Método para la detección e identificación rápida de Lactobacillus plantarum mediante la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

19 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA 11 Núme o de publicación: 2 268 913 21 Núme o de solici ud: 200301407 51 In . Cl.: C12Q 1/10 (2006.01) C12Q 1/68 (2006.01) 12 PATENTE DE INVENCIÓN B1 22 Fecha de p esen ación: 11.03.2002 43 Fecha de publicación de la solici ud: 16.03.2007 Fecha de la concesión: 30.01.2008 45 Fecha de anuncio de la concesión: 16.03.2008 45 Fecha de publicación del olle o de la pa en e: 16.03.2008 62 Núme o de la solici ud inicial: 200200600 73 Ti ula /es: Uni e sidad de Se illa Pabellón de B asil Paseo de las Delicias, s/n 41012 Se illa, ES 72 In en o /es: Paloma es Folia, José Ca los; To es Sánchez, Ma ía José; Paloma es Quesada, Ma ía Concepción; To es Rueda, An onio; San os Rosa, F ancisco y Azna Ma ín, Ja ie 74 Agen e: No cons a 54 Tí ulo: Mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de Lac obacillus plan a um median e la eacción en cadena de la polime asa en iempo eal. 57 Resumen: Mé odo pa a le de ección e iden i icación ápida de Lac o- bacillus plan a um median e la eacción en cadena de la polime asa en iempo eal. El mé odo comp ende (i) p epa a un conjun o de ubos con eniendo cada ubo una mezcla de eacción especí ica pa a la bac e ia a de ec a (L. plan a um), (ii) p og ama n apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli ica- ciones de ácido nucleico e comp ende un e mociclado , una uen e de luz y un senso pa a ob ene un conjun o de señales, (iii) in e p e a las señales ob enidas, y (i ) de e - mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en las mues as ensayadas, median e el empleo de oligonucleó idos (iniciado es y sondas ma cadas) es- pecí icos pa a dicha bac e ia. De in e és especial en la indus ia ag o-alimen a ia y de dis ibución de alimen os, pa a la de ección de bac e ias que de e io an alimen os ales como Lac obacillus plan a um. A iso: Se puede ealiza consul a p e is a po el a . 37.3.8 LP. ES 2 268 913 B1 Ven a de ascículos: O icina Española de Pa en es y Ma cas. Pº de la Cas ellana, 75 – 28071 Mad id 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 DESCRIPCIÓN Mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de Lac obacillus plan a um median e la eacción en cadena de la polime asa en iempo eal. Campo de la in ención La in ención se elaciona, en gene al, con la de ección e iden i icación de bac e ias que de e io an alimen os, ales como Lac obacillus plan a um, median e la eacción en cadena de la polime asa en iempo eal. An eceden es de la in ención La de ección de bac e ias que de e io an alimen os, ales como Lac obacillus plan a um (L. plan a um) iene mu- cho in e és en la indus ia ag oalimen a ia, an o la p oduc o a como la dis ibuido a de p oduc os alimen icios (ma e- ias p imas y/o p oduc os elabo ados), po lo que se han desc i o di e sos mé odos pa a su de ección e iden i icación. El Código Alimen a io Español es ablece una no ma i a en la que, pa a cada alimen o, se especi ican los mic oo - ganismos cuya p esencia debe se de ec ada, así como las écnicas ecomendadas pa a es os análisis. En gene al, es as écnicas u ilizan me odologías con encionales basadas en el cul i o del mic oo ganismo, que equie en el p e-en ique- cimien o en caldo du an e 24-48 ho as, el sub-cul i o en medios selec i os du an e o as 24-48 ho as, y, inalmen e, ealiza una iden i icación bioquímica y de se o ipación, lo que equie e o as 24-48 ho as; es deci , en o al deben anscu i en e 72 y 96 ho as an es de ob ene un esul ado. Po o a pa e, dicha me odología basada en el cul i o del mic oo ganismo no es o almen e iable ya que muchos mic oo ganismos son di íciles de cul i a y, más aún, de cuan i ica , y, po el iempo que emplea, equie e la gos pe íodos de almacenamien o de las ma e ias p imas y de los p oduc os elabo ados, con su co espondien e impac o en los cos es y posible disminución de compe i i idad an o a ni el nacional como in e nacional. Lo mismo ocu e con las emp esas de dis ibución, en especial con las g andes supe icies, que deben almacena g andes can idades de p oduc os, algunos de ellos pe ecede os, así como con las emp esas de hos ele ía que, en nume osas ocasiones, se en pe judicadas po el e aso en el con ol de los alimen os que si en. Po es os mo i os, exis e la necesidad de aumen a la sensibilidad y al mismo iempo la iabilidad y api- dez en la de ección de los mic oo ganismos que pueden llega a de e io a los alimen os, en pa icula , los alimen os p ocesados. En algunos casos se á necesa io sólo aumen a la sensibilidad del mé odo pa a de ec a de o ma iable y ápida la p esencia o ausencia del mic oo ganismo, mien as que, en o os casos se á necesa io, además, cuan i ica los mic oo ganismos e en ualmen e p esen es con el in de es ablece los lími es de concen ación a pa i de los cuales la p esencia del mic oo ganismo puede ep esen a un p oblema pa a la es abilidad del p oduc o alimen icio. En compa ación con los mé odos de cul i o de mic oo ganismos adicionales, las écnicas molecula es, espe- cialmen e la eacción en cadena de la polime asa (PCR) [Saiki, R.K., e al., 1988. Science 239: 487-491] se es án e elando como un mé odo ácil, sensible y en ajoso en su elación cos o-bene icio pa a de ec a la p esencia de mic oo ganismos. Es os mé odos es án desplazando ápidamen e a los mé odos con encionales en el diagnós ico de múl iples en e medades, aunque en el á ea alimen icia es án desa ollando sus p ime os a ances con un alo única- men e cuali a i o. Exis e la necesidad de dispone de un mé odo ápido, que p opo cione esul ados en menos de 24 ho as, p eciso y iable, que pe mi a la de ección cuali a i a y, si se desea, cuan i a i a, de mic oo ganismos con aminan es e en ual- men e p esen es en una mues a de ensayo, y que pe mi a de ec a e iden i ica indi idual o simul áneamen e uno o más de dichos mic oo ganismos. Es e obje i o puede ob ene se median e el empleo de una eacción en cadena de la polime asa en iempo eal (PCR en iempo eal), que comp ende ampli ica el núme o de copias de un agmen o del genoma de un mic oo ganismo y la de ección del p oduc o ob enido en cada paso de la eacción, empleando pa a ello un apa a o e mociclado ápido con de ección a iempo eal que inco po a una conexión a un o denado en el que se encuen a el so wa e necesa io pa a el con ol de odos los p ocesos paso a paso. Se a a de una écnica ecien e cuya p incipal ca ac e ís ica eside en que la ampli icación y el análisis ocu en en el mismo ubo de eacción y se ob iene in o mación du an e odo el iempo en que anscu e la écnica sin necesidad de ene que u iliza isó opos o geles de elec o o esis, lo que pe mi e educi el iempo de de ección de ácidos nucleicos de 5 ho as a 20 minu os. Compendio de la in ención La in ención se en en a, en gene al, con el p oblema de desa olla un mé odo ápido, p eciso y iable, que pe mi a de ec a e iden i ica , bac e ias causan es del de e io o de alimen os, ales como L. plan a um, basado en el empleo de écnicas molecula es. La solución p opo cionada po es a in ención se basa en el diseño y desa ollo de una se ie de eac i os (oligo- nucleó idos iniciado es y sondas especí icos) que, en de e minadas condiciones de eacción, pe mi en ampli ica un agmen o del genoma especí ico de L. plan a um, y de ec a la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en una mues a de ensayo median e PCR en iempo eal. 2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 B e emen e, el mé odo p opo cionado po es a in ención pa a de ec a e iden i ica L. plan a um en una mues a de ensayo, median e PCR en iempo eal, comp ende la ex acción del ADN e en ualmen e p esen e en dicha mues a de ensayo, la ampli icación de una secuencia de inida de ese ADN median e PCR y la de ección con inua de los p oduc os ampli icados. Pa a ealiza dicha ampli icación y de ección es necesa io u iliza una se ie de eac i os y oligonucleó idos (iniciado es y sondas) especí icos. Po an o, pa a ampli ica y de ec a dicho mic oo ganismo se ha diseñado, po una pa e, una pa eja de iniciado es que pe mi en ampli ica una secuencia de nucleó idos diana p esen e en el genoma bac e iano que se desea pone de mani ies o, y, po o a pa e, una pa eja de sondas que pe mi en iden i ica con ce eza dicha secuencia diana, siendo dichas sondas complemen a ias a una egión p esen e en los p oduc os de ampli icación y es ando ma cadas, una de ellas, con un luo ó o o y la o a con un colo an e que cap u a la ene gía libe ada po el luo ó o o y la emi e a su ez en o a longi ud de onda de ec able po el sis ema. El e mociclado ápido con de ección a iempo eal, en cada paso de la eacción ealiza la duplicación del agmen o de ADN median e los iniciado es y una polime asa e mo esis en e y a cada uno de los dos agmen os esul an es se unen las sondas. Es as sondas adhe idas al agmen o de ADN emi i án ene gía a una de e minada longi ud de onda al se exci adas. Es e p oceso (unión de los iniciado es, duplicación del agmen o de ADN, unión de las sondas, de ección ene gía emi ida) se epi e un núme o de e minado de eces, ípicamen e unas 30 eces, ob eniéndose al inal g an can idad del p oduc o ampli icado. Con odas las medidas ealizadas, se ealiza un análisis es adís ico que de e mina el ipo de ADN ampli icado, po ejemplo, median e análisis de la Tempe a u a de Hib idación (Tm) y, si se desea, la concen ación del mismo. Pa a la pues a en p ác ica del mé odo p opo cionado po es a in ención, se equie e un e mociclado ápido a iempo eal, el cual, en una ealización pa icula , es á unido a un sis ema de de ección po luo escencia, lo que pe mi e la moni o ización en iempo eal del p oceso de ampli icación as cada ciclo. Además, el análisis del p oduc o inal de PCR se ealiza una ez e minado el p oceso de ampli icación sin necesidad de ninguna manipulación. Su in eg ación jun o con un o denado pe mi e diseña los p og amas de ampli icación, de ección y análisis de los p oduc os. Un mé odo como el p opo cionado po es a in ención p esen a la en aja de que pe mi e la de ección e iden i ica- ción ápida, ípicamen e en menos de 24 ho as, p ecisa y iable, de L. plan a um, en una mues a de ensayo, así como la cuan i icación de los mic oo ganismos e en ualmen e p esen es en dicha mues a de ensayo Un obje o de es a in ención lo cons i uye un mé odo pa ada de ección e iden i icación de L. plan a um, median- e PCR en iempo eal. Los oligonucleó idos (iniciado es y sondas ma cadas) u ilizados en la ealización de dicho mé odo, así como los ki s que los con ienen cons i uyen obje os adicionales de es a in ención. Desc ipción de allada de la in ención La in ención p opo ciona un mé odo pa a la de ección e iden i icación ápida de L. plan a um, en una o más mues as de ensayo, median e la eacción en cadena de la polime asa (PCR) en iempo eal, en adelan e mé odo de la in ención, que comp ende: a) ex ae el ADN p esen e en dicha mues a o mues as de ensayo; b) p epa a un conjun o de ubos con eniendo cada ubo una mezcla de eacción especí ica pa a dicha bac e ia a de ec a e iden i ica , comp endiendo cada mezcla de eacción los eac i os necesa ios pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica ; c) p og ama un apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli icaciones de ácido nucleico que com- p ende (i) un e mociclado que incluye un elemen o que con iene una plu alidad de o i icios en los que se in oducen dichos ubos que con ienen la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica , (ii) una uen e de luz óp icamen e acoplada a dicho e mociclado y adap ada pa a dis ibui luz sob e dicha plu alidad de o i icios, y (iii) un senso adap ado pa a de ec a simul áneamen e la luz emi ida desde dicha plu alidad de o i icios, con el in de ob ene un conjun o de señales; d) in e p e a dichas señales; y e) de e mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensaya- das; ca ac e izado po que i) la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación especí ica de L. plan a um comp ende un pa de iniciado es iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 3 unida a un luo ó o o y una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 4 unida a un colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda di e en e; y ii) la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensayadas se de e mina po la apa- ición de una cu a de usión especí ica de cada p oduc o ampli icado, ob eniéndose dicha cu a de usión 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 po hib idación de las sondas especí icas pa a la iden i icación de dicha bac e ia con el p oduc o de ampli- icación ob enido en cada ubo, y, si se desea, de e mina la empe a u a de usión ca ac e ís ica de cada p oduc o ampli icado. El mé odo p opo cionado po es a in ención pe mi e de ec a , iden i ica y, si se desea, cuan i ica , bac e ias cau- san es del de e io o de alimen os, ales como L. plan a um, en una o más mues as de ensayo, median e PCR en iempo eal. La mues a de ensayo puede se cualquie mues a que con iene ADN en la que se desea conoce la posible con- aminación po dicha bac e ia. En una ealización pa icula , dicha mues a de ensayo es una mues a de un p oduc o alimen icio, po ejemplo, una mues a de una ma e ia p ima u ilizada en la p oducción de alimen os o una mues a de un p oduc o alimen icio p ocesado. An es de pone en con ac o el ADN de las bac e ias e en ualmen e p esen es en dicha mues a o mues as de ensayo a analiza con la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN, se p ocede a ex ae la o alidad o pa e del ADN p esen e en las mues as de ensayo. La ex acción del ADN se puede ealiza median e mé odos con encionales, incluyendo aquéllos que no p ecisan una pu i icación del ADN ex aído. En una ealización pa icula , la ex acción del ADN se ealizó u ilizando la esina Chelex 100 ( éase el Ejemplo que acompaña a es a desc ipción). Pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención se p epa a un conjun o de ubos, en el que cada ubo con iene una mezcla de eacción especí ica pa a la bac e ia a de ec a e iden i ica (L. plan a um), comp endiendo cada mezcla de eacción los eac i os necesa ios pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica . En gene al, dicha mezcla de eacción con iene los eac i os necesa ios pa a la ealización del mé odo de la in ención, po ejemplo, agua calidad PCR, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un ampón adecuado pa a la eacción de ampli icación enzimá ica, una ADN polime asa e moes able, una sal magnésica, e c., jun o con un pa de iniciado es y un pa de sondas ma cadas especí icos pa a la bac e ia a ensaya . Los iniciado es u ilizados en el mé odo de la in ención pe mi en ampli ica una secuencia de nucleó idos diana o agmen o especí ico del genoma bac e iano que se desea pone de mani ies o. En gene al, puede ampli ica se cual- quie agmen o del genoma bac e iano que pe mi a la iden i icación de una bac e ia, a ni el de géne o o especie, co espondien e. La pa eja de sondas ma cadas pe mi e iden i ica con ce eza dicho agmen o especí ico del geno- ma bac e iano a de ec a y comp enden una secuencia de nucleó idos complemen a ia a una egión p esen e en los p oduc os de ampli icación y un ma cado . En una ealización pa icula , una de dichas sondas es á ma cada con un luo ó o o que ac úa como donado de ene gía y la o a sonda con un colo an e que cap u a la ene gía libe ada po el luo ó o o y la emi e a su ez en o a longi ud de onda de ec able po el sis ema p esen e en el apa a o pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención. En una ealización pa icula , la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación especí ica de L. plan a um comp ende un pa de iniciado es iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 3 unida a un luo ó o o y una sonda iden i icada como SEQ. ID. Nº: 4 unida a un colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda di e en e. Dicho pa de iniciado es SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2 pe mi e la ampli icación de un agmen o de 281 pb del ARN ibosómico (ARN ) de L. plan a um ( egión espaciado a en e los genes de los ARN 16S y 23S). Como luo ó o o puede u iliza se cualquie g upo o sus ancia luo escen e capaz de dona ene gía as se ac i ado, y como colo an e puede u iliza se cualquie compues o capaz de cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y emi i la a una longi ud de onda di e en e. En una ealización pa icula , dicho luo ó o o es luo esceína y dicho colo an e que cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y la emi e a una longi ud de onda di e en e es el colo an e Red640. Ejemplos adicionales de luo ó o os y colo an es que pueden u iliza se pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención se ecogen en la Tabla 1. TABLA 1 Fluo ó o os y Colo an es Ma cado Fluo ó o o Fluo esceína Syb G een TAMRA Colo an e LC Red 640 LC Red 705 Fluo esceína Cy5 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 El mé odo de la in ención se ealiza en un apa a o pa a el con ol simul áneo de múl iples ampli icaciones de ácido nucleico que comp ende (i) un e mociclado que incluye un elemen o que con iene una plu alidad de o i icios en los que se in oducen dichos ubos que con ienen la mezcla de eacción pa a la ampli icación enzimá ica de ADN e iden i icación de la bac e ia a de ec a e iden i ica , (ii) una uen e de luz óp icamen e acoplada a dicho e mociclado y adap ada pa a dis ibui luz sob e dicha plu alidad de o i icios, al como una uen e de adiación láse ; y (iii) un senso adap ado pa a de ec a simul áneamen e la luz emi ida desde dicha plu alidad de o i icios, con el in de ob ene un conjun o de señales, al como un de ec o de luo escencia. Dichos apa a os son conocidos [ éase, po ejemplo, la solici ud de pa en e eu opea EP 640 828 A]. El e mociclado ápido con de ección a iempo eal, en cada paso de la eacción ealiza la duplicación de un agmen o de ADN (secuencia diana p esen e en el genoma bac e iano que se desea de ec a ) median e el empleo de los iniciado es co espondien es y de una polime asa e mo esis en e y, a cada uno de los dos agmen os esul an es, se unen las sondas ma cadas. Es as sondas adhe idas al agmen o de ADN emi i án ene gía a una de e minada longi ud de onda al se exci adas. Es e p oceso (unión de los iniciado es, duplicación del agmen o de ADN, unión de las sondas, de ección ene gía emi ida) se epi e un núme o de e minado de eces, ípicamen e unas 30 eces, ob eniéndose al inal g an can idad del p oduc o ampli icado. Con odas las medidas ealizadas, se ealiza un análisis es adís ico que de e mina el ipo de ADN ampli icado, po ejemplo, median e análisis de la Tempe a u a de Hib idación (Tm) y, si se desea, se de e mina la concen ación del mismo. En una ealización pa icula , el apa a o u ilizado pa a la pues a en p ác ica del mé odo de la in ención comp ende un e mociclado ápido a iempo eal unido a un sis ema de de ección po luo escencia, lo que pe mi e la moni o- ización en iempo eal del p oceso de ampli icación as cada ciclo, al como el e mociclado Ligh Cycle (Roche Biochemicals) [ éase el Ejemplo que acompaña a es a desc ipción]. En es e caso, el análisis del p oduc o inal de PCR se ealiza una ez e minado el p oceso de ampli icación sin necesidad de ninguna manipulación. Su in eg ación jun o con un o denado pe mi e diseña los p og amas de ampli icación, de ección y análisis de los p oduc os. T as in e p e a las señales ob enidas se puede de e mina simul áneamen e la p esencia o ausencia de L. plan a- um. En una ealización pa icula , la p esencia o ausencia de dicha bac e ia en dicha mues a o mues as ensayadas se de e mina po la apa ición de una cu a de usión especí ica de cada p oduc o ampli icado, ob eniéndose dicha cu a de usión po hib idación de las sondas especí icas pa a la iden i icación de dicha bac e ia con el p oduc o de ampli i- cación ob enido en cada ubo. Adicionalmen e, si se desea, se puede de e mina la empe a u a de usión ca ac e ís ica de cada p oduc o ampli icado así como la concen ación del mismo. El mé odo de la in ención pe mi e de ec a , iden i ica y, si se desea, cuan i ica , bac e ias que de e io an alimen- os, ales como L. plan a um, en mues as de ensayo, median e PCR en iempo eal. Po an o, dicho mé odo se puede aplica al análisis mic obiológico de odos los alimen os suscep ibles de se de e io ados po dichas bac e ias, pe mi- iendo su de ección en pocas ho as, gene almen e en menos de 24 ho as, colabo ando de es e modo en ga an iza la es abilidad del p oduc o alimen icio y aco ando el iempo de almacenamien o p e io a la come cialización del mismo. En una ealización pa icula , el mé odo de la in ención se u iliza en la de ección ápida (cuali a i a y cuan i a i a) en alimen os del genoma de bac e ias que causan de e io o en alimen os (L. plan a um). Los alimen os que pueden se analizados pueden se an o ma e ias p imas, po ejemplo, leche, hue os, ca nes, e du as, e c., como sus de i a- dos, alimen os p ocesados o no, acei es, salsas, e c., an o en las emp esas p oduc o as como en las dis ibuido as y hos ele ía. Un mé odo pa a la de ección e iden i icación de bac e ias que de e io an alimen os como el p opo cionado po es a in ención p esen a, en e o as, las siguien es en ajas: a) equie e un iempo sus ancialmen e in e io a los mé odos habi ualmen e u ilizados, ípicamen e 24 ho as en compa ación con los mé odos con encionales que equie en en e 72 y 96 ho as; b) una ez ealizado el p e-en iquecimien o y la ex acción del ADN, odo el p oceso se lle a a cabo en el mismo ubo, e i ando manipulaciones y con aminaciones ex e nas; c) es un mé odo cuan i a i o, que no sólo de ec a e iden i ica las bac e ias e en ualmen e p esen es en una mues a de ensayo sino que pe mi e, además, si se desea, de e mina la concen ación de dichas bac e ias p esen es en la mues a de ensayo; d) es posible su au oma ización comple a; y e) pe mi e ealiza la de ección de a ias bac e ias simul áneamen e. La in ención ambién p opo ciona un oligonucleó ido pa a la de ección e iden i icación de bac e ias causan es de de e io o en alimen os, ales como L. plan a um, en adelan e oligonucleó ido de la in ención, que iene una secuencia de nucleó idos seleccionada del g upo o mado po las secuencias iden i icadas como SEQ. ID. Nº: 1, SEQ. ID. Nº: 2, SEQ. ID. Nº: 3 y SEQ. ID. Nº: 4. Asimismo, la in ención p opo ciona una sonda ma cada, en adelan e sonda ma cada de la in ención, que comp en- 5 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 de (i) un oligonucleó ido, seleccionado del g upo o mado po los oligonucleó idos iden i icados como SEQ. ID. Nº: 3 y SEQ. ID. Nº: 4, y (ii) un ma cado , al como un luo ó o o, po ejemplo, luo esceína, o un colo an e capaz de cap u a la ene gía emi ida po la ac i ación del luo ó o o y emi i la a una longi ud de onda di e en e, po ejemplo, el colo an- e Red640. En una ealización pa icula , dicha sonda ma cada de la in ención se selecciona del g upo o mado po : el oligonucleó ido iden i icado como SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína, el oligonucleó ido iden i icado como SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640, y sus mezclas. La in ención ambién p opo ciona un ki pa a la de ección e iden i icación ápida de L. plan a um, en una o más mues as de ensayo, median e PCR en iempo eal, que comp ende, al menos, un oligonucleó ido de la in ención o una sonda ma cada de la in ención. En una ealización pa icula , dicho ki comp ende los oligonucleó idos iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2, y las sondas ma cadas compues as po el oligonucleó ido SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína y el oligonucleó ido SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640. En gene al, los ki de la in ención con ienen la pa eja de iniciado es co espondien es a la bac e ia a de ec a ( L. plan a um) en un ubo indi idualizado, al igual que la pa eja de sondas ma cadas pa a dicha bac e ia, con el in de pode elegi en e ealiza la de ección de una sola bac e ia (usando solo el ubo de sus iniciado es y el de sus sondas ma cadas), o bien pa a la de ección simul ánea de dicha bac e ia y o a bac e ia que de e io a alimen os, po ejemplo, Bacillus ce eus, dependiendo de las necesidades. Los ki s p opo cionados po es a in ención pueden p esen a se en o ma de es uche con eniendo, además de unos ecipien es con uno o más de dichos oligonucleó idos y/o sondas ma cadas mencionados p e iamen e, unos ecipien es con la o alidad o pa e del es o de eac i os necesa ios pa a la ealización del mé odo en cues ión, po ejemplo, agua ul apu a, dNTPs (dATP, dCTP, dGTP y dTTP), un ampón adecuado pa a la eacción de ampli icación enzimá ica, una ADN polime asa e moes able (po ejemplo, ADN polime asa Taq), una sal magnésica (po ejemplo, clo u o magnésico), e c. Adicional y opcionalmen e, los ki s p opo cionados po es a in ención pueden inclui unos ecipien es con ADN de L. plan a um, pa a su empleo como con oles posi i os. El siguien e ejemplo ilus a la in ención y no debe se conside ado como limi a i o del alcance de la misma. Ejemplo 1 De ección e iden i icación de L. plan a um en un p oduc o alimen icio median e PCR en iempo eal 1. Ma e iales y Mé odos El equipo diagnós ico diseñado pa a la de ección de L. plan a um en p oduc os alimen icios consis e en a ios ubos con eniendo cada uno de ellos los iniciado es, sondas ma cadas, ADN polime asa e moes able, solución de MgCl2y agua bides ilada es é il, necesa ios pa a lle a a cabo el mé odo de ampli icación diseñado pa a dicho equipo. En es e caso conc e o, el equipo u ilizado incluye odos los componen es básicos pa a la ealización de la ampli icación de has a 100 mues as y con oles. El ADN con ol p o is o es á compues o po una mezcla del ADN ex aído de cepas de labo a o io de odas las bac e ias a de ec a . La pa eja de iniciado es co espondien es a la bac e ia a de ec a se p esen a en un ubo indi idualizado, al igual que la pa eja de sondas ma cadas pa a dicha bac e ia. Pa a la ealización del mé odo se ha u ilizado una mic ocen i uga, un e mociclado Ligh Cycle (Roche Bioche- micals), unas mic opipe as y unas pun as de mic opipe as con il o. La plani icación del mé odo se ecoge en la Tabla 2. Aunque el iempo de manipulación se ha calculado pa a una sola mues a, se pueden manipula a ias mues as simul áneamen e sin apenas inc emen a los iempos. TABLA 2 Plani icación del mé odo Paso Manipulación (min) Tiempo (min) P epa ación mezcla de eac i os y ubos de la eacción. 5 10 Colocación en el e mociclado Reacción PCR 20-40 30-50 Análisis de da os 0-5 5-10 Tiempo o al del ensayo 45-60 6 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 El mé odo puede ealiza se siguiendo el p o ocolo es ánda que se desc ibe a con inuación: 1. Toma de mues a (25 g del p oduc o) y p epa ación median e p e-en iquecimien o en agua de pep ona amponada du an e 20-24 ho as a 37ºC. 2. Ex acción del ADN median e su ex acción con un mé odo iable, po ejemplo, usando la esina Chelex 100. 3. Ampli icación y de ección: Se p epa a un capila con eniendo los componen es necesa ios pa a la eacción, ADN polime asa e moes able, los cua o dNTPs, MgCl2, ADN ex aído de la mues a, iniciado es y sondas ma cadas especí icos pa a la bac e ia que se desea de ec a . Adicionalmen e, se p epa a un ubo con el ADN con ol y los iniciado es y sondas de la(s) bac e ia(s) a de ec a . 4. Coloca los capila es p epa ados en el e mociclado a iempo eal y p og ama la ealización del p oceso de ampli icación y de ección: empe a u a, iempo, núme o de ciclos y momen o de lec u a según el esquema. 5. Inicia el p og ama ( éase la Tabla 3). TABLA 3 P og ama Pa áme os Valo es Ciclos 45 Tipo Cuan i icación Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3 Tempe a u a (ºC) 95 55 72 Tiempo incubación (s) 0 1-10 10-20 Velocidad cambio 20 20 20 Tempe a u a (ºC/s) Modo lec u a Ninguno Indi idual Ninguno Valo es de lec u a F1 = 1; F2 = 10; F3 = 10 6. Al inaliza el p og ama, se analizan los esul ados comenzando po el con ol posi i o, con inuando el análisis en caso de que és e ue a co ec o. En caso con a io, se desca a el ensayo. 7. La p esencia o ausencia de una bac e ia se de e mina po la apa ición de una cu a de usión especí ica en e las sondas y el amplicón de la bac e ia buscada. En el capila co espondien e a dicha bac e ia, las sondas ma cadas especí icas se uni án sólo con el amplicón de i ado de la bac e ia buscada si és a se encuen a p esen e y la cu a de usión que se p oduce al inal del p o ocolo, end á una Tm conc e a y única pa a ese mismo mic oo ganismo. En las condiciones ensayadas, u ilizando las pa ejas de iniciado es iden i icados como SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2 pa a la de ección de L. plan a um, y las pa ejas de sondas ma cadas compues as po el oligonucleó ido con la SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína y el oligonucleó ido con la SEQ. ID. Nº: 4 unido al colo an e Red640, pa a la de ección de L. plan a um, las Tm co espondien es se ecogen en la Tabla 4. TABLA 4 Tm del amplicón y de las sondas Mic oo ganismo Iniciado es Tm amplicón ±SD (ºC) Tm sondas ±SD (ºC) L. plan a um SEQ. ID. Nº: 1/ 84,88±0,2 71,10±0,3 SEQ. ID. Nº: 2 7 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 2. Aplicación del mé odo a la de ección de Lac obacillus plan a um en salsa de mayonesa Se ealizó es e ensayo pa a ilus a la e icacia del mé odo de la in ención en el análisis de un alimen o pa a pone de mani ies o una posible con aminación. Conc e amen e, se desc ibe el ensayo de una mues a de salsa de mayonesa en la que se p e ende de ec a una posible con aminación con L. plan a um. Se ecogen 25 g de la mues a de salsa de mayonesa y se disg egan en un es omache in oducidos en bolsa es- é il con 225 ml de agua de pep ona amponada (pH 7,2) o medio M.R.S.(pH 7,0) y se incuba a 37ºC en agi ación du an e 20 ho as. T anscu idas 20 ho as de incubación, pa a ex ae el ADN e en ualmen e p esen e en la mues a de ensayo, se ex ae una alícuo a de 300 µl con una esina Chelex 100, pa a lo cual, se añaden 300 µl de una sus- pensión al 10% en agua de Chelex 100, se agi a igo osamen e, se incuba du an e 45 minu os a 45ºC con agi ación pe iódica de los ubos pa a e i a la p ecipi ación de la esina, se calien a a 95ºC du an e 5 minu os y se cen i u- ga du an e 5 minu os a 13.000 x g, e i ándose el sob enadan e que se u iliza en el siguien e paso (Ampli icación y de ección). El ADN ex aído al como se ha indicado p e iamen e se u iliza á di ec amen e pa a la ampli icación y de ección, lo que se ealiza en un ubo capila ce ado con un olumen o al de 20 µl. Pa a ello, en cada capila se añaden los componen es ap opiados de la mezcla de ampli icación en las can idades indicadas en la Tabla 5. TABLA 5 Mezcla de ampli icación y de ección Volumen (µl) Concen ación inal Ligh Cycle -DNA Mas e 2 1X Solución de MgC122,4 4 mM Iniciado es (10 µM de cada uno) (a) 1 + 1 0,5 µM Sondas de hib idación (2 µM) (b) 1 + 1 0,1 µM H2O (PCR) 9,6 - ADN ex aído 2 - Volumen o al 20 - (a): SEQ. ID. Nº: 1 y SEQ. ID. Nº: 2 (b): SEQ. ID. Nº: 3 unido a luo esceína y SEQ. ID. Nº: 4 unido a Red640 Una ez que se añadie on odos los componen es, se mezcla on median e un pulso en una mic ocen í uga. A con inuación, los capila es se coloca on en el ca usel del e mociclado Ligh Cycle (Roche Biochemicals) y ue on some idos al p oceso de ampli icación y de ección, lo que equie e unos 30 minu os ap oximadamen e. Las condicio- nes pa a la PCR son las siguien es: Desna u alización du an e 10 segundos a 98ºC P o ocolo de Ampli icación: Pa áme os Valo es Ciclos 45 Tipo Cuan i icación Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3 Tempe a u a (ºC) 95 55 72 Tiempo de incubación (s) 0 5 10 Velocidad cambio Tª (ºC/s) 20 20 20 Modo de lec u a Ninguno Indi idual Ninguno Valo es de lec u a F1=1 F2=10 F3= 10 8 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 ES 2 268 913 B1 T as la ampli icación se aplicó un p og ama pa a calcula la Tm, inc emen ando len amen e la empe a u a (0,1ºC/s) y midiendo la luo escencia de o ma con inua. Las condiciones ue on las siguien es: Pa áme os Valo es Ciclos 1 Tipo Fusión (mel ing) Segmen o 1 Segmen o 2 Segmen o 3 Tempe a u a (ºC) 95 50 95 Tiempo de incubación (s) 10 10 0 Velocidad cambio Tª (ºC/s) 20 20 0,1 Modo de lec u a Ninguno Ninguno Con inuo Valo es de lec u a F1=1 F2=10 F3= 10 Finalmen e se en ió a 40ºC Pa a in e p e a los esul ados, el so wa e del sis ema analiza au omá icamen e los da os ob enidos, o eciendo los esul ados en o ma de cu a de in eg ación, pe mi iendo de es e modo ob ene la Tempe a u a de Fusión (Tm) ca ac- e ís ica de cada p oduc o ampli icado. En es e caso, pa a la de ección de L. plan a um en las condiciones ensayadas, la Tm sondas es de 71,1ºC. 3. Sensibilidad y especi icidad Los alo es de sensibilidad y especi icidad ob enidos en el e mociclado Ligh Cycle u ilizando las pa ejas de iniciado es seleccionadas pa a dicha bac e ia (L. plan a um) se ecogen en la Tabla 6. TABLA 6 Sensibilidad y especi icidad de las pa ejas de iniciado es Mic oo ganismo Iniciado es Sensibilidad (%) Especi icidad (%) L. plan a um SEQ. ID. Nº: 1/ 100 99,1 SEQ. ID. Nº: 2 Asimismo, los alo es de sensibilidad y especi icidad ob enidos en el e mociclado Ligh Cycle u ilizando las pa ejas de sondas ma cadas seleccionadas pa a cada bac e ia se ecogen en la Tabla 7. TABLA 7 Sensibilidad y especi icidad de las pa ejas de sondas ma cadas Mic oo ganismo Sondas Sensibilidad (%) Especi icidad (%) L. plan a um SEQ. ID. Nº: 3/ 100 99,1 SEQ. ID. Nº: 4 9