UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Análisis de la exp esión en memb ana
de ecep o es iono ópicos de
glu ama o y GABA en ce ebelo.
Al e aciones en modelos animales de
ence alopa ía hepá ica
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNO/A: Rica do San ama ía Adame
TUTORES: D a. And ea Cab e a Pas o y D . Vicen e Felipo
Cu so Académico: 2014/2015
VALENCIA, Julio de 2015
ALUMNO: Rica do San ama ía Adame
TUTORES: D a. And ea Cab e a Pas o y D . Vicen e Felipo
FECHA: Valencia, Julio de 2015
TÍTULO: Análisis de la exp esión en memb ana de ecep o es iono ópicos de glu ama o y
GABA en ce ebelo. Al e aciones en modelos animales de ence alopa ía hepá ica
RESUMEN
La ence alopa ía hepá ica (EH) es un sínd ome neu opsiquiá ico complejo que puede
p esen a se en pacien es con en e medades hepá icas c ónicas o agudas. Se ca ac e iza po una
p og esi a al e ación de las unciones cogni i as, mo o as y del sueño como consecuencia del
allo hepá ico y puede p og esa en di e en es es adios has a el coma y la mue e. Los
mecanismos que conducen a las al e aciones neu ológicas en la EH oda ía no es án bien
es ablecidos pe o comienzan a iden i ica se en modelos animales (Felipo V., Na u e Re iews
Neu oscience, 2013). La hipó esis más acep ada ac ualmen e ace ca de las bases
neu obiológicas de la EH apun an a una combinación siné gica de dos ac o es: la ele ada
concen ación de amonio o hipe amonemia, debida a la de icien e eliminación en el hígado de
es a oxina y la neu oin lamación. Es os dos ac o es conducen a al e aciones en la
neu o ansmisión glu ama é gica y GABAé gica que son esponsables del de e io o cogni i o y
mo o . Uno de los mecanismos que pod ía con ibui a la al e ación de la neu o ansmisión es
un cambio en la exp esión en memb ana de ecep o es de los neu o ansmiso es glu ama o y
GABA. El p esen e abajo p e ende analiza cómo a ec a la EH a la exp esión en memb ana, en
ce ebelo, de ecep o es iono ópicos (NMDA, AMPA y GABA) implicados en p ocesos de
ap endizaje y memo ia, así como de los anspo ado es enca gados de e i a el neu o ansmiso
glu ama o de la hendidu a sináp ica as su libe ación.
Se u iliza án co es de ce ebelo ex i o de di e en es modelos animales de EH pa a
es udia la posible al e ación de la exp esión en memb ana de dichos ecep o es y su
implicación en el de e io o cogni i o y mo o .
PALABRAS CLAVE: Ence alopa ía hepá ica, hipe amonemia, anspo ado es de glu ama o,
ecep o es iono ópicos, NMDA, AMPA, GABA, exp esión en memb ana.
STUDENT: Rica do San ama ía Adame
PROFESSORS: D a. And ea Cab e a Pas o y D . Vicen e Felipo
DATE: July 2015, Valencia
TITLE: Analysis o memb ane exp ession o iono opic glu ama e and GABA ecep o s in
ce ebellum. Al e a ions in animal models o hepa ic encephalopa hy
ABSTRACT
Hepa ic encephalopa hy is a complex neu opsychia ic synd ome ha can occu in pa ien s
wi h acu e o ch onic li e disease. I is cha ac e ized by a p og essi e al e a ion o cogni i e,
mo o and sleep as a esul o li e ailu e unc ions and can p og ess a di e en s ages o coma
and dea h. The mechanisms leading o neu ological diso de s in HE a e no ye well es ablished
bu begin o iden i y in animal models (Felipo V., Na u e Re iews Neu oscience, 2013). The
mos widely accep ed abou he neu obiological basis o HE hypo hesis poin o a syne gis ic
combina ion o wo ac o s: he high concen a ion o ammonium o hype ammonemia due o
poo elimina ion in he li e o his oxin and neu oin lamma ion. These wo ac o s lead o
abno mali ies in glu ama e gic and GABAe gic neu o ansmission a e esponsible o cogni i e
and mo o impai men . One o he mechanisms ha could con ibu e o impai ed
neu o ansmission is a change in exp ession o memb ane ecep o s o he neu o ansmi e s
glu ama e and GABA. This pape analyzes how HE a ec s he memb ane exp ession, in
ce ebellum, o iono opic ecep o s (NMDA, AMPA and GABA) in ol ed in lea ning and
memo y as well as anspo e s esponsible o emo ing he neu o ansmi e glu ama e o he
synap ic cle a e his elease.
We will be used slices o ce ebellum ex i o in di e en animal models o HE o s udy
he possible al e a ion o he memb ane exp ession o hese ecep o s and hei in ol emen in
cogni i e and mo o impai men .
KEY WORDS: Hepa ic encephalopa hy, hype ammonemia, glu ama e anspo e s, iono opic
ecep o s, NMDA, AMPA, GABA, memb ane exp ession.
AGRADECIMIENTOS
Me gus a ía dedica especialmen e es e abajo, que an as ho as me ha cos ado, a la
pe sona que más lo ha su ido odo es e iempo, an o en los buenos como en los peo es y más
es esan es momen os. Sí, e lo dedico especialmen e a i, And ea, po es a siemp e a mi lado.
Sin emba go, se ía injus o no compa i es e ag adecimien o con quien, sin duda, han sido
igual de impo an es. A mis pad es, a quien debo odo lo que he conseguido has a aho a. Y a
mis abuelos, odos, quienes cada uno a su modo ambién me han ayudado en odo lo que ha
es ado en sus manos.
También quie o aco da me de mis compañe os, especialmen e de quienes han es ado ce ca
de mí es os úl imos meses, que me hayan dado el empujón mo al que quizás ambién necesi aba.
Po úl imo, ag adece al labo a o io de Neu obiología del Cen o de In es igaciones
P íncipe Felipe, especialmen e a Lucas y And ea, que me han enseñado odo lo que po aho a
se, que me hayan concedido la opo unidad de abaja con ellos.
ÍNDICE
1- INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1
1.1 Ence alopa ía Hepá ica ............................................................................................... 1
1.2 Modelos Animales ....................................................................................................... 2
1.3 P incipales ac o es que con ibuyen a la EH ........................................................... 3
1.4 Neu o ansmisión y su elación con la EH ................................................................ 4
1.4.1 Neu o ansmisión glu ama é gica................................................................................. 4
1.4.2 Neu o ansmisión GABAé gica ................................................................................... 7
1.4.3 Al e ación de la neu o ansmisión en la EH ................................................................. 8
1.5 Es ado ac ual y e apias eme gen es ........................................................................ 10
2- OBJETIVOS ................................................................................................ 12
3- MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 13
3.1 Modelos Animales ..................................................................................................... 13
3.2 Ob ención de las mues as ........................................................................................ 13
3.3 T a amien o de las mues as .................................................................................... 13
3.4 De e minación de la can idad de p o eína .............................................................. 15
3.5 Análisis del con enido de p o eínas o ales y de memb ana po Wes e n-Blo ... 15
3.6 Análisis es adís icos ................................................................................................... 17
4- RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 18
4.1 Exp esión en memb ana de anspo ado es y ecep o es iono ópicos de glu ama o
y GABA en modelo de hipe amonemia c ónica sin allo hepá ico en condiciones basales
................................................................................................................................................. 18
4.1.1 La exp esión en memb ana basal de las subunidades (NR1, NR2A, GluR1 y GluR2)
de ecep o es iono ópicos de glu ama o es á disminuida en hipe amonemia c ónica ........ 18
4.1.2 La exp esión en memb ana basal de la subunidad GABAα1 del ecep o GABA es á
disminuida en hipe amonemia c ónica ................................................................................ 22
4.1.3 La exp esión en memb ana de los anspo ado es de glu ama o GLT-1 y EAAC1 es á
disminuida en condiciones basales de hipe amonemia c ónica .......................................... 23

4.2. Exp esión en memb ana del anspo ado de glu ama o EAAC1 as la ac i ación
del ecep o AMPA a di e en es dosis y iempos de incubación con un agonis a ............ 25
4.2.1 El a amien o con AMPA al e a la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1
obse ándose un e ec o dosis y un e ec o iempo ............................................................... 26
5- CONCLUSIONES ....................................................................................... 31
6- BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 32
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Subunidades de los dis in os ecep o es iono ópicos. ............................................ 8
Tabla 2. An icue pos p ima ios y secunda ios u ilizados con su co espondien e dilución.
.....................................................................................................................................................16
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Vía Glu ama o-Óxido Ní ico-GMPcíclco ............................................................. 6
Figu a 2. Sis ema de pe usión. ............................................................................................. 14
Figu a 3. Rep esen ación de un Wes e n-Blo con BS3 ....................................................... 17
Figu a 4. La exp esión basal en memb ana de las subuniades NR1 (a) y NR2A (b) es á
disminuida en ce ebelo de a as hipe amonémicas ................................................................18
Figu a 5. La exp esión en memb ana de las subunidades GluR1 (a) y GluR2 (b) es á
disminuida en ce ebelo de a as hipe amonémicas. ...............................................................19
Figu a 6. La exp esión en memb ana de la subunidad GABAα1 es á disminuida en
ce ebelo de a as hipe amonémicas en condiciones basales. .................................................22
Figu a 7. La exp esión basal en memb ana de los anspo ado es de glu ama o EAAC1
(a) y Gl -1 (b) es á disminuida en ce ebelo de a as hipe amonémicas ................................24
Figu a 8. Resumen de las al e aciones de la exp esión en memb ana de los ecep o es
NMDA, AMPA y GABA y de los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y Gl -1 en a as
con hipe amonemia c ónica .....................................................................................................25
Figu a 9. Exp esión en memb ana de EAAC1 as la ac i ación del ecep o AMPA a
di e en es dosis y iempo en a as con ol e hipe amonémicas .............................................27
Figu a 10. Resumen de la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1 as la
ac i ación del ecep o AMPA en a as con ol .....................................................................28
Figu a 11. Resumen de la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1 as la
ac i ación del ecep o AMPA en a as hipe amonémicas ...................................................29
Ab e ia u as
EH: Ence alopa ía Hepá ica
EHM: Ence alopa ía Hepá ica Mínima
PHES: Psychome ic Hepa ic Encephalopa hy Sco e
ISHEn: In e na ional Socie y o Hepa ic Encephalopa hy and Ni ogen Me abolism
PCS: Po a-Ca al Shun (Anas omosis Po a-Ca a)
TNFα: Fac o Nec osis Tumo al α
AINE: An iin lama o io no es e oideo
GABA: ácido γ-aminobu í ico
EAAT: T anspo ado de aminoácidos exci ado es (Exci a o y Amino Acid T anspo e )
GLAST: T anspo ado Glu ama o Aspa a o (GLu ama e ASpa a e T anspo e )
Gl -1: T anspo ado de glu ama o glial 1 (Glial glu ama e anspo e 1)
EAAC1: T anspo ado de aminoácidos exci a o ios 1 (Exci a o y Amino Acid Ca ie 1)
iGluR: Recep o de glu ama o iono ópico
NMDA: N-me il-D-aspa a o
AMPA: α-amino-3-hid oxi-5-me ilo-4-isoxazolp opiónico
GMP: Guanosín mono os a o
GMPc: Guanosín mono os a o cíclico
CAMKII: p o ein quinasa dependien e de calcio/calmodulina
NOS: Óxido Ní ico Sin asa
CM: Calmodulina
NO: Óxido Ní ico
GC: Guanila o Ciclasa
LTP: Po enciación a La go Plazo
Na+: Ion Sodio
Ca2+: Ion Calcio
SN : Subs ancia nig a pa s e icula a
Cl-: Ion Clo o
mRNA: Ácido Ribonucleico mensaje o
LTD: Dep esión a La go Plazo
p/p: Po cen aje en peso
M: Mola
mM: miliMola
NaCl: Clo u o de Sodio
KCl: Clo u o de Po asio
KH2PO4: Fos a o de Monopo asio
NaHCO3: Bica bona o de Sodio
O2: Oxígeno
CO2: Dióxido de Ca bono
µm: mic óme os
T is: T is(hid oxime il)aminome ano
HCl: Ácido Clo híd ico
SDS: Dodecilsul a o de Sodio
EGTA: E ilen Glicol Ácido Te aacé ico
NaF: Fluo u o de Sodio
APS: Pe sul a o de Amonio
TEMED: Te ame ile ilenediamina
TBS: T is-bu e ed saline
MgCl2: Clo u o de Magnesio
NBT: Te azolium, (3,3'-dime hoxy-4,4'-biphenylene)bis[2,(4-ni ophenyl)-5-phenyl-2H]
BCIP: 1H-Indol-3-ol, 5-b omo-4-chlo o-dihyd ogen phospha e
BS3: Bis[sul osuccinimidyl] Sube a e
BCA: Ácido Bicinconínico
BSA: Albúmina de Sue o Bo ino
nm: nanóme os
ºC: G ados Cen íg ados
µg: mic og amos
mA: miliAmpe ios
PVDF: Poli luo u o de Vinilideno
.a.: os a asa alcalina
ANOVA: Análisis de la Va ianza
SEM: E o Es ánda de las Medias
PKC: P o eína Quinasa C
PKA: P o eína Quinasa AMPc-dependien e
AMPc: Adenosín Mono os a o cíclico
In oducción
7
puede lle a a la ac i ación de los ecep o es NMDA al despola iza la memb ana neu onal (Xin
e al, 2005; Salonen e al, 2006; Cab e a-Pas o e al, 2012).
La ac i ación de los ecep o es AMPA o NMDA aumen a el glu ama o ex acelula
(Kakizawa e al, 2005). Debido a la dualidad de los ecep o es AMPA (al a y baja a inidad), la
can idad de glu ama o libe ado al ex e io de la célula a ia á en unción de la concen ación de
agonis a que lo ac i e, y po lo an o, la can idad de anspo ado es de glu ama o que se án
mo ilizados pa a compensa es e aumen o ambién se á a iable. Además, es e aumen o al e a
la ía glu ama o-óxido ní ico-cGMP además de causa al e aciones como po ejemplo
hipoquinesia debida al aumen o de la concen ación de glu ama o ex acelula en la subs ancia
nig a pa s e icula a (SN ) (Felipo V. 2013).
Recep o es de kaina o: e áme os o mados po las subunidades GluR5, GluR6, GluR7,
KA1 y KA2 o mando e áme os, pudiendo se homo e áme os de alguna de las subunidades
GluR5-7 o si es á o mado po las subunidades KA1-2 mezcladas con subunidades GluR5-7.
1.4.2 Neu o ansmisión GABAé gica
La mayo ía de las sinapsis inhibi o ias del sis ema ne ioso cen al u ilizan el ácido γ-
amimobu í ico (GABA) o la glicina como neu o ansmiso . Exis en es ipos dis in os de
ecep o es GABA (GABAA/B/C). La sub amilia GABAA, son una se ie de ecep o es
iono ópicos o mados po pen áme os de las dis in as subunidades (α, β, γ, δ y ρ). Los
ecep o es GABAé gicos pe mi en la en ada de Cl- inhibiendo las células pos sináp icas. Dada
su al a a iedad, la unción de es os ecep o es a ía según el ipo neu onal. La sub amilia
GABAb son ecep o es me abo ópicos o mados po he e odíme os de sus dos subunidades
GABAb R1 y R2.
El mecanismo de eliminación de GABA es simila al del glu ama o. Tan o las p opias
neu onas como las células gliales poseen anspo ado es de al a a inidad po GABA
denominados GAT, que es au a an los ni eles no males de GABA as su libe ación po la
neu ona p e-sináp ica, p e iniendo la ac i ación excesi a de los ecep o es (Chiu e al. 2005).
La neu o ansmisión GABAé gica juega un papel undamen al en la coo dinación mo o a
que es á egulada p incipalmen e po el ce ebelo. Hancha e al. 2005 demos a on que los
ni eles de glu ama o ex acelula p oceden e de células g anula es o GABA p oceden e de las
células de Pu kinje u o as egiones con olan la coo dinación mo o a. La neu o ansmisión
GABAé gica es á implicada en la sin oma ología de la EH (Scha e y Jones, 1982). Di e sos
es udios han demos ado que el aumen o de GABA ex acelula de e io a la coo dinación

In oducción
8
mo o a (Chiu e al., 2005; Hancha e al., 2005, Boix e al., 2010). Además, es udios p e ios en
es e labo a o io demues an un aumen o del ono GABAé gico en a as hipe amonémicas como
esul ado del aumen o del GABA ex acelula y de algunos neu oes e oides que los modulan
posi i amen e (Cauli e al. 2009a). El aumen o del ono GABAé gico pod ía se esponsable de
la incoo dinación mo o a en modelos de hipe amonemia y EH.
Tabla 1. Subunidades de los dis in os ecep o es iono ópicos.
* Subunidades que se án es udiadas en el p esen e abajo
1.4.3 Al e ación de la neu o ansmisión en la EH
La co ec a exp esión y localización subcelula de odos es os ecep o es iono ópicos
( an o glu ama é gicos como GABAé gicos) es cla e en el co ec o uncionamien o de la
neu o ansmisión. El cambio en la concen ación de es os ecep o es a ec a á a como la célula
esponde al impulso ne ioso, al e ando la pos e io ansducción de señales y la plas icidad
sináp ica, cla e en p ocesos de ap endizaje y memo ia. Po o o lado, la exp esión y localización
co ec as de los anspo ado es de glu ama o son ambién cla es en el man enimien o de la
espues a exci a o ia ápida, siendo además óxicas las al as concen aciones de glu ama o si
és as no son co ec amen e eliminadas.
La co ec a exp esión en memb ana de ecep o es y anspo ado es es á de e minada po
un conjun o complejo de p ocesos celula es, cuya al e ación causa ía un deso den en es a
exp esión. Se equie e un balance de: ansc ipción, ni eles co ec os de mRNA, aducción,
es abilidad de las p o eínas, ensamblaje co ec o y co ec a localización en la memb ana celula
(T aynelis e al., 2010). Po o o lado, las modi icaciones pos aduccionales (sob e odo
In oducción
9
median e os o ilaciones), ambién se án de e minan es en su unción: egulación del á ico
hacia la memb ana, endoci osis, localización sináp ica y unión a o as p o eínas (Malinow and
Malenka, 2002).
La al e ación en los ecep o es de neu o ansmiso es a ec a ambién a la adap ación de las
sinapsis en espues a a los es ímulos que eciben. En conc e o, es a al e ación a ec a á a la
plas icidad sináp ica ca ac e ís ica de los ecep o es en la hendidu a sináp ica.
Las conexiones en e las sinapsis neu onales no son es á icas sino que pueden su i
cambios en espues a a expe iencias p e ias de la célula, pe mi iendo que cie os es ímulos
ex e nos po encien cie as sinapsis y debili en o as. Es e p oceso de plas icidad sináp ica es la
base de la memo ia y el ap endizaje. La al e ación de es a plas icidad con ibuye al de e io o
cogni i o en pa ologías an g a es como el Alzheime , as o nos au is as o e aso men al.
La al e ación en los ni eles de ecep o es de neu o ansmiso es en la memb ana sináp ica
da á luga a que no se consiga una co ec a plas icidad causando los p oblemas de memo ia y
ap endizaje obse ados en pacien es con EH.
Dos enómenos cla e in oluc ados en la plas icidad sináp ica son la po enciación y
dep esión a la go plazo (LTP Long- e m po en ia ion y LTD Long-Te m dep ession).
La LTP consis e en un aumen o pe sis en e del componen e exci ado de la espues a
sináp ica, que se aduce en un aumen o de la e icacia sináp ica que se man iene en el iempo.
La LTP en hipocampo se conside a una de las bases de la memo ia y el ap endizaje (Cooke y
Bliss, 2006). Además del papel ya mencionado del ce ebelo como p incipal esponsable de la
unción y coo dinación mo o a, o os es udios lo elacionan ambién con el ap endizaje mo o
(Vezina y Kim, 1999), la memo ia de abajo (Wiggs e al., 1999) e incluso en cie as unciones
cogni i as como la a ención iso-espacial, mecanismos de ap endizaje, plani icación y
adecuación empo al y en la modulación e bal (Go don, 2007). Ma in e al. (2003) ambién
demos a on que el ce ebelo juega un papel en el ap endizaje espacial.
La LTD p oduce una educción en la e icacia de la sinapsis neu onal. Las egiones
p incipales en las que se da son ambién el hipocampo y el ce ebelo pe o puede ocu i en o as
egiones.
Una co ec a exp esión y localización de ecep o es es cla e pa a man ene la co ec a
neu o ansmisión y plas icidad en el sis ema ne ioso cen al.
Tan o ecep o es como anspo ado es pueden e se al e ados po la EH. Y cualquie a de
las siguien es condiciones pod ía se la causan e del de e io o cogni i o asociado a la al e ación
de la neu o ansmisión (Mon o e al., 2002):
In oducción
10
- La can idad an o de ecep o es como de anspo ado es. Es a al e ación puede
se debida a un allo en su exp esión, sín esis y/o deg adación. Cualquie a o una
combinación de és os pod ía da luga a una al e ación de los ni eles no males en
memb ana.
- La egulación de su localización espacial. Aunque la can idad de ecep o es o
anspo ado es no se haya is o al e ada, un e o en la localización de és os en la
memb ana al e a ía su unción, ya que sólo econocen ligandos ex acelula es.
- La unción de los ecep o es y anspo ado es, ya que es án egulados po
dis in os mecanismos como os o ilación-de os o ilación, unión de co-agonis as, e c.
- Al e ación en la libe ación o en la ecap ación ( anspo ado es) del
neu o ansmiso .
- Al e aciones en cualquie paso de las ías de ansducción de señales asociadas
a los di e en es ipos de ecep o es, pueden da como esul ado una neu o ansmisión
al e ada.
1.5 Es ado ac ual y e apias eme gen es
La po en e in es igación lle ada a cabo en la úl ima década ha dado como esul ado
di e sos nue os en oques an o pa a el a amien o de la EH como pa a el diagnós ico emp ano
de la EHM, pe mi iendo an icipa se a sus sín omas clínicos.
Pa a el a amien o de la EH c ónica, adicionalmen e se ha in en ado educi los ni eles
de amonio educiendo la can idad de p o eínas en la die a o la p oducción de és e po la lo a
in es inal median e an ibió icos como la neomicina. Es udios ecien es indican que la i aximina
es el an ibió ico más e ec i o (Bass e al., 2010). También se u iliza lac ulosa pa a acidi ica el
lumen in es inal y educi el anspo e de amonio al o en e sanguíneo.
La in es igación ealizada en la úl ima década ha dado luga a una se ie de nue as
es a egias e apéu icas que ac úan sob e dianas en el ce eb o implicadas en el de e io o
cogni i o y mo o . Como hemos is o, la educción del GMPc po la al e ación de la ía
glu ama o-óxido ní ico-GMPc es una de las esponsables del de e io o en el ap endizaje.
Aumen a los ni eles de GMPc en ce ebelo median e un inhibido de la os odies e asa 5
es au a la unción cogni i a en a as con EHM (Mon o e al. 2007). Po o o lado, un
an agonis a de los ecep o es GABAA (como la bicuculina) es au an la capacidad de
ap endizaje en a as con EHM (Cauili e al. 2009). Po úl imo, ambién se han desa ollado
es a egias cen adas en la educción de la neu oin lamación. Se ha demos ado que el
a amien o con ibup o eno en a as es au aba las al e aciones cogni i as y mo o as pe o, en
pacien es con allo hepá ico, el ibup o eno pod ía induci en el pacien e allo enal. Po lo an o,
In oducción
11
se han p obado o o ipo de an iin lama o ios como los inhibido es de p38. Es e inhibido educe
la ac i ación de la mic oglía educiendo la neu oin lamación sin a ec a a los iñones y es au a
la unción cogni i a y mo o a en a as con EH (Agus i e al., 2011).
Obje i os
12
2- OBJETIVOS
El p incipal obje i o del p esen e abajo es analiza la exp esión en memb ana de
anspo ado es de glu ama o y de di e en es subunidades de ecep o es iono ópicos de
glu ama o y de GABA implicados en la neu o ansmisión, en ce ebelo de a as con ol y
es udia si es án al e ados en a as con hipe amonemia c ónica.
Los obje i os conc e os son:
1. Analiza la exp esión en memb ana de ecep o es NMDA (subunidades NR1 y NR2A),
AMPA (subunidades GluR1 y GluR2) y GABA (subunidad GABAα1) en ce ebelo de
a as con ol en condiciones basales.
2. Analiza la exp esión en memb ana de los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y
GLT-1 en ce ebelo de a as con ol en condiciones basales.
3. Es udia si la hipe amonemia al e a la exp esión en memb ana de los ecep o es
iono ópicos NMDA (subunidades NR1 y NR2A), AMPA (subunidades GluR1 y
GluR2) y GABA (subunidad GABAα1), y los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y
Gl -1 en condiciones basales.
4. E alua el e ec o de la ac i ación de ecep o es AMPA sob e la exp esión en
memb ana del anspo ado de glu ama o EAAC1 en co es de ce ebelo ex i o y sus
posibles al e aciones en hipe amonemia.

Ma e iales y Mé odos
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3- MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Modelos Animales
De los modelos animales an es mencionados, pa a el desa ollo de es a expe imen ación se
u ilizó el modelo de hipe amonemia c ónica sin allo hepá ico, diseñado en es e labo a o io
(Felipo e al., 1988; Azo in e al, 1989). És e consis e en ele a el ni el de amonio en sang e de
las a as modelo median e una die a ica en amonio (25% ace a o amónico p/p) du an e un
mínimo de 3 semanas. Es a die a p o oca un aumen o sos enido de los ni eles de amonio an o
en sang e como en ejidos (41, 37 y 51% espec i amen e en ce eb o, hígado y músculo),
simulando así las condiciones de un pacien e con p oblemas c ónicos hepá icos.
Los ni eles de u ea en sang e alcanzan ≈ 16 mM y la eliminación de u ea es de 25
mmoles/24 h, ap oximadamen e el doble que en las a as con ol.
3.2 Ob ención de las mues as
Se decapi a on las a as y se les ex ajo el ce ebelo. Se sume gie on en solución K ebs (en
mM: NaCl 119, KCl 2.5, KH2PO4 1, NaHCO3 26.2, CaCl2 2.5 y glucosa 11), en iada con hielo
y se bu bujea on con ca bógeno (95% O2 y 5% de CO2). Se hicie on co es ans e sales de
unos 400 µm con un Vib ó omo (LEICA, V 1000s), cuidando siemp e que los co es es én en
solución K ebs y co ec amen e bu bujeados con ca bógeno.
3.3 T a amien o de las mues as
Una ez ob enidas las mues as, se pasan a los pocillos del incubado (Campden
Ins umen s, L d. Modelo 745) (Figu a 2), que cuen a con un sis ema de pe usión que pe mi e
que a los pocillos llegue la solución elegida (K ebs bu bujeado con ca bógeno o a amien o).
La empe a u a es cons an e a lo la go de odo el expe imen o a 35ºC, moni o izada con un
con olado de empe a u a.
Ma e iales y Mé odos
14
Figu a 2. Sis ema de pe usión.
Se coloca on 4 co es de ce ebelo en cada pocillo y se es abiliza on du an e 20 minu os con
solución K ebs. Pa a es udia la can idad de ecep o es o anspo ado es basales an o en
condiciones isiológicas como en hipe amonemia, los co es ue on únicamen e es abilizados en
K ebs. Además, pa a el es udio de la exp esión del anspo ado de glu ama o EAAC1 en
espues a a la ac i ación del ecep o AMPA, as la es abilización, se añade 1 mL de
a amien o con el agonis a AMPA en cada pocillo. Las concen aciones de AMPA u ilizadas
ue on: un basal sólo con K ebs, 0.3, 1 y 2 mM de AMPA, an o pa a los co es de a as con ol
como hipe amonémicas. A su ez, cada a amien o se ealizó a iempos dis in os. Los iempos
de a amien o ue on de 8 y 15 minu os.
T as la es abilización y el a amien o, se ans i ie on los co es de cada pocillo a dos
ubos dis in os. Uno de ellos con el c osslinke BS3 (Bis[sul osuccinimidyl] sube a e) (Pie ce,
Rock o d, IL) 2 mM, y el o o sólo con K ebs. El BS3 es un c osslinke que se uni á
especí icamen e a p o eínas de memb ana, p o ocando que és as se queden en los pocillos del
gel de ac ilamida y pe mi iéndonos de e mina únicamen e la can idad de p o eína de
memb ana. Se man ienen los ubos en agi ación con inua a una empe a u a de 4ºC du an e 30
minu os y, pos e io men e, se de iene la eacción añadiendo glicina (100 mM en K ebs)
du an e o os 10 minu os a 4ºC.
Po úl imo, se ans i ie on los co es a un ubo con 200 µL de ampón de os o ilación
(T is-HCl 66 mM pH 7.4, SDS 1%, EGTA 1 mM, Glice ol 10%, Leupep ina 0.2 mg/mL, NaF 1
mM, Na o o- anada o 1 mM), y se homogeniza on po sonicación du an e 20 segundos.
Después, se gua dó una alícuo a pa a la de e minación de la can idad de p o eína y se
almacena on las mues as a -20ºC.
Ma e iales y Mé odos
15
3.4 De e minación de la can idad de p o eína
Se cuan i icó la can idad de p o eína de cada mues a po duplicado po el mé odo
colo imé ico del ácido bicinconínico (BCA P o ein Assay Ki , The mo). Se colocó una cu a
pa ón con BSA (Albúmina de Sue o Bo ino), y las mues as po duplicado. Se añadie on los
eac i os Pie ce® BSA P o ein Assay Reagen s A y B, y se incubó la placa a 37 ºC du an e 30
minu os. Po úl imo se midió la abso bancia a 570 nm.
3.5 Análisis del con enido de p o eínas o ales y de memb ana po Wes e n-Blo
Se sepa a on las p o eínas median e elec o o esis en gel de poliac ilamida al 8% con SDS.
La mues a se diluyó (1:1) en ampón de ca ga 2x (T is-HCl 0.5 M a pH 6.8, Glice ol 5%, SDS
10%, 2-Me cap oe anol 2.5%, B omo enol 1%). Y se hi ie on a 100 ºC du an e 5 minu os en
un e moblock. La can idad de p o eína po mues a ue de 100, 200 o 250 µg según la p o eína
a analiza .
Los geles de poliac ilamida cons an de dos pa es. La pa e supe io o “s acking” (T is
Base 0.125 M, 0,1% SDS a pH 6.8, Ac ilamida 3.9%, Bisac ilamida 0.015%, APS 0,04% y
TEMED), que acili a la concen ación de la mues a en una banda es echa an es de que en e
en la segunda pa e del gel o “sepa a ing” (T is Base 0.4 M, 0.1% SDS, pH a 8.8, Ac ilamida 8
%, Bisac ilamida 0.2%, APS 0.04% y TEMED), en el cual se sepa an las p o eínas en unción
de su masa ela i a. El ampón u ilizado pa a la elec o o esis ue el ampón “ unning” (T is
Base 0.3%, 0.02% SDS, Glicina 1.5%) y se ealizó en geles g andes de 20 pocillos. La
in ensidad de co ien e ue de 10 mA po gel du an e 16 ho as (o e nigh ).
Una ez inalizada la elec o o esis, se ans i ie on las p o eínas a una memb ana de
PVDF ( ehid a ada p e iamen e en me anol) en ampón de ans e encia (T is Base 0.025 M,
Glicina 0.05 M), du an e 5 ho as a una in ensidad de 250 mA.
A con inuación, se bloqueó la memb ana con una solución de leche en pol o al 5% en
TBS-Tween (NaCl 0.15 M, T is Base 50 mM, Tween-20 0.05%, pH 7.5) du an e 45-60 minu os
y se incuba on con el an icue po p ima io especí ico (Tabla 2) diluido en BSA al 5% en TBS-
Tween du an e 16 ho as en agi ación a 4ºC. Se la a on las memb anas 4 eces du an e 10
minu os con TBS-Tween y se incubó con el an icue po secunda io co espondien e conjugado
con os a asa alcalina, diluido ambién en la solución de BSA 5%, du an e 1ho a.
Ma e iales y Mé odos
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Tabla 2. An icue pos p ima ios y secunda ios u ilizados con su co espondien e dilución.
An icue po 1º
Dilución
An icue po 2ª
Dilución
An i Gl -1 (ABCAM)
1:2000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i EAAC1
(ALPHA
DIAGNOSTIC)
1:1000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i GABAα1
(ABCAM)
1:500
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i GluR1
(Calbiochem)
1:1000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i GluR2
(CHEMICON)
1:2000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i NR2A
(UPSTATE)
1:1000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG conejo
(Sigma)
1:4000
An i NR1 (BD)
1:1000
An i-IgG cab a- .a.*
con a IgG a a
(Sigma)
1:4000
* .a. Fos a asa alcalina
La memb ana se la ó 4 eces du an e 10 minu os con TBS-Tween y un úl imo la ado de
10 minu os en ampón sus a o (NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, T is-HCl 100 mM a pH= 9.5).
Po úl imo, se e eló u ilizando un mé odo colo imé ico pa a la enzima os a asa alcalina con
una solución de e elado (NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, T is-HCl 100 mM, 0.6% s ock NBT,
0.35% s ock BCIP, pH= 9.5).
Las imágenes de las bandas ue on cap u adas en un escáne Hewle Packa d Scanje
5300C y la in ensidad de las bandas ue cuan i icada con el p og ama AlphaImage 2200
(AlphaEaseFC 2200 o Windows, Camb idge, UK).
Resul ados y Discusión
23
El es udio de la neu o ansmisión GABAé gica en modelos de EH ha mos ado
p incipalmen e un aumen o del ono GABAé gico en ce ebelo (Cauli e al., 2009a y 2009b), que
con ibuye a las al e aciones cogni i as y mo o as en la EH.
Las posibles causas de es e aumen o del ono GABAé gico son: a) aumen o en la can idad
de ecep o es GABA en la memb ana pos -sináp ica, b) un aumen o en el GABA ex acelula y
c) sín esis aumen ada de neu oes e oides. Además, ambién se ha demos ado que la al e ación
en la libe ación y cap ación del GABA puede se debida a una al e ación de los anspo ado es
en as oci os en modelos de hipe amonemia (Bende e al. 2000).
Tan o la al e ación en la libe ación y cap ación de GABA po al e ación en la exp esión de
sus anspo ado es, como la sín esis de neu oes e oides pod ían aumen a el ono GABAé gico
en el ce ebelo. Como consecuencia, pod ía desa olla se un p oceso de adap ación simila al
e e enciado en los ecep o es de NMDA, po el que se in en e de o ma na u al educi ese
aumen o en el ono GABAé gico median e la disminución de la exp esión en memb ana de su
ecep o , al como indican nues os esul ados.
4.1.3 La exp esión en memb ana de los anspo ado es de glu ama o GLT-1 y EAAC1
es á disminuida en condiciones basales de hipe amonemia c ónica
De o ma análoga se es udió la exp esión basal en memb ana de los anspo ado es de
glu ama o EAAC1 (localizado en neu onas) y GLT-1 (localizado en as oci os).
Se obse ó una disminución de ambos anspo ado es, de EAAC1 a un 73 ± 10% (p<0.01)
y de GLT-1 a un 70 ± 11%) (p<0.05) (Figu a 7).

Resul ados y Discusión
24
Figu a 7. La exp esión basal en memb ana de los anspo ado es de glu ama o EAAC1
(a) y Gl -1 (b) es á disminuida en ce ebelo de a as hipe amonémicas. Los da os son la media
± e o es ánda de (a) 16 y (b) 8 a as po g upo. *di e encia signi ica i a espec o al con ol (p<0.05); **
di e encia signi ica i a espec o al con ol (p<0.01).
El glu ama o es el p incipal neu o ansmiso exci ado en ce eb o. La acumulación
excesi a de glu ama o en el medio ex acelula es neu o óxica y puede induci degene ación y
mue e neu onal. Po lo an o, la co ec a eliminación de és e no sólo a ec a á al co ec o
uncionamien o de la neu o ansmisión sino ambién a la supe i encia de la neu ona. Un
aumen o basal en los ni eles de glu ama o ex acelula ha sido demos ado en modelos de
hipe amonemia y allo hepá ico agudo (J. de Kneg e al. 1994).
Una disminución en la exp esión en memb ana de los anspo ado es EAAC1 y Gl -1
lle a á asociado un aumen o del glu ama o ex acelula an e la imposibilidad de pode
ecap a lo, con un aumen o de la oxicidad asociado a hipe exci abilidad y exoci o oxicidad
(Bu e wo h 2002). Es a es una hipó esis ya plan eada po Vaque o y Bu e wo h (2006) y que
nues os esul ados apoyan.
Di e en es es udios ob ienen esul ados simila es. Ragha end a e al. (1998) y No enbe g
e al. (1997) obse an una disminución en la exp esión génica de Gl -1 en modelos de daño
ce eb al e hipe amonemia, espec i amen e. Sua ez e al. 2000 ambién ob ienen una
disminución en los ni eles de exp esión de Gl -1 y EAAC1 en ce ebelo de a as con
anas omosis po a-ca a. Obse an que el mRNA de Gl -1 en modelo de allo hepá ico agudo
Resul ados y Discusión
25
es aba disminuido. Así pues, la ep esión de la exp esión génica pod ía se una posible causa de
la disminución de la exp esión en memb ana de los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y
Gl -1.
Como conclusión, la exp esión en memb ana de las subunidades NR1 y NR2A del ecep o
NMDA, GluR1 y GluR2 del ecep o AMPA y GABAα1 del ecep o GABA es á disminuida
en a as con hipe amonemia c ónica (Figu a 8). En consecuencia, es o pod ía al e a la
neu o ansmisión y con ibui a las al e aciones en la unción cogni i a y mo o a en pacien es
con ence alopa ía hepá ica.
Figu a 8. Resumen de las al e aciones de la exp esión en memb ana de los ecep o es NMDA,
AMPA y GABA y de los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y Gl -1 en a as con
hipe amonemia c ónica. Tan o los ecep o es iono ópicos de NMDA, AMPA y GABA como los
anspo ado es EAAC1 y Gl -1 ienen disminuida su exp esión en memb ana.
4.2 Exp esión en memb ana del anspo ado de glu ama o EAAC1 as la
ac i ación del ecep o AMPA a di e en es dosis y iempos de incubación con un agonis a
Una ez es udiada la exp esión basal an o de ecep o es como de anspo ado es,
analizamos la exp esión en memb ana del anspo ado de glu ama o EAAC1 en espues a a la
unión de AMPA a su ecep o .
La ac i ación de los ecep o es AMPA y/o NMDA p o oca un aumen o ápido de la
exp esión en memb ana del anspo ado de glu ama o EAAC1 (Waxman e al, 2007).
Además, es udios de mic odialisis in i o han demos ado que la unión de un agonis a a es os
ecep o es aumen aba los ni eles de glu ama o ex acelula , y es a pod ía aumen a la
Resul ados y Discusión
26
anslocación de EAAC1 en memb ana, pa a ecap a el exceso de glu ama o. La secuencia de
e en os en o den c onológico se ía la siguien e: ac i ación de los ecep o es AMPA y/o NMDA,
aumen o del glu ama o ex acelula , aumen o en la exp esión en memb ana de EAAC1,
ecap ación del glu ama o po és e y ápida disminución del glu ama o ex acelula has a
alcanza ni eles basales. En es e p oceso, los ecep o es AMPA de al a y baja a inidad pod ían
juga un papel cla e. Los ecep o es AMPA de al a a inidad no al e an los ni eles de glu ama o
ex acelula pe o los de baja a inidad si, aumen ando ansi o iamen e has a que disminuye a
ni eles basales po el aumen o de la exp esión de EAAC1 (Cab e a-Paso e al., 2015 en iado,
no publicado).
Como hemos is o an e io men e, la hipe amonemia p o oca un descenso en la exp esión
en memb ana basal de los ecep o es iono ópicos. Además, se ha is o en es udios de
mic odialisis in i o un e ec o de la hipe amonemia sob e la libe ación de glu ama o as la
ac i ación de los ecep o es AMPA a di e en es concen aciones. Po odo ello, en es e abajo
es udiamos cómo a ec a el a amien o con AMPA a la exp esión en memb ana del
anspo ado EAAC1, y si exis en di e encias en la espues a a dis in as concen aciones y a
dis in os iempos de incubación con el agonis a AMPA. Pa a ello se a a on co es de ce ebelo
de a as con ol e hipe amonémicas con 0.3, 1 y 2 mM de AMPA y cada uno de es os, a su ez,
du an e 8 o 15 minu os.
4.2.1 El a amien o con AMPA al e a la exp esión en memb ana del anspo ado
EAAC1 obse ándose un e ec o dosis y un e ec o iempo
El a amien o con di e en es concen aciones de AMPA induce cambios en la exp esión
en memb ana de EAAC1. En a as con ol, se obse a un e ec o dosis dependien e a los 8
minu os. A concen aciones bajas de AMPA (0.3 mM), la exp esión en memb ana de EAAC1
aumen a a 162 ± 44% y a concen aciones al as de AMPA (2 mM) disminuye p og esi amen e
su exp esión en memb ana (49 ± 14%) (p<0.05). Es o pa ece indica que el AMPA a al as
concen aciones no sólo no aumen a sino que disminuye la exp esión de EAAC1 en el
a amien o de 8 minu os. Sin emba go, en las a as con ol, el a amien o con AMPA de 15
minu os pa ece aumen a los ni eles del anspo ado sin impo a su concen ación,
man eniéndose en ni eles simila es de aumen o (AMPA 0.3 mM = 170 ± 29% p<0.05; AMPA 1
mM = 182 ± 33% p<0.05 y AMPA 2 mM = 186 ± 24% p<0.05) (Figu a 9 y 10).
En las a as hipe amonémicas, los a amien os con AMPA an o a los 8 como a los 15
minu os aumen an la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1 espec o an o a su basal
como al con ol, sin ap ecia se un e ec o de la dosis en ambos casos (Figu a 9 y 11).
Resul ados y Discusión
27
El e ec o del iempo de a amien o no se ap ecia en las a as hipe amonémicas,
alcanzándose los ni eles de exp esión en memb ana de o ma simila an o en dis in as dosis
como a dis in os iempos. Sin emba go, en las a as con ol hay un e ec o signi ica i o del
iempo, a concen aciones de 1 y 2 mM de AMPA (p<0.05 y p<0.01 espec i amen e) (Figu a
9,10 y 11).
Figu a 9. Exp esión en memb ana de EAAC1 as la ac i ación del ecep o AMPA a
di e en es dosis y iempo en a as con ol e hipe amonémicas. La exp esión en memb ana de
EAAC1 en a as con ol a los 8 minu os de a amien o pa ece segui un e ec o dosis,
disminuyendo su exp esión has a alcanza ni eles in e io es al basal a concen aciones de 2
mM. A los 15 minu os la exp esión aumen a de o ma simila a dis in as concen aciones,
desapa eciendo el e ec o dosis. En las a as hipe amonémicas, a los 8 y 15 minu os de
a amien o se alcanzan ni eles de exp esión supe io es al con ol basal, sin obse a se el e ec o
dosis. Los da os son la media ± e o es ánda de 15 a as po g upo. *di e encia signi ica i a espec o al
con ol basal (p<0.05); *** di e encia signi ica i a espec o al con ol basal (p<0.001); b di e encia
signi ica i a en e 8 y 15 minu os (p<0.05); bb di e encia signi ica i a en e 8 y 15 minu os (p<0.01); a
di e encia signi ica i a espec o al basal de hipe amonemia (p<0.05); aa di e encia signi ica i a espec o
al basal de hipe amonemia (p<0.01)
Resul ados y Discusión
28
Figu a 10. Resumen de la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1 as la ac i ación
del ecep o AMPA en a as con ol. En el a amien o de 8 minu os se obse a un mayo aumen o de la
exp esión de EAAC1 a concen aciones de 0.3 mM de AMPA, un meno aumen o a concen aciones de 1 mM
de AMPA y un descenso a concen aciones de 2 mM (e ec o dosis). En el a amien o de 15 minu os se obse a
un aumen o de la exp esión en memb ana de EAAC1 que no se e al e ada po la dosis.

Resul ados y Discusión
29
Figu a 11. Resumen de la exp esión en memb ana del anspo ado EAAC1 as la ac i ación
del ecep o AMPA en a as hipe amonémicas. En hipe amonemia an o la exp esión basal del ecep o
AMPA como la del anspo ado EAAC1 es án disminuidas. La ac i ación del ecep o AMPA aumen a los
ni eles de exp esión en memb ana de EAAC1 alcanzado ni eles signi ica i amen e aumen ados espec o a su
basal, independien emen e de la concen ación y el iempo del a amien o.
Pa a explica es os esul ados, y como se ha comen ado an e io men e ( e In oducción),
se pueden dis ingui ecep o es AMPA de baja y al a a inidad. Los ecep o es AMPA de al a
a inidad inhiben a los ecep o es NMDA a a és de un mecanismo no iono ópico basado en el
es ado de ape u a del ecep o AMPA (abie o, ce ado o desensibilizado) simila a un
mecanismo de unión a ligando (Bai e al., 2002). Una inhibición de los ecep o es NMDA
disminui á la exp esión en memb ana de EAAC1. Es o explica ía el e ec o dosis encon ado en
el a amien o con AMPA de 8 minu os en a as con ol, en el que a mayo concen ación meno
exp esión en memb ana del anspo ado se obse a.
Como al as concen aciones de AMPA inhibi ían en mayo medida los ecep o es NMDA,
es e esul ado concue da con el ob enido po Cab e a-Pas o e al. (2012) donde la libe ación de
glu ama o con 0.1 mM de AMPA ue mayo que a una concen ación de 0.3 mM en a as
con ol. T ussell e al. (1993) demos a on que al as concen aciones de neu o ansmiso podían
desensibiliza los ecep o es AMPA. O a posible explicación a es e e ec o dosis se ía que el
aumen o de glu ama o inducido as la ac i ación de los ecep o es AMPA, p oduci á una
desensibilización de és os a al as concen aciones de AMPA, lo que conduci ía a la disminución
de la exp esión de EAAC1.
Resul ados y Discusión
30
El e ec o del iempo de a amien o sob e la exp esión de EAAC1 en memb ana en a as
con ol pod ía debe se a una es abilización de los ni eles as un pe iodo de adap ación. En las
a as hipe amonémicas no se obse a e ec o del iempo ni de la dosis en los ni eles de exp esión
del anspo ado , en odos los casos aumen an signi ica i amen e su exp esión en memb ana
espec o a su basal.
Como conclusión inal, podemos a i ma que la hipe amonemia c ónica al e a la exp esión
en memb ana de ecep o es y anspo ado es. És o al e a á la neu o ansmisión sináp ica y en
consecuencia, con ibui á a las al e aciones de la unción cogni i a y mo o a en pacien es con
ence alopa ía hepá ica.
Conclusiones
31
5- CONCLUSIONES
1. La exp esión en memb ana de las subunidades NR1 y NR2A ( ecep o NMDA), GluR1
y GluR2 ( ecep o AMPA) y GABAα1 ( ecep o GABA) es á disminuida en ce ebelo
de a as con hipe amonemia c ónica.
2. La exp esión en memb ana de los anspo ado es de glu ama o EAAC1 y Gl -1 es á
disminuida en ce ebelo de a as con hipe amonemia c ónica.
3. La unión del agonis a AMPA a su ecep o modula la exp esión del anspo ado de
glu ama o EAAC1 dependiendo de la dosis y el iempo a amien o.
4. En a as con hipe amonemia c ónica es á al e ada la modulación de la exp esión del
anspo ado de glu ama o EAAC1 as la ac i ación del ecep o AMPA.
5. La hipe amonemia c ónica al e a la exp esión en memb ana de ecep o es y
anspo ado es, es o al e a á la neu o ansmisión sináp ica y en consecuencia
con ibui á a las al e aciones en la unción cogni i a y mo o a en pacien es con
ence alopa ía hepá ica.
Bibliog a ía
32
6- BIBLIOGRAFÍA
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