Epistasia entre ATHB25 y COG1, factores de transcripción que aumentan la longevidad de semillas de Arabidopsis thaliana, y enzimas implicadas en la formación de la suberina y el mucílago

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Epistasia entre ATHB25 y COG1, factores de transcripción que aumentan la longevidad de semillas de Arabidopsis thaliana, y enzimas implicadas en la formación de la suberina y el mucílago. TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO/A: SAMUEL BARBERÀ MORENO TUTORES: RAMÓN SERRANO SALOM Y EDUARDO BUESO RÓDENAS Curso Académico: 2014-2015 VALENCIA, 30 DE JUNIO DE 2015 ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Datos personales Nombre y apellidos: Samuel Barberà Moreno Datos del trabajo fin de grado Título: Epistasia entre ATHB25 y COG1, factores de transcripción que aumentan la longevidad de semillas de Arabidopsis thaliana, y enzimas implicadas en la formación de la suberina y el mucílago. Titulación: Grado en Biotecnología Tutores: Ramón Serrano Salom y Eduardo Bueso Ródenas Fecha de lectura: Julio 2015 Resum La longevitat de les llavors és un factor crític a l’agricultura. A mesura que passa el temps, van perdent viabilitat i açò obliga als agricultors a comprar-ne de noves tots els anys. Este fet provoca un augment de les despeses associades a la producció i disminueix els beneficis de l’agricultor. Per tant, la recerca dels gens implicats en la longevitat de les llavors constitueix un nou objectiu en la millora genètica d’aquelles plantes d’interès agrícola. En aquest treball s’ha estudiat la relació dels factors de transcripció ATHB25 i COG1 amb components essencials de la formació de la coberta de la llavor d’Arabidopsis thaliana com són PRX25, GPAT5 i SEX1 per poder determinar si la resistència la l’envelliment es veu alterada en els mutants de pèrdua de funció d’aquests components. Per poder determinar l’efecte es varen creuar els individus que posseïen una sobreexpressió dels factors de transcripció ATHB25 i COG1 amb individus mutants de pèrdua de funció per als enzims PRX25, GPAT5 i SEX1. Posteriorment, es van determinar els mutants dobles homozigots i s’analitzaren característiques fenotípiques com la grandària, la resistència a l’envelliment de la llavor, la permeabilitat i les possibles alteracions en la deposició de mucílag i de suberina. Els resultats han mostrat que l’augment de la resistència a l’envelliment rau en la sobreexpressió dels factors de transcripció ATHB25 i COG1 perquè són capaços de promoure canvis en la coberta de la llavor. Açò es va comprovar mitjançant l’aïllament de mutants dobles per als enzims PRX25, GPAT5 i SEX1. ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D'ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Paraules clau Arabidopsis, aciltransferasa, suberina, mucílag, epistasia Abstract Seed longevity is a critical factor in agriculture. As time passes, they lose viability and this requires farmers to buy new ones every year. This fact causes an increase in expenses associated with the production and decreased profits for the farmer. Therefore, the search for genes involved in seed longevity is a new target in breeding those plants of agricultural interest. This work has studied the relationship between transcription factors ATHB25 and COG1 and essential components of the formation of the testa in Arabidopsis thaliana. These components are PRX25, GPAT5 and SEX1. To determine whether the resistance is, we make aging mutants altered in the loss of function of these components. To determine the effect we crossed the individuals who owned overexpression of the transcription factors ATHB25 and COG1 with individuals that have loss of function mutant enzymes PRX25, GPAT5 and SEX1. Later, we determined the double homozygous mutants and analysed phenotypic characteristics such as size, resistance to aging in seeds, permeability and possible alterations in the deposition of suberin and mucilage. The results showed that the increased aging resistance lies in the overexpression of the transcription factors ATHB25 and COG1 because they are able to promote changes in the testa. This was verified by isolating double mutants of the enzymes PRX25, GPAT5 and SEX1. Key words Arabidopsis, acyltransferase, suberin, mucilage, epistasis Agraïments AGRAÏMENTS En primer lloc vull agrair a Ramón i a Mariche l’oportunitat de desenvolupar el meu Treball de Final de Grau al seu laboratori, i més amb les circumstàncies de com vaig arribar-hi. A vosaltres dos, gràcies pel vostre somriure amable i familiar, la consideració, la paciència i les formes tan educades que són característiques de les bones persones, dels bons cors. En segon lloc vull donar-li les gràcies al meu tutor, Edu, que amb paciència, dedicació i atenció, ha sabut transmetre’m la importància del treball ben fet, la constància que es necessita al laboratori, el coneixement tècnic, la perspectiva científica i, si més no, les seues xicotetes manies (els dos sabem de què estic parlant). També vull agrair-li el respecte que he rebut com a persona i la formalitat dels tractes, valors que m’han fet sentir des d’un primer moment com un més de l’equip del laboratori. Per descomptat, no puc deixar de costat a la meua inestimable companya Irene. Has sigut un punt de suport enorme durant tot el temps que ha durat este treball. De tu m’emporte l’alegria, l’interès, la cura a l’hora de desenvolupar un experiment, la preocupació per obtenir bons resultats i les nostres meravelloses xarrades filosofico-político-economico-culturals. Eres i seràs molt especial per a mi. També vull agrairlos a Jesús, Lola, Marcos, Manu, Belén i Betlem els seus consells, la visió i les comentaris graciosos que fan que done gust anar a treballar. En tercer lloc vull donar les gràcies a la meua família i amics, especialment als meus pares. Gràcies per estar sempre al meu costat, per saber traure’m un somriure en els pitjors moments, per donar-me ànims quan més els necessitava i pel vostre amor i respecte. Estos dos valors m’han ajudat a avançar, a créixer com a persona i a semblar-me, encara que siga un poc, a vosaltres. Aprofite estes línies per agrair-li, a ella, la força, la valentia i el coratge que ens ha transmès a tots, encara que hui no es trobe entre nosaltres. Espere que allà on estigues ens continues ajudant com quan era de costum. Índice i Índice 1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 3 1.1 Erosión genética .................................................................................................................. 4 1.2 Conservación de los recursos fitogenéticos ........................................................................ 6 1.3 Longevidad de semilla ......................................................................................................... 7 1.4 Factores que afectan a la longevidad de la semilla ............................................................. 7 1.5 La cubierta de las semillas ................................................................................................... 8 1.5.1. Origen, desarrollo y diferenciación de la cubierta .................................................... 8 1.5.2 Suberina ................................................................................................................... 10 1.5.3 Giberelinas................................................................................................................ 11 1.6. Factores de transcripción DOF ......................................................................................... 12 1.7. Enzimas relacionadas con el desarrollo de la cubierta ..................................................... 13 1.8 Antecedentes del proyecto ............................................................................................... 14 1.8.1 Rastreo de mutantes con semillas más longevas ..................................................... 14 1.8.2 Localización de la inserción en los mutantes seleccionados .................................... 14 1.8.3 Análisis de la expresión de los genes adyacentes en los mutantes ......................... 15 1.8.4 Recapitulación del fenotipo mediante líneas de sobreexpresión ............................ 15 1.8.5 COG1 y ATHB25 regulan la capa de suberina de la cubierta de la semilla ............... 15 2. OBJETIVOS .............................................................................................................................. 16 2.1 Objetivo general ................................................................................................................ 17 2.2 Objetivos específicos ......................................................................................................... 17 3. MATERIALES Y MÉTODOS ....................................................................................................... 18 3.1 Obtención de mutantes ..................................................................................................... 19 3.2 Esterilización húmeda de semillas ..................................................................................... 19 3.3 Cultivo en medio sólido Murashige-Skoog (ms) ................................................................ 19 3.4 Cultivo en invernadero ...................................................................................................... 20 3.5 Aislamiento de DNA genómico .......................................................................................... 20 3.6 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) ..................................................................... 21 3.6.1 Oligonucleótidos cebadores ..................................................................................... 21 3.6.2 Condiciones de la PCR .............................................................................................. 21 Índice ii 3.7 PCR diagnóstica.................................................................................................................. 22 3.8 Electroforesis de DNA ........................................................................................................ 22 3.9 Envejecimiento acelerado ................................................................................................. 23 3.10 Tinción de la capa de mucílago con rojo de rutenio ........................................................ 23 3.11 Tinción de la capa de suberina con rojo Sudán ............................................................... 23 3.12 Tinción de permeabilidad ................................................................................................ 24 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ..................................................................................................... 25 4.1 Tamaño de la semilla ......................................................................................................... 29 4.2 Envejecimiento .................................................................................................................. 31 4.3 Mucílago ............................................................................................................................ 34 4.4 Suberina ............................................................................................................................. 35 4.5 Permeabilidad .................................................................................................................... 37 5. CONCLUSIONES ...................................................................................................................... 39 6. BIBLIOGRAFÍA…………………………………………………………………………………………………………………….42 Introducción 3 1. INTRODUCCIÓN Introducción 4 1.1 Erosión genética Los humanos, después del último periodo glacial, cambiaron su estilo de vida de tipo nómada a sedentario. Este cambio supuso el inicio de procesos de domesticación tanto de plantas como de animales. En el caso de las plantas, se escogieron aquellas que presentaban una mejor adaptación a las condiciones ambientales de la época. Este proceso de selección y domesticación fue denominado como “Primera Revolución Verde”, que supuso una reducción importante de la variabilidad genética puesto que muchas variedades no eran interesantes para el cultivo (van de Wouw et al., 2009). En el siglo XX, durante la década de los 40, ya se poseían un gran número de variedades de cultivos tradicionales de todas aquellas especies que podían tener impacto o interés en la agricultura. Fue entonces cuando se produjo la “Segunda revolución Verde”. Esto supuso un aumento del 50% de los rendimientos de producción por el uso de fertilizantes, implantación de sistemas mecánicos de recolección, la utilización de sustancias químicas para prevenir enfermedades y plagas, y la entrada de cultivos derivados de la mejora genética vegetal. Estas nuevas variedades introducidas destinadas al uso comercial eran bastante homogéneas a nivel genético y se adaptaban mucho mejor tanto a las técnicas de producción como a la comercialización agrícolas, lo que provocó grandes beneficios para una población en constante crecimiento. Sin embargo, la utilización de este tipo de variedades todavía redujo más la variabilidad genética existente por el abandono de variedades que no cumplían con determinados estándares de producción (Iriondo, 2009). La biodiversidad es la totalidad de la variación hereditaria en todos los niveles de organización biológica, desde los genes a los individuos, poblaciones, especies, comunidades y ecosistemas (Wilson EO, 1988). Además, es esencial tanto para que se produzca la especiación como para que las especies puedan sobrevivir en un entorno cambiante que les es desfavorable. La erosión genética se puede definir como la pérdida de biodiversidad (www.redandaluzadesemillas.org). La selección artificial clásica que se ha llevado a la praxis desde la Primera Revolución Verde, una economía globalizada, las costumbres y hábitos alimenticios cada vez más homogéneos y las nuevas técnicas de selección genética encaminadas a satisfacer las necesidades de los consumidores y productores, han intensificado los efectos de la erosión genética. Las variedades mejoradas a nivel de estabilidad y de producción, el desplazamiento de cultivos tradicionales, la destrucción de ecosistemas Introducción 5 naturales que han provocado la desaparición de muchas especies, han provocado una fuerte reducción de la variabilidad genética. El estrechamiento genético entre especies puede suponer un problema muy grave en un futuro próximo. El estrechamiento genético provoca una gran susceptibilidad en las especies a nuevos patógenos. Un ejemplo de la gravedad de este hecho es la conocida como “hambruna de la patata” que se produjo en Irlanda en el siglo XIX en la que todos los cultivos de patata presentaban uniformidad genética varietal y eran susceptibles al hongo Phytophtora infestans que destruyó la gran mayoría de los cultivos. Sus efectos provocaron que millones de irlandeses emigraran a EE.UU. Desgraciadamente, esta situación no es la única que se conoce. De hecho, una cepa de Helminthosporium maydis, en 1970, destruyó la mitad de los maizales situados al sur de EE.UU. puesto que procedían de semillas híbridas obtenidas a partir de una única variedad. En el siglo XIX, en los años cincuenta, se reconoció que la pérdida de biodiversidad era un problema serio que afectaba tanto a la agricultura más avanzada como a los propios ecosistemas. Esto condujo a la implantación de medidas para la conservación de las fuentes de variabilidad genética. Concretamente, la FAO, en 1961, convocó una reunión denominada “Plant Exploration and Introduction” con la finalidad de determinar la situación, conservación, empleo, exploración, etc., de los recursos fitogenéticos disponibles. A partir de esta reunión, un gran número de conferencias, asociaciones y organizaciones se han encargado de preservar, conservar y proteger las fuentes de variabilidad genética. La Figura 1 muestra las variaciones de la diversidad con el tiempo: Fig. 1. Evolución de la diversidad de la especies vegetales durante la historia de la humanidad, adaptado de van de Wouw et al. (2009). Introducción 12 antisentido con reducción de expresión en los factores de transcripción ATHB25, ATHB22 y ATHB31 manifestaban una menor longevidad de las semillas. Las semillas tratadas con GAs y las provenientes de la línea mutante DELLA con una señalización constitutiva de GAs son más tolerantes al envejecimiento (Bueso et al., 2014). En el laboratorio de Ramón Serrano, aparte de los factores de transcripción HOMEOBOX, los resultados de otro rastreo mostraron que los factores de transcripción DOF también poseen un papel fundamental en el desarrollo de la cubierta. 1.6. Factores de transcripción DOF Estudios genómicos comparativos entre Caenothabtidis, Drosophila melanogaster, levadura y Arabidopsis han determinado que las proteínas DOF (DNA-BINDING ONE ZINC FINGER) son factores de transcripción exclusivos de las plantas (Yanagisawa, 2002) y los presentan las plantas inferiores como el musgo Physcomitrella patens o como el alga verde Chlamydomonas reinhardtii, angioespermas y gimnoespermas. Además, presentan un dominio de unión al DNA formado por 52 aminoácidos muy conservados entre especies. La secuencia aminoacídica es la siguiente: CX2CX12CX2C, y, al unirse un átomo de zinc (Zn2+), adquiere la conformación característica de “dedo de zinc”. Este dominio está localizado cerca del extremo N-terminal. En la siguiente figura se muestra un esquema gráfico de su estructura: Fig. 2. Estructura de los factores de transcripción DOF, adaptado de Noguero et al. (2013). Tal y como se observa en la imagen, existen cuatro cisteínas que son clave para la unión del átomo de zinc. Los enlaces formados con el átomo de zinc y la conservación del aminoácido triptófano en el extremo C-terminal, son esenciales para que la proteína adquiera el motivo específico de unión al DNA tanto in vivo como in vitro (Yanagisawa, 2001). Las secuencias que reconocen los factores DOF son CTTT o AAAG y pueden unirse a aquellos promotores que posean una o varias de estas secuencias (Kisu, et al., 1998; Yanagisawa y Introducción 13 Schmidt, 1999). El resto de la proteína DOF posee gran variabilidad aminoacídica entre los extremos N y C-terminal por lo que sea estas diferencias las que marquen la especificidad de unión a otras proteínas, al DNA o, incluso, a otros factores de transcripción (Yanagisawa, 2001). Los factores DOF están involucrados en una gran variedad de procesos y funciones biológicas. Debido a que están presentes solamente en plantas, regulan aspectos biológicos inherentes de las plantas como la germinación, la respuesta a la luz o el desarrollo de la semilla. Por tanto, estos procesos biológicos pueden clasificarse en regulación del metabolismo, desarrollo y germinación de la semilla y diferenciación de tejidos. Además, los factores DOF pueden desempeñar funciones redundantes entre los distintos grupos y, de algunos no se conoce todavía su función. El mutante isl5-1D posee una sobreexpresión del gen COG1 que codifica para el factor de transcripción DOF1.5. Esta sobreexpresión provoca un refuerzo de la cubierta de la semilla aumentando así su tolerancia hacia el envejecimiento. 1.7. Enzimas relacionadas con el desarrollo de la cubierta Existen diversas enzimas involucradas en la síntesis de la cubierta de la semilla de Arabidopsis. En el presente trabajo se va a abordar el estudio de longevidad de las semillas en los mutantes nulos para las enzimas peroxidasa 25 (prx25), glicerol-3-fosfato aciltransferasa 5 (gpat5) y alfa-glucano diquinasa mediada por agua: SEX1 (sex1). Tanto las rutas de síntesis de la lignina como de la suberina, poseen enzimas comunes y una de ellas es la PRX25. Esta enzima tiene la función de polimerizar los monómeros responsables de la formación de lignina y/o suberina (Shigeto, J. et al., 2013). La glicerol-3fosfato aciltransferasa5 está involucrada en la biosíntesis de poliésteres como la suberina de la cubierta de las semillas (Beisson, R. et al., 2007). Y, por último la SEX1 está involucrada en la fosforilación de las glucosas que forman parte de la amilopecina para que se pueda realizar la hidrólisis parcial del almidón (Tien-Shin, Y. et al., 2001) y, posteriormente, la desfosforilación e hidrólisis completa del almidón, aunque estas últimas funciones corresponden a otras enzimas. Introducción 14 1.8 Antecedentes del proyecto Una de las líneas de investigación del laboratorio del Dr. Ramón Serrano tiene como objetivo profundizar en el conocimiento de los mecanismos moleculares relacionados con la longevidad de semillas. En los siguientes apartados, se detallan los resultados previos que condujeron a plantear la realización de este trabajo. 1.8.1 Rastreo de mutantes con semillas más longevas Con el objetivo de aislar mutantes con mayor longevidad de semilla, el Dr. Eduardo Bueso y el Dr. Francisco Campos realizaron dos búsquedas independientes del conjunto de mutantes “activation tagging” de W. Scheible y C. Somerville. Para la identificación de estos mutantes, se utilizó un método de envejecimiento acelerado conocido como CDT (Controlled Deterioration Treatment) (Tesnier et al., 2002). Las semillas inmersas en agua se estratificaron a 4ºC durante 48 h. Posteriormente, se incubaron durante 48h a 42 ºC. En la primera búsqueda o rastreo de mutantes, se analizaron unas 150.000 semillas que provenían de 30.000 líneas distintas. Mientras que en la segunda búsqueda, se sembraron unas 300.000 semillas provenientes de 60.000 líneas diferentes. Una vez realizadas, se preseleccionaron 290 individuos candidatos de la primera búsqueda y 387 de la segunda. La descendencia de los candidatos se analizó posteriormente. Una vez realizado el análisis de la siguiente generación, se pudo identificar el mejor individuo de cada búsqueda. Los mutantes seleccionados presentaban una inserción de copia única de T-DNA que co-segregaba con su mayor longevidad. 1.8.2 Localización de la inserción en los mutantes seleccionados El Dr. Eduardo Bueso y el Dr. Francisco Campos recuperaron el plásmido presente en el T-DNA con las secuencias flanqueantes de los mutantes seleccionados con el objetivo de determinar la posición en dónde se había producido la inserción del T-DNA. En el primer mutante isl1-1D por “improved seed longevity”, la inserción de produjo en el cromosoma 5, concretamente entre los genes At5g65410 y At5g65420. El gen At5g65410 se le denomina ATHB25 ya que codifica para el factor de transcripción HOMEOBOX25 en Arabidopsis. Mientras que en el segundo mutante isl5-1D, la inserción se produjo en el cromosoma 1, concretamente entre los genes At1g29160 y At1g29170. El gen anterior a la inserción de At1g29160 (COG1) pertenece a una familia de factores de transcripción DOF, concretamente Introducción 15 codifica para el factor DOF1.5. Este factor, actúa regulando negativamente la señalización por luz de los fitocromos (PhyA y PhyB). 1.8.3 Análisis de la expresión de los genes adyacentes en los mutantes En el caso de isl5-1D, se pudo determinar por qRT-PCR que la expresión de COG1 era 6 veces mayor. En el caso de isl1-1D, comparando el genotipo silvestre con el genotipo mutado por RT-PCR semicuantitativa, se pudo determinar que la sobreexpresión sólo afectaba al gen ATHB25. 1.8.4 Recapitulación del fenotipo mediante líneas de sobreexpresión Con la intención de comprobar si COG1 y ATHB25 regulan la longevidad de semillas en Arabidopsis, se llevó a cabo la obtención de plantas transgénicas sobreexpresoras de los cDNA de ambos factores transcritos. Tras la obtención de las semillas T3, se seleccionaron las líneas homocigotas y posteriormente fueron sometidas a envejecimiento acelerado. Estas líneas resultaron resistentes al tratamiento comparándolas con el genotipo silvestre. Por otra parte, mutantes dobles de pérdida tanto de ATHB25 como de ATHB22 (factor de transcripción más próximo a ATHB25) resultaron sensibles al envejecimiento acelerado. Las mismas conclusiones se obtuvieron mediante líneas amiRNA que reducían la expresión de los transcritos de COG1 y CDF4 (factor de transcripción más próximo a COG1). 1.8.5 COG1 y ATHB25 regulan la capa de suberina de la cubierta de la semilla Mediante cruces recíprocos se comprobó que la resistencia a envejecimiento de las líneas sobreexpresoras de COG1 y ATHB25 tenía herencia materna, lo que significaba que la modificación de la cubierta debería ser la explicación más probable de esta resistencia. Se realizaron diferentes cortes histológicos y tinciones que condujeron a averiguar que la modificación de la cubierta era esencialmente a nivel de la capa de suberina en la capa más superficial de la cubierta. La modificación de esta capa producía a una impermeabilización de las semillas que sobreexpresan COG1 y ATHB25 como se pudo demostrar tras incubación en sales de tetrazolio, que al penetrar y ser reducidas metabólicamente forman un depósito rojo. Objetivos 16 2. OBJETIVOS Objetivos 17 2.1 Objetivo general El presente trabajo final de grado tiene el objetivo principal, el comprobar que la resistencia a envejecimiento en semillas de mutantes sobreexpresores de los factores de transcripción ATHB25 y COG1 viene mediada por una modificación de la cubierta. 2.2 Objetivos específicos  Identificación de líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1 obtenidas por transformación de mutantes de pérdida de función de la peroxidasa 25 (prx25).  Identificación de líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1 obtenidas por transformación de mutantes de pérdida de función de la glicerolaciltransferasa 5 (gpat5).  Identificación de líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1 obtenidas por transformación de mutantes de pérdida de función de la alfaglucano-agua diquinasa (sex1).  Estudio del tamaño de semilla en los mutantes de pérdida de función prx25, gpat5 y sex1 en líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1.  Análisis de la longevidad de las semillas en los mutantes de pérdida de función prx25, gpat5 y sex1 en líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1.  Tinción de componentes de la capa externa de la cubierta de la semilla en los mutantes de pérdida de función prx25, gpat5 y sex1 en líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1.  Determinación de la permeabilidad de las semillas a tetrazolio en los mutantes con pérdida de función prx25, gpat5 y sex1 en las líneas sobreexpresoras de los factores de transcripción ATHB25 y COG1 Materiales y métodos 18 3. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales y métodos 19 3.1 Obtención de mutantes  La línea mutante seleccionada para la glicerol-3-fosfato aciltransferasa5 (gpat5) es la SALK_142456.  La línea mutante seleccionada para la peroxidasa25 (prx25) es la GABI_716G12.  La línea mutante seleccionada para la glucano-agua dikinasa (sex1) es la SALK_062752. 3.2 Esterilización húmeda de semillas Se preparó una solución de etanol al 70% a la que se le añadió un 0,5% de Tritón X-100. Seguidamente, se preparó una solución de hipoclorito sódico al 2,5% (esto se consigue diluyendo a la mitad la lejía comercial con un 4% de cloro activo) a la que se le añadió un 0,5% de Tritón X-100. A continuación, se introdujeron 100 semillas aproximadamente de A. thaliana en un microtubo de 1,5 ml y se le agregó 1 ml de la solución de etanol con Tritón. El tubo se dejó en agitación durante 15 minutos. Posteriormente, se eliminó la solución de etanol con Tritón empleando una micropipeta y se agregó la solución de hipoclorito de sodio con Tritón. Las semillas se dejaron en agitación durante 8 minutos. Por último, en la campana de flujo laminar y en condiciones asépticas, se eliminó la solución de hipoclorito sódico y se realizaron 4 lavados con 1ml de volumen de agua milli Q estéril empleando una micropipeta y puntas estériles. Después del cuarto lavado se dejaron las semillas en agua durante 48 horas a 4ºC con la finalidad de romper la etapa de latencia o estratificación antes de sembrarlas. 3.3 Cultivo en medio sólido Murashige-Skoog (MS) Para el cultivo y germinación in vitro de las plantas se usaron placas Petri de 9 cm de diámetro a las que se les añadió 25 ml de medio de cultivo estándar MS en condiciones asépticas. Se empleó una solución comercial de sales de MS en polvo de la empresa SigmaAldrich (ref. M-5524) para la preparación del medio sólido en una proporción de 4,3 g/l, junto a sacarosa al 1%, tampón MES al 0,1% y agar al 1% ajustando el pH a 5,7 empleando KOH 1M. Este medio fue suplementado cuando fue necesario seleccionar plantas resistentes con:  Sulfadiazina con una concentración de 75 g/ml, Kanamicina con una concentración de 25 g/ml, BASTA con una concentración de 50 g/ml e Higromicina a una concentración de 25 g/ml. El medio se esterilizó en el autoclave durante 20 minutos a una temperatura de 121ºC y a una atmósfera de presión. Cuando se tuvo que añadir las sustancias termolábiles (antibióticos, Materiales y métodos 20 en este caso) se esperó hasta que la temperatura descendió hasta 50-60ºC para evitar su descomposición. Las placas Petri se sellaron con cinta porosa (Micropore) y se incubaron en una cámara a una temperatura (23ºC) y fotoperiodo (día largo: 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad) controlados con una intensidad lumínica de 100 E·m-2s-1. 3.4 Cultivo en invernadero Las plantas de A. thaliana se cultivaron en una mezcla de 2:1 de turba (Biolan): vermicuta exfoliada (Asfaltex). Las macetas se colocaron en bandejas y se irrigaron 2 veces de semana. Las condiciones para el crecimiento en el invernadero son de día largo: 23ºC de temperatura, 70% de humedad relativa y una intensidad lumínica de 130 E·m-2s-1. 3.5 Aislamiento de DNA genómico Para el aislamiento del DNA genómico se utilizó una adaptación de la metodología del detergente catiónico CTAB descrita en McKinney et al. en 1995. Esta consiste en la toma de 1 g de tejido vegetal que se homogeniza en un mortero empleando nitrógeno líquido. Este homogeneizado se introdujo en un tubo eppendorf de 1,5 ml y se le añadió 400 l de CTAB al 2% (2% p/v CTAB, 100 mM Tris-HCl pH8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl y 1% p/v PVP Mr 40.000) precalentado a 65ºC y se incubó durante 20 minutos a 65ºC. A continuación se añadieron 400 l de cloroformo y se mezclaron usando el vórtex. Posteriormente, se realizó un centrifugado de 4 minutos a 5.000 rpm. Se tomó el sobrenadante y se transfirió a otro tubo eppendorf. Se añadió un volumen igual de isopropanol y, posteriormente, se centrifugó durante 4 minutos a 12.000 rpm. Se descartó el sobrenadante y se realizaron dos lavados con etanol 70% al precipitado. A continuación, se eliminó el etanol y se dejó secar el precipitado. Una vez seco, se añadieron 50 l de agua milli Q estéril. Por último se añadieron 0,5 l de RNAasa en una concentración de 10g/ml y se dejó en incubación durante 20 minutos a 37ºC. Materiales y métodos 21 3.6 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) 3.6.1 Oligonucleótidos cebadores  Los cebadores empleados para el mutante GPAT5 son: LP ATTCGGTCGTGTCAGAGTTTG RP ATACCACAGGGTCCATTAGGG  Los cebadores empleados para el mutante PRX25 son: LP ATTGGTTTTCTTTTGCCAACC RP CTGCTGCACACATCACATACC  Los cebadores empleados para el mutante SEX1 son: LP TAAACTGTGTTGGCACTTCCC RP TGGGTCAAGTCGGTTAACAAG  El cebador empleado para la detección del inserto de T-DNA en la línea SALK es: lbb1.3: ATTTTGCCGATTTCGGAAC  El cebador empleado para la detección del inserto de T-DNA en la línea GABI es: o2588: CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACG 3.6.2 Condiciones de la PCR Las dos reacciones de PCR llevadas a cabo en este trabajo se realizaron en placas de 96 pocillos en los que se añadieron los siguientes reactivos:  1 l de DNA genómico.  2 l Tampón PCR 10x.  2 l dNTPs 10 mM.  1l Cebador sentido (0,1 g/l).  1 l Cebador antisentido (0,1 g/l).  1 l Polimerasa (Taq) 1 U/l.  Agua milli Q estéril hasta completar un volumen de 20 l. Resultados y discusión 28 Fig. 5. Esquema de la PCR para la detección del alelo mutante. Fig. 6. Resultado de la PCR2 en gel de agarosa para el genotipo athb25-1D gpat5. Se comprueba que son mutantes dobles homocigotos. Juntando los resultados de las dos PCRs existen tres combinaciones posibles que permiten establecer el genotipo de los individuos para los genes SEX1, GPAT5 y PRX25, tal como se muestra en la siguiente tabla: Tabla. 1. Tabla resumen con los posibles resultados del genotipado por PCR. Una vez seleccionados por PCR los individuos homocigotos mutantes para SEX1, GPAT5 y PRX25, se recogieron las semillas de la F3 y se crecieron en presencia de antibiótico para seleccionar aquellos individuos homocigotos para las mutaciones en los genes ATHB25 y COG1. Resultados y discusión 29 La lista de los individuos homocigotos mutantes caracterizados por las dos reacciones de PCR y la siembra en antibiótico, se muestra en la siguiente tabla: Genotipo Mutantes dobles homocigotos Azigotos para la mutación recesiva athb25-1D gpat5 L.18, L.20, L.24 L.1 athb25-1D prx25 L.3, L.4, L.14 L.7 athb25-1D sex1 L.4, L.22, L.23 L.17 cog1-2D gpat5 L.18,L.22 L.17, L.24 Tabla. 2. Tabla con las líneas seleccionadas como mutantes dobles homocigotas y azigotas para la mutación recesiva en los distintos genotipos. Con la finalidad de determinar si existían características distintas en la descendencia de los distintos cruces, se llevó a cabo un estudio fenotípico que engloba tanto el tamaño de la semilla, como la resistencia que presentan al envejecimiento, la posible alteración de la capa de mucílago y las posibles modificaciones de la capa de suberina. 4.1 Tamaño de la semilla En el caso del tamaño de las semillas, se tomaron muestras de las distintas líneas y se realizaron fotografías representativas con el microscopio óptico. Posteriormente, se determinó el área proyectada por la semilla usando del programa imageJ. En las representaciones gráficas se muestran tanto la media y como la desviación estándar correspondientes para los distintos genotipos: Fig. 7. Tamaño semilla en mm2 del genotipo athb25-1D gpat5 Resultados y discusión 30 Fig. 8. Tamaño semilla en mm2 del genotipo athb25-1D prx25. Fig. 9. Tamaño semilla en mm2 del genotipo athb25-1D sex1 Fig. 10. Tamaño semilla en mm2 del genotipo cog1-2D gpat5. Tal y como se observa en los gráficos, los resultados obtenidos muestran que mutaciones en enzimas importantes para la formación de la cubierta no afectan al tamaño de las semillas de A. thaliana. Resultados y discusión 31 4.2 Envejecimiento Las semillas de líneas F3 aisladas se sometieron a un tratamiento de envejecimiento acelerado. Por una parte se germinaron en MS sin tratamiento para comprobar que las líneas no tenían defecto en su germinación. Por otra, tras envejecimiento la semillas se sembraron en MS y se contabilizó la germinación tras varios días desde su siembra. La siguiente imagen muestra las diferencias entre las muestras tratadas con el tratamiento de envejecimiento acelerado frente a las muestras no tratadas: Fig. 11. Imagen tomada que muestra la comparación entre los genotipos athb25-1D sex1 (parte superior) y el genotipo athb25-1D (parte inferior) cuando no han sido tratadas (A) y cuando han sido sometidas al tratamiento del envejecimiento acelerado (B). Los resultados obtenidos para la tasa de germinación de los distintos genotipos corresponden a la fracción de semillas que han germinado frente a las totales que había en las placas. Los datos fueron tomados en los días 0, 3, 6 y 9 desde su siembra en medio MS. Los resultados obtenidos son los siguientes: Resultados y discusión 32 Fig. 12: Tasa de germinación del genotipo athb25-1D gpat5 después del envejecimiento acelerado. Fig. 13. Tasa de germinación del genotipo athb25-1D prx25 después del envejecimiento acelerado. Resultados y discusión 33 Fig. 14. Tasa de germinación genotipo athb25-1D sex1 después del envejecimiento acelerado. Fig. 15. Tasa de germinación al envejecimiento acelerado del genotipo cog1-2D gpat5 después del envejecimiento acelerado. Las gráficas obtenidas para la tasa de germinación muestran que las mutaciones introducidas en los distintos genotipos anulan el efecto de la sobreexpresión de los factores de transcripción que están implicados en la longevidad de las semillas. Esto se adecua a la hipótesis de que estos factores de transcripción ejercen un papel fundamental en la formación de la cubierta proporcionando una mayor longevidad a las semillas de A. thaliana. Sin embargo, no se conocen las partes de la cubierta que se ven afectadas por estas mutaciones. Resultados y discusión 34 4.3 Mucílago La capa de mucílago se determinó mediante una tinción con rojo de rutenio y las imágenes se tomaron en el microscopio óptico. Fig. 16. Tinción de la capa de mucílago con rojo de Ruterio. La imagen A corresponde a la línea 1 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 18 de genotipo athb25-1D gpat5. Fig. 17. Tinción de la capa de mucílago con rojo de Ruterio. La imagen A corresponde a la línea 7 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 14 de genotipo athb25-1D prx25. Fig. 18. Tinción de la capa de mucílago con rojo de Ruterio. La imagen A corresponde a la línea 17 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 22 de genotipo athb25-1D sex1. Resultados y discusión 35 Fig. 19. Tinción de la capa de mucílago con rojo de Rutenio. La imagen A corresponde a la línea 24 (cog1-2D) y la imagen B corresponde a la línea 18 de genotipo cog1-2D gpat5. Como muestran las imágenes, los dobles mutantes athb25-1D gpat5, athb25-1D prx25, cog1-2D gpat5, no muestran ninguna alteración en la capa de mucílago cuando son comparados los individuos mutantes dobles homocigotos y los individuos azigotos para las mutaciones recesivas. No obstante, el genotipo athb25-1D sex1 sí que muestra una reducción significativa de la capa de mucílago, lo que pone en evidencia el papel fundamental de la enzima SEX1 en la hidrólisis de los gránulos de almidón para la formación de esta capa. 4.4 Suberina La capa de suberina se visualizó empleando una tinción con Sudán rojo y las imágenes fueron tomadas en el microscopio óptico. Fig. 20. Tinción de la capa de suberina con rojo Sudán. La imagen A corresponde a la línea 1 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 24 de genotipo athb25-1D gpat5. Resultados y discusión 36 Fig. 21. Tinción de la capa de suberina con rojo Sudán. La imagen A corresponde a la línea 7 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 14 de genotipo athb25-1D prx25. Fig. 22. Tinción de la capa de suberina con rojo Sudán. La imagen A corresponde a la línea 17 (athb25-1D) y la imagen B corresponde a la línea 4 de genotipo athb25-1D sex1. Fig. 23. Tinción de la capa de suberina con rojo Sudán. La imagen A corresponde a la línea 24 (cog1-2D) y la imagen B corresponde a la línea 22 de genotipo cog1-2D gpat5. Las imágenes obtenidas para la tinción capa de suberina muestran que la falta de la enzima GPAT5 impide una mayor deposición de suberina en los mutantes que sobreexpresan tanto ATHB25 como COG1. En el caso de PRX25 sólo se ve afectada la longevidad ya que la capa de suberina no parece existir diferencias entre los individuos mutantes dobles homocigotos y los individuos azigotos para las mutaciones recesivas, por lo que es de esperar que exista otra peroxidasa controlada por el factor de transcripción que supliría el papel de Resultados y discusión 37 PRX25 en la biosíntesis de suberina. En el caso de los genotipos athb25-1D sex1 se observa que tanto la capa de mucílago, como la capa de suberina así como la longevidad se ven afectadas. 4.5 Permeabilidad La permeabilidad de la semilla se midió utilizando sales de tetrazolio. Estas sales cuando entran en contacto con el embrión y penetran en las células se reducen metabólicamente para formar formazán (un compuesto insoluble de tonalidad rojiza) de manera que aquellas semillas que posean una tonalidad más roja son más permeables puesto que han permitido una mayor entrada de tetrazolio. Fig. 24. respuesta de las semillas de los distintos genotipos a la sales de tetrazolio. Como se muestra en la figura, la permeabilidad entre los individuos azigotos para la mutación recesiva y los mutantes dobles homocigotos no varía en el caso del genotipo athb251D sex1. En el caso de los otros genotipos sí que se observan variaciones en la permeabilidad cuando se comparan los individuos mutantes dobles homocigotos gpat5 y prx25 con las líneas sobreexpresoras athb25-1D y cog1-2D, puesto que poseen cambios importantes a nivel de la 44 Espelie, K.E., Davis, R.W., Kolattukudy, P.E. (1980). 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