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Uni e sidad Poli écnica de Valencia
Más e en Mejo a Gené ica Vege al
CARACTERIZACIÓN DE UN
POTENCIAL SUPRESOR DE
SILENCIAMIENTO DE ARN EN EL
SUBGRUPO 1 DE LOS ILARVIRUS
Alumno: Nei a Cuad ado Cazo la
Di ec o es: Ca melo López del Rincón
F ede ic Apa icio He e o
Valencia, Junio 2017
2
Ag adecimien os
Quie o ap o echa es as líneas pa a ag adece a odas las pe sonas que me han
apoyado y han compa ido conmigo es os años de Uni e sidad en la Poli ecnica de
Valencia.
En p ime luga me gus a ía ag adece les a mis u o es, Ca melo López del Rincon y
F ede ic Apa icio He e o, po da me la opo unidad de o ma pa e de es e p oyec o,
sin sus conocimien os, guía y paciencia es o no hubie a sido posible.
A mis compañe os, quienes a a és del iempo han ido o aleciendo una amis ad,
muchas g acias po compa i conmigo es a expe iencia. En pa icula a mi compañe a
Claudia, con quien he compa ido más de ce ca es a ul ima e apa, y quien más me ha
ayudado en la consecución y elabo ación de es e p oyec o, sin ella muchas cosas me
hab ían esul ado más di íciles.
Po ul imo, quisie a ag adece les a la base de odo, mi amilia, en especial a mi
pad es, he mana y abuela, quienes con sus consejos ue on el mo o de a anque y un
cons an e e incondicional apoyo y mo i ación, muchas g acias po ues a paciencia y
comp ensión, y sob e odo po ues o ca iño.
Muchas g acias a odos.
3
Resumen
Los i us ege ales son agen es in ecciosos que ac úan como pa ási os in acelula es
obligados, ya que sólo pueden eplica se y comple a su ciclo de in ección den o de una
célula hospedado a adecuada. Las plan as se p o egen de su in ección median e una
se ie de mecanismos de de ensa, siendo uno de ellos el del silenciamien o génico pos -
ansc ipcional o PTGS (pos ansc p ional gene silencing). Como espues a al
silenciamien o de RNA en plan as, los i us han desa ollado es a egias especí icas
basadas en la u ilización de p o eínas p opias con capacidad de sup imi el
silenciamien o. Es as p o eínas son di e sas en secuencia y o igen e olu i o y pueden
ac ua en di e en es pasos de la u a de silenciamien o. Son capaces de inhibi la
espues a an i i al del huésped po medio de la in e acción con ac o es cla e de la
maquina ia de silenciamien o implicados en el econocimien o de RNA i al, el
p ocesamien o de dsRNAs, el ensamblaje del complejo RISC y la ampli icación de
señal. De hecho, un i us puede p esen a a ias p o eínas con ac i idad sup eso a del
silenciamien o de o ma que cada una puede a ec a a e apas di e en es de la u a. En
algunos i us de la amilia B omo i idae se ha encon ado un supues o gen que
codi ica ía la p o eína 2b. En el caso del Cucumo i us del mosaico del pepino (CMV)
se ha comp obado que la p o eína 2b se exp esa y que dicha p o eína in e iene en el
mo imien o sis émico a la ga dis ancia del i us y ac úa como sup eso del PTGS. Po
homología en cuan o a la o ganización genómica se ha p opues o que esa misma
p o eína 2b en los miemb os del subg upo 1 de los Ila i us, debe ía ene unciones
simila es. Po an o, el obje i o gene al de es e T abajo Final de Más e consis e en
de e mina la posible unción de la p o eína 2b del i us del es iado del abaco
(Tobacco s eak i us, TSV) y del i us de las manchas clo ó icas anula es de la
za zamo a (Blackbe y chlo o ic ingspo i us, BCRV) como sup eso a del PTGS a
ni el local. Pa a ello, las ORFs de ambas p o eínas se clona on en plásmidos bina ios
bajo la exp esión del p omo o 35S pa a su exp esión ansi o ia median e ag o-
in il ación. Ambas cons ucciones ue on exp esadas en plan as de Nico iana
ben hamiana 16c las cuales exp esan cons i u i amen e la p o eína e de luo escen e
(GFP). Los esul ados ob enidos sugie en que ninguna de es as p o eínas end ía
ac i idad de sup esión del PTGS, de modo que al con a io que la p o eína 2b del CMV,
la de los ila i us no p esen a ía ac i idad de silenciamien o del PTGS a ni el local.
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Índice
1. In oducción ............................................................................................................ 7
1.1. Impo ancia económica del oma e .................................................................. 7
1.2. Familia B omo i idae ........................................................................................ 8
1.3. Géne o Ila i us .............................................................................................. 10
1.4. Vi us del mo eado de la Pa ie a ia (PMoV). ................................................. 12
1.5. El silenciamien o génico en plan as ................................................................ 14
1.5.1. Sup eso es i ales del silenciamien o de RNA ____________________ 15
2. Obje i os. ............................................................................................................... 19
3. Ma e iales y mé odos. ........................................................................................... 21
3.1 ma e iales ......................................................................................................... 21
3.1.1. Ma e ial ege al: plan a huésped Nico iana ben hamiana ___________ 21
3.1.2. Ma e ial bac e iano __________________________________________ 22
3.1.3. Plásmidos __________________________________________________ 22
3.2. Mé odos ........................................................................................................... 24
3.2.1. Reacción de ligación de DNA __________________________________ 24
3.2.2. Elec opo ación de plásmidos en E. coli _________________________ 24
3.2.3. Selección de bac e ias ecombinan es median e PCR de las colonias _ 26
3.2.4. Elec o o esis en gel de aga osa ________________________________ 27
3.2.5. Pu i icación de DNA a pa i de un gel de aga osa ________________ 28
3.2.6. Pu i icación de plásmidos ecombinan es (minip eps) _____________ 28
3.2.7. Cuan i icación del DNA plasmídico_____________________________ 30
3.2.8. Diges ión del DNA plasmídico _________________________________ 30
3.2.9. Pu i icación de DNA de una solución ___________________________ 30
3.2.10. Secuenciación de ácidos nucleicos _____________________________ 30
3.2.11. Análisis in o má ico ________________________________________ 30
3.2.12. Ag oinoculación de plan as __________________________________ 31
3.2.12.1. Elec opo ación de plásmidos en A. ume aciens ........................... 31
3.2.12.2. P epa ación del inóculo ................................................................... 31
5
3.2.12.3. Ag oin il ación................................................................................ 31
3.2.13. Análisis de p o eínas median e Wes e n blo ____________________ 32
3.2.13.1. P epa ación del gel de poliac ilamida (PAGE-SDS) ...................... 32
3.2.13.2. Ex acción de p o eínas o ales de plan as ag oin il adas ............ 32
3.2.13.3. T ans e encia de las p o eínas a memb ana ................................... 33
3.2.13.4. Inmunode ección de p o eínas ans e idas a la memb ana ______ 33
3.2.13.5. Visualización de las p o eínas en la memb ama ............................. 34
4. Resul ados y discusión .......................................................................................... 35
4.1. Ob ención, clonación y comp obación de la secuencia de DNA del gen que
codi ica la p o eína 2b de TSV y BCRV ............................................................... 37
4.2. Subclonación del gen 2b en el ec o pSK en e el doble p omo o 35S y el
e minado popi ................................................................................................... 39
4.3. Subclonación de los case es de exp esión en el ec o bina io pMOG 800 ... 42
4.4. Ag oin il ación de los plásmidos pMOG ecombinan es en plan as de N.
ben hamiana. Análisis de la exp esión de las p o eínas 2b ................................... 44
4.5. Análisis ipo Wes e n blo . ............................................................................. 46
5. Conclusiones .......................................................................................................... 48
6. Bibliog a ía. ........................................................................................................... 51
Anexos. ...................................................................................................................... 56

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1. INTRODUCCIÓN
7
1. In oducción
1.1. Impo ancia económica del oma e
El oma e (Solanum Lycope sicum), miemb o de la amilia de las Solanáceas, gene o
Solanum, es uno de los p incipales cul i os ho ícolas en odo el mundo y el de mayo
alo económico. Su demanda aumen a con inuamen e y con ella su cul i o, p oducción
y come cio. Du an e el año 2016 la p oducción española ue de algo más de 5 millones
de oneladas (según el MAGRAMA), y ocupando en el año 2014 el pues o 7 en e los
países con mayo p oducción a ni el mundial según la FAO (Figu a 1). Dada la
impo ancia económica de es e cul i o, se hace más pa en e el es ue zo ecnológico en
cuan o a iden i icación y a amien o de plagas y en e medades, así como en la
p oducción de semillas esis en es, nu ición y écnicas de cul i o adecuadas a la zona
p oduc o a.
Figu a 1. P incipales países p oduc o es de oma e a ni el mundial, según la FAO, en millones de
oneladas, en el año 2014.
El cul i o del oma e se e ue emen e a ec ado po en e medades que educen
conside ablemen e la p oducción y calidad, pudiendo llega a ocasiona la pé dida o al
del cul i o. En e las nume osas en e medades que le a ec an, las p o ocadas po i us
se encuen an en e las más impo an es ya que no exis en medios de lucha con a es as
en e medades (sólo indi ec os a a és de la lucha con a sus ec o es o el manejo de los
cul i os).
Los i us ege ales son pa ículas in ecciosas que ac úan como pa ási os
in acelula es obligados ya que solo puedan eplica se y comple a su ciclo de in ección
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den o de una célula hospedado a adecuada, causando g a es daños al cul i o. El oma e
es especialmen e sensible a una amplia gama de i us an o de DNA como de RNA. El
cul i o puede se in ec ado po un único i us o po a ios a la ez po lo que la
sin oma ología puede se muy a iada y en ocasiones con usa. En España, las
in ecciones i ales que p oducen o han p oducido un mayo impac o económico en los
cul i os de oma e son: el i us del b onceado del oma e (Toma o spo ed wil i us,
TSWV), el i us del izado ama illo del oma e o de la cucha a (Toma o yellow lea cu l
i us, TYLCV), el i us X de la pa a a (Po a o i us X), el i us del ama illeo clo ó ico
del oma e (Toma o chlo osis i us, ToCV), el i us del mosaico del pepino dulce
(Pepino mosaic i us, PepMV), el i us del mosaico del oma e (Toma o mosaic i us,
ToMV), el i us del mosaico del pepino (Cucumbe mosaic i us, CMV), el i us Y de
la pa a a (Po a o i us Y, PVY) y el i us del o ado del oma e (Toma o o ado i us,
TTV). Todos ellos pueden causa daños an o en hojas como en el u o, educiendo su
endimien o, e in luyendo ambién en la madu ación del u o o c ecimien o de la
plan a. Además de los i us mencionados an e io men e, ambién se ha de ec ado en los
cul i os de oma e de di e en es egiones españolas el i us del mo eado de la pa ie a ia
(Pa ie a ia mo le i us, PMoV, géne io Ila i us, amilia B omo i idae), i us del que
se ocupa es e p oyec o inal de Más e .
1.2. Familia B omo i idae
Es a amilia incluye los géne os Al amo i us y Anula i us con un único miemb o y
los géne os B omo i us, Cucumo i us, Olea i us e Ila i us con a ios miemb os cada
uno. Los i us de es a amilia ienen un genoma de RNA ipa i o de cadena sencilla y
pola idad posi i a (ssRNA+). El RNA 1, es monocis ónico y iene un único ma co de
lec u a abie a (ORF), que codi ica la p o eína P1. El RNA 2 es ambién monocis ónico
y iene un ORF, que codi ica la p o eína P2. La p o eína P2 jun o con la P1, o man
pa e del complejo de la eplicasa i al. Además, en el ex emo 3´ e minal del RNA 2
del i us del mosaico del pepino (CMV) y de los miemb os del géne o de los Ila i us,
se ha encon ado un ORF adicional (ORF 2b) que solapa con en el ORF 2 y que codi ica
la p o eína 2b (Figu a 2). En el caso del CMV, la p o eína 2b in e iene en el
mo imien o sis émico a la ga dis ancia del i us y ac úa como sup eso del
silenciamien o génico pos - ansc ipcional o PTGS (Ding e al., 1995; B igne i e al.,
1998; Maye s e al., 2000).
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El RNA 3 es bicis ónico y iene 2 ORFs sepa ados po una egión no codi ican e
(IGR). El ORF del ex emo 5´ e minal codi ica la p o eína del mo imien o i al (MP) y
el del ex emo 3´ e minal codi ica la p o eína de cubie a (CP). La CP y la p o eína 2b
se exp esan median e dos RNAs subgenómicos (sgRNA); la CP median e el sgRNA 4 y
la p o eína 2b median e el sgRNA 4A. Los ex emos 5´y el 3´ e minales de cada RNA
genómico iene secuencias que no se aducen (NTRs). Además, el ex emo 5´ e minal
de cada RNA p esen a una es uc u a ipo Cap (m7G5ppp) cuya unción es p o ec o a.
Los 3 RNAs genómicos son encapsidados o mando i ones de o ma es é ica en los
géne os B omo i us y Cucumo i us, bacili o me en el géne o Al amo i us, y es é ica o
isomé ica en los géne os Olea i us e Ila i us, aunque ambien hay i ones
bacili o mes en los dos úl imos géne os (Bol, 1999).
Figu a 2. O ganización genómica de los i us pe enecien es a la amilia B omo i idae. El panel A
mues a el esquema de los miemb os que no p esen an en su genoma el ORF 2b, mien as que el panel B
mues a el esquema de los que si con ienen el ORF 2b en la pa e 3´ e minal de RNA 2. Los di e en es
ORFs se ep esen an en colo e de y las p o eínas que codi ican (P1, P2, 2b, MP y CP) en colo na anja.
Cada segmen o de RNA con iene una es uc u a ipo Cap en el ex emo 5´ e minal. Las p o eínas 2b y CP
se exp esan a a és de dos RNAs subgenómico, sgRNA 4A y sgRNA 4, espec i amen e. En colo g is
se ep esen an las egiones genómicas no aducidas. En las p o eínas se señalan los di e en es dominios
conse ados: Me il ans e asa (MET), Helicasas (HEL), RNA polime asa dependien e de RNA (POL),
Dominio de Unión al RNA (RBD), Región Hid o óbica (HR), y la Región de Dime ización (DR).
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de silenciamien o. Son capaces de inhibi la espues a an i i al del huésped po medio
de la in e acción con ac o es cla e de la maquina ia de silenciamien o implicados en el
econocimien o de RNA i al, el p ocesamien o de dsRNAs, el ensamblaje del complejo
RISC y la ampli icación de señal (Figu a 7).
Figu a 7. Ac i idad de los sup eso es i ales del silenciamien o po RNA Las p o eínas sup eso as
del silenciamien o i ales que se ep esen an con cí culo ojo puede ac ua bloqueando el silenciamien o
mediado po dsRNAs, en dis in os pasos de la u a. HCP o del TEV (géne o Po y i us), p19 del i us del
enanismo a bus i o del oma e (Toma o bushy s un i us, TBSV géne o Tombus i us), p126 y p122 del
TMV (géne o Tobamo i us), P0 del i us del ama illo de la emolacha occiden al (Bee wes e n yellows
i us, BWYV géne o Pole o i us), p38 del i us del a ugamien o del nabo (Tu nip c inkle i us, TCV
géne o Ca mo i us), 2b del i us del mosaico del pepino (Cucumbe mosaic i us, CMV géne o
Cucumo i us), P1 del i us del mo eado sua e del ba a a (Swee po a o mild mo le i us, SPMMV
géne o Ipomo i us). AC4 del i us del mosaico de la yuca a icana (A ican cassa a mosaic i us,
ACMV géne o Begomo i us), p21 del i us del ama illeo de la emolacha (Bee yellow i us, BYV
géne o Clos e o i us). Tomado de Shimu a y Pan aleo, 2011.

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De hecho, un i us puede p esen a a ias p o eínas con ac i idad sup eso a del
silenciamien o de o ma que cada una puede a ec a a e apas di e en es de la u a de
silenciamien o (Cso ba e al., 2015). La mayo ía de las p o eínas con ac i idad
sup eso a del silenciamien o iden i icadas son mul i uncionales ya que además ac úan
como p o eínas de cubie a, eplicasas, p o eínas de mo imien o, ac o es implicados en
la ansmisión o egulado es ansc ipcionales (Ro h e al., 2004; Bu gyan and Ha elda,
2011; Wang e al., 2012). En o as ocasiones esas p o eínas se ca ac e iza on
inicialmen e como de e minan es de pa ogenicidad y i ulencia al es a elacionadas con
la apa ición de sín omas du an e la in ección i al (Ga cia and Pallas, 2015). Las
p o eínas sup eso as del silenciamien o más es udiadas son la p o eína 2b del CMV y
HC-P o de po y i us.
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2. OBJETIVOS
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2. Obje i os.
Como se ha comen ado en la in oducción, en el ex emo 3´ e minal del RNA 2 de
algunos i us de la amilia B omo i idae se ha encon ado un ORF adicional (ORF 2b)
que solapa con el ORF 2 y que codi ica ía la p o eína 2b. En el caso del cucumo i us
del mosaico del pepino (CMV) se ha comp obado que la p o eína 2b se exp esa a pa i
del RNA subgenómico 4A (sgRNA4) y que dicha p o eína in e iene en el mo imien o
sis émico a la ga dis ancia del i us y ac úa como sup eso del silenciamien o génico
pos - ansc ipcional o PTGS.
Po homología en cuan o a la o ganización genómica se ha p opues o que esa misma
p o eína 2b en los miemb os de los Ila i us (subg upos 1 y 2), debe ía ene unciones
simila es. En el caso de los i us del subg upo 1, se ha de ec ado la p esencia del
sgRNA 4A en plan as de Chenopodium quinoa in ec adas con PMoV, pe o no la
p o eína 2b. Además, en expe imen os de exp esión ansi o ia de la p o eína 2b,
ealizados en nues o g upo con plan as de Nico iana ben hamiana 16c (exp esan
cons i u i amen e la p o eína e de luo escen e oGFP), se comp obó la exp esión de la
p o eína, pe o és a no ac uaba como sup eso del silenciamien o génico a ni el local ni
sis émico.
Po ello, el obje i o gene al de es e T abajo Final de Más e consis e en ealiza
expe imen os simila es con la p o eína 2b de o os dos i us del subg upo 1: el i us del
es iado del abaco (Tobacco s eak i us, TSV) y el i us de las manchas clo ó icas
anula es de la za zamo a (Blackbe y chlo o ic ingspo i us, BCRV). La ealización
de es os expe imen os nos pe mi i á de e mina el papel de la p o eína 2b de es e
subg upo 1 en elación con la ac i idad sup eso a del PTGS a ni el local. Como
obje i os pa ciales des acan:
1- Clonación del ORF 2b de los i us TSV y BCRV en el ec o de exp esión
de i ado del plásmido pMOG.
2- Ag oinoculación de plan as de N. ben hamiana 16c y de e mina si la p o eína
2b desempeña alguna unción en la sup esión del silenciamien o génico a ni el local.
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3. MATERIALES Y MÉTODOS
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3. Ma e iales y mé odos.
3.1 ma e iales
3.1.1. Ma e ial ege al: plan a huésped Nico iana ben hamiana
N. ben hamiana (Figu a 8) es un o ganismo modelo de in es igación con plan as
debido a su ácil cul i o y a la acilidad de ag oin il ación.
Figu a 8. Nico iana ben hamiana plan a y hoja.
Las plan as 16c empleadas en la ealización de es os expe imen os son plan as
ansgénicas que exp esan de o ma cons i u i a el mRNA de la p o eína e de
luo escen e (g een luo escen p o ein, GFP), una p o eína p oducida po la medusa
Aequo ea ic o ia, que emi e luo escencia en la zona e de del espec o isible as se
i adiada con luz ul a iole a (UV) (Figu a 9). Pa a es e abajo se emplea on plan as de
N. ben hamiana 16c en es adio de desa ollo de 4 a 6 hojas. Las plan as se cul i a on en
mace as de 9 cm de diáme o con una mezcla de u ba y e miculi a. Se man u ie on en
una cáma a de cul i o con las siguien es condiciones:
- Régimen é mico de 22˚C/20˚C (día/noche).
- Humedad ela i a de 60-65%/95-100% (día/noche).
- Fo ope iodo de 12 h de luz y 12 h de oscu idad con una i adianza de 65-85
µmol·m-2·s-1 suminis ada po ubos luo escen es con un in e alo de longi ud de onda
de en e 400-700 nm.

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Figu a 9. (A) Exp esión de GFP en plan as de Nico iana ben hamiana. (B) plan as de N.
ben hamiana sil es es. En ambos casos las plan as son iluminadas con luz UV (B igne i e al., 1998).
3.1.2. Ma e ial bac e iano
La bac e ia empleada pa a la ampli icación de los plásmidos ue la cepa DH5α de
Esche ichia coli, mien as que pa a el p oceso de ag oin il ación se u ilizó la cepa
C58C1 de Ag obac e ium ume acien.
3.1.3. Plásmidos
Los plásmidos que se usa on en el desa ollo del abajo ue on pJET1.2/blun ,
pKSmyc y pMOG 800.
El plásmido pJET1.2/Blun de Fe men as ( igu a 10) se usó como plásmido
in e medio en el p oceso de clonación y ampli icación del gen 2b de los i us TCV y
BCRV. La sín esis del gen ue enca gada a la emp esa The mo Scien i ic al inicio del
p oyec o y clonado en pJET1.2/blun .
El plásmido con iene un o igen de eplicación pa a E. coli, esis encia a ampicilina y
un sis ema de selección bajo un gen le al que acili a la iden i icación de las colonias
ecombinan es. El plásmido iene p epa ado pa a p ocede a la ligación del agmen o
de DNA de in e és. T as la ligación el gen le al se in e umpe y sólo las células
bac e ianas con plásmidos ecombinan es pod án o ma colonias. Las moléculas de
ec o pJET1.2/blun en las que no se p oduce la ligación exp esa án la enzima le al
p o ocando la mue e de las bac e ias después de la ans o mación. Es a selección
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posi i a acele a el p oceso de iden i icación de colonias y elimina los cos es adicionales
necesa ios pa a la selección de colo azul/blanco p esen es en o os ec o es de
clonación.
Figu a 10. Rep esen ación esquemá ica del plásmido pJET1.2/blun de Fe men as.
El plásmido pKSmyc ( igu a 11) con iene un MCS (si io de clonación múl iple) en e
el p omo o 35S del i us del mosaico de la coli lo (CaMV) duplicado y el e minado
popi del gen que codi ica el inhibido II de la p o easa de pa a a (Solanum ube osum).
El plásmido posibili a la clonación de los di e en es genes empleados en es e abajo. El
plásmido con iene ambién un o igen de eplicación pa a E. coli y esis encia a
ampicilina.
Figu a 11. Rep esen ación esquemá ica del ec o in e medio pKS. Cons a de un o igen de
eplicación, un gen de esis encia a ampicilina y las secuencias del p omo o 35S duplicado y del
e minado popi , lanqueados po los si ios de es icción HindIII. Se indican los pun os de co e de las
enzimas NcoI y Bgl II pa a acili a el p oceso de clonación.
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El plásmido pMOG 800 ( igu a 12) es un plásmido bina io que posibili a la
clonación de los di e en es genes en e los bo des izquie do y de echo del plásmido Ti
de A. ume aciens. Además, p esen a esis encia a kanamicina y un o igen de eplicación
de amplio espec o que pe mi e su eplicación an o en E. coli como en A. ume aciens.
Figu a 12. Rep esen ación esquemá ica del ec o bina io de exp esión pMOG 800. Cons a de un
o igen de eplicación, un gen de esis encia a kanamicina y los bo des izquie do (LB) y de echo (RB) del
plásmido Ti de A. ume aciens. Se indica el si io de es icción HindIII pa a acili a el p oceso de
clonación.
3.2. Mé odos
3.2.1. Reacción de ligación de DNA
Es a eacción pe mi e inse a un agmen o de DNA en un ec o de clonación o
ci cula iza un plásmido p e iamen e linealizado. En los casos de ligación inse o: ec o
se a ó de man ene una elación mola 4:1. El olumen inal de la eacción ue de 10 μl
o 20 μl dependiendo del olumen de inse o y ec o que se u ilizó. Se añadió 1 μl (si el
olumen inal e a de 10 μl) o 2 μl (si el olumen inal e a de 20 μl) del ampón de la T4
DNA ligasa (x10). Seguidamen e, se adicionó 1 μl de la enzima T4 DNA ligasa (5 U/µl)
(Fe men as) y el olumen de agua necesa io pa a alcanza el olumen inal. La eacción
se incubó du an e 1-2 h a 22°C.
3.2.2. Elec opo ación de plásmidos en E. coli
En es e caso la ans o mación de las células compe en es de la cepa DH5 de E. coli
se ealizó median e elec opo ación. Es a écnica consis e en some e las células a un
pulso eléc ico que da luga a la ape u a de po os en la memb ana plasmá ica
bac e iana, pe mi iendo la en ada del plásmido a su in e io .
Hind
III
25
Se pa ió de alícuo as de células elec ocompe en es congeladas a -80°C. Se
mezcla on en un ubo Eppendo de 1,5 ml, 50 μl de células compe en es (una ez
descongeladas) con 2-3 μl del plásmido de in e és. Pos e io men e, la mezcla de
plásmido y células se in odujo en una cube a de elec opo ación a empe ada sob e
hielo. Se seca on los elec odos de la cube a y se si uó en el elec opo ado (BTX
ECM399) (Figu a 13). Se le some ió a un pulso eléc ico (1500 V du an e 5 ms). T as la
aplicación del pulso se pipe eó ápidamen e sob e la cube a de elec opo ación 500 μl de
solución SOC (20 g/l de ip ona, 5 g/l de ex ac o de le adu a, 0,5 g/l de NaCl, 2,5 mM
KCl, 10 mM de MgCl2, ajus ado odo ello a pH 7 con NaOH). La mezcla se ans i ió a
un ubo Eppendo de 1,5 ml y se incubó a 37°C du an e 1 h.
Figu a 13. A) Elec opo ado , B) siemb a en placas.
T as la incubación se semb a on las bac e ias en medio LB con aga en p esencia de
ampicilina (50 g/ml). Pa a asegu a que se conseguían colonias aisladas, el o al de
células se epa ió en dos placas. En una de ellas se semb a on 50 μl y en la o a el es o
del cul i o. Las placas se incuba on a 37°C has a que c ecie an las colonias ( igu a 14).
32
p esiona el émbolo len amen e, la solución bac e iana pene a gene ando un halo en los
espacios in e celula es del ejido ege al ( igu a 18).
Figu a 18. P oceso de ag oinoculación. Izquie da: Momen o de la ag oinoculación en el en és de la
hoja. En medio: He ida as la ag oinoculación. De echa: G á ico ampliado de la he ida as la
ag oinoculación.
3.2.13. Análisis de p o eínas median e Wes e n blo
3.2.13.1. P epa ación del gel de poliac ilamida (PAGE-SDS)
La sepa ación de p o eínas se ealizó en condiciones desna u alizan es en geles de
poliac ilamida en p esencia del de e gen e sodiododecilsul a o (SDS), u ilizando el
sis ema MiniP o ean 3 (BioRad). Es os geles cons an de dos ases; la in e io (7 cm) de
sepa ación o esol ing al 10% (30% mezcla de ac ilamida:bisac ilamida (29:1), 1,5M
T is pH 8,8, 10% SDS, 0,01% de APS al 10% y 0,001% TEMED) y la supe io (3 cm)
de compac ación, concen ación o s aking (30% mezcla de ac ilamida:bisac ilamida
(29:1), 1M T is pH 6.8, 10% SDS, 0,01% de APS al 10% y 0,001 % TEMED). Una ez
polime izada la ac ilamida, los geles se mon a on en cube as de elec o o esis y se
cub ie on con ampón de elec o o esis de p o eínas (0,025 M T is-HCl pH 8,3; 0,2 M
glicina; 1% SDS).
3.2.13.2. Ex acción de p o eínas o ales de plan as ag oin il adas
Pa a la ex acción de p o eínas o ales se u iliza on mues as de ma e ial ege al
ag oin il ado con un peso de unos 50 mg. El ma e ial ege al se i u ó en p esencia de
ni ógeno líquido, se esuspendió en 200 μl de ampón de ex acción de p o eínas (60
mM T is-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 100 mM di hio h ei ol, 10% glice ol y 0.01% azul de
b omo enol) y se incubó a 95°C du an e 10 min pa a induci la desna u alización de las
p o eínas. Seguidamen e, las mues as se cla i ica on median e cen i ugación a 13.000

33
pm du an e 30 s y se ca ga on 20 μl del sob enadan e en el gel de poliac ilamida. La
elec o o esis se lle ó a cabo a 35 mA du an e ap oximadamen e 2 h. Como ma cado
de peso molecula de p o eínas se empleó el ma cado BenchMa k™ P e-S ained
P o ein Ladde de In i ogen.
3.2.13.3. T ans e encia de las p o eínas a memb ana
T as su sepa ación po PAGE-SDS, las p o eínas se ans i ie on a una memb ana de
PVDF (poli inilideno luo u o, Ame sham) pa a su pos e io econocimien o se ológico
con un an icue po especí ico que econoce el epí opo myc. La memb ana ue a ada
p e iamen e, sume giéndola en me anol al 100% du an e 1 min y pos e io men e
ealizando 3 la ados de 5 minu os con agua des ilada en agi ación. La ans e encia de
p o eínas a la memb ana se ealizó con el equipo de ans e encia semiseca TE 70 de
Hoe e ™. Pa a ello, la memb ana y el gel se coloca on en e papeles wha man 3MM
( igu a 19) humedecidos con ampón de elec o ans e encia (25 mM T is base, 192 mM
glicina). La ans e encia de las p o eínas se ealizó median e la aplicación de un campo
eléc ico cons an e de 1 mA/cm2 de memb ana du an e 1 h.
Figu a 19. Esquema de ans e encia de las p o eínas a memb anas de PVDF.
3.2.13.4. Inmunode ección de p o eínas ans e idas a la memb ana
Finalizada la ans e encia, la memb ana se la ó du an e 5 min con solución TBS (20
mM T is-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) y pos e io men e se bloqueó du an e una ho a a
empe a u a ambien e con leche en pol o desna ada al 5%, disuel a en TBST (TBS más
Tween 20 al 0,3%). A con inuación se incubó la memb ana du an e oda la noche a 4°C
en solución de hib idación (5% de leche desna ada en solución TBST) a la que se
34
añadió el an isue o especí ico con a la p o eína myc (en dilución 1:7.000).
Seguidamen e se hicie on 3 la ados de 5 min cada uno en agi ación con TBST pa a
elimina el exceso del an icue po de la memb ana. Una ez la ada, la memb ana se
incubó 1 h a empe a u a ambien e con solución de hib idación a la que se añadió el
an icue po secunda io (dilución 1:10.000), que econoce la acción cons an e del
an icue po an i-myc, conjugado a os a asa alcalina. Con el in de elimina el exceso de
an icue po secunda io se ealiza on 2 la ados consecu i os de 5 min cada uno a
empe a u a ambien e con ampón TBST y un la ado de 5 min a empe a u a ambien e
con TBS.
Finalmen e, el e elado de la memb ana se ealizó p epa ando el sus a o
quimioluminiscen e especial pa a la os a asa alcalina, siguiendo las ins ucciones del
ki de e elado o osensible ECL plus Wes e n Blo ing Sys em de Ame sham. La
solución que con enía el sus a o se aplicó sob e la memb ana du an e 5 min en
oscu idad. Pa a la de ección de la señal quimio-luminiscen e, la memb ana se expuso a
películas au o adiog á icas (Ame sham) du an e 30-60 min y se e ela on
au omá icamen e. Todos los pasos del e elado se lle a on a cabo en oscu idad y a
empe a u a ambien e.
3.2.13.5. Visualización de las p o eínas en la memb ama
T as la ans e encia de p o eínas a la memb ana, es a se iñó du an e 40 min en
solución de azul coomassie (0,1% azul coomassie (p/ ), 40% me anol y 10% ácido
acé ico) y, pos e io men e, se eliminó el exceso de colo an e du an e 1-2 h en solución
de la ado (20% isop opanol, 5% ácido acé ico) has a que pudie on ap ecia se las bandas
de p o eínas.
35
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
36
4. Resul ados y discusión
La en e medad de la nec osis apical del oma e causada po el i us del mo eado de
la pa ie a ia (PMoV) ha p o ocado nume osas pé didas económicas en algunos cul i os
ho ícolas desde su p ime a de ección en España en 2000 (A ambu u e al., 2001). Las
plan as in ec adas se p o egen de su in ección median e una se ie de mecanismos de
de ensa, siendo uno de ellos el del silenciamien o génico pos - ansc ipcional o PTGS
(pos ansc p ional gene silencing). Como espues a al silenciamien o de RNA en
plan as, los i us han desa ollado es a egias especí icas basadas en la u ilización de
p o eínas p opias con capacidad de sup imi el silenciamien o. Es as p o eínas son
di e sas en secuencia y o igen e olu i o y pueden ac ua en di e en es pasos de la u a
de silenciamien o. Son capaces de inhibi la espues a an i i al del huésped po medio
de la in e acción con ac o es cla e de la maquina ia de silenciamien o implicados en el
econocimien o de RNA i al, el p ocesamien o de dsRNAs, el ensamblaje del complejo
RISC y la ampli icación de señal. De hecho un i us puede p esen a a ias p o eínas
con ac i idad sup eso a del silenciamien o de o ma que cada una puede a ec a a e apas
di e en es de la u a. En algunos i us de la amilia B omo i idae se ha encon ado un
supues o gen que codi ica ía la p o eína 2b. En el caso del Cucumo i us del mosaico del
pepino (CMV) se ha comp obado que la p o eína 2b se exp esa y que dicha p o eína
in e iene en el mo imien o sis émico a la ga dis ancia del i us y ac úa como sup eso
del PTGS. Po homología en cuan o a la o ganización genómica se ha p opues o que esa
misma p o eína 2b en los Ila i us géne o al que pe enece PMoV, debe ía ene
unciones simila es.
En un p oyec o an e io se comp obó la p esencia del sgRNA 4A en plan as de
Chenopodium quinoa in ec adas con PMoV, pe o no la p o eína 2b. Además, en
expe imen os de exp esión ansi o ia de la p o eína 2b, ealizados con plan as de
Nico iana ben hamiana 16c (exp esan cons i u i amen e la p o eína e de luo escen e
GFP), se comp obó la exp esión de la p o eína, pe o és a no ac uaba como sup eso del
silenciamien o génico a ni el local ni sis émico (doo Pee e s, 2009). Que emos
de e mina si la ausencia de ac i idad sup eso a del PTGS es especí ica de la p o eína
2b de PMoV, o es e hecho es ex ensible a la misma p o eína de odos los Ila i us. El
obje i o gene al de es e T abajo Final de Más e consis e en ealiza expe imen os
simila es con la p o eína 2b de o os dos Ila i us del mismo subg upo que PMoV,
como son: el i us del es iado del abaco (Tobacco s eak i us, TSV) y el i us de las
37
manchas clo ó icas anula es de la za zamo a (Blackbe y chlo o ic ingspo i us,
BCRV). Pa a ello, la p o eína 2b de ambos i us (y la p o eína 2b de PMoV usada como
con ol) se exp esa án ansi o iamen e en plan as de N. ben hamiana 16c y se
de e mina á su capacidad o no pa a ompe el PTGS.
4.1. Ob ención, clonación y comp obación de la secuencia de DNA del gen que
codi ica la p o eína 2b de TSV y BCRV
Debido a que en nues o g upo no disponemos de los i us TSV y BCRV, se
p ocedió a ob ene la secuencia del ORF 2b disponible en la base de da os del Genbank
y se solici ó la sín esis del co espondien e gen a la casa come cial The mo Scien i ic.
Pa a acili a el p oceso de clonación, cada una de las secuencias se equipó con un pun o
de co e en NcoI (CCATGG) en el ex emo 5´ y un pun o de co e Bgl II (AGATCT) en
el ex emo 3´ (p ecedidas ambas de los 5 nucleó idos AAAAA pa a op imiza la
pos e io es icción). P e iamen e, se con i mó la ausencia de co e de es os dos
enzimas de es icción en la secuencia de ambos genes, median e el análisis de la misma
con el p og ama in o má ico Res ic ion Map. Además, pa a comp oba la co ec a
exp esión de las p o eínas, cada secuencia se e iqué ó con el epí opo myc (secuencia de
aminoácidos E Q K L I S E E D L, codi icados en la secuencia de nucleó idos
gaacaaaaac ca c cagaagagga c g). La sín esis solici ada incluía las siguien es secuencias
mos adas en la igu a 20.
Tobacco s eak i us (TSV) pu a i e 2b p o ein gene, NCBI Re e ence Sequence:
NC_003842.1
AAAAACCATGGaacaaaaac ca c cagaagagga c g a ccga c g cc cac gac
c cgcg cagcaga g ga gac c ga ggag ccgaacc caacc cgacgacagaaag cg ccaa
gca gcc ccga aaac caggaaaaccgag g acggagaagcccgg g agaa aaaccccggaga
aaccg aaaag gaaagcggagcag caa acag caa ccag ggaa gaaac ggaaaagcgaa
cc cccggaaggg agga caaa gca gac g gc a ccaac gccaaaggcga g c c g
caagg ccgaag gaa a caac cgagg g c ga ccg c caagg aa a gccac
g agcccaaagag gaag c a ccc a gag c c gag cccagcga a caaagga g
cagc cg gc c agg gacg agaag cc ca c ca ccaaaa gg ggaaacaaa ga
aa g c ga g gg ccggg ga a cccgaaga cccg cca agc cccaaag ggag ca g
g cgg ga gcc aaa c gaAGATCTAAAAA
Secuencia de aminoácidos deducida de la p o eína 2b de TSV
MEQKLISEEDLFIPILFLTLTLASADVMTLMESEPQPSTTESRPSMPPINSGKPSVTEKPGVELNPGETV
KVKAEQFNTVNPVELKLEKRIPPGRVGSNCIDCAISNLPKAMFSVKVPKLNINFEVSDFPSSRLIFATLA
QRVKSIPFIESLSFPSDIQRMQLRALGDVEVLIFIPKFGWKQILKLSDVVSGFDIPKIPSIAPKVESCVG
DCLNS-

38
Blackbe y chlo o ic ingspo i us (BCRV) pu a i e 2b p o ein gene, NCBI
Re e ence Sequence: NC_011554.1
AAAAACCATGGaacaaaaac ca c cagaagagga c ga g a ccaa c g ga gc c g
agccca g g gc cgcagac ga gcc cacccagaaga ccgaga g ccggaaacgagaaag
ccgaa cgg cccgaaac ccaga g gg cc ggagaaaggaa accgagccggaga aaaa gag
accccgcgaa c g gaagg g ccacggacggggaaagagagagcccag gcaaaccc caacgaa
cg agaggaaaggagc cacc ggaaagg ggcaacaaa gcc ga g gc a cac ca c c
cagagg agc c c g gaagg accgaag gaa a aaac cgaag caga cc ca c
aagg aa c gccagc ggccag agaa aaggac accc g cga ca gagg a ccc
ac ga ca caaagga cag acg c a gg ga g gaag acaca cca a ccaaaa g
g ggaaacaag gaaga g c ga g ga ccgg gaa accgaaga cccacca cgc
ccaaaag ggag cg g g gg gaa g aaccca aaAGATCTAAAAA
Secuencia de aminoácidos deducida de la p o eína 2b de BCRV
MEQKLISEEDLMFIPILLMLLSPCVLADLMPHPEDPRFVPETRKSESVPETPDVVPGERNTEPEIKLRPR
ESVKVSTDGERESPVQTLNEFRLEERSSPGKVATNCLDCAITHLPEVAFSVKVPKLNINFEVSDFPSSRL
IFASLASRIKDLPFVRSLRYPTDHQRIQLRSIGDVEVHIHIPKFGWKQVLKMSDVISGFELPKIPTIAPK
VESCVGECLTH-
Figu a 20. Secuencia de nucleó idos y secuencia deducida de aminoácidos (en osa) del gen 2b de
TSV y BCRV. Se indican en ojo los codones de inicio y in de cada gen. En mayúsculas y sub ayados
los pun os de co e de los enzimas de es icción NcoI y Bgl II. En ama illo se indica la secuencia de
nucleó idos (gen) o de aminoácidos (p o eína) del epí opo myc. Después podemos obse a una
alineación de la secuencia solici ada con la ecibida, así comp obamos que co esponde con lo solici ado.
Los espec i os genes sin e izados po la emp esa The mo Scien i ic se clona on en el
ec o pJET1.2/blun según se desc ibe en el apa ado XXX con el obje i o de dispone
de su icien e can idad pa a las pos e io es subclonaciones. T as la ligación, se in odujo
el plásmido ecombinan e median e elec opo ación en la cepa DH5a de E. coli y la
mezcla se dis ibuyó en placas con aga y se deja on a 37º C has a el desa ollo de las
colonias (Figu a 21).
Figu a 21. C ecimien o de bac e ias po ado as de los plásmidos ecombinan es pJET1.2/blun +
gen 2b de TSV y BCRV.
39
La p esencia del gen 2b (de TSV y/o de BCRV) en las colonias ecombinan es se
comp obó median e PCR. Se aisló el plásmido ecombinan e de una colonia de bac e ias
de cada ipo y se p ocedió a su secuenciación empleando cebado es especí icos del
ec o de clonación. Las secuencias de nucleó idos ob enidas se alinea on con las
secuencias de sín esis solici adas usando el p og ama blas del NCBI, con el in de
desca a cualquie e o du an e el p oceso de sín esis química de cada uno de los
genes. Comp obada la secuencia co ec a de cada gen, los plásmidos pJET-TSV
(colonia núme o 5) y pJET-BCRV (colonia núme o 8) se some ie on a diges ión con las
enzimas de es icción NcoI y Bgl II, pa a su pos e io ligación en el ec o pSK
dige ido con las mismas enzimas de es icción en e el doble p omo o 35 S y el
e minado popi (Anexo 1).
Una ez lle ada a cabo la es icción, los agmen os de DNA se sepa a on en una
elec o o esis en gel de aga osa ( igu a 22) y el agmen o de DNA con eniendo el gen
2b (ap oximadamen e 650 pb) se pu i icó del gel de aga osa.
Figu a 22. Elec o o esis en gel de aga osa al 0,8% de mues as de DNA as la diges ión con las
enzimas de es icción NcoI y Bgl II. Ca il 1, ma cado de peso molecula . Ca il 2, pJET + gen 2b TSV
(colonia 5) co ado con NcoI y Bgl II. Ca il 3, pJET + gen 2b BCRV (colonia 8) co ado con NcoI y Bgl
II. Se indica con un ecuad o la banda de DNA con el gen 2b co ada pa a pu i ica .
4.2. Subclonación del gen 2b en el ec o pSK en e el doble p omo o 35S y el
e minado popi
T as la pu i icación, los agmen os de DNA con eniendo el gen 2b se
comp oba on y cuan i ica on median e un gel de elec o o esis, jun o con el ec o
40
pKS dige ido con las dos mismas enzimas de es icción y pu i icado de igual o ma
( igu a 23). El obje i o de es a diges ión ue gene a ex emos cohesi os en e los
inse os (genes 2b de TSV y BCRV) y el ec o pKS con el in de acili a la clonación.
Figu a 23. Elec o o esis en gel de aga osa al 0,8% de mues as de DNA pu i icadas as la
diges ión con las enzimas de es icción NcoI y Bgl II del ec o de clonación pKS (Ca il 2) y del gen 2b
de los aislados TSV (ca il 3) y BCRV (ca il 4). Ca il 1, ma cado de amaños de DNA 100 pb Ladde
Plus (Fe men as).
Los agmen os de DNA con eniendo el gen 2b de los dos i us aislados se liga on en
el ec o in e medio pKS siguiendo el esquema de la igu a 24.
Figu a 24. Rep esen ación esquemá ica del p oceso de ligación en e el ec o pKS dige ido con las
enzimas de es icción NcoI y Bgl II y el gen 2b de TSV o BCRV dige ido con las mismas enzimas. El
case e de exp esión cons a del gen 2b clonado en e la secuencia del doble p omo o 35S y del e minado
popi .
Como el ec o pKS no lle a ningún gen epo e o, pa a iden i ica las colonias
po ado as del ec o ecombinan e se ealizó una PCR de colonias con dos cebado es
41
del ec o . En la igu a 25 se mues a un ejemplo de ampli icación a pa i de di e en es
colonias de bac e ias ans o madas con pKS + gen 2b de TSV.
Figu a 25. Elec o o esis en gel de aga osa al 0,8% de los p oduc os de ampli icación a pa i de
di e en es colonias de bac e ias ans o madas con pKS + gen 2b de TSV. En la pa e supe io de la
imagen se indica el núme o de cada colonia. Los p oduc os de ampli icación de 1200 pb co esponden al
amaño del doble p omo o 35S + e minado popi . Los p oduc os de ampli icación ecuad ados de unos
2000 pb co esponden a los que han inse ado el gen 2b en e p omo o y e minado . Ca iles 1 y 21,
ma cado es de DNA 100 bp Ladde Plus y DNA 100 bp Ladde , espec i amen e, ambos de Fe men as.
U ilizando es a es a egia se ob u ie on las dos cons ucciones pKS-gen 2b TSV y
pKS-gen 2b BCRV. La comp obación de los dos plásmidos ecombinan es
seleccionados se ealizó median e secuenciación con un cebado que hib ida en el
e minado popi , y median e diges ión con la enzima de es icción HindIII ( igu a 26).
Figu a 26. Elec o o esis en gel de aga osa al 0,8% de los plásmidos ecombinan es pKS + gen 2b
de los i us TSV (ca il 2) y BCRV (ca il 3) as la diges ión con la enzima de es icción HindIII. La
banda supe io de los ca iles 2 y 3 co esponde al esquele o del ec o y la in e io al case e libe ado 2 x
35S + gen 2b + e minado popi . Ca il 1, ma cado DNA 100 pb Ladde Plus de Fe men as.
48
5. Conclusiones

49
5. Conclusiones
1. Se ha clonado en un ec o bina io, pa a la exp esión ansi o ia median e
ag oin il ación, el gen que codi ica la supues a p o eína 2b de los Ila i us:
i us del es iado del abaco (Tobacco s eak i us, TSV) y i us de las manchas
clo ó icas anula es de la za zamo a (Blackbe y chlo o ic ingspo i us,
BCRV).
2. Median e la exp esión ansi o ia en el sis ema de plan as de N. ben hamiana 16c
se ha de e minado que ninguna de es as p o eínas p esen an ac i idad sup eso a
del PTGS a ni el local.
50
6. Bibliog a ía
51
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Anexos
56
Anexos.
TSV
Aquí podemos obse a como se comp obó median e una alineación que la secuencia
solici ada pa a la sín esis y lo ecibido son idén icas en un 99%.
57
BCRV
Ocu e lo mismo en el caso del i us BCRV, donde se comp obó median e una
alineación que la secuencia solici ada al labo a o io pa a su sín esis co esponde en un
99% a la secuencia ecibida.