Análisis de la expresión en membrana de receptores ionotrópicos de glutamato y GABA en cerebelo. Alteraciones en modelos animales de encefalopatía hepática

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Análisis de la expresión en membrana de receptores ionotrópicos de glutamato y GABA en cerebelo. Alteraciones en modelos animales de encefalopatía hepática TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNO/A: Ricardo Santamaría Adame TUTORES: Dra. Andrea Cabrera Pastor y Dr. Vicente Felipo Curso Académico: 2014/2015 VALENCIA, Julio de 2015 ALUMNO: Ricardo Santamaría Adame TUTORES: Dra. Andrea Cabrera Pastor y Dr. Vicente Felipo FECHA: Valencia, Julio de 2015 TÍTULO: Análisis de la expresión en membrana de receptores ionotrópicos de glutamato y GABA en cerebelo. Alteraciones en modelos animales de encefalopatía hepática RESUMEN La encefalopatía hepática (EH) es un síndrome neuropsiquiátrico complejo que puede presentarse en pacientes con enfermedades hepáticas crónicas o agudas. Se caracteriza por una progresiva alteración de las funciones cognitivas, motoras y del sueño como consecuencia del fallo hepático y puede progresar en diferentes estadios hasta el coma y la muerte. Los mecanismos que conducen a las alteraciones neurológicas en la EH todavía no están bien establecidos pero comienzan a identificarse en modelos animales (Felipo V., Nature Reviews Neuroscience, 2013). La hipótesis más aceptada actualmente acerca de las bases neurobiológicas de la EH apuntan a una combinación sinérgica de dos factores: la elevada concentración de amonio o hiperamonemia, debida a la deficiente eliminación en el hígado de esta toxina y la neuroinflamación. Estos dos factores conducen a alteraciones en la neurotransmisión glutamatérgica y GABAérgica que son responsables del deterioro cognitivo y motor. Uno de los mecanismos que podría contribuir a la alteración de la neurotransmisión es un cambio en la expresión en membrana de receptores de los neurotransmisores glutamato y GABA. El presente trabajo pretende analizar cómo afecta la EH a la expresión en membrana, en cerebelo, de receptores ionotrópicos (NMDA, AMPA y GABA) implicados en procesos de aprendizaje y memoria, así como de los transportadores encargados de retirar el neurotransmisor glutamato de la hendidura sináptica tras su liberación. Se utilizarán cortes de cerebelo ex vivo de diferentes modelos animales de EH para estudiar la posible alteración de la expresión en membrana de dichos receptores y su implicación en el deterioro cognitivo y motor. PALABRAS CLAVE: Encefalopatía hepática, hiperamonemia, transportadores de glutamato, receptores ionotrópicos, NMDA, AMPA, GABA, expresión en membrana. STUDENT: Ricardo Santamaría Adame PROFESSORS: Dra. Andrea Cabrera Pastor y Dr. Vicente Felipo DATE: July 2015, Valencia TITLE: Analysis of membrane expression of ionotropic glutamate and GABA receptors in cerebellum. Alterations in animal models of hepatic encephalopathy ABSTRACT Hepatic encephalopathy is a complex neuropsychiatric syndrome that can occur in patients with acute or chronic liver disease. It is characterized by a progressive alteration of cognitive, motor and sleep as a result of liver failure functions and can progress at different stages to coma and death. The mechanisms leading to neurological disorders in HE are not yet well established but begin to identify in animal models (Felipo V., Nature Reviews Neuroscience, 2013). The most widely accepted about the neurobiological basis of HE hypothesis point to a synergistic combination of two factors: the high concentration of ammonium or hyperammonemia due to poor elimination in the liver of this toxin and neuroinflammation. These two factors lead to abnormalities in glutamatergic and GABAergic neurotransmission are responsible for cognitive and motor impairment. One of the mechanisms that could contribute to impaired neurotransmission is a change in expression of membrane receptors for the neurotransmitters glutamate and GABA. This paper analyzes how HE affects the membrane expression, in cerebellum, of ionotropic receptors (NMDA, AMPA and GABA) involved in learning and memory as well as transporters responsible for removing the neurotransmitter glutamate of the synaptic cleft after his release. We will be used slices of cerebellum ex vivo in different animal models of HE to study the possible alteration of the membrane expression of these receptors and their involvement in cognitive and motor impairment. KEY WORDS: Hepatic encephalopathy, hyperammonemia, glutamate transporters, ionotropic receptors, NMDA, AMPA, GABA, membrane expression. AGRADECIMIENTOS Me gustaría dedicar especialmente este trabajo, que tantas horas me ha costado, a la persona que más lo ha sufrido todo este tiempo, tanto en los buenos como en los peores y más estresantes momentos. Sí, te lo dedico especialmente a ti, Andrea, por estar siempre a mi lado. Sin embargo, sería injusto no compartir este agradecimiento con quien, sin duda, han sido igual de importantes. A mis padres, a quien debo todo lo que he conseguido hasta ahora. Y a mis abuelos, todos, quienes cada uno a su modo también me han ayudado en todo lo que ha estado en sus manos. También quiero acordarme de mis compañeros, especialmente de quienes han estado cerca de mí estos últimos meses, que me hayan dado el empujón moral que quizás también necesitaba. Por último, agradecer al laboratorio de Neurobiología del Centro de Investigaciones Príncipe Felipe, especialmente a Lucas y Andrea, que me han enseñado todo lo que por ahora se, que me hayan concedido la oportunidad de trabajar con ellos. ÍNDICE 1INTRODUCCIÓN ......................................................................................... 1 1.1 Encefalopatía Hepática ............................................................................................... 1 1.2 Modelos Animales ....................................................................................................... 2 1.3 Principales factores que contribuyen a la EH ........................................................... 3 1.4 Neurotransmisión y su relación con la EH ................................................................ 4 1.4.1 Neurotransmisión glutamatérgica................................................................................. 4 1.4.2 Neurotransmisión GABAérgica ................................................................................... 7 1.4.3 Alteración de la neurotransmisión en la EH ................................................................. 8 1.5 Estado actual y terapias emergentes ........................................................................ 10 2OBJETIVOS ................................................................................................ 12 3MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................... 13 3.1 Modelos Animales ..................................................................................................... 13 3.2 Obtención de las muestras ........................................................................................ 13 3.3 Tratamiento de las muestras .................................................................................... 13 3.4 Determinación de la cantidad de proteína .............................................................. 15 3.5 Análisis del contenido de proteínas totales y de membrana por Western-Blot ... 15 3.6 Análisis estadísticos ................................................................................................... 17 4RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................. 18 4.1 Expresión en membrana de transportadores y receptores ionotrópicos de glutamato y GABA en modelo de hiperamonemia crónica sin fallo hepático en condiciones basales ................................................................................................................................................. 18 4.1.1 La expresión en membrana basal de las subunidades (NR1, NR2A, GluR1 y GluR2) de receptores ionotrópicos de glutamato está disminuida en hiperamonemia crónica ........ 18 4.1.2 La expresión en membrana basal de la subunidad GABAα1 del receptor GABA está disminuida en hiperamonemia crónica ................................................................................ 22 4.1.3 La expresión en membrana de los transportadores de glutamato GLT-1 y EAAC1 está disminuida en condiciones basales de hiperamonemia crónica .......................................... 23 4.2. Expresión en membrana del transportador de glutamato EAAC1 tras la activación del receptor AMPA a diferentes dosis y tiempos de incubación con un agonista ............ 25 4.2.1 El tratamiento con AMPA altera la expresión en membrana del transportador EAAC1 observándose un efecto dosis y un efecto tiempo ............................................................... 26 5CONCLUSIONES ....................................................................................... 31 6BIBLIOGRAFÍA ......................................................................................... 32 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Subunidades de los distintos receptores ionotrópicos. ............................................ 8 Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados con su correspondiente dilución. .....................................................................................................................................................16 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Vía Glutamato-Óxido Nítrico-GMPcíclco ............................................................. 6 Figura 2. Sistema de perfusión. ............................................................................................. 14 Figura 3. Representación de un Western-Blot con BS3 ....................................................... 17 Figura 4. La expresión basal en membrana de las subuniades NR1 (a) y NR2A (b) está disminuida en cerebelo de ratas hiperamonémicas ................................................................18 Figura 5. La expresión en membrana de las subunidades GluR1 (a) y GluR2 (b) está disminuida en cerebelo de ratas hiperamonémicas. ...............................................................19 Figura 6. La expresión en membrana de la subunidad GABAα1 está disminuida en cerebelo de ratas hiperamonémicas en condiciones basales. .................................................22 Figura 7. La expresión basal en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 (a) y Glt-1 (b) está disminuida en cerebelo de ratas hiperamonémicas ................................24 Figura 8. Resumen de las alteraciones de la expresión en membrana de los receptores NMDA, AMPA y GABA y de los transportadores de glutamato EAAC1 y Glt-1 en ratas con hiperamonemia crónica .....................................................................................................25 Figura 9. Expresión en membrana de EAAC1 tras la activación del receptor AMPA a diferentes dosis y tiempo en ratas control e hiperamonémicas .............................................27 Figura 10. Resumen de la expresión en membrana del transportador EAAC1 tras la activación del receptor AMPA en ratas control .....................................................................28 Figura 11. Resumen de la expresión en membrana del transportador EAAC1 tras la activación del receptor AMPA en ratas hiperamonémicas ...................................................29 Abreviaturas EH: Encefalopatía Hepática EHM: Encefalopatía Hepática Mínima PHES: Psychometric Hepatic Encephalopathy Score ISHEn: International Society for Hepatic Encephalopathy and Nitrogen Metabolism PCS: Porta-Caval Shunt (Anastomosis Porta-Cava) TNFα: Factor Necrosis Tumoral α AINE: Antiinflamatorio no esteroideo GABA: ácido γ-aminobutírico EAAT: Transportador de aminoácidos excitadores (Excitatory Amino Acid Transporter) GLAST: Transportador Glutamato Aspartato (GLutamate ASpartate Transporter) Glt-1: Transportador de glutamato glial 1 (Glial glutamate transporter 1) EAAC1: Transportador de aminoácidos excitatorios 1 (Excitatory Amino Acid Carrier 1) iGluR: Receptor de glutamato ionotrópico NMDA: N-metil-D-aspartato AMPA: α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico GMP: Guanosín monofosfato GMPc: Guanosín monofosfato cíclico CAMKII: protein quinasa dependiente de calcio/calmodulina NOS: Óxido Nítrico Sintasa CM: Calmodulina NO: Óxido Nítrico GC: Guanilato Ciclasa LTP: Potenciación a Largo Plazo Na+: Ion Sodio Ca2+: Ion Calcio SNr: Substancia nigra pars reticulata Cl-: Ion Cloro mRNA: Ácido Ribonucleico mensajero LTD: Depresión a Largo Plazo p/p: Porcentaje en peso M: Molar mM: miliMolar NaCl: Cloruro de Sodio KCl: Cloruro de Potasio KH2PO4: Fosfato de Monopotasio NaHCO3: Bicarbonato de Sodio O2: Oxígeno CO2: Dióxido de Carbono µm: micrómetros Tris: Tris(hidroximetil)aminometano HCl: Ácido Clorhídrico SDS: Dodecilsulfato de Sodio EGTA: Etilen Glicol Ácido Tetraacético NaF: Fluoruro de Sodio APS: Persulfato de Amonio TEMED: Tetrametiletilenediamina TBS: Tris-buffered saline MgCl2: Cloruro de Magnesio NBT: Tetrazolium, (3,3'-dimethoxy-4,4'-biphenylene)bis[2,(4-nitrophenyl)-5-phenyl-2H] BCIP: 1H-Indol-3-ol, 5-bromo-4-chloro-dihydrogen phosphate BS3: Bis[sulfosuccinimidyl] Suberate BCA: Ácido Bicinconínico BSA: Albúmina de Suero Bovino nm: nanómetros ºC: Grados Centígrados µg: microgramos mA: miliAmperios PVDF: Polifluoruro de Vinilideno f.a.: fosfatasa alcalina ANOVA: Análisis de la Varianza SEM: Error Estándar de las Medias PKC: Proteína Quinasa C PKA: Proteína Quinasa AMPc-dependiente AMPc: Adenosín Monofosfato cíclico Introducción 7 puede llevar a la activación de los receptores NMDA al despolarizar la membrana neuronal (Xin et al, 2005; Salonen et al, 2006; Cabrera-Pastor et al, 2012). La activación de los receptores AMPA o NMDA aumenta el glutamato extracelular (Kakizawa et al, 2005). Debido a la dualidad de los receptores AMPA (alta y baja afinidad), la cantidad de glutamato liberado al exterior de la célula variará en función de la concentración de agonista que lo active, y por lo tanto, la cantidad de transportadores de glutamato que serán movilizados para compensar este aumento también será variable. Además, este aumento altera la vía glutamato-óxido nítrico-cGMP además de causar alteraciones como por ejemplo hipoquinesia debida al aumento de la concentración de glutamato extracelular en la substancia nigra pars reticulata (SNr) (Felipo V. 2013). Receptores de kainato: tetrámeros formados por las subunidades GluR5, GluR6, GluR7, KA1 y KA2 formando tetrámeros, pudiendo ser homotetrámeros de alguna de las subunidades GluR5-7 o si está formado por las subunidades KA1-2 mezcladas con subunidades GluR5-7. 1.4.2 Neurotransmisión GABAérgica La mayoría de las sinapsis inhibitorias del sistema nervioso central utilizan el ácido γamimobutírico (GABA) o la glicina como neurotransmisor. Existen tres tipos distintos de receptores GABA (GABAA/B/C). La subfamilia GABAA, son una serie de receptores ionotrópicos formados por pentámeros de las distintas subunidades (α, β, γ, δ y ρ). Los receptores GABAérgicos permiten la entrada de Clinhibiendo las células postsinápticas. Dada su alta variedad, la función de estos receptores varía según el tipo neuronal. La subfamilia GABAb son receptores metabotrópicos formados por heterodímeros de sus dos subunidades GABAb R1 y R2. El mecanismo de eliminación de GABA es similar al del glutamato. Tanto las propias neuronas como las células gliales poseen transportadores de alta afinidad por GABA denominados GAT, que restauraran los niveles normales de GABA tras su liberación por la neurona pre-sináptica, previniendo la activación excesiva de los receptores (Chiu et al. 2005). La neurotransmisión GABAérgica juega un papel fundamental en la coordinación motora que está regulada principalmente por el cerebelo. Hanchar et al. 2005 demostraron que los niveles de glutamato extracelular procedente de células granulares o GABA procedente de las células de Purkinje u otras regiones controlan la coordinación motora. La neurotransmisión GABAérgica está implicada en la sintomatología de la EH (Schafer y Jones, 1982). Diversos estudios han demostrado que el aumento de GABA extracelular deteriora la coordinación Introducción 8 motora (Chiu et al., 2005; Hanchar et al., 2005, Boix et al., 2010). Además, estudios previos en este laboratorio demuestran un aumento del tono GABAérgico en ratas hiperamonémicas como resultado del aumento del GABA extracelular y de algunos neuroesteroides que los modulan positivamente (Cauli et al. 2009a). El aumento del tono GABAérgico podría ser responsable de la incoordinación motora en modelos de hiperamonemia y EH. Tabla 1. Subunidades de los distintos receptores ionotrópicos. * Subunidades que serán estudiadas en el presente trabajo 1.4.3 Alteración de la neurotransmisión en la EH La correcta expresión y localización subcelular de todos estos receptores ionotrópicos (tanto glutamatérgicos como GABAérgicos) es clave en el correcto funcionamiento de la neurotransmisión. El cambio en la concentración de estos receptores afectará a como la célula responde al impulso nervioso, alterando la posterior transducción de señales y la plasticidad sináptica, clave en procesos de aprendizaje y memoria. Por otro lado, la expresión y localización correctas de los transportadores de glutamato son también claves en el mantenimiento de la respuesta excitatoria rápida, siendo además tóxicas las altas concentraciones de glutamato si éstas no son correctamente eliminadas. La correcta expresión en membrana de receptores y transportadores está determinada por un conjunto complejo de procesos celulares, cuya alteración causaría un desorden en esta expresión. Se requiere un balance de: transcripción, niveles correctos de mRNA, traducción, estabilidad de las proteínas, ensamblaje correcto y correcta localización en la membrana celular (Traynelis et al., 2010). Por otro lado, las modificaciones postraduccionales (sobre todo Introducción 9 mediante fosforilaciones), también serán determinantes en su función: regulación del tráfico hacia la membrana, endocitosis, localización sináptica y unión a otras proteínas (Malinow and Malenka, 2002). La alteración en los receptores de neurotransmisores afecta también a la adaptación de las sinapsis en respuesta a los estímulos que reciben. En concreto, esta alteración afectará a la plasticidad sináptica característica de los receptores en la hendidura sináptica. Las conexiones entre las sinapsis neuronales no son estáticas sino que pueden sufrir cambios en respuesta a experiencias previas de la célula, permitiendo que ciertos estímulos externos potencien ciertas sinapsis y debiliten otras. Este proceso de plasticidad sináptica es la base de la memoria y el aprendizaje. La alteración de esta plasticidad contribuye al deterioro cognitivo en patologías tan graves como el Alzheimer, trastornos autistas o retraso mental. La alteración en los niveles de receptores de neurotransmisores en la membrana sináptica dará lugar a que no se consiga una correcta plasticidad causando los problemas de memoria y aprendizaje observados en pacientes con EH. Dos fenómenos clave involucrados en la plasticidad sináptica son la potenciación y depresión a largo plazo (LTP Long-term potentiation y LTD Long-Term depression). La LTP consiste en un aumento persistente del componente excitador de la respuesta sináptica, que se traduce en un aumento de la eficacia sináptica que se mantiene en el tiempo. La LTP en hipocampo se considera una de las bases de la memoria y el aprendizaje (Cooke y Bliss, 2006). Además del papel ya mencionado del cerebelo como principal responsable de la función y coordinación motora, otros estudios lo relacionan también con el aprendizaje motor (Vezina y Kim, 1999), la memoria de trabajo (Wiggs et al., 1999) e incluso en ciertas funciones cognitivas como la atención viso-espacial, mecanismos de aprendizaje, planificación y adecuación temporal y en la modulación verbal (Gordon, 2007). Martin et al. (2003) también demostraron que el cerebelo juega un papel en el aprendizaje espacial. La LTD produce una reducción en la eficacia de la sinapsis neuronal. Las regiones principales en las que se da son también el hipocampo y el cerebelo pero puede ocurrir en otras regiones. Una correcta expresión y localización de receptores es clave para mantener la correcta neurotransmisión y plasticidad en el sistema nervioso central. Tanto receptores como transportadores pueden verse alterados por la EH. Y cualquiera de las siguientes condiciones podría ser la causante del deterioro cognitivo asociado a la alteración de la neurotransmisión (Monfort et al., 2002): Introducción 10 - La cantidad tanto de receptores como de transportadores. Esta alteración puede ser debida a un fallo en su expresión, síntesis y/o degradación. Cualquiera o una combinación de éstos podría dar lugar a una alteración de los niveles normales en membrana. - La regulación de su localización espacial. Aunque la cantidad de receptores o transportadores no se haya visto alterada, un error en la localización de éstos en la membrana alteraría su función, ya que sólo reconocen ligandos extracelulares. - La función de los receptores y transportadores, ya que están regulados por distintos mecanismos como fosforilación-defosforilación, unión de co-agonistas, etc. - Alteración en la liberación o en la recaptación (transportadores) del neurotransmisor. - Alteraciones en cualquier paso de las vías de transducción de señales asociadas a los diferentes tipos de receptores, pueden dar como resultado una neurotransmisión alterada. 1.5 Estado actual y terapias emergentes La potente investigación llevada a cabo en la última década ha dado como resultado diversos nuevos enfoques tanto para el tratamiento de la EH como para el diagnóstico temprano de la EHM, permitiendo anticiparse a sus síntomas clínicos. Para el tratamiento de la EH crónica, tradicionalmente se ha intentado reducir los niveles de amonio reduciendo la cantidad de proteínas en la dieta o la producción de éste por la flora intestinal mediante antibióticos como la neomicina. Estudios recientes indican que la rifaximina es el antibiótico más efectivo (Bass et al., 2010). También se utiliza lactulosa para acidificar el lumen intestinal y reducir el transporte de amonio al torrente sanguíneo. La investigación realizada en la última década ha dado lugar a una serie de nuevas estrategias terapéuticas que actúan sobre dianas en el cerebro implicadas en el deterioro cognitivo y motor. Como hemos visto, la reducción del GMPc por la alteración de la vía glutamato-óxido nítrico-GMPc es una de las responsables del deterioro en el aprendizaje. Aumentar los niveles de GMPc en cerebelo mediante un inhibidor de la fosfodiesterasa 5 restaura la función cognitiva en ratas con EHM (Monfort et al. 2007). Por otro lado, un antagonista de los receptores GABAA (como la bicuculina) restauran la capacidad de aprendizaje en ratas con EHM (Cauili et al. 2009). Por último, también se han desarrollado estrategias centradas en la reducción de la neuroinflamación. Se ha demostrado que el tratamiento con ibuprofeno en ratas restauraba las alteraciones cognitivas y motoras pero, en pacientes con fallo hepático, el ibuprofeno podría inducir en el paciente fallo renal. Por lo tanto, Introducción 11 se han probado otro tipo de antiinflamatorios como los inhibidores de p38. Este inhibidor reduce la activación de la microglía reduciendo la neuroinflamación sin afectar a los riñones y restaura la función cognitiva y motora en ratas con EH (Agusti et al., 2011). Objetivos 12 2OBJETIVOS El principal objetivo del presente trabajo es analizar la expresión en membrana de transportadores de glutamato y de diferentes subunidades de receptores ionotrópicos de glutamato y de GABA implicados en la neurotransmisión, en cerebelo de ratas control y estudiar si están alterados en ratas con hiperamonemia crónica. Los objetivos concretos son: 1. Analizar la expresión en membrana de receptores NMDA (subunidades NR1 y NR2A), AMPA (subunidades GluR1 y GluR2) y GABA (subunidad GABAα1) en cerebelo de ratas control en condiciones basales. 2. Analizar la expresión en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 y GLT-1 en cerebelo de ratas control en condiciones basales. 3. Estudiar si la hiperamonemia altera la expresión en membrana de los receptores ionotrópicos NMDA (subunidades NR1 y NR2A), AMPA (subunidades GluR1 y GluR2) y GABA (subunidad GABAα1), y los transportadores de glutamato EAAC1 y Glt-1 en condiciones basales. 4. Evaluar el efecto de la activación de receptores AMPA sobre la expresión en membrana del transportador de glutamato EAAC1 en cortes de cerebelo ex vivo y sus posibles alteraciones en hiperamonemia. Materiales y Métodos 13 3MATERIALES Y MÉTODOS 3.1 Modelos Animales De los modelos animales antes mencionados, para el desarrollo de esta experimentación se utilizó el modelo de hiperamonemia crónica sin fallo hepático, diseñado en este laboratorio (Felipo et al., 1988; Azorin et al, 1989). Éste consiste en elevar el nivel de amonio en sangre de las ratas modelo mediante una dieta rica en amonio (25% acetato amónico p/p) durante un mínimo de 3 semanas. Esta dieta provoca un aumento sostenido de los niveles de amonio tanto en sangre como en tejidos (41, 37 y 51% respectivamente en cerebro, hígado y músculo), simulando así las condiciones de un paciente con problemas crónicos hepáticos. Los niveles de urea en sangre alcanzan ≈ 16 mM y la eliminación de urea es de 25 mmoles/24 h, aproximadamente el doble que en las ratas control. 3.2 Obtención de las muestras Se decapitaron las ratas y se les extrajo el cerebelo. Se sumergieron en solución Krebs (en mM: NaCl 119, KCl 2.5, KH2PO4 1, NaHCO3 26.2, CaCl2 2.5 y glucosa 11), enfriada con hielo y se burbujearon con carbógeno (95% O2 y 5% de CO2). Se hicieron cortes transversales de unos 400 µm con un Vibrótomo (LEICA, Vt1000s), cuidando siempre que los cortes estén en solución Krebs y correctamente burbujeados con carbógeno. 3.3 Tratamiento de las muestras Una vez obtenidas las muestras, se pasan a los pocillos del incubador (Campden Instruments, Ltd. Modelo 745) (Figura 2), que cuenta con un sistema de perfusión que permite que a los pocillos llegue la solución elegida (Krebs burbujeado con carbógeno o tratamiento). La temperatura es constante a lo largo de todo el experimento a 35ºC, monitorizada con un controlador de temperatura. Materiales y Métodos 14 Figura 2. Sistema de perfusión. Se colocaron 4 cortes de cerebelo en cada pocillo y se estabilizaron durante 20 minutos con solución Krebs. Para estudiar la cantidad de receptores o transportadores basales tanto en condiciones fisiológicas como en hiperamonemia, los cortes fueron únicamente estabilizados en Krebs. Además, para el estudio de la expresión del transportador de glutamato EAAC1 en respuesta a la activación del receptor AMPA, tras la estabilización, se añade 1 mL de tratamiento con el agonista AMPA en cada pocillo. Las concentraciones de AMPA utilizadas fueron: un basal sólo con Krebs, 0.3, 1 y 2 mM de AMPA, tanto para los cortes de ratas control como hiperamonémicas. A su vez, cada tratamiento se realizó a tiempos distintos. Los tiempos de tratamiento fueron de 8 y 15 minutos. Tras la estabilización y el tratamiento, se transfirieron los cortes de cada pocillo a dos tubos distintos. Uno de ellos con el crosslinker BS3 (Bis[sulfosuccinimidyl] suberate) (Pierce, Rockford, IL) 2 mM, y el otro sólo con Krebs. El BS3 es un crosslinker que se unirá específicamente a proteínas de membrana, provocando que éstas se queden en los pocillos del gel de acrilamida y permitiéndonos determinar únicamente la cantidad de proteína de membrana. Se mantienen los tubos en agitación continua a una temperatura de 4ºC durante 30 minutos y, posteriormente, se detiene la reacción añadiendo glicina (100 mM en Krebs) durante otros 10 minutos a 4ºC. Por último, se transfirieron los cortes a un tubo con 200 µL de tampón de fosforilación (Tris-HCl 66 mM pH 7.4, SDS 1%, EGTA 1 mM, Glicerol 10%, Leupeptina 0.2 mg/mL, NaF 1 mM, Na orto-vanadato 1 mM), y se homogenizaron por sonicación durante 20 segundos. Después, se guardó una alícuota para la determinación de la cantidad de proteína y se almacenaron las muestras a -20ºC. Materiales y Métodos 15 3.4 Determinación de la cantidad de proteína Se cuantificó la cantidad de proteína de cada muestra por duplicado por el método colorimétrico del ácido bicinconínico (BCA Protein Assay Kit, Thermo). Se colocó una curva patrón con BSA (Albúmina de Suero Bovino), y las muestras por duplicado. Se añadieron los reactivos Pierce® BSA Protein Assay Reagents A y B, y se incubó la placa a 37 ºC durante 30 minutos. Por último se midió la absorbancia a 570 nm. 3.5 Análisis del contenido de proteínas totales y de membrana por Western-Blot Se separaron las proteínas mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% con SDS. La muestra se diluyó (1:1) en tampón de carga 2x (Tris-HCl 0.5 M a pH 6.8, Glicerol 5%, SDS 10%, 2-Mercaptoetanol 2.5%, Bromofenol 1%). Y se hirvieron a 100 ºC durante 5 minutos en un termoblock. La cantidad de proteína por muestra fue de 100, 200 o 250 µg según la proteína a analizar. Los geles de poliacrilamida constan de dos partes. La parte superior o “stacking” (Tris Base 0.125 M, 0,1% SDS a pH 6.8, Acrilamida 3.9%, Bisacrilamida 0.015%, APS 0,04% y TEMED), que facilita la concentración de la muestra en una banda estrecha antes de que entre en la segunda parte del gel o “separating” (Tris Base 0.4 M, 0.1% SDS, pH a 8.8, Acrilamida 8 %, Bisacrilamida 0.2%, APS 0.04% y TEMED), en el cual se separan las proteínas en función de su masa relativa. El tampón utilizado para la electroforesis fue el tampón “running” (Tris Base 0.3%, 0.02% SDS, Glicina 1.5%) y se realizó en geles grandes de 20 pocillos. La intensidad de corriente fue de 10 mA por gel durante 16 horas (overnight). Una vez finalizada la electroforesis, se transfirieron las proteínas a una membrana de PVDF (rehidratada previamente en metanol) en tampón de transferencia (Tris Base 0.025 M, Glicina 0.05 M), durante 5 horas a una intensidad de 250 mA. A continuación, se bloqueó la membrana con una solución de leche en polvo al 5% en TBS-Tween (NaCl 0.15 M, Tris Base 50 mM, Tween-20 0.05%, pH 7.5) durante 45-60 minutos y se incubaron con el anticuerpo primario específico (Tabla 2) diluido en BSA al 5% en TBSTween durante 16 horas en agitación a 4ºC. Se lavaron las membranas 4 veces durante 10 minutos con TBS-Tween y se incubó con el anticuerpo secundario correspondiente conjugado con fosfatasa alcalina, diluido también en la solución de BSA 5%, durante 1hora. Materiales y Métodos 16 Tabla 2. Anticuerpos primarios y secundarios utilizados con su correspondiente dilución. Anticuerpo 1º Dilución Anticuerpo 2ª Dilución Anti Glt-1 (ABCAM) 1:2000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti EAAC1 (ALPHA DIAGNOSTIC) 1:1000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti GABAα1 (ABCAM) 1:500 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti GluR1 (Calbiochem) 1:1000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti GluR2 (CHEMICON) 1:2000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti NR2A (UPSTATE) 1:1000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG conejo (Sigma) 1:4000 Anti NR1 (BD) 1:1000 Anti-IgG cabra-f.a.* contra IgG rata (Sigma) 1:4000 *f.a. Fosfatasa alcalina La membrana se lavó 4 veces durante 10 minutos con TBS-Tween y un último lavado de 10 minutos en tampón sustrato (NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 100 mM a pH= 9.5). Por último, se reveló utilizando un método colorimétrico para la enzima fosfatasa alcalina con una solución de revelado (NaCl 100 mM, MgCl2 5 mM, Tris-HCl 100 mM, 0.6% stock NBT, 0.35% stock BCIP, pH= 9.5). Las imágenes de las bandas fueron capturadas en un escáner Hewlett Packard Scanjet 5300C y la intensidad de las bandas fue cuantificada con el programa AlphaImager 2200 (AlphaEaseFC 2200 for Windows, Cambridge, UK). Resultados y Discusión 23 El estudio de la neurotransmisión GABAérgica en modelos de EH ha mostrado principalmente un aumento del tono GABAérgico en cerebelo (Cauli et al., 2009a y 2009b), que contribuye a las alteraciones cognitivas y motoras en la EH. Las posibles causas de este aumento del tono GABAérgico son: a) aumento en la cantidad de receptores GABA en la membrana post-sináptica, b) un aumento en el GABA extracelular y c) síntesis aumentada de neuroesteroides. Además, también se ha demostrado que la alteración en la liberación y captación del GABA puede ser debida a una alteración de los transportadores en astrocitos en modelos de hiperamonemia (Bender et al. 2000). Tanto la alteración en la liberación y captación de GABA por alteración en la expresión de sus transportadores, como la síntesis de neuroesteroides podrían aumentar el tono GABAérgico en el cerebelo. Como consecuencia, podría desarrollarse un proceso de adaptación similar al referenciado en los receptores de NMDA, por el que se intente de forma natural reducir ese aumento en el tono GABAérgico mediante la disminución de la expresión en membrana de su receptor, tal como indican nuestros resultados. 4.1.3 La expresión en membrana de los transportadores de glutamato GLT-1 y EAAC1 está disminuida en condiciones basales de hiperamonemia crónica De forma análoga se estudió la expresión basal en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 (localizado en neuronas) y GLT-1 (localizado en astrocitos). Se observó una disminución de ambos transportadores, de EAAC1 a un 73 ± 10% (p<0.01) y de GLT-1 a un 70 ± 11%) (p<0.05) (Figura 7). Resultados y Discusión 24 Figura 7. La expresión basal en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 (a) y Glt-1 (b) está disminuida en cerebelo de ratas hiperamonémicas. Los datos son la media ± error estándar de (a) 16 y (b) 8 ratas por grupo. *diferencia significativa respecto al control (p<0.05); ** diferencia significativa respecto al control (p<0.01). El glutamato es el principal neurotransmisor excitador en cerebro. La acumulación excesiva de glutamato en el medio extracelular es neurotóxica y puede inducir degeneración y muerte neuronal. Por lo tanto, la correcta eliminación de éste no sólo afectará al correcto funcionamiento de la neurotransmisión sino también a la supervivencia de la neurona. Un aumento basal en los niveles de glutamato extracelular ha sido demostrado en modelos de hiperamonemia y fallo hepático agudo (J. de Knegt et al. 1994). Una disminución en la expresión en membrana de los transportadores EAAC1 y Glt-1 llevará asociado un aumento del glutamato extracelular ante la imposibilidad de poder recaptarlo, con un aumento de la toxicidad asociado a hiperexcitabilidad y exocitotoxicidad (Butterworth 2002). Esta es una hipótesis ya planteada por Vaquero y Butterworth (2006) y que nuestros resultados apoyan. Diferentes estudios obtienen resultados similares. Raghavendra et al. (1998) y Norenberg et al. (1997) observan una disminución en la expresión génica de Glt-1 en modelos de daño cerebral e hiperamonemia, respectivamente. Suarez et al. 2000 también obtienen una disminución en los niveles de expresión de Glt-1 y EAAC1 en cerebelo de ratas con anastomosis porta-cava. Observan que el mRNA de Glt-1 en modelo de fallo hepático agudo Resultados y Discusión 25 estaba disminuido. Así pues, la represión de la expresión génica podría ser una posible causa de la disminución de la expresión en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 y Glt-1. Como conclusión, la expresión en membrana de las subunidades NR1 y NR2A del receptor NMDA, GluR1 y GluR2 del receptor AMPA y GABAα1 del receptor GABA está disminuida en ratas con hiperamonemia crónica (Figura 8). En consecuencia, esto podría alterar la neurotransmisión y contribuir a las alteraciones en la función cognitiva y motora en pacientes con encefalopatía hepática. Figura 8. Resumen de las alteraciones de la expresión en membrana de los receptores NMDA, AMPA y GABA y de los transportadores de glutamato EAAC1 y Glt-1 en ratas con hiperamonemia crónica. Tanto los receptores ionotrópicos de NMDA, AMPA y GABA como los transportadores EAAC1 y Glt-1 tienen disminuida su expresión en membrana. 4.2 Expresión en membrana del transportador de glutamato EAAC1 tras la activación del receptor AMPA a diferentes dosis y tiempos de incubación con un agonista Una vez estudiada la expresión basal tanto de receptores como de transportadores, analizamos la expresión en membrana del transportador de glutamato EAAC1 en respuesta a la unión de AMPA a su receptor. La activación de los receptores AMPA y/o NMDA provoca un aumento rápido de la expresión en membrana del transportador de glutamato EAAC1 (Waxman et al, 2007). Además, estudios de microdialisis in vivo han demostrado que la unión de un agonista a estos receptores aumentaba los niveles de glutamato extracelular, y esta podría aumentar la Resultados y Discusión 26 translocación de EAAC1 en membrana, para recaptar el exceso de glutamato. La secuencia de eventos en orden cronológico sería la siguiente: activación de los receptores AMPA y/o NMDA, aumento del glutamato extracelular, aumento en la expresión en membrana de EAAC1, recaptación del glutamato por éste y rápida disminución del glutamato extracelular hasta alcanzar niveles basales. En este proceso, los receptores AMPA de alta y baja afinidad podrían jugar un papel clave. Los receptores AMPA de alta afinidad no alteran los niveles de glutamato extracelular pero los de baja afinidad si, aumentando transitoriamente hasta que disminuye a niveles basales por el aumento de la expresión de EAAC1 (Cabrera-Pasor et al., 2015 enviado, no publicado). Como hemos visto anteriormente, la hiperamonemia provoca un descenso en la expresión en membrana basal de los receptores ionotrópicos. Además, se ha visto en estudios de microdialisis in vivo un efecto de la hiperamonemia sobre la liberación de glutamato tras la activación de los receptores AMPA a diferentes concentraciones. Por todo ello, en este trabajo estudiamos cómo afecta el tratamiento con AMPA a la expresión en membrana del transportador EAAC1, y si existen diferencias en la respuesta a distintas concentraciones y a distintos tiempos de incubación con el agonista AMPA. Para ello se trataron cortes de cerebelo de ratas control e hiperamonémicas con 0.3, 1 y 2 mM de AMPA y cada uno de estos, a su vez, durante 8 o 15 minutos. 4.2.1 El tratamiento con AMPA altera la expresión en membrana del transportador EAAC1 observándose un efecto dosis y un efecto tiempo El tratamiento con diferentes concentraciones de AMPA induce cambios en la expresión en membrana de EAAC1. En ratas control, se observa un efecto dosis dependiente a los 8 minutos. A concentraciones bajas de AMPA (0.3 mM), la expresión en membrana de EAAC1 aumenta a 162 ± 44% y a concentraciones altas de AMPA (2 mM) disminuye progresivamente su expresión en membrana (49 ± 14%) (p<0.05). Esto parece indicar que el AMPA a altas concentraciones no sólo no aumenta sino que disminuye la expresión de EAAC1 en el tratamiento de 8 minutos. Sin embargo, en las ratas control, el tratamiento con AMPA de 15 minutos parece aumentar los niveles del transportador sin importar su concentración, manteniéndose en niveles similares de aumento (AMPA 0.3 mM = 170 ± 29% p<0.05; AMPA 1 mM = 182 ± 33% p<0.05 y AMPA 2 mM = 186 ± 24% p<0.05) (Figura 9 y 10). En las ratas hiperamonémicas, los tratamientos con AMPA tanto a los 8 como a los 15 minutos aumentan la expresión en membrana del transportador EAAC1 respecto tanto a su basal como al control, sin apreciarse un efecto de la dosis en ambos casos (Figura 9 y 11). Resultados y Discusión 27 El efecto del tiempo de tratamiento no se aprecia en las ratas hiperamonémicas, alcanzándose los niveles de expresión en membrana de forma similar tanto en distintas dosis como a distintos tiempos. Sin embargo, en las ratas control hay un efecto significativo del tiempo, a concentraciones de 1 y 2 mM de AMPA (p<0.05 y p<0.01 respectivamente) (Figura 9,10 y 11). Figura 9. Expresión en membrana de EAAC1 tras la activación del receptor AMPA a diferentes dosis y tiempo en ratas control e hiperamonémicas. La expresión en membrana de EAAC1 en ratas control a los 8 minutos de tratamiento parece seguir un efecto dosis, disminuyendo su expresión hasta alcanzar niveles inferiores al basal a concentraciones de 2 mM. A los 15 minutos la expresión aumenta de forma similar a distintas concentraciones, desapareciendo el efecto dosis. En las ratas hiperamonémicas, a los 8 y 15 minutos de tratamiento se alcanzan niveles de expresión superiores al control basal, sin observarse el efecto dosis. Los datos son la media ± error estándar de 15 ratas por grupo. *diferencia significativa respecto al control basal (p<0.05); *** diferencia significativa respecto al control basal (p<0.001); b diferencia significativa entre 8 y 15 minutos (p<0.05); bb diferencia significativa entre 8 y 15 minutos (p<0.01); a diferencia significativa respecto al basal de hiperamonemia (p<0.05); aa diferencia significativa respecto al basal de hiperamonemia (p<0.01) Resultados y Discusión 28 Figura 10. Resumen de la expresión en membrana del transportador EAAC1 tras la activación del receptor AMPA en ratas control. En el tratamiento de 8 minutos se observa un mayor aumento de la expresión de EAAC1 a concentraciones de 0.3 mM de AMPA, un menor aumento a concentraciones de 1 mM de AMPA y un descenso a concentraciones de 2 mM (efecto dosis). En el tratamiento de 15 minutos se observa un aumento de la expresión en membrana de EAAC1 que no se ve alterada por la dosis. Resultados y Discusión 29 Figura 11. Resumen de la expresión en membrana del transportador EAAC1 tras la activación del receptor AMPA en ratas hiperamonémicas. En hiperamonemia tanto la expresión basal del receptor AMPA como la del transportador EAAC1 están disminuidas. La activación del receptor AMPA aumenta los niveles de expresión en membrana de EAAC1 alcanzado niveles significativamente aumentados respecto a su basal, independientemente de la concentración y el tiempo del tratamiento. Para explicar estos resultados, y como se ha comentado anteriormente (ver Introducción), se pueden distinguir receptores AMPA de baja y alta afinidad. Los receptores AMPA de alta afinidad inhiben a los receptores NMDA a través de un mecanismo no ionotrópico basado en el estado de apertura del receptor AMPA (abierto, cerrado o desensibilizado) similar a un mecanismo de unión a ligando (Bai et al., 2002). Una inhibición de los receptores NMDA disminuirá la expresión en membrana de EAAC1. Esto explicaría el efecto dosis encontrado en el tratamiento con AMPA de 8 minutos en ratas control, en el que a mayor concentración menor expresión en membrana del transportador se observa. Como altas concentraciones de AMPA inhibirían en mayor medida los receptores NMDA, este resultado concuerda con el obtenido por Cabrera-Pastor et al. (2012) donde la liberación de glutamato con 0.1 mM de AMPA fue mayor que a una concentración de 0.3 mM en ratas control. Trussell et al. (1993) demostraron que altas concentraciones de neurotransmisor podían desensibilizar los receptores AMPA. Otra posible explicación a este efecto dosis sería que el aumento de glutamato inducido tras la activación de los receptores AMPA, producirá una desensibilización de éstos a altas concentraciones de AMPA, lo que conduciría a la disminución de la expresión de EAAC1. Resultados y Discusión 30 El efecto del tiempo de tratamiento sobre la expresión de EAAC1 en membrana en ratas control podría deberse a una estabilización de los niveles tras un periodo de adaptación. En las ratas hiperamonémicas no se observa efecto del tiempo ni de la dosis en los niveles de expresión del transportador, en todos los casos aumentan significativamente su expresión en membrana respecto a su basal. Como conclusión final, podemos afirmar que la hiperamonemia crónica altera la expresión en membrana de receptores y transportadores. Ésto alterará la neurotransmisión sináptica y en consecuencia, contribuirá a las alteraciones de la función cognitiva y motora en pacientes con encefalopatía hepática. Conclusiones 31 5CONCLUSIONES 1. La expresión en membrana de las subunidades NR1 y NR2A (receptor NMDA), GluR1 y GluR2 (receptor AMPA) y GABAα1 (receptor GABA) está disminuida en cerebelo de ratas con hiperamonemia crónica. 2. La expresión en membrana de los transportadores de glutamato EAAC1 y Glt-1 está disminuida en cerebelo de ratas con hiperamonemia crónica. 3. La unión del agonista AMPA a su receptor modula la expresión del transportador de glutamato EAAC1 dependiendo de la dosis y el tiempo tratamiento. 4. En ratas con hiperamonemia crónica está alterada la modulación de la expresión del transportador de glutamato EAAC1 tras la activación del receptor AMPA. 5. La hiperamonemia crónica altera la expresión en membrana de receptores y transportadores, esto alterará la neurotransmisión sináptica y en consecuencia contribuirá a las alteraciones en la función cognitiva y motora en pacientes con encefalopatía hepática. Bibliografía 32 6BIBLIOGRAFÍA AGUSTI, A.; CAULI, O.; RODRIGO, R.; LLANSOLA, M.; HERNÁNDEZ-RABAZA, V.; & FELIPO, V. (2011). p38 MAP kinase is a therapeutic target for hepatic encephalopathy in rats with portacaval shunts. Gut, 60(11), 1572-1579. AZORIN. 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