Repositorio Institucional de Documentos

2020
57
Paula Domingo Tomás
P ese ación espe má ica
en la especie cunícola.
Es udio de nue as
ecnologías
Depa amen o
Di ec o /es
Pa ología Animal
González O i, Noelia
Gil Hue a, Lydia
© Uni e sidad de Za agoza
Se icio de Publicaciones
ISSN 2254-7606
Reconocimien o – NoCome cial –
SinOb aDe i ada (by-nc-nd): No se
pe mi e un uso come cial de la ob a
o iginal ni la gene ación de ob as
de i adas.
Paula Domingo Tomás
PRESERVACIÓN ESPERMÁTICA EN LA ESPECIE
CUNÍCOLA. ESTUDIO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS
Di ec o /es
Pa ología Animal
González O i, Noelia
Gil Hue a, Lydia
Tesis Doc o al
Au o
2019
UNIVERSIDAD DE ZARAGOZA
Reposi o io de la Uni e sidad de Za agoza – Zaguan h p://zaguan.uniza .es
P ese ación espe má ica en la
especie cunícola.
Es udio de nue as ecnologías
Spe m p ese a ion in abbi s.
Resea ch o new echnologies
Paula Domingo Tomás
2018

PRESERVACIÓN ESPERMÁTICA EN LA ESPECIE
CUNÍCOLA. ESTUDIO DE NUEVAS TECNOLOGÍAS
SPERM PRESERVATION IN RABBITS. RESEARCH
OF NEW TECHNOLOGIES
Paula Domingo Tomás
2018
D a. Lydia Gil Hue a, P o eso a Ti ula del Depa amen o de Pa ología Animal de la
Uni e sidad de Za agoza, y D a. Noelia González O í, P o eso a Con a ada Doc o del
Depa amen o de Pa ología Animal de la Uni e sidad de Za agoza.
INFORMAN que:
Dña. Paula Domingo Tomás, licenciada en Ve e ina ia, ha ealizado bajo nues a
di ección du an e los años comp endidos en e 2015 y 2018 los abajos co espondien es
a su Tesis Doc o al i ulada “P ese ación espe má ica en la especie cunícola. Es udio
de nue as ecnologías”, la cual coincide con el p oyec o de Tesis ap obado po la
comisión de Doc o ado.
Así mismo, ce i icamos que el ma e ial bibliog á ico, expe iencias y casuís ica
p esen ados han sido seleccionados y que an o su elabo ación como sus esul ados y
conclusiones hacen es ima al que susc ibe, como di ec o a y co-di ec o a de la Tesis
Doc o al, que cumple los equisi os exigidos pa a op a al g ado de Doc o po la
Uni e sidad de Za agoza, po lo que au o izamos su de ensa de “Doc o con mención
In e nacional”, pudiendo se some ida al ibunal que sea nomb ado po la Di ección del
Depa amen o.
Pa a que cons e a los e ec os opo unos, emi imos es e in o me en Za agoza a 21 de
Sep iemb e de 2018.
Fdo.: Lydia Gil Hue a Fdo.: Noelia González O í
Tesis Doc o al
PRESERVACIÓN SEMINAL EN LA ESPECIE CUNÍCOLA. ESTUDIO DE
NUEVAS TECNOLOGÍAS
Memo ia de Tesis Doc o al p esen ada po Paula Domingo Tomás.
TESIS DOCTORAL POR COMPEDIO DE PUBLICACIONES
Publicaciones en e is as.
Domingo P, Gil L. (2016) P ese ación seminal: es ado ac ual en la especie cunícola.
Bole ín de cunicul u a, 180, 30-35.
Publicaciones en e is as incluidas en Jou nal o Ci a ion Repo s (JCR).
Domingo P, Olaci egui M, González N, De Blas I, Gil L. (2018) Long- e m p ese a ion
o eeze-d ied abbi spe m by adding osma inic acid and di e en chela ing agen s.
C yobiology, 81, 174-177. doi: 10.1016/j.c yobiol.2018.01.004.
Domingo P, Olaci egui M, González N, De Blas I, Gil L. (2018) E ec s o seminal
plasma and di e en c yop o ec an s on abbi spe m p ese a ion a 16ºC. Exp Anim,
67(4). doi: 10.1538/expanim.17-0152
Domingo P, Olaci egui M, González N, De Blas I, Gil L. (2018) Compa ison o di e en
semen ex ende s and c yop o ec an agen s o enhance he c yop ese a ion o abbi
spe ma ozoa. Czech J Anim Sci.
A ículo cien í ico de i ado de es a esis doc o al en p oceso de e isión.
Domingo P, Olaci egui M, González N, De Blas I, Gil L. (2018) E ec o glyce ol, n, n-
dime hyl o mamide and n-me hyl-2-py olidone on abbi spe m s o ed a 4ºC and 16ºC.
Anim Rep od.
Es e abajo ha sido inanciado po la Uni e sidad de
Za agoza (UZ 2017-BIO-03), el Fondo Social Eu opeo
y el Gobie no de A agón a a és de la do ación
económica al G upo de Re e encia RAySA (A17_17R)
ÍNDICE DE TABLAS Y FIGURAS
Tabla 1. Composición de los diluyen es de e ige ación ............................................... 25
Tabla 2. Composición de los diluyen es de congelación ................................................ 26
Tabla 3. Composición de los diluyen es de lio ilización ................................................ 26
Figu a 1. Tubos colec o es con semen ecién ex aído ................................................... 26
Figu a 2. P o ocolo de congelación
Figu a 2a. Unidad de congelación y ejilla con pajuelas de congelación................ 28
Figu a 2b. Tanque de ni ógeno líquido con pajuelas de congelación .................... 28
Figu a 3. P o ocolo de lio ilización
Figu a 3a. C io iales congelados ............................................................................ 29
Figu a 3b. Lio ilizado p og amable ....................................................................... 29
Figu a 4. Tes de i alidad espe má ica
Figu a 4a. Espe ma ozoide sin eñi ........................................................................ 30
Figu a 4b. Espe ma ozoide eñido ........................................................................... 30
Figu a 5. Tes de in eg idad de la memb ana plasmá ica
Figu a 5a. Espe ma ozoide con cola en espi al ....................................................... 31
Figu a 5b. Espe ma ozoide con cola ec a............................................................... 31
Figu a 6. Tes de in eg idad del ADN espe má ico
Figu a 6a. Espe ma ozoide con ADN in ac o .......................................................... 32
Figu a 6b. Espe ma ozoide con ADN agmen ado ................................................ 32

ABREVIATURAS
ADN: Ácido desoxi ibonucleico
ALH: Ampli ud media del desplazamien o la e al de la cabeza
ATP: Adenosina i os a o
BCF: F ecuencia de ba ido
CP: C iop o ec o
DMF: N, N-Dime il o mamida
EDTA: Ácido e ilen-1,2-diamino 2,2’,2’’,2’’- e aacé ico
EGTA: Ácido e ilenglicol-bis(2-aminoe ilé e )-N,N,N’,N’- e aacé ico
FIO: Fac o induc o de la o ulación
FIV: Fecundación in i o
GLM: Modelo lineal gene al
HOS es : Tes hipoosmó ico
IA: Inseminación a i icial
ICSI: Inyección in aci oplasmá ica de espe ma ozoides
LH: Ho mona lu einizan e
LIN: Índice de linealidad de la ayec o ia cu ilínea
LN2: Ni ógeno líquido
MOT: Mo ilidad o al
NMP: N-Me il-2-Pi olidona
PBS: Tampón os a o salino
PS: Plasma seminal
ROS: Especies eac i as de oxígeno
SCD : Tes de dispe sión de la c oma ina del espe ma ozoide
STR: Índice de ec i ud
TE: T ans e encia de emb iones
VAP: Velocidad media
VCL: Velocidad cu ilínea
VSL: Velocidad ec ilínea
WOB: Índice de oscilación
INTRODUCCIÓN
3
INTRODUCCIÓN
Las écnicas de ep oducción asis ida en mamí e os han e olucionado no ablemen e a lo
la go de los años con el in de p ese a azas en pelig o de ex inción y mejo a la
p oducción animal. Un g an sal o en la mejo a de la ep oducción animal ue g acias a la
inseminación a i icial (IA), la cual empezó a u iliza se en cunicul u a desde 1920
(Sinko icks y cols., 1983). Sin emba go, en las explo aciones cunícolas españolas no ue
ins au ada has a inales de los años 80 (López y Al a iño, 2000; La a a y cols., 2003;
He nández y cols., 2012). Es e g an a ance ue posible debido a que la e ilidad ob enida
median e IA, an o a pa i de semen esco como de semen e ige ado, se asemejaba a
la ob enida median e mon a na u al (80% de e ilidad) (He nández y cols., 2012).
Ac ualmen e la IA es una p ác ica muy común que apo a no ables en ajas y conlle a un
aumen o de la e iciencia económica de las explo aciones: pe mi e disminui el núme o de
machos ep oduc o es en la g anja, pues o que con el eyaculado de un macho es posible
insemina en e 30-35 hemb as; es posible alo a la calidad seminal y con ola la
ansmisión de en e medades; nos posibili a eag upa hemb as en el mismo es adio del
ciclo y po lo an o sinc oniza pa os; o ece la en aja de dis ibui semen incluso en e
la gas dis ancias; y además selecciona buenos machos ep oduc o es lo que nos da
opción a mejo a la gené ica de la aza y p ese a ecu sos gené icos (Al a iño, 1993;
López y Al a iño, 1998).
O as écnicas de ep oducción asis ida como la ecundación in i o (FIV), la
ans e encia de emb iones (TE) y la inyección in aci oplasmá ica de espe ma ozoides
(ICSI) son ac ualmen e muy u ilizadas en medicina humana, g acias al desa ollo y pues a
a pun o de las mismas u ilizando modelos animales. El conejo es conside ado uno de los
mejo es modelos animales de labo a o io debido a la g an simili ud que p esen an sus
espe ma ozoides con los espe ma ozoides humanos. Además son animales de ácil
manejo, en los que esul a sencillo ob ene mues as seminales (a di e encia del a ón no
es necesa io sac i ica al animal), se pueden ob ene esul ados más ápidos (pe íodos
co os de ges ación) y exis e la posibilidad de adap a el mismo a expe imen o en o as
especies. Cabe des aca que la p ime a TE iene sus o ígenes en 1890, cuando Wal e
Heape ans i ió con éxi o emb iones de una coneja a o a naciendo seis gazapos
comple amen e sanos (Bigge s, 1991). En 1929, Lewis y G ego y publica on el p ime

In oducción
4
expe imen o de FIV el cual se había ealizado en la especie cunícola. Lewis y G ego y
log a on madu a emb iones in i o has a el es adio de blas ocis o y, a pesa de no
ob ene descendencia i a as ans e i los a las ompas de Falopio de una coneja, es e
es udio si ió de modelo pa a o as especies animales. No ue has a 1934 cuando Pincus
y Enzmann ob u ie on el p ime nacimien o de un conejo p oceden e de la écnica FIV.
Po ello, el desa ollo de es as bio ecnologías hace necesa io implemen a mé odos más
e icaces pa a la p ese ación de ma e ial gené ico, sis emas que pe mi an el
almacenamien o du an e la gos pe íodos de iempo man eniendo la iabilidad de los
espe ma ozoides y que ga an icen ambién su anspo e en e la gas dis ancias. La
e ige ación, la congelación y la lio ilización son los es mé odos u ilizados pa a la
p ese ación seminal.
La e ige ación es la p incipal écnica u ilizada en las explo aciones cunícolas de c ía
in ensi a. A pesa de ello, es una écnica que solo pe mi e almacena espe ma ozoides a
empe a u as en e 4 y 25ºC du an e 48 ho as, as ese pe íodo de iempo la e ilidad se
e conside ablemen e a ec ada (López y Al a iño, 1998; Roca y cols., 2000; Johinke y
cols., 2014). Po ello, esul a ía de g an in e és la in es igación de nue os diluyen es que
pe mi an almacena semen du an e pe íodos de iempo más la gos y ambién op imiza
del p oceso de e ige ación.
La supe i encia espe má ica se e a ec ada an o po la empe a u a de almacenamien o
como po la composición del diluyen e (Ca luccio y cols., 2004). Pa a cumpli con las
necesidades de los espe ma ozoides, la mayo ía de los diluyen es de e ige ación es án
compues os a base de una solución ampón y suplemen os. La solución ampón es á
compues a po ci a o de sodio, ace a o po ásico y/o bica bona o sódico que son los
enca gados de apo a los mine ales necesa ios pa a ga an iza un pH en o no a 7 y un
adecuado equilib io iónico. Los suplemen os son muy a iados y podemos encon a
di e en es opciones: sus ancias coloidales que p o egen los espe ma ozoides e i ando su
aglu inación y p ecipi ación, como puede se el ácido e ilen-1,2-diamino 2,2’,2’’,2’’-
e aacé ico (EDTA); sus ancias nu i i as que a o ezcan el me abolismo, ida y
longe idad del espe ma ozoide como lo son la glucosa y los an ioxidan es; y sus ancias
bac e icidas como la gen amicina, penicilina, en o loxacina y/o es ep omicina que e i an
la p oli e ación de bac e ias (Al a iño, 1993). Debido a la g an can idad de
combinaciones posibles, han sido muchos los diluyen es (López y Al a iño, 2000;
In oducción
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Ca luccio y cols., 2004) y sus ancias (T ejo y cols., 2013; Johinke y cols., 2014; Sa iözkan
y cols., 2014) es udiadas pa a p ese a el semen du an e el máximo iempo posible. Sin
emba go, Ca luccio y cols. (2004) demos a on que INRA 96® man enía la calidad del
semen de conejo mejo que o os diluyen es a pesa de se un diluyen e especí ico pa a
e ige a semen de caballo.
En la ac ualidad, la congelación o c iop ese ación es el único mé odo capaz de
p ese a espe ma ozoides du an e pe íodos inde inidos de iempo (Gibb y Ai ken, 2016).
La p ime a congelación espe má ica da a de 1776, cuando Laza o Spallanzani obse ó
que espe ma ozoides de humanos, caballos y anas quedaban inmo ilizados cuando
en aban en con ac o con nie e y se eac i aban cuando e an some idos de nue o a al as
empe a u as. En 1937, Be ns ein y Pe opa lo sky congela on espe ma ozoides de
conejo, cobaya, mo ueco, o o, ce do, caballo y a es u ilizando una solución con glice ol,
que pe mi ió alcanza empe a u as de congelación de -21ºC. No obs an e, no ue has a
1949 cuando Polge y cols. in oduje on el glice ol como c iop o ec o (CP), suponiendo
un g an a ance en el desa ollo de los sis emas de congelación celula .
Hoy en día, la c iop ese ación seminal se emplea con éxi o en la especie bo ina g acias
a las ele adas asas de supe i encia espe má ica as la descongelación (Ca luccio y
cols., 2004), sin emba go en la especie cunícola no se ha desa ollado ningún
p ocedimien o ni ningún diluyen e e ec i o que pueda e i a el daño que su en los
espe ma ozoides du an e el p oceso de congelación-descongelación, po lo que en
cunicul u a es e mé odo no es u ilizado con ines come ciales (López y Al a iño, 1998;
Maeda y cols., 2012). Es o es debido a que son muchos los ac o es que in luyen du an e
el p oceso de congelación-descongelación. Nos encon amos con ac o es in e nos o
p opios del animal (especie animal, con o mación del espe ma ozoide, pe meabilidad de
la memb ana, hid a ación, e c) y con ac o es ex e nos los cuales podemos modi ica pa a
e i a el daño celula (composición química del diluyen e, empe a u a de congelación,
elocidad de congelación y descongelación, plasma seminal (PS), e c).
La congelación apo a el bene icio de que pe mi e p ese a semen du an e más iempo,
median e la educción de la asa me abólica de los espe ma ozoides disminuyendo el
gas o de ATP y la mo ilidad espe má ica, ambién educiendo la p oducción de
me aboli os óxicos p oceden es de la glucólisis y la os o ilación oxida i a que acidi ican
el medio (pe óxido de hid ógeno, aldehídos o dióxido de clo o) y educe las especies
In oducción
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eac i as de oxígeno (ROS) (Hamme s ed , 1993; Gibb y Ai ken, 2016). Sin emba go,
du an e el p oceso de congelación-descongelación, en los espe ma ozoides de los
mamí e os, se o man c is ales de hielo in acelula es que causan des ucción celula y
daño en la memb ana, el ci oesquele o, el ac osoma, el ADN y el lagelo (Fulle y Payn e
2004; He nández y cols., 2012), lo que conlle a a una bajada de la asa de e ilidad de al
menos un 20% (Cas ellini y cols., 2006). Pa a e i a es e g a e daño i e e sible, es
necesa io mejo a los p o ocolos de c ioconse ación.
Una mane a de mejo a los p o ocolos de congelación de semen es median e la
in es igación de nue os agen es CP. El glice ol es el p incipal CP u ilizado pa a la
c iop ese ación de espe ma ozoides an o en animales domés icos como sal ajes (Cu y
y cols., 1995), a pesa de ello no es el p ime CP de elección a la ho a de congela
espe ma ozoides de conejo debido a la oxicidad que p esen a en es a especie. O os
au o es han demos ado p e iamen e en conejos que el glice ol puede p o oca es és
osmó ico y desna u alización de p o eínas (Al a iño 1993; Gilmo e y cols., 1995;
Ia aldano y cols., 2012) debido a su al o peso molecula , el cual hace que a a iese la
memb ana celula más len amen e que o os CP y ocasione es és oxida i o en la
memb ana (Gilmo e y cols., 1995). Po ello, dadas las ca ac e ís icas de los
espe ma ozoides de conejo (al a ene gía de ac i ación y bajo coe icien e de pe meabilidad
de agua), los CP con meno peso molecula y mayo pe meabilidad, como las amidas o
los g upos me ilos, pod ían se los más adecuados pa a educi el daño osmó ico (Da in-
benne y Whi e, 1977; Cu y y cols., 1995; Mocé y Vicen e, 2009). La N, N-
dime il o mamida (DMF) es un disol en e amida que pod ía u iliza se como CP en la
congelación de espe ma ozoides. Has a la echa no hay es udios sob e la e icacia que
pod ía ene la DMF pa a congela semen de conejo, pe o sí que los hay en o as especies.
Po ejemplo, es udios p e ios demos a on que la DMF es mejo CP que el glice ol
cuando es u ilizada pa a congela espe ma ozoides de caballos (Olaci egui y cols., 2014;
Pukazhen hi y cols., 2014). Po el con a io, se ha demos ado que en jabalí (Malo y cols.,
2009), pe o (Fu ino y cols., 2008; Lopes y cols., 2009; Mo a Filho y cols., 2011), cab a
(Beze a y cols., 2011) y a es (Chalah y cols., 1999) la calidad de los espe ma ozoides
empeo a cuando se usa DMF en luga de glice ol. O o disol en e amida u ilizado
comúnmen e en eacciones químicas es N-me il-2-pi olidona (NMP). Pe o a di e encia
de la DMF, no hay es udios p e ios de congelación seminal en ninguna especie u ilizando
es e CP.
In oducción
7
O o ac o a ene en cuen a pa a mejo a el p o ocolo de congelación de semen de conejo
pod ía se el e ec o que eje ce el PS. El PS es la acción líquida del semen que in e iene
en la supe i encia y compe encia espe má ica, el desa ollo emb iona io, la ecep i idad
endome ial y la unción o á ica de las hemb as después de la IA (Hol z y Foo e, 1978;
Al a iño, 2000; T oedsson y cols., 2005; Wabe ski y cols., 2006). El PS es á compues o
po uc osa, so bi ol, ácido cí ico, inosi ol, glice ol, e go ioneína, ácido glu ámico,
elec oli os, glice il os o ilcolina, p o eínas como el ac o induc o de la o ulación (FIO)
(Sil a y cols., 2011), glicop o eínas, enzimas y mine ales como sodio, po asio, ós o o,
magnesio, calcio y zinc (Hol z y Foo e, 1978; Se chell, 1989). Cada componen e del PS
iene un ol di e en e; FIO es una de las p incipales p o eínas que es imula la sec eción
de la ho mona lu einizan e (LH), la o ulación y el desa ollo del cue po lú eo en especies
con o ulación inducida o espon ánea (Adam y Ra o, 2013). Además, el FIO aumen a el
núme o o al de olículos an ales y olículos ano ula o ios hemo ágicos en conejos
(Sil a y cols., 2011). Po el con a io, el PS p esen a una glicop o eína que inhibe
e e siblemen e el p oceso de capaci ación espe má ica y la eacción ac osómica (Eng y
Oliphan , 1979). Sin emba go los esul ados en conejos no son muy concluyen es, la
p esencia de PS ha mos ado un lige o e ec o bene icioso sob e la calidad del espe ma
(Gogol, 1999; Cas ellini y cols., 2000; Aksoy y cols., 2008). Al igual que con el diluyen e,
el e ec o del PS pa ece es a elacionado con la especie animal. En bo ino (Sahni y
Mohan, 1990; G aham, 1994), o ino (G aham, 1994) y equino (Au ich y cols., 1996;
Moo e y cols., 2005) se ha demos ado un e ec o noci o del PS du an e el p oceso de la
congelación y descongelación de semen. Po el con a io, Sahni y Mohan (1990) y
Ma ínez-Pas o y cols. (2006) demos a on que e a mejo man ene el PS du an e el
p oceso de congelación de espe ma ozoides de bú alo y cie o espec i amen e.
Po úl imo, la e ce a écnica u ilizada pa a conse a semen es la lio ilización, un p oceso
de conse ación po el cual un sus a o congelado se some e a un p ime secado po
sublimación y pos e io men e un segundo secado po deso ción pa a consegui la
educción del sol en e y así, educi las pé didas de los componen es olá iles o e mo-
sensibles de una sus ancia (Jennings, 2002). Los o ígenes de la lio ilización se emon an
al año 200 a.C. cuando los incas ab icaban chuño (papa lio ilizada) y cha qui (ca ne de
llama), pos e io men e ue on los ikingos quienes la u iliza on pa a conse a a enque
de pescado. Más adelan e, en 1935, Flosdo y Mudd mejo a on la écnica consiguiendo
lio iliza ejidos animales, plasma sanguíneo y á macos. Pe o no ue has a 4 años más
Ma e ial y mé odos
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OBJETIVOS

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OBJETIVOS
El p incipal obje i o de es a esis doc o al ue in es iga los p ocesos de e ige ación,
congelación y lio ilización espe má ica en la especie cunícola. Pa a ello, se p opusie on
los siguien es obje i os:
1. E alua la in luencia del PS y el e ec o de di e en es CP (glice ol, DMF y NMP)
sob e la calidad espe má ica du an e el almacenamien o de las mues as seminales
en condiciones de e ige ación (A ículo 2).
2. Valo a el e ec o p o ec o del glice ol, DMF y NMP en espe ma ozoides de
conejo e ige ados a dos empe a u as (16ºC y 4ºC) du an e un la go pe íodo de
iempo (A ículo 3).
3. Analiza el e ec o de di e en es CP (glice ol, DMF y NMP) y del PS en e al
posible shock é mico que pueden su i los espe ma ozoides du an e el p oceso
de congelación. (A ículo 4).
4. E alua el e ec o de dos agen es quelan es (EGTA y EDTA) y sus ancias
an ioxidan es como el ácido osma ínico sob e la in eg idad del ADN de
espe ma ozoides lio ilizados. De e mina la empe a u a óp ima de
almacenamien o de espe ma ozoides lio ilizados. (A ículo 5).
MATERIAL Y MÉTODOS
Ma e ial y mé odos
30
Vi alidad
La i alidad de los espe ma ozoides se e aluó con la inción de eosina-nig osina
siguiendo el p o ocolo es ablecido po Bjo ndahl y cols. (2003). Pa a ello, se colocó una
alícuo a de semen sob e un po aobje os de id io, se mezcló con un olumen igual de
suspensión de eosina-nig osina y se hizo un o is. Una ez el o is es aba seco, se
examina on 100 espe ma ozoides po mues a con un mic oscopio a x400 aumen os.
Los espe ma ozoides i os no enían la memb ana dañada po lo que no dejaban pene a
el colo an e en su in e io , de es e modo la cabeza de los espe ma ozoides es aba sin eñi ,
de colo blanco. Po o o lado, los espe ma ozoides mue os, debido al daño en la
memb ana, pe mi ie on la en ada del colo an e en el in e io de la célula y se obse aban
espe ma ozoides con cabeza de colo oja o osa oscu a ( eñidos) (WHO, 2010).
Figu a 4. Espe ma ozoide sin eñi (a) y espe ma ozoide eñido (b).
In eg idad de la memb ana plasmá ica
La p ueba u ilizada pa a e alua la in eg idad de la memb ana plasmá ica del
espe ma ozoide ue el es hipoosmó ico (HOS es ), el cual se basa en la esis encia de la
memb ana plasmá ica cuando es some ida a un medio hipoosmó ico. El es se ealizó
siguiendo el p o ocolo es ablecido po Jeyend an y cols. (1984) que consis e en mezcla
10 µl de semen con 90 µl de solución HOS (100 mM de ci a o de sodio) en un ubo
eppendo y pos e io men e incuba a 37ºC du an e 30 minu os. T anscu idos los 30
minu os, se añaden 100 µl de glu a aldehído al 2% pa a ija los espe ma ozoides. Se
coloca on 10 µl de la mezcla sob e un po aobje os y se cub ió con un cub eobje os pa a
examina 100 espe ma ozoides po mues a median e un mic oscopio de con as e de
ases a x400 aumen os.
Los espe ma ozoides con las memb anas in ac as pe mi ie on la en ada de agua den o
de ellos, dando luga a espe ma ozoides hinchados con la cola en espi al (Amo im y cols.,
2009; WHO, 2010).
a
b

Ma e ial y Mé odos
31
Figu a 5. Espe ma ozoide con cola en espi al (a) y espe ma ozoide con cola ec a (b).
In eg idad del ac osoma
El p o ocolo desa ollado po Pu sel y Johnson (1974) se basa en la ijación de los
espe ma ozoides pa a ap ecia la mo ología y la in eg idad de la memb ana del
ac osoma. Pa a ello, 10 µl de semen se ija on con 90 µl de glu a aldehído al 2%.
Inmedia amen e después, 10 µl de la mezcla se colocó sob e un po aobje os y se cub ió
con un cub eobje os pa a examina 100 espe ma ozoides po mues a con un mic oscopio
de con as e de ases u ilizando un aumen o x1000 y acei e de inme sión.
Los ac osomas se clasi ica on en dos clases: ac osomas in ac os (c es a apical no mal) y
ac osomas dañados (c es a apical dañada o ausencia de c es a apical).
In eg idad del ADN espe má ico
El es de dispe sión de la c oma ina del espe ma ozoide (SCD ) especí icamen e
diseñado pa a la especie O yc olagus cuniculus (O.cuniculus-Halomax® ki ; Halo ech
DNA S.L., Mad id, España) ue el u ilizado pa a e alua la in eg idad del ADN de los
espe ma ozoides lio ilizados. Es a écnica es á basada en la espues a di e encial del
núcleo del espe ma ozoide agmen ado y no agmen ado a un a amien o de
desna u alización del ADN. La ex acción de las p o eínas nuclea es del espe ma ozoide
libe a los agmen os al e ados del ADN, de es a o ma la c oma ina se dispe sa o mando
un halo pe i é ico lige amen e eñido.
La e aluación de la agmen ación del ADN espe má ico se ealizó siguiendo las
ins ucciones del ab ican e. P ime o se p epa ó el ma e ial, la solución de lisis se dejó a
empe a u a ambien e y los ubos con aga osa se p ecalen a on en baño ma ía en e 95 y
100⁰C du an e 5 minu os y seguidamen e se pasa on al baño ma ía de 37⁰C. Los
espe ma ozoides lio ilizados y pos e io men e ehid a ados se cen i uga on a 1000 x g
du an e 2 minu os, y as elimina el sob enadan e, el sedimen o se esuspendió en 500 µl
a
b
Ma e ial y mé odos
32
de ampón os a o salino (PBS; Sigma-Ald ich Química S.A., Mad id, España). En un
ubo eppendo se in oduje on 25 μl de las mues as espe má icas diluidas en PBS y se
añadie on 50 μl de la aga osa líquida, se homogeneiza on y se man u ie on a 37⁰C.
Seguidamen e, se colocó una go a de 2 μl de cada suspensión espe má ica den o del
pocillo ma cado del po aobje os y se cub ió con cub eobje os de id io de 24 x 24 mm.
El po aobje os se man u o en posición ho izon al du an e 5 minu os a 4ºC pa a que se
solidi icase la aga osa. Pasados los 5 minu os se e i ó el cub eobje os sua emen e y el
po aobje os ue sume gido comple amen e en 10 ml de solución de lisis du an e 5
minu os. A con inuación se la a on las mues as en agua des ilada du an e 5 minu os y se
deshid a a on po inme sión en dos baños sucesi os de e anol (70% y 100%) du an e 2
minu os cada uno. Finalmen e las mues as se deja on seca al ai e pa a pos e io men e
se eñidas.
Los espe ma ozoides se iñe on con el ki come cial de luo escencia e de (FluoG een®;
Halo ech DNA S.L., Mad id, España). Una ez que el eac i o A se mezcló con el
eac i o B en una p opo ción de 1:1, se coloca on 3 μl de la mezcla en cada pocillo pa a
eñi la c oma ina espe má ica. Las mues as ue on e aluadas con un mic oscopio de
luo escencia a x400 aumen os (Olympus BX-40, Olympus U-RFL-T, Tokyo, Japón) y
se con a on al menos 400 espe ma ozoides po mues a.
Los espe ma ozoides que p esen aban un pequeño halo compac o al ededo del núcleo
espe má ico enían el ADN in ac o (Figu a 6a), mien as que los espe ma ozoides con el
ADN agmen ado mos aban un halo g ande y dispe so (Figu a 6b).
Figu a 6. Espe ma ozoide con ADN in ac o (a) y espe ma ozoide con ADN agmen ado (b).
a
b
Ma e ial y Mé odos
33
Análisis es adís ico
Todos los es udios se ealiza on po iplicado. Los da os se analiza on con el paque e
es adís ico IBM SPSS, e sión 23 pa a Windows (SPSS, Chicago, EE. UU.). Los
esul ados co espondien es a los es udios de e ige ación y congelación se exp esa on
con la media ± SEM. Los alo es ela i os a los e ec os de los diluyen es, el PS, la
empe a u a y el iempo de almacenamien o de las mues as e ige adas y congeladas se
analiza on como ac o es ijos en un modelo lineal gene al (GLM) u ilizando un diseño
ac o ial comple o con in e acciones en e ac o es. La p ueba pos hoc de Duncan se
u ilizó pa a e alua el e ec o del diluyen e y el iempo de almacenamien o. Po o o lado,
los da os ela i os a la agmen ación de ADN se exp esa on en po cen ajes y se
analiza on median e la p ueba de Chi-cuad ado de Pea son. En odos los es udios el ni el
de signi icancia se es ableció en p<0.050.
DISEÑO EXPERIMENTAL Y
RESULTADOS

37
DISEÑO EXPERIMENTAL Y RESULTADOS
Obje i o 1: E alua la in luencia del PS y el e ec o de di e en es CP (glice ol, DMF
y NMP) sob e la calidad espe má ica du an e el almacenamien o de las mues as
seminales en condiciones de e ige ación.
Diseño expe imen al
Las mues as seminales ue on ob enidas de ocho machos ep oduc o es de un cen o de
IA. Con el in de elimina las di e encias indi iduales de cada animal, las mues as ue on
homogeneizadas. En el p ime es udio la mues a he e ospé mica se di idió en ocho
acciones. Una de ellas se diluyó (1:5) con un medio base de e ige ación (INRA 96®)
y ue u ilizada como mues a con ol (ex ende A). Las o as es acciones se diluye on
(1:5) con di e en es diluyen es p e iamen e p epa ados, los cuales con enían INRA 96®
y un CP al 6%: glice ol (diluyen e B), DMF (diluyen e C) o NMP (diluyen e D). Las o as
cua o acciones se cen i uga on una ez a 700 x g du an e 10 minu os y el sob enadan e
se desca ó pa a elimina el máximo PS posible. Pos e io men e, cada sedimen o se
esuspendió con el diluyen e A, B, C o D, espec i amen e. Finalmen e, odas las mues as
se en ia on p og esi amen e de 37ºC a 16ºC en el anscu so de 120 minu os y se
almacena on a 16ºC du an e 72 ho as. Los espe ma ozoides se analiza on a las 4, 24, 48
y 72 ho as as su ecogida con el p og ama ISAS® y se ealiza on las p uebas de i alidad,
HOS es e in eg idad ac osómica.
Resul ados
Los esul ados e ela on que el diluyen e u o un papel impo an e sob e la calidad
espe má ica du an e el p oceso de e ige ación seminal. Las mues as diluidas con el
diluyen e C ob u ie on esul ados simila es a las mues as diluidas con el diluyen e
con ol (diluyen e A) en cuan o a la MOT (63.1±4.3% diluyen e A; 63.4±3.7% diluyen e
C) y i alidad (88.9±2.6% diluyen e A; 87.7±2.7% diluyen e C). Los mejo es esul ados
elacionados con la ciné ica del espe ma ozoide como VSL (32.9±2.0 μm/s), VAP
(49.1±2.5 μm/s), LIN (41.2±1.9%), STR (64.7±1.7%) y WOB (62.1±1.8%) ue on
ob enidos po el diluyen e A (p<0.050). Po o o lado, o os pa áme os como VCL
(81.3±3.8 μm/s), ALH (3.6±0.2 μm) y HOS es (74.3±2.3%) ue on signi ica i amen e
(p<0.050) más al os en las mues as p ocesadas con el diluyen e C. Las mues as diluidas
Diseño y esul ados
38
con los diluyen es B y D mos a on los peo es esul ados en la mayo ía de los pa áme os
es udiados.
Aunque las mues as p ocesadas con y sin PS mos a on esul ados bas an e simila es en
cuan o a la MOT, i alidad e in eg idad del ac osoma, los espe ma ozoides con PS
ob u ie on mejo es esul ados (p=0.020) en la p ueba de HOS es (71.9±1.6% con PS;
66.5±1.6% sin PS). Po o o lado, los espe ma ozoides sin PS alcanza on pa áme os
ciné icos elacionados con la elocidad y la ayec o ia de los espe ma ozoides
lige amen e más al os, especí icamen e en cuan o a LIN (32.2±1.2% con PS; 36.3±1.3%
sin PS), STR (60.1±1.1% con PS; 62.8±1.1% sin PS) y WOB (53.0±1.2% con PS;
56.2±1.2% sin PS), mos ando espe ma ozoides más ápidos y con ayec o ias más
lineales.
Con espec o a odos los pa áme os espe má icos es udiados, la calidad de los
espe ma ozoides disminuyó a la ez que a anzaba el iempo de almacenamien o
(p<0.025). La p ime a caída signi ica i a (p<0.001) en la MOT se obse ó de las 24
(58.4±3.7%) a las 48 ho as (44.1±3.7%) de almacenamien o. No obs an e, la disminución
más p onunciada de la MOT ue a pa i de las 72 ho as de almacenamien o (27.4±5.1%).
El po cen aje de espe ma ozoides i os se man u o has a las 72 ho as, disminuyendo
lige amen e de 86.6±2.7% (4 ho as) a 77.2±2.5% (72 ho as). Finalmen e, la memb ana
plasmá ica y ac osómica se daña on p og esi amen e has a las 72 ho as, esul ando un
49.5±2.3% de espe ma ozoides con la memb ana plasmá ica in ac a y un 58.1±3.2% de
espe ma ozoides con el ac osoma ín eg o. O os pa áme os elacionados con la ciné ica
de los espe ma ozoides como VSL, LIN, STR y WOB expe imen an una ue e
disminución después de 24 ho as de almacenamien o. T anscu idas 48 ho as de
almacenamien o se obse ó una disminución del es o de los pa áme os ciné icos
es udiados (VCL, VAP, ALH y BCF).
En unción a los esul ados an e io men e desc i os podemos deci que el PS pod ía
eje ce una acción p o ec o a sob e las memb anas de los espe ma ozoides y ayuda a
man ene la mo ilidad espe má ica. Po o o lado, la DMF eje ce un e ec o p o ec o sob e
la memb ana de los espe ma ozoides mejo ando la calidad seminal du an e la
conse ación de semen de conejo a 16ºC.
Diseño y esul ados
39
Obje i o 2: Valo a el e ec o p o ec o del glice ol, DMF y NMP en espe ma ozoides
de conejo e ige ados a dos empe a u as (16ºC y 4ºC) du an e un la go pe íodo de
iempo.
Diseño expe imen al
Las mues as seminales se ob u ie on de ocho machos ep oduc o es de un cen o de IA.
Con el in de elimina las di e encias indi iduales de cada animal, las mues as ue on
homogeneizadas. La mues a espe má ica se di idió en cua o acciones y cada una de
ellas se diluyó (1:5) con un diluyen e di e en e p e iamen e p epa ado: INRA 96®
(ex ende A) como con ol e INRA 96® suplemen ado al 6% con di e en es CP: glice ol
(diluyen e B), DMF (diluyen e C) o NMP (diluyen e D). Pos e io men e, cada mues a de
semen se di idió en dos ubos eppendo pa a almacena cada una a 16 y 4ºC. El descenso
é mico se ealizó en un pe íodo de en e 90 y 120 minu os y, una ez alcanzada la
empe a u a deseada, se almacena on du an e 72 ho as. La mo ilidad espe má ica,
pa áme os ciné icos, i alidad, in eg idad de la memb ana plasmá ica y del ac osoma se
e alua on a las 4, 24, 48 y 72 ho as as la ob ención del semen.
Resul ados
El diluyen e jugó un impo an e papel du an e el p oceso de e ige ación de
espe ma ozoides de conejo. Las mues as diluidas con el diluyen e C ob u ie on
esul ados simila es a las mues as diluidas con el diluyen e con ol (diluyen e A), sin
emba go el diluyen e C man u o mejo las memb anas plasmá icas de los
espe ma ozoides (p<0.050). También se obse ó que el diluyen e A ob u o los mejo es
alo es en elación a la elocidad y ayec o ia de los espe ma ozoides. Po o o lado, las
mues as diluidas con los diluyen es B y D mos a on los peo es esul ados.
A pesa de no obse a se di e encias es adís icamen e signi ica i as en e las mues as
almacenadas a 16 o 4ºC en casi odos los pa áme os es udiados, el pa áme o BCF ue el
único que di i ió, siendo mayo cuando las mues as se almacena on a 4ºC en luga de
16ºC (p<0.001). Cabe des aca que cuando se ealizó un es udio minucioso de la
in e acción del diluyen e con la empe a u a pa a alo a el e ec o de ambos sob e la
MOT, se obse ó que las mejo es condiciones de almacenamien o e an el uso del ex ende
A an o a 4 (57.6±3.2%) como a 16ºC (63.1±3.7%) y el ex ende C a 16ºC (63.4±3.2%)
(p=0.027).

A ículo 2
“E ec s o seminal plasma and di e en c yop o ec an s
on abbi spe m p ese a ion a 16ºC”
(
Exp. Anim.
67(4), 2018)
49
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55
62
All ejacula es we e pooled wi h he pu pose o elimina e indi idual di e ences,
immedia ely he ea e we e di ided in ou ac ions and each one was dilu ed wi h a
di e en ex ende : INRA 96® (IMV Technologies, L’Aigle, F ance) (Ex ende A) as
con ol, and INRA 96® supplemen ed wi h 6% glyce ol (Ex ende B), 6% DMF (Ex ende
C) o 6% NMP (Ex ende D).
Subsequen ly, each semen sample was placed in o wo eppendo ube in o de o s o e
each sample a 4ºC and a 16ºC. Samples we e cooled p og essi ely om 37ºC o 16ºC
and 4ºC in a ime pe iod among 90 and 120 minu es (Mocé and Vicen e, 2009) and inally
hey we e s o ed.
E alua ion o spe ma ozoa
Spe m mo ili y, i ali y, memb ane in eg i y and ac osome in eg i y we e assessed a 4,
24, 48 and 72 hou s a e collec ion o bo h empe a u e s o age and all ex ende s.
- Spe m mo ili y and kinema ics
Spe m mo ili y and kinema ics pa ame e s we e e alua ed by ISAS® (PROISER ISAS
Lab CASA sys em, Valencia, Spain). Samples we e examined by phase-con as
mic oscope (x100). The ollowing pa ame e s we e assessed: pe cen age o mo ile
spe ma ozoa (MOT), cu ilinea eloci y (VCL), s aigh -line eloci y (VSL), a e age
pa h eloci y (VAP), linea i y (LIN=VSL/VCL), s aigh ness (STR=VSL/VAP), wobble
(WOB=VAP/VCL), ampli ude o la e al head displacemen (ALH) and bea c oss
equency (BCF).
- Vi ali y
Eosin-nig osin s ain was used o e alua e he i ali y o he spe ma ozoa ollowing he
p o ocol desc ibed by Bjo ndahl e al. (2003). Acco ding o he s ain pene a ion ough
he damaged memb ane he dead spe ma ozoa had ed o da k pink heads (s ained) and
he li e spe ma ozoa had whi e heads (uns ained) (WHO, 2010).
- Spe m plasma memb ane in eg i y
Hypo-osmo ic swelling es (HOS es ) was pe o med ollowing he p o ocol es ablished
by Jeyend an e al. (1984). Ten mic oli e s o semen we e mixed wi h 90µl o HOS es
solu ion (100 mM o Sodium Ci a e) and kep a 37ºC a leas 30 minu es. Subsequen ly
100µl o glu a aldehyde 2% was added o he sample o ix i . Each sample was analysed

63
by phase-con as mic oscope a x400 magni ica ion. Spe ma ozoa wi h in ac memb anes
allowed an in lux o wa e inside he cell gi ing place o swollen spe ma ozoa wi h coiling
ail (Amo im e al., 2009; WHO, 2010).
- Ac osome in eg i y
Ac osome in eg i y es is based on he ixa ion o he spe ma ozoa. Ten mic oli e s o
semen was immedia ely ixed in 90µl o glu a aldehyde 2% solu ion, igh a e each
sample was analysed by phase-con as mic oscope a x1000 magni ica ion (Pu sel and
Johnson, 1974).
S a is ical analysis
The s udy was eplica ed h ee imes. Da a we e analysed using IBM SPSS S a is ics 23
o Windows. Resul s we e exp essed as mean ± SEM. The e ec o he ex ende , s o age
empe a u e and ime o s o age on he s udied pa ame e s we e analysed by ANOVA.
Duncan's pos -hoc es was used o e alua e he e ec o he ex ende and ime o s o age.
The in e ac ions among he ex ende used, s o age empe a u e and ime elapsed we e
assessed using GLM p ocedu e. The le el o signi icance was se a p<0.050.
IV. RESULTS
The e ec o he ex ende played an impo an ole in seminal p ese a ion, in ac , all
pa ame e s s udied we e signi ican ly signi ican (p<0.050), excluding ac osome in eg i y
pa ame e (Table 1 and Fig. 1). When he samples we e dilu ed wi h ex ende C, he da a
ob ained we e simila o con ol samples (ex ende A), mo eo e ex ende C go highe
pe cen age (p<0.050) o MOT, i ali y and HOS es . A ew wo se esul s o MOT,
i ali y and HOS es we e ob ained by ex ende D, hough he wo s esul s we e
obse ed in samples dilu ed wi h ex ende B. O he kinema ic pa ame e s we e s udied,
showing ex ende A g ea e esul s on eloci y and ajec o y.
When he e ec o s o age empe a u e on cooled abbi spe m was analysed no
signi ican di e ences we e obse ed on MOT, kinema ic pa ame e s, i ali y, HOS es
and ac osome in eg i y. Wi h he excep ion o BCF pa ame e (p<0.001), which was
highe when spe m samples we e s o ed a 4ºC (8,307±0,189) ins ead o 16ºC
(7,475±0,203). In spi e o no s a is ically di e ences we e obse ed be ween s o age
64
samples a 4ºC o 16ºC, i should be no ed ha s udying ho oughly he in e ac ion
be ween he diluen s and he empe a u e s a is ically di e ences (p=0.027) on MOT we e
shown (Fig. 2).
Rega ding all spe m pa ame e s s udied, spe m quali y dec eased o e s o age ime
(p<0.050). The pe cen age o o al spe m mo ili y d opped o om 64.7±2.3% a 4 hou s
a e collec ion o 44.5±2.3% passing 48 hou s. Ne e heless, he sha pes decline o
mo ili y was om 72 hou s o s o age (28.6±2.6% o mo ile spe ma ozoa). The i ali y
o spe ma ozoa was kep ill 72 hou s a e s o age, om 87.5±1.8% o 75.3±1.7% o li e
spe ma ozoa. Almos all kinema ic pa ame e s and ac osome in eg i y shown a
conside able decline a e 24 hou s o s o age. Las ly, spe m plasma memb ane was
s a ed o damage as o 48 hou s.
The in e ac ion be ween he ex ende and he hou s ha elapsed since he collec ion o
he samples a e p esen ed in Fig. 3. All he pa ame e s s udied, excep ac osome in eg i y,
we e s a is ically signi ican (p<0.050) showing ha as ime goes by, semen quali y
dec eases.
Ex ende A ob ained he highes MOT up o 24 hou s, bu a e ha pe iod o ime he
addi ion o DMF o INRA 96® o e ed highe MOT. Ex ende C ob ained he bes da a
on MOT a 72 hou s (40.8±4.6%). MOT pa ame e was simila o ex ende C and D un il
24 hou s o s o age, he ea e MOT d opped eaching less han 20% a 72 hou s a e
collec ion. Ex ende B ob ained he wo s MOT in ela ion o o he ex ende s (p<0.050)
(Fig. 3a).
The pe cen age o ali e spe ma ozoa ob ained wi h ex ende A was simila han ex ende
C du ing 72 hou s (Fig. 3b). Ex ende B o D showed simila alues ill 48 hou s o
s o age, a e 48 hou s o s o age he i ali y o spe ma ozoa dilu ed wi h ex ende B came
down om 82.6±3.5% a 48 hou s o 56.9±3.5% a 72 hou s o s o age (p<0.050).
The e alua ion o he damage o he spe m plasma memb ane is syn hesise in Fig. 3c. As
i is shown, ex ende C o e ed be e p o ec ion on he spe m plasma memb ane,
obse ing s a is ically di e ences (p<0.050) a e 72 hou s o s o age.
65
V. DISCUSSION
I is known ha he addi ion o CPA o an ex ende is pe o med wi h he goal o p o ec
he spe m om c yodamage, which causes de as a ing consequences in spe m su i al
du ing spe m cooling p ocess. Though also, CPA, such as glyce ol, could ha e a oxic
e ec on spe m (memb ane des abiliza ion, p o ein and enzyme dena u a ion, osmo ic
s ess, al e a ion o ac in in e ac ions and induc ion o p o ein- ee memb ane blis e )
di ec ly ela ed o he concen a ion used and he ime o cell exposu e (Al a iño, 1993;
Gilmo e e al., 1995; Okuda e al., 2007; Ia aldano e al., 2012). In e es ingly, his s udy
on abbi spe m showed same esul s as p e ious s udies in s allion spe m p ese a ion
(Olaci egui e al., 2014; Pukazhen hi e al., 2014): he addi ion o DMF main ained cooled
abbi spe m quali y be e han glyce ol. In addi ion, samples dilu ed wi h INRA 96® plus
DMF go , along wi h samples dilu ed wi h INRA 96®, he bes spe m quali y du ing
cooled spe m p ese a ion. Su p isingly, spe m quali y dec eased when samples we e
dilu ed wi h INRA 96® plus NMP. Reminding o abbi spe m cha ac e is ics, he mos
app op ia e sol en s o use in abbi spe m p ese a ion should ha e low molecula
weigh and high pe meabili y, such as amides (Cu y e al., 1995; Mocé and Vicen e,
2009). The e o e, he di e ences ound be ween DMF and NMP could be owing o hei
molecula weigh s and densi ies. Despi e DMF and NMP a e bo h an amide sol en s,
NMP has highe molecula weigh (99.13 g/mol) and densi y (1.028 g/cm3) han DMF
(73.09 g/mol o molecula weigh ; 0.944 g/cm3 o densi y). These small di e ences in
hei composi ion migh sugges ha a e esponsible o NMP no being a good CPA o
s o age cooled abbi spe m. Anyhow, u he s udies should be ca ied ou o de e mine
he op imal concen a ion o NMP.
On he o he hand, as expec ed glyce ol go he wo s da a due o i s oxici y p e iously
demons a ed by o he au ho s (Al a iño, 1993; Gilmo e e al., 1995; Okuda e al., 2007),
no ge ing no 30% o mo ile abbi spe m s o ing i a 16ºC.
P e ious s udies ha e shown he abili y o abbi spe m o esis en i onmen al s ess.
Because o he d ople s and esicles p esen in abbi spe m; hey a e ich in choles e ol
and phospholipids, assis ing o modula e he memb ane luidi y and in his way o
wi hs and g ea e cold shock (Spa e al., 2002; Cas ellini e al., 2006; Mocé and Vicen e,
2009). Mo eo e , he high choles e ol:phospholipid a io o abbi spe m plasma
66
memb ane allows he abili y o e ilize oocy es om cooling spe m a 4ºC is simila o
esh spe m (Mocé and Vi en e, 2009). In he p esen s udy on cooled abbi spe m, we
demons a ed ha he e a e no di e ences be ween s o age abbi spe m a 4ºC o 16ºC
when INRA 96® is he ex ende used, con a ily o he s udy published by Johinke e al.
(2014) which using T is-ci ic-acid ex ende wi h wo di e en concen a ions o glucose,
ob ained be e esul s when s o ed abbi spe m a 15ºC ins ead o 5ºC. Conside ing his,
we can app ecia e ha he ex ende and CPA play an impo an ole, mo eo e INRA 96®
ex ende can be used sa is ac o ily among 4ºC and 16ºC.
As expec ed, in his s udy he spe m quali y o all he samples dec eased h oughou
s o age ime as o he au ho s p e iously epo ed (López and Al a iño, 1998; Roca e al.,
2000; Cas ellini e al., 2000), showing a e 48 hou s a conside able d op on MOT
pa ame e . Ne e heless p e ious s udies demons a ed ha MOT is no he only good
pa ame e o e alua e spe m quali y, o he pa ame e s ela ed wi h MOT such as VCL,
VSL, VAP, LIN, STR, WOB, ALH and BCF a e also use ul o p edic male in i o
e ili y (Liu e al., 1991; Hagen e al., 2010). To da e, all kinema ic pa ame e s in abbi
spe ma ozoa ha e ne e been s udied p e iously by o he au ho s. Su p isingly, in his
s udy we can app ecia e ha almos all kinema ic pa ame e s only we e main ained ill 24
hou s, unlike i ali y pa ame e which ha dly showed a decline du ing 72 hou s o s o age.
Mo eo e , e en hough he quali y o all he samples dec eased h oughou s o age ime,
da a showed ha he addi ion o DMF kep he mo ili y and spe m plasma memb ane
in eg i y a e 24 hou s o s o age be e han o he ex ende s.
Summa ising, hese esul s demons a ed ha he addi ion o DMF o INRA 96® diluen
exe s a p o ec i e e ec on he memb ane o spe ma ozoa and he e o e i imp o e
seminal quali y. Mo eo e NMP could no be used o eplace DMF conside ing ha wo se
esul s we e ob ained. Also we a e in ag eemen wi h p e ious esul s epo ed o he
oxici y o glyce ol, which made i no a good c yop o ec o (Al a iño, 1993; Gilmo e e
al., 1995; Okuda e al., 2007). Finally, he empe a u e o s o age among 4ºC and 16ºC
did no a ec he quali y o abbi spe m dilu ed wi h INRA 96®.
67
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VII. AKNOWLEDGEMENTS
The au ho s would like o hank Miguel Domingo, chie o Técnicas Cunícolas S.A. a m,
o his incalculable help in he ieldwo k. This s udy was suppo ed by Go e nmen o
A agon Resea ch G oups (Fondo Social Eu opeo, DGA) and IA2.
71
VIII. ABBREVIATIONS
CPA: C yop o ec an agen s
DMF: N, N-Dime hyl o mamide
NMP: N-Me hyl-2-Py olidone
AI: A i icial insemina ion
MOT: Pe cen age o mo ile spe ma ozoa
VCL: Cu ilinea eloci y
VSL: S aigh -line eloci y
VAP: A e age pa h eloci y
LIN: Linea i y
STR: S aigh ness
WOB: Wobble
ALH: Ampli ude o la e al head displacemen
BCF: Bea c oss equency
HOS es : Hypo-osmo ic swelling es

79
Compa ison o di e en semen ex ende s and c yop o ec an
agen s o enhance he c yop ese a ion o abbi spe ma ozoa
Paula Domingo, Mai e Olaci egui, Noelia González, Ignacio De Blas, Lydia Gil
I. ABSTRACT
The pu pose o his esea ch was o ind a sui able p o ocol o enhance ozen abbi spe m
p ese a ion analysing he ole ha seminal plasma (SP) plays and he e ec o di e en
c yop o ec an agen s on spe m quali y 0 and 2 hou s a e hawing. Spe m samples we e
pooled and di ided in eigh ac ions. Fou o hem we e dilu ed wi h Bo uC io® (ex ende
A), INRA 96® plus 6% glyce ol (ex ende B), 6% N, N-Dime hyl o mamide (ex ende C)
and 6% N-me hyl-2-py olidone (ex ende D) espec i ely. The o he ou ac ions we e
cen i uged and he supe na an was disca ded in o de o elimina e SP. Each sample was
hen esuspended wi h ex ende A, B, C and D. Samples we e cooled p og essi ely,
loaded in o 0.5ml eezing s aws and ozen wi h liquid ni ogen apou . Thawing was
pe o med by placing he s aws in o a bain-ma ie a 37ºC o 21 seconds. S aws we e
d ied and spe m samples placed in o eppendo ubes o be analyzed by ISAS® so wa e,
i ali y es , HOS es and ac osome in eg i y es . A e he esul s, he highes da a on
mo ili y and eloci y pa ame e s was ob ained by ex ende A (P<0.050) e en when he
mo ili y pa ame e was compa ed wi h p e ious s udies using o he diluen s.
Addi ionally, spe m quali y dec eased o e incuba ion ime (P<0.050) and no di e ences
we e ound in samples p ocessed wi h o wi hou SP. This esea ch e eal ha Bo uC io®
could be used o abbi spe m c yop ese a ion and mo eo e he imp o emen o he
c yop ese a ion p ocess o abbi spe m due o he demons a ion ha SP emo ing is
no equi ed.
Keywo ds: Bo uc io®; C yop o ec an ; Dime hyl o mamide; Glyce ol; N-me hyl-2-
py olidone; Rabbi Spe m P ese a ion.
II. INRODUCTION
Assis ed Rep oduc i e Technologies in mammals ha e been s eadily p og essing o e he
yea s o main aining and p ese ing b eeds on he e ge o ex inc ion. Mo eo e , a
necessi y o anspo gene ic esou ces all o e he wo ld ins ead o li e animals leads o
de elop an al e na i e echnology. A possible al e na i e may be spe m c yop ese a ion
80
which is an economy me hod able o p ese e gene esou ces and ca y spe m be ween
emo e des ina ions. Howe e , due o he issues associa ed wi h he use o eeze- hawed
spe m (lowe e ili y and p oli icacy han cooled spe m), a i icial insemina ion wi h
c yop ese ed abbi spe m has no been used o comme cial pu poses a p esen (López
and Al a iño 1998; Mocé and Vicen e 2009).
Du ing he eeze- hawing p ocedu e in acellula ice c ys als a e o med in mammalian
spe m cells causing cell des uc ion and memb ane damage (Fulle and Payn e 2004;
He nández e al. 2012). To a oid his se e e i e e sible damage i is necessa y o enhance
c yop ese a ion p o ocols by adding new sui able c yop o ec an agen s (CPA).
Glyce ol has been he main CPA used o p ese e domes ic o wild animal spe m (Cu y
e al. 1995). Ne e heless, glyce ol has no been he i s CPA o choice o p ese e abbi
semen due o i s oxici y, which may esul in osmo ic s ess, p o ein dena u a ion,
al e a ion o ac in in e ac ions and induc ion o p o ein- ee memb ane blis e ha leads
o ge wo se e ili y (Al a iño 1993; Gilmo e e al. 1995; Ia aldano e al. 2012).
Nega i e e ec s o glyce ol may be ela ed wi h he high molecula weigh which leads
o pe mea ing he cell memb ane mo e slowly han o he CPA (Gilmo e e al. 1995).
Consequen ly he ideal CPA should ha e low molecula weigh and high pe meabili y
(Da in-benne and Whi e 1977). Amide o me hyl g oups ha e lowe molecula weigh
and g ea e wa e solubili y han glyce ol being able o educe osmo ic damage (Cu y e
al. 1995; Mocé and Vicen e 2009).
An amide sol en ha could be used as an al e na i e o p epa e eezing ex ende s and
educe memb ane damage caused du ing he p ocedu e is N, N-Dime hyl o mamide
(DMF). To da e, no s udies we e pe o med using DMF as CPA o abbi spe m
c yop ese a ion. Ne e heless, he e icacy o DMF o c yop ese e spe m has been
s udied on s allion (Olaci egui e al. 2014), boa (Malo e al. 2009), dog (Lopes e al.
2009), goa (Beze a e al. 2011) and owl (Chalah e al. 1999).
Ano he amide sol en commonly used in chemical eac ions is N-me hyl-2-py olidone
(NMP). Despi e ha ing simila cha ac e is ics o DMF no p e ious s udies ha e been
pe o med.
The lack o e icien c yop ese a ion p o ocols in abbi s along wi h he ew s udies
ca ied ou on glyce ol e ec in abbi spe m c yop ese a ion and he absence o s udies
on p ese ing ozen abbi spe m wi h DMF o NMP, led o in es iga ion he e ec o
81
hese h ee CPA. The e o e, he pu pose o his esea ch was o ind a sui able p o ocol
o enhance ozen abbi spe m p ese a ion analysing he ole ha SP plays and
u he mo e he e ec o di e en CPA on spe m quali y 0 o 2 pos - haw.
III. MATERIALS AND METHODS
Chemicals
Unless no ed o he wise, all chemicals we e om Pan eac Quimica S.L.U (Ba celona,
Spain).
Animals
The s udy was pe o med ollowing app o al by he Ve e ina y E hical Commi ee o
Uni e si y o Za agoza. The ca e and use o animals we e pe o med acco ding o he
Spanish Policy o Animal P o ec ion RD1201/05, which mee s he Eu opean Union
Di ec i e 86/609 on he p o ec ion o animals used o expe imen al and o he scien i ic
pu poses.
Eigh Cali o nian-New Zeland whi e hyb id bucks p e iously selec ed om a comme cial
AI cen e (Técnicas Cunícolas S.A., Za agoza, Spain) we e used as dono s. Males we e
housed in indi idual cages wi h a ligh cycle o 12 hou s ligh /da k a a oom empe a u e
o 22-24ºC and a ela i e humidi y o 60-70%. All abbi s we e ed a comme cial pelle
die acco ding o hei ep oduc i e condi ion and esh wa e was p o ided ad libi um.
Semen collec ion and p ocessing
Semen was collec ed using a i icial agina (IMV Technologies, L’Aigle, F ancia) a
50ºC and any gel plug was emo ed. Be o e dilu ion, a mic oscopic analyse o he mo ili y
and a mac oscopic analyse o e alua e he colou and he olume o he sample we e
pe o med in he a m. Only whi e colou ejacula es wi h a leas o 0.2ml and 85% o
mo ili y we e used o he esea ch. All ejacula es we e pooled o elimina e indi idual
di e ences.
Expe imen al design
Figu e 1 illus a es he expe imen al design. Pooled semen samples we e di ided in o
eigh ac ions, ou o hem we e dilu ed (1:5) a oom empe a u e wi h ou di e en
semen ex ende s: Bo uC io® (Nidacon, Mölndal, Sweden: 1% glyce ol and 4%
me hyl o mamid) (Ex ende A), INRA 96® (IMV Technologies, L’Aigle, F ance:
82
pu i ied ac ion o milk micella p o eins) supplemen ed wi h 6% glyce ol (Ex ende B),
INRA 96® supplemen ed wi h 6% DMF (Ex ende C) and INRA 96® supplemen ed wi h
6% NMP (Ex ende D). The o he ou ac ions we e cen i uged once a 700x g o 10
minu es a 37ºC, and he supe na an was disca ded o elimina e SP. Then each pelle was
esuspended (1:5) wi h ex ende A, ex ende B, ex ende C and ex ende D.
F eezing and hawing p o ocol
C yop ese a ion p ocedu e was pe o med as p e iously desc ibed (Al a iño 1993;
Mocé and Vicen e 2009). B ie ly, samples we e cooled p og essi ely om 37ºC o 4ºC
o e 90 o 120 minu es and loaded in o 0.5 ml eezing s aws (Mini ube Ibe ica,
Ta agona, Spain). F eezing s aws we e ozen ho izon ally in acks placed 4 cm abo e
he su ace o liquid ni ogen (LN2) o 20 minu es and hen plunged in o LN2 (-196ºC)
o s o age. A e 1 mon h, samples we e hawed by placing he s aws in o a bain-ma ie
a 37ºC o 21 seconds. S aws we e d ied and spe m samples placed in o eppendo ubes
loca ed in o a bain-ma ie a 37ºC. Thawed samples we e main ained a 37ºC and analyzed
immedia ely a e hawing and pas 2 hou s.
E alua ion o spe ma ozoa
Spe m mo ili y, kinema ic pa ame e s, i ali y, memb ane in eg i y and ac osome
in eg i y o all he samples we e assessed immedia ely a e hawing and pas 2 hou s.
- Assessmen o spe m mo ili y and kinema ic pa ame e s
Spe m mo ili y and kinema ics pa ame e s we e e alua ed by ISAS® so wa e (PROISER
R+D, Valencia, Spain) ollowing he de aul se ing speci ically o abbi s. Fi e
mic oli e s was placed on a slide and co e ed wi h 20 × 20mm co e slip. Fi e ields we e
andomly cap u ed a ×10 magni ica ion by phase-con as mic oscope. Up o 200 ames
pe second we e acqui ed selec ing pa icles wi h an a ea o be ween 10 and 70µm2. The
linea ly mo ile spe m we e de ia ed <45% om a s aigh line. The analyses p o ided
in o ma ion abou he pe cen age o mo ile spe ma ozoa (MOT, %), cu ilinea eloci y
(VCL, µm/s), s aigh -line eloci y (VSL, µm/s), a e age pa h eloci y (VAP, µm/s),
linea i y (LIN=VSL/VCL, %), s aigh ness (STR=VSL/VAP, %), wobble
(WOB=VAP/VCL, %), ampli ude o la e al head displacemen (ALH, µm) and bea c oss
equency (BCF, Hz).
83
- Assessmen o i ali y
Eosin-nig osin s ain was used o e alua e he i ali y o he spe ma ozoa ollowing he
p o ocol desc ibed by Bjo ndahl e al. (2003). An aliquo o semen was pu o e a glass
slide, mixed wi h an equal olume o eosin-nig osin suspension and made a smea on a
glass slide. Immedia ely a e he smea was d y, 100 spe ma ozoa in each eplica e we e
examined by mic oscope a ×400 magni ica ion and coun ed on he aid o a labo a o y
coun e . Li e spe ma ozoa had whi e heads and dead spe ma ozoa had ed o da k pink
heads.
- Assessmen o spe m plasma memb ane in eg i y
Hypo-osmo ic swelling es (HOS es ) was pe o med ollowing he p o ocol es ablished
by Jeyend an e al. (1984). B ie ly, 90µl o HOS es solu ion (100mM o Sodium Ci a e)
was placed in o an eppendo ube o wa m a 37ºC o 5 minu es. Once i was hea ed, i
was added o 10µl o semen, and he mix u e was mixed gen ly wi h he pipe e and kep
a 37ºC o leas 30 minu es. Subsequen ly, 100µl o 2% glu a aldehyde solu ion was
added o ix he sample. Ten mic oli e s o he mix u e was placed on o a glass slide and
co e ed wi h a co e slip o examine 100 spe ma ozoa in each eplica e by phase-con as
mic oscope a ×400 magni ica ion. Spe ma ozoa wi h in ac memb anes allowed an in lux
o wa e inside hem esul ing in swollen spe ma ozoa wi h coiled ail (Amo im e al.
2009).
- Assessmen o ac osome in eg i y
The p o ocol de eloped by Pu sel and Johnson (1974) based on he ixa ion o he
spe ma ozoa o app ecia e he mo phology and he in eg i y o ac osome memb ane. Ten
mic oli e s o semen was immedia ely ixed in 90µl o glu a aldehyde 2% solu ion, igh
a e 10µl o he mix u e was placed on o a glass slide and co e ed wi h a co e slip o
examine 100 spe ma ozoa in each eplica e by phase-con as mic oscope a x1000
magni ica ion and imme sion oil. Ac osomes we e di e en ially ca ego ized in o wo
classes: in ac ac osome (no mal apical idge) and damaged ac osome (damaged apical
idge and/o missing apical idge).
S a is ical analysis
The s udy was eplica ed h ee imes. Da a we e analysed using IBM SPSS 19.0 so wa e
o Windows (SPSS, Chicago, USA). Resul s we e exp essed as mean ± SEM. The e ec
o he ex ende , SP and ime elapsed a e hawing on all he pa ame e s we e analysed

84
by a Gene al Linea Model (GLM) using a comple e ac o ial design wi h in e ac ions
be ween ac o s. Duncan's pos -hoc es was used o e alua e he e ec o he ex ende .
The le el o signi icance was se a P<0.050.
IV. RESULTS
The compa ison be ween he ea men s showed ex ende A ob ained he highes da a
(P<0.050) on kinema ic pa ame e s as MOT, VCL, VSL, VAP, ALH and BCF (Table 1)
and also on o he spe m quali y pa ame e s like i ali y and ac osome in eg i y (Figu e
2). Ne e heless, as shown Figu e 2, he g ea es p o ec ion o spe m plasma memb ane
was pe o med by ex ende B and samples dilu ed wi h ex ende D showed he wo s da a
on spe m quali y.
As expec ed, almos all spe m pa ame e s lessened pas 2 hou s hawed. Kinema ic
pa ame e s like MOT (32.5±1.4% a 0h; 15.4±1.4% a 2h), VCL (53.1±1.5µm/s a 0h;
32.8±1.5µm/s a 2h), VSL (17.1±0.4µm/s a 0h; 13.1±0.4µm/s a 2h), VAP
(29.8±0.7µm/s a 0h; 21.5±0.5µm/s a 2h), ALH (2.7±0.1µm a 0h; 2.4±0.1µm a 2h) and
BCF (5.6±0.3Hz a 0h; 3.2±0.3Hz a 2h) signi ican ly dec eased (P<0.050) pas 2 hou s
hawed none heless, o he kinema ic pa ame e s as LIN (32.8±0.9% a 0h; 41.2±0.9% a
2h), STR (57.6±0.9% a 0h, 61.1±0.8% a 2h) and WOB (56.7±0.9% a 0h; 67.2±0.8% a
2h) aised signi ican ly (P<0.050) a e 2 hou s pos hawing. Spe m i ali y and plasma
memb ane we e a ec ed by he ime elapsed a e hawing (P<0.050) (Figu e 3).
Con e sely, in eg i y o ac osome memb anes was main ain 2 hou s pos - haw.
The in e ac ion be ween he ex ende and he ime a e hawing was analysed. The e was
ound signi ican di e ence (P<0.001) in he pe cen age o mo ile spe ma ozoa be ween
spe m immedia ely pos - haw and spe m a e 2 hou s incuba ion pos - haw in e e y
g oup (ex ende ) (Table 2). The highes pe cen age o mo ile spe ma ozoa was eached
by ex ende A a 0 hou s a e hawing (52.9±2.8%). Ex ende D go he wo s alues a
0 and 2 hou s pos - haw.
Rega ding all spe m pa ame e s s udied, signi ican di e ences be ween eeze- hawed
abbi spe m samples p ocessed wi h o wi hou SP we e no app ecia ed (Table 3).
85
V. DISCUSSION
Spe m c yop ese a ion echnique is used o conse a ion o banking esou ces
(endange ed b eeds o high- alue males), animal gene ic di usion be ween coun ies
(semen om selec ed lines) and esea ch. On accoun o he lack o an e icien
c yop ese a ion me hod, many au ho s ha e ied o imp o e i by es ing ex ende s
(López and Al a iño 2000; Ca luccio e al. 2004) and CPA (Dalima a and G aham 1997;
Rosa o and Ia aldano 2013; Johinke e al. 2014; Nishijima e al. 2015). Ne e heless,
Ca luccio e al. (2004) demons a ed ha INRA 96® diluen main ained chilled abbi
spe m quali y be e han o he s e en hough i was made speci ically o chilling s allion
spe m p ese a ion. To a oid c yodamage caused du ing eeze- hawing spe m p ocess
some CPA should be added o chilling diluen (Fulle and Payn e 2004; He nández e al.
2012). Addi ionally, he e a e ex ende s eady o use in spe m c yop ese a ion such as
Bo uC io® which is composed o lowe concen a ion o glyce ol (1%) and amides (4%).
In his s udy has been obse ed ha he addi ion o CPA as 6% o glyce ol, DMF o NMP
o INRA 96® (speci ic diluen o p ese e cooled spe m) we e no sui able o main ain
spe m quali y du ing eeze- hawing p ocedu e as well as Bo uC io® (speci ic diluen o
p ese e ozen spe m). The highes da a on mo ili y and eloci y pa ame e s (VCL, VSL
and VAP) ob ained by Bo uC io® con i med he hypo hesis o Salmani e al. (2014)
sugges ing ha high concen a ions o CPA may inc ease he iscosi y o he media and
he e o e dec ease he eloci y and mo emen cha ac e is ics o spe ma ozoa. And
u he mo e, he di e en concen a ion o glyce ol con ained in Bo uC io® (1% glyce ol)
and ex ende A (6% glyce ol) could be one o he easons o Bo uC io® main ain be e
spe m quali y han ex ende A, suppo ing o he au ho s who demons a ed ha he oxic
e ec o glyce ol on abbi spe m is di ec ly ela ed o he concen a ion and he ime o
cell exposu e (Al a iño 1993, Swain 2010).
To highligh , o he s udies in s allion spe m c yop ese a ion (Olaci egui e al. 2014)
sugges ed ha DMF should be used o c yop ese a ion; con a y in o he animal species
like boa (Malo e al. 2009), canine (Lopes e al. 2009), goa (Beze a e al. 2011) and
owl (Chalah e al. 1999) concluded ha glyce ol was mo e sui able CPA han DMF o
spe m c yop ese a ion. In ou s udy signi ican di e ences we e no ound be ween
glyce ol o amide sol en s (DMF and NMP). These esul s di e om o he au ho s such
as Cu y e al. 1995 and Mocé and Vicen e 2009 sugges ing ha he mos app op ia e
sol en s o use in abbi spe m c yop ese a ion should ha e low molecula weigh and
86
high pe meabili y as amide sol en s. Mo eo e , hese esul s sugges ed ha he
di e ences in a y acid composi ion and s e ol le els o mammals spe m memb ane
(Da in-Benne and Whi e 1977) make e e y animal species equi es a speci ic CPA
acco ding o hei needs.
The mo ili y is one o he mos s udied pa ame e s which is ela ed di ec ly o spe m
quali y. Dalima a and G aham (1997) s udied he c yop ese a ion o abbi spe ma ozoa
using di e en CPA concluding ha he combina ion o cell pe mea ing CPA (ace amide)
wi h cell non-pe mea ing CPA ( ehalose and me hyl cellulose) was he mos e ec i e
media o abbi spe m c yop ese a ion eaching 46±3% o mo ile spe ma ozoa a e
hawing. Simila ly esul s we e ound by Rosa o and Ia aldano (2013) using 0.1M
ehalose o eeze- hawed abbi spe m (45% o MOT) and Nishijima e al. (2015)
demons a ing ha 1.5% o leci hin could be used as a CPA o eeze- hawed abbi spe m
(34.3±7.3% o MOT). Two in e es ing esea ches we e pe o med by Kulíko á e al. One
was published in 2015 whe e hey s udied he c yop o ec i e e ec o Ficoll (non-
pe meable CPA) on he abbi spe ma ozoa quali y, as a esul Kulíko á e al. achie ed
50.93% o mo ile spe m 0 minu es a e hawing and 26.93% o MOT a e 2 hou s pos
haw. A ecen esea ch was published in 2017, whe e Kulíko á e al. demons a ed no
b eed e ec (Ni a and Zobo abbi ) on mo ile spe m a e hawing, no eaching 40% o
mo ile spe ma ozoa immedia ely pos haw. In e es ingly compa ing wi h a ailable
publica ions, his esea ch achie ed he highes pe cen age o MOT (52.9±2.8%)
p ocessing abbi spe m samples wi h Bo uC io®.
As o he au ho s ha e published, he spe m quali y dec eased pas 2 hou s a 37ºC hawed
(Kulíko á e al. 2015; Hall e al. 2017) may be due o he pe oxida ion o spe ma ozoa
du ing he conse a ion (Da in-Benne and Whi e 1977; Cas ellini e al. 2006). In spi e o
almos all pa ame e s dec eased, he e was no obse ed a signi ican al e a ion on he
memb ane o he ac osome a e 2 hou s hawed. This app ecia ion along wi h he good
pe cen age o ali e and mo ile spe ma ozoa sugges s ha ozen spe m samples hawed
du ing 2 hou s may be able o use o a i icial insemina ion. Na u ally, he as e a i icial
insemina ion wi h hawed spe m is pe o med, highe e ili y a e will be ob ained.
In he p esen expe imen he elimina ion o SP p io o c yop ese a ion did no exe a
bene icial e ec on spe m su i al pos eeze- hawing p ocedu e. This obse a ion is in
ag eemen wi h p e ious indings o Gogol (1999), epo ing ha eeze- hawed samples
87
p ocessed wi h SP ob ained simila e ili y (81%) han samples wi hou SP (77%).
Simila ly Dalima a and G aham (1997) and Aksoy e al. (2008) came o he conclusion
ha a de imen al e ec o SP emo ing du ing c yop ese a ion p ocess on spe m
e ilizing abili y seems unlikely. Fo ha eason, despi e SP con aining bene icial
componen s o spe m, his esul s sugges ha i is no necessa y o emo e SP du ing
c yop ese a ion p ocess wha would diminish and acili a e eeze- hawing spe m
p o ocol.
VI. CONCLUSION
To ou knowledge Bo uC io® has ne e been s udied o eezing abbi spe m and whils
i is a comme cial diluen o s allion spe m c yop ese a ion, he inding o his esea ch
is e y impo an e ealing ha Bo uC io® is a good ex ende o using in eeze- hawing
abbi spe m p ocedu e. Anyhow, u he s udies should be ca ied ou o con i m his
esul s by in i o expe imen s and de e mine he op imal concen a ion o glyce ol, DMF
and NMP c yop o ec an s. Addi ionally, a i icial insemina ion wi h ozen spe m should
pe o m immedia ely a e hawing and he elimina ion o SP is no necessa y making
easie he c yop ese a ion p ocess o abbi spe m.
VII. AKNOWLEDGEMENTS
The au ho s would like o hank Miguel Domingo, chie o Técnicas Cunicolas S.A. a m,
o his incalculable help in he ieldwo k. This s udy was suppo ed by Go e nmen o
A agon Resea ch G oups (Fondo Social Eu opeo, DGA) and IA2.
VIII. REFERENCES
Al a iño M.R. (1993): Con ol de la ep oducción del conejo. Ed. Mundi-P ensa, Mad id,
España.
Amo im E.A.M., To es C.C.A., G aham J.K., Amo im L.S., San os L.V.L. (2009): The
hypoosmo ic swelling es in esh abbi spe ma ozoa. Animal Rep oduc ion Science, 11,
338-343.
Aksoy M., Canka Lechimcioglu N., Akman O. (2008): E ec o seminal plasma on
unc ional in eg i y o abbi spe m memb anes du ing s o age a 4ºC o eezing. Wo ld
Rabbi Science, 16, 1-6.
94
Table 2
Pe cen age o mo ile spe ma ozoa o pos haw abbi spe m a 0 and 2 hou s dilu ed wi h
ex ende A, B, C and D om SP and Non-SP g oups.
Hou s
a e hawing
MOT
(%)
Ex ende A
0
52.9±2.8a
2
24.3±2.8bc
Ex ende B
0
25.6±2.8b
2
16.8±2.8c
Ex ende C
0
35.0±2.8b
2
11.9±2.7d
Ex ende D
0
16.4±2.7c
2
8.7±2.7e
*Di e en le e s wi hin each column deno e s a is ical di e ences (P<0.050). Da a a e
mean ± SEM.
Table 3
E ec o seminal plasma on eeze- hawed abbi spe ma ozoa on MOT, i ali y, HOS
es and ac osome in eg i y pa ame e s.
MOT
(%)
VCL
(µm/s)
VSL
(µm/s)
VAP
(µm/s)
LIN
(%)
STR
(%)
Wi hou SP
24.0±1.4
42.5±1.5
14.9±0.4
25.1±0.7
37.0±0.9
59.9±0.9
Wi h SP
23.9±1.4
43.4±1.5
15.4±0.4
26.2±0.7
36.9±0.9
58.8±0.8
p
0.968
0.684
0.480
0.327
0.928
0.351
WOB
(%)
ALH
(µm)
BCF
(Hz)
Vi ali y
(%)
HOS
es
(%)
Ac osome
in eg i y
(%)
Wi hou SP
61.6±0.9
2.6±0.1
4.5±0.3
42.7±1.5
43.7±1.6
41.6±2.8
Wi h SP
62.4±0.9
2.6±0.1
4.3±0.3
40.9±1.5
45.2±1.7
36.1±2.9
p
0.519
0.984
0.687
0.387
0.479
0.230
* Da a a e mean ± SE.

A ículo 5
“Long- e m p ese a ion o eeze-d ied abbi spe m by
adding osma inic acid and di e en chela ing agen s”
(
C yobiology.
81, 174-177, 2018)
97
98
99

100
CONCLUSIONES
103
CONCLUSIONES
1. La adición de DMF al diluyen e base de e ige ación INRA 96® eje ce un e ec o
p o ec o sob e la memb ana de los espe ma ozoides mejo ando la calidad de los
mismos du an e un pe íodo de e ige ación de 72 ho as.
2. El man enimien o del PS du an e la e ige ación espe má ica eje ce un e ec o
p o ec o sob e las memb anas de los espe ma ozoides y mejo a los pa áme os
ciné icos.
3. En la congelación espe má ica la eliminación p e ia del PS no mejo a la calidad
de los espe ma ozoides as la descongelación, siendo innecesa ia su eliminación.
4. El diluyen e Bo uC io® ep esen a una al e na i a en la congelación seminal en la
especie cunícola.
5. El agen e quelan e EDTA p ese a más e icien emen e la in eg idad del ADN de
los espe ma ozoides de conejo lio ilizados y además, la adición de ácido
osma ínico en el medio de lio ilización disminuye el po cen aje de ADN
agmen ado.
6. Los espe ma ozoides de conejo lio ilizados pueden conse a se an o a 4ºC como
a empe a u a ambien e, o eciendo simila es po cen ajes de ADN agmen ado
as su ehid a ación.

111
RESUMEN
La inseminación a i icial (IA) con semen e ige ado es la p ác ica más común en las
explo aciones cunícolas, po lo que cualquie mejo a en la misma ayuda ía a aumen a
signi ica i amen e su e iciencia. Po o o lado, la congelación espe má ica en cunicul u a
es un mé odo u ilizado únicamen e en in es igación o pa a la p ese ación de especies en
pelig o de ex inción, debido a la baja asa de supe i encia espe má ica as la
descongelación seminal. De es e modo, una mejo a en la écnica de congelación acili a ía
el almacenamien o de ecu sos gené icos y el anspo e de ma e ial gené ico sin la
necesidad de anspo a animales i os. Po úl imo, la lio ilización de espe ma ozoides
es un mé odo muy inno ado que aún es á en p oceso de desa ollo. La pues a a pun o de
es e mé odo supond ía un g an a ance en la ep oducción asis ida, ya que acili a ía el
almacenamien o de dosis seminales du an e la gos pe íodos de iempo sin la necesidad
de u iliza ni ógeno líquido (LN2). Po odo ello, el p incipal obje i o de es e abajo ue
in es iga los di e en es pun os c í icos de los p ocesos de e ige ación, congelación y
lio ilización espe má ica con el in de mejo a la p ese ación seminal en la especie
cunícola.
El obje i o de la p ime a expe iencia ue e alua si el plasma seminal (PS) puede mejo a
la calidad de los espe ma ozoides almacenados a 16ºC du an e 72 ho as y ambién e alua
el e ec o p o ec o del glice ol, DMF y NMP. Las mues as seminales se homogeneiza on
y di idie on en ocho acciones. Una de ellas se diluyó con INRA 96® (diluyen e A) y las
o as es con INRA 96® y un c iop o ec o (CP) al 6%: glice ol (diluyen e B), DMF
(diluyen e C) o NMP (diluyen e D). Las o as cua o acciones se cen i uga on y el
sob enadan e se desca ó pa a elimina el PS. A con inuación, cada mues a se
esuspendió con el diluyen e A, B, C o D, espec i amen e. Todas las mues as se
almacena on a 16ºC y se analiza on a las 4, 24, 48 y 72 ho as median e el sis ema
in eg ado de análisis de semen (ISAS®) y las p uebas de i alidad, es hipoosmó ico
(HOS es ) e in eg idad del ac osoma. T as analiza los esul ados, las mues as
p ocesadas con PS mos a on un mayo po cen aje (p=0.020) de espe ma ozoides con la
memb ana plasmá ica sin daña (71,9±1,6%) que las mues as p ocesadas sin PS
(66.5±1.6%). Po o o lado, los espe ma ozoides sin PS ob u ie on mejo es pa áme os
ciné icos. Los diluyen es A y C mos a on excelen es esul ados en MOT (63.1±4.3%
Resumen
112
diluyen e A; 63.4±3.7% diluyen e C), i alidad (88.9±2.6% diluyen e A; 87.7 ± 2.7%
diluyen e C) y HOS es (68.9±1.4% diluyen e A; 75.2±1.4% diluyen e C). Los peo es
esul ados ue on ob enidos po los diluyen es B y D. Es os esul ados sugie en que el PS
eje ce una acción p o ec o a en las memb anas de los espe ma ozoides de los conejos y
man iene la MOT. La adición de glice ol y NMP a un diluyen e de e ige ación base
como INRA 96® no mejo a la calidad del espe ma del conejo. Sin emba go, la DMF
eje ce un e ec o p o ec o sob e la memb ana de los espe ma ozoides mejo ando la
calidad seminal du an e la p ese ación del espe ma del conejo a 16ºC.
En la segunda expe iencia se alo ó el e ec o de di e en es c iop o ec o es como el
glice ol, DMF y NMP en espe ma ozoides de conejo e ige ados a dos empe a u as
(16ºC y 4ºC) du an e 72 ho as. Las mues as seminales se di idie on en cua o acciones
y se diluye on con: INRA 96® (diluyen e A) e INRA 96® con un CP al 6%: glice ol
(diluyen e B), DMF (diluyen e C) o NMP (diluyen e D). Pos e io men e cada mues a se
di idió en dos ubos eppendo pa a se almacenada cada mues a a 16ºC y 4ºC. Se
analiza on a las 4, 24, 48 y 72 ho as con el p og ama ISAS® y se ealiza on las p uebas
i alidad, HOS es y la in eg idad del ac osoma. Como esul ado, el diluyen e C mos ó
una mayo MOT, i alidad y HOS es que el ex ende B y D (p<0.050). A pesa de que
la calidad seminal disminuyó con el iempo (p<0.050), se obse ó que a las 24 ho as de
almacenamien o, las mues as p ocesadas con DMF man u ie on una mayo MOT y de
espe ma ozoides con la memb ana plasmá ica sin daña . Es os esul ados sugie en que la
adición de glice ol y NMP a INRA 96® no o ece en ajas. Sin emba go, se ha demos ado
que la adición de DMF a INRA 96® eje ce un e ec o p o ec o sob e la memb ana de los
espe ma ozoides mejo ando la calidad seminal. La empe a u a de almacenamien o en e
16ºC y 4ºC no a ec ó la calidad de los espe ma ozoides de los conejos.
El obje i o de la e ce a expe iencia ue encon a un p o ocolo adecuado pa a mejo a la
c iop ese ación de espe ma ozoides de conejo analizando el papel que desempeña el PS
y di e en es CP sob e la calidad seminal en el momen o de la descongelación y
anscu idas 2 ho as. Las mues as seminales se homogeneiza on y se di idie on en ocho
acciones. Una de ellas se diluyó con Bo uC io® (diluyen e A) y las o as es con INRA
96® más un CP al 6%: glice ol (diluyen e B), DMF (diluyen e C) o NMP (diluyen e D).
Las o as cua o acciones se cen i uga on y el sob enadan e se desca ó pa a elimina
el PS. Luego, cada mues a se esuspendió con el diluyen e A, B, C o D. Las mues as se
en ia on p og esi amen e, se ca ga on en pajuelas de congelación de 0.5 ml y se
Resumen
113
congela on con apo es de LN2. La descongelación se ealizó colocando las pajuelas en
un baño ma ía a 37ºC du an e 21 segundos. Las mues as se coloca on en ubos eppendo
pa a su análisis median e el p og ama ISAS®, y se ealiza on las p uebas de i alidad,
HOS es e in eg idad del ac osoma. Los mejo es esul ados de MOT y pa áme os
ciné icos ue on ob enidos po diluyen e A (p<0.050), incluso cuando se compa ó la MOT
con es udios p e ios u ilizando o os diluyen es. La calidad de los espe ma ozoides
disminuyó a las 2 ho as de su descongelación (p<0.050) y no se encon a on di e encias
signi ica i as en e las mues as p ocesadas con o sin PS. Es a expe iencia e ela que el
Bo uC io® pod ía usa se pa a la c iop ese ación de espe ma ozoides de conejos y,
además, que la eliminación del PS du an e el p oceso de congelación seminal no es
necesa ia, acili ando y educiendo el iempo de p ocesado de las mues as.
En la cua a expe iencia se in en a on mejo a las condiciones de almacenamien o de
mues as de semen lio ilizadas añadiendo al medio de lio ilización di e en es agen es
quelan es como EDTA y EGTA y un an ioxidan e (ácido osma ínico). La lio ilización
se ha aplicado como una ecnología al e na i a pa a p ese a ecu sos gené icos du an e
la gos pe íodos de iempo y pe mi i el en ío de espe ma ozoides a 4ºC en e la gas
dis ancias. Sin emba go, el ADN de los espe ma ozoides puede daña se debido al es és
mecánico u oxida i o al que son some idos du an e la lio ilización. Pa a lle a a cabo es a
expe iencia los espe ma ozoides de conejo se lio iliza on en medio básico ( ampón T is-
HCl 10 mM y NaCl 50 mM) suplemen ado con EGTA 50 mM (EGTA), EGTA 50 mM
más ácido osma ínico 105 μM (EGTA-RA), EDTA 50 mM (EDTA) o EDTA 50 mM
más 105 μM ácido osma ínico (EDTA-RA). Las mues as de semen se man u ie on a
4ºC y empe a u a ambien e du an e 8 meses. T as la ehid a ación, la in eg idad del ADN
se e aluó con el es de dispe sión de la c oma ina del espe ma ozoide (SCD ) obse ando
que la agmen ación del ADN e a mayo cuando las mues as de semen se lio ilizaban
con EGTA (10.9%) en ez de EDTA (4.1%) (p<0.001). Además, el ácido osma ínico
ac uó mejo en condiciones ad e sas y no se encon a on di e encias signi ica i as en el
almacenamien o a empe a u a ambien e. Po ello, la lio ilización es un mé odo que puede
pe mi i la conse ación de ecu sos gené icos en e 4 y 25ºC du an e 8 meses y
anspo a los sin la necesidad de LN2 o hielo seco. El agen e quelan e EDTA es el medio
de lio ilización más adecuado pa a p ese a semen de conejo lio ilizado y la adición de
ácido osma ínico p o ege el ADN con a el es és oxida i o causado du an e la
lio ilización.
SUMMARY

117
SUMMARY
A i icial insemina ion wi h cooled semen is he mos common p ac ise in abbi a ms
and any imp o emen in i helps o inc ease he e iciency o abbi mea a ms. On he
o he hand, he c yop ese a ion o abbi spe m is a me hod only used o esea ching o
p ese ing b eeds on he e ge o ex inc ion, due o he low a e o spe m su i al a e
hawing. In his way, an imp o emen o he c yop ese a ion p ocess could make easie
he s o age o gene ic esou ces and he anspo o seminal doses ins ead o li e animals.
Finally, eeze-d ying is a e y inno a i e me hod ha is s ill in de elopmen p ocess.
Tuning o his me hod would be a g ea ad ance in assis ed ep oduc ion, since i would
acili a e he s o age o seminal doses o long pe iods o ime wi hou he need o use
liquid ni ogen (LN2).
The e o e, he main objec i e o his esea ch was o in es iga e he di e en c i ical
poin s o spe m e ige a ion, eeze- hawing and eeze-d ying p ocess in o de o
imp o e seminal p ese a ion in he abbi species.
The pu pose o he i s expe imen was e alua e whe he seminal plasma (PS) can
imp o e spe m quali y o abbi spe ma ozoa s o ed a 16ºC ill 72 hou s and mo eo e
e alua e he c yop o ec an e ec o glyce ol, DMF and NMP. Semen samples we e
pooled and di ided in eigh ac ions. Fou o hem we e dilu ed wi h INRA 96® (ex ende
A), INRA 96® wi h 6% glyce ol (ex ende B) o 6% DMF (ex ende C) o 6% NMP
(ex ende D) espec i ely. The o he ou ac ions we e cen i uged and he supe na an
was emo ed in o de o elimina e PS. Then each sample was esuspended wi h ex ende
A, B, C and D espec i ely. All samples we e s o ed a 16ºC and we e analysed a 4, 24,
48 and 72 hou s by in eg a ed spe m analysis sys em (ISAS®), i ali y es , hypo-osmo ic
swelling es (HOS es ) and ac osome in eg i y es . A e analyse he esul s, samples
wi h PS showed a signi ican highe pe cen age (p=0.02) on HOS es (71.9±1.6%) han
non-PS samples (66.5±1.6%). Non-PS samples had be e esul s on kinema ic
pa ame e s. Ex ende A and C showed g ea esul s on MOT (63.1±4.3% A; 63.4±3.7%
C), i ali y (88.9±2.6% A; 87.7±2.7% C) and HOS es (68.9±1.4% A; 75.2±1.4% C).
Ex ende B and D showed he wo s da a on spe m quali y. These esul s sugges ha PS
exe s a p o ec i e ac ion on abbi spe m memb anes and kep spe m mo ili y g ea e .
Summa y
118
The addi ion o glyce ol and NMP o INRA 96® do no imp o e abbi spe m quali y
ne e heless, DMF exe s a p o ec i e e ec on he memb ane o spe ma ozoa imp o ing
seminal quali y du ing abbi spe m p ese a ion a 16ºC.
In he second expe imen we e alua ed he e ec o di e en c yop o ec an agen s (CP)
as glyce ol, DMF and NMP on cooled abbi spe m s o ed a 4ºC and 16ºC du ing a long
pe iod o ime. Spe m samples we e dilu ed wi h INRA 96® (ex ende A), INRA 96® wi h
6% glyce ol (ex ende B) o 6% DMF (ex ende C) o 6% NMP (ex ende D) espec i ely,
we e s o ed a 4ºC and 16ºC and analysed a 4, 24, 48 and 72 hou s a e e ige a ion by
ISAS®, eosin-nig osin s ain ( i ali y), HOS es and ac osome in eg i y es . As a esul ,
Ex ende C showed highe MOT, i ali y and HOS es han ex ende B and D (p<0.050).
Whe eas spe m quali y dec eased o e ime (p<0.050), da a showed ha he addi ion o
DMF kep MOT and spe m plasma memb ane in eg i y a e 24 hou s o s o age be e
han o he diluen s. These esul s sugges ha he addi ion o glyce ol and NMP o INRA
96® did no o e ad an ages. Ne e heless, i has been demons a ed ha he addi ion o
DMF o INRA 96® exe s a p o ec i e e ec on he memb ane o spe ma ozoa imp o ing
seminal quali y. The empe a u e o s o age among 4ºC and 16ºC did no a ec he quali y
o abbi spe m.
The aim o he hi d expe imen was o ind a sui able p o ocol o enhance ozen abbi
spe m p ese a ion analysing he ole ha PS plays and he e ec o di e en CP on spe m
quali y 0 and 2 hou s a e hawing. Spe m samples we e pooled and di ided in eigh
ac ions. Fou o hem we e dilu ed wi h Bo uC io® (ex ende A), INRA 96® plus 6%
glyce ol (ex ende B), 6% DMF (ex ende C) and 6% NMP (ex ende D) espec i ely.
The o he ou ac ions we e cen i uged and he supe na an was disca ded in o de o
elimina e he PS. Each sample was hen esuspended wi h ex ende A, B, C and D,
espec i ely. Samples we e cooled p og essi ely, loaded in o 0.5 ml eezing s aws and
ozen wi h liquid ni ogen apou . Thawing was pe o med by placing he s aws in o a
bain-ma ie a 37ºC o 21 seconds. S aws we e d ied and spe m samples placed in o
eppendo ubes o be analysed by ISAS® so wa e, i ali y es , HOS es and ac osome
in eg i y es . A e he esul s, he highes da a on MOT and eloci y pa ame e s was
ob ained by ex ende A (p<0.050) e en when MOT pa ame e was compa ed wi h
p e ious s udies using o he diluen s. Addi ionally, spe m quali y dec eased o e
incuba ion ime (p<0.050) and no di e ences we e ound in samples p ocessed wi h o
wi hou PS. This esea ch e eal ha Bo uC io® could be used o abbi spe m
Summa y
119
c yop ese a ion and mo eo e he imp o emen o he c yop ese a ion p ocess o abbi
spe m due o he demons a ion ha PS emo ing is no equi ed.
In he ou h expe imen we ied o imp o e s o age condi ions o eeze-d ied spe m
samples by adding di e en chela ing agen s and an ioxidan s o eeze-d ying media.
F eeze-d ying echnique has been applied as an al e na i e echnology o p ese e gene
esou ces o allow simple spe m p ese a ion and shipmen a 4ºC. Ne e heless, DNA
spe m migh be damaged by mechanical o oxida i e s ess h oughou eeze-d ying
p ocedu e. The e o e, o pe o m his expe imen , abbi spe m we e eeze-d ied in basic
medium (10mM T is-HCl bu e and 50mM NaCl) supplemen ed wi h 50 mM EGTA
(EGTA), 50 mM EGTA plus 105 µM osma inic acid (EGTA-RA), 50 mM EDTA
(EDTA) o 50 mM EDTA plus 105 µM osma inic acid (EDTA-RA). Semen samples
we e kep a 4ºC and oom empe a u e du ing 8 mon hs. A e ehyd a ion, DNA
in eg i y was e alua ed wi h spe m ch oma in dispe sion es (SCD ) obse ing ha DNA
agmen a ion was highe when semen samples we e eeze-d ied wi h EGTA (10.9%)
han wi h EDTA (4.1%) (p<0.001). Fu he mo e, osma inic acid ac ed be e unde
ad e se condi ions and no signi ican di e ences we e ound in empe a u e s o age.
Summa izing, eeze-d ying is a me hod ha can allow simple gene esou ces
p ese a ion among 4ºC o 25ºC du ing 8 mon hs and anspo a ion wi hou he need o
LN2 o d y ice. EDTA chela ing agen is he mos sui able media o eeze-d ied abbi
spe m and he addi ion o osma inic acid p o ec s he DNA agains he oxida i e s ess
caused du ing eeze-d ying p ocedu e.
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APÉNDICE
135
Ca a de acep ación del a ículo pendien e de publicación