Caracterización de un potencial supresor de silenciamiento de ARN en el subgrupo 1 de los Ilarvirus

1 Universidad Politécnica de Valencia Máster en Mejora Genética Vegetal CARACTERIZACIÓN DE UN POTENCIAL SUPRESOR DE SILENCIAMIENTO DE ARN EN EL SUBGRUPO 1 DE LOS ILARVIRUS Alumno: Neiva Cuadrado Cazorla Directores: Carmelo López del Rincón Frederic Aparicio Herrero Valencia, Junio 2017 2 Agradecimientos Quiero aprovechar estas líneas para agradecer a todas las personas que me han apoyado y han compartido conmigo estos años de Universidad en la Politecnica de Valencia. En primer lugar me gustaría agradecerles a mis tutores, Carmelo López del Rincon y Frederic Aparicio Herrero, por darme la oportunidad de formar parte de este proyecto, sin sus conocimientos, guía y paciencia esto no hubiera sido posible. A mis compañeros, quienes a través del tiempo han ido fortaleciendo una amistad, muchas gracias por compartir conmigo esta experiencia. En particular a mi compañera Claudia, con quien he compartido más de cerca esta ultima etapa, y quien más me ha ayudado en la consecución y elaboración de este proyecto, sin ella muchas cosas me habrían resultado más difíciles. Por ultimo, quisiera agradecerles a la base de todo, mi familia, en especial a mi padres, hermana y abuela, quienes con sus consejos fueron el motor de arranque y un constante e incondicional apoyo y motivación, muchas gracias por vuestra paciencia y comprensión, y sobre todo por vuestro cariño. Muchas gracias a todos. 3 Resumen Los virus vegetales son agentes infecciosos que actúan como parásitos intracelulares obligados, ya que sólo pueden replicarse y completar su ciclo de infección dentro de una célula hospedadora adecuada. Las plantas se protegen de su infección mediante una serie de mecanismos de defensa, siendo uno de ellos el del silenciamiento génico posttranscripcional o PTGS (postranscrptional gene silencing). Como respuesta al silenciamiento de RNA en plantas, los virus han desarrollado estrategias específicas basadas en la utilización de proteínas propias con capacidad de suprimir el silenciamiento. Estas proteínas son diversas en secuencia y origen evolutivo y pueden actuar en diferentes pasos de la ruta de silenciamiento. Son capaces de inhibir la respuesta antiviral del huésped por medio de la interacción con factores clave de la maquinaria de silenciamiento implicados en el reconocimiento de RNA viral, el procesamiento de dsRNAs, el ensamblaje del complejo RISC y la amplificación de señal. De hecho, un virus puede presentar varias proteínas con actividad supresora del silenciamiento de forma que cada una puede afectar a etapas diferentes de la ruta. En algunos virus de la familia Bromoviridae se ha encontrado un supuesto gen que codificaría la proteína 2b. En el caso del Cucumovirus del mosaico del pepino (CMV) se ha comprobado que la proteína 2b se expresa y que dicha proteína interviene en el movimiento sistémico a larga distancia del virus y actúa como supresor del PTGS. Por homología en cuanto a la organización genómica se ha propuesto que esa misma proteína 2b en los miembros del subgrupo 1 de los Ilarvirus, debería tener funciones similares. Por tanto, el objetivo general de este Trabajo Final de Máster consiste en determinar la posible función de la proteína 2b del virus del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV) y del virus de las manchas cloróticas anulares de la zarzamora (Blackberry chlorotic ringsport virus, BCRV) como supresora del PTGS a nivel local. Para ello, las ORFs de ambas proteínas se clonaron en plásmidos binarios bajo la expresión del promotor 35S para su expresión transitoria mediante agroinfiltración. Ambas construcciones fueron expresadas en plantas de Nicotiana benthamiana 16c las cuales expresan constitutivamente la proteína verde fluorescente (GFP). Los resultados obtenidos sugieren que ninguna de estas proteínas tendría actividad de supresión del PTGS, de modo que al contrario que la proteína 2b del CMV, la de los ilarvirus no presentaría actividad de silenciamiento del PTGS a nivel local. 4 Índice 1. Introducción ............................................................................................................ 7 1.1. Importancia económica del tomate .................................................................. 7 1.2. Familia Bromoviridae ........................................................................................ 8 1.3. Género Ilarvirus .............................................................................................. 10 1.4. Virus del moteado de la Parietaria (PMoV). ................................................. 12 1.5. El silenciamiento génico en plantas ................................................................ 14 1.5.1. Supresores virales del silenciamiento de RNA ____________________ 15 2. Objetivos. ............................................................................................................... 19 3. Materiales y métodos. ........................................................................................... 21 3.1 materiales ......................................................................................................... 21 3.1.1. Material vegetal: planta huésped Nicotiana benthamiana ___________ 21 3.1.2. Material bacteriano __________________________________________ 22 3.1.3. Plásmidos __________________________________________________ 22 3.2. Métodos ........................................................................................................... 24 3.2.1. Reacción de ligación de DNA __________________________________ 24 3.2.2. Electroporación de plásmidos en E. coli _________________________ 24 3.2.3. Selección de bacterias recombinantes mediante PCR de las colonias _ 26 3.2.4. Electroforesis en gel de agarosa ________________________________ 27 3.2.5. Purificación de DNA a partir de un gel de agarosa ________________ 28 3.2.6. Purificación de plásmidos recombinantes (minipreps) _____________ 28 3.2.7. Cuantificación del DNA plasmídico_____________________________ 30 3.2.8. Digestión del DNA plasmídico _________________________________ 30 3.2.9. Purificación de DNA de una solución ___________________________ 30 3.2.10. Secuenciación de ácidos nucleicos _____________________________ 30 3.2.11. Análisis informático ________________________________________ 30 3.2.12. Agroinoculación de plantas __________________________________ 31 3.2.12.1. Electroporación de plásmidos en A. tumefaciens ........................... 31 3.2.12.2. Preparación del inóculo ................................................................... 31 5 3.2.12.3. Agroinfiltración................................................................................ 31 3.2.13. Análisis de proteínas mediante Western blot ____________________ 32 3.2.13.1. Preparación del gel de poliacrilamida (PAGE-SDS) ...................... 32 3.2.13.2. Extracción de proteínas totales de plantas agroinfiltradas ............ 32 3.2.13.3. Transferencia de las proteínas a membrana ................................... 33 3.2.13.4. Inmunodetección de proteínas transferidas a la membrana ______ 33 3.2.13.5. Visualización de las proteínas en la membrama ............................. 34 4. Resultados y discusión .......................................................................................... 35 4.1. Obtención, clonación y comprobación de la secuencia de DNA del gen que codifica la proteína 2b de TSV y BCRV ............................................................... 37 4.2. Subclonación del gen 2b en el vector pSK entre el doble promotor 35S y el terminador popit ................................................................................................... 39 4.3. Subclonación de los casetes de expresión en el vector binario pMOG 800 ... 42 4.4. Agroinfiltración de los plásmidos pMOG recombinantes en plantas de N. benthamiana. Análisis de la expresión de las proteínas 2b ................................... 44 4.5. Análisis tipo Western blot. ............................................................................. 46 5. Conclusiones .......................................................................................................... 48 6. Bibliografía. ........................................................................................................... 51 Anexos. ...................................................................................................................... 56 6 1. INTRODUCCIÓN 7 1. Introducción 1.1. Importancia económica del tomate El tomate (Solanum Lycopersicum), miembro de la familia de las Solanáceas, genero Solanum, es uno de los principales cultivos hortícolas en todo el mundo y el de mayor valor económico. Su demanda aumenta continuamente y con ella su cultivo, producción y comercio. Durante el año 2016 la producción española fue de algo más de 5 millones de toneladas (según el MAGRAMA), y ocupando en el año 2014 el puesto 7 entre los países con mayor producción a nivel mundial según la FAO (Figura 1). Dada la importancia económica de este cultivo, se hace más patente el esfuerzo tecnológico en cuanto a identificación y tratamiento de plagas y enfermedades, así como en la producción de semillas resistentes, nutrición y técnicas de cultivo adecuadas a la zona productora. Figura 1. Principales países productores de tomate a nivel mundial, según la FAO, en millones de toneladas, en el año 2014. El cultivo del tomate se ve fuertemente afectado por enfermedades que reducen considerablemente la producción y calidad, pudiendo llegar a ocasionar la pérdida total del cultivo. Entre las numerosas enfermedades que le afectan, las provocadas por virus se encuentran entre las más importantes ya que no existen medios de lucha contra estas enfermedades (sólo indirectos a través de la lucha contra sus vectores o el manejo de los cultivos). Los virus vegetales son partículas infecciosas que actúan como parásitos intracelulares obligados ya que solo puedan replicarse y completar su ciclo de infección 8 dentro de una célula hospedadora adecuada, causando graves daños al cultivo. El tomate es especialmente sensible a una amplia gama de virus tanto de DNA como de RNA. El cultivo puede ser infectado por un único virus o por varios a la vez por lo que la sintomatología puede ser muy variada y en ocasiones confusa. En España, las infecciones virales que producen o han producido un mayor impacto económico en los cultivos de tomate son: el virus del bronceado del tomate (Tomato spotted wilt virus, TSWV), el virus del rizado amarillo del tomate o de la cuchara (Tomato yellow leaf curl virus, TYLCV), el virus X de la patata (Potato virus X), el virus del amarilleo clorótico del tomate (Tomato chlorosis virus, ToCV), el virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV), el virus del mosaico del tomate (Tomato mosaic virus, ToMV), el virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV), el virus Y de la patata (Potato virus Y, PVY) y el virus del torrado del tomate (Tomato torrado virus, TTV). Todos ellos pueden causar daños tanto en hojas como en el fruto, reduciendo su rendimiento, e influyendo también en la maduración del fruto o crecimiento de la planta. Además de los virus mencionados anteriormente, también se ha detectado en los cultivos de tomate de diferentes regiones españolas el virus del moteado de la parietaria (Parietaria mottle virus, PMoV, génerio Ilarvirus, familia Bromoviridae), virus del que se ocupa este proyecto final de Máster. 1.2. Familia Bromoviridae Esta familia incluye los géneros Alfamovirus y Anulavirus con un único miembro y los géneros Bromovirus, Cucumovirus, Oleavirus e Ilarvirus con varios miembros cada uno. Los virus de esta familia tienen un genoma de RNA tripartito de cadena sencilla y polaridad positiva (ssRNA+). El RNA 1, es monocistrónico y tiene un único marco de lectura abierta (ORF), que codifica la proteína P1. El RNA 2 es también monocistrónico y tiene un ORF, que codifica la proteína P2. La proteína P2 junto con la P1, forman parte del complejo de la replicasa viral. Además, en el extremo 3´terminal del RNA 2 del virus del mosaico del pepino (CMV) y de los miembros del género de los Ilarvirus, se ha encontrado un ORF adicional (ORF 2b) que solapa con en el ORF 2 y que codifica la proteína 2b (Figura 2). En el caso del CMV, la proteína 2b interviene en el movimiento sistémico a larga distancia del virus y actúa como supresor del silenciamiento génico post-transcripcional o PTGS (Ding et al., 1995; Brigneti et al., 1998; Mayers et al., 2000). 9 El RNA 3 es bicistrónico y tiene 2 ORFs separados por una región no codificante (IGR). El ORF del extremo 5´terminal codifica la proteína del movimiento viral (MP) y el del extremo 3´terminal codifica la proteína de cubierta (CP). La CP y la proteína 2b se expresan mediante dos RNAs subgenómicos (sgRNA); la CP mediante el sgRNA 4 y la proteína 2b mediante el sgRNA 4A. Los extremos 5´y el 3´ terminales de cada RNA genómico tiene secuencias que no se traducen (NTRs). Además, el extremo 5´terminal de cada RNA presenta una estructura tipo Cap (m7G5ppp) cuya función es protectora. Los 3 RNAs genómicos son encapsidados formando virones de forma esférica en los géneros Bromovirus y Cucumovirus, baciliforme en el género Alfamovirus, y esférica o isométrica en los géneros Oleavirus e Ilarvirus, aunque tambien hay virones baciliformes en los dos últimos géneros (Bol, 1999). Figura 2. Organización genómica de los virus pertenecientes a la familia Bromoviridae. El panel A muestra el esquema de los miembros que no presentan en su genoma el ORF 2b, mientras que el panel B muestra el esquema de los que si contienen el ORF 2b en la parte 3´terminal de RNA 2. Los diferentes ORFs se representan en color verde y las proteínas que codifican (P1, P2, 2b, MP y CP) en color naranja. Cada segmento de RNA contiene una estructura tipo Cap en el extremo 5´terminal. Las proteínas 2b y CP se expresan a través de dos RNAs subgenómico, sgRNA 4A y sgRNA 4, respectivamente. En color gris se representan las regiones genómicas no traducidas. En las proteínas se señalan los diferentes dominios conservados: Metiltransferasa (MET), Helicasas (HEL), RNA polimerasa dependiente de RNA (POL), Dominio de Unión al RNA (RBD), Región Hidrofóbica (HR), y la Región de Dimerización (DR). 16 de silenciamiento. Son capaces de inhibir la respuesta antiviral del huésped por medio de la interacción con factores clave de la maquinaria de silenciamiento implicados en el reconocimiento de RNA viral, el procesamiento de dsRNAs, el ensamblaje del complejo RISC y la amplificación de señal (Figura 7). Figura 7. Actividad de los supresores virales del silenciamiento por RNA Las proteínas supresoras del silenciamiento virales que se representan con círculo rojo puede actuar bloqueando el silenciamiento mediado por dsRNAs, en distintos pasos de la ruta. HCPro del TEV (género Potyvirus), p19 del virus del enanismo arbustivo del tomate (Tomato bushy stunt virus, TBSV género Tombusvirus), p126 y p122 del TMV (género Tobamovirus), P0 del virus del amarillo de la remolacha occidental (Beet western yellows virus, BWYV género Polerovirus), p38 del virus del arrugamiento del nabo (Turnip crinkle virus, TCV género Carmovirus), 2b del virus del mosaico del pepino (Cucumber mosaic virus, CMV género Cucumovirus), P1 del virus del moteado suave del batata (Sweet potato mild mottle virus, SPMMV género Ipomovirus). AC4 del virus del mosaico de la yuca africana (African cassava mosaic virus, ACMV género Begomovirus), p21 del virus del amarilleo de la remolacha (Beet yellow virus, BYV género Closterovirus). Tomado de Shimura y Pantaleo, 2011. 17 De hecho, un virus puede presentar varias proteínas con actividad supresora del silenciamiento de forma que cada una puede afectar a etapas diferentes de la ruta de silenciamiento (Csorba et al., 2015). La mayoría de las proteínas con actividad supresora del silenciamiento identificadas son multifuncionales ya que además actúan como proteínas de cubierta, replicasas, proteínas de movimiento, factores implicados en la transmisión o reguladores transcripcionales (Roth et al., 2004; Burgyan and Havelda, 2011; Wang et al., 2012). En otras ocasiones esas proteínas se caracterizaron inicialmente como determinantes de patogenicidad y virulencia al estar relacionadas con la aparición de síntomas durante la infección viral (Garcia and Pallas, 2015). Las proteínas supresoras del silenciamiento más estudiadas son la proteína 2b del CMV y HC-Pro de potyvirus. 18 2. OBJETIVOS 19 2. Objetivos. Como se ha comentado en la introducción, en el extremo 3´terminal del RNA 2 de algunos virus de la familia Bromoviridae se ha encontrado un ORF adicional (ORF 2b) que solapa con el ORF 2 y que codificaría la proteína 2b. En el caso del cucumovirus del mosaico del pepino (CMV) se ha comprobado que la proteína 2b se expresa a partir del RNA subgenómico 4A (sgRNA4) y que dicha proteína interviene en el movimiento sistémico a larga distancia del virus y actúa como supresor del silenciamiento génico post-transcripcional o PTGS. Por homología en cuanto a la organización genómica se ha propuesto que esa misma proteína 2b en los miembros de los Ilarvirus (subgrupos 1 y 2), debería tener funciones similares. En el caso de los virus del subgrupo 1, se ha detectado la presencia del sgRNA 4A en plantas de Chenopodium quinoa infectadas con PMoV, pero no la proteína 2b. Además, en experimentos de expresión transitoria de la proteína 2b, realizados en nuestro grupo con plantas de Nicotiana benthamiana 16c (expresan constitutivamente la proteína verde fluorescente oGFP), se comprobó la expresión de la proteína, pero ésta no actuaba como supresor del silenciamiento génico a nivel local ni sistémico. Por ello, el objetivo general de este Trabajo Final de Máster consiste en realizar experimentos similares con la proteína 2b de otros dos virus del subgrupo 1: el virus del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV) y el virus de las manchas cloróticas anulares de la zarzamora (Blackberry chlorotic ringsport virus, BCRV). La realización de estos experimentos nos permitirá determinar el papel de la proteína 2b de este subgrupo 1 en relación con la actividad supresora del PTGS a nivel local. Como objetivos parciales destacan: 1Clonación del ORF 2b de los virus TSV y BCRV en el vector de expresión derivado del plásmido pMOG. 2Agroinoculación de plantas de N. benthamiana 16c y determinar si la proteína 2b desempeña alguna función en la supresión del silenciamiento génico a nivel local. 20 3. MATERIALES Y MÉTODOS 21 3. Materiales y métodos. 3.1 materiales 3.1.1. Material vegetal: planta huésped Nicotiana benthamiana N. benthamiana (Figura 8) es un organismo modelo de investigación con plantas debido a su fácil cultivo y a la facilidad de agroinfiltración. Figura 8. Nicotiana benthamiana planta y hoja. Las plantas 16c empleadas en la realización de estos experimentos son plantas transgénicas que expresan de forma constitutiva el mRNA de la proteína verde fluorescente (green fluorescent protein, GFP), una proteína producida por la medusa Aequorea victoria, que emite fluorescencia en la zona verde del espectro visible tras ser irradiada con luz ultravioleta (UV) (Figura 9). Para este trabajo se emplearon plantas de N. benthamiana 16c en estadio de desarrollo de 4 a 6 hojas. Las plantas se cultivaron en macetas de 9 cm de diámetro con una mezcla de turba y vermiculita. Se mantuvieron en una cámara de cultivo con las siguientes condiciones: - Régimen térmico de 22˚C/20˚C (día/noche). - Humedad relativa de 60-65%/95-100% (día/noche). - Fotoperiodo de 12 h de luz y 12 h de oscuridad con una irradianza de 65-85 µmol·m-2·s-1 suministrada por tubos fluorescentes con un intervalo de longitud de onda de entre 400-700 nm. 22 Figura 9. (A) Expresión de GFP en plantas de Nicotiana benthamiana. (B) plantas de N. benthamiana silvestres. En ambos casos las plantas son iluminadas con luz UV (Brigneti et al., 1998). 3.1.2. Material bacteriano La bacteria empleada para la amplificación de los plásmidos fue la cepa DH5α de Escherichia coli, mientras que para el proceso de agroinfiltración se utilizó la cepa C58C1 de Agrobacterium tumefacien. 3.1.3. Plásmidos Los plásmidos que se usaron en el desarrollo del trabajo fueron pJET1.2/blunt, pKSmyc y pMOG 800. El plásmido pJET1.2/Blunt de Fermentas (figura 10) se usó como plásmido intermedio en el proceso de clonación y amplificación del gen 2b de los virus TCV y BCRV. La síntesis del gen fue encargada a la empresa Thermo Scientific al inicio del proyecto y clonado en pJET1.2/blunt. El plásmido contiene un origen de replicación para E. coli, resistencia a ampicilina y un sistema de selección bajo un gen letal que facilita la identificación de las colonias recombinantes. El plásmido viene preparado para proceder a la ligación del fragmento de DNA de interés. Tras la ligación el gen letal se interrumpe y sólo las células bacterianas con plásmidos recombinantes podrán formar colonias. Las moléculas de vector pJET1.2/blunt en las que no se produce la ligación expresarán la enzima letal provocando la muerte de las bacterias después de la transformación. Esta selección 23 positiva acelera el proceso de identificación de colonias y elimina los costes adicionales necesarios para la selección de color azul/blanco presentes en otros vectores de clonación. Figura 10. Representación esquemática del plásmido pJET1.2/blunt de Fermentas. El plásmido pKSmyc (figura 11) contiene un MCS (sitio de clonación múltiple) entre el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) duplicado y el terminador popit del gen que codifica el inhibidor II de la proteasa de patata (Solanum tuberosum). El plásmido posibilita la clonación de los diferentes genes empleados en este trabajo. El plásmido contiene también un origen de replicación para E. coli y resistencia a ampicilina. Figura 11. Representación esquemática del vector intermedio pKS. Consta de un origen de replicación, un gen de resistencia a ampicilina y las secuencias del promotor 35S duplicado y del terminador popit, flanqueados por los sitios de restricción HindIII. Se indican los puntos de corte de las enzimas NcoI y Bgl II para facilitar el proceso de clonación. 24 El plásmido pMOG 800 (figura 12) es un plásmido binario que posibilita la clonación de los diferentes genes entre los bordes izquierdo y derecho del plásmido Ti de A. tumefaciens. Además, presenta resistencia a kanamicina y un origen de replicación de amplio espectro que permite su replicación tanto en E. coli como en A. tumefaciens. Figura 12. Representación esquemática del vector binario de expresión pMOG 800. Consta de un origen de replicación, un gen de resistencia a kanamicina y los bordes izquierdo (LB) y derecho (RB) del plásmido Ti de A. tumefaciens. Se indica el sitio de restricción HindIII para facilitar el proceso de clonación. 3.2. Métodos 3.2.1. Reacción de ligación de DNA Esta reacción permite insertar un fragmento de DNA en un vector de clonación o circularizar un plásmido previamente linealizado. En los casos de ligación inserto:vector se trató de mantener una relación molar 4:1. El volumen final de la reacción fue de 10 μl o 20 μl dependiendo del volumen de inserto y vector que se utilizó. Se añadió 1 μl (si el volumen final era de 10 μl) o 2 μl (si el volumen final era de 20 μl) del tampón de la T4 DNA ligasa (x10). Seguidamente, se adicionó 1 μl de la enzima T4 DNA ligasa (5 U/µl) (Fermentas) y el volumen de agua necesario para alcanzar el volumen final. La reacción se incubó durante 1-2 h a 22°C. 3.2.2. Electroporación de plásmidos en E. coli En este caso la transformación de las células competentes de la cepa DH5 de E. coli se realizó mediante electroporación. Esta técnica consiste en someter las células a un pulso eléctrico que da lugar a la apertura de poros en la membrana plasmática bacteriana, permitiendo la entrada del plásmido a su interior. Hind III 25 Se partió de alícuotas de células electrocompetentes congeladas a -80°C. Se mezclaron en un tubo Eppendorf de 1,5 ml, 50 μl de células competentes (una vez descongeladas) con 2-3 μl del plásmido de interés. Posteriormente, la mezcla de plásmido y células se introdujo en una cubeta de electroporación atemperada sobre hielo. Se secaron los electrodos de la cubeta y se situó en el electroporador (BTX ECM399) (Figura 13). Se le sometió a un pulso eléctrico (1500 V durante 5 ms). Tras la aplicación del pulso se pipeteó rápidamente sobre la cubeta de electroporación 500 μl de solución SOC (20 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura, 0,5 g/l de NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM de MgCl2, ajustado todo ello a pH 7 con NaOH). La mezcla se transfirió a un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se incubó a 37°C durante 1 h. Figura 13. A) Electroporador, B) siembra en placas. Tras la incubación se sembraron las bacterias en medio LB con agar en presencia de ampicilina (50 g/ml). Para asegurar que se conseguían colonias aisladas, el total de células se repartió en dos placas. En una de ellas se sembraron 50 μl y en la otra el resto del cultivo. Las placas se incubaron a 37°C hasta que crecieran las colonias (figura 14). 32 presionar el émbolo lentamente, la solución bacteriana penetra generando un halo en los espacios intercelulares del tejido vegetal (figura 18). Figura 18. Proceso de agroinoculación. Izquierda: Momento de la agroinoculación en el envés de la hoja. En medio: Herida tras la agroinoculación. Derecha: Gráfico ampliado de la herida tras la agroinoculación. 3.2.13. Análisis de proteínas mediante Western blot 3.2.13.1. Preparación del gel de poliacrilamida (PAGE-SDS) La separación de proteínas se realizó en condiciones desnaturalizantes en geles de poliacrilamida en presencia del detergente sodiododecilsulfato (SDS), utilizando el sistema MiniProtean 3 (BioRad). Estos geles constan de dos fases; la inferior (7 cm) de separación o resolving al 10% (30% mezcla de acrilamida:bisacrilamida (29:1), 1,5M Tris pH 8,8, 10% SDS, 0,01% de APS al 10% y 0,001% TEMED) y la superior (3 cm) de compactación, concentración o staking (30% mezcla de acrilamida:bisacrilamida (29:1), 1M Tris pH 6.8, 10% SDS, 0,01% de APS al 10% y 0,001 % TEMED). Una vez polimerizada la acrilamida, los geles se montaron en cubetas de electroforesis y se cubrieron con tampón de electroforesis de proteínas (0,025 M Tris-HCl pH 8,3; 0,2 M glicina; 1% SDS). 3.2.13.2. Extracción de proteínas totales de plantas agroinfiltradas Para la extracción de proteínas totales se utilizaron muestras de material vegetal agroinfiltrado con un peso de unos 50 mg. El material vegetal se trituró en presencia de nitrógeno líquido, se resuspendió en 200 μl de tampón de extracción de proteínas (60 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 100 mM dithiothreitol, 10% glicerol y 0.01% azul de bromofenol) y se incubó a 95°C durante 10 min para inducir la desnaturalización de las proteínas. Seguidamente, las muestras se clarificaron mediante centrifugación a 13.000 33 rpm durante 30 s y se cargaron 20 μl del sobrenadante en el gel de poliacrilamida. La electroforesis se llevó a cabo a 35 mA durante aproximadamente 2 h. Como marcador de peso molecular de proteínas se empleó el marcador BenchMark™ Pre-Stained Protein Ladder de Invitrogen. 3.2.13.3. Transferencia de las proteínas a membrana Tras su separación por PAGE-SDS, las proteínas se transfirieron a una membrana de PVDF (polivinilidenofluoruro, Amersham) para su posterior reconocimiento serológico con un anticuerpo específico que reconoce el epítopo myc. La membrana fue tratada previamente, sumergiéndola en metanol al 100% durante 1 min y posteriormente realizando 3 lavados de 5 minutos con agua destilada en agitación. La transferencia de proteínas a la membrana se realizó con el equipo de transferencia semiseca TE 70 de Hoefer™. Para ello, la membrana y el gel se colocaron entre papeles whatman 3MM (figura 19) humedecidos con tampón de electrotransferencia (25 mM Tris base, 192 mM glicina). La transferencia de las proteínas se realizó mediante la aplicación de un campo eléctrico constante de 1 mA/cm2 de membrana durante 1 h. Figura 19. Esquema de transferencia de las proteínas a membranas de PVDF. 3.2.13.4. Inmunodetección de proteínas transferidas a la membrana Finalizada la transferencia, la membrana se lavó durante 5 min con solución TBS (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) y posteriormente se bloqueó durante una hora a temperatura ambiente con leche en polvo desnatada al 5%, disuelta en TBST (TBS más Tween 20 al 0,3%). A continuación se incubó la membrana durante toda la noche a 4°C en solución de hibridación (5% de leche desnatada en solución TBST) a la que se 34 añadió el antisuero específico contra la proteína myc (en dilución 1:7.000). Seguidamente se hicieron 3 lavados de 5 min cada uno en agitación con TBST para eliminar el exceso del anticuerpo de la membrana. Una vez lavada, la membrana se incubó 1 h a temperatura ambiente con solución de hibridación a la que se añadió el anticuerpo secundario (dilución 1:10.000), que reconoce la fracción constante del anticuerpo anti-myc, conjugado a fosfatasa alcalina. Con el fin de eliminar el exceso de anticuerpo secundario se realizaron 2 lavados consecutivos de 5 min cada uno a temperatura ambiente con tampón TBST y un lavado de 5 min a temperatura ambiente con TBS. Finalmente, el revelado de la membrana se realizó preparando el sustrato quimioluminiscente especial para la fosfatasa alcalina, siguiendo las instrucciones del kit de revelado fotosensible ECL plus Western Blotting System de Amersham. La solución que contenía el sustrato se aplicó sobre la membrana durante 5 min en oscuridad. Para la detección de la señal quimio-luminiscente, la membrana se expuso a películas autorradiográficas (Amersham) durante 30-60 min y se revelaron automáticamente. Todos los pasos del revelado se llevaron a cabo en oscuridad y a temperatura ambiente. 3.2.13.5. Visualización de las proteínas en la membrama Tras la transferencia de proteínas a la membrana, esta se tiñó durante 40 min en solución de azul coomassie (0,1% azul coomassie (p/v), 40% metanol y 10% ácido acético) y, posteriormente, se eliminó el exceso de colorante durante 1-2 h en solución de lavado (20% isopropanol, 5% ácido acético) hasta que pudieron apreciarse las bandas de proteínas. 35 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 36 4. Resultados y discusión La enfermedad de la necrosis apical del tomate causada por el virus del moteado de la parietaria (PMoV) ha provocado numerosas pérdidas económicas en algunos cultivos hortícolas desde su primera detección en España en 2000 (Aramburu et al., 2001). Las plantas infectadas se protegen de su infección mediante una serie de mecanismos de defensa, siendo uno de ellos el del silenciamiento génico post-transcripcional o PTGS (postranscrptional gene silencing). Como respuesta al silenciamiento de RNA en plantas, los virus han desarrollado estrategias específicas basadas en la utilización de proteínas propias con capacidad de suprimir el silenciamiento. Estas proteínas son diversas en secuencia y origen evolutivo y pueden actuar en diferentes pasos de la ruta de silenciamiento. Son capaces de inhibir la respuesta antiviral del huésped por medio de la interacción con factores clave de la maquinaria de silenciamiento implicados en el reconocimiento de RNA viral, el procesamiento de dsRNAs, el ensamblaje del complejo RISC y la amplificación de señal. De hecho un virus puede presentar varias proteínas con actividad supresora del silenciamiento de forma que cada una puede afectar a etapas diferentes de la ruta. En algunos virus de la familia Bromoviridae se ha encontrado un supuesto gen que codificaría la proteína 2b. En el caso del Cucumovirus del mosaico del pepino (CMV) se ha comprobado que la proteína 2b se expresa y que dicha proteína interviene en el movimiento sistémico a larga distancia del virus y actúa como supresor del PTGS. Por homología en cuanto a la organización genómica se ha propuesto que esa misma proteína 2b en los Ilarvirus género al que pertenece PMoV, debería tener funciones similares. En un proyecto anterior se comprobó la presencia del sgRNA 4A en plantas de Chenopodium quinoa infectadas con PMoV, pero no la proteína 2b. Además, en experimentos de expresión transitoria de la proteína 2b, realizados con plantas de Nicotiana benthamiana 16c (expresan constitutivamente la proteína verde fluorescente GFP), se comprobó la expresión de la proteína, pero ésta no actuaba como supresor del silenciamiento génico a nivel local ni sistémico (door Peeters, 2009). Queremos determinar si la ausencia de actividad supresora del PTGS es específica de la proteína 2b de PMoV, o este hecho es extensible a la misma proteína de todos los Ilarvirus. El objetivo general de este Trabajo Final de Máster consiste en realizar experimentos similares con la proteína 2b de otros dos Ilarvirus del mismo subgrupo que PMoV, como son: el virus del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV) y el virus de las 37 manchas cloróticas anulares de la zarzamora (Blackberry chlorotic ringsport virus, BCRV). Para ello, la proteína 2b de ambos virus (y la proteína 2b de PMoV usada como control) se expresarán transitoriamente en plantas de N. benthamiana 16c y se determinará su capacidad o no para romper el PTGS. 4.1. Obtención, clonación y comprobación de la secuencia de DNA del gen que codifica la proteína 2b de TSV y BCRV Debido a que en nuestro grupo no disponemos de los virus TSV y BCRV, se procedió a obtener la secuencia del ORF 2b disponible en la base de datos del Genbank y se solicitó la síntesis del correspondiente gen a la casa comercial Thermo Scientific. Para facilitar el proceso de clonación, cada una de las secuencias se equipó con un punto de corte en NcoI (CCATGG) en el extremo 5´ y un punto de corte Bgl II (AGATCT) en el extremo 3´ (precedidas ambas de los 5 nucleótidos AAAAA para optimizar la posterior restricción). Previamente, se confirmó la ausencia de corte de estos dos enzimas de restricción en la secuencia de ambos genes, mediante el análisis de la misma con el programa informático Restriction Map. Además, para comprobar la correcta expresión de las proteínas, cada secuencia se etiquétó con el epítopo myc (secuencia de aminoácidos E Q K L I S E E D L, codificados en la secuencia de nucleótidos gaacaaaaactcatctcagaagaggatctg). La síntesis solicitada incluía las siguientes secuencias mostradas en la figura 20. Tobacco streak virus (TSV) putative 2b protein gene, NCBI Reference Sequence: NC_003842.1 AAAAACCATGGaacaaaaactcatctcagaagaggatctgtttattccgatcttgttcctcactttgact ctcgcgtcagcagatgtgatgactctgatggagtccgaacctcaaccttcgacgacagaaagtcgtccaa gcatgcctccgataaactcaggaaaaccgagtgttacggagaagcccggtgtagaattaaaccccggaga aaccgtaaaagtgaaagcggagcagttcaatacagtcaatccagtggaattgaaactggaaaagcgaatt cctcccggaagggtaggatcaaattgcattgactgtgctatttccaacttgccaaaggcgatgttctctg tcaaggttccgaagttgaatatcaacttcgaggtgtctgattttccgtcttcaaggttaatatttgccac gttagcccaaagagtgaagtctattccctttattgagtctctgagttttcccagcgatattcaaaggatg cagcttcgtgctctaggtgacgtagaagtcctcatcttcattccaaaatttggttggaaacaaattttga aattgtctgatgtggtttccgggtttgatatcccgaagatcccgtccatagctcccaaagtggagtcatg tgtcggtgattgcctaaattcttgaAGATCTAAAAA Secuencia de aminoácidos deducida de la proteína 2b de TSV MEQKLISEEDLFIPILFLTLTLASADVMTLMESEPQPSTTESRPSMPPINSGKPSVTEKPGVELNPGETV KVKAEQFNTVNPVELKLEKRIPPGRVGSNCIDCAISNLPKAMFSVKVPKLNINFEVSDFPSSRLIFATLA QRVKSIPFIESLSFPSDIQRMQLRALGDVEVLIFIPKFGWKQILKLSDVVSGFDIPKIPSIAPKVESCVG DCLNS- 38 Blackberry chlorotic ringspot virus (BCRV) putative 2b protein gene, NCBI Reference Sequence: NC_011554.1 AAAAACCATGGaacaaaaactcatctcagaagaggatctgatgtttattccaatcttgttgatgctcttg agcccatgtgtgctcgcagacttgatgcctcacccagaagatccgagatttgttccggaaacgagaaagt ccgaatcggttcccgaaactccagatgtggttcctggagaaaggaataccgagccggagataaaattgag accccgcgaatctgtgaaggtgtccacggacggggaaagagagagcccagtgcaaaccctcaacgaattt cgtttagaggaaaggagctcacctggaaaggtggcaacaaattgccttgattgtgctatcactcatcttc cagaggtagctttctctgtgaaggtaccgaagttgaatataaacttcgaagtttcagattttccttcatc aaggttaatctttgccagcttggccagtagaattaaggacttaccctttgttcgatcattgaggtatccc actgatcatcaaaggattcagttacgttctattggtgatgttgaagtacacatccatattccaaaatttg gttggaaacaagttttgaagatgtctgatgtgatttccggttttgaattaccgaagattcccaccatcgc tccaaaagtggagtcgtgtgttggtgaatgtttaacccattaaAGATCTAAAAA Secuencia de aminoácidos deducida de la proteína 2b de BCRV MEQKLISEEDLMFIPILLMLLSPCVLADLMPHPEDPRFVPETRKSESVPETPDVVPGERNTEPEIKLRPR ESVKVSTDGERESPVQTLNEFRLEERSSPGKVATNCLDCAITHLPEVAFSVKVPKLNINFEVSDFPSSRL IFASLASRIKDLPFVRSLRYPTDHQRIQLRSIGDVEVHIHIPKFGWKQVLKMSDVISGFELPKIPTIAPK VESCVGECLTHFigura 20. Secuencia de nucleótidos y secuencia deducida de aminoácidos (en rosa) del gen 2b de TSV y BCRV. Se indican en rojo los codones de inicio y fin de cada gen. En mayúsculas y subrayados los puntos de corte de los enzimas de restricción NcoI y Bgl II. En amarillo se indica la secuencia de nucleótidos (gen) o de aminoácidos (proteína) del epítopo myc. Después podemos observar una alineación de la secuencia solicitada con la recibida, así comprobamos que corresponde con lo solicitado. Los respectivos genes sintetizados por la empresa Thermo Scientific se clonaron en el vector pJET1.2/blunt según se describe en el apartado XXX con el objetivo de disponer de suficiente cantidad para las posteriores subclonaciones. Tras la ligación, se introdujo el plásmido recombinante mediante electroporación en la cepa DH5a de E. coli y la mezcla se distribuyó en placas con agar y se dejaron a 37º C hasta el desarrollo de las colonias (Figura 21). Figura 21. Crecimiento de bacterias portadoras de los plásmidos recombinantes pJET1.2/blunt + gen 2b de TSV y BCRV. 39 La presencia del gen 2b (de TSV y/o de BCRV) en las colonias recombinantes se comprobó mediante PCR. Se aisló el plásmido recombinante de una colonia de bacterias de cada tipo y se procedió a su secuenciación empleando cebadores específicos del vector de clonación. Las secuencias de nucleótidos obtenidas se alinearon con las secuencias de síntesis solicitadas usando el programa blast del NCBI, con el fin de descartar cualquier error durante el proceso de síntesis química de cada uno de los genes. Comprobada la secuencia correcta de cada gen, los plásmidos pJET-TSV (colonia número 5) y pJET-BCRV (colonia número 8) se sometieron a digestión con las enzimas de restricción NcoI y Bgl II, para su posterior ligación en el vector pSK digerido con las mismas enzimas de restricción entre el doble promotor 35 S y el terminador popit (Anexo 1). Una vez llevada a cabo la restricción, los fragmentos de DNA se separaron en una electroforesis en gel de agarosa (figura 22) y el fragmento de DNA conteniendo el gen 2b (aproximadamente 650 pb) se purificó del gel de agarosa. Figura 22. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de muestras de DNA tras la digestión con las enzimas de restricción NcoI y Bgl II. Carril 1, marcador de peso molecular. Carril 2, pJET + gen 2b TSV (colonia 5) cortado con NcoI y Bgl II. Carril 3, pJET + gen 2b BCRV (colonia 8) cortado con NcoI y Bgl II. Se indica con un recuadro la banda de DNA con el gen 2b cortada para purificar. 4.2. Subclonación del gen 2b en el vector pSK entre el doble promotor 35S y el terminador popit Tras la purificación, los fragmentos de DNA conteniendo el gen 2b se comprobaron y cuantificaron mediante un gel de electroforesis, junto con el vector 40 pKS digerido con las dos mismas enzimas de restricción y purificado de igual forma (figura 23). El objetivo de esta digestión fue generar extremos cohesivos entre los insertos (genes 2b de TSV y BCRV) y el vector pKS con el fin de facilitar la clonación. Figura 23. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de muestras de DNA purificadas tras la digestión con las enzimas de restricción NcoI y Bgl II del vector de clonación pKS (Carril 2) y del gen 2b de los aislados TSV (carril 3) y BCRV (carril 4). Carril 1, marcador de tamaños de DNA 100 pb Ladder Plus (Fermentas). Los fragmentos de DNA conteniendo el gen 2b de los dos virus aislados se ligaron en el vector intermedio pKS siguiendo el esquema de la figura 24. Figura 24. Representación esquemática del proceso de ligación entre el vector pKS digerido con las enzimas de restricción NcoI y Bgl II y el gen 2b de TSV o BCRV digerido con las mismas enzimas. El casete de expresión consta del gen 2b clonado entre la secuencia del doble promotor 35S y del terminador popit. Como el vector pKS no lleva ningún gen reportero, para identificar las colonias portadoras del vector recombinante se realizó una PCR de colonias con dos cebadores 41 del vector. En la figura 25 se muestra un ejemplo de amplificación a partir de diferentes colonias de bacterias transformadas con pKS + gen 2b de TSV. Figura 25. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los productos de amplificación a partir de diferentes colonias de bacterias transformadas con pKS + gen 2b de TSV. En la parte superior de la imagen se indica el número de cada colonia. Los productos de amplificación de 1200 pb corresponden al tamaño del doble promotor 35S + terminador popit. Los productos de amplificación recuadrados de unos 2000 pb corresponden a los que han insertado el gen 2b entre promotor y terminador. Carriles 1 y 21, marcadores de DNA 100 bp Ladder Plus y DNA 100 bp Ladder, respectivamente, ambos de Fermentas. Utilizando esta estrategia se obtuvieron las dos construcciones pKS-gen 2b TSV y pKS-gen 2b BCRV. La comprobación de los dos plásmidos recombinantes seleccionados se realizó mediante secuenciación con un cebador que hibrida en el terminador popit, y mediante digestión con la enzima de restricción HindIII (figura 26). Figura 26. Electroforesis en gel de agarosa al 0,8% de los plásmidos recombinantes pKS + gen 2b de los virus TSV (carril 2) y BCRV (carril 3) tras la digestión con la enzima de restricción HindIII. La banda superior de los carriles 2 y 3 corresponde al esqueleto del vector y la inferior al casete liberado 2 x 35S + gen 2b + terminador popit. Carril 1, marcador DNA 100 pb Ladder Plus de Fermentas. 48 5. Conclusiones 49 5. Conclusiones 1. Se ha clonado en un vector binario, para la expresión transitoria mediante agroinfiltración, el gen que codifica la supuesta proteína 2b de los Ilarvirus: virus del estriado del tabaco (Tobacco streak virus, TSV) y virus de las manchas cloróticas anulares de la zarzamora (Blackberry chlorotic ringsport virus, BCRV). 2. Mediante la expresión transitoria en el sistema de plantas de N. benthamiana 16c se ha determinado que ninguna de estas proteínas presentan actividad supresora del PTGS a nivel local. 50 6. Bibliografía 51 6. Bibliografía. Adenot, X., Elmayan, T., Lauressergues, D., Boutet, S., Bouche, N., Gasciolli, V., and Vaucheret, H., (2006). DRB4-dependent TAS3 trans-acting siRNAs control leaf morphology through AGO7. Curr Biol 16:927-932. Aparicio, F., Vilar, M., Perez-Paya, E. and Pallas, V. (2003). The coat protein of prunus necrotic ringspot virus specifically binds to and regulates the conformation of its genomic RNA. Virology 313:213-223. Aramburu, J., (2001). 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