UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Diseño acional y ca ac e ización de
nanodisposi i os de sílice mesopo osa
pa a libe ación con olada en células
senescen es
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
ALUMNA: Regina Bou Pue o
TUTOR: José Ramón Mu guía Ibáñez
Cu so Académico: 2014/2015
VALENCIA, 7 de julio de 2015
Tí ulo del TFG
Diseño acional y ca ac e ización de nanodisposi i os de sílice mesopo osa pa a libe ación
con olada en células senescen es.
Au o a
Regina Bou Pue o
Ti ulación
G ado en Bio ecnología
Tu o
José Ramón Mu guía Ibáñez
Fecha y localidad de lec u a
Valencia, julio de 2015
ABSTRACT
The main goal o he cu en p ojec is he de elopmen and alida ion, in a cellula model
o senescence, o mesopo ous silica nanopa icles (MSNs) unc ionalized wi h galac o-
oligosaccha ides (GOS) which can selec i ely deli e hei ca go in senescen cells.
Cellula senescence is a s a e in which cells en e an i e e sible cell cycle a es and
acqui e an al e ed pheno ype cha ac e ized by hype -sec e ion. I is a p ocess igge ed by
s ess and cellula damage, and i cons i u es an al e na i e ou e o p og ammed cell dea h o
a oid cell damage p og ession. Howe e , accumula ion o hese cells al e s issue s uc u e,
being associa ed o aging and ela ed diseases, cance o idiopa hic pulmona y ib osis (IPF).
All oge he , i is necessa y o de elop he apeu ic s a egies selec i ely a ge ing senescen
cells.
The use o MSNs as con olled d ug deli e y sys em has been ex ensi ely exploi ed ecen ly
due o he ad an ages hey show. Among hem, biocompa ibili y, he mal and chemical
s abili y, homogeneous po e olume, high speci ic su ace a ea o con ain g ea e amoun s o
d ugs and he possibili y o su ace unc ionaliza ion wi h biomolecules ac ing as molecula
ga es, a e highligh ed. Molecula ga es a e sup amolecula de ices (DNA, pep ides, syn he ic
molecules, polyme s…) in which mass ans e is ini ia ed by an ex e nal s imuli, in such a way
ha molecules p e iously loaded in o he mesopo es o MSN a e eleased.
Conc e ely, ou g oup has de eloped a nanode ice able o deli e small molecules a ge ing
senescen cells. I is based in mesopo ous silica nanopa icles unc ionalized wi h galac o-
oligosaccha ides as molecula ga e. Senescen cells a ge ing is achie ed hanks o
inc emen ed β-galac osidase ac i i y (SA- β-gal). Howe e , in he p esen wo k a p oo o
concep is p oposed o demons a e ha speci ici y achie ed by ou nanode ice is no only
due o SA-β-gal, bu also o he p esence o GOS ecep o s in senescen cells su ace.
The nanode ice unc ionalized wi h GOS was s uc u ally and unc ionally alida ed,
showing speci ici y o senescen cells. Finally, we we e able o demons a e, h ough a p oo
o concep , ha senescen cells show an inc eased exp ession o galac o-saccha ides ecep o s
which ease he endocy osis o he syn hesized nanopa icle. Such knowledge could b ing
aluable in o ma ion o de elop in a u u e nanode ices unc ionalized wi h mo e selec i e
GOS o senescen cells loaded wi h cy o oxic compounds, and use hese nanode ices o ea
diseases such as cance .
Key wo ds
Mesopo ous Silica Nanopa icles (MSNs), cellula senescence, a ge ing.
RESUMEN
El obje i o p incipal del p esen e TFG es el desa ollo y alidación, en un modelo celula de
senescencia, de ma e iales mesopo osos de sílice (MSNs) uncionalizados con galac o-
oligosacá idos (GOS) que puedan libe a su ca ga de o ma selec i a en las células senescen es.
La senescencia celula es una condición en la que las células p esen an un es ado de a es o
i e e sible del ciclo celula y un eno ipo al e ado hipe sec e o . Se a a de un p oceso que se
inicia como espues a al es és y daño celula , y cons i uye una u a al e na i a de espues a a
la mue e celula p og amada pa a e i a la p og esión del daño. Sin emba go, la acumulación
de dichas células al e a la a qui ec u a isula , es ando elacionada con el en ejecimien o y
pa ologías elacionadas, cánce o ib osis pulmona idiopá ica (IPF). Po odo ello, es necesa io
dispone de es a egias e apéu icas di igidas que eliminen las células senescen es
selec i amen e.
El empleo de MSNs como sis ema de en ega con olada y di igida de á macos ha sido
ex ensamen e explo ado ecien emen e debido a las múl iples en ajas que p esen an. En e
es as des aca su biocompa ibilidad, es abilidad é mica y química, olumen de po o
homogéneo, al a supe icie especí ica pa a albe ga mayo can idad de á maco y la posibilidad
de uncionaliza su supe icie con biomoléculas que ac úen como pue a molecula . Las
pue as molecula es son disposi i os sup amolecula es (DNA, pép idos, moléculas sin é icas,
políme os, e c.) en los que exis e un anspo e de ma e ia iniciado po un es ímulo ex e no,
de o ma que as dicho es ímulo se libe an las moléculas p e iamen e a apadas en los
mesopo os del ma e ial MSN.
Conc e amen e, nues o g upo ha desa ollado un nanodisposi i o que iene la capacidad
de libe a de o ma con olada moléculas pequeñas exclusi amen e en células senescen es.
Dicho nanodisposi i o se basa en nanopa ículas mesopo osas de sílice, uncionalizadas con
galac o-oligosacá idos como pue a molecula . La especi icidad hacia las células senescen es se
consigue g acias a la ac i idad aumen ada β-galac osidasa asociada a dichas células (SA-β-gal).
Sin emba go, en el p esen e abajo se plan ea una p ueba de concep o pa a demos a
que la especi icidad conseguida con los nanodisposi i os sin e izados no se debe únicamen e a
SA-β-gal, sino que se hipo e iza la exis encia de ecep o es especí icos po GOS en la supe icie
de las células senescen es.
El nanodisposi i o uncionalizado con GOS ue alidado es uc u al y uncionalmen e,
mos ando especi icidad po las células senescen es. Finalmen e, se ha podido demos a
median e una p ueba de concep o que en las células senescen es exis e una
exp esión/sob eexp esión de ecep o es de galac o-azúca es que posibili an la endoci osis de
la nanopa ícula sin e izada. Dicho conocimien o pod ía pe mi i en un u u o el desa ollo de
nanodisposi i os uncionalizados con GOS más selec i os ca gados con compues os ci o óxicos
pa a las células senescen es como nan e apia pa a a a en e medades como el cánce .
Palab as cla e
Nanopa ículas Mesopo osas de Sílice (MSNs), senescencia celula , a ge ing.

AGRADECIMIENTOS
An es que nada, da las g acias a Jose a po b inda me es a opo unidad. Sabes cómo
ende e bien, pe o aun así no haces jus icia al mundo “nano”: es mucho más emocionan e y
p ome edo de lo que se puede imagina o explica con palab as. También ag adece a Ramón
que me acogiese en el g upo con los b azos abie os, abaja en él ha sido una de las mejo es
decisiones de mi oda ía co a ca e a bio ecnológica.
También quie o ap o echa la ocasión pa a ag adece a la Asociación Española Con a el
Cánce , no solo a í ulo pe sonal po la beca que me concedie on, sino sob e odo po apos a
po la in es igación y los jó enes españoles. Ese es el camino a segui pa a gana la ba alla
con a el cánce .
Cómo no, g acias a odas las chicas (y algún que o o chico) del Lab de Nanomedicina, y a oda
la gen e del 2.6. Po los almue zos, los consejos, la “IDM Fashion Week” y las isas, sob e odo
en los momen os de máxima desespe ación expe imen al. Todo el su imien o y ho as de
abajo han me ecido la pena sólo po conoce os y habe ap endido an o de oso os.
Finalmen e y no po ello menos impo an e…
G acias in ini as al “Equipo Senescencia”. C is, I ene, ha sido un place abaja con oso as.
I ene, que ha sido mi co u o a en la somb a y no se ha podido lle a ese econocimien o. Me
habéis dejado el lis ón muy al o, aho a a a se muy di ícil encon a unas compañe as de
labo a o io, p o es y amigas an buenas. Ojalá odo el mundo uese igual de compe en e, de
ag adable, de inspi ado , como lo sois oso as. G acias po odo lo que me habéis enseñado,
an o den o como ue a del lab (sí, home). Vos o a é a al a ! ¿Qué pasa á, qué mis e io
hab á? ¡Vues o Pa i o no os ol ida!
Po supues ísimo, g acias a mi amilia. G acias po la educación que me habéis dado y que me
ha pe mi ido llega has a aquí. Mis pad es, mi ejemplo a segui , mi mo i ación. Bicho, ú en as
en es a amilia. Ellos, que se aleg an más de mis ic o ias que yo misma, el pila inamo ible de
mi ida. P ome o se siemp e una buena in e sión y alguien de quien os sin áis o gullosos.
Y pa a acaba … G acias a La Pega ina. Vues a música y ues o buen ollo amenizan cualquie
a ea, ¡incluso el análisis de in ini as imágenes de con ocal!
Índice
I
ÍNDICE

1
1|
|
I
IN
NT
TR
RO
OD
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UC
CC
CI
IÓ
ÓN
N
1| In oducción
3
1.1 SENESCENCIA CELULAR
La senescencia celula es un es ado es able de a es o del ciclo celula , en el que las células
de ienen su p oli e ación y adquie en un eno ipo al e ado, como se desc ibi á a con inuación.
Fue desc i a po p ime a ez en ib oblas os diploides humanos (HDF) cul i ados in i o
(Hay lick & Moo head, 1961) como consecuencia del aco amien o de los elóme os as
sucesi as eplicaciones, po lo que se conoce como senescencia eplica i a (Campisi, 1997;
Ha ley e al., 1990; Hay lick, 1965). Hoy en día se conocen más mecanismos di e en es a la
senescencia eplica i a que desencadenan el eno ipo senescen e, como se menciona á en
es e abajo, de en e los cuales des aca la senescencia inducida po oncogén (OIS) (Se ano e
al., 1997) . Asimismo, se ha conseguido elaciona la senescencia celula con condiciones
isiológicas no males, pe o ambién pa ológicas, de o ma que en cie as en e medades ac úa
como un mecanismo de de ensa pa a de ene la p og esión de la pa ología, mien as que en
o as con ibuye a su desa ollo, dualidad conocida como pleio opía an agonis a ( e isado po
Muñoz-Espín & Se ano, 2014; Campisi, 1997). Así, la senescencia celula eme ge como un
a ma de doble ilo, en la que e apias p o-senescen es ayudan a comba i en e medades, pe o
deben i combinadas con pos e io es a amien os an i-senescen es (Campisi, 2005; Muñoz-
Espín & Se ano, 2014; Na della e al., 2011).
1.1.1 Mecanismos de inducción de senescencia.
Ac ualmen e se conocen nue os mecanismos de inducción de senescencia di e en es al
cons i uido po el aco amien o de los elóme os. Algunos de los desencadenan es de
senescencia apa ecen esquema izados en la Figu a 1.
Figu a 1. Mecanismos molecula es de senescencia celula . Las di e en es señales (aco amien o de
elóme os, daño al DNA, ac i ación de oncogenes) inducen el eno ipo senescen e a a és de p o eínas
inhibido as del ciclo celula y del sup eso umo al p o eína del e inoblas oma (Rb). ROS: especies
eac i as de oxígeno. SASP: eno ipo sec e o asociado a senescencia (Muñoz-Espín & Se ano, 2014).
1| In oducción
4
Es os nue os mecanismos incluyen la inducción de senescencia como espues a al daño al
DNA (DDR), po es és y especies eac i as de oxígeno (ROS), po pe u bación de la c oma ina,
po señales mi ogénicas ue es, po de ep esión del locus CDKN2A (que codi ica pa a los
inhibido es del ciclo celula p16 y ARF), inducida po oncogén, o incluso po la acción pa ac ina
de o as células senescen es (po SASP) ( e isado po Campisi & d’Adda di Fagagna (2007) y
Muñoz-Espín & Se ano (2014)). En gene al, dichas causas con e gen en la ac i ación de genes
sup eso es de umo es e inhibido es del ciclo celula como p16, p15, p21, p27 y la o ma hipo-
os o ilada de la p o eína del e iboblas oma (Rb).
1.1.2 Ca ac e ís icas eno ípicas de las células senescen es.
A pesa de es a a iedad en las causas de la inducción de senescencia, exis en una se ie de
ca ac e ís icas eno ípicas y bioma cado es acep ados como comunes a las células
senescen es. Es as ca ac e ís icas incluyen la ausencia de ma cado es p oli e a i os (p o eína
Ki67 o no inco po ación de 5-b omodeoxiu idina (B dU)), exp esión de inhibido es del ciclo
celula y sup eso es de umo es (p16, p15, p21, p27, p53, Rb hipo os o ilada, en e o os), un
aumen o en la ac i idad β–galac osidasa (senescence–associa ed

–galac osidase, SA–β–gal);
ma cado es de daño del DNA, ocis nuclea es de he e oc oma ina asociados a senescencia
(SAHF), un eno ipo hipe sec e o p o-in lama o io (senescence-associa ed sec e o y
pheno ype (SASP), con exp esión de moléculas como el ac o de c ecimien o ans o man e β
(TGF–β), el ac o nuclea κB (NF–κB), in e leuquinas 6 y 8 (IL-6, IL-8) o p o eínas in lama o ias
de mac ó agos (MIP), en e muchas o as), al e aciones me abólicas o mac oau o agia
(Muñoz-Espín & Se ano, 2014; Pé ez-Mance a e al., 2014). El conocimien o de es as
ca ac e ís icas eno ípicas p opias de las células senescen es es imp escindible pa a su
de ección y pa a el desa ollo de e apias di igidas hacia es as células. Ac ualmen e, de odas
ellas, la ac i idad SA–β–gal adquie e especial ele ancia, pues ha sido y es ex ensamen e
empleada pa a su de ección (Dim i e al., 1995).
1.1.3 Senescencia en isiología y pa ología.
En condiciones isiológicas, la senescencia juega un papel cla e en la emodelación isula .
Ac ualmen e se sabe que pa icipa en el desa ollo emb iona io, donde elimina es uc u as
ansi o ias y egula la p opo ción de di e en es ipos celula es (Muñoz-Espín e al., 2013;
S o e e al., 2013), ac uando como un mecanismo complemen a io a la apop osis. Asimismo,
se sabe que la senescencia ocu e ambién en ejidos adul os no males, siendo un mecanismo
de madu ación de megaca ioci os (Besanceno e al., 2010) y sinci io o oblas os de la
placen a (Chup in e al., 2013).
1| In oducción
5
Pe o la senescencia no solo es á p esen e en condiciones isiológicas como las has a aho a
expues as, sino que ambién se ha desc i o en pa ologías. Muñox-Espín & Se ano (2014)
p oponen que el in úl imo de la senescencia es con ibui a la eliminación de células dañadas,
es ingi la p oli e ación del daño isula y p omo e la egene ación del ejido. La secuencia
de pasos pa a consegui al p opósi o consis e en un p ime paso de inducción de senescencia
de las células dañadas, seguido de la eliminación de es as células senescen es po pa e del
sis ema inmune (Hoenicke & Zende , 2012) – paso al que con ibuye el eno ipo hipe sec e o
y p o-in lama o io de dichas células – y inalmen e egene ación del ejido dañado. En ese
mismo a ículo, los au o es hacen una e isión de aquellas condiciones pa ológicas en las que
se cumple dicha secuencia y la inducción de senescencia ac úa como un mecanismo p o ec o
y de de ención de la p og esión de la pa ología, siendo algunos ejemplos la ib osis hepá ica,
enal, o al y ca diaca; la a e oscle osis, la hipe ensión pulmona y el cánce , en el cual la
senescencia de iene la p opagación de las lesiones p e-cance osas.
Sin emba go no siemp e se p oduce una eliminación e ec i a de las células senescen es,
debido an o a la ac uación de ec uosa del sis ema inmune como a la inducción de senescencia
en células mad e (Muñoz-Espín & Se ano, 2014). Es a acumulación es á ue emen e
elacionada con el en ejecimien o, pe o ambién con ibuye a o as en e medades como la
ib osis pulmona idiopá ica (IPF), la obesidad, la diabe es ipo 2, las ca a a as o incluso el
cánce , en el que a pesa de ac ua inicialmen e como una ba e a con a su p og esión, as la
acumulación de células senescen es su eno ipo hipe sec e o (SASP) induce umo igénesis
(Pé ez-Mance a e al., 2014). Es e concep o de la senescencia como a ma de doble ilo apa ece
e lejado en la Figu a 2.
Figu a 2. Modelo de senescencia. T as el daño celula se induce senescencia como mecanismo de
de ensa, se eclu a al sis ema inmune g acias al SASP y se eliminan las células senescen es. Sin emba go,
en cie as pa ologías o po el en ejecimien o se acumulan es as células y se p oduce dis unción isula
(Muñoz-Espín & Se ano, 2014). SASP: eno ipo sec e o asociado a senescencia.

1| In oducción
6
1.1.4 Te apias an i-senescen es.
Es e abajo se cen a en las e apias an i-senescen es, que buscan la eliminación de células
senescen es pa a a a pa ologías como el cánce o la IPF. Ac ualmen e los dos pun os de
acción p incipales de es as e apias pasan po la inmuno e apia senescen e y el diseño de
pequeñas moléculas le ales pa a las células senescen es, campo en el que se ha p oducido un
g an a ance al descub i la ue e demanda y dependencia ene gé ica que p esen an las
células senescen es, y que se puede explo a median e inhibido es me abólicos del
ca abolismo de la glucosa (Dö e al., 2013; O adya & K izhano sky, 2014). Sin emba go, en
cualquie a de los casos es necesa io encon a una es a egia que pe mi a una e apia di igida
especí icamen e hacia células senescen es, sin que gene e e ec os secunda ios en el es o del
o ganismo. En es e pun o en a en juego la nano ecnología y la nanomedicina, ciencias
capaces de apo a soluciones que cumplen es os eque imien os.
1.2 NANOTECNOLOGÍA Y NANOMEDICINA
La nano ecnología es la ciencia que, median e la manipulación de á omos y moléculas,
consigue cons ui es uc u as de un amaño nanomé ico (100 nm o menos) con unas
p opiedades ísicas y químicas únicas, a menudo mejo es o adicalmen e di e en es a las de la
ma e ia inicial (Climen Te ol, 2012; Moghimi e al., 2005).
Den o de es a amplia disciplina su ge la nanomedicina, una nue a ama de la
nano ecnología que busca la aplicación de nanopa ículas y nanoma e iales pa a el
a amien o, diagnós ico, moni o ización y con ol de sis emas biológicos (Moghimi e al.,
2005). Algunas de es as aplicaciones biomédicas incluyen el desa ollo de nanodisposi i os
como biosenso es pa a el diagnós ico, nanopa ículas magné icas pa a imagen biomédica o
bioma e iales pa a implan es biomédicos (Wagne e al., 2006). Sin emba go, la angua dia en
el mundo de la nanomedicina es el empleo de nanodisposi i os pa a consegui la en ega
di igida y con olada de á macos de mane a especí ica (Moghimi e al., 2005; Wagne e al.,
2006).
1.2.1 Nanodisposi i os como sis ema con olado de libe ación de á macos.
Exis e una amplia a iedad de nanodisposi i os que pe mi en la en ega y libe ación de
á macos (d ug deli e y sys em, DDS), como son políme os, liposomas, dend íme os, micelas
polimé icas, nanopa ículas de i adas de cápsula de i us o nanopa ículas ce ámicas
(Bawa ski e al., 2008; Moghimi e al., 2005).
Es os nano anspo ado es apo an un g an núme o de en ajas espec o al uso de
á macos en o mulación lib e. Median e la nano o mulación de moléculas e apéu icas se
1| In oducción
7
consigue mejo a sus p opiedades a macociné icas y a macodinámicas, se aumen a su
solubilidad y su biodisponibilidad y se consigue un e ec o e apéu ico más inmedia o
educiendo además los e ec os secunda ios (Med ede a e al., 2007; Valle -Regí e al., 2007).
Conc e amen e, en el p esen e abajo se emplea án nanopa ículas mesopo osas de sílice
como disposi i os pa a un a amien o di igido. Es os nanodisposi i os p esen an en ajas
adicionales además de las ya expues as, que se desa olla án con más de alle. Su educido
amaño (en e 80 y 100 nm) pe mi e aspasa ba e as biológicas y una mayo pene ación
celula (Da is e al., 2008; Med ede a e al., 2007), siendo posible po ejemplo que a a iesen
la ba e a hema oence álica (Fiand a e al., 2015). Además, y como se p o undiza á más
adelan e, es e ipo de ma e iales pe mi e su uncionalización con biomoléculas pa a di igi las
nanopa ículas especí icamen e hacia células o ejidos diana, consiguiendo mejo a la
e ec i idad a macológica de moléculas e apéu icas y educi sus e ec os secunda ios
(Moghimi e al., 2005; Slowing e al., 2008).
1.2.2 Nanopa ículas Mesopo osas de Sílice (MSNs).
Ac ualmen e, los ma e iales mesopo osos de sílice (MSNs) su gen como naodisposi i os de
en ega y libe ación de á macos con mucho po encial (Valle -Regí e al., 2006; Yang e al.,
2012). Es o se debe al g an núme o de en ajas que p esen an pa a dicho in, ampliamen e
e isado en la bibliog a ía. Po un lado, se a a de moléculas biocompa ibles que no p esen an
oxicidad (Yang e al., 2012). Además, son es ables química y é micamen e (Slowing e al.,
2008). Po o o lado, es e ipo de ma e iales se ca ac e izan po posee una ed o denada y
homogénea de po os (2-10 nm) que pe mi en un amplio con ol en la ca ga y la ciné ica de
libe ación del con enido de los nanodisposi i os. Además, cons an de un al o olumen de po o
(1 cm3g -1) y supe icie especí ica (500–1000 m2 g-1), pe mi iendo la ca ga y adso ción de
mayo es can idades de á maco. Finalmen e, el hecho de p esen a g upos silanoles (Si–OH)
sin eacciona en su supe icie pe mi e su uncionalización con moléculas y biomoléculas
o gánicas, que pe mi an con ola la ca ga encapsulada en los po os y el p oceso y luga de su
libe ación (Figu a 3). Finalmen e, es e ipo de ma e iales pe mi en un g an con ol en la
es uc u a y po osidad del sólido inal, a a és del cambio de las condiciones de
concen ación, pH, empe a u a o su ac an e empleadas en la sín esis (Climen Te ol, 2012;
Valle -Regí e al., 2007).
Figu a 3. Funcionalización de MSNs. Los silanoles de MSNs eaccionan con g upos ialcoxisilano
(modi icada de Ho mann e al., 2006).
1| In oducción
8
De en e es e ipo de ma e iales MSN, des acan las es uc u as MCM-41, MCM-48 y MCM-
50, que pe enecen a la amilia mesopo osa M41S desa ollada en 1992 y p esen an un
diáme o de po o de en e 2 y 10 nm (Ho mann e al., 2006). En la Figu a 4 apa ecen
ep esen adas las es uc u as de es os es ma e iales. Conc e amen e el ma e ial MCM-41,
con el que se abaja á en es e p oyec o, se empleó po p ime a ez como anspo ado de
á macos en 2001 (Valle -Regi e al., 2001).
Figu a 4. Es uc u a de los ma e iales mesopo osos de la amilia M41S. a) MCM-41 con dis ibución
hexagonal de po os; b) MCM-48 con dis ibución cúbica; y c) MCM-50 con es uc u a lamina (Ho mann
e al., 2006).
1.2.3 Pue as molecula es.
El concep o de pue a molecula de ine un sis ema nanoscópico capaz de con ola el
anspo e y en ega de ma e ia, que se inicia en espues a a un es ímulo ex e no. Los
nanodisposi i os con pue a molecula cons an de una es uc u a ino gánica, que apo a los
po os en los que encapsula la ca ga de in e és, uncionalizada con una pue a molecula
ex e na que man iene dicha ca ga ence ada y únicamen e la libe a as la acción de un
es ímulo ex e no. Po an o, es as pue as p esen an un es ado ce ado, en el que idealmen e
exis e una libe ación ce o; y o o abie o, en el que únicamen e as la aplicación de un
es ímulo ex e no la pue a se ab e y libe a el con enido a apado en los po os de los
ma e iales MSNs (Coll e al., 2013; Climen Te ol, 2012).
Es as pue as molecula es pueden se de na u aleza muy di e sa (pé idos, sacá idos, DNA,
políme os…), ob eniéndose como esul ado un ma e ial híb ido o gánico-ino gánico.
Asimismo, se han desc i o un amplio abanico de sis emas con pue as molecula es capaces de
esponde a es ímulos muy di e sos (pH, empe a u a, luz, p esencia de enzimas, po encial
edox), ampliamen e e isados en la bibliog a ía (Coll e al., 2013; Climen Te ol, 2012; Yang e
al., 2012; Slowing e al., 2008).
Sumando oda la in o mación has a aho a expues a, el diseño de un nanodisposi i o
mesopo oso de sílice uncionalizado con una biomolécula capaz de di igi lo selec i amen e
hacia células senescen es se plan ea como una es a egia e apéu ica iable pa a el
a amien o de en e medades elacionadas con la acumulación de dichas células.
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OB
BJ
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VO
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S
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ac i idad β–galac osidasa. Todos los polisacá idos empleados es aban disponibles
come cialmen e, y su es uc u a se puede obse a en la igu a 5.
Así pues, Galac an es un oligosacá ido o mado po dos isacá idos de galac osa unidos po
un enlace σ-glicosídico. Po su pa e, Glucidex-47 es un hid olizado de almidón (polisacá ido
que consis e en un g an núme o de moléculas de glucosa unidas po enlaces σ-glicosídicos)
que cons a de un 5% de glucosa, 50% de mal osa y 45% de oligosacá idos y polisacá idos de
glucosa.
Figu a 5. Es uc u a química básica de Galac an (izquie da, ChemicalBook CAS 39300-87-3) y Glucidex-
47 (de echa, Be na dos e al., 2010).
3.2.3 Sín esis de la es uc u a mesopo osa ino gánica de sílice MCM-41.
Pa a la sín esis de la es uc u a MCM-41 se pesó 1 g (2.74 mmol) del su ac an e CTAB y se
añadie on 480 mL de agua desionizada en un aso de p ecipi ados, muy despacio pa a que no
se c ease espuma. Sob e una placa cale ac o a con un e mopa pa a con ola la empe a u a
se aumen ó la empe a u a a 28oC con agi ación pa a disol e o almen e el CTAB.
En ese momen o se añadie on 3.5 mL de NaOH 2M en agua desionizada, ápidamen e pa a
e i a la ca bona ación. Se apó el aso de p ecipi ados en el que se p oducía la eacción con
un id io de eloj y se ajus ó la empe a u a a 80oC, man eniendo la agi ación.
Al llega a los 80oC se añadie on 5 mL de TEOS (2.57 x 10-2 mol) go a a go a con una pipe a
Pas eu . Cubie a con el id io de eloj, se dejó anscu i la eacción du an e 2 ho as a 80oC,
man eniendo la agi ación.
T as es e pe iodo se ob u o un p ecipi ado blanco, el cual ue cen i ugado 20 minu os a
9500 pm. T as es a p ime a cen i ugación se eliminó el sob enadan e y se la ó
epe idamen e el sólido con agua des ilada has a que se alcanzó un pH de 7 en las aguas de
la ado. En es e momen o, se dejó seca el sólido MCM-41 a 60oC du an e la noche pa a
elimina la humedad.
Finalmen e se calcinó el ma e ial en la mu la pa a elimina el CTAB y deja lib es los po os
del sólido, pa a pode ca ga lo pos e io men e con el compues o deseado. Pa a ello el
p og ama de calcinación que se empleó consis ió en llega a 550oC y man ene esa
empe a u a du an e 5 ho as en a mos e a oxidan e.

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En esumen, se empleó una p opo ción mola de 2 TEOS: 0.52 CTAB: 0.5 NaOH: 180 H2O
pa a p oduci la es uc u a mesopo osa MCM-41. De mane a más isual, en la igu a 6 se
puede obse a cómo du an e el p oceso el su ac an e CTAB o ma micelas que se disponen
en o ma de cilind o y que adquie en una dis ibución hexagonal. És e ac úa como “ empla e”
al ededo del cual se condensa el p ecu so ino gánico TEOS. Finalmen e, el su ac an e es
eliminado median e calcinación, dejando disponibles los po os de la es uc u a MCM-41.
Figu a 6. Esquema de la sín esis del nanodisposi i o mesopo oso de sílice MCM-41. El su ac an e
CTAB o ma micelas que se disponen en o ma de cilind os con a eglo hexagonal, al ededo del cual se
condensa el TEOS. Finalmen e, el su ac an e es eliminado po calcinación (modi icada a pa i de Yang
e al., 2012). TEOS: e ae ilo osilica o.
3.2.4 Ca ga del ma e ial MCM-41 con odamina B: ob ención de los sólidos S1.
A pa i del ma e ial MCM-41 p epa ado se sin e iza on dos sólidos S1 di e en es, que
pos e io men e llama emos S1-GAL y S1-GLU en unción de la pue a molecula empleada en
cada uno de ellos (Galac an en el p ime caso, Glucidex-47 en el segundo). Los dos ma e iales
sin e izados se ca ga on con el colo an e luo escen e odamina B (Figu a 7), que po sus
ca ac e ís icas (ausencia de oxicidad celula , ácil cuan i icación y posibilidad de encapsula en
MCM-41) es idóneo pa a ealiza ensayos de pues a a pun o de nue os sis emas y si ió como
ma cado pa a de ec a la libe ación de la ca ga de las nanopa ículas.
El p oceso de ca ga ue lige amen e di e en e pa a cada sólido. En ambos casos se pesa on
700 mg de MCM-41 y 268.25 mg de odamina B (0.8 mmol odamina B/g MCM-41). En el caso
del sólido S1-GAL las nanopa ículas y el colo an e se esuspendie on en 56 mL de e anol (80
mL e anol/g MCM-41), mien as que en el caso de S1-GLU la suspensión se ealizó en el mismo
olumen pe o de agua des ilada (80 mL agua des inada/g MCM-41). La suspensión se dejó en
un balón agi ándose a empe a u a ambien e du an e 24 ho as.
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Figu a 7. Es uc u a química de la odamina B (PubChem CID: 6694).
3.2.5 Funcionalización de los sólidos S1 pa a ob ene S1-GAL y S1-GLU: anclaje de la pue a
molecula .
La uncionalización de los sólidos con los polisacá idos que ac úan como pue a molecula
se lle ó a cabo median e p e ia eacción de de i a ización. Es o signi ica que se hizo
eacciona p ime amen e el g upo amina del APTES con los oligosacá idos Galac an y Glucidex-
47, ob eniéndose así un p oduc o de i ado que pos e io men e se ancló a la supe icie del
sólido S1.
Pa a lle a a cabo la eacción de de i a ización el p ime paso consis ió en pone a acío 1
g amo de cada sacá ido du an e unas ho as, pa a elimina la humedad. A con inuación, a cada
balón que con enía el sacá ido se le añadie on 50 mL de e anol, en a mós e a de ni ógeno y
agi ación a empe a u a ambien e. T as la disolución de los azúca es se añadie on 1.17 mL de
APTES (10 mmol APTES/g MCM-41), y se deja on anscu i ambas eacciones du an e 24
ho as en agi ación. T as es o se aumen ó la empe a u a a 40oC en el caso del balón con
Galac an y se man u o du an e 1 ho a, y a 60oC en el del Glucidex-47, du an e 30 minu os.
Finalmen e, se elimina on los disol en es de ambas eacciones median e o a apo ación, y los
p oduc os esul an es se man u ie on a acío du an e la noche.
A con inuación se p ocedió a lle a a cabo el anclaje de las pue as molecula es ecién
sin e izadas a los sólidos S1. En el caso del sólido S1-GAL se añadie on 3.5 mg del p oduc o
Galac an de i a izado, p e iamen e mol u ado, a su espec i a eacción de ca ga de la MCM-
41 desc i a en el apa ado 3.2.3 (5 g p oduc o/g MCM-41). En el caso del sólido S1-GLU se
añadie on 0.7 mg del p oduc o Glucidex-47 de i a izado y mol u ado a su espec i a eacción
de ca ga de MCM-41 (apa ado 3.2.3) (1 g/g MCM-41). Es as suspensiones se man u ie on en
agi ación du an e 24 ho as y se cen i uga on pos e io men e du an e 10 minu os a 9500 pm
pa a ecupe a los sólidos S1-GAL y S1-GLU, que se seca on en es u a a 37oC. Finalmen e las
nanopa ículas ob enidas se la a on con agua median e epe idas il aciones (pa a elimina
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los es os de odamina B adhe idos a la supe icie ex e na de las nanopa ículas) y se seca on a
acío, ob eniéndose así los sólidos S1-GAL y S1-GLU inales.
3.2.6 Ca ac e ización de los sólidos S1-GAL y S1-GLU.
Una ez ob enidos los sólidos inales, la MCM-41 sin calcina y calcinada y los sólidos S1-
GAL y S1-GLU se analiza on pa a comp oba la co ec a sín esis, ca ga y uncionalización de los
ma e iales, así como pa a e si p esen aban las p opiedades ca ac e ís icas de es e ipo de
ma e iales. La ca ac e ización cons ó de un análisis de di acción de ayos X en pol o (DRX),
análisis e mog a imé ico (TG), cuan i icación de la ca ga de odamina B po espec oscopía
UV/V y mic oscopía elec ónica de ansmisión (TEM), ealizados en el Cen o de
Reconocimien o Molecula y Desa ollo Tecnológico (IDM) de la Uni e sidad Poli écnica de
Valencia (UPV); es udio de adso ción-deso ción de N2 en la Uni e sidad Complu ense de
Mad id (UCM); y análisis elemen al en el Ins i u o de Ciencia de los Ma e iales de la
Uni e sidad de Valencia (ICMUV).
El análisis de di acción de ayos X se ealizó pa a los cua o sólidos. Se empleó un
di ac óme o B uke D8 Ad ance con adiación CuKα. Unos 200 mg de cada sólido (en caso de
dispone se de ellos, o en su de ec o la can idad máxima posible) se mol u a on y coloca on
o mando una pas illa en el disco del equipo. El p og ama empleado u iliza unas en anas de
bajo ángulo ( en ana de di e gencia de 0.2 mm, en ana de dispe sión de 3 mm y en ana del
de ec o de 1 mm), sin gi o de la mues a, con una du ación de 11 minu os.
El análisis e mog a imé ico ealizado a los sólidos inales pa a calcula la can idad de
ma e ia o gánica que con enían se lle ó a cabo en un analizado de Me le Toledo en
a mós e a oxidan e (ai e, 80 mL/min). El p og ama de calo empleado consis ió en una ampa
de 10 g ados/min, comenzando en 393 K y acabando en 1273 K, y 30 minu os iso é micos a
1273 K.
El cálculo de la ca ga de odamina en los sólidos S1 inales se lle ó a cabo median e la
cuan i icación de la can idad de odamina pe dida en las aguas de ca ga y la ado de los
sólidos, y su sus acción a la can idad de odamina inicial añadida a la eacción de ca ga de las
nanopa ículas. La cuan i icación se lle ó a cabo po espec oscopía de ul a iole a- isible en
un equipo JASCO V-650.
Las imágenes de TEM de las 4 nanopa ículas pa a obse a su es uc u a a ni el
mic oscópico ue on ob enidas en el Se icio de Mic oscopía de la UPV, en un mic oscopio
Philips CM10. Pa a la p epa ación de las mues as se suspendió una pequeña can idad de cada
sólido en diclo oe ano, y unas go as de dicha suspensión se deposi a on sob e una ejilla de
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cob e ecubie a de 300 mallas de ca bono, quedando lis as pa a su obse ación una ez se
secó el disol en e.
Las iso e mas de adso ción-deso ción de N2 pa a los cua o sólidos se ob u ie on en el
equipo Mic ome i ics ASAP2010 Au oma ed So p ion Analyse del ICMUV, p e ia
desgasi icación de las mues as a acío a 120oC du an e la noche. Los esul ados de uel os
incluyen la dis ibución del amaño de po o, calculado siguiendo el mé odo Ba e -Joyne -
Halenda (BJH) (Ba e e al., 1951), y el á ea de supe icie especí ica a pa i de los da os de
adso ción en el ango de p esiones meno es empleando el modelo B unaue -Emme -Telle
(BET) (B unaue e al., 1938).
El análisis elemen al pa a de e mina el con enido en ca bono, ni ógeno e hid ógeno de
S1-GAL y S1-GLU se lle ó a cabo en un equipo CE Ins umen EA-1110 CHN Elemen al Analyze
en el Cen o de Mic oanálisis Elemen al de la UCM.
3.3 VALIDACIÓN FUNIONAL: ENSAYOS DE LIBERACIÓN IN VITRO DE LOS MATERIALES
HÍBRIDOS
T as la ca ac e ización es uc u al de los sólidos se lle ó a cabo la alidación uncional, que
se ealizó median e es udios de libe ación de odamina B in i o. Pa a ello se emplea on
es ímulos capaces de p o oca la libe ación de la ca ga de los sólidos po o u a de la pue a
molecula , el enzima galac osidasa en el caso de S1-GAL y panc ea ina de S1-GLU.
3.3.1 Reac i os.
Las enzimas -galac osidasa de Kluy e omyces lac is y panc ea ina de pánc eas po cino,
que se án los es ímulos pa a la up u a de los polisacá idos que ac úan como pue a
molecula , se ob u ie on de Sigma-Ald ich.
3.3.2 Ensayos de libe ación in i o.
Pa a lle a a cabo las p uebas de libe ación in i o de los ma e iales sin e izados, el p ime
paso ue p epa a las disoluciones enzimá icas. Pa a ello, po un lado se disol ie on 300 μL de
la enzima -galac osidasa en 9.7 mL de agua des ilada a pH 7.5, y po o o lado 30 mg de la
enzima panc ea ina en 7.5 mL de agua des ilada a pH 7.5 (4 mg/mL).
A con inuación, 6.25 mL de cada disolución enzimá ica se lle a on a 25 mL con agua
des ilada a pH 7.5. A es as disoluciones enzimá icas se les añadie on 10 mg de nanopa ículas
(S1-GAL en el caso de la disolución con -galac osidasa, y S1-GLU en el caso de la de
panc ea ina), y se suspendie on median e una b e e sonicación. De mane a pa alela, 10 mg de
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cada nanopa ícula se suspendie on en 25 mL de agua des ilada a pH 7.5 sin enzima, pa a
ac ua como blanco sin libe ación.
Las cua o eacciones se pusie on en agi ación a 200 pm. A pa i de ese momen o se
ue on omando alícuo as de 1 mL a di e en es iempos (1 min, 2.5, 4, 7.5 y 24 ho as), que se
il a on en il os de e lón (PTFE 17 mm, 0.45 μm).
Finalmen e, se midió la luo escencia de cada alícuo a en un espec o o óme o JASCO FP-
8500 pa a de e mina la libe ación de odamina B que se había p oducido, empleando la
longi ud de onda de emisión ca ac e ís ica del colo an e (λexci ación = 555 nm, λemisión = 580 nm).
3.4 ENSAYOS EN UN MODELO CELULAR DE SENESCENCIA
Finalmen e se p e endió alida el uncionamien o de los sólidos S1-GAL y S1-GLU
sin e izados y ca ac e izados en un modelo celula de senescencia. Pa a ello, en p ime luga
se lle a on a cabo ensayos de inducción de senescencia pa a comp oba la idoneidad del
modelo celula , así como se comp obó la ausencia de oxicidad de los sólidos en las células.
Una ez el modelo celula es u o pues o a pun o, se emplea on los sólidos pa a e alua la
p esencia de ecep o es de azúca es especí icos pa a galac o-oligosacá idos en células
senescen es. Pa a comenza se es udió el ni el de in e nalización no mal de ambos sólidos
po pa e de células senescen es y no senescen es, median e la cuan i icación de la libe ación
de odamina B en las células po mic oscopia con ocal. A con inuación, y como p ueba de
concep o, se es udió si dicha in e nalización se eía a ec ada po la adición p e ia de un azúca
con galac osa en su composición (como la lac osa), pa a de e mina si és e e a capaz de
bloquea los ecep o es de azúca es y po an o a ec aba a la in e nalización de nanopa ículas
en las células.
3.4.1 Reac i os.
El medio de cul i o Dulbecco’s Modi ied Eagle’s Medium 1X sin ojo enol (DMEM), la
ipsina-EDTA 0.05% (1X), el sue o bo ino e al (FBS) y el an ibió ico-an imicó ico 100X
(compues o po penicilina, es ep omicina y an o e icina B) ue on adqui idos de Gibco Li e
Technologies. Sigma-Ald ich p opo cionó el Dulbecco’s Phospha e Bu e ed Saline Mod ied
(PBS), T ypan Blue, el colo an e c is al iole a, la lac osa, el 4',6-diamino-2- enilindol (DAPI), el
pa a o maldehído (PFA) y el análogo de es ógenos 4-hid oxi amoxi eno (4OHT). De Scha lau
se adqui ió el e anol, y de Calbiochem el mowiol 4-88. El ki de inción de células senescen es
Senescence

-galac osidase S aining Ki se ob u o de CellSignalling.

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3.4.2 Línea celula , condiciones de cul i o y siemb a.
La línea celula empleada ue ITM ( ib oblas os pulmona es humanos), p opo cionada
amablemen e po el D . Manuel Se ano del g upo de Sup esión Tumo al del Cen o Nacional
de In es igaciones Oncológicas (CNIO), Mad id (España). Es a línea de i a de la línea p ima ia
IMR-90, inmo alizada median e la exp esión o zada de la unidad ca alí ica de la elome asa
(hTERT), la cual p esen a ac i idad ansc ip asa in e sa (Bodna e al., 1998; Collado e al.,
2005; Vazi i & Benchimol, 1998). Además, es a nue a línea denominada IT ha sido ansducida
e o i almen e con una e sión inducible del oncogén MEK1, que se encuen a usionado a un
dominio de unión a ho monas del ecep o de es ógenos humano ( usión MEK-ER),
consiguiendo inalmen e la línea celula ITM. De es a o ma, median e inducción del dominio
ER se consigue la ac i ación del oncogén y se desencadena una espues a de OIS. Dicho
dominio de unión a ho monas es á modi icado pa a no esponde a es ógenos, sino al
á maco 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) (Figu a 8), un an agonis a del ecep o de es ógenos.
Así, al adiciona el compues o 4OHT en la línea celula ITM se consigue un modelo de
senescencia celula en 72 ho as, ap opiado pa a es e abajo (Collado e al., 2005; Lin e al.,
1998).
Figu a 8. Es uc u a química del 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) (D ugBank, Accession Numbe
DB04468).
Las células se cul i a on en medio DMEM sin ojo enol suplemen ado con 10% FBS (o 0.5%
según el ensayo celula ) y 1% de an ibió ico-an imicó ico, a 37oC en a mós e a húmeda con 5%
CO2. La ausencia de ojo enol se debe a que dicho compues o in e acciona con el ecep o de
es ógenos ( usión MEK-ER), desencadenando el eno ipo senescen e en la p esen e línea
celula .
El le an amien o de las células pa a ealiza los subcul i os y siemb as se lle ó a cabo con 2
mL de ipsina y 5 minu os de incubación a 37oC. Los pases de man enimien o se ealiza on 3
eces po semana a diluciones 1:2 o 1:3 en unción del g ado de con luencia.
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Las siemb as se ealiza on a pa i de células que se encon aban en con luencia en e los
pases 3 y 12. El cálculo de la concen ación celula pa a las siemb as se ealizó median e
inción con el colo an e de exclusión T ypan Blue (pa a de e mina iabilidad) y con aje en
cáma a Neubaue .
Pa a los ensayos en los que se ecu ió a mic oscopía con ocal, las células se semb a on
sob e cub eobje os de c is al pa a que pudiesen se obse adas y o og a iadas al mic oscopio.
Du an e los pe iodos de incubación con 4OHT pa a inducción de senescencia se empleó
medio suplemen ado con 0.5% FBS (en luga de 10%) pa a e i a el c ecimien o desmedido de
las células ehículo (sin 4OHT) espec o a las células senescen es (con 4OHT), pues las
segundas cesan su p oli e ación. También con es e in se semb ó un meno núme o de células
en los pocillos de células ehículo en la mayo ía de los ensayos.
3.4.3 Inducción de senescencia con 4-hid oxi amoxi eno en células ITM y comp obación
median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal.
Al comenza a abaja con la línea celula ue imp escindible ealiza ensayos de inducción
de senescencia pa a pode es ablece el modelo de senescencia en el cual ealiza los es udios
con las nanopa ículas sin e izadas. Pa a lle a los a cabo, la línea celula ITM se semb ó en
placas mul ipocillo de 35 mm de diáme o (6 pocillos) sob e cub eobje os ci cula es de c is al
de 24 mm de diáme o, pa a que las células c eciesen sob e ellos y pode así obse a las
pos e io men e al mic oscopio. La concen ación de siemb a ue de 60000 células/pocillo, 2
mL/pocillo, en medio DMEM suplemen ado con 10% FBS. El diseño de placa empleado en el
ensayo apa ece ep esen ado en la igu a 9.
Figu a 9. Diseño de la placa mul ipocillo pa a el ensayo ‘Inducción de senescencia con 4-
hid oxi amoxi eno (4OHT) y comp obación median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal’. La
ila supe io son células con ol a adas con e anol ( ehículo en el que es á disuel o el 4OHT). La ila
in e io son células a las que se les añadió 4OHT 100 nM pa a induci senescencia. En ambos casos se
semb a on 60000 células/pocillo.
T as 24 ho as de incubación a 37oC y 5% de CO2, se cambió el medio a DMEM
suplemen ado con 0.5% FBS, p e io la ado con PBS, y se añadió el á maco 4OHT a
concen ación 100 nM disuel o en e anol 96% pa a induci senescencia. A las células con ol no
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senescen es se les añadió el mismo olumen de e anol, pues e a el ehículo en el que es aba
disuel o el 4OHT, pe o sin el á maco.
T as 72 ho as de incubación bajo las condiciones desc i as se p ocedió a la ijación de las
células con PFA 4%, pa a pode ealiza la inción con el ki de de ección de senescencia en el
momen o deseado. Pa a ello, se e i ó el medio, se la a on las células con PBS y se incuba on a
empe a u a ambien e du an e 10-15 minu os con 1 mL de PFA. Finalmen e se e i ó la
solución de PFA, se la ó con PBS dos eces y se ol ie on a añadi 2 mL de PBS nue os, con los
que se gua dó la placa en ne e a a 4oC has a el día de su inción, en caso de pospone se po
disponibilidad de mic oscopía.
Pa a ealiza la inción se empleó el ki Senescence

-Galac osidase S aining Ki , de Cell
Signalling Technologies, USA. Las soluciones se p epa a on de acue do al p o ocolo de la casa
come cial con los eac i os p opo cionados en el ki . Es imp escindible ajus a el pH de la β–
galac osidase S aining Solu ion a 6. Pa a p ocede con la inción se e i ó el PBS en el que se
encon aban las células y se añadió 1 mL de β–Galac osidase S aining Solu ion a cada pocillo.
La placa se selló con pa a ilm pa a e i a la e apo ación de la solución y se incubó du an e la
noche en es u a a 37oC. Pasada la incubación se e i ó la solución de inción y se la ó dos eces
con PBS.
Finalmen e se ecupe a on los cub eobje os de la placa con la ayuda de unas pinzas, se
la a on con agua des ilada y se deposi a on en un po aobje os sob e una go a de mowiol.
Finalmen e se odea on los cub eobje os con laca de uñas pa a sella los al po aobje os. Las
células se obse a on y o og a ia on en un mic oscopio óp ico Nikon Eclipse E600, con cáma a
DS-Ri1.
El esumen del ensayo apa ece ecogido en la Tabla 1.
Tabla 1. Esquema po días del ensayo ‘Inducción de senescencia con 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) y
comp obación median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal’.
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
Día 6
· Semb ado
· Adición
4OHT (72h)
-
-
· Fijación
· Tinción X-Gal
· Mic oscopía
3.4.4 Ensayo de iabilidad con los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU.
Con el obje i o de comp oba que las nanopa ículas inales S1-GAL y S1-GLU no esul aban
óxicas pa a las células, se lle a on a cabo ensayos de iabilidad celula ep oduciendo las
condiciones con las que luego se a a ían las células con los sólidos.
Pa a lle a a cabo el ensayo de iabilidad se ealizó una siemb a de la línea celula ITM en
placa mul ipocillo de 24 pocillos. En el caso de las células ehículo no senescen es la
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concen ación de siemb a ue de 40000 células/pocillo, y 150000 células/pocillo en el caso de
las células senescen es a adas con 4OHT, pa a consegui un c ecimien o simila al inal del
ensayo. El medio empleado ue DMEM suplemen ado con 10% FBS, 1mL/pocillo.
Los pasos seguidos du an e el p esen e ensayo apa ecen ecogidos en la Tabla 2.
Tabla 2. Esquema po días del ensayo ‘Ensayo de iabilidad con los sólidos S1-GAL y S1-GLU’. 4OHT: 4-
hid oxi amoxi eno.
Día 1
Día 2
Día 3
Día 4
Día 5
Día 6
Día 7
·Semb ado
-
· Adición
4OHT
(72h)
-
-
· Adición S1-GAL
y S1-GLU (24h)
· Tinción
c is al
iole a
T as la siemb a, las células se incuba on du an e 48 ho as a 37oC y 5%CO2, un pe iodo más
la go que en el caso del ensayo an e io pa a ga an iza una mayo adhe encia celula .
T as ese pe iodo se la a on con PBS y se añadió 1 mL de medio DMEM suplemen ado con
0.5% FBS y con 4OHT 100 nM pa a induci senescencia, inducción que du ó 72 ho as. En el
caso de las células ehículo no senescen es se añadió la misma p opo ción de e anol en DMEM
0.5% FBS.
T as las 72 ho as de incubación se ealizó un la ado con PBS pa a e i a el 4OHT, se ol ió
a añadi 1 mL de DMEM 10% FBS y se añadie on los sólidos S1-GAL y S1-GLU, suspendidos en
PBS median e p e ia sonicación. Las concen aciones inales en los pocillos ue on de 50 μg de
sólido/mL. El diseño de la placa apa ece ecogido en la Figu a 10.
Figu a 10. Diseño de la placa mul ipocillo pa a el ensayo ‘Ensayo de iabilidad con los sólidos S1-GAL
y S1-GLU’. Las ilas p ime a y e ce a son células con ol a adas con e anol ( ehículo en el que es á
disuel o el 4OHT), semb adas a una concen ación de 40000 células/mL. Las ilas segunda y cua a son
células senescen es po la adición de 4OHT 100 nM, semb adas a una concen ación de 150000
células/pocillo. Las nanopa ículas S1-GLU y S1-GAL se añadie on a 50μg/mL en los pocillos indicados.
Unos pocillos se deja on sin adición de nanopa ículas pa a ene los como e e encia de 100% de
iabilidad. 4OHT: 4-hid oxi amoxi eno.
La incubación con las nanopa ículas u o 24 ho as de du ación, momen o en el que se
p ocedió a la medida de la iabilidad celula . Pa a ello se e i ó el medio celula y las células

4| Resul ados y discusión
33
El p oceso global de ob ención de los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU, desc i o en el
apa ado de Ma e iales y Mé odos, consis ió en un p ime paso de sín esis de la es uc u a
mesopo osa ino gánica MCM-41. Dicho ma e ial se ca gó pos e io men e con el colo an e
odamina B, dando luga así al ma e ial híb ido ino gánico-o gánico S1. Finalmen e dicho
sólido se uncionalizó con dos pue as molecula es di e en es, los oligosacá idos Galac an y
Glucidex-47, capaces de apa los po os del ma e ial man eniendo en su in e io la odamina B.
Dichas moléculas que ac úan como pue as son capaces de esponde a es ímulos ex e nos
(conc e amen e a los enzimas β–galac osidasa y panc ea ina, espec i amen e), de mane a
que pueden se hid olizadas a monosacá idos dejando así los po os lib es pa a la libe ación del
colo an e encapsulado.
El sólido S1-GAL unciona ía como un nanodisposi i o capaz de di igi se selec i amen e a
células senescen es, ya que és as p esen an un al o con enido en el enzima β–galac osidasa
espec o a las células no senescen es (senescen -associa ed

–galac osidase, SA–β–gal). Es e
enzima es capaz de deg ada la pue a molecula del sólido y libe a su con enido, que en es e
caso se a a del colo an e odamina B pe o que en un u u o pod ía se un á maco ci o óxico
(Figu a 13). La exis encia de selec i idad po pa e de nanopa ículas uncionalizadas con
galac o-oligosacá idos (GOS) ya ha sido demos ada po miemb os de es e g upo, aunque con
un azúca di e en e al Galac an (Agos ini e al., 2012). Si se comp obaba que las p esen es
nanopa ículas S1-GAL ambién se di igían selec i amen e a células senescen es, se p e endía
es udia si dicha especi icidad e a debida únicamen e a la p esencia de SA–β–gal, o bien si
podía debe se ambién a la exis encia de ecep o es de azúca es especí icos pa a galac o-
oligosacá idos en la supe icie de las células senescen es (que acili asen la endoci osis de
nanopa ículas uncionalizadas con GOS, como se plan ea en el p esen e abajo). En la p ueba
de concep o pa a comenza a es udia dicha eo ía se a a ía de bloquea los hipo é icos
ecep o es median e la adición de un azúca . Dicho azúca debe ía cons a de galac osa en su
es uc u a, y las células no debe ían posee anspo ado es pa a su in e nalización, pa a
ga an iza su acción ex acelula . Pos e io men e se adiciona ían las nanopa ículas S1-GAL y
se es udia ía si su in e nalización y ape u a se eía educida.
Po su pa e, S1-GLU unciona ía como un con ol posi i o, que se espe aba que libe ase su
con enido independien emen e en células senescen es y no senescen es, dado que ambas
p esen an equi a i amen e el enzima lisosomal amilasa capaz de deg ada la pue a molecula .
4| Resul ados y discusión
34
Figu a 13. Esquema de una MCM-41 ca gada con odamina B y uncionalizada con un galac o-
oligosacá ido. Debido a la acción del enzima β-galac osidasa asociada a senescencia (SA-β-gal) el
galac o-oligosacá ido es hid olizado y se libe a la odamina B, p e e en emen e en células senescen es
con dicha ac i idad enzimá ica.
4.1 VALIDACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE S1-GAL Y S1-GLU
Las p uebas de ca ac e ización y alidación ienen el obje i o de comp oba que an o las
nanopa ículas MCM-41 como los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU sin e izados p esen an las
p opiedades ca ac e ís icas de es e ipo de ma e iales.
Po un lado se ealizó una ca ac e ización es uc u al, con la que se p e endió con i ma
que la sín esis anscu ió co ec amen e y las nanopa ículas p esen aban la es uc u a
idimensional ca ac e ís ica de MCM-41. Pa a ello se ecu ió a écnicas como DRX, TEM y
po osime ía po adso ción-deso ción de N2. Po o o lado, median e po osime ía, análisis
elemen al, TGA y cuan i icación de odamina B en las aguas de la ado se comp obó que los
sólidos inales se habían ca gado adecuadamen e, y se cuan i icó dicha ca ga de colo an e. En
cuan o a la alidación uncional, se ealiza on es udios de libe ación in i o con los sólidos en
p esencia y ausencia de los enzimas capaces de deg ada las pue as molecula es. En ausencia
del enzima se espe aba una “libe ación ce o”, signo de que la pue a e a capaz de apa los
po os; y en p esencia del enzima e a de espe a una libe ación con olada del colo an e a
medida que anscu ía el iempo, señal de que la nanopa ícula espondía co ec amen e al
es ímulo de ape u a de la pue a (es deci , que e a uncional).
Pa a comenza se ealiza on los es udios de di acción de ayos X (DRX) y TEM pa a
comp oba la co ec a dis ibución espacial p opia de la MCM-41 (Figu as 14 y 15).
En cuan o al di ac og ama de los sólidos (Figu a 14), en a) se puede obse a el pa ón de
di acción ca ac e ís ico de una MCM-41 sin calcina , en el que apa ecen cua o picos de B agg
4| Resul ados y discusión
35
co espondien es a las cua o e lexiones de bajo ángulo p opias de la p esen e es uc u a
hexagonal. En cambio, en la MCM-41 calcinada b) se obse a un desplazamien o de dichos
picos, que se debe a la con acción de la es uc u a del ma e ial po la condensación de los
silanoles que se p oduce du an e el p oceso de calcinación. Sin emba go, a pesa de que es e
desplazamien o implica una pé dida pa cial del o den, el man enimien o de las e lexiones
indica que se p ese a la sime ía mesopo osa. Finalmen e, en c) y d) (co espondien es a los
sólidos S1-GAL y S1-GLU espec i amen e) desapa ecen las 3 e lexiones meno es, así como
disminuye la señal de mayo in ensidad, siendo es o signo de que se p oduce una educción
del con as e al es a los po os ca gados de odamina B. Aún así, el man enimien o del p ime
pico sugie e que no se ha modi icado sus ancialmen e la es uc u a mesopo osa hexagonal
(Agos ini e al., 2012; Be na dos e al., 2009).
Figu a 14. Di ac og ama de ayos X en pol o de MCM-41 sin calcina a), MCM-41 calcinada b), S1-
GAL c) y S1-GLU d). En a) y b) se obse an las 4 e lexiones ca ac e ís icas de MCM-41. En c) y d) se
pie den las 3 e lexiones meno es debido a la ca ga de los ma e iales. En b), c) y d) el p ime pico se
desplaza hacia la de echa, debido a la compac ación de los po os po la condensación de los silanoles
as la calcinación.
Como o a o ma de comp obación adicional de la co ec a es uc u a de los ma e iales, se
obse a on los sólidos en el mic oscopio elec ónico de ansmisión (TEM) (Figu a 15). Así, se
pudie on ap ecia los canales y la po osidad hexagonal que con o man la MCM-41,
con i mando la co ec a sín esis. Es a con i mación ue de especial impo ancia en el caso de
S1-GAL y S1-GLU (c) y d) espec i amen e), ya que a i maba el man enimien o de la es uc u a
hexagonal a pesa de habe se pe dido las 3 e lexiones meno es en el di ac og ama as la
ca ga de la nanopa ícula con odamina B. Asimismo se obse a un mayo con as e de los
po os en la MCM-41 calcinada b) espec o al es o de sólidos, ya que es el único sólido en el
que los po os se conse an acíos.
4| Resul ados y discusión
36
Figu a 15. Fo og a ías ep esen a i as de MCM-41 sin calcina a), MCM-41 calcinada b), S1-GAL c)
y S1-GLU d), ob enidas po TEM. Se pueden obse a los po os y canales hexagonales p opios de la
p esen e es uc u a mesopo osa, con mayo con as e en b) – dado que la MCM-41 calcinada iene los
po os lib es – espec o a la MCM-41 sin calcina (que aún con iene el ensoac i o CTAB en sus po os) y
S1-GAL y S1-GLU (que con ienen Rodamina B).
Así pues, eniendo en cuen a la in o mación apo ada po la di acción de ayos X en pol o
y el TEM, se concluyó que la sín esis de los sólidos S1-GAL y S1-GLU ue co ec a y que los
ma e iales p esen aban la es uc u a ca ac e ís ica del ma e ial MCM-41.
Po o o lado, se analiza on las iso e mas de adso ción-deso ción de N2 de los ma e iales
MCM-41 calcinada, S1-GAL y S1-GLU (Figu a 16), a pa i de las cuales se ob u o in o mación
sob e el amaño, olumen y supe icie especí ica de po o de los sólidos (Tabla 5).
Figu a 16. Iso e mas de adso ción-deso ción de N2 de la MCM-41 calcinada a), S1-GAL b) y S1-GLU c).
La MCM-41 calcinada mues a un aumen o a bajas p esiones pa ciales en la adso ción de N2, debido a la
in e nalización del gas en los po os; mien as que los sólidos inales mues an una o ma plana, signo de
que los po os se encuen an bloqueados con el colo an e odamina B que impide la en ada de N2.
4| Resul ados y discusión
37
Tabla 5. Tamaño, olumen de po o (calculados median e el mé odo BJH) y supe icie especí ica de
po o (calculada median e el modelo BET) de MCM-41 calcinada, S1-GAL y S1-GLU.
Sólido
Tamaño de po o
(nm)
Volumen de po o
(cm3 g-1)
Supe icie
especí ica (m2 g-1)
MCM-41calcinada
2.51
0.72
995.6
S1-GAL
-
0.418082
372.6037
S1-GLU
-
0.266134
131.8791
Las iso e mas ob enidas pa a MCM-41 (Figu a 16, a)) son p opias de es e ipo de ma e ial. A
p esiones pa ciales bajas-medias (P/P0 < 0.3) se obse a un aumen o del ni ógeno adso bido
debido a su condensación po capila idad en los mesopo os, y a al as p esiones pa ciales se
uel e a ap ecia un aumen o de la adso ción de N2, iso e ma conocida como de ipo IV. En el
caso de los sólidos S1-GAL y S1-GLU (Figu a 16, b) y c) espec i amen e) no se obse a un
aumen o apa en e en la adso ción de ni ógeno a bajas p esiones y la cu a p esen a una
o ma plana espec o a la de la MCM-41. Es e hecho indica una educción ap eciable de la
mesopo osidad, es deci , que los po os es án co ec amen e bloqueados con odamina B. Sin
emba go, a al as p esiones uel e a obse a se un aumen o de la adso ción, signo de que la
po osidad se conse a (Agos ini e al., 2012).
Es os es udios de po osime ía, jun o con la disminución que se p oduce en el olumen de
po o y en el á ea especí ica de los ma e iales inales espec o a la MCM-41 calcinada (Tabla 5),
indican que el ca gado de las nanopa ículas con odamina B ha enido luga co ec amen e:
los po os de los ma e iales uncionalizados es án llenos de colo an e y po an o la capacidad
de adso ción de N2 es meno .
Po úl imo, pa a log a una cuan i icación más exac a del con enido de odamina B
encapsulado en los po os y de la can idad de pue a molecula con la que se uncionaliza on
los sólidos, se ecu ió al análisis e mog a imé ico, análisis elemen al y a la cuan i icación de
odamina pe dida en las aguas de ca ga y la ado median e espec oscopia de abso ción UV/V
(a la longi ud de onda de máxima abso ción de la odamina B, λmáx = 555 nm). Los esul ados
ob enidos a pa i de es os análisis ue on: pa a el sólido S1-GAL, 0.22 mmol odamina B/g
sólido y 97.82 mg Galac an/g sólido; y pa a el sólido S1-GLU, 0.20 mmol odamina B/g sólido y
72.91 mg Glucidex-47/g sólido.
Una ez los sólidos es u ie on ca ac e izados es uc u almen e se p ocedió a lle a a cabo
su alidación uncional, que se ealizó median e es udios de libe ación in i o de odamina B.
Las libe aciones se lle a on a cabo en solución acuosa a pH 7.5 pa a simila las condiciones
isiológicas, en p esencia y ausencia de un es ímulo que uese capaz de ab i la pue a

4| Resul ados y discusión
38
molecula . En el caso de S1-GAL el es ímulo ue el enzima β–galac osidasa de le adu a
Kluy e omyces lac is, el cual es capaz de hid oliza los enlaces glicosídicos que con o man el
Galac an, pue a molecula de S1-GAL. En el caso de S1-GLU se ecu ió al complejo enzimá ico
panc ea ina, que con iene di e en es enzimas hid olí icos en e los que des aca la amilasa,
capaz de hid oliza el almidón que compone la pue a molecula de S1-GLU (Glucidex-47). Los
esul ados de los es udios de libe ación se mues an en la Figu a 17.
Figu a 17. Libe ación de odamina B en S1-GAL (izquie da) y S1-GLU (de echa), en p esencia y
ausencia (blanco) de los enzimas β–galac osidasa y panc ea ina espec i amen e. En los blancos se
obse a una libe ación de odamina B mínima, mien as que en p esencia del es ímulo enzimá ico se
obse a una libe ación mucho mayo que alcanza su máximo a las 24 ho as. La libe ación de colo an e
se midió median e luo escencia a λemisión = 580 nm. Los alo es es án ep esen ados como media ± s.
En la Figu a 17 se mues a cómo en las condiciones de blanco, en las que no había p esen e
enzima capaz de hid oliza la pue a molecula de los sólidos, la libe ación de odamina B es
p óxima a ce o, señal de que las pue as bloquean co ec amen e los po os y son capaces de
e ene el colo an e con enido en su in e io . Sin emba go, se obse a una mínima libe ación
en ausencia de enzima, que puede se debida a la p esencia de es os de odamina B
adso bida en la supe icie de los sólidos que no pudie on se eliminados median e los la ados.
En cambio, en p esencia del es ímulo enzimá ico se obse a una libe ación mucho mayo de
colo an e, no able ya a pa i de las 2.5 ho as (70% de la libe ación máxima) y que alcanza su
máximo a las 24 ho as. Es os esul ados demues an que el anclaje de las pue as molecula es
a la supe icie de los sólidos ca gados se lle ó a cabo co ec amen e, que dichas pue as son
capaces de bloquea los po os y que esponden al es ímulo pa a el cual es aban diseñadas.
Con odos los da os ob enidos se puede a i ma que los sólidos S1-GAL y S1-GLU p esen an
la es uc u a p opia de una nanopa ícula mesopo osa de sílice MCM-41 y son uncionales, po
lo que se puede p ocede a su empleo en sis emas celula es in i o.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
%In
Tiempo (h)
Blanco b-Galac osidasa
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25
%In
Tiempo (h)
Blanco Panc ea ina
4| Resul ados y discusión
39
4.2 ENSAYOS CELULARES
Una ez se ca ac e iza on y alida on los sólidos S1-GAL y S1-GLU es uc u al y
uncionalmen e, se p ocedió a es udia su espues a en un sis ema celula , conc e amen e en
el modelo de senescencia cons i uido po la línea celula ITM y el compues o 4-
hid oxi amoxi eno (4OHT), capaz de induci senescencia en dicha línea. Como ya se ha desc i o
en el apa ado 3.4.2, la línea ITM con iene una usión de la o ma ac i a del oncogén MEK1 al
dominio de unión a ho monas del ecep o de es ógeno humano, modi icado pa a que
únicamen e econozca al análogo de es ógenos 4OHT. De es a o ma, al añadi 4OHT se ac i a
el oncogén y se desencadena una espues a de senescencia inducida po oncogén.
Los p ime os ensayos celula es se lle a on a cabo pa a comp oba que el modelo celula de
senescencia inducida uncionaba. Pa a comenza se ealizó un ensayo de inducción de
senescencia con 4OHT, y la inducción se comp obó a a és de los cambios eno ípicos en las
células y del ensayo colo imé ico con X-Gal, que se explica á a con inuación. Una ez
con i mado que el modelo e a adecuado, se p obó que las nanopa ículas sin e izadas no
uesen óxicas pa a las células, y se p ocedió a con inuación a su alidación uncional en cul i o
celula . Pa a ello se añadie on las nanopa ículas an o a células senescen es y como no
senescen es, y se obse ó y cuan i icó la libe ación de odamina de ambos sólidos median e
mic oscopía con ocal. Finalmen e, se epi ió es e ensayo de mic oscopía con ocal en es e caso
habiendo a ado a las células p e iamen e con el disacá ido lac osa, pa a es udia si la adición
de dicho azúca a ec aba a la in e nalización y ape u a del sólido S1-GAL.
4.2.1 Comp obación del modelo celula de senescencia.
Uno de los asgos p opios de las células senescen es es su a es o del ciclo celula , po lo
que no sin e izan DNA. Sin emba go, es a ca ac e ís ica no puede emplea se pa a su
de ección, pues ambién es á p esen e en o as células del o ganismo, como las quiescen es o
las di e enciadas e minalmen e. El asgo eno ípico que las dis ingue de es as células que
ampoco se di iden, y que ha sido ex ensamen e empleado pa a su de ección desde que ue
desc i o en 1995, es su ac i idad β–galac osidasa aumen ada (Dim i e al., 1995; I hana e al.,
2013). Es a ac i idad se debe a un inc emen o en la masa lisosomal de las células senescen es,
que posibili a la ac i idad de dicho enzima a un pH subóp imo de 6 en luga de pH 4 – 4.5, al
que suele unciona de mane a óp ima no mal (Ku z e al., 2000). Así pues, es e asgo ue el
empleado pa a comp oba que, siguiendo las condiciones desc i as po Collado e al. (2005),
e ec i amen e se inducía el eno ipo senescen e en las células ITM.
4| Resul ados y discusión
40
El ensayo de de ección de senescencia ap o echando la ac i idad SA–β–Gal se basa en la
hid ólisis del sus a o pe meable X-Gal (5-b omo-4-clo o-3-indolil-β-D-galac opi anósido) po
pa e del enzima β–galac osidasa en condiciones de pH 6, libe ándose un compues o azulado
de ec able a simple is a. El sus a o X-Gal es á compues o po una molécula de galac osa,
econocida po el enzima β–galac osidasa, unida a 5-b omo-4-clo o-3-hid oxindol. Es e úl imo
compues o, al se libe ado po la hid ólisis, se oxida y dime iza espon áneamen e o mando
5,5’-dib omo-4,4’-diclo o-indigo (Figu a 18) (Bu n, 2012), p ecipi ado insoluble de colo azul
que iñe las células senescen es. La cla e del ensayo eside en el pH 6, que pe mi e que a pesa
de que odas las células p esen en β–galac osidasa, solo las senescen es mues en ac i idad a
es e pH subóp imo debido al al o con enido del enzima.
Figu a 18. Reacción de hid ólisis de X-Gal po el enzima β-galac osidasa y libe ación de un compues o
azulado.
El ensayo se lle ó a cabo al y como se desc ibe en el apa ado 3.4.3, siendo cla e la
inducción de senescencia du an e 72 ho as con 4OHT 100 nM. Fo og a ías celula es omadas al
mic oscopio se mues an en la Figu a 19. En ellas se obse a cómo las células no senescen es
(a, b y c) apenas mues an inción azul, mien as que un al o po cen aje de las células a las que
se les ha añadido 4OHT pa a induci senescencia (d, e y ) p esen an una ue e colo ación
azulada. Los esul ados de es e ensayo indican pues que la inducción de senescencia con 4OHT
ue e icaz. Asimismo, pe mi en ap ecia los cambios eno ípicos que se p oducen en las células
senescen es de la p esen e línea celula . Mien as que las células no senescen es p esen an la
mo ología ala gada en o ma de huso ca ac e ís ica de los ib oblas os, las células ITM
senescen es se encogen y adquie en una o ma edondeada, haciéndose más pequeñas. Así
pues, el eno ipo de senescencia en es e modelo celula es ácilmen e econocible, además las
células p esen an un g an núme o de pequeñas esículas de endoci osis y se ma ca mucho el
núcleo, que se e más e ingen e y se obse a poco ci oplasma.
4| Resul ados y discusión
41
Figu a 19. Imágenes ep esen a i as de la inción con X-Gal de células no senescen es (sin 4OHT, a, b
y c) y senescen es (con 4OHT, d, e y ). En las p ime as se obse a una inción azulada muy educida,
en e al al o po cen aje de células eñidas en el caso de las células senescen es. 4OHT: 4-
hid oxi amoxi eno.
4.2.2 Es udio de iabilidad celula con S1-GAL y S1-GLU.
A pesa de la expe iencia del g upo de in es igación con nanopa ículas MCM-41 y de ya
habe se comp obado que es os ma e iales son biocompa ibles y no causan oxicidad celula
(Agos ini e al., 2012; Be na dos e al., 2010), se ealiza on ensayos de iabilidad en las células
ITM a 24 ho as añadiendo los sólidos S1-GAL y S1-GLU a la concen ación empleada en el es o
de ensayos (50 μg/mL).
Como se expone en el apa ado 3.4.4, pa a es e ensayo se añadie on los sólidos S1-GAL y
S1-GLU a células ITM no senescen es y senescen es (que habían sido incubadas 72 ho as con
4OHT 100 nM). T as 24 ho as de incubación con las nanopa ículas, la iabilidad celula se
midió median e inción con c is al iole a. Los esul ados se mues an en la Figu a 20.
Figu a 20. Ensayo de iabilidad de células senescen es (+4-hid oxi amoxi eno (4OHT)) y no
senescen es (sin 4OHT) incubadas con S1-GAL (50 μg/mL) y S1-GLU (50 μg/mL) du an e 24 ho as. Los
da os apa ecen e e enciados espec o a sus espec i os con oles (senescen es y no senescen es sin
nanopa ículas), como media ± s. En ninguna de las condiciones se obse a una disminución ap eciable
de la iabilidad celula en las células a adas con nanopa ículas espec o a los con oles (p > 0.05).
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
Con ol sin NP S1-GAL S1-GLU
Abs/Abs0
50 ug/mL NP
sin 4OHT
+ 4OHT

5| Conclusión
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Los ensayos ealizados han pe mi ido ex ae las siguien es conclusiones…
1. Median e el p ocedimien o me odológico seguido se ha conseguido diseña , sin e iza y
ca ac e iza co ec amen e dos nanodisposi i os mesopo osos de sílice o mados po el
sopo e ino gánico MCM-41, ca gados con el luo ó o o odamina B y uncionalizados
con dis in os polisacá idos como pue a molecula , ob eniendo los sólidos inales S1-GAL
y S1-GLU.
2. Dichos nanodisposi i os son capaces de esponde al es ímulo enzimá ico ex e no pa a el
que es aban diseñados, mos ando una libe ación p óxima a ce o en su ausencia.
Asimismo, han demos ado se uncionales en los ensayos celula es, causando una
oxicidad celula nula. El sólido S1-GAL ha p obado se especí ico pa a las células
senescen es, mos ando una in e nalización y ape u a en dichas células es eces
mayo a la ob enida en células no senescen es. Po su pa e, S1-GLU no p esen a ningún
ipo de especi icidad po las células senescen es, libe ando su ca ga indisc iminadamen e
ambién en células con ol.
3. Finalmen e, se ha podido demos a median e una p ueba de concep o que en las células
senescen es exis e una exp esión/sob eexp esión de ecep o es de galac o-azúca es que
posibili an la endoci osis del sólido S1-GAL, con ibuyendo a su mayo in e nalización en
células senescen es.
El abajo ealizado no solo desa olla un nanodisposi i o capaz de di igi se selec i amen e a
las células senescen es, implicadas en un g an núme o de en e medades. También apo a
nue a in o mación espec o a las ca ac e ís icas dis in i as de dichas células, pe mi iendo en
un u u o un mayo conocimien o de su eno ipo y ab iendo la pue a al diseño de nue os
nanodisposi i os que engan una mayo selec i idad y pe mi an educi los e ec os
secunda ios de los a amien os a macológicos di igidos a la eliminación de células
senescen es.
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