UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MOLUSCOS HOSPEDEIROS INTERMEDIÁRIOS DE
TREMÁTODES: ESTUDO MOLECULAR DE Helisoma sp.
(GASTROPODA; PLANORBIDAE) DE DIFERENTES ÁREAS
GEOGRÁFICAS
Débo a dos San os Co eia
2011
UNIVERSIDADE NOVA DE LISBOA
INSTITUTO DE HIGIENE E MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MOLUSCOS HOSPEDEIROS INTERMEDIÁRIOS DE
TREMÁTODES: ESTUDO MOLECULAR DE Helisoma sp.
(GASTROPODA; PLANORBIDAE) DE DIFERENTES ÁREAS
GEOGRÁFICAS
Tese ap esen ada pa a a ob enção do g au
de Mes e em Ciências Biomédicas,
especialidade de Biologia Molecula em
Medicina T opical e In e nacional
O ien ado a:
P o ª Dou o a Ma ia Manuela Calado
Co-O ien ado a:
P o ª Dou o a Ma ia Amélia G ácio
2011
Publicações no âmbi o des e abalho:
Co eia, D; Calado, M; A onso, A; Fe ei a, P; Fe ei a, C; Pin o, A; Mau ício, I &
G ácio, M.A.A. 2010. ANÁLISE MOLECULAR APLICADA AO DNA
MITOCONDRIAL E À REGIÃO ITS DO DNA RIBOSSOMAL DE MOLUSOS DA
FAMÍLIA PLANORBIDAE, POTENCIAIS HOSPEDEIROS INTERMEDIÁRIOS DE
TREMÁTODES. Ac a Pa asi ológica Po uguesa, 17 (2): 42
AGRADECIMENTOS
i
Ag adecimen os
Foi sem dú ida uma expe iência única a ealização des e p ojec o. Ao longo
des es dois anos i e a opo unidade de conhece e abalha com pessoas
ex ao diná ias, a odas elas o meu since o ag adecimen o:
À P o esso a Dou o a Ma ia Amélia G ácio, pela disponibilidade que semp e e e
pa a comigo, pelos conhecimen os pa ilhados sob e Malacologia e pelo igo na
co ecção des e abalho;
À P o esso a Dou o a Ma ia Manuela Calado, pelos ensinamen os labo a o iais e
eó icos e p incipalmen e po e sido o meu g ande supo e ao longo des e p ojec o;
À Técnica Especialis a Isabel Clemen e, pela suas pala as de amizade nos bons e
maus momen os e po oda a ajuda que me deu quando eu necessi ei;
À P o esso a Dou o a Isabel Mau ício e à In es igado a Dou o a Ana A onso,
pelos ensinamen os e apoio na á ea da Biologia Molecula ;
Aos Mes es Cá ia Fe ei a, Ped o Fe ei a e Síl ia Bea o pelos imensos concelhos
que me de am e po me auxilia em em udo o que eu p ecisei desde o p imei o
momen o;
À In es igado a Auxilia Alcione T inca, pelos momen os de aleg ia e boa
disposição;
À P o esso a Aida Es e es, ao Dou o José Simões e ao Mes ando An ónio Pin o,
pelo Ma e ial Biológico que me o nece am pa a a ealização des e abalho;
A oda a Unidade de Helmin ologia e Malacologia Médicas, pelo acolhimen o e
apoio que me de am;
À minha mãe, po se um exemplo pa a mim e po me e incen i ado a segui
semp e o meu caminho mesmo que es e pa eça di ícil de pe co e ;
À minha amília e às minhas i mãs do co ação, Ana Ru e, Raquel e Madalena po
odo o apoio que me de am ao longo da minha ida e p incipalmen e nes es dois anos;
Ao P o esso Dou o Ge mano de Sousa po me e dado a opo unidade de aze
es e p ojec o e po semp e me e enco ajado a e mina-lo;
AGRADECIMENTOS
Ao Ca los po nunca me e ei o desis i dos meus sonhos;
A odos aqueles que de alguma o ma con ibuí am pa a es e p ojec o, pela
amizade e apoio que me oi dado semp e que p ecisei;
E po im, a Deus po nunca me e abandonado e po es a semp e p esen e na
minha ida.

RESUMO
i
Resumo
Ao longo dos empos a ca ac e ização
das di e en es espécies da classe Gas opoda
basea a-se apenas em ca ac e ís icas eno ípicas (mo ologia da concha e pa es moles),
as quais e am insu icien es pa a dis ingui espécies e subespécies. Assim, a
ca ac e ização gené ica desen ol ida nos úl imos anos, em-se mos ado uma boa
e amen a aplicada á di e enciação molecula de espécies, pe mi indo uma melho
comp eensão sob e moluscos com um impo an e papel como hospedei os
in e mediá ios de emá odes e qual a sua posição den o da amília Plano bidae.
Os objec i os des e abalho o am, po um lado aze um es udo compa a i o
de populações de Helisoma sp., de Po ugal e Cabo Ve de, baseado num es udo
molecula u ilizando ma cado es molecula es, nomeadamen e o gene COI do DNA
mi ocond ial (m DNA) e o gene 16S do RNA ibossomal ( RNA) e a egião in e na
ansc i a (ITS) do DNA ibossomal, e eco endo à écnica PCR-RFLP, di eccionada
pa a a egião ITS pa a a iden i icação de possí eis polimo ismos e, po ou o lado
es abelece uma elação ilogené ica en e as populações po uguesas e cabo e dianas
de Helisoma e ou os plano bideos, hospedei os in e mediá ios de emá odes.
Os esul ados ob idos, pa a os genes em análise pe mi i am a iden i icação de
ês egiões dis in as: Cabo Ve de, Madei a e Po ugal Con inen al, es a úl ima o mada
pelas amos as de Alga e e Coimb a, apesa da dis an e geog á ica que sepa a cada
umas des as duas á eas.
Os esul ados ob idos pa a os genes COI e 16S e pa a a egião ITS, mos a am
uma ele ada homologia com as espécies Helisoma i ol is e H. du yi.
ABSTRACT
ii
Abs ac
O e ime he cha ac e iza ion o di e en species o he Class Gas opoda has
solely been based on pheno ypic cha ac e s (mo phology o he shell and so pa s),
which we e insu icien o dis inguish some species and subspecies.
Thus, gene ic cha ac e iza ion, de eloped in ecen yea s, has p o ed a good ool
o he molecula di e en ia ion o species, allowing a be e unde s anding o molluscs
ha ha e an impo an ole as in e media e hos s o ema odes and o hei posi ion
wi hin he amily Plano bidae.
The aims o his esea ch we e o make a compa a i e s udy o popula ions o
Helisoma sp, om Po ugal and Cape Ve de, based on a molecula s udy using
molecula ma ke s, including he COI gene o mi ochond ial DNA (m DNA) and 16S
ibosomal RNA ( RNA) and he in e nal ansc ibed space (ITS) o ibosomal DNA,
and using PCR-RFLP o he ITS egion o iden i y possible polymo phisms, and on he
o he hand o es ablish he phylogene ic ela ion be ween popula ions o Helisoma
om Po ugal and Cap Ve de and o he Plano bidae in e media e ho s o ema odes.
The esul s o he genes unde analysis allowed he iden i ica ion o h ee
dis inc egions: Cape Ve de, Madei a and mainland Po ugal, he la e o med by he
s ains o Alga e and Coimb a, despi e he geog aphical dis ance ha sepa a es each
one o hese wo a eas. The esul s ob ained o he genes COI and mi ochond ial 16S
DNA and he ITS egion showed high homology o he species Helisoma i ol is and
H. du yi.
ÍNDICE GERAL
iii
AGRADECIMENTOS i
RESUMO i
ABSTRACT ii
ÍNDICE GERAL iii
ÍNDICE FIGURAS x
ÍNDICE TABELAS xiii
ABREVIATURAS xi
CAPÍTULO 1
1. INTRODUÇÃO 2
1.1.Dados his ó icos sob e os moluscos
2
1.2.Classi icação Taxonómica da amília Plano bidae
3
1.3.Géne o Plano ba ius F o iep, 1806
6
1.3.1. Ca ac e ís icas Mo ológicas e Ana ómicas do Plano ba ius me idjensis 6
1.3.2. Plano ba ius me idjensis: Impo ância em Pa asi ologia 7
1.3.3. Dis ibuição geog á ica do Plano ba ius me idjensis 8
1.4. Géne o Helisoma Swainson, 1840 8
1.4.1. Ca ac e is icas Mo ologicas e Ana ómicas do géne o Helisoma 8
1.4.2. Impo ância do géne o Helisoma 10
1.4.3. Dis ibuição geog á ica do géne o Helisoma 12
1.5. Impo ância da Biologia Molecula aplicada ao es udo da amília
Plano bidae 13
1.5.1. PCR 13
1.5.2. Ma cado es molecula es 14
1.5.2.1. DNA mi ocond ial 14
1.5.2.2. DNA ibossomal 16
1.5.3.
RFLP - PCR 17
CAPÍTULO 2
2. OBJECTIVOS 19
ÍNDICE GERAL
ix
CAPÍTULO 3
3. MATERIAL E MÉTODOS 21
3.1. Ob enção de Moluscos 21
3.2. Iden i icação Mo ológica dos Moluscos 21
3.3. Dissecção de Moluscos 21
3.4. Ex acção do DNA genómico 21
3.5.
Quan i icação do DNA genómico 22
3.6. Ampli icação do DNA genómico 22
3.7. Aplicação de enzimas de es ição pa a a análise de polimo ismos -
PCR-RFLP 25
3.8.Pu i icação e sequenciação das amos as 26
3.9. Análise molecula das amos as 26
CAPÍTULO 4
4. RESULTADOS 28
4.1. Polimo ismos do gene 16S do RNA ibossomal ( RNA)
28
4.1.1. Di e sidade Molecula
28
4.1.2. Dis ibuição e análise dos haplo ipos
29
4.1.3. Análise ilogené ica 32
4.2. Polimo ismos do gene COI do DNA mi ocond ial (m DNA) 34
4.2.1. Di e sidade Molecula
34
4.2.2. Dis ibuição e análise dos haplo ipos
35
4.2.3. Análise ilogené ica
38
4.3. Polimo ismos da Região In e na T ansc i a (ITS) do DNA ibossomal 40
4.3.1. Di e sidade Molecula
40
4.3.2. Dis ibuição e análise dos haplo ipos
41
4.2.3. Análise ilogené ica 44
4.4. Aplicação de enzimas de es ição à Região ITS 46
CAPÍTULO 5 48
5. DISCUSSÃO E CONCLUSÕES 49
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 54
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
2
1. INTRODUÇÃO
1.1. DADOS HISTÓRICOS SOBRE OS MOLUSCOS
Como hospedei os in e mediá ios de emá odes, os moluscos são um g upo
mui o as o, cujos ósseis mos am que eles ocupa am um luga impo an e, en e os
demais habi an es do plane a Te a, desde os empos geológicos mais an igos. São se es
essencialmen e aquá icos, (com habi a s em ma es, lagos e ios), endo alguns se
adap ado à ida e es e (Malek & Cheng, 1974 e G ácio, 1981)).
Os moluscos (Filo Mollusca), de aco do com es udo de ósseis, e iam su gido
na e a no pe íodo Câmb ico, po an o há ce ca de 600 milhões de anos (G ácio, 1981
& Kloos & Da id., 2002). O núme o ac ual de espécies de moluscos não é conhecido
mas pensa-se que es eja mui o p óximo de 150.000, es ando ce ca de 80.000 incluídas
na Classe Gas opoda (Malek & Cheng, 1974). Pode-se conclui , a a és des es
núme os, que os moluscos se encon am en e os animais com mais possibilidade de
sucesso, dado que apa ecem em odos os ipos de “nichos” ecológicos, desde as
p o undidades abissais dos oceanos, às mais á idas egiões e es es.
Só com Swamme dam (1737) se eio a conhece o papel dos moluscos como
hospedei o in e mediá ios de pa asi as, e é a pa i des a al u a que os biólogos
começam a in e essa -se pela Malacologia Médica (G ácio, 1981).
Es e in e esse eio a aumen a nos ins do século XIX com a descobe a, pelo
alemão Bilha z, do Schis osoma, causado da bilha ziose esical (1851) e com o
conhecimen o de que aquele pa asi a necessi a no seu ciclo de ida de um molusco de
água doce como hospedei o in e mediá io (G ácio, 1981).
Dado que a Malacologia, es a a ligada a doenças de ca ác e menos “agudo”,
só mui o len amen e se oi impondo, sendo que apenas no século XX, começou a se
econhecida como uma impo an e á ea de Biologia Aplicada e da Pa asi ologia (Malek
& Cheng, 1974 e G ácio, 1981).

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
3
1.2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÓMICA DA FAMÍLIA PLANORBIDAE
Ao eco da mos alguns moluscos mais conhecidos como ca acóis, lesmas,
pol o, choco, os as, mexilhões, e c., azemos, a é ce o pon o, ideia da a iação de
o mas que podemos encon a no Filo Mollusca.
Os moluscos Plano bidae são cons i uídos po , cabeça, pé, massa isce al e
man o e não possuem segmen ação. A cabeça aloja os ó gãos dos sen idos ( en áculos e
olhos) e inclui o bolbo bucal onde se encon a a ádula (es e é um ó gão exclusi o dos
moluscos). O pé ep esen a a egião en al do saco de mo- isce al, pa icula men e
o e e mui as ezes p olongada. A massa isce al é uma olumosa p o ube ância da
egião do sal, que aloja a maio ia dos ó gãos. E po im o man o ou palio, egião da
“pele” que seg ega a concha e cob e a massa isce al, e que ap esen a uma dob a
salien e, o cola do man o, que o ma uma ca idade, a ca idade paleal, na qual es ão
alojados os ó gãos espi a ó ios e nalguns casos os o i ícios exc e o es e sexuais (Malek
& Cheng, 1974).
Sendo assim, o Filo Mollusca engloba seis classes (Tabela 1), das quais
apenas a emos e e ência à classe Gas opoda pela sua impo âcia em Medicina.
Tabela 1 – Classes do Filo Mollusca.
Classes
Filo Mollusca
Monoplacopho a
Amphineu a
Bi al ia
Scaphopoda
Cephalopoda
Gas opoda
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
4
Po sua ez, es a classe di ide-se em ês subclasses (Tabela 2) das quais
apenas abo da emos a subclasse Pulmona a.
Tabela 2 – Subclasses da Classe Gas opoda.
Subclasses
Filo Mollusca Classe Gas opoda
P osob anchia a
Opis hob anchia a
Pulmona a
Os pulmonados são p incipalmen e ca acóis e es es e de água doce. Alguns,
con udo, são ma inhos e de águas salob as. Não possuem b ânquias e uma pa e da
ca idade do man o unciona como um pulmão, po ap esen a nume osos asos
sanguíneos e daí a designação de pulmonados. A concha, quando p esen e, possui a
o ma de uma espi al simples e egula . Os pulmonados são he ma odi as,
no malmen e o ípa os, mas po ezes o o i ípa os (Malek & Cheng. 1974 e Malek,
1980)
A subclasse Pulmona a es á di idida em ês o dens (Tabela 3). Des as ês
apenas ala emos da o dem Basomma opho a.
Tabela 3 – O dens da Subclasse Pulmona a.
O dens
Filo Mollusca Classe Gas opoda Subclasse Pulmona a
Sys ollomma opho a
S ylomma opho a
Basomma opho a
Os memb os des a o dem são na sua maio ia ca acóis de água doce, mas
exis em alguns e es es ou apenas ma inhos. Possuem um pa de en áculos con ác eis
em que os olhos se encon am na base. A concha é cónica, discoidal ou pa eli o me
( o ma de lapa). A egião geni al masculina e eminina ab em sepa adamen e pa a o
ex e io , mas ambas es ão localizadas mui o pe o uma da ou a (Malek & Cheng,
1974).
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
5
Den o da o dem Basomma opho a exis em á ias amílias (Tabela 4) en e
elas encon a-se a Família Plano bidae.
Tabela 4 – Famílias da o dem Basomma opho a.
Famílias
Filo
Mollusca
Classe
Gas opoda
Subclasse
Pulmona a
O dem
Basomma opho a
Siphona idae
Gadiniidae
Ellobiidae
Ca ychiidae
Ancylidae
Physidae
Lymnaeidae
Ac oloxidae
Chilinidae
Plano bidae
A amília Plano bidae é uma das amílias mais impo an es do pon o de is a
da saúde pública. A concha é discoidal, sinis al (ul adex al) e pode se globosa ou
isóide. O animal é sini al com as abe u as pulmona es e geni ais si uadas no lado
esque do. Os en áculos são longos, ili o mes e cilínd icos, com olhos si uados na base.
A es u u a do complexo penial é a iá el, mas cons i uído semp e de um p epúcio e de
um saco é gico. A ádula é cons i uída po um den e bicúspide cen al, den es la e ais
g andes e bi ou icúspides e os den es ma ginais são comp idos, es ei os e
mul icúspides. Uma pseudob ânquia, odeada pelo cola do man o, al amen e
ascula izada es á p esen e do lado esque do. Os memb os des a amília possuem
hemoglobina na sua hemolin a e po conseguin e es a ap esen a uma co a e melhada
(Malek & Cheng, 1974).
A Família Plano bidae engloba á ios géne os dos quais des acamos:
- Plano ba ius F o iep, 1806;
- Helisoma Swainson, 1840.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
6
1.3. GÉNERO Plano ba ius F o iep, 1806
Do géne o Plano ba ius apenas a emos e e ência à espécie Plano ba ius
me idjensis Fo bes, 1838.
1.3.1. Ca ac e ís icas Mo ológicas e Ana ómicas do Plano ba ius
me idjensis
O P. me idjensis (Figu a 1), é um molusco de água doce, ap esen a uma concha
(Figu a 2) discóide, ágil, espi a o mada po ês a qua o ol as a edondadas, com
es ias ans e sais e longi udinais. As es ias longi udinais são inas e mais apa en es
nas p imei as ol as. Ap esen a uma su u a p o unda e bas an e umbilicada na ace
supe io e quase plana na ace in e io . A abe u a é de g andes dimensões, a edondada
e um pouco oblíqua. A concha de co ama ela pálida pode, con udo ap esen a -se
esb anquiçada e anslúcida e a epide me um pouco espessa e cas anha escu a (Medei os
& Simões., 1985).
Os diâme os oscilam en e 13 a 17mm (diâme o maio ) e 6 a 10 mm
(diâme o meno ).
Figu a 1 - Plano ba ius me idjensis (Fo og a ia da au o a).
1 mm
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
7
Figu a 2- Ca ac e ís icas da concha do Plano ba ius me idgensis (Fo og a ias
da au o a).
A ádula do P. me idjensis al como a de qualque Plano bidae é uma
memb ana ca ilaginosa, a edondada na ex emidade an e io . Fica si uada den o do
bolbo bucal pe o da sua ex emidade pos e io . A ex emidade an e io é isí el a a és
da boca quando o ca acol se alimen a. A sua supe ície supe io es á cobe a po
pequeníssimos den es, dispos os em inúme as iadas ans e sais. Cada iada ans e sal
é compos a po um den e cen al de con o no apezoidal, p o ido de duas cúspides
iangula es com é ices aguçados. De ambos os lados do den e cen al dispõem-se os
den es la e ais, em núme o de no e, p o ido de ês cúspides aguçadas nas
ex emidades, uma cúspide cen al, o mesocone, mais la go que as duas cúspides
la e ais, o ec ocone e o endocone. Aos den es la e ais seguem-se os den es in e médios,
em núme o de qua o e cuja con igu ação é idên ica à dos an e io men e desc i os mas
mais alongados e p o idos de um mesocone (Aze edo e al., 1954).
1.3.2. Plano ba ius me idjensis: impo ância em Pa asi ologia
P. me idjensis, desempenha um impo an e papel como hospedei o
in e mediá io de Schis osoma haema obium no No e de Á ica (Yacoubi e al, 1999),
de S. bo is em Salamanca (Ramajo-Ma in & Simon-Vicen e, 1988), no Sudão, com
alguns casos desc i os (Touassem & Jou dane, 1986) e oi hospedei o na u al de S.
haema obium no Alga e (Be encou e al, 1921, Be encou & Bo ges, 1922, F ança,
1923 e Aze edo e al. 1948). Pa a escla ece o papel des es moluscos, na ansmissão de
Schis osoma sp, á ios abalhos expe imen ais o am ealizados nas úl imas décadas
(Oli ei a e al, 1974, Sil a e al 1977, Sou hga e e al, 1984, Kechemi & Combes, 1988
e Zekhnini, e al, 1997).
1 mm

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
8
1.3.3. Dis ibuição geog á ica do Plano ba ius me idjensis
P. me idjensis em uma dis ibuição geog á ica limi ada a duas zonas
Medi e ânicas: do Medi e âneo No e a é à Península Ibé ica e do Medi e âneo Sul
a é Ma ocos e A gélia.
Em Po ugal, P. me idjensis em uma ampla dis ibuição geog á ica podendo
encon a -se, p a icamen e, ao longo de odo o e i ó io (Nob e, 1941 e G ácio, 1981).
1.4. GÉNERO Helisoma Swainson, 1840
O géne o Helisoma inclui á ias espécies, sendo algumas delas hospedei os
in e mediá ios de emá odes (Malek & Cheng, 1974).
1.4.1. Ca ac e is icas Mo ologicas e Ana ómicas do géne o Helisoma
As espécies do géne o Helisoma (Figu a 3), êm uma concha discóide, com
espi a mode adamen e aumen ada, com ol as que se podem ap esen a anguladas ou
a edondadas no meio. A abe u a é de g andes dimensões, em o ma de sino
(campanulada) (Figu a 4). Ap esen am uma co a e melhada e a epide me um pouco
espessa e cas anha escu a. Os diâme os oscilam en e 13 a 20 mm (Malek & Cheng,
1974).
Hospedei os in e mediá ios de emá odes:
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas
Figu a
Figu a 4 –
Ca ac e ís icas da concha do géne o
No apa elho geni al dos m
p epúcial
bem desen ol ida em o ma de chá ena, a
cana
l espe má ico, a glândula da p ó
leque (ou em ole em co e ans e
dispos os em iadas
simples ao longo do canal da p ó
al., 2007). Na Figu a 5
Helisoma i ol is (
Malek &
Hospedei os in e mediá ios de emá odes:
es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas
geog á icas
Figu a
3- Helisoma sp. (Fo og a ia da au o a)
.
Ca ac e ís icas da concha do géne o
Helisoma
sp.(Fo og a ias da
au o a).
No apa elho geni al dos m
emb os des e géne o dis ingue-
se
bem desen ol ida em o ma de chá ena, a
pa i da qual se
es ende um longo
l espe má ico, a glândula da p ó
s a a é mul iplamen e di e iculada em o ma de
leque (ou em ole em co e ans e
sal) e os di e ículos da p ó
s a a são sacos simples
simples ao longo do canal da p ó
s a a
(B own, 1994
ap esen amos como exemplo o apa elho ep odu i o
Malek &
Cheng, 1974).
1 mm
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
9
.
sp.(Fo og a ias da
se
uma glândula
es ende um longo
s a a é mul iplamen e di e iculada em o ma de
s a a são sacos simples
(B own, 1994
e Ibikounlé e
ap esen amos como exemplo o apa elho ep odu i o
de
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
10
Figu a 5 – Apa elho geni al de Helisoma i ol is (Imagem adap ada de Malek
& Cheng, 1974).
1.4.2. Impo ância do géne o Helisoma
O géne o Helisoma em indo a se aplicado cada ez mais, como modelo, pa a
a iados es udos, como, po exemplo, es udos neu obiológicos (Jiménez, e al. 2006;
Va oulis, e al. 2007 e Goldbe g, e al. 2008), eco oxicológicos, an o em o os
(Tchounwou, e al. 1991), e em o mas emb ioná ias (Aboul-Ela & Khalil, 1987 e Cole
e al. 2002), como em es adios ju enis e adul os (A hu , e al. 1987 e Cama go &
Alonso 2007). Es e ac o de e-se em pa e, á sua dis ibuição geog á ica, á sua
Canal
espe má ico
Glândula p os á ica
Ó iduc o
Ú e o
Recep áculo do
saco seminal
Vesícula seminal
Saco é gico
Glândula do
canal p epucial
Canal he ma odi a
Canal
espe má ico
Ó iduc o
Vagina
O o és is
Canal he ma odi a
Abe u a geni al masculina
P epúcio Abe u a geni al eminina
Glândula da
albumina
Musculo
penial
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
1
INTRODUÇÃO
11
pa icipação na cadeia ó ica em ambien es aquá icos e ambém á sua cápsula
anspa en e, onde se podem obse a os á ios es adios emb ioná ios.
Os memb os do géne o Helisoma são hospedei os in e mediá ios de um g ande
núme o de espécies de ema ódes, nomeadamen e, do géne o Echinos oma (Malek &
Cheng, 1974). Na Figu a 6, es á esquema izado um ciclo de ida de Echinos oma
sp.,mos ando o papel que aquele molusco desempenha como hospedei o in e mediá io.
O
o
Adul o
Mi acídio
Rédia
mãe
Rédia
ilha
Ce cá ia
Espo ocis o
Me ace cá ia
Hospedei o de ini i o
(Animais)
P imei o hospedei o in e mediá io
(memb os do géne o Helisoma )
Segundo
hospedei o
in e mediá io
Figu a 6
– Esquema do ciclo de ida do
Echinos oma sp.
(Esquema adap ado
de Knaap & Loke , 1990)
CAPÍTULO 2- Objec i os

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
Capí ulo
2
OBJECTIVOS
19
2. OBJECTIVOS
A al a a iabilidade mo ológica e gené ica, o amanho eduzido de alguns
espécimes e a simila idade in e especí ica di icul a e o na, mui as ezes, di ícil a
co ec a iden i icação das espécies.
Face a es a si uação, écnicas molecula es começa am a se u ilizadas como
e amen as adicionais à iden i icação mo ológica e ana ómica pa a escla ecimen o da
co ec a iden i icação.
No que e e e á amília Plano bidae, onde es ão incluídas á ias sub amílias, o
ecu so a es udos molecula es o na-se, em ge al, absolu amen e necessá io,
conside ando que nelas se encon am hospedei os in e mediá ios de pa asi as de
humanos e animais, conc e amen e, na sub amília Helisoma inae, o géne o Helisoma.
Es e géne o, com p o á el o igem na Amé ica do No e, oi in oduzido nou os
Con inen es. Assim, Helisoma sp. oi ecen emen e, colhido, na na u eza, em colecções
de água doce de Po ugal Con inen al (Alga e e Coimb a), da Madei a e de Cabo
Ve de.
O objec i o ge al da p esen e in es igação oi aze um es udo compa a i o das
populações de Helisoma de habi a s po ugueses e cabo e dianos, baseado num es udo
molecula u ilizando ma cado es molecula es, nomeadamen e o gene COI do DNA
mi ocond ial (m DNA) e o gene 16S do RNA ibossomal ( RNA) e a egião in e na
ansc i a (ITS) do DNA ibossomal,e eco endo á écnica PCR-RFLP, di eccionada
pa a a egião ITS pa a a iden i icação de polimo ismos das amos as.
O objec i o especí ico oi p ocu a es abelece a elação ilogené ica en e
populações po uguesas e cabo e dianas de Helisoma e ou os plano bideos
hospedei os in e mediá ios de emá odes.
CAPÍTULO 3 – Ma e ial e Mé odos
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. OBTENÇÃO DE MOLUSCOS
Os moluscos Helisoma sp. o am seleccionados alea o iamen e a pa i de
qua o colónias man idas na Unidade de Helmin ologia e Malacologia Médica do
Ins i u o de Higiene e Medicina T opical/UNL. Os moluscos que de am o igem às
colónias o am colhidos em Cabo Ve de, Ilha da Madei a e em dois habi a s de Po ugal
Con inen al, localizados em Coimb a e Alga e, espec i amen e.
3.2. IDENTIFICAÇÃO MORFOLÓGICA DOS MOLUSCOS
A iden i icação mo ológica dos moluscos oi baseada na compa ação das
ca ac e ís icas das conchas e ana omia dos ó gãos ep odu i os e do ubo enal, de 15
exempla es, pa a cada um dos locais de colhei a em es udo, com as ca ac e ís icas de
espécies de Helisoma e e idas po Malek & Cheng (1974) e Pa aense (2003).
3.3. DISSEÇÃO DE MOLUSCOS
Os moluscos o am p e iamen e colocados numa solução anes ésica (em sais
de men ol), pa a elaxamen o du an e 4 a 6 ho as e de seguida o am sac i icados
a a és de choque é mico em água a 70°C. Um agmen o da egião ce alopodal oi
colocado em e anol a 70% e gua dado a -70C°, a é à análise molecula .
3.4. EXTRACÇÃO DE DNA GENÓMICO
A ex acção genómica do DNA o al oi ei a de aco do com o p o ocolo
desc i o po S o ha d e al. (1996), com as seguin es al e ações: em ubos es é eis de 1,5
ml p e iamen e iden i icados, colocou-se a zona ce alopodal do molusco, adicionou-se
700 µl de Tampão CTAB – (Ce yl ime hylammonium B omide, Amnesco ®-
C
9
H
42
NB
) que oi p e iamen e aquecido na es u a a 65⁰C e po im adicionou-se, nos
mesmos ubos, 10 µL de P o einase K. Com o auxílio de um homogeneizado ,
homogeneizou-se a mis u a a é odos os ecidos ica em comple amen e dissol idos no
ampão. As amos as o am colocadas na es u a a 65⁰C, du an e 90 minu os, com
agi ação de 20 em 20 minu os. Após os 90 minu os de incubação adiciona am-se 700 µl
de Cho o o m/Isoamylalchol (24:1), ez-se a agi ação po in e são sua e du an e 2
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
22
minu os. Cen i ugou-se apidamen e, pa a que hou esse sepa ação da ase aquosa da
ase o gânica. Com o auxílio de uma pipe a de Pas eu e i ou-se a ase aquosa pa a
no os ubos es é eis de 1,5 ml, adicionou-se 1 ml de e anol absolu o a 4⁰C e mis u ou-se
po in e são. Cen i ugou-se du an e 15 minu os a 1600 pm (He mle Z 160H). Após a
cen i ugação o sob enadan e oi decan ado e adiciona am-se 500 ml de e anol a 70%,
pa a la agem do “pelle ” e ol ou-se a cen i uga nas mesmas condições desc i as
an e io men e. O sob enadan e oi decan ado uma ez mais e e i ado o excesso com a
ajuda de uma pipe a de Pas eu , os ubos o am colocados na es u a a 65⁰C num
máximo de 10 minu os, pa a e apo ação comple a do e anol. Po im, o am
adicionados 50 µl de ampão TE (T is EDTA, pH /7) e agi ou-se o ubo a é comple a
dissolução do “pelle ”. Os p odu os da ex acção o am a mazenados a -20⁰C.
3.5. QUANTIFICAÇÃO DO DNA GENÓMICO
As amos as de DNA genómico dos moluscos o am analisados em gel de
aga ose 1% em ampão TAE (40 mM T is-Ace a o, 1 mM EDTA, ph 8,0), con endo 8µl
de B ome o de E ídio (0,5 µgml
-1
). A isualização de DNA ez-se no ansluminado
(AlphaImage ®HP, Alpha Inno ech) com luz ul a- iole a (UV). A quan i icação de
DNA em como inalidade e i ica a in eg idade e qualidade das amos as. As amos as
o am seleccionadas a a és das bandas ob idas num gel de aga ose a 1%. Elimina am-
se odas as amos as que não ap esen a am uma banda isí el.
3.6. AMPLIFICAÇÃO DO DNA GENÓMICO
A ampli icação do DNA genómico oi ei a u ilizando a PCR. As eacções de
ampli icação o am ei as a a és do Ki Illus a
TM
puReTaq Ready-To-Go PCR Beads
(GE Heal hca e).
O Ki Illus a
TM
puReTaq Ready-To-Go PCR “Beads” (GE Heal hca e), é
cons i uído po ubos de 0.2 ml que con ém “Beads”, às quais oi adicionado, 2µl da
amos a diluída, 1µl de P ime
1
, 1µl de P ime
2
e 21µl de H
2
O, pa a pe aze um olume
o al de 25µl.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
23
Pa a as eacções de ampli icação dos genes COI e 16S e da egião ITS o am
u ilizados os oligonucleó idos desc i os na Tabela 5.
Tabela 5 – Sequências dos oligonucleó idos u ilizados pa a a ampli icação dos
genes, CO1, 16S e ITS.
Gene
Sequência do Oligonucleó ido
Au o es
COI 1 (Fwd) 5`- GGT CAA CAA ATC ATA AAG ATA
TTG G 3`
Folme e al.,
1994
COI 2 (R s) 5`- TAA ACT TCA GGG TGA CCA AAA
AAT CA 3`
ITS 1 (Fwd) 5` - TGC TTA AGT TCA GCG GGT- 3` Kane &
Rollinson.,
1994
ITS 2 (R s) 5`- TAA CAA GGT TTC CGT AGG TGA A -
3`
16S 1 (Fwd) 5´- CGC CTG TTT ATC AAA AAC AT-3` Pip &
F anck.,
2008
16S 2 (R s) 5`- CCG GTC TGA ACT CAG ATC ACG T- 3`
Pa a as mesmas eacções de ampli icação o am aplicados os ciclos desc i os
na Tabela 6.

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
24
Tabela 6 – Condições é micas da PCR pa a os di e en es genes ampli icados.
Gene E apas dos ciclos de
ampli icação T°/h N° Ciclos
CO1
Desna u ação inicial 95°C-5 min 1
1ª E apa 95°C-15 seg
37 Ex ensão In e na 58°C-30 seg
2ª E apa 72°C-90 seg
Ex ensão inal 72°C-5 min 1
16S
Desna u ação inicial 95°C-5 min 1
1ª E apa 94°C-1 min
37 Ex ensão In e na 50°C-1 min
2ª E apa 72°C-2 min
Ex ensão inal 72°C-5min 1
ITS
Desna u ação inicial 95°C-5 min
32
1ª E apa 95°C-45 seg
Ex ensão In e na 54°C-1 min
2ª E apa 72°C-2 min
Ex ensão inal 72°C-5min 1
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
25
3.7. APLICAÇÃO DE ENZIMAS DE RESTRIÇÃO PARA A ANÁLISE
DE POLIMORFISMOS-PCR-RFLP.
Nes e es udo u ilizou-se apenas um ipo de enzima de es ição, agmen ando
em locais especí icos o DNA ampli icado, da egião ITS, con o me indica a seguin e
Tabela 7:
Tabela 7- Enzima de es ição u ilizada pa a o es udo da egião ITS.
Enzima
Sequência
Local de cli agem
Alu I
5´-AGCT-3´
3´-TCGA-5´
5´-AG↓CT-3´
3´-TC↓GA-5´
Num ubo es e ilizado adiciona am-se 8,0 µl de p odu o ampli icado, 0,1 µl da
enzima, 1,0 µl do ampão ( o necido pela casa come cial), 1,0 µl de BSA ( ampão) e 6,9
µl de água desionizada, pe azendo um olume inal de 15 µl. Homogeneizou-se e ez-
se uma cen i ugação ápida. Incubou du an e 4 ho as a 37º C e, pos e io men e,
inac i ou-se a ac i idade da enzima du an e 20 minu os a 65ºC.
Após a inac i ação da enzima de es ição oi ei a uma elec o o ese em gel de
aga ose a 2,5% em solução ampão TAE (40mM T is-Ace a o, 1mM EDTA, pH 8,0)
con endo 0,5 µgml-1 de b ome o de e ídeo. A mig ação das moléculas de DNA oi
a aliada po compa ação com as de um ma cado de amanho molecula de 2000 pb
(Hyppe Ladde II, Bioline). As amos as o am p epa adas com 5µl de p odu o da PCR
subme ido à acção da enzima de es ição ao qual oi adicionado 1µl de ampão (Azul
de B omo enol com glice ol). A mig ação oi ei a a 100V, du an e ap oximadamen e
60 minu os. Os agmen o de DNA o am isualizados após exposição a aios
ul a iole a (Alphalmage ®HP, Alpha Inno ech).
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp. (Gas opoda;
Plano didae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
3
MATERIAL E MÉTODOS
26
3.8. PURIFICAÇÃO E SEQUENCIAÇÃO DAS AMOSTRAS
Os p odu os da PCR o am pu i icados usando colunas de pu i icação
come cializadas pela Qiagen Inc (QIAquick PCR pu i ica ion Ki p o ocol).
O p ocesso de pu i icação das amos as oi ei o segundo o p o ocolo desc i o
pela casa come cial, endo-se ob ido, como p odu o inal, 50 µl de DNA concen ado e
pu i icado. Os p odu os da PCR ampli icados e pu i icados o am en iados pa a
se iços de sequenciação da emp esa STAB VIDA (ITQB, Oei as, Po ugal).
As sequências nucleo ídicas pa ciais ob idas, pa a os genes COI, 16S e ITS,
o am analisadas a a és do p og ama Basic Local Alignmen Sea ch Tool” (Blas )
(www.ncbi.nlm.nih.go /BLAST), pe mi indo des a o ma a pesquisa de sequências
semelhan es disponí eis nas bases de dados públicas, como a GenBack (Na ional Cen e
o Bio echnology In o ma ion, NCBI).
Os alinhamen os das sequências nucleo ídicas dos p odu os da PCR
sequenciados o am e ec uados usando o p og ama de alinhamen o múl iplo Clus al W
(Thompson e al., 1994), ainda que alguns ajus es enham sido in oduzidos
manualmen e.
3.9. ANÁLISE MOLECULAR DAS AMOSTRAS
As sequências ob idas, bem como as que se ob i e am em ecu so ao GenBack
o am alinhadas, com o apoio do p og ama Clus al W (Thompson e al., 1994), ainda
que alguns ajus es enham sido in oduzidos manualmen e, á pos e io . Os es udos de
in e e ência ilogené ica, o am ealizados com o auxílio do p og ama Mega 3.1
(Kuma , e al. 2004), onde se calcula am as ma izes de dis ância gené ica, de inidas
pelo modelo dos dois pa âme os de Kimu a e cons uídas as espec i as á o es pelo
mé odo de “neighbo joining” (junção de izinhos), pa a cada um dos genes analisados.
Os alo es de con iança, pa a os amos indi iduais da á o e, o am de e minados po
análise de “boo s ap” ob idos com 1000 éplicas alea ó ias dos dados. A es ima i a do
núme o médio de di e ença nucleo ídica (K), a di e sidade nucleo ídica (π) e a
di e sidade haplo ípica (Hd) o am analisados de aco do com Nei (1987) em apoio do
p og ama DNASP 4.10. (Rozas, e al., 2003).
CAPÍTULO 4- Resul ados
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
34
hospedei os in e mediá ios de Schis osoma spp e de ou os emá odes, in e idas pela análise
das sequências pa ciais do gene 16S a a és do mé odo “neighbo joining”, ende po base as
dis âncias gené icas calculadas pelo modelo Kimu a2-pa âme os. Os núme os sob e os amos
indicam os alo es de con iança, de e minados po análise de “boo s ap” com 1000 éplicas.
4.2. Polimo ismos do gene COI do DNA mi ocond ial (m DNA)
4.2.1. Di e sidade molecula
Os esul ados, da analise de 30 exempla es de moluscos, de qua o á eas geog á icas,
(Alga e, n=8; Coimb a, n=8; Madei a, n=8 e Cabo Ve de, n=6), mos a am em odas as amos as
agmen os com ap oximadamen e 800 pb. A Figu a 14 mos a os p odu os da PCR ampli icados
ao gene COI pa a os moluscos das di e en es á eas.
Figu a 14. – Visualização do gel de aga ose a 1% pa a os p odu os da PCR ampli icados pa a
o gene COI. (1-19 algumas das amos as es udadas pa a di e en es á eas geog á icas).
As amos as pa a as quais a PCR ou a sequenciação não p oduziu esul ados, o am e i adas
do es udo. As médias das bases nucleó idicas ap esen adas o am de 12,9 % pa a a ci osina, 43,6 %
pa a imina, 20,85 % pa a a adenina e 22,57 % pa a a guanina. A equência A+T encon ada oi
ele ada, com 64,45 %. A Tabela 11 mos a a composição nucleó idica das amos as pa a cada á ea
geog á ica em es udo.
~800 pb
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
35
Tabela 11. Dis ibuição das pe cen agens de nucleó idos encon ados nas sequências
analisadas pa a o gene COI.
4.2.2. Dis ibuição e análise dos haplo ipos
As sequências analisadas, ainda que pa ciais, ap esen a am 9 (no e) haplo ipos dis in os.
Os exempla es do Alga e ap esen a am 4 haplo ipos dis in os (Hap1, Hap7, Hap8 e Hap9),
enquan o que os de Cabo Ve de ap esen a am 3 haplo ipos (Hap2, Hap4 e Hap6). Os exempla es
de Coimb a e da Madei a mos a am-se monomó icos po ap esen a em um único haplo ipo, o
haplo ipo 3 (Hap3) e o haplo ipo 5 (Hap5), espec i amen e. A dis ibuição e equência ela i a
dos haplo ipos encon ados nas di e en es á eas geog á icas analisadas es ão desc i as na Tabela 12.
Tabela 12 - Dis ibuição e equências ela i as dos haplo ipos iden i icados no gene COI
nos di e en es exempla es em es udo.
C% T% A% G%
Alga e 17,77 38,94 27,93 15,36
Cabo Ve de 12,30 44,04 19,54 24,12
Coimb a 12,50 44,53 17,97 25,00
Madei a 9,38 46,88 17,97 25,78
Média 12,99 43,60 20,85 22,57
Alga e
Cabo Ve de
Coimb a
Madei a
Hap1
0,25
Hap2
0,5
Hap3
1,00
Hap4
0,25
Hap5
1,00
Hap6
0,25
Hap7
0,25
Hap8
0,25
Hap9
0,25
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
36
Na Tabela 13, es ão desc i os os haplo ipos encon ados nas di e en es á eas geog á icas, o
núme o médio de di e enças nucleó idicas (K), a di e sidade nucleo idica (π) e a di e sidade
haplo ipica (Hd).
Tabela 13. – Índice de polimo ismos do gene COI.
O cálculo da di e sidade nucleó idica (π
ππ
π) pa a as amos as das di e en es á eas geog á icas
ema análise ap esen ou um baixo índice de polimo ismo π=0,0631. A di e sidade haplo ipica (Hd)
oi de 0,955 no seu conjun o, endo Cabo Ve de ap esen ado meno di e sidade haplo ipica
Hd=0,83.
Após sequenciação, as amos as que se mos a am incong uen es o am e i adas do
es udo. Como consequência o núme o de amos a icou bas an e eduzido. Con udo, com base nas
sequências pa ciais ob idas oi cons uída uma á o e pelo mé odo de junção de izinhos (“neighbo
joining”), endo po base as dis âncias gené icas calculadas pelo modelo de dois pa âme os de
Kimu a.
A á o e ob ida ap esen a a o mação de ês amos dis in os. O p imei o amo é o mado
pelos exempla es de Cabo Ve de, demons ando uma elação de p oximidade en e eles. O segundo
Haplo ipos
KHd
Alga e
Hap 1;
Hap 7,
Hap 8; Hap 9 6,450 0,124
1,000
Cabo Ve de
Hap2; Hap 4,
Hap 6
6,5 0,0125 0,83
Coimb a
Hap 3
Madei a
Hap 5;
To al
9 Haplo ipos
32,77 0,0631 0,955
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
37
amo es á di idido em dois sub- amos o mados pelos exempla es da Madei a supo ado po um
alo de “boo s ap” de 99% e pelos exempla es de Coimb a com um alo de “boo s ap” de 75%.
Po im, no e cei o amo es ão ep esen adas as populações de Alga e com um alo de
“boo s ap” de 100%. Aqui, ao con á io dos esul ados ob idos pa a o gene 16S, os esul ados
ob idos pa a o gene COI mos am que as populações do Alga e e Coimb a ap esen am-se
gene icamen e mais dis an es (Figu a 15).
Figu a 15 - Relação en e as populações de moluscos, pela análise das sequências pa ciais do
gene COI a a és do mé odo “neighbo joining”, endo po base as dis âncias gené icas
calculadas pelo modelo Kimu a2-pa âme os. Os núme os que se encon am sob e os amos
indicam os alo es de con ianças, de e minados po análise de “boo s ap” com 1000 éplicas.
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Madei a
Madei a
Coimb a
Coimb a
Alga e
Alga e
100
99
92
88
75
70
0.02
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
38
4.2.3. Análise ilogené ica
A análise ilogené ica das sequencias pa ciais das amos as em es udo ob idas pa a o gene
COI do DNA mi ocond ial (m DNA), oi ealizada em conjun o com as sequências homólogas
disponí eis no GenBank, a a és da cons ução de á o es pelo mé odo de junção de izinhos
(“neighbo joining”), endo po base as dis âncias gené icas calculadas pelo modelo de dois
pa âme os de Kimu a.
A análise demons ou a o mação de dois amos dis in os (Figu a 16). O p imei o amo es á
di idido em dois sub- amos. O p imei o é o mado pelas espécies pe encen es ao géne o
Biomphala ia, supo ado po um alo de “boo s ap” de 100% e o segundo sub- amo, o mado
pelas espécies pe encen es ao géne o Bulinus, ao qual ambém pe encem as espécies pe encen es
ao géne o Plano bis (= Plano ba ius) e uma ou a espécie ambém ela hospedei a in e mediá ia de
Schis osoma sp., Fe issia i ula is.
No segundo amo es á incluído o conjun o das espécies pe encen es ao géne o Helisoma,
ep esen a i o das di e en es á eas. Associado a es e amo encon am-se as espécies Plano bella
i ol is e P. unue, supo ado po um alo de “boo s ap” de 100%, o mando um g upo
pa a ilé ico. Ancylus sp unciona como um g upo ex e no pa a a á o e ilogené ica.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
39
Figu a 16. – Relação ilogené ica en e as á ias populações de moluscos pe encen es ao géne o
Helisoma pa a as di e en es á eas geog a ias em es udo e ou as espécies de moluscos, hospedei os
in e mediá ios de Schis osoma spp e de ou os emá odes, in e idas pela análise das sequências
pa ciais do gene COI a a és do mé odo “neighbo joining”, ende po base as dis âncias gené icas
calculadas pelo modelo Kimu a-2 pa . Os núme os sob e os amos indicam os alo es de con iança,
de e minados po análise de “boo s ap” com 1000 éplicas.
Biomphala ia
sudanica
Biomphala ia sudanica
Biomphala ia smi hi
Biomphala ia choanomphala
Biomphala ia
angulosa
Biomphala ia
alexand ina
Biomphala ia
p ei e i
Bulinus
o skalii
Bulinus
nasu us
nasu us
Fe issia
i ula is
Plano ba ius
co neus
Plano bis
co neus
Cabo e de
Cabo e de
Cabo e de
P
lano bella
i ol is
Madei a
Madei a
Plano bella unue
Coimb a
C
oimb a
Alga e
Alga e
Ancylus
sp.
100
99
73
34
44
61
100
27
41
29
94
98
83
47
42
100
87
98
0.02
Biomphala ia Bulinus

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
40
4.3. Polimo ismos da Região In e na T ansc i a (ITS) do DNA ibossomal
4.3.1. Di e sidade molecula
Os esul ados, da analise de 30 exempla es de moluscos, de qua o á eas geog á icas,
(Alga e, n=8; Coimb a, n=8; Madei a, n=8 e Cabo Ve de, n=6), mos a am em odas as amos as
agmen os com ap oximadamen e 800 pb. A Figu a 17 mos a os p odu os da PCR ampli icados
pa a a egião ITS pa a os moluscos das di e en es á eas.
As amos as que não ampli ica am o am e i adas do es udo. A composição nucleo ídica
das sequências oi de 29,35 % pa a ci osina, 28,77 % pa a imina, 18,47 % pa a adenina e 23,41 %
pa a guanina, com a iação geog á ica (Tabela 14). A equência A+T encon ada oi ele ada, com
47,24 %.
Figu a 17 – Visualização do gel de aga ose a 1% pa a os p odu os da PCR ampli icados pa a
a egião ITS (1-14 - algumas das amos as es udadas pa a di e en es á eas geog á icas).
Tabela 14. Dis ibuição das pe cen agens de nucleó idos encon ados nas sequências
analisadas pa a a egião ITS.
M
~1200 pb
C% T% A% G%
Alga e 27,06 30,91 15,25 26,79
Cabo Ve de 32,2 27,58 25,93 14,29
Coimb a 29,21 30,04 14,19 26,56
Madei a 28,94 26,56 18,5 26,01
Média 29,35 28,77 18,47 23,41
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
41
4.3.2. Dis ibuição e análise dos haplo ipos
As sequências analisadas, ainda que pa ciais, ap esen a am 15 haplo ipos dis in os. Nos
exempla es do Alga e o am iden i icados qua o haplo ipos (Hap1, Hap3, Hap7 e Hap14) e nos
exempla es de Coimb a iden i ica am-se seis haplo ipos (Hap2, Hap4, Hap5, Hap6, Hap8 e
Hap15).
Na Madei a e Cabo Ve de o am iden i icados ês haplo ipos, Hap11, Hap12 e Hap13 e
Hap8, Hap9 e Hap10, espec i amen e.
O haplo ipo 8 (Hap8) oi o único haplo ipo comum às amos as de Cabo Ve de e Coimb a.
A dis ibuição e equência ela i a dos hapló ipos encon ados nas di e en es á eas geog á icas
analisadas es ão desc i as na Tabela 15.
Tabela 15 - Dis ibuição e equências ela i as dos hapló ipos iden i icados na egião ITS
nas di e en es á eas em es udo.
Alga e
Cabo Ve de
Coimb a
Madei a
Hap1 0,25
Hap2 0,167
Hap3 0,25
Hap4 0,167
Hap5 0,167
Hap6 0,167
Hap7 0,25
Hap8 0,6
0,167
Hap9 0,2
Hap10 0,2
Hap11 0,333
Hap12 0,333
Hap13 0,333
Hap14 0,25
Hap15 0,167
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
42
Na Tabela 16, es ão desc i os os hapló ipos encon ados nas di e en es á eas geog á icas, o
núme o médio de di e enças nucleó idicas (K), a di e sidade nucleo ídica (π) e a di e sidade
haplo ípica (Hd). A di e sidade nucleó idica (π
ππ
π) na amos a o al oi baixa (π=0,054), sendo um
g au de magni ude mais baixa pa a cada população indi idualmen e. A Madei a ap esen ou o maio
π, ce ca do dob o do Alga e e Cabo Ve de. A di e sidade haplo ípica (Hd) oi de 0,96 no seu
conjun o, sendo Cabo Ve de a população com meno di e sidade haplo ípica Hd=0,700.
Tabela 16 – Índice de polimo ismos da egião ITS
As sequências pa ciais ob idas pa a a egião ITS, o am usadas pa a p oduzi uma á o e
ilogené ica pelo mé odo de junção de izinhos (“neighbo joining”), endo po base as dis âncias
gené icas calculadas a a és do modelo de dois pa âme os de Kimu a. A á o e ob ida, indica que
os exempla es de Cabo Ve de o mam um único amo mos ando uma baixa di e sidade gené ica
en e eles, enquan o que os exempla es da Madei a ap esen am uma maio dis ância gené ica
ela i amen e aos ou os exempla es. As amos as do Alga e e de Coimb a ap esen am uma
dis ância gené ica mais baixa. (Figu a 18).
Haplo ipos
K
π
ππ
π
Hd
Alga e
Hap1; Hap3,
Hap7; Hap14
26,833 0,038 1,000
Cabo Ve de
Ha
p8; Hap9,
Hap10 1,200 0,0017
0,700
Coimb a
Hap2; Hap4,
Hap5;Hap6;
Hap8;Hap15
15,130 0,0219
1,000
Madei a
Hap11; Hap12,
Hap13 89.66 0,146 1,000
To al
15 Haplo ipos
37,3 0,054 0,96
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas.
Capí ulo
4
RESULTADOS
43
Figu a 18 - Análise ilogené ica das amos as de moluscos com base em sequências pa ciais
da egião ITS. Mé odo de ag upamen o de “neighbo joining”, com base nas dis âncias
gené icas calculadas pelo modelo Kimu a2-pa âme os. Os núme os que se encon am sob e
os amos indicam os alo es de con iança, em pe cen agem, de e minados po análise de
“boo s ap” com 1000 éplicas.
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Cabo Ve de
Coimb a
Coimb a
Coimb a
Alga e
Alga e
Alga e
Alga e
Alga e
Coimb a
Coimb a
Alga e
Alga e
Alga e
Madei a
Madei a
100
57
52
98
23
72
100
71
48
35
21
46
39
18
25
34
0.01
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
CAPÍTULO
5
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
50
We he by, 1879 mos ou se , em condições labo a o iais, um compe ido biológico da
Biomphala ia p e e i, (F ansden, 1979).
O p esen e abalho pe mi iu ap esen a as p imei as sequências, ainda que pa ciais, pa a os
genes COI e 16S do ADN mi ocond ial, assim como pa a a egião ITS do ADN ibossomal, de
moluscos p o enien es de á ias á eas geog á icas Po ugal Con inen al, Madei a e Cabo Ve de e,
pa alelamen e, es uda as suas elações ilogené icas com ou as espécies pe encen es à mesma
amília (Plano bidae).
Pa a os dois genes mi ocond iais (16S e COI) em es udo, oi obse ada uma p opo ção
maio pa a o pa Timina - Adenina (T+A), com 68,4% e 64,55%, espec i amen e, enquan o que
pa a o pa Guanina – Ci osina (G+C) as pe cen agens o am de 38,7% e 45,66%, espec i amen e.
Es a pa ece se uma ca ac e ís ica dos genes mi ocond iais de algumas espécies de in e eb ados
(Da is e al, 1996 ci po S o ha d e al, 2002).
Po ou o lado, pa a a egião ITS oi encon ada uma maio p opo ção pa a o pa Guanina –
Ci ocina (T+C) do que pa a o pa Timina – Adenina, com 52,76% e 47,24 %, espec i amen e.
Nes e es udo o am iden i icados seis haplo ipos pa a o gene 16S, no e haplo ipos pa a o
gene COI e 15 haplo ipos pa a a egião ITS. Os moluscos p o enien es da egião do Alga e o am
os que mos a am se mais polimó icos pa a o gene COI e ITS, com ês e qua o haplo ipos,
espec i amen e. Po ou o lado, os exempla es de Coimb a ap esen a am apenas um haplo ipo pa a
o gene COI e 16S, espec i amen e. O gene 16S oi o que ap esen ou o meno núme o de
haplo ipos, num o al de seis pa a odas as amos as de cada uma das populações em es udo,
mos ando se assim, mais conse ado do que os ou os dois genes.
Es es esul ados são semelhan es aos ob idos em ou os es udos sob e a iabilidade gené ica
en e populações de B. glab a a, onde oi e i icado um g ande polimo ismo en e as populações
man idas em condições labo a o iais, suge indo que uma manu enção p olongada das espécies em
labo a ó io pode a o ece o apa ecimen o de polimo ismos (Mul ey & V ijenhoek, 1981).
A di e sidade haplo ípica é um índice que e lec e a p obabilidade de dois haplo ipos
escolhidos ao acaso numa população se em di e en es, enquan o que a di e sidade nucleo idica
e lec e a p obabilidade de dois nucleó idos homólogos escolhidos ao acaso se em di e en es numa
população (Nei & Li, 1979). Nenhum dos genes ap esen ou uma ele ada di e sidade nucleo idica.

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
CAPÍTULO
5
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
51
A média da di e sidade nucleo idica (π) encon ada pa a o gene 16S oi 0,0159, pa a o gene COI
oi 0,0631 e pa a a egião ITS oi 0,054.
Obse ou-se um haplo ipo comum pa a o gene 16S, o haplo ipo dois (Hap 2) que oi
encon ado nos exempla es do Alga e, de Coimb a e da Madei a. Pa a a egião ITS, o haplo ipo
oi o (Hap 8) oi comum nos exempla es de Cabo Ve de e de Coimb a. Pa a o gene COI não oi
obse ado nenhum gene comum en e as populações es udadas. Es a ca ac e ís ica pode á es a
elacionada com o ac o do gene 16S se mais conse ado e ap esen a uma meno di e sidade
nucleo ídica. Já o gene COI ap esen ou-se mais a iá el, o que pode se explicado po acumulação
de mu ações sem a in luência de ecombinação ou con e são génica.
A es u u a populacional dos moluscos Plano bidae ca ac e iza-se po uma al a a iabilidade
gené ica in e populacional e baixa a iabilidade in apopulacional, de ido à ausência ou baixo luxo
génico en e as populações (Ja ne & Dalay, 1991). O ipo de ep odução ca ac e ís ico des e
plano bídios, a au o ecundação, le a a um aumen o da homozigo ia, e po an o a meno di e sidade,
a não se quando as condições ambien ais são des a o á eis (Pa aense, 1955 ci po Campos e al,
2002). Nes e caso, os moluscos de água doce he ma odi as cons i uem um modelo biológico
ele an e no es udo e olu i o do sis ema ep odu i o, de ido ao ac o de na mesma espécie
pode em oco e dois ipos de ep odução: au o ecundação e ecundação c uzada (Ange s e al,
2003 e Cha bonnel e al, 2002 e 2005).
Nas á o es ilogené icas cons uídas com base nas dis âncias gené icas calculadas pa a o
gene 16S, os exempla es de Cabo Ve de e Madei a o ma am dois g upos obus os, com um supo e
es a ís ico bas an e al o (87% e 98%), e um e cei o g upo o mado pelos exempla es de Coimb a e
Alga e, com um supo e es a ís ico de 99%, es es bas an e homogéneos apesa da dis ância
geog á ica en e eles. Pa a os es an es dois genes, COI e ITS, o ma am-se os mesmos g upos, com
um al o apoio de boo s ap, mos ando a solidez dos esul ados.
Nas úl imas décadas, a análise de sequências de ADN dos ma cado es molecula es 16S e
COI, em pe mi ido esol e algumas ques ões elacionadas com as elações ilogené icas en e os
moluscos e a sua e olução (Remigio & He be , 2003 e Alb ech e al, 2006).
Os genes 16S e COI do ADN mi ocond ial, assim como, a egião ITS do ARN ibossomal
analisados no p esen e es udo, pa ecem, po isso, se ú eis pa a descob i as elações ilogené icas e
sis emá ica dos moluscos em es udo, pe encen es ao géne o Helisoma e ou as espécies de ou os
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
CAPÍTULO
5
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
52
géne os e á eas geog á icas dis in as, os quais desempenham um impo an e papel na ansmissão de
Schis osoma sp. e de ou os emá odes.
Apesa des as egiões genómicas se em ap op iadas pa a es udos ilogené icos, não oi
possí el de e mina com exac idão a espécie a que pe encem os moluscos aqui es udados, o que se
icou a de e ao eduzido núme o de sequências homólogas, disponí eis na base de dados pa a o
géne o Helisoma. Apenas se pôde obse a que as amos as em es udo, ap esen am um ele ado g au
de homologia (“boo s ap” de 100%) com as espécies Helisoma du yi e Plano bella i ol is,
o mando um único amo.
As espécies do géne o Biomphala ia o ma am dois g upos dis in os, o g upo a icano e o
g upo neo opical, o que es á de aco do com ou os es udos ealizados pa a o mesmo ma cado
gené ico (Dejong e al, 2001, Mo gan e al, 2002 e Jøge sen e al, 2004). Resul ados idên icos
o am obse ados que pa a o gene COI, que pa a a egião ITS, em que a o mação de g upos
dis in os, mos a uma ele ada homologia en e as amos as em es udo e espécies pe encen es ao
géne o Helisoma, com um alo es a ís ico signi ica i o de 100%, que pa a o gene 16S que pa a a
egião ITS.
A écnica de PCR-RFLP em indo a se amplamen e u ilizada no es udo de moluscos
pe encen es ao géne o Biomphala ia, que pa a a iden i icação de subespécies (Caldei a e al,
2000), que na iden i icação de espécies (Vidigal e al, 1998, 2002, 2004 e Ca alho e al, 2001).
Es a écnica ambém em sido u ilizada na di e enciação de moluscos pe encen es ao géne o
Bulinus (S o ha d e al, 1996 e 1997) e pa a dis ingui subespécies den o do géne o Oncomelania
huppens (Hape & Macmanus, 1994).
Con udo, nes e es udo, não hou e di e enciação en e as amos as pa a as di e en es á eas
geog á icas. P o a elmen e, es es esul ados es a ão elacionados com a enzima aplicada na
diges ão enzimá ica. Es udos an e io es que isa am a di e enciação in aespecí ica, e i ica am
que após a diges ão com AluI, inham sido p oduzidos polimo ismos in aespeci icos, mas
es ições in e especí icas indicando que es a enzima não é su icien e pa a a di e enciação en e
espécies (Vidigal e al, 2002). Os nossos esul ados pa ecem co obo a os esul ados ob idos po
es es au o es
.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
CAPÍTULO
5
DISCUSSÃO E CONCLUSÕES
53
Como conclusões ge ais emos:
1.- Os moluscos em es udo o am iden i icados como pe encen es ao géne o Helisoma
baseado nas suas ca ac e ís icas mo ológicas;
2.- De ido ao núme o insu icien e de amos as e de egis os bibliog á icos não oi possí el
p ocede -se à iden i icação a ní el de espécie dos moluscos;
3.- O p esen e es udo con ibuiu pa a a ca ac e ização molecula de moluscos pe encen es ao
géne o Helisoma colhidos em Po ugal Con inen al, Madei a e Cabo Ve de;
4.- Os genes 16S, COI e a egião ITS suge em isolamen o en e as populações de Cabo Ve de
e da Madei a;
5.- As amos as de Coimb a e Alga e apesa da dis ância geog á ica que sepa a cada uma das
populações, ap esen a am-se como um único g upo pa a os ês genes em análise;
6.- Apesa do núme o insu icien e de sequências homólogas disponí eis na base de dados
pa a o géne o Helisoma, os genes em es udo, pe mi i am a sua econs ução ilogené ica,
con ibuindo assim pa a um melho escla ecimen o das elações ilogené icas des e géne o
com ou as espécies homólogas, pe encen es à mesma amília;
7.- A écnica de PCR-RFLP é uma écnica simples e obus a. Em u u os es udos de e á se
usado um g upo mais ala gado de enzimas pa a en a iden i ica a iação in aespecí ica e
in apopulacional;
8.- Em u u os es udos se á necessá io ob e não só um maio núme o de exempla es, como
ambém ala ga a pesquisa malacológica a ou as á eas geog á icas;
9.- Em u u os abalhos que en ol am es e géne o, a aplicação de ou os ma cado es
molecula es e a u ilização de “p ime s” desenhados especi icamen e pa a cada um dos genes
al o, i á pe mi i um melho conhecimen o des e géne o e escla ece qual a sua posição na
as a amília Plano bidae.
Re e ências Bibliog á icas
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
57
ABOUL-ELA, I. A. & KHALIL, M.T. 1987. The ch onic oxici y o h ee
pollu an s upon he eshwa e snail Helisoma i ol is. P oceedings o he
Zoological Socie y A. R. Egyp , 13:17-29.
ARTHUR, J.W.; WEST, C.W.; ALLEN, K.N. & HEDTKE, S.F. 1987. Seasonal
oxici y o ammonia o i e ish and nine in e eb a e species. Bulle in o
En i onmen al Con amina ion and Toxicology, 38:324-331.
ANGERS, B., CHARBONNEL, N., GALTIER, N. & JARNE, P., 2003. The
in luence o demog aphy, popula ion s uc u e and di e si y in he sel ing
eshwa e snail Biomphala ia. Gene . Res., 81 (3): 193-204.
ALBRECHT, C., KUHN, K. & STREIT, B., 2006. A molecula phylogeny o
Plano boidea (Gas opoda:Pulmona a); insigh s om enhanced axon sampling.
Zoologia Sc ip a, 36 (1): 27-39.
AYVAZIAN, S. G. AND J. C. MALLETT. 1986. Resis ance o Helisoma
i ol is om he Dominican Republic o in ec ion by he emá ode Schis osoma
mansoni. Jou nal o Pa asi ology 72: 785-786
AZEVEDO, J. F. & MEDEIROS, L. C. M., 1954. A iden i icação do
Plano ba ius me idjensis, Fo bes, do Alga e pela mo ologia dos ó gãos geni ais
e ádula, sua compa ação com os mesmos elemen os de Plano bis co neus. Anais
do Ins i u o de Higiene e MedicinaT opical., XI (2): 231-240.
AZEVEDO, J.F., SILVA, J.B., COITO, A.M., COELHO, M.F. & COLAÇO, A.,
1948. O oco po uguês de schis osomiasis. Anais. do Ins i u o de Higiene e
MedicinaT opical, 5:175-222.
BETTENCOURT, A. & BORGES, I., 1922. Le Plano bis me idjensis, hô e
in e media e du Schis osoma haema obium au Po ugal. Con i ma ion
expe imen ale. A q. Ins . Bac . Câma a Pes ana. Tomo IV: 133-135.
BROWN, D., 1994. F eshwa e snails o A ica and hei Medical Impo ance.
2nd Edi ion, Taylo & F ancis, London, 456 págs.

Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
58
CAMARGO, J.A. & A. ALONSO. 2007. Con aminación po ni ógeno
ino gânico en los ecosis emas acuá icos: p oblemas medioambien ales, c i e ios
de calidad del agua, e implicaciones del cambio climá ico. Ecosis emas, 16: 1-13.
CALDEIRA RL, VIDIGAL THDA, MATINELLA L, SIMPSON AJG,
CARVALHO OS 2000. Iden i ica ion o Plano bids omVenezuela by
polyme ase chain eac ion ampli ica ion and es ic ion agmen leng h
polymo phism (PCR-RFLP). Mem Ins Oswaldo C uz 9 (1): 171-177.
CAMPOS, Y.R., CARVALHO, O. S., GOVEIA, C. O. & ROMANHA, A. J.,
2002. Gene ic a iabili y o he main in e media e hos o Schis osoma mansoni in
B azil, Biomphala ia glab a a (Gas opoda:Plano bidae) assessed by SSR-PCR,
Ac a T opica 83 (1): 19-27.
CARVALHO, O. S., CALDEIRA, R. L., SIMPSON, A.J.G. & VIDIGAL,
T.H.D.A., 2001. Gene ic a iabili y and molecula iden i ica ion o b azilian
Biomphala ia species (Mollusca:Plano bidae). Pa asi ology, 123 (Suppl.1):197-
207
CHARBONNEL, N., RASATAVONJIZAY, R., SELLIN, E., BREMONS,P. &
JARNE, P., 2005. The in luence o gene ic ac o s and popula ion dynamics on
he ma ing sys em o he he maph odi ic eshwa e snail Biomphala ia p ei e i.
Oikos, 108 (2): 283-296.
COLE, A. G.; MASHKOURNIA, A.; PARRIES, S. C. & GOLBERG, J. 2002.
Regula ion o ea ly emb yonic beha io by ni ic oxide in he pond snail Helisoma
i ol is. Jou nal o Expe imen al Biology, 205: 3143-3152.
COOPER, G. M. & HAUSMAN, R. E., 2007. A Célula Uma Abo dagem
Molecula , 3ª edição”A med”: 112-117.
DAVIS, G. M., WILKE, T., SPOLSKY, C., QIU, C. P., QIU, D.C., XIA, M. M.,
ZHANG, Y. & ROSEMBERG, G., 1998. Cy och ome oxidase 1-based
phylogene ic ela ionships among Poma iopsidae, Hyd obidae; Rissoidae and
unca ellidae (Gas opoda:Caenoga opoda:Rissoacea). Malacologia, 40: 251-
266.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
59
DEJONG, R.J., MORGAN, J.A.T., PARAENSE, W.L., POINTIER, J.P.,
AMARISTIA, M., AUEK-KUMI, P.F.K., BABIKER, A., BARBOSA, C.S.,
BRÉMOND, P., CANENSE, A.P., PEREIRA DE SOUZA, C., DOMINGUEZ,
C., FILE, S., GUTIERREZ, A., INCANI, R.N., KAWANO, T., KAZIBWE, F.,
KPIKPI, J., LWAMBO, N.J.S., MIMPFOUDI, R., NJIOKOU, F., PODA, J.N.,
SENE, M., MKOJI, G. & LOKER, E.S., 2001. E olu iona y ela ionships and
biogeog aphy o Biomphala ia (Gas opoda:Plano bidae) wi h implica ions
ega ding i s ole as hos o he human blood luke, Schis osoma mansoni.
Molecula Biology and E olu ion., 18 (12): 2225-2239.
FRANÇA, C, 1923. Obse a ion su la bilha iose a Shis osoma haema obium IV –
Su hô e in e eb é du Shis osoma au Po ugal e conside a ions su les
Plano bides. J. Sci. Ma h. Phys. Na . Lisboa, 4: 163-180
FRANDSEN, F., 1979. Discussion o he ela ionships be ween Schis osoma and
hei in e media e hos s, assessmen o he deg ee o hos -pa asi e compa ibili y
and e alua ion o schis osome axonomy. Pa asi ol Resea ch 58: 275-296.
FRANDSEN, F. & MADSEN, H., 1979. A e iew o Helisoma du yi in biological
con ol. Ac a T opica, 36: 67-84.
FOLMER, O., BLACK, M., HOEH, W., LUTZ, R. & VRIJENHOEK, R., 1994.
DNA p ime s o ampli ica ion o mi ochond ial cy och ome C oxidase subuni -1
om di e se me azoan in e eb a es. Molecula Ma in Biology and
bio echnology, 3 (5):294-299.
GRÁCIO, M.A.A., 1981. A impo ância da malacologia em pa asi ologia médica
com b e e no a sob e os Gas opoda de água doce em Po ugal. Sep. Jo nal da
Soc. Ciências Médicas, CXLV (2): 119-140.
GRÁCIO, M.A.A., 1982. A malacologia e a medicina opical sua impo ância
eal e po encial em Po ugal e dis ibuição geog á ica dos gas opodas de água
doce em alguns dos seus des i os. Sep. de “O Médico”, 102: 828-836.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
60
GRÁCIO, M.A.A., 1983. Dis ibu ion and habi a s o six species o eshwa e
pulmona e snails in Alga e, Sou he n Po ugal. Malacological Re iew, 16 (1/2):
17-23.
GOLBERG, J.; DORAN, S.; SHARTAU, R.; PON, J.; ALI, D.; TAM, R. &
KUANG, S. 2008. In eg a i e biology o an emb yonic espi a o y beha iou in
pond snails: he 'emb yo s i -ba hypo hesis'. Jou nal o Expe imen al Biology,
211: 1729-1736.
GOW, J.L., NOBLE, L.R., ROLLINSON, D., MIMPFOUNDI, R. & JONES,
C.S., 2004. B eeding sys em and demog aphy shape popula ios gene ic s uc u e
ac oss ecological and clima ic zones in he A ican eshwa e snail Bulinus
o skalli (Gas opoda:Pulmona a) in e media e hos o schis osomes, Molecula
Ecology ,13 (11): 3561-3573.
HOPE M, & MCMANUS, D.P., 1994. Gene ic a ia ions in geog aphically
isola ed popula ions and subspecies o Oncomelania hupensis de e mined by a
PCR-based RFLP me hod. Ac a T opica, 57(1): 75-82.
IBIKOUNLÉ, M., MASSOUGBODJI, A., SAKITI, N. G., POINTIER J. P., &
MONÉ, H. 2007. Ana omic cha ac e s o easy iden i ica ion be ween
Biomphala ia p ei e i, Helisoma du yi and Indoplano bis exus us du ing ield
su eys. Jou nal o Cell and Animal Biology, 2: 112-117.
JARNE, P. & DELAY, B., 1991. Popula ion gene ics o eshwa e snails. T ends
in Ecology & E olu ion, 6 (12): 383-386.
JIMÉNEZ, C., SPIJKER, S., DE SCHIPPER, S., LODDER, J.C., JANSE, C.K.,
GERAERTS, W.P.M.; MINNEM, J.V.; SYED, N.I.; BURLINGAME, A.L.;
SMIT, A.B., & LI, K. 2006. Pep idomics o a single iden i ied neu on e eals
di e si y o mul iple neu opep ides wi h con e gen ac ions on cellula
exci abili y. Jou nal o Neu oscience, 26: 518- 529.
Hospedei os in e mediá ios de emá odes: es udo molecula de Helisoma sp.
(Gas opoda; Plano bidae) de di e en es á eas geog á icas
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
61
JǾRGENSEN, A., KRISTENSEN, K. & STOTHARD, R., 2004. An in es iga ion
o he “Ancyloplano bidae” (Gas opoda, Pulmona a, Hyg ophila): p elimina y
e idence om DNA sequence da a. Molecula Phylogene ics and E olu ion,
32:778-787.
KNAAP, W.P.W. & LOKER, E.S., 1990. Immune mechanisms in T ema ode-
Snail In e ac ions. Pa asi ology Today, 6 (6): 175-182
KANE, A. & ROLLINSON, D., 1994. Rep i i e sequences in he ibosomal DNA
in e nal ansc ibed space o Schis osoma haema obium, Schis osoma
in e cala um and Schis osoma ma heii. Mol. Biol. Pa asi ., 63 (1): 153-156.
KAWANO, T.; SIMÕES, L. & ALMEIDA, L. 1985. Ka yo ype and nucleola
o ganize egions o Helisoma du yi (We he by, 1897). Re is a B asilei a de
Gené ica, 8: 285-290.
KECHEMIR N. & COMBES, C., 1988. Up o wha poin a e ce ca iogenesis and
spo ocys ogenesis e e sible in schis osomes J. Helmin hology, 62 (3) 261-264.
KLOOS, H. & DAVIS, R., 2002. The Paleoepidemiology o Schis osomiasis in
Ancien Egyp . Human Ecology Re iew, 9 (1): 14-25.
LITTLEWOOD, D.T.J. & BRAY, R.A., 2001. In e ela ionships o
Pla yhelmin hes. CRC, New Yo k, 365 pag.
LOCKYER, A.E., JONES, C.S., NOBLE, L.R. & ROLLINSON, D., 2004.
T ema odes and snails: an in ima e associa ion. Canadian Jou nal o Zoology, 82
(2): 251.
LOFTY,W.M., DEJONG, R.J., ABDEL KADER, A. & LOKER, E.S., 2005. A
molecula su ey o Biomphala ia in Egyp : is B. glab a a p esen ? Am J T op
Med Hyg, 73: 131-139.