UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Epis asia en e ATHB25 y COG1, ac o es de ansc ipción que
aumen an la longe idad de semillas de A abidopsis haliana, y
enzimas implicadas en la o mación de la sube ina y el mucílago.
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNO/A: SAMUEL BARBERÀ MORENO
TUTORES: RAMÓN SERRANO SALOM Y EDUARDO BUESO RÓDENAS
Cu so Académico: 2014-2015
VALENCIA, 30 DE JUNIO DE 2015
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Da os pe sonales
Nomb e y apellidos: Samuel Ba be à Mo eno
Da os del abajo in de g ado
Tí ulo: Epis asia en e ATHB25 y COG1, ac o es de ansc ipción que aumen an la
longe idad de semillas de A abidopsis haliana, y enzimas implicadas en la
o mación de la sube ina y el mucílago.
Ti ulación: G ado en Bio ecnología
Tu o es: Ramón Se ano Salom y Edua do Bueso Ródenas
Fecha de lec u a: Julio 2015
Resum
La longe i a de les lla o s és un ac o c í ic a l’ag icul u a. A mesu a que passa el
emps, an pe den iabili a i açò obliga als ag icul o s a comp a -ne de no es o s els anys.
Es e e p o oca un augmen de les despeses associades a la p oducció i disminueix els
bene icis de l’ag icul o . Pe an , la ece ca dels gens implica s en la longe i a de les lla o s
cons i ueix un nou objec iu en la millo a genè ica d’aquelles plan es d’in e ès ag ícola.
En aques eball s’ha es udia la elació dels ac o s de ansc ipció ATHB25 i COG1
amb componen s essencials de la o mació de la cobe a de la lla o d’A abidopsis haliana
com són PRX25, GPAT5 i SEX1 pe pode de e mina si la esis ència la l’en ellimen es eu
al e ada en els mu an s de pè dua de unció d’aques s componen s.
Pe pode de e mina l’e ec e es a en c eua els indi idus que posseïen una
sob eexp essió dels ac o s de ansc ipció ATHB25 i COG1 amb indi idus mu an s de pè dua
de unció pe als enzims PRX25, GPAT5 i SEX1. Pos e io men , es an de e mina els mu an s
dobles homozigo s i s’anali za en ca ac e ís iques eno ípiques com la g andà ia, la esis ència
a l’en ellimen de la lla o , la pe meabili a i les possibles al e acions en la deposició de
mucílag i de sube ina.
Els esul a s han mos a que l’augmen de la esis ència a l’en ellimen au en la
sob eexp essió dels ac o s de ansc ipció ATHB25 i COG1 pe què són capaços de p omou e
can is en la cobe a de la lla o . Açò es a comp o a mi jançan l’aïllamen de mu an s dobles
pe als enzims PRX25, GPAT5 i SEX1.
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Pa aules clau
A abidopsis, acil ans e asa, sube ina, mucílag, epis asia
Abs ac
Seed longe i y is a c i ical ac o in ag icul u e. As ime passes, hey lose iabili y and
his equi es a me s o buy new ones e e y yea . This ac causes an inc ease in expenses
associa ed wi h he p oduc ion and dec eased p o i s o he a me . The e o e, he sea ch o
genes in ol ed in seed longe i y is a new a ge in b eeding hose plan s o ag icul u al
in e es .
This wo k has s udied he ela ionship be ween ansc ip ion ac o s ATHB25 and
COG1 and essen ial componen s o he o ma ion o he es a in A abidopsis haliana. These
componen s a e PRX25, GPAT5 and SEX1. To de e mine whe he he esis ance is, we make
aging mu an s al e ed in he loss o unc ion o hese componen s.
To de e mine he e ec we c ossed he indi iduals who owned o e exp ession o he
ansc ip ion ac o s ATHB25 and COG1 wi h indi iduals ha ha e loss o unc ion mu an
enzymes PRX25, GPAT5 and SEX1. La e , we de e mined he double homozygous mu an s and
analysed pheno ypic cha ac e is ics such as size, esis ance o aging in seeds, pe meabili y and
possible al e a ions in he deposi ion o sube in and mucilage.
The esul s showed ha he inc eased aging esis ance lies in he o e exp ession o he
ansc ip ion ac o s ATHB25 and COG1 because hey a e able o p omo e changes in he es a.
This was e i ied by isola ing double mu an s o he enzymes PRX25, GPAT5 and SEX1.
Key wo ds
A abidopsis, acyl ans e ase, sube in, mucilage, epis asis
Ag aïmen s
AGRAÏMENTS
En p ime lloc ull ag ai a Ramón i a Ma iche l’opo uni a de desen olupa el meu
T eball de Final de G au al seu labo a o i, i més amb les ci cums àncies de com aig a iba -hi.
A osal es dos, g àcies pel os e som iu e amable i amilia , la conside ació, la paciència i les
o mes an educades que són ca ac e ís iques de les bones pe sones, dels bons co s.
En segon lloc ull dona -li les g àcies al meu u o , Edu, que amb paciència, dedicació i
a enció, ha sabu ansme e’m la impo ància del eball ben e , la cons ància que es
necessi a al labo a o i, el coneixemen ècnic, la pe spec i a cien í ica i, si més no, les seues
xico e es manies (els dos sabem de què es ic pa lan ). També ull ag ai -li el espec e que he
ebu com a pe sona i la o mali a dels ac es, alo s que m’han e sen i des d’un p ime
momen com un més de l’equip del labo a o i. Pe descomp a , no puc deixa de cos a a la
meua ines imable companya I ene. Has sigu un pun de supo eno me du an o el emps
que ha du a es e eball. De u m’empo e l’aleg ia, l’in e ès, la cu a a l’ho a de desen olupa
un expe imen , la p eocupació pe ob eni bons esul a s i les nos es me a elloses xa ades
iloso ico-polí ico-economico-cul u als. E es i se às mol especial pe a mi. També ull ag ai -
los a Jesús, Lola, Ma cos, Manu, Belén i Be lem els seus consells, la isió i les comen a is
g aciosos que an que done gus ana a eballa .
En e ce lloc ull dona les g àcies a la meua amília i amics, especialmen als meus
pa es. G àcies pe es a semp e al meu cos a , pe sabe au e’m un som iu e en els pi jo s
momen s, pe dona -me ànims quan més els necessi a a i pel os e amo i espec e. Es os dos
alo s m’han ajuda a a ança , a c éixe com a pe sona i a sembla -me, enca a que siga un poc,
a osal es. Ap o i e es es línies pe ag ai -li, a ella, la o ça, la alen ia i el co a ge que ens ha
ansmès a o s, enca a que hui no es obe en e nosal es. Espe e que allà on es igues ens
con inues ajudan com quan e a de cos um.
Índice
i
Índice
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 3
1.1 E osión gené ica .................................................................................................................. 4
1.2 Conse ación de los ecu sos i ogené icos ........................................................................ 6
1.3 Longe idad de semilla ......................................................................................................... 7
1.4 Fac o es que a ec an a la longe idad de la semilla ............................................................. 7
1.5 La cubie a de las semillas ................................................................................................... 8
1.5.1. O igen, desa ollo y di e enciación de la cubie a .................................................... 8
1.5.2 Sube ina ................................................................................................................... 10
1.5.3 Gibe elinas................................................................................................................ 11
1.6. Fac o es de ansc ipción DOF ......................................................................................... 12
1.7. Enzimas elacionadas con el desa ollo de la cubie a ..................................................... 13
1.8 An eceden es del p oyec o ............................................................................................... 14
1.8.1 Ras eo de mu an es con semillas más longe as ..................................................... 14
1.8.2 Localización de la inse ción en los mu an es seleccionados .................................... 14
1.8.3 Análisis de la exp esión de los genes adyacen es en los mu an es ......................... 15
1.8.4 Recapi ulación del eno ipo median e líneas de sob eexp esión ............................ 15
1.8.5 COG1 y ATHB25 egulan la capa de sube ina de la cubie a de la semilla ............... 15
2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 16
2.1 Obje i o gene al ................................................................................................................ 17
2.2 Obje i os especí icos ......................................................................................................... 17
3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 18
3.1 Ob ención de mu an es ..................................................................................................... 19
3.2 Es e ilización húmeda de semillas ..................................................................................... 19
3.3 Cul i o en medio sólido Mu ashige-Skoog (ms) ................................................................ 19
3.4 Cul i o en in e nade o ...................................................................................................... 20
3.5 Aislamien o de DNA genómico .......................................................................................... 20
3.6 Reacción en Cadena de la Polime asa (PCR) ..................................................................... 21
3.6.1 Oligonucleó idos cebado es ..................................................................................... 21
3.6.2 Condiciones de la PCR .............................................................................................. 21

Índice
ii
3.7 PCR diagnós ica.................................................................................................................. 22
3.8 Elec o o esis de DNA ........................................................................................................ 22
3.9 En ejecimien o acele ado ................................................................................................. 23
3.10 Tinción de la capa de mucílago con ojo de u enio ........................................................ 23
3.11 Tinción de la capa de sube ina con ojo Sudán ............................................................... 23
3.12 Tinción de pe meabilidad ................................................................................................ 24
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................................... 25
4.1 Tamaño de la semilla ......................................................................................................... 29
4.2 En ejecimien o .................................................................................................................. 31
4.3 Mucílago ............................................................................................................................ 34
4.4 Sube ina ............................................................................................................................. 35
4.5 Pe meabilidad .................................................................................................................... 37
5. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 39
6. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………………….42
In oducción
3
1. INTRODUCCIÓN
In oducción
4
1.1 E osión gené ica
Los humanos, después del úl imo pe iodo glacial, cambia on su es ilo de ida de ipo
nómada a seden a io. Es e cambio supuso el inicio de p ocesos de domes icación an o de
plan as como de animales. En el caso de las plan as, se escogie on aquellas que p esen aban
una mejo adap ación a las condiciones ambien ales de la época. Es e p oceso de selección y
domes icación ue denominado como “P ime a Re olución Ve de”, que supuso una educción
impo an e de la a iabilidad gené ica pues o que muchas a iedades no e an in e esan es
pa a el cul i o ( an de Wouw e al., 2009).
En el siglo XX, du an e la década de los 40, ya se poseían un g an núme o de a iedades de
cul i os adicionales de odas aquellas especies que podían ene impac o o in e és en la
ag icul u a. Fue en onces cuando se p odujo la “Segunda e olución Ve de”. Es o supuso un
aumen o del 50% de los endimien os de p oducción po el uso de e ilizan es, implan ación
de sis emas mecánicos de ecolección, la u ilización de sus ancias químicas pa a p e eni
en e medades y plagas, y la en ada de cul i os de i ados de la mejo a gené ica ege al. Es as
nue as a iedades in oducidas des inadas al uso come cial e an bas an e homogéneas a ni el
gené ico y se adap aban mucho mejo an o a las écnicas de p oducción como a la
come cialización ag ícolas, lo que p o ocó g andes bene icios pa a una población en cons an e
c ecimien o. Sin emba go, la u ilización de es e ipo de a iedades oda ía edujo más la
a iabilidad gené ica exis en e po el abandono de a iedades que no cumplían con
de e minados es ánda es de p oducción (I iondo, 2009).
La biodi e sidad es la o alidad de la a iación he edi a ia en odos los ni eles de
o ganización biológica, desde los genes a los indi iduos, poblaciones, especies, comunidades y
ecosis emas (Wilson EO, 1988). Además, es esencial an o pa a que se p oduzca la especiación
como pa a que las especies puedan sob e i i en un en o no cambian e que les es
des a o able.
La e osión gené ica se puede de ini como la pé dida de biodi e sidad
(www. edandaluzadesemillas.o g). La selección a i icial clásica que se ha lle ado a la p axis
desde la P ime a Re olución Ve de, una economía globalizada, las cos umb es y hábi os
alimen icios cada ez más homogéneos y las nue as écnicas de selección gené ica
encaminadas a sa is ace las necesidades de los consumido es y p oduc o es, han in ensi icado
los e ec os de la e osión gené ica. Las a iedades mejo adas a ni el de es abilidad y de
p oducción, el desplazamien o de cul i os adicionales, la des ucción de ecosis emas
In oducción
5
na u ales que han p o ocado la desapa ición de muchas especies, han p o ocado una ue e
educción de la a iabilidad gené ica. El es echamien o gené ico en e especies puede
supone un p oblema muy g a e en un u u o p óximo.
El es echamien o gené ico p o oca una g an suscep ibilidad en las especies a nue os
pa ógenos. Un ejemplo de la g a edad de es e hecho es la conocida como “hamb una de la
pa a a” que se p odujo en I landa en el siglo XIX en la que odos los cul i os de pa a a
p esen aban uni o midad gené ica a ie al y e an suscep ibles al hongo Phy oph o a in es ans
que des uyó la g an mayo ía de los cul i os. Sus e ec os p o oca on que millones de
i landeses emig a an a EE.UU. Desg aciadamen e, es a si uación no es la única que se conoce.
De hecho, una cepa de Helmin hospo ium maydis, en 1970, des uyó la mi ad de los maizales
si uados al su de EE.UU. pues o que p ocedían de semillas híb idas ob enidas a pa i de una
única a iedad.
En el siglo XIX, en los años cincuen a, se econoció que la pé dida de biodi e sidad e a un
p oblema se io que a ec aba an o a la ag icul u a más a anzada como a los p opios
ecosis emas. Es o condujo a la implan ación de medidas pa a la conse ación de las uen es de
a iabilidad gené ica. Conc e amen e, la FAO, en 1961, con ocó una eunión denominada
“Plan Explo a ion and In oduc ion” con la inalidad de de e mina la si uación, conse ación,
empleo, explo ación, e c., de los ecu sos i ogené icos disponibles. A pa i de es a eunión,
un g an núme o de con e encias, asociaciones y o ganizaciones se han enca gado de
p ese a , conse a y p o ege las uen es de a iabilidad gené ica. La Figu a 1 mues a las
a iaciones de la di e sidad con el iempo:
Fig. 1. E olución de la di e sidad de la especies ege ales
du an e la his o ia de la humanidad, adap ado de an de
Wouw e al. (2009).
In oducción
12
an isen ido con educción de exp esión en los ac o es de ansc ipción ATHB25, ATHB22 y
ATHB31 mani es aban una meno longe idad de las semillas. Las semillas a adas con GAs y
las p o enien es de la línea mu an e DELLA con una señalización cons i u i a de GAs son más
ole an es al en ejecimien o (Bueso e al., 2014).
En el labo a o io de Ramón Se ano, apa e de los ac o es de ansc ipción
HOMEOBOX, los esul ados de o o as eo mos a on que los ac o es de ansc ipción DOF
ambién poseen un papel undamen al en el desa ollo de la cubie a.
1.6. Fac o es de ansc ipción DOF
Es udios genómicos compa a i os en e Caeno hab idis, D osophila melanogas e ,
le adu a y A abidopsis han de e minado que las p o eínas DOF (DNA-BINDING ONE ZINC
FINGER) son ac o es de ansc ipción exclusi os de las plan as (Yanagisawa, 2002) y los
p esen an las plan as in e io es como el musgo Physcomi ella pa ens o como el alga e de
Chlamydomonas einha d ii, angioespe mas y gimnoespe mas. Además, p esen an un dominio
de unión al DNA o mado po 52 aminoácidos muy conse ados en e especies. La secuencia
aminoacídica es la siguien e: CX2CX12CX2C, y, al uni se un á omo de zinc (Zn2+), adquie e la
con o mación ca ac e ís ica de “dedo de zinc”. Es e dominio es á localizado ce ca del ex emo
N- e minal. En la siguien e igu a se mues a un esquema g á ico de su es uc u a:
Fig. 2. Es uc u a de los ac o es de ansc ipción DOF, adap ado
de Nogue o e al. (2013).
Tal y como se obse a en la imagen, exis en cua o cis eínas que son cla e pa a la
unión del á omo de zinc. Los enlaces o mados con el á omo de zinc y la conse ación del
aminoácido ip ó ano en el ex emo C- e minal, son esenciales pa a que la p o eína adquie a
el mo i o especí ico de unión al DNA an o in i o como in i o (Yanagisawa, 2001). Las
secuencias que econocen los ac o es DOF son CTTT o AAAG y pueden uni se a aquellos
p omo o es que posean una o a ias de es as secuencias (Kisu, e al., 1998; Yanagisawa y

In oducción
13
Schmid , 1999). El es o de la p o eína DOF posee g an a iabilidad aminoacídica en e los
ex emos N y C- e minal po lo que sea es as di e encias las que ma quen la especi icidad de
unión a o as p o eínas, al DNA o, incluso, a o os ac o es de ansc ipción (Yanagisawa,
2001).
Los ac o es DOF es án in oluc ados en una g an a iedad de p ocesos y unciones
biológicas. Debido a que es án p esen es solamen e en plan as, egulan aspec os biológicos
inhe en es de las plan as como la ge minación, la espues a a la luz o el desa ollo de la
semilla. Po an o, es os p ocesos biológicos pueden clasi ica se en egulación del
me abolismo, desa ollo y ge minación de la semilla y di e enciación de ejidos. Además, los
ac o es DOF pueden desempeña unciones edundan es en e los dis in os g upos y, de
algunos no se conoce oda ía su unción.
El mu an e isl5-1D posee una sob eexp esión del gen COG1 que codi ica pa a el ac o
de ansc ipción DOF1.5. Es a sob eexp esión p o oca un e ue zo de la cubie a de la semilla
aumen ando así su ole ancia hacia el en ejecimien o.
1.7. Enzimas elacionadas con el desa ollo de la cubie a
Exis en di e sas enzimas in oluc adas en la sín esis de la cubie a de la semilla de
A abidopsis. En el p esen e abajo se a a abo da el es udio de longe idad de las semillas en
los mu an es nulos pa a las enzimas pe oxidasa 25 (p x25), glice ol-3- os a o acil ans e asa 5
(gpa 5) y al a-glucano diquinasa mediada po agua: SEX1 (sex1).
Tan o las u as de sín esis de la lignina como de la sube ina, poseen enzimas comunes
y una de ellas es la PRX25. Es a enzima iene la unción de polime iza los monóme os
esponsables de la o mación de lignina y/o sube ina (Shige o, J. e al., 2013). La glice ol-3-
os a o acil ans e asa5 es á in oluc ada en la biosín esis de poliés e es como la sube ina de la
cubie a de las semillas (Beisson, R. e al., 2007). Y, po úl imo la SEX1 es á in oluc ada en la
os o ilación de las glucosas que o man pa e de la amilopecina pa a que se pueda ealiza la
hid ólisis pa cial del almidón (Tien-Shin, Y. e al., 2001) y, pos e io men e, la des os o ilación e
hid ólisis comple a del almidón, aunque es as úl imas unciones co esponden a o as
enzimas.
In oducción
14
1.8 An eceden es del p oyec o
Una de las líneas de in es igación del labo a o io del D . Ramón Se ano iene como
obje i o p o undiza en el conocimien o de los mecanismos molecula es elacionados con la
longe idad de semillas. En los siguien es apa ados, se de allan los esul ados p e ios que
conduje on a plan ea la ealización de es e abajo.
1.8.1 Ras eo de mu an es con semillas más longe as
Con el obje i o de aisla mu an es con mayo longe idad de semilla, el D . Edua do
Bueso y el D . F ancisco Campos ealiza on dos búsquedas independien es del conjun o de
mu an es “ac i a ion agging” de W. Scheible y C. Some ille. Pa a la iden i icación de es os
mu an es, se u ilizó un mé odo de en ejecimien o acele ado conocido como CDT (Con olled
De e io a ion T ea men ) (Tesnie e al., 2002). Las semillas inme sas en agua se es a i ica on
a 4ºC du an e 48 h. Pos e io men e, se incuba on du an e 48h a 42 ºC. En la p ime a
búsqueda o as eo de mu an es, se analiza on unas 150.000 semillas que p o enían de 30.000
líneas dis in as. Mien as que en la segunda búsqueda, se semb a on unas 300.000 semillas
p o enien es de 60.000 líneas di e en es. Una ez ealizadas, se p eselecciona on 290
indi iduos candida os de la p ime a búsqueda y 387 de la segunda. La descendencia de los
candida os se analizó pos e io men e. Una ez ealizado el análisis de la siguien e gene ación,
se pudo iden i ica el mejo indi iduo de cada búsqueda. Los mu an es seleccionados
p esen aban una inse ción de copia única de T-DNA que co-seg egaba con su mayo
longe idad.
1.8.2 Localización de la inse ción en los mu an es seleccionados
El D . Edua do Bueso y el D . F ancisco Campos ecupe a on el plásmido p esen e en el
T-DNA con las secuencias lanquean es de los mu an es seleccionados con el obje i o de
de e mina la posición en dónde se había p oducido la inse ción del T-DNA. En el p ime
mu an e isl1-1D po “imp o ed seed longe i y”, la inse ción de p odujo en el c omosoma 5,
conc e amen e en e los genes A 5g65410 y A 5g65420. El gen A 5g65410 se le denomina
ATHB25 ya que codi ica pa a el ac o de ansc ipción HOMEOBOX25 en A abidopsis.
Mien as que en el segundo mu an e isl5-1D, la inse ción se p odujo en el c omosoma
1, conc e amen e en e los genes A 1g29160 y A 1g29170. El gen an e io a la inse ción de
A 1g29160 (COG1) pe enece a una amilia de ac o es de ansc ipción DOF, conc e amen e
In oducción
15
codi ica pa a el ac o DOF1.5. Es e ac o , ac úa egulando nega i amen e la señalización po
luz de los i oc omos (PhyA y PhyB).
1.8.3 Análisis de la exp esión de los genes adyacen es en los mu an es
En el caso de isl5-1D, se pudo de e mina po qRT-PCR que la exp esión de COG1 e a 6
eces mayo . En el caso de isl1-1D, compa ando el geno ipo sil es e con el geno ipo mu ado
po RT-PCR semicuan i a i a, se pudo de e mina que la sob eexp esión sólo a ec aba al gen
ATHB25.
1.8.4 Recapi ulación del eno ipo median e líneas de sob eexp esión
Con la in ención de comp oba si COG1 y ATHB25 egulan la longe idad de semillas en
A abidopsis, se lle ó a cabo la ob ención de plan as ansgénicas sob eexp eso as de los cDNA
de ambos ac o es ansc i os. T as la ob ención de las semillas T3, se selecciona on las líneas
homocigo as y pos e io men e ue on some idas a en ejecimien o acele ado. Es as líneas
esul a on esis en es al a amien o compa ándolas con el geno ipo sil es e. Po o a pa e,
mu an es dobles de pé dida an o de ATHB25 como de ATHB22 ( ac o de ansc ipción más
p óximo a ATHB25) esul a on sensibles al en ejecimien o acele ado. Las mismas conclusiones
se ob u ie on median e líneas amiRNA que educían la exp esión de los ansc i os de COG1 y
CDF4 ( ac o de ansc ipción más p óximo a COG1).
1.8.5 COG1 y ATHB25 egulan la capa de sube ina de la cubie a de la semilla
Median e c uces ecíp ocos se comp obó que la esis encia a en ejecimien o de las
líneas sob eexp eso as de COG1 y ATHB25 enía he encia ma e na, lo que signi icaba que la
modi icación de la cubie a debe ía se la explicación más p obable de es a esis encia. Se
ealiza on di e en es co es his ológicos y inciones que conduje on a a e igua que la
modi icación de la cubie a e a esencialmen e a ni el de la capa de sube ina en la capa más
supe icial de la cubie a. La modi icación de es a capa p oducía a una impe meabilización de
las semillas que sob eexp esan COG1 y ATHB25 como se pudo demos a as incubación en
sales de e azolio, que al pene a y se educidas me abólicamen e o man un depósi o ojo.
Obje i os
16
2. OBJETIVOS
Obje i os
17
2.1 Obje i o gene al
El p esen e abajo inal de g ado iene el obje i o p incipal, el comp oba que la
esis encia a en ejecimien o en semillas de mu an es sob eexp eso es de los ac o es de
ansc ipción ATHB25 y COG1 iene mediada po una modi icación de la cubie a.
2.2 Obje i os especí icos
 Iden i icación de líneas sob eexp eso as de los ac o es de ansc ipción ATHB25 y
COG1 ob enidas po ans o mación de mu an es de pé dida de unción de la
pe oxidasa 25 (p x25).
 Iden i icación de líneas sob eexp eso as de los ac o es de ansc ipción ATHB25 y
COG1 ob enidas po ans o mación de mu an es de pé dida de unción de la glice ol-
acil ans e asa 5 (gpa 5).
 Iden i icación de líneas sob eexp eso as de los ac o es de ansc ipción ATHB25 y
COG1 ob enidas po ans o mación de mu an es de pé dida de unción de la al a-
glucano-agua diquinasa (sex1).
 Es udio del amaño de semilla en los mu an es de pé dida de unción p x25, gpa 5 y
sex1 en líneas sob eexp eso as de los ac o es de ansc ipción ATHB25 y COG1.
 Análisis de la longe idad de las semillas en los mu an es de pé dida de unción p x25,
gpa 5 y sex1 en líneas sob eexp eso as de los ac o es de ansc ipción ATHB25 y
COG1.
 Tinción de componen es de la capa ex e na de la cubie a de la semilla en los
mu an es de pé dida de unción p x25, gpa 5 y sex1 en líneas sob eexp eso as de los
ac o es de ansc ipción ATHB25 y COG1.
 De e minación de la pe meabilidad de las semillas a e azolio en los mu an es con
pé dida de unción p x25, gpa 5 y sex1 en las líneas sob eexp eso as de los ac o es de
ansc ipción ATHB25 y COG1

Ma e iales y mé odos
18
3. MATERIALES Y MÉTODOS
Ma e iales y mé odos
19
3.1 Ob ención de mu an es
 La línea mu an e seleccionada pa a la glice ol-3- os a o acil ans e asa5 (gpa 5) es la
SALK_142456.
 La línea mu an e seleccionada pa a la pe oxidasa25 (p x25) es la GABI_716G12.
 La línea mu an e seleccionada pa a la glucano-agua dikinasa (sex1) es la SALK_062752.
3.2 Es e ilización húmeda de semillas
Se p epa ó una solución de e anol al 70% a la que se le añadió un 0,5% de T i ón X-100.
Seguidamen e, se p epa ó una solución de hipoclo i o sódico al 2,5% (es o se consigue
diluyendo a la mi ad la lejía come cial con un 4% de clo o ac i o) a la que se le añadió un 0,5%
de T i ón X-100. A con inuación, se in oduje on 100 semillas ap oximadamen e de A. haliana
en un mic o ubo de 1,5 ml y se le ag egó 1 ml de la solución de e anol con T i ón. El ubo se
dejó en agi ación du an e 15 minu os. Pos e io men e, se eliminó la solución de e anol con
T i ón empleando una mic opipe a y se ag egó la solución de hipoclo i o de sodio con T i ón.
Las semillas se deja on en agi ación du an e 8 minu os. Po úl imo, en la campana de lujo
lamina y en condiciones asép icas, se eliminó la solución de hipoclo i o sódico y se ealiza on
4 la ados con 1ml de olumen de agua milli Q es é il empleando una mic opipe a y pun as
es é iles. Después del cua o la ado se deja on las semillas en agua du an e 48 ho as a 4ºC con
la inalidad de ompe la e apa de la encia o es a i icación an es de semb a las.
3.3 Cul i o en medio sólido Mu ashige-Skoog (MS)
Pa a el cul i o y ge minación in i o de las plan as se usa on placas Pe i de 9 cm de
diáme o a las que se les añadió 25 ml de medio de cul i o es ánda MS en condiciones
asép icas. Se empleó una solución come cial de sales de MS en pol o de la emp esa Sigma-
Ald ich ( e . M-5524) pa a la p epa ación del medio sólido en una p opo ción de 4,3 g/l, jun o
a saca osa al 1%, ampón MES al 0,1% y aga al 1% ajus ando el pH a 5,7 empleando KOH 1M.
Es e medio ue suplemen ado cuando ue necesa io selecciona plan as esis en es con:
 Sul adiazina con una concen ación de 75 g/ml, Kanamicina con una concen ación
de 25 g/ml, BASTA con una concen ación de 50 g/ml e Hig omicina a una
concen ación de 25 g/ml.
El medio se es e ilizó en el au ocla e du an e 20 minu os a una empe a u a de 121ºC y a
una a mós e a de p esión. Cuando se u o que añadi las sus ancias e molábiles (an ibió icos,
Ma e iales y mé odos
20
en es e caso) se espe ó has a que la empe a u a descendió has a 50-60ºC pa a e i a su
descomposición. Las placas Pe i se sella on con cin a po osa (Mic opo e) y se incuba on en
una cáma a a una empe a u a (23ºC) y o ope iodo (día la go: 16 ho as de luz y 8 ho as de
oscu idad) con olados con una in ensidad lumínica de 100 E·m-2s-1.
3.4 Cul i o en in e nade o
Las plan as de A. haliana se cul i a on en una mezcla de 2:1 de u ba (Biolan):
e micu a ex oliada (As al ex). Las mace as se coloca on en bandejas y se i iga on 2 eces de
semana. Las condiciones pa a el c ecimien o en el in e nade o son de día la go: 23ºC de
empe a u a, 70% de humedad ela i a y una in ensidad lumínica de 130 E·m-2s-1.
3.5 Aislamien o de DNA genómico
Pa a el aislamien o del DNA genómico se u ilizó una adap ación de la me odología del
de e gen e ca iónico CTAB desc i a en McKinney e al. en 1995. Es a consis e en la oma de 1 g
de ejido ege al que se homogeniza en un mo e o empleando ni ógeno líquido. Es e
homogeneizado se in odujo en un ubo eppendo de 1,5 ml y se le añadió 400 l de CTAB al
2% (2% p/ CTAB, 100 mM T is-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl y 1% p/ PVP M 40.000)
p ecalen ado a 65ºC y se incubó du an e 20 minu os a 65ºC. A con inuación se añadie on 400
l de clo o o mo y se mezcla on usando el ó ex. Pos e io men e, se ealizó un cen i ugado
de 4 minu os a 5.000 pm. Se omó el sob enadan e y se ans i ió a o o ubo eppendo . Se
añadió un olumen igual de isop opanol y, pos e io men e, se cen i ugó du an e 4 minu os a
12.000 pm. Se desca ó el sob enadan e y se ealiza on dos la ados con e anol 70% al
p ecipi ado. A con inuación, se eliminó el e anol y se dejó seca el p ecipi ado. Una ez seco,
se añadie on 50 l de agua milli Q es é il. Po úl imo se añadie on 0,5 l de RNAasa en una
concen ación de 10g/ml y se dejó en incubación du an e 20 minu os a 37ºC.
Ma e iales y mé odos
21
3.6 Reacción en Cadena de la Polime asa (PCR)
3.6.1 Oligonucleó idos cebado es
 Los cebado es empleados pa a el mu an e GPAT5 son:
LP ATTCGGTCGTGTCAGAGTTTG
RP ATACCACAGGGTCCATTAGGG
 Los cebado es empleados pa a el mu an e PRX25 son:
LP ATTGGTTTTCTTTTGCCAACC
RP CTGCTGCACACATCACATACC
 Los cebado es empleados pa a el mu an e SEX1 son:
LP TAAACTGTGTTGGCACTTCCC
RP TGGGTCAAGTCGGTTAACAAG
 El cebado empleado pa a la de ección del inse o de T-DNA en la línea SALK es:
lbb1.3: ATTTTGCCGATTTCGGAAC
 El cebado empleado pa a la de ección del inse o de T-DNA en la línea GABI es:
o2588: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG
3.6.2 Condiciones de la PCR
Las dos eacciones de PCR lle adas a cabo en es e abajo se ealiza on en placas de 96
pocillos en los que se añadie on los siguien es eac i os:
 1 l de DNA genómico.
 2 l Tampón PCR 10x.
 2 l dNTPs 10 mM.
 1l Cebado sen ido (0,1 g/l).
 1 l Cebado an isen ido (0,1 g/l).
 1 l Polime asa (Taq) 1 U/l.
 Agua milli Q es é il has a comple a un olumen de 20 l.
Resul ados y discusión
28
Fig. 5. Esquema de la PCR pa a la de ección del alelo
mu an e.
Fig. 6. Resul ado de la PCR2 en
gel de aga osa pa a el geno ipo
a hb25-1D gpa 5. Se comp ueba
que son mu an es dobles
homocigo os.
Jun ando los esul ados de las dos PCRs exis en es combinaciones posibles que
pe mi en es ablece el geno ipo de los indi iduos pa a los genes SEX1, GPAT5 y PRX25, al
como se mues a en la siguien e abla:
Tabla. 1. Tabla esumen con los posibles esul ados del
geno ipado po PCR.
Una ez seleccionados po PCR los indi iduos homocigo os mu an es pa a SEX1, GPAT5
y PRX25, se ecogie on las semillas de la F3 y se c ecie on en p esencia de an ibió ico pa a
selecciona aquellos indi iduos homocigo os pa a las mu aciones en los genes ATHB25 y COG1.

Resul ados y discusión
29
La lis a de los indi iduos homocigo os mu an es ca ac e izados po las dos eacciones
de PCR y la siemb a en an ibió ico, se mues a en la siguien e abla:
Geno ipo
Mu an es dobles
homocigo os
Azigo os pa a la
mu ación ecesi a
a hb25-1D gpa 5
L.18, L.20, L.24
L.1
a hb25-1D p x25
L.3, L.4, L.14
L.7
a hb25-1D sex1
L.4, L.22, L.23
L.17
cog1-2D gpa 5
L.18,L.22
L.17, L.24
Tabla. 2. Tabla con las líneas seleccionadas como mu an es dobles homocigo as y
azigo as pa a la mu ación ecesi a en los dis in os geno ipos.
Con la inalidad de de e mina si exis ían ca ac e ís icas dis in as en la descendencia de
los dis in os c uces, se lle ó a cabo un es udio eno ípico que engloba an o el amaño de la
semilla, como la esis encia que p esen an al en ejecimien o, la posible al e ación de la capa
de mucílago y las posibles modi icaciones de la capa de sube ina.
4.1 Tamaño de la semilla
En el caso del amaño de las semillas, se oma on mues as de las dis in as líneas y se
ealiza on o og a ías ep esen a i as con el mic oscopio óp ico.
Pos e io men e, se de e minó el á ea p oyec ada po la semilla usando del p og ama
imageJ. En las ep esen aciones g á icas se mues an an o la media y como la des iación
es ánda co espondien es pa a los dis in os geno ipos:
Fig. 7. Tamaño semilla en mm2 del geno ipo a hb25-1D gpa 5
Resul ados y discusión
30
Fig. 8. Tamaño semilla en mm2 del geno ipo a hb25-1D p x25.
Fig. 9. Tamaño semilla en mm2 del geno ipo a hb25-1D sex1
Fig. 10. Tamaño semilla en mm2 del geno ipo cog1-2D gpa 5.
Tal y como se obse a en los g á icos, los esul ados ob enidos mues an que
mu aciones en enzimas impo an es pa a la o mación de la cubie a no a ec an al amaño de
las semillas de A. haliana.
Resul ados y discusión
31
4.2 En ejecimien o
Las semillas de líneas F3 aisladas se some ie on a un a amien o de en ejecimien o
acele ado. Po una pa e se ge mina on en MS sin a amien o pa a comp oba que las líneas
no enían de ec o en su ge minación. Po o a, as en ejecimien o la semillas se semb a on en
MS y se con abilizó la ge minación as a ios días desde su siemb a.
La siguien e imagen mues a las di e encias en e las mues as a adas con el
a amien o de en ejecimien o acele ado en e a las mues as no a adas:
Fig. 11. Imagen omada que mues a la compa ación en e los
geno ipos a hb25-1D sex1 (pa e supe io ) y el geno ipo a hb25-1D
(pa e in e io ) cuando no han sido a adas (A) y cuando han sido
some idas al a amien o del en ejecimien o acele ado (B).
Los esul ados ob enidos pa a la asa de ge minación de los dis in os geno ipos
co esponden a la acción de semillas que han ge minado en e a las o ales que había en las
placas. Los da os ue on omados en los días 0, 3, 6 y 9 desde su siemb a en medio MS. Los
esul ados ob enidos son los siguien es:
Resul ados y discusión
32
Fig. 12: Tasa de ge minación del geno ipo a hb25-1D gpa 5 después del en ejecimien o acele ado.
Fig. 13. Tasa de ge minación del geno ipo a hb25-1D p x25 después del en ejecimien o acele ado.
Resul ados y discusión
33
Fig. 14. Tasa de ge minación geno ipo a hb25-1D sex1 después del en ejecimien o acele ado.
Fig. 15. Tasa de ge minación al en ejecimien o acele ado del geno ipo cog1-2D gpa 5 después del
en ejecimien o acele ado.
Las g á icas ob enidas pa a la asa de ge minación mues an que las mu aciones
in oducidas en los dis in os geno ipos anulan el e ec o de la sob eexp esión de los ac o es de
ansc ipción que es án implicados en la longe idad de las semillas. Es o se adecua a la
hipó esis de que es os ac o es de ansc ipción eje cen un papel undamen al en la o mación
de la cubie a p opo cionando una mayo longe idad a las semillas de A. haliana. Sin
emba go, no se conocen las pa es de la cubie a que se en a ec adas po es as mu aciones.

Resul ados y discusión
34
4.3 Mucílago
La capa de mucílago se de e minó median e una inción con ojo de u enio y las
imágenes se oma on en el mic oscopio óp ico.
Fig. 16. Tinción de la capa de mucílago con ojo de Ru e io. La imagen A
co esponde a la línea 1 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la línea
18 de geno ipo a hb25-1D gpa 5.
Fig. 17. Tinción de la capa de mucílago con ojo de Ru e io. La imagen A
co esponde a la línea 7 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la línea
14 de geno ipo a hb25-1D p x25.
Fig. 18. Tinción de la capa de mucílago con ojo de Ru e io. La imagen A
co esponde a la línea 17 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la
línea 22 de geno ipo a hb25-1D sex1.
Resul ados y discusión
35
Fig. 19. Tinción de la capa de mucílago con ojo de Ru enio. La imagen A
co esponde a la línea 24 (cog1-2D) y la imagen B co esponde a la línea
18 de geno ipo cog1-2D gpa 5.
Como mues an las imágenes, los dobles mu an es a hb25-1D gpa 5, a hb25-1D p x25,
cog1-2D gpa 5, no mues an ninguna al e ación en la capa de mucílago cuando son
compa ados los indi iduos mu an es dobles homocigo os y los indi iduos azigo os pa a las
mu aciones ecesi as. No obs an e, el geno ipo a hb25-1D sex1 sí que mues a una educción
signi ica i a de la capa de mucílago, lo que pone en e idencia el papel undamen al de la
enzima SEX1 en la hid ólisis de los g ánulos de almidón pa a la o mación de es a capa.
4.4 Sube ina
La capa de sube ina se isualizó empleando una inción con Sudán ojo y las imágenes
ue on omadas en el mic oscopio óp ico.
Fig. 20. Tinción de la capa de sube ina con ojo Sudán. La imagen A
co esponde a la línea 1 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la
línea 24 de geno ipo a hb25-1D gpa 5.
Resul ados y discusión
36
Fig. 21. Tinción de la capa de sube ina con ojo Sudán. La imagen A
co esponde a la línea 7 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la
línea 14 de geno ipo a hb25-1D p x25.
Fig. 22. Tinción de la capa de sube ina con ojo Sudán. La imagen A
co esponde a la línea 17 (a hb25-1D) y la imagen B co esponde a la
línea 4 de geno ipo a hb25-1D sex1.
Fig. 23. Tinción de la capa de sube ina con ojo Sudán. La imagen A
co esponde a la línea 24 (cog1-2D) y la imagen B co esponde a la
línea 22 de geno ipo cog1-2D gpa 5.
Las imágenes ob enidas pa a la inción capa de sube ina mues an que la al a de la
enzima GPAT5 impide una mayo deposición de sube ina en los mu an es que sob eexp esan
an o ATHB25 como COG1. En el caso de PRX25 sólo se e a ec ada la longe idad ya que la
capa de sube ina no pa ece exis i di e encias en e los indi iduos mu an es dobles
homocigo os y los indi iduos azigo os pa a las mu aciones ecesi as, po lo que es de espe a
que exis a o a pe oxidasa con olada po el ac o de ansc ipción que supli ía el papel de
Resul ados y discusión
37
PRX25 en la biosín esis de sube ina. En el caso de los geno ipos a hb25-1D sex1 se obse a que
an o la capa de mucílago, como la capa de sube ina así como la longe idad se en a ec adas.
4.5 Pe meabilidad
La pe meabilidad de la semilla se midió u ilizando sales de e azolio. Es as sales
cuando en an en con ac o con el emb ión y pene an en las células se educen
me abólicamen e pa a o ma o mazán (un compues o insoluble de onalidad ojiza) de
mane a que aquellas semillas que posean una onalidad más oja son más pe meables pues o
que han pe mi ido una mayo en ada de e azolio.
Fig. 24. espues a de las semillas de los dis in os geno ipos a la
sales de e azolio.
Como se mues a en la igu a, la pe meabilidad en e los indi iduos azigo os pa a la
mu ación ecesi a y los mu an es dobles homocigo os no a ía en el caso del geno ipo a hb25-
1D sex1. En el caso de los o os geno ipos sí que se obse an a iaciones en la pe meabilidad
cuando se compa an los indi iduos mu an es dobles homocigo os gpa 5 y p x25 con las líneas
sob eexp eso as a hb25-1D y cog1-2D, pues o que poseen cambios impo an es a ni el de la
44
Espelie, K.E., Da is, R.W., Kola ukudy, P.E. (1980). Composi ion, ul as uc u e and unc ion o
he cu in- and sube in-con aining laye s in he lea , ui peel, juice-sac and inne seed coa o
he g ape ui (Ci us pa adise Mac ed.) Plan a 149: 498-511.
Gasse , C.S., Robinson-Bee s, K. (1993). Pis il de elopmen . Plan Cell 5: 1231-1239.
Go o, N. (1985). A mucilage polysaccha ide sec e ed om es a o A abidopsis haliana.A abid.
In . Se 22: 143-145.
G aça, J., Pe ei a, H. (2000a). Me hanolysis o ba k sube in, Analysis o glyce ol and acid
monome s. Phy ochem Anal 11: 45-51.
Gu ie ez, L., Van Wuy swinkel, O., Cas elain, M., Bellini, C. (2007). Combined ne wo ks
egula ing seed ma u a ion. T ends Plan Sci 12: 294-300.
Haughn, G., Chaudhu y, A. (2005). Gene ic analysis o seed coa de elopmen in A abidopsis.
T ends Plan Sci 10: 472-477.
Haughn, G., Chaundhu y, A. (2005). Gene ic analysis o seed coa de elopmen in A abidopsis.
T end Plan Sci 10: 472-477.
Holdswo h, M., Ku up, S., McKibbin, R. (1999). Molecula and gene ic mechanisms egula ing
he ansi ion om emb yo de elopmen o ge mina ion. T ends Plan Sci 4: 275-280.
h p://www. ao.o g/doc ep/x5563E/X5563e0a.h m#e. plan gene ic esou ces ( ollow up o
con e ence esolu ion 681) (FAO 1983) 22-Mayo-2015.
I iondo, J.M., (2001): Conse ación de ecu sos i ogené icos In: Conse ación y
Ca ac e ización de Recu sos Fi ogené icos, pp 15-31. Eds.: González-And és F and Pi a JM.
Publicaciones I.N.E.A.
Kisu, Ono, Y., Shimo u u ani, T.N., Suzuki, M., Esaka, M. (1998). Cha ac e iza ion and
Exp ession o a New Class o Zinc Finge P o ein Tha Binds o Silence Region o Asco ba e
Oxidase Gene. Plan Cell Physiol 39: 1054-1064.
Kola ukudy, P.E. (2001). Polyes e s in highe plan s. Ad . Biochem. Eng. Bio echnol. 71: 1-49
Ko ak, S., Vie ling, E., Bäumlein, H., on Koskull-Dö ing, P. (2007). A no el ansc ip ional
cascade egula ing exp ession o hea s ess p o eins du ing seed de elopmen o A abidopsis.
Plan cell 19: 182-195.
Kuns , L., Samuels, A.L., Je e , R. (2005). The plan cu icle: Fo ma ion and s uc u e o
epide mal su aces. In Plan Lipids-Biology, U ilisa ion and Manipula ion, D. mu phy, ed
(Ox o d, UK: Blackwell) 270-302.
Ma ín, I. (2001). Conse ación de ecu sos i ogené icos. Mad id: Minis e io de Ag icul u a,
Pesca y Alimen ación. Hojas di ulgado as, 2114. 28 p. ISBN: 84-491-0505-6.
McKinney, E.C., Nazeem, A., T au , A., Kenne h, A., Feldmann, D.A. Belos o sky, McDowell,
J.M., Meaghe , R.B. (1995). Sequence-Based Iden i ica ion o T-DNA Inse ion Mu a ions in
A abidopsis Ac in Mu an s Ac 2-1 and Ac 4-1, Plan J 8: 613-622.

45
Moi e, L., Schmu z, A., Buchala, A., Yan, B., S a k, R.E., Ryse , U. (1999). Glyce ol is a sube in
monome . New expe imen al e idence o and old hypo hesis. Plan Phsiol 119: 1137-1146.
Naw a h, C. (2002). The biopolyme s cu in and sube in. In The A abidopsis Book, Some ille,
C.R., Meye owi z, E.M. (Rock ille, MD: Ame ican Socie y o Plan Biologis s),
doi/10.1199/ ab.0021, www.aspb.o g/publica ions/a abidopsis/
Nogue o, M., A i , R.M., Ocha , S., Thompson, R.D. (2013). The Role o he DNA-Binding One
Zinc Finge (Do ) T ansc ip ion Fac o Family in Plan s." Plan Sci 209: 32-45.
Ogé, L., Bou dais, G., Bo e, J., Colle , B., Godin, B., G anie , F., Bou in, J.P., Job, D., Jullien, M.,
G appin, P. (2008). P o ein epai L-isoaspa il me hyl ans e ase 1 is in ol ed in bo h seed
longe i y and ge mina ion igo in A abidopsis. Plan Cell 20: 3022-3037.
Pi a Villamil, J. M., Ma ínez-Labo de, J.B, (2001). Bancos de Semillas. In González-And és, F. &
Pi a Villamil, J. M. (Eds.). Conse ación y Ca ac e ización de Recu sos Fi ogené icos.
Publicaciones I.N.E.A. Valladolid, España.
P ie o-Dapena, P., Cas año, R., Almogue a, C., Jo dano, J. (2006). Imp o ed esis ance o
con olled de e io a ion in ansgenic seeds. Plan Physiol 142: 1102-1112.
Rajjou, L., Debeaujon, I. (2008). Seed Longe i y: Su i al and Main enance o High Ge mina ion
Abili y o D y Seeds." C R Biol 331: 796-805.
Robinson-Bee s, K., P ui , R.E., Gasse , C.S. (1992). O ule de elopmen in wild- ype
A abidopsis and wo emale-s e ile mu an s. Plan Cell 4: 1237-1249).
Ryse , U., Holloway, P.J. (1985). Ul as uc u e and chemis y o soluble and polyme ic lipids in
cell walls om seed coa s and ib es o Gossypium species. Plan a 163: 151-163.
Sa elmache , B. (2001). The apoplas and i s signi icance o plan mine al nu i ion. New
Phy ol 149: 167–192.
Sa le , S.E., Gilliland, L.U., Magallanes-Lundback, M., Polla d, M., DellaPenna, D. (2004).
Vi amine E is essen ial o seed longe i y and o p e en ing lipid pe oxida ion du ing
ge mina ion. Plan Cell 16: 1419-1432.
Schnei z, K., Hülskamp, M., P ui , R.E. (1995). Wild- ype o ule de elopmen in A abidopsis
haliana: a ligh mic oscope s udy o clea ed whole-moun issue. Plan J 7: 731-749.
Sch eibe , L., B eine , H-W., Riede e , M., Duggelin, M. (1994). The Caspa ian s ip o Cli ia
minia a Reg. oo s: Isola ion, ine s uc u e and chemical s uc u e. Bo . Ac a 107: 353–361.
Shige o, J., Kiyonaga, Y., Fuji a, K., Kondo, R., Tsu sumi, Y. (2013). Pu a i e ca ionic cell-wall-
bound pe oxidase homologues in A abidopsis, A P x2, A P x25 and A P x71 a e in ol ed in
ligni ica ion. J Ag ic Food Chem 61: 3781-3788.
S a k, R.E., and Tian, S. (2006). The cu in biopolyme ma ix. In Biology o he Plan Cu icle, Vol.
23, M. Riede e , ed (Ox o d, UK: Blackwell Publishing), pp. 126–144.
Suzuki, M., McCa y, D.R. (2008). Func ional symme y o he B3 ne wo k con olling seed
de elopmen . Cu Opin Plan Biol 11: 548-553.
46
Tejedo -Cano, J., P ie o-Dapena, P., Almogue a, C., Ca anco, R., Hi a su, K., Ohme-Takagi, M.,
Jo dano, J. (2010). Loss o Func ion o he Hs a9 Seed Longe i y P og am. Plan Cell En i on 33:
1408-1417.
Tesnie , K., S ookman-Donke s, H.M., an Pijlen, J.G., an de Gees , A.H., Bino, R.J., G oo ,
S.P. (2002). A con olled de e io a ion es o A abidopsis haliana e eals gene ic a ia ion in
seed quali y. Seed Sci Technol 30: 149-165.
an de Wouw, M., Kik, C., an Hin um, T., an T eu en, R., Visse , B. (2009) Gene ic e osion in
c ops: concep , esea ch esul s and challenges. Plan Gene ic Resou ces: Cha ac e iza ion and
U iliza ion 8(1); 1–15 doi:10.1017/S1479262109990062.
Wilson E.O., F ances M.P. (1988). Biodi e si y, Capí ulo 1. Washing on (DC): Na ional
Academies P ess (US) (1988).
Windso , J.B., Symonds, V.V., Mendenhall, J., Lloyd, A.M. (2000). A abidopsis seed coa
de elopmen : mo phological di e en ia ion o he ou e in egumen . Plan J 22: 483-493.
Yanagisawa, S. (2001). The T ansc ip ional Ac i a ion Domain o he Plan -Speci ic Do 1 Fac o
Func ions in Plan , Animal, and Yeas Cells. Plan Cell Physiol 42: 813-822.
Yanagisawa, S. (2002) The Do Family o Plan T ansc ip ion Fac o s.T ends Plan Sci 7: 555-
560.
Yanagisawa, S., Schmid , R.J. (1999). Di e si y and Simila i y among Recogni ion Sequences o
Do T ansc ip ion Fac o s. Plan J 17: 209-214.
Yu, T-S., Ko le , H., Häusle , R.E., Hille, D., Flügge, U-I., Zeedman, S.C., Smi h, A.M., Kossmann,
J., Lloyd, J., Ri e, G., S eup, M., Lue, W-L., Chen, J., Webe , A. (2001). The A abidopsis sex1
mu an is de ec i e in he R1 p o ein, a gene al egula o o s a ch deg ada ion in plan s, and
no in he chlo oplas hexose anspo e . Plan Cell 13: 1907-191