i icación del ADN ex aído. En una ealización pa icula ,
la ex acción del ADN se ealizó u ilizando la esina Chelex 100 ( éase el Ejemplo que acompaña a es a desc ipción).
Pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención se p epa a un conjun o de ubos, en el que cada ubo con iene
una mezcla de eacción especí ica pa a la bac e ia a de ec a e iden i ica (L. plan a um), comp endiendo cada mezcla
de eacción los eac i os necesa ios pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a
e iden i ica . En gene al, dicha mezcla de eacción con iene los eac i os necesa ios pa a la ealización del mé odo
de la in ención, po ejemplo, agua calidad PCR, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un ampón adecuado pa a la
eacción de ampli icación enzimá ica, una ADN polime asa e moes able, una sal magnésica, e c., jun o con un pa de
iniciado es y un pa de sondas ma cadas especí icos pa a la bac e ia a ensaya .
Los iniciado es u ilizados en el mé odo de la in ención pe mi en ampli ica una secuencia de nucleó idos diana o
agmen o especí ico del genoma bac e iano que se desea pone de mani ies o. En gene al, puede ampli ica se cual-
quie agmen o del genoma bac e iano que pe mi a la iden i icación de una bac e ia, a ni el de géne o o especie,
co espondien e. La pa eja de sondas ma cadas pe mi e iden i ica con ce eza dicho agmen o especí ico del geno-
ma bac e iano a de ec a y comp enden una secuencia de nucleó idos complemen a ia a una egión p esen e en los
p oduc os de ampli icación y un ma cado . En una ealización pa icula , una de dichas sondas es á ma cada con un
luo ó o o que ac úa como donado de ene gía y la o a sonda con un colo an e que cap u a la ene gía libe ada po el
luo ó o o y la emi e a su ez en o a longi ud de onda de ec able po el sis ema p esen e en el apa a o pa a la pues a
en p ác ica del mé odo de la in ención.
En una ealización pa icula , la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación
especí ica de L. plan a um comp ende un pa de iniciado es iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, una
sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 3 unida a un luo ó o o y una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 4 unida a
un colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda di e en e.
Dicho pa de iniciado es SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2 pe mi e la ampli icación de un agmen o de 281 pb del
ARN ibosómico (ARN ) de L. plan a um ( egión espaciado a en e los genes de los ARN 16S y 23S).
Como luo ó o o puede u iliza se cualquie g upo o sus ancia luo escen e capaz de dona ene gía as se ac i ado,
y como colo an e puede u iliza se cualquie compues o capaz de cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del
luo ó o o y emi i la a una longi ud de onda di e en e. En una ealización pa icula , dicho luo ó o o es luo esceína
y dicho colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda
di e en e es el colo an e Red640.
Ejemplos adicionales de luo ó o os y colo an es que pueden u iliza se pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la
in ención se ecogen en la Tabla 1.
TABLA 1
Fluo ó o os y Colo an es
Ma cado
Fluo ó o o Fluo esceína
Syb G een
TAMRA
Colo an e LC Red 640
LC Red 705
Fluo esceína
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El mé odo de la in ención se ealiza en un apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli icaciones de ácido
nucleico que comp ende (i) un e mociclado que incluye un elemen o que con iene una plu alidad de o i icios en
los que se in oducen dichos ubos que con ienen la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e
iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica , (ii) una uen e de luz óp icamen e acoplada a dicho e mociclado
y adap ada pa a dis ibui luz sob e dicha plu alidad de o i icios, al como una uen e de adiación láse ; y (iii) un
senso adap ado pa a de ec a simul áneamen e la luz emi ida desde dicha plu alidad de o i icios, con el in de ob ene
un conjun o de señales, al como un de ec o de luo escencia. Dichos apa a os son conocidos [ éase, po ejemplo, la
solici ud de pa en e eu opea EP 640 828 A].
El e mociclado ápido con de ección a iempo eal, en cada paso de la eacción ealiza la duplicación de un
agmen o de ADN (secuencia diana p esen e en el genoma bac e iano que se desea de ec a ) median e el empleo de los
iniciado es co espondien es y de una polime asa e mo esis en e y, a cada uno de los dos agmen os esul an es, se
unen las sondas ma cadas. Es as sondas adhe idas al agmen o de ADN emi i án ene gía a una de e minada longi ud
de onda al se exci adas. Es e p oceso (unión de los iniciado es, duplicación del agmen o de ADN, unión de las
sondas, de ección ene gía emi ida) se epi e un núme o de e minado de eces, ípicamen e unas 30 eces, ob eniéndose
al inal g an can idad del p oduc o ampli icado. Con odas las medidas ealizadas, se ealiza un análisis es adís ico que
de e mina el ipo de ADN ampli icado, po ejemplo, median e análisis de la Tempe a u a de Hib idación (Tm) y, si se
desea, se de e mina la concen ación del mismo.
En una ealización pa icula , el apa a o u ilizado pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención comp ende
un e mociclado ápido a iempo eal unido a un sis ema de de ección po luo escencia, lo que pe mi e la moni o-
ización en iempo eal del p oceso de ampli icación as cada ciclo, al como el e mociclado Ligh Cycle (Roche
Biochemicals) [ éase el Ejemplo que acompaña a es a desc ipción]. En es e caso, el análisis del p oduc o inal de PCR
se ealiza una ez e minado el p oceso de ampli icación sin necesidad de ninguna manipulación. Su in eg ación jun o
con un o denado pe mi e diseña los p og amas de ampli icación, de ección y análisis de los p oduc os.
T as in e p e a las señales ob enidas se puede de e mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de L. plan a-
um. En una ealización pa icula , la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensayadas se
de e mina po la apa ición de una cu a de usión especí ica de cada p oduc o ampli icado, ob eniéndose dicha cu a
de usión po hib idación de las sondas especí icas pa a la iden i icación de dicha bac e ia con el p oduc o de ampli i-
cación ob enido en cada ubo. Adicionalmen e, si se desea, se puede de e mina la empe a u a de usión ca ac e ís ica
de cada p oduc o ampli icado así como la concen ación del mismo.
El mé odo de la in ención pe mi e de ec a , iden i ica y, si se desea, cuan i ica , bac e ias que de e io an alimen-
os, ales como L. plan a um, en mues as de ensayo, median e PCR en iempo eal. Po an o, dicho mé odo se puede
aplica al análisis mic obiológico de odos los alimen os suscep ibles de se de e io ados po dichas bac e ias, pe mi-
iendo su de ección en pocas ho as, gene almen e en menos de 24 ho as, colabo ando de es e modo en ga an iza la
es abilidad del p oduc o alimen icio y aco ando el iempo de almacenamien o p e io a la come cialización del mismo.
En una ealización pa icula , el mé odo de la in ención se u iliza en la de ección ápida (cuali a i a y cuan i a i a)
en alimen os del genoma de bac e ias que causan de e io o en alimen os (L. plan a um). Los alimen os que pueden
se analizados pueden se an o ma e ias p imas, po ejemplo, leche, hue os, ca nes, e du as, e c., como sus de i a-
dos, alimen os p ocesados o no, acei es, salsas, e c., an o en las emp esas p oduc o as como en las dis ibuido as y
hos ele ía.
Un mé odo pa a la de ección e iden i icación de bac e ias que de e io an alimen os como el p opo cionado po es a
in ención p esen a, en e o as, las siguien es en ajas:
a) equie e un iempo sus ancialmen e in e io a los mé odos habi ualmen e u ilizados, ípicamen e 24 ho as
en compa ación con los mé odos con encionales que equie en en e 72 y 96 ho as;
b) una ez ealizado el p e-en iquecimien o y la ex acción del ADN, odo el p oceso se lle a a cabo en el
mismo ubo, e i ando manipulaciones y con aminaciones ex e nas;
c) es un mé odo cuan i a i o, que no sólo de ec a e iden i ica las bac e ias e en ualmen e p esen es en una
mues a de ensayo sino que pe mi e, además, si se desea, de e mina la concen ación de dichas bac e ias
p esen es en la mues a de ensayo;
d) es posible su au oma ización comple a; y
e) pe mi e ealiza la de ección de a ias bac e ias simul áneamen e.
La in ención ambién p opo ciona un oligonucleó ido pa a la de ección e iden i icación de bac e ias causan es de
de e io o en alimen os, ales como L. plan a um, en adelan e oligonucleó ido de la in ención, que iene una secuencia
de nucleó idos seleccionada del g upo o mado po las secuencias iden i icadas como SEQ. ID. Nº: 1, SEQ. ID. Nº: 2,
SEQ. ID. Nº: 3 y SEQ. ID. Nº: 4.
Asimismo, la in ención p opo ciona una sonda ma cada, en adelan e sonda ma cada de la in ención, que comp en-
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de (i) un oligonucleó ido, seleccionado del g upo o mado po los oligonucleó idos iden i icados como SEQ. ID. Nº: 3
y SEQ. ID. Nº: 4, y (ii) un ma cado , al como un luo ó o o, po ejemplo, luo esceína, o un colo an e capaz de cap u a
la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y emi i la a una longi ud de onda di e en e, po ejemplo, el colo an-
e Red640. En una ealización pa icula , dicha sonda ma cada de la in ención se selecciona del g upo o mado po :
el oligonucleó ido iden i icado como SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína,
el oligonucleó ido iden i icado como SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640, y sus mezclas.
La in ención ambién p opo ciona un ki pa a la de ección e iden i icación ápida de L. plan a um, en una o más
mues as de ensayo, median e PCR en iempo eal, que comp ende, al menos, un oligonucleó ido de la in ención o una
sonda ma cada de la in ención. En una ealización pa icula , dicho ki comp ende los oligonucleó idos iden i icados
como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, y las sondas ma cadas compues as po el oligonucleó ido SEQ. ID. Nº: 3 unido
a luo esceína y el oligonucleó ido SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640.
En gene al, los ki de la in ención con ienen la pa eja de iniciado es co espondien es a la bac e ia a de ec a ( L.
plan a um) en un ubo indi idualizado, al igual que la pa eja de sondas ma cadas pa a dicha bac e ia, con el in de
pode elegi en e ealiza la de ección de una sola bac e ia (usando solo el ubo de sus iniciado es y el de sus sondas
ma cadas), o bien pa a la de ección simul ánea de dicha bac e ia y o a bac e ia que de e io a alimen os, po ejemplo,
Bacillus ce eus, dependiendo de las necesidades.
Los ki s p opo cionados po es a in ención pueden p esen a se en o ma de es uche con eniendo, además de unos
ecipien es con uno o más de dichos oligonucleó idos y/o sondas ma cadas mencionados p e iamen e, unos ecipien es
con la o alidad o pa e del es o de eac i os necesa ios pa a la ealización del mé odo en cues ión, po ejemplo, agua
ul apu a, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un ampón adecuado pa a la eacción de ampli icación enzimá ica,
una ADN polime asa e moes able (po ejemplo, ADN polime asa Taq), una sal magnésica (po ejemplo, clo u o
magnésico), e c. Adicional y opcionalmen e, los ki s p opo cionados po es a in ención pueden inclui unos ecipien es
con ADN de L. plan a um, pa a su empleo como con oles posi i os.
El siguien e ejemplo ilus a la in ención y no debe se conside ado como limi a i o del alcance de la misma.
Ejemplo 1
De ección e iden i icación de L. plan a um en un p oduc o alimen icio median e PCR en iempo eal
1. Ma e iales y Mé odos
El equipo diagnós ico diseñado pa a la de ección de L. plan a um en p oduc os alimen icios consis e en a ios
ubos con eniendo cada uno de ellos los iniciado es, sondas ma cadas, ADN polime asa e moes able, solución de
MgCl2y agua bides ilada es é il, necesa ios pa a lle a a cabo el mé odo de ampli icación diseñado pa a dicho equipo.
En es e caso conc e o, el equipo u ilizado incluye odos los componen es básicos pa a la ealización de la ampli icación
de has a 100 mues as y con oles. El ADN con ol p o is o es á compues o po una mezcla del ADN ex aído de cepas
de labo a o io de odas las bac e ias a de ec a .
La pa eja de iniciado es co espondien es a la bac e ia a de ec a se p esen a en un ubo indi idualizado, al igual
que la pa eja de sondas ma cadas pa a dicha bac e ia.
Pa a la ealización del mé odo se ha u ilizado una mic ocen i uga, un e mociclado Ligh Cycle (Roche Bioche-
micals), unas mic opipe as y unas pun as de mic opipe as con il o.
La plani icación del mé odo se ecoge en la Tabla 2. Aunque el iempo de manipulación se ha calculado pa a una
sola mues a, se pueden manipula a ias mues as simul áneamen e sin apenas inc emen a los iempos.
TABLA 2
Plani icación del mé odo
Paso Manipulación (min) Tiempo (min)
P epa ación mezcla de eac i os y ubos de la eacción. 5 10
Colocación en el e mociclado
Reacción PCR 20-40 30-50
Análisis de da os 0-5 5-10
Tiempo o al del ensayo 45-60
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El mé odo puede ealiza se siguiendo el p o ocolo es ánda que se desc ibe a con inuación:
1. Toma de mues a (25 g del p oduc o) y p epa ación median e p e-en iquecimien o en agua de pep ona
amponada du an e 20-24 ho as a 37ºC.
2. Ex acción del ADN median e su ex acción con un mé odo iable, po ejemplo, usando la esina Chelex
100.
3. Ampli icación y de ección: Se p epa a un capila con eniendo los componen es necesa ios pa a la eacción,
ADN polime asa e moes able, los cua o dNTPs, MgCl2, ADN ex aído de la mues a, iniciado es y sondas
ma cadas especí icos pa a la bac e ia que se desea de ec a . Adicionalmen e, se p epa a un ubo con el ADN
con ol y los iniciado es y sondas de la(s) bac e ia(s) a de ec a .
4. Coloca los capila es p epa ados en el e mociclado a iempo eal y p og ama la ealización del p oceso de
ampli icación y de ección: empe a u a, iempo, núme o de ciclos y momen o de lec u a según el esquema.
5. Inicia el p og ama ( éase la Tabla 3).
TABLA 3
P og ama
Pa áme os Valo es
Ciclos 45
Tipo Cuan i icación
Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3
Tempe a u a (ºC) 95 55 72
Tiempo incubación (s) 0 1-10 10-20
Velocidad cambio 20 20 20
Tempe a u a (ºC/s)
Modo lec u a Ninguno Indi idual Ninguno
Valo es de lec u a F1 = 1; F2 = 10; F3 = 10
6. Al inaliza el p og ama, se analizan los esul ados comenzando po el con ol posi i o, con inuando el
análisis en caso de que és e ue a co ec o. En caso con a io, se desca a el ensayo.
7. La p esencia o ausencia de una bac e ia se de e mina po la apa ición de una cu a de usión especí ica en e
las sondas y el amplicón de la bac e ia buscada. En el capila co espondien e a dicha bac e ia, las sondas
ma cadas especí icas se uni án sólo con el amplicón de i ado de la bac e ia buscada si és a se encuen a
p esen e y la cu a de usión que se p oduce al inal del p o ocolo, end á una Tm conc e a y única pa a ese
mismo mic oo ganismo. En las condiciones ensayadas, u ilizando las pa ejas de iniciado es iden i icados
como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2 pa a la de ección de L. plan a um, y las pa ejas de sondas ma cadas
compues as po el oligonucleó ido con la SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína y el oligonucleó ido con la
SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640, pa a la de ección de L. plan a um, las Tm co espondien es se
ecogen en la Tabla 4.
TABLA 4
Tm del amplicón y de las sondas
Mic oo ganismo Iniciado es Tm amplicón ±SD (ºC) Tm sondas ±SD (ºC)
L. plan a um SEQ. ID. Nº: 1/ 84,88±0,2 71,10±0,3
SEQ. ID. Nº: 2
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2. Aplicación del mé odo a la de ección de Lac obacillus plan a um en salsa de mayonesa
Se ealizó es e ensayo pa a ilus a la e icacia del mé odo de la in ención en el análisis de un alimen o pa a pone
de mani ies o una posible con aminación. Conc e amen e, se desc ibe el ensayo de una mues a de salsa de mayonesa
en la que se p e ende de ec a una posible con aminación con L. plan a um.
Se ecogen 25 g de la mues a de salsa de mayonesa y se disg egan en un es omache in oducidos en bolsa es-
é il con 225 ml de agua de pep ona amponada (pH 7,2) o medio M.R.S.(pH 7,0) y se incuba a 37ºC en agi ación
du an e 20 ho as. T anscu idas 20 ho as de incubación, pa a ex ae el ADN e en ualmen e p esen e en la mues a
de ensayo, se ex ae una alícuo a de 300 µl con una esina Chelex 100, pa a lo cual, se añaden 300 µl de una sus-
pensión al 10% en agua de Chelex 100, se agi a igo osamen e, se incuba du an e 45 minu os a 45ºC con agi ación
pe iódica de los ubos pa a e i a la p ecipi ación de la esina, se calien a a 95ºC du an e 5 minu os y se cen i u-
ga du an e 5 minu os a 13.000 x g, e i ándose el sob enadan e que se u iliza en el siguien e paso (Ampli icación y
de ección).
El ADN ex aído al como se ha indicado p e iamen e se u iliza á di ec amen e pa a la ampli icación y de ección,
lo que se ealiza en un ubo capila ce ado con un olumen o al de 20 µl. Pa a ello, en cada capila se añaden los
componen es ap opiados de la mezcla de ampli icación en las can idades indicadas en la Tabla 5.
TABLA 5
Mezcla de ampli icación y de ección
Volumen (µl) Concen ación inal
Ligh Cycle -DNA Mas e 2 1X
Solución de MgC122,4 4 mM
Iniciado es (10 µM de cada uno) (a) 1 + 1 0,5 µM
Sondas de hib idación (2 µM) (b) 1 + 1 0,1 µM
H2O (PCR) 9,6 -
ADN ex aído 2 -
Volumen o al 20 -
(a): SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2
(b): SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína y SEQ. ID. Nº: 4 unido a Red640
Una ez que se añadie on odos los componen es, se mezcla on median e un pulso en una mic ocen í uga. A
con inuación, los capila es se coloca on en el ca usel del e mociclado Ligh Cycle (Roche Biochemicals) y ue on
some idos al p oceso de ampli icación y de ección, lo que equie e unos 30 minu os ap oximadamen e. Las condicio-
nes pa a la PCR son las siguien es:
Desna u alización du an e 10 segundos a 98ºC
P o ocolo de Ampli icación:
Pa áme os Valo es
Ciclos 45
Tipo Cuan i icación
Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3
Tempe a u a (ºC) 95 55 72
Tiempo de incubación (s) 0 5 10
Velocidad cambio Tª (ºC/s) 20 20 20
Modo de lec u a Ninguno Indi idual Ninguno
Valo es de lec u a F1=1 F2=10 F3= 10
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T as la ampli icación se aplicó un p og ama pa a calcula la Tm, inc emen ando len amen e la empe a u a (0,1ºC/s)
y midiendo la luo escencia de o ma con inua. Las condiciones ue on las siguien es:
Pa áme os Valo es
Ciclos 1
Tipo Fusión (mel ing)
Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3
Tempe a u a (ºC) 95 50 95
Tiempo de incubación (s) 10 10 0
Velocidad cambio Tª (ºC/s) 20 20 0,1
Modo de lec u a Ninguno Ninguno Con inuo
Valo es de lec u a F1=1 F2=10 F3= 10
Finalmen e se en ió a 40ºC
Pa a in e p e a los esul ados, el so wa e del sis ema analiza au omá icamen e los da os ob enidos, o eciendo los
esul ados en o ma de cu a de in eg ación, pe mi iendo de es e modo ob ene la Tempe a u a de Fusión (Tm) ca ac-
e ís ica de cada p oduc o ampli icado. En es e caso, pa a la de ección de L. plan a um en las condiciones ensayadas,
la Tm sondas es de 71,1ºC.
3. Sensibilidad y especi icidad
Los alo es de sensibilidad y especi icidad ob enidos en el e mociclado Ligh Cycle u ilizando las pa ejas de
iniciado es seleccionadas pa a dicha bac e ia (L. plan a um) se ecogen en la Tabla 6.
TABLA 6
Sensibilidad y especi icidad de las pa ejas de iniciado es
Mic oo ganismo Iniciado es Sensibilidad (%) Especi icidad (%)
L. plan a um SEQ. ID. Nº: 1/ 100 99,1
SEQ. ID. Nº: 2
Asimismo, los alo es de sensibilidad y especi icidad ob enidos en el e mociclado Ligh Cycle u ilizando las
pa ejas de sondas ma cadas seleccionadas pa a cada bac e ia se ecogen en la Tabla 7.
TABLA 7
Sensibilidad y especi icidad de las pa ejas de sondas ma cadas
Mic oo ganismo Sondas Sensibilidad (%) Especi icidad (%)
L. plan a um SEQ. ID. Nº: 3/ 100 99,1
SEQ. ID. Nº: 4
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