UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A
TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DEL INÓCULO DE Phaeomoniella
chlamydospo a EN CAMPO
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNO: SERGIO ARIZMENDI PABLOS
TUTOR: JOSEP ARMENGOL FORTÍ
COTUTORES: MÓNICA BERBEGAL MARTÍNEZ
SANTIAGO CATALÁ GARCÍA
Cu so Académico: 2014-2015
VALENCIA, Julio de 2015
Tipo Licencia
Da os pe sonales
Nomb e y apellidos: Se gio A izmendi Pablos
Da os del abajo de in de g ado
Tí ulo del TFG: Desa ollo de un p o ocolo de PCR a iempo eal pa a la de ección y
cuan i icación del inóculo de Phaeomoniella chlamydospo a en campo.
Luga de ealización: Unidad de Pa ología Vege al, Dp o. Ecosis emas Ag o o es ales
Ti ulación: G ado en Bio ecnología
Tu o y Co u o es: Josep A mengol Fo í, Mónica Be begal Ma ínez, San iago Ca alá Ga cía
Valencia, julio de 2015
Resumen
Phaeomoniella chlamydospo a es uno de los p incipales hongos i opa ógenos implicados en
las en e medades úngicas de made a de la id (EFMV), que causan impo an es pé didas en el
sec o i ícola. Pa a el con ol de las EFMV es necesa io minimiza el iesgo de in ección a
a és de he idas de poda desde el momen o de la plan ación en el iñedo. En es e sen ido,
conoce la disponibilidad de inóculo en campo es imp escindible pa a la oma de decisiones
elacionadas con el manejo de es as en e medades.
Uno de los mé odos u ilizados pa a el seguimien o en campo del inóculo aé eo de hongos
i opa ógenos es el sis ema Bu ka d, que oma mues as de pa ículas en el ai e po impac o
en una cin a adhesi a, pa a su pos e io cuan i icación po obse ación de espo as en
mic oscopio. Dada la complejidad de es e p oceso, las écnicas molecula es pueden supone
una al e na i a e icaz pa a de ec a e incluso cuan i ica hongos en mues as ambien ales.
El obje i o de es e abajo es pone a pun o un p o ocolo de ex acción, de ección y
cuan i icación de Pa. chlamydospo a median e PCR a iempo eal. Pa a ello, se u iliza on
mues as de concen aciones conocidas de conidios ob enidos in i o, así como mues as
p oceden es de campo.
En p ime luga , se p epa ó una solución mad e con al a concen ación de conidios (5 x 107
conidios/ml) p oceden e de Pa. chlamydospo a cul i ado in i o y se ealiza on diluciones
se iadas 1:10 y 1:5. Sob e cin as imp egnadas con silicona, ep oduciendo el sis ema Bu ka d,
se aplicó una can idad de e minada de cada dilución y se p ocedió a la ex acción de ADN.
Pa a la de ección ue necesa io el uso de una PCR anidada. En la p ime a eacción se ampli icó
una egión de ADN con enida en e los genes 18S y el Espaciado In e no T ansc i o 2 (ITS2)
con la combinación de un cebado uni e sal y uno especí ico de Pa. chlamydospo a. Los
p oduc os de PCR se u iliza on como molde en la PCR a iempo eal usando cebado es
especí icos de Pa. chlamydospo a.
Pa a la aplicación del p o ocolo pues o a pun o se expusie on dos po aobje os con cin as
siliconadas en dos iñedos localizados en On enien e y Albace e. Además, se ecopila on los
da os me eo ológicos de zonas p óximas a las pa celas es udiadas du an e el pe iodo de
mues eo.
El p o ocolo desa ollado esul ó al amen e especí ico y sensible, consiguiéndose alcanza un
lími e de de ección de 52 conidios de Pa. chlamydospo a po cm2 de cin a. En las mues as
p oceden es de campo se ob u ie on 7 posi i os de Pa. chlamydospo a en On enien e y 2 en
Albace e. El mayo núme o de posi i os de ec ados en la pa cela de On enien e pod ía
asocia se a que se a a de un iñedo más an iguo y sin los con oles i osani a ios de la
pa cela de Albace e. Las mues as posi i as se elaciona on con las condiciones ambien ales
egis adas en las pa celas.
El uso de écnicas molecula es esul a una al e na i a a la de ección y cuan i icación po
mic oscopía de conidios, y su combinación con sis emas de cap u a de pa ículas aé eas pod ía
da luga al desa ollo de mé odos de p edicción de las EFMV con un ma gen de iempo
adecuado pa a el empleo e icien e de las medidas de con ol exis en es.
Palab as cla e
Phaeomoniella chlamydospo a, en e medades úngicas de made a de la id, PCR a iempo eal,
cuan i icación de conidios
Abs ac
Phaeomoniella chlamydospo a is one o he main ungal pa hogens associa ed wi h g ape ine
unk diseases (GTD), which cause signi ican economic losses o he wine indus y wo ldwide.
Fo GTD managemen i is necessa y o minimize in ec ion isk h ough p uning wounds since
he ime o plan ing. The eby, knowledge o pa hogen inoculum dynamics in ield and i s
ela ionship wi h he en i onmen al condi ions is essen ial o suppo decision-making in GTD
managemen .
One o he me hods used o moni o ing he ai bo ne inoculum o plan pa hogenic ungi in
ield is he Bu ka d sys em, which akes samples o he ai bo ne pa icles impac ing on a ape
o he subsequen quan i ica ion o spo es by obse a ion unde mic oscope. This p ocess is
complex, so ha molecula echniques can ep esen an e ec i e al e na i e o de ec and
quan i y ungi in en i onmen al samples.
The objec i e o his esea ch is he de elopmen o Pa. chlamydospo a ex ac ion, de ec ion
and quan i ica ion p o ocol using eal- ime PCR. To his aim, samples wi h known
concen a ions o conidia ob ained in i o and om ield samples we e used.
A i s , a s ock solu ion wi h high concen a ion o conidia was p epa ed (5 x 107 conidia/ml)
om Pa. chlamydospo a g own in i o and se ial dilu ions 1:10 and 1:5 we e made. Known
quan i ies o each dilu ion we e applied on apes ep oducing he Bu ka d sys em and DNA
ex ac ion was made.
A nes ed PCR was needed o low concen a ions o DNA de ec ion. In he i s ound o PCR
eac ion, a DNA egion included be ween 18S and he In e nal T ansc ibed Space s 2 (ITS2)
genes was ampli ied wi h a combina ion o a uni e sal p ime and a speci ic p ime o Pa.
chlamydospo a. Resul ing p oduc s we e used as DNA empla e in second ound eal- ime PCR
using speci ic p ime s o Pa. chlamydospo a.
Two slides wi h apes we e exposed in wo ineya ds loca ed in On enien e and Albace e o
he applica ion o he p o ocol. Mo eo e , me eo ological da a we e ob ained in a eas close o
he ineya ds du ing he sampling pe iod.
The es ablished p o ocol was p obed o be speci ic and sensi i e, and he limi o de ec ion
was 52 conidia o Pa. chlamysopo a pe cm2 o ape. Se en and 2 posi i es samples o Pa.
chlamydospo a we e ob ained in On enien e and Albace e, espec i ely. These esul s can be
associa ed o On enien e ineya d condi ions, olde han he one loca ed in Albace e and no
unde phy osani a y con ol measu es. A ela ionship be ween he en i onmen al condi ions
egis e ed and he posi i e samples was obse ed.
The use o molecula echniques is an al e na i e o he conidia mic oscopic de ec ion and
quan i ica ion and i s combina ion wi h spo e sample s could help o de elop GTD p edic ion
me hods and op imize disease managemen .
Key wo d
Phaeomoniella chlamydospo a, g ape ine unk diseases, eal ime PCR, conidia quan i ica ion

Ag adecimien os
A Josep A mengol, que me ab ió las pue as de es e labo a o io, ayudándome a ap ende y a
dis u a con lo que hacía. A Mónica, undamen al en cada momen o, que me ha dedicado el
doble de su iempo cuando ni siquie a lo enía pa a sí misma. Y, po supues o, a San i, po odo
y mucho más.
G acias a odo el equipo del labo a o io po habe me hecho sen i uno más du an e odo
es e iempo, esol e me dudas y pone odos los ecu sos que he necesi ado a mi alcance.
Especialmen e a Toni, un compañe o y un amigo con el que siemp e he podido con a .
Finalmen e, g acias a mi amilia. A mi he mano, mi pad e y, sob e odo, a mi mad e, po que
su con ianza en mí nunca me ha hecho des allece .
I
ÍNDICE GENERAL
1. INTRODUCCIÓN ........................................................................................................................ 1
1.1. Impo ancia del cul i o de la id en España ...................................................................... 1
1.2. Las en e medades úngicas de la made a de la id ........................................................... 2
1.3. Dispe sión de las en e medades úngicas de la made a e in ección de las plan as .......... 4
1.3.1. Fuen es de inóculo ..................................................................................................... 4
1.3.2. Vías de dispe sión ....................................................................................................... 5
1.3.3. Vías de in ección ......................................................................................................... 6
1.3.4. El ciclo de la en e medad causada po Phaeomoniella chlamydospo a .................... 6
1.4. Técnicas molecula es pa a la de ección de EFMV ............................................................. 8
2. OBJETIVOS ............................................................................................................................... 11
3. DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL PARA LA DETECCIÓN Y
CUANTIFICACIÓN DEL INÓCULO DE Phaeomoniella chlamydospo a EN CAMPO .................... 12
3.1. Ma e iales y mé odos ...................................................................................................... 12
3.1.1. P epa ación de suspensiones de conidios, ex acción de ADN y p epa ación de
diluciones de ADN .............................................................................................................. 12
3.1.2. Ajus e del p o ocolo de de ección y cuan i icación de conidios de Pa.
chlamydospo a ................................................................................................................... 13
3.1.3. Validación del p o ocolo ........................................................................................... 19
3.1.4. Validación del p o ocolo en mues as de campo ..................................................... 19
3.2. Resul ados y discusión ..................................................................................................... 21
3.2.1. Ajus e del p o ocolo ................................................................................................. 21
3.2.2. Ob ención de la ec a de calib ado y alidación del p o ocolo ................................ 23
3.2.3. Validación del p o ocolo en mues as de campo ..................................................... 26
3.3. Conclusiones .................................................................................................................... 31
4. BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................................................... 32
II
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Concen ación de conidios (conidios/ml y conidios/cm2) de las diluciones se iadas 1:10
(D1, D2, D3, D4 y D5) e in e medias 1:5 (D3,8 y D4,8). ............................................................... 14
Tabla 2. Concen ación y olumen de los componen es de la mezcla de eacción de PCR y
qPCR. ........................................................................................................................................... 15
Tabla 3. Condiciones de eacción pa a PCR y qPCR. ................................................................... 16
Tabla 4. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación de los Espaciado es In e nos T ansc i os
(ITS) de ADN ibosómico (ADN ). ................................................................................................ 17
Tabla 5. Concen ación de conidios en la suspensión (conidios/ml), conidios en la supe icie de
la cin a (conidios/cm2 de cin a) y ADN (ng/µl) de las mues as de alidación. ........................... 19
Tabla 6. Valo es p omedio de C pa a las diluciones (Tabla 1) y alidaciones (Tabla 5)
ampli icadas con los cebado es Pch1 y Pch2. ............................................................................. 25
Tabla 7. Concen ación de conidios (conidios/cm2) cuan i icada en los po aobje os A y B de las
pa celas de On enien e y Albace e las semanas en que se ob u ie on posi i os pa a Pa.
chlamydospo a. ........................................................................................................................... 27
III
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1, E olución de la supe icie de iñedo plan ada en España (po hec á ea) desde la
campaña 2008/2009 has a 2012/2013 (MAGRAMA, 2015). ........................................................ 1
Figu a 2. Sin oma ología de las EFMV en plan a adul a. (a) Seca de b azos y agos amien o
p ema u o en una plan a a ec ada po Yesca. (b) De alle de pod edumb e esponjosa de la
made a en una plan a a ec ada po Yesca. (c) B azo con b o aciones aquí icas en una plan a
a ec ada po Eu ipiosis. (d) De alle de nec osis sec o iales de made a en una plan a a ec ada
po “Bo yosphae ia dieback”.. ..................................................................................................... 2
Figu a 3. Ciclo de la en e medad causada po Pa. chlamydospo a (G amaje y La ignon, 2015). 7
Figu a 4. (a) Conidió o os y conidios de Pa. chlamydospo a. (b) Conidió o os y conidios del
sinanamo o ipo Phoma (C ous y Gams, 2000). .......................................................................... 8
Figu a 5. Tipos de sis ema de mues eo de pa ículas aé eas. (a) Cap u ado Bu ka d. (b)
Sis ema de b azo o a o io. (c) Sis ema de mues eo en ase líquida. (d) Va ian e del Sis ema
Bu ka d. (e) Sis ema Ande sen (Wes e al., 2008). ...................................................................... 9
Figu a 6. Esquema de los pasos seguidos en el ajus e del p o ocolo de de ección y
cuan i icación de conidios de Pa. chlamydospo a. Cada uno de los pasos mos ados en los
ecuad os se desa olló median e una PCR cuan i a i a en la que se emplea on los cebado es
que se emplea on los cebado es que apa ecen en colo ojo. ................................................... 14
Figu a 7. Localización de cada uno de los cebado es en el ADN ibosómico de Pa.
chlamydospo a (Ga des y B uns, 1993; Ko abecna, 2007; Edwa ds e al., 2007). ..................... 17
Figu a 8. (a) T ampa de conidios diseñada. (b) De alle de go as de llu ia dispues as en la
supe icie de la ampa de conidios. (c) Pa cela de On enien e donde se pueden dis ingui ides
sin omá icas de EFMV. ................................................................................................................ 21
INTRODUCCIÓN
3
Yesca. En e medad causada p incipalmen e po el hongo basidiomice o Fomi ipo ia
medi e anea que p o oca una pod edumb e seca y esponjosa de la made a en las zonas
cen ales del onco y/o b azos (Figu a 2a y b), la cual apa ece sepa ada po una línea neg a de
o a zona más ex e io , de consis encia du a, en la que se ap ecian pun os o es ías nec ó icas
en los que, además, se pueden encon a los hongos Phaeoac emonium spp. y Phaeomoniella
chlamydospo a. Ex e namen e, la yesca se puede p esen a bajo dos o mas: len a y ápida o
apopléjica. En la p ime a, las hojas mues an en las zonas in e ne iales colo aciones
ama illen as en las a iedades de u a blanca y ojizas en las in as, que pos e io men e
e olucionan a nec osis. Los acimos pueden llega a pasi ica se p ema u amen e. Es os
sín omas pueden mani es a se de o ma c ónica en algunas plan as y de o ma o almen e
e á ica en o as, mos ándolos un año pe o no al siguien e. En la o ma apopléjica se p oduce
la mue e epen ina de la plan a, gene almen e en los meses de e ano (MAGRAMA, 2014).
Eu ipiosis. Es a en e medad es á p o ocada p incipalmen e po Eu ypa la a, un hongo que
p esen a más de 80 especies hospedan es y puede a ec a a plan as de menos de 10 años
(Be sch e al., 2012). Las plan as que su en eu ipiosis desa ollan b o es aquí icos con
en enudos co os y hojas pequeñas y clo ó icas con nec osis ma ginal y ejido in e ne ial
mue o (Figu a 2c), lo cual puede supone la mue e de la plan a po ca encias o osin é icas
(Be sch e al., 2012).
Decaimien o po Bo yosphae ia. Los hongos esponsables de es a en e medad pe enecen
a la amilia Bo yosphae iaceae, siendo algunas de las especies más impo an es a ec ando a
id en España Diplodia se ia a o Neo usicoccum pa um (MAGRAMA, 2014). Los sín omas de la
en e medad son simila es a los de eu ipiosis: las yemas no b o an en p ima e a o dan luga a
pámpanos muy débiles. Además, se obse an nec osis sec o iales y de consis encia du a en la
made a que, en sus p ime as ases, a ec an a uno solo de los b azos de la plan a (Figu a 2d),
causando su desecación y mue e (MAGRAMA, 2014).
Di e sos es udios han conseguido aisla la mayo ía de es os pa ógenos en mues as de
made a (Ma ín e al., 2012; Van Nieke k e al., 2011), pe o no han podido aisla se en
mues as de hoja o u os (Be sch e al., 2012). Es o indica que los hongos no alcanzan es os
ejidos, sino que seg egan oxinas capaces de dis ibui se po oda la plan a y al e a el
me abolismo p ima io, desencadenando eacciones de de ensa po pa e de la id, ales como
la gomosis o la sín esis de p o eínas ungicidas, en de imen o del c ecimien o y la
uc i icación (Be sch e al., 2012).

INTRODUCCIÓN
4
En las úl imas dos décadas la incidencia de las EFMV se ha inc emen ado en odas las
egiones i i inícolas del mundo, p incipalmen e a aíz de la p ohibición del ungicida más
e ec i o has a la echa, el a seni o de sodio (Be sch e al., 2012). Además, ac o es como el
es és bió ico y abió ico p esen e en los i e os, la inadecuada ges ión de los iñedos y la al a
de es a egias e icaces sob e la en e medad han empeo ado os ensiblemen e la si uación
(G amaje y A mengol, 2011). Es o ha supues o un mayo in e és en la búsqueda de mé odos
de de ección, iden i icación y manejo sos enible de los pa ógenos causan es de las EFMV que
sean e icaces y aplicables en las pa celas come ciales.
1.3. Dispe sión de las en e medades úngicas de la made a e in ección de
las plan as
Los pa ógenos asociados a las EFMV pueden en a en con ac o con las plan as de id en
di e en es momen os, desde el p oceso i e ís ico has a el campo (G amaje y A mengol,
2011). Una ez en campo, y cuando las condiciones climá icas son a o ables, las
en e medades pueden mani es a se en e apas emp anas o pe manece en es ado de la encia
pa a mani es a se más a de (Luque e al., 2014a), con lo cual, el inóculo de es as
en e medades es á p esen e a lo la go de oda la ida de la id.
Algunos de los hongos ci ados en el apa ado an e io se ca ac e izan po se habi an es
comunes del suelo (Luque e al., 2014a) y o os pueden disemina se po salpicadu as de llu ia,
co ien es de ai e, a ópodos y/o ije as de poda (Agus í-B isach e al., 2015), dándose
p e e en emen e la in ección cuando las espo as úngicas (sexuales y/o asexuales) pene an a
a és de las he idas de poda du an e el pe íodo de la encia (Agus í-B isach e al., 2015).
1.3.1. Fuen es de inóculo
El inóculo de los hongos de la made a de la id es á p esen e en las plan as que han
desa ollado la en e medad y mues an pa es sin omá icas que deben se eliminadas du an e
la poda (Luque e al., 2014a). A menudo es os es os de poda in ec ados son abandonados en
las p oximidades del iñedo y es en onces cuando se gene a la p incipal uen e de inóculo de
es os hongos, ya que sob e los es os ege ales la espo ulación de los pa ógenos, como E. la a
INTRODUCCIÓN
5
y a ias especies de Bo yosphae iaceae (G amaje y A mengol, 2011), se man iene du an e
años, lo que con ibuye a aumen a el iesgo de in ección (Luque e al., 2014a).
1.3.2. Vías de dispe sión
Go as de agua. Los hongos de la made a de la id como Pa. chlamydospo a,
Phaeoac emonium spp., E. la a y a ias especies de Bo yosphae iaceae son capaces de
in ec a he idas de poda a pa i de su diseminación después de los e en os de llu ia o as
la gos pe iodos de al a humedad ela i a (Nieke k e al., 2010), especialmen e si és os ienen
luga desde inales de o oño has a p incipios de p ima e a (Ú bez-To es e al., 2010). La
in ensidad de las p ecipi aciones y el diáme o de las go as de agua son pa áme os a ene en
cuen a en la dispe sión, ya que las go as de mayo amaño pueden con ene más can idad de
conidios p oceden es de los hongos de la made a de la id y, además, el impac o con a el
suelo supone su di isión en múl iples go as que inc emen an la dispe sión (Ahime a e al.,
2004).
Aunque la mayo ía de es udios se han cen ado en la de ección de conidios de los pa ógenos
esponsables de las EFMV en agua de llu ia, al agua de iego se le pod ían aplica los mismos
e ec os y la misma impo ancia en la dispe sión de las en e medades úngicas (Ú bez-To es e
al., 2010).
Vien o. El ien o es una ía de dispe sión esencial en la diseminación de los p opágulos de E.
la a, los cuales pueden llega a eco e dis ancias de has a 100 km siendo aspo ados po las
co ien es de ai e (Ú bez-To es e al., 2010). También se asocia a la diseminación de
Bo yosphae iaceae spp., aunque en meno medida (Ú bez-To es e al., 2010).
Insec os. Los insec os (p incipalmen e a ópodos) y, en meno medida, las a es, son o os
agen es na u ales de dispe sión de las en e medades de la made a de la id, sob e odo
elacionados con Bo yosphae iaceae spp. (Ahime a e al., 2004).
Tije as de poda. El uso inadecuado de ije as de poda sin desin es a iene una epe cusión
impo an e en la ans e encia de los p opágulos de hongos de la made a de la id
p oceden es de ides in ec adas hacia ma e ial ege al sano (Agus í-B isach e al., 2015). En los
ensayos ealizados po Agus í-B isach e al. (2015) se con i mó la p esencia de Pm. aleophilum,
INTRODUCCIÓN
6
Bo yosphae iaceae spp. y Pa. chlamydospo a en ije as de poda u ilizadas en iñedos
come ciales, así como la suscep ibilidad de las he idas de poda a se in ec adas po es a ía de
dispe sión.
1.3.3. Vías de in ección
La p incipal ía de in ección de los pa ógenos causan es de las EFMV son las he idas de poda
( an Nieke k e al., 2011), especialmen e cuando las condiciones ambien ales de empe a u a
y humedad son a o ables (Luque e al., 2014b). La se e idad de la in ección depende del
inóculo del pa ógeno y del es ado sani a io del iñedo, pe o el ac o undamen al en la
suscep ibilidad de la plan a es el momen o de la poda (Luque e al., 2014b).
En España, el momen o óp imo pa a la poda ha sido adicionalmen e a inales de in ie no
(Luque e al., 2014b), ya que se conside a que ealiza la poda a inales de o oño o p incipios
de in ie no inc emen a la suscep ibilidad a los pa ógenos de la made a (Agus í-B isach e al.,
2015). Sin emba go, según los es udios de Luque e al. (2014b) ealizados en la coma ca del
Penedés, la asa de in ección de las he idas de poda po los pa ógenos de la made a de la id
ue meno cuando se ealizó la poda en o oño que a inales de in ie no. Po es e mo i o, es
di ícil es ablece una pau a de inida en el con ol de las EFMV asociada a la poda, a menos que
se e alúen las condiciones especí icas pa a cada egión.
El pe iodo de suscep ibilidad de las he idas de poda a es os hongos du a de 2 a 3 meses en
unción de las condiciones me eo ológicas, la época del año y, p obablemen e, del p opio
iñedo ( a iedad, edad, iego, e c.) (Luque e al., 2014a). Sin emba go, la suscep ibilidad de las
he idas iende a desapa ece a medida que la plan a madu a (Luque e al., 2014b).
1.3.4. El ciclo de la en e medad causada po Phaeomoniella chlamydospo a
Es e abajo se cen a en la de ección de conidios de Pa. chlamydospo a median e écnicas
molecula es, con lo cual es imp escindible conoce el ciclo de la en e medad (Figu a 3), ya que
a a jus i ica pa e del p oceso expe imen al diseñado y alguna de las decisiones omadas
du an e la ealización de es e abajo.
INTRODUCCIÓN
7
Figu a 3. Ciclo de la en e medad causada po Pa. chlamydospo a (G amaje y La ignon,
2015).
La p incipal uen e de inóculo de Pa. chlamydospo a se encuen a en los es os de poda
in ec ados, donde el hongo gene a conidios a pa i de células conidiógenas o conidió o os
lib es en el micelio (Figu a 4a), o den o de picnidios (Figu a 4b). Las g ie as y hendidu as
p o undas en el in e io de la made a suponen un en o no ideal pa a el desa ollo de conidios,
ya que p opo cionan un ambien e húmedo y p o egido.
Según el abajo desa ollado po La ignon y Dubos (2000), la dispe sión de los conidios de
es e hongo iene luga du an e odo el año y se e po enciada po los ac o es explicados en el
apa ado 3.2.
Los conidios pene an la made a de la id ap o echando las he idas de poda, cuya
suscep ibilidad a la in ección puede du a has a 4 meses ( an Nieke k e al., 2011). Po o a
pa e, ambién se ha conside ado la posibilidad de que los conidios de Pa. chlamydospo a
pene en en el ma e ial ege al a a és de las aíces de la id (G amaje y A mengol, 2011).
Una ez en la plan a, el pa ógeno inicia la in ección p opagándose a lo la go del xilema hacia
di e en es ó ganos ege ales.
INTRODUCCIÓN
8
Figu a 4. (a) Conidió o os y conidios de Pa. chlamydospo a. (b) Conidió o os y
conidios del sinanamo o ipo Phoma (C ous y Gams, 2000).
1.4. Técnicas molecula es pa a la de ección de EFMV
La necesidad de de ec a e iden i ica los pa ógenos causan es de las EFMV ha supues o un
ex enso desa ollo de he amien as molecula es dedicadas a es e in. El mé odo adicional de
aislamien o a pa i de ma e ial ege al a ec ado se basa en el uso de medios de cul i o
especí icos, donde se cul i an agmen os de las mues as obje o de diagnós ico con el in de
de e mina si hay c ecimien o, es deci , si es á p esen e el hongo u hongos de in e és. Sin
emba go, es e mé odo se ca ac e iza po su len i ud y sus limi aciones ope acionales, debido a
a ios mo i os: el hongo debe de c ece en el medio du an e días o semanas, puede que no
odos los hongos en la mues a queden ep esen ados en el p oceso o que las dis in as
especies p esen es c ezcan a i mos di e en es (G amaje y A mengol, 2011).
Las écnicas molecula es ienen g an in e és si se aplican a es udios epidemiológicos. En es e
sen ido, el p incipal obje i o ha sido el diseño de cebado es especí icos pa a la especie
pa ógena obje o de es udio, que pe mi an la de ección y cuan i icación de los mismos a pa i
de una mues a ambien al. En el con ex o de las EFMV se han conseguido esul ados
sa is ac o ios, log ando iden i ica , po ejemplo, especies de Bo yosphae iaceae a pa i de
mues as de ejidos ege ales, agua y suelo de los iñedos (G amaje y A mengol, 2011). Los
p o ocolos desa ollados ambién pueden aplica se a la de ección y cuan i icación de
p opágulos en el ai e, median e los di e sos sis emas de mues eo de pa ículas aé eas
exis en es (Figu a 5), de los cuales, el sis ema Bu ka d (Bu ka d Manu ac u ing Company L d)
es el más usado pa a es udios epidemiológicos (Jacksonab y Bayliss, 2011). El cap u ado

INTRODUCCIÓN
9
Bu ka d iene la capacidad de a apa las pa ículas aé eas po impac o en una cin a adhesi a
que se mue e a una elocidad de 2 mm/h, pa a p opo ciona un egis o con inuo de las
espo as p esen es en el ai e cada 24 h en un pe iodo de 7 días (Wes e al., 2008). Po an o,
median e es e sis ema se puede ob ene in o mación ho a ia de la can idad de espo as
p esen es en el ai e pa a se asociada a a iables ambien ales u ope acionales en cada
momen o (Wes y Kimbe , 2015).
Figu a 5. Tipos de sis ema de mues eo de pa ículas aé eas. (a) Cap u ado Bu ka d. (b)
Sis ema de b azo o a o io. (c) Sis ema de mues eo en ase líquida. (d) Va ian e del Sis ema
Bu ka d. (e) Sis ema Ande sen (Wes e al., 2008).
En las úl imas dos décadas, la aplicación de écnicas molecula es en la de ección de los
pa ógenos causan es de las EFMV ha c ecido exponencialmen e, en g an pa e g acias a la
elocidad, especi icidad y sensibilidad de sus esul ados compa ado con las écnicas
adicionales (Ma ín e al., 2012). Además, se ha demos ado que los mé odos de de ección
molecula en plan as esul an muy ú iles en el caso de hongos causan es de EFMV, ales como
Pa. chlamydospo a (Pouzoule e al., 2013). Edwa ds e al. (2007) compa a on las es écnicas
molecula es más empleadas: PCR con encional, PCR a iempo eal (qPCR) y PCR anidada,
de e minando que la más sensible en la de ección de conidios de Pa. chlamydospo a en
mues as de agua es la PCR anidada y, sumado a es o, el uso de qPCR inc emen a la exac i ud
de la de ección y cuan i icación de concen aciones bajas de mues a (Weßling y Pans uga,
2012).
El uso de la qPCR pe mi e la cuan i icación del ADN a pa i de la de ección de la in ensidad
de luo escencia que a aumen ando a medida que los ciclos de ampli icación a anzan y se
es ima un ciclo umb al o “cycle h eshold” (C ), el ciclo al cual el inc emen o de la luo escencia
se conside a es adís icamen e ele an e con espec o a la luo escencia de ondo. Una ez
ob enido el alo de C , és e se anspo a a una cu a de calib ación es ánda (soluciones de
ADN s alo es de C ) pa a ob ene el núme o de copias del gen diana p esen es en la mues a
ambien al. La p incipal limi ación de la qPCR es á en que su de ección/cuan i icación no
INTRODUCCIÓN
10
dis ingue p opágulos i os o mue os, sin emba go la mayo ía de conidios es án adap ados a
sob e i i du an e la gos pe iodos de iempo con el in de asegu a su dispe sión (Wes e al.
2008), po lo que, si los seguimien os son ela i amen e cons an es, es a limi ación no debe ía
se un p oblema.
Po su pa e, la PCR anidada es una he amien a empleada cuando la concen ación de ADN
en la mues a es demasiado baja y consis e en una ampli icación de las egiones genómicas de
in e és p e ia a la de ección y/o cuan i icación, ya que puede combina se con PCR
con encional o qPCR con el in de emplea lo pa a la mejo a de los es udios epidemiológicos y
el pe eccionamien o en el manejo de las en e medades úngicas.
Recien emen e, los úl imos a ances en el ámbi o de la iden i icación de mic oo ganismos a
pa i de mues as ambien ales se han cen ado en el manejo de po en es he amien as de
secuenciación denominadas “Nex Gene a ion Sequencing” (NGS) o “High Th oughpu
Sequencing” (HTS) (Thie y e al., 2015). En la ac ualidad, el uso de es as écnicas de
“ba coding” y “me aba coding” es án es ingidas a la de ección masi a de o ganismos
p esen es en mues as ambien ales y al egis o axonómico de especies localizadas en
egiones cuya p esencia no es ecuen e (Tabe le e al., 2012; Lallias e al., 2015).
2. OBJETIVOS
OBJETIVOS
11
2. OBJETIVOS
La incidencia de en e medades de la made a de la id se ha inc emen ado en los úl imos 20
años y el desa ollo de nue as he amien as que ayuden a la p edicción de in ección y el
con ol de los pa ógenos úngicos esponsables ha cob ado una impo ancia cada ez mayo .
Has a aho a, no se han ealizado es udios dedicados a combina las écnicas molecula es
disponibles con sis emas de cap u a de conidios de los pa ógenos esponsables de EFMV, con
el in de pode hace un seguimien o y p edicción de la disponibilidad de inóculo en campo.
En es e sen ido, los obje i os de es e abajo son:
-Pone a pun o un p o ocolo de ección y cuan i icación de Phaeomoniella chlamydospo a
median e PCR a iempo eal.
-Aplica el p o ocolo desa ollado en mues as p oceden es de campo.
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
17
Se compa ó la e iciencia de dos combinaciones di e en es de cebado es:
- ITS1 e ITS4. El ADN se ampli icó median e la combinación de los cebado es uni e sales ITS1
e ITS4 (Tabla 4). ITS1 ampli ica una secuencia de la egión 18S e ITS4 ampli ica una secuencia
de la egión 28S del ADN ibosómico (Whi e e al., 1990), como apa ece en la Figu a 7.
- ITS1-F y Pch2 / Pch1 e ITS4. El ADN molde se ampli icó median e la combinación del
cebado uni e sal ITS1-F y el cebado especí ico de Pa. chlamydospo a Pch2 (Tabla 4). ITS1-F
ampli ica una secuencia del ADN ibosómico (Ga des y B uns, 1993) y Pch2 ampli ica una
secuencia especí ica den o de la egión ADN -ITS (Tegli e al., 2000), como apa ece en la
Figu a 7.
Tabla 4. Cebado es u ilizados pa a la ampli icación de los Espaciado es In e nos
T ansc i os (ITS) de ADN ibosómico (ADN ).
Cebado
Sen ido
Secuencia (5’-3’)
Re e encia
ITS1
Di ec o
TCCGTAGGTGAACCTTGCGG
Whi e e al., 1990
ITS4
Re e so
TCCTCCGCTTATTGATATGC
Whi e e al., 1990
ITS1-F
Di ec o
CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA
Ga des y B uns, 1993
Pch1
Di ec o
CTCCAACCCTTTGTTTATC
Tegli e al., 2000
Pch2
Re e so
TGAAAGTTGATATGGACCC
Tegli e al., 2000
Pa alelamen e, el ADN molde se ampli icó median e la combinación del cebado especí ico
de Pa. chlamydospo a Pch1 y el cebado uni e sal ITS4 (Tabla 4). Pch1 ampli ica una secuencia
especí ica den o de la egión ADN -ITS1 (Tegli e al., 2000) e ITS4 ampli ica una secuencia del
ADN ibosómico del gen 28S (Whi e e al., 1990), como apa ece en la Figu a 7.
Figu a 7. Localización de cada uno de los cebado es en el ADN ibosómico de Pa.
chlamydospo a (Ga des y B uns, 1993; Ko abecna, 2007; Edwa ds e al., 2007).

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
18
Las mues as ampli icadas en la PCR ue on las diluciones de ADN y se in oduje on po
duplicado.
Los p oduc os de cada PCR se emplea on como ADN molde pa a la co espondien e eacción
de qPCR. De es a o ma se de e minó la calidad de las cu as ob enidas, compa ando la
ep oducibilidad y sensibilidad demos ada po cada combinación de cebado es pa a
selecciona la más sa is ac o ia.
3.1.2.4. De e minación del núme o óp imo de ciclos pa a la p ime a onda de PCR anidada
El núme o de ciclos en la p ime a onda de ampli icación de la PCR anidada ha de se el
adecuado pa a gene a un ADN molde de qPCR su icien e pa a que las concen aciones más
bajas de conidios puedan en a en el lími e de de ección.
Se ealizó una qPCR di ec a, omando como mues as las diluciones de ADN, in oducidas po
duplicado. El ADN molde se ampli icó median e la combinación del cebado uni e sal ITS1-F y
el cebado especí ico de Pa. chlamydospo a Pch2 (Tabla 4).
Se comp obó a pa i de qué ciclo de qPCR se empezaba a de ec a el ADN de la dilución más
concen ada, el cual se oma ía como núme o de ciclos a aplica en la p ime a eacción de
ampli icación de la PCR anidada.
3.1.2.5. Ob ención de la ec a de calib ado
La ec a de calib ado se es ableció ep esen ando el loga i mo decimal de concen aciones
conocidas de conidios (conidios/ml) del aislado ep esen a i o de Pa. chlamydospo a. Las
mues as analizadas ue on las diluciones de ADN in oducidas po iplicado.
Las mues as se some ie on a una PCR anidada u ilizando los cebado es ITS1-F y Pch2 en la
p ime a onda de ampli icación y los cebado es Pch1 y Pch2 en la segunda onda (Tablas 2 y 3).
Los esul ados ob enidos se emplea on pa a cons ui una ec a de calib ado de la que se
pudie a es ima la concen ación de conidios de Pa. chlamydospo a en mues as desconocidas
conociendo su alo C (“Cycle h eshold”). Finalizada la qPCR, se ejecu ó un p og ama de
cu as de usión con el in de iden i ica posibles p oduc os inespecí icos.
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
19
3.1.3. Validación del p o ocolo
Con el in de ob ene pun os conocidos que alida an la ec a de calib ado se emplea on las
ex acciones ealizadas a pa i de las cin as con concen aciones conocidas de conidios
in oducidas po duplicado (Tabla 5). Con es as mues as de alidación se lle ó a cabo la PCR
anidada y los alo es C ob enidos se expo a on a la ec a de calib ado. Finalizada la qPCR, se
ejecu ó un p og ama de cu as de usión con el in de iden i ica posibles p oduc os
inespecí icos. Además, se cuan i icó la concen ación de ADN (ng/µl) en una de las cin as (cin a
de alidación 1.4) median e luo ime ía con el ki Qubi Fluo ome ic Quan i a ion (Li e
Technologies, Ca lsbad, CA, USA).
Tabla 5. Concen ación de conidios en la suspensión (conidios/ml),
conidios en la supe icie de la cin a (conidios/cm2 de cin a) y ADN
(ng/µl) de las mues as de alidación.
* alo no calculado.
3.1.4. Validación del p o ocolo en mues as de campo
Las mues as de campo ue on omadas en dos localizaciones di e en es (Albace e y
On enien e). Los iñedos seleccionados, ambos con plan as que mos aban sín omas de EFMV,
co espondie on a: i) una pa cela come cial de 10 años cul i ada en espalde a con a iedad
Temp anillo en el caso de Albace e y ii) una pa cela no come cial de 20 años cul i ada en aso
con la misma a iedad en el caso de On enien e. El pe iodo de oma de mues as ue on los
meses de Ab il y Mayo de 2015. Semanalmen e se ecogie on dos mues as de pa ículas
aé eas p oceden es de cada localización. Además, se desca ga on los da os co espondien es a
las a iables ambien ales: empe a u a media (ºC), HR media (%) y p ecipi ación (mm),
Cin as
conidios/ml
conidios/cm2 de cin a
ng/µl
1.1
2,5 x 107
2.604.167
-*
1.2
2,5 x 106
260.417
-
1.3
2,5 x 105
26.042
-
1.4
2,5 x 104
2.604
0,38
1.5
2,5 x 103
260
-
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
20
egis ados dia iamen e du an e dicho pe iodo en es aciones ag oclimá icas p óximas a las
pa celas de es udio.
Pa a la cap u a aé ea de los conidios p esen es en campo se mon a on ampas de conidios.
Cada ampa consis ió en una cin a de plás ico siliconada de 48 mm de la go ijada a un
po aobje os de c is al aplicando esmal e en los má genes la e ales de la cin a pa a asegu a
su co ec a ijación. Además, el po aobje os con la cin a siliconada se suje ó en una es uc u a
que man u ie a el po aobje os en o ien ación ho izon al y pudie a a ianza se en el onco de
la iña (Figu a 8). De es a o ma, en cada pa cela obje o de es udio se expusie on
semanalmen e dos po aobje os (po aobje os A y B), que se ija on al onco de dos plan as
de la pa cela, sepa adas al menos 10 m.
Al inicio del p oceso de ex acción se incluyó un paso adicional en el caso de las mues as de
campo, que consis ió en la eliminación de los má genes de la cin a que habían sido ijados con
esmal e al po aobje os. Es o no supuso ningún cambio en la supe icie o al de cap u a de la
cin a, ya que los ex emos de la cin a se p olonga on 0,5 cm pa a aplica en ellos el esmal e
ijado .
T as la ex acción se lle ó a cabo la PCR anidada de las mues as de campo y los alo es C
ob enidos se expo a on a la ec a de calib ado. Finalizada la qPCR se ejecu ó un p og ama de
cu as de usión con el in de iden i ica posibles p oduc os inespecí icos.
Los p oduc os de qPCR posi i os ob enidos pa a el hongo Pa. chlamydospo a se con i ma on
median e elec o o esis (120 V, 80 mA) (PS 304 minipac II, Apelex) en gel de aga osa al 2%
(aga osa D-1 Low EEO; Conda, Mad id, España) eñidos con 3 µl de REALSAFE (REALSAFE
nucleic acid s aining solu ion 20.000x; Real). Se u ilizó un ma cado de peso molecula de 100
pb (Gene- ule 0,5 µg/µ; Fe men as, S . Leon-Ro , Alemania) como e e encia. El gel se dejó
co e (100 V) du an e 2 h. La isualización de los p oduc os de PCR se ealizó bajo luz UV en
un ansiluminado .
Los p oduc os de qPCR posi i os con i mados en el gel de aga osa se ex aje on po co e de
las bandas bajo luz UV en un ansiluminado . Los p oduc os ex aídos ue on pu i icados del
gel de aga osa siguiendo el p o ocolo de HBL-Aga osa QuickClean (Dominion mbl, Có doba,
España) y pos e io men e secuenciados con el cebado Pch2 a a és del se icio de
secuenciación de la emp esa Mac ogen (Mac ogen Eu ope, Ams e dam, The Ne he lands).
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
21
Figu a 8. (a) T ampa de conidios diseñada. (b) De alle de go as de llu ia
dispues as en la supe icie de la ampa de conidios. (c) Pa cela de
On enien e donde se pueden dis ingui ides sin omá icas de EFMV.
3.2. Resul ados y discusión
3.2.1. Ajus e del p o ocolo
3.2.1.1. Selección en e qPCR y PCR anidada
Pa a de e mina la e icacia de las dos écnicas molecula es se compa a on los alo es de C
esul an es. Con la qPCR se ob u ie on alo es de C al os pa a mues as cuya concen ación
de ADN e a ele ada (Figu a 9). Las diluciones D2, D3 y D4 p esen a on alo es de C de 29,96;
35,91 y 36,68 ciclos, espec i amen e, y la dilución D5 no llegó a se de ec ada. Asumiendo un
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
22
100% de e iciencia de eacción, la di e encia de ciclos en e dos diluciones (1:10) es
ap oximadamen e de 3,3 ciclos (23,3=10). Los ele ados alo es de C que se ob u ie on en es e
ensayo, sin una elación lineal apa en e (en e la dilución 3 y la 4 se obse a menos de un ciclo
de di e encia) conducen a pensa que el mé odo u ilizado es poco sensible cuando se abaja
con concen aciones de ADN bajas. El lími e de de ección obse ado (LD) ue in e io al que se
p e endía consegui en es e abajo y se concluyó, po an o, que el p o ocolo debía
desa olla se en base a una PCR anidada pa a aumen a la sensibilidad de la de ección
(Edwa ds e al., 2007).
Figu a 9. Cu as de ampli icación, donde se ep esen a el núme o de ciclos en e
a la luo escencia emi ida. Diluciones po duplicado (Tabla 1) ampli icadas con la
pa eja de cebado es Pch1 y Pch2.
3.2.1.2. De e minación de la pa eja de cebado es óp ima de la p ime a onda de PCR
anidada
Se desca ó la p ime a combinación de cebado es uni e sales (ITS1 e ITS4), pues o que pa a
la aplicación de es e p o ocolo en campo, hay que ene en cuen a que exis e g an a iedad de
especies úngicas que pueden es a p esen es en las mues as ambien ales ob enidas. Po lo
an o, las uniones inespecí icas de Pch1 y Pch2 a los p oduc os de PCR pod ían ene una
ep esen a i idad an al a que inc emen a a la de ección de alsos posi i os de Pa.
chlamydospo a. De es a o ma, se p ocedió a p oba la e iciencia de una pa eja de cebado es
donde se combina a un cebado uni e sal y un cebado especí ico de Pa. chlamydospo a con el
in de inc emen a la especi icidad del p oceso.
D5
D4
D3
D2

DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
23
Las e iciencias demos adas po las combinaciones de cebado es ITS1-F y Pch2 y Pch1 e ITS4
ue on simila es en e sí (Figu a 10). Tan o los alo es de C y las cu as de usión de las
diluciones como los LD ob enidos en ambas qPCR (una pa a cada combinación de cebado es)
se conside a on iguales. La pa eja de cebado es seleccionada pa a la p ime a onda de
ampli icación de PCR anidada ue ITS1-F y Pch2.
3.2.1.3. De e minación del núme o de ciclos óp imo de la p ime a onda de PCR anidada
Las diluciones con mayo y meno concen ación de ADN que se incluye on en es e paso
ue on D2 y D5 espec i amen e, esul ando D4 la dilución con menos concen ación de ADN
de ec ada. Los alo es de C ob enidos pa a cada dilución ue on: 20,99 ciclos pa a D2; 25,42
ciclos pa a D3 y 28,35 ciclos pa a D4. Po an o, se de e minó que el núme o de ciclos óp imo
pa a la p ime a onda de PCR anidada e a de 25 ciclos. De es e modo, se ob u o una mayo
concen ación de p oduc o de PCR pa a la unión de Pch1 y Pch2 du an e la onda de qPCR y,
en consecuencia, un aumen o del LD, es deci , de la sensibilidad del p oceso de de ección y
pos e io cuan i icación.
3.2.2. Ob ención de la ec a de calib ado y alidación del p o ocolo
La qPCR ealizada con las diluciones se iadas demos ó que la mínima concen ación de
conidios capaz de se de ec ada ue de 5 x 102 conidios/ml, es deci , el LD se hallaba ijado en
la dilución D4.8. La dilución D1 se excluyó, ya que su al a can idad de p oduc o de PCR inicial
impedía di e encia signi ica i amen e la luo escencia basal y la luo escencia inicial emi ida,
no pudiendo de e mina se el alo de C . En las cu as de usión se obse ó que la dilución D5
p esen aba una g an can idad de p oduc o inespecí ico p obablemen e a ibuible a díme os
en e los cebado es o “p ime dime s”. Po lo an o, la ec a de calib ado se ajus ó con las
diluciones: D2; D3; D3,8; D4 y D4,8 con una e iciencia de eacción de 0,65442 y un alo de R2
de 0,99143 (Figu a 11).
Cada mues a pe enecien e a las alidaciones p esen ó un alo de C igual al de la dilución
con la co espondien e can idad de ADN (Tabla 6), lo cual signi icó que el p o ocolo de
ex acción y cuan i icación ue el adecuado.
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
24
Figu a 10. Cu as de ampli icación, donde se ep esen a el núme o de ciclos
en e a la luo escencia emi ida. Diluciones po duplicado (Tabla 1)
ampli icadas con: (A) pa eja de cebado es ITS1-F y Pch2 y (B) pa eja de
cebado es Pch1 e ITS4.
Figu a 11. Rec a de calib ado ajus ada con las diluciones D2; D3; D3,8; D4 y D4,8 (Tabla 2),
donde se ep esen a la concen ación de ADN en e al alo de C de cada una de las
diluciones.
D5
D5
D4
D3
D2
D4
D3
D2
(B)
(A)
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
25
La cin a de alidación 1.4 p esen ó un alo de C p óximo al de la dilución D3, po lo an o se
asumió que la concen ación de ADN mínima capaz de de ec a se ue de 76 pg/µl, es deci , la
co espondien e a la dilución que ma ca el LD. Es e LD puede compa a se con el ob enido en el
abajo de Tegli e al. (2000) donde se emplea on los mismos cebado es con mues as de ADN
p oceden es de cul i o pu o de Pa. chlamydospo a, llegando a de ec a has a 10 pg/µl. O os
au o es han ealizado el mismo ipo de es udios u ilizando cebado es de diseño p opio, de
mane a consiguie on un LD a 100 g/µl a pa i de qPCR en mues as de made a in ec ada
(Ma ín e al., 2012) y 50 g/µl a pa i de una PCR anidada con mues as de suelo de i e o
(Whi eman e al., 2000). O o pa áme o que hay que ene en cuen a a la ho a de e alua el
LD ob enido es la concen ación de conidios po cm2 de cin a p oceden e del sis ema de
mues eo, siendo la concen ación mínima de ec ada 52 conidios/cm2, o lo que es lo mismo, lo
co espondien e a la dilución D4.8 (500 conidios/ml). En el abajo de Edwa ds e al. (2007) se
ealiza on es udios simila es a pa i de mues as de agua ob enidas en i e o. Pa a es e in se
emplea on dos pa ejas de cebado es diseñados po o os au o es, ob eniendo cuan i icaciones
con una al a a iabilidad en e mues as epe idas, ya que sus LD oscilaban en e 8 y 3.452
conidios/ml pa a una pa eja de cebado es y 1-17.394 conidios/ml pa a o a. En un u u o se ía
in e esan e p oba los cebado es diseñados po o os au o es pa a la posible mejo a en la
sensibilidad de es e p o ocolo.
Tabla 6. Valo es p omedio de C pa a las
diluciones (Tabla 1) y alidaciones (Tabla 5)
ampli icadas con los cebado es Pch1 y Pch2.
* alo no calculado.
Mues as
Valo es
p omedio de C
Des iación
es ánda
D2
4,26
0,31
D3
8,42
0,02
D3.5
11,40
0,21
D4
12,73
0,08
D4.5
16,85
0,25
1.1
-*
-
1.2
-
-
1.3
3,88
0,02
1.4
6,77
0,07
1.5
10,75
0,16
DESARROLLO DE UN PROTOCOLO DE PCR A TIEMPO REAL
26
3.2.3. Validación del p o ocolo en mues as de campo
En el o al de mues as de campo analizadas se de ec a on 9 posi i os po debajo del LD
ijado pa a alo es de C . Las mues as posi i as se e alua on po elec o o esis en un gel de
aga osa pa a desca a la posible in e e encia de o as especies úngicas, ya que los cebado es
Pch1 y Pch2 p esen an cie a simili ud con las secuencias de o os o ganismos y pueden da
luga a anillamien os poco especí icos du an e la ampli icación, educiendo la sensibilidad del
p oceso (Edwa ds e al., 2007).
El gel de aga osa con los p oduc os de qPCR e idenció la p esencia de dos bandas, an o en
los p oduc os de las diluciones como en los posi i os de campo ob enidos (Figu a 12). Po el
amaño del amplicón, la banda supe io co espondía a los p oduc os de 600 pb gene ados en
la p ime a onda de ampli icación, mien as que la banda in e io , de 360 pb, co espondía a
los p oduc os de la segunda onda de ampli icación. Pa a comp oba que e ec i amen e se
había de ec ado la especie Pa. chlamydospo a se secuencia on los p oduc os de qPCR y se
de e minó que los p oduc os de ambas bandas pe enecían a Pa. chlamydospo a. Las
secuencias ob enidas p esen a on un 100% de simili ud con la secuencia del aislado CBS
229.95 de Pa. chlamydospo a deposi ado en la base de da os GenBank, coincidiendo el
agmen o del p oduc o secuenciado con el Espaciado In e no T ansc i o 2 y pa cialmen e con
el gen de ARN ibosomal 5.8S (GenBank: AY772237.1).
Figu a 12. P oduc os de PCR anidada
co espondien es a mues as aé eas de campo
posi i as pa a conidios de Pa. chlamydospo a.
M: 3 µl de ma cado GeneRule 100 pb Plus; 1-
9: posi i os ob enidos en los po aobje os A
(Tabla 7); (+): con ol posi i o de ADN pu o; (-):
con ol nega i o.
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
+
-
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