Diseño racional y caracterización de nanodispositivos de sílice mesoporosa para liberación controlada en células senescentes

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Diseño acional y ca ac e ización de nanodisposi i os de sílice mesopo osa pa a libe ación con olada en células senescen es TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA ALUMNA: Regina Bou Pue o TUTOR: José Ramón Mu guía Ibáñez Cu so Académico: 2014/2015 VALENCIA, 7 de julio de 2015 Tí ulo del TFG Diseño acional y ca ac e ización de nanodisposi i os de sílice mesopo osa pa a libe ación con olada en células senescen es. Au o a Regina Bou Pue o Ti ulación G ado en Bio ecnología Tu o José Ramón Mu guía Ibáñez Fecha y localidad de lec u a Valencia, julio de 2015 ABSTRACT The main goal o he cu en p ojec is he de elopmen and alida ion, in a cellula model o senescence, o mesopo ous silica nanopa icles (MSNs) unc ionalized wi h galac o- oligosaccha ides (GOS) which can selec i ely deli e hei ca go in senescen cells. Cellula senescence is a s a e in which cells en e an i e e sible cell cycle a es and acqui e an al e ed pheno ype cha ac e ized by hype -sec e ion. I is a p ocess igge ed by s ess and cellula damage, and i cons i u es an al e na i e ou e o p og ammed cell dea h o a oid cell damage p og ession. Howe e , accumula ion o hese cells al e s issue s uc u e, being associa ed o aging and ela ed diseases, cance o idiopa hic pulmona y ib osis (IPF). All oge he , i is necessa y o de elop he apeu ic s a egies selec i ely a ge ing senescen cells. The use o MSNs as con olled d ug deli e y sys em has been ex ensi ely exploi ed ecen ly due o he ad an ages hey show. Among hem, biocompa ibili y, he mal and chemical s abili y, homogeneous po e olume, high speci ic su ace a ea o con ain g ea e amoun s o d ugs and he possibili y o su ace unc ionaliza ion wi h biomolecules ac ing as molecula ga es, a e highligh ed. Molecula ga es a e sup amolecula de ices (DNA, pep ides, syn he ic molecules, polyme s…) in which mass ans e is ini ia ed by an ex e nal s imuli, in such a way ha molecules p e iously loaded in o he mesopo es o MSN a e eleased. Conc e ely, ou g oup has de eloped a nanode ice able o deli e small molecules a ge ing senescen cells. I is based in mesopo ous silica nanopa icles unc ionalized wi h galac o- oligosaccha ides as molecula ga e. Senescen cells a ge ing is achie ed hanks o inc emen ed β-galac osidase ac i i y (SA- β-gal). Howe e , in he p esen wo k a p oo o concep is p oposed o demons a e ha speci ici y achie ed by ou nanode ice is no only due o SA-β-gal, bu also o he p esence o GOS ecep o s in senescen cells su ace. The nanode ice unc ionalized wi h GOS was s uc u ally and unc ionally alida ed, showing speci ici y o senescen cells. Finally, we we e able o demons a e, h ough a p oo o concep , ha senescen cells show an inc eased exp ession o galac o-saccha ides ecep o s which ease he endocy osis o he syn hesized nanopa icle. Such knowledge could b ing aluable in o ma ion o de elop in a u u e nanode ices unc ionalized wi h mo e selec i e GOS o senescen cells loaded wi h cy o oxic compounds, and use hese nanode ices o ea diseases such as cance . Key wo ds Mesopo ous Silica Nanopa icles (MSNs), cellula senescence, a ge ing. RESUMEN El obje i o p incipal del p esen e TFG es el desa ollo y alidación, en un modelo celula de senescencia, de ma e iales mesopo osos de sílice (MSNs) uncionalizados con galac o- oligosacá idos (GOS) que puedan libe a su ca ga de o ma selec i a en las células senescen es. La senescencia celula es una condición en la que las células p esen an un es ado de a es o i e e sible del ciclo celula y un eno ipo al e ado hipe sec e o . Se a a de un p oceso que se inicia como espues a al es és y daño celula , y cons i uye una u a al e na i a de espues a a la mue e celula p og amada pa a e i a la p og esión del daño. Sin emba go, la acumulación de dichas células al e a la a qui ec u a isula , es ando elacionada con el en ejecimien o y pa ologías elacionadas, cánce o ib osis pulmona idiopá ica (IPF). Po odo ello, es necesa io dispone de es a egias e apéu icas di igidas que eliminen las células senescen es selec i amen e. El empleo de MSNs como sis ema de en ega con olada y di igida de á macos ha sido ex ensamen e explo ado ecien emen e debido a las múl iples en ajas que p esen an. En e es as des aca su biocompa ibilidad, es abilidad é mica y química, olumen de po o homogéneo, al a supe icie especí ica pa a albe ga mayo can idad de á maco y la posibilidad de uncionaliza su supe icie con biomoléculas que ac úen como pue a molecula . Las pue as molecula es son disposi i os sup amolecula es (DNA, pép idos, moléculas sin é icas, políme os, e c.) en los que exis e un anspo e de ma e ia iniciado po un es ímulo ex e no, de o ma que as dicho es ímulo se libe an las moléculas p e iamen e a apadas en los mesopo os del ma e ial MSN. Conc e amen e, nues o g upo ha desa ollado un nanodisposi i o que iene la capacidad de libe a de o ma con olada moléculas pequeñas exclusi amen e en células senescen es. Dicho nanodisposi i o se basa en nanopa ículas mesopo osas de sílice, uncionalizadas con galac o-oligosacá idos como pue a molecula . La especi icidad hacia las células senescen es se consigue g acias a la ac i idad aumen ada β-galac osidasa asociada a dichas células (SA-β-gal). Sin emba go, en el p esen e abajo se plan ea una p ueba de concep o pa a demos a que la especi icidad conseguida con los nanodisposi i os sin e izados no se debe únicamen e a SA-β-gal, sino que se hipo e iza la exis encia de ecep o es especí icos po GOS en la supe icie de las células senescen es. El nanodisposi i o uncionalizado con GOS ue alidado es uc u al y uncionalmen e, mos ando especi icidad po las células senescen es. Finalmen e, se ha podido demos a median e una p ueba de concep o que en las células senescen es exis e una exp esión/sob eexp esión de ecep o es de galac o-azúca es que posibili an la endoci osis de la nanopa ícula sin e izada. Dicho conocimien o pod ía pe mi i en un u u o el desa ollo de nanodisposi i os uncionalizados con GOS más selec i os ca gados con compues os ci o óxicos pa a las células senescen es como nan e apia pa a a a en e medades como el cánce . Palab as cla e Nanopa ículas Mesopo osas de Sílice (MSNs), senescencia celula , a ge ing. AGRADECIMIENTOS An es que nada, da las g acias a Jose a po b inda me es a opo unidad. Sabes cómo ende e bien, pe o aun así no haces jus icia al mundo “nano”: es mucho más emocionan e y p ome edo de lo que se puede imagina o explica con palab as. También ag adece a Ramón que me acogiese en el g upo con los b azos abie os, abaja en él ha sido una de las mejo es decisiones de mi oda ía co a ca e a bio ecnológica. También quie o ap o echa la ocasión pa a ag adece a la Asociación Española Con a el Cánce , no solo a í ulo pe sonal po la beca que me concedie on, sino sob e odo po apos a po la in es igación y los jó enes españoles. Ese es el camino a segui pa a gana la ba alla con a el cánce . Cómo no, g acias a odas las chicas (y algún que o o chico) del Lab de Nanomedicina, y a oda la gen e del 2.6. Po los almue zos, los consejos, la “IDM Fashion Week” y las isas, sob e odo en los momen os de máxima desespe ación expe imen al. Todo el su imien o y ho as de abajo han me ecido la pena sólo po conoce os y habe ap endido an o de oso os. Finalmen e y no po ello menos impo an e… G acias in ini as al “Equipo Senescencia”. C is, I ene, ha sido un place abaja con oso as. I ene, que ha sido mi co u o a en la somb a y no se ha podido lle a ese econocimien o. Me habéis dejado el lis ón muy al o, aho a a a se muy di ícil encon a unas compañe as de labo a o io, p o es y amigas an buenas. Ojalá odo el mundo uese igual de compe en e, de ag adable, de inspi ado , como lo sois oso as. G acias po odo lo que me habéis enseñado, an o den o como ue a del lab (sí, home). Vos o a é a al a ! ¿Qué pasa á, qué mis e io hab á? ¡Vues o Pa i o no os ol ida! Po supues ísimo, g acias a mi amilia. G acias po la educación que me habéis dado y que me ha pe mi ido llega has a aquí. Mis pad es, mi ejemplo a segui , mi mo i ación. Bicho, ú en as en es a amilia. Ellos, que se aleg an más de mis ic o ias que yo misma, el pila inamo ible de mi ida. P ome o se siemp e una buena in e sión y alguien de quien os sin áis o gullosos. Y pa a acaba … G acias a La Pega ina. Vues a música y ues o buen ollo amenizan cualquie a ea, ¡incluso el análisis de in ini as imágenes de con ocal! Índice I ÍNDICE 1 1| | I IN NT TR RO OD DU UC CC CI IÓ ÓN N 1| In oducción 3 1.1 SENESCENCIA CELULAR La senescencia celula es un es ado es able de a es o del ciclo celula , en el que las células de ienen su p oli e ación y adquie en un eno ipo al e ado, como se desc ibi á a con inuación. Fue desc i a po p ime a ez en ib oblas os diploides humanos (HDF) cul i ados in i o (Hay lick & Moo head, 1961) como consecuencia del aco amien o de los elóme os as sucesi as eplicaciones, po lo que se conoce como senescencia eplica i a (Campisi, 1997; Ha ley e al., 1990; Hay lick, 1965). Hoy en día se conocen más mecanismos di e en es a la senescencia eplica i a que desencadenan el eno ipo senescen e, como se menciona á en es e abajo, de en e los cuales des aca la senescencia inducida po oncogén (OIS) (Se ano e al., 1997) . Asimismo, se ha conseguido elaciona la senescencia celula con condiciones isiológicas no males, pe o ambién pa ológicas, de o ma que en cie as en e medades ac úa como un mecanismo de de ensa pa a de ene la p og esión de la pa ología, mien as que en o as con ibuye a su desa ollo, dualidad conocida como pleio opía an agonis a ( e isado po Muñoz-Espín & Se ano, 2014; Campisi, 1997). Así, la senescencia celula eme ge como un a ma de doble ilo, en la que e apias p o-senescen es ayudan a comba i en e medades, pe o deben i combinadas con pos e io es a amien os an i-senescen es (Campisi, 2005; Muñoz- Espín & Se ano, 2014; Na della e al., 2011). 1.1.1 Mecanismos de inducción de senescencia. Ac ualmen e se conocen nue os mecanismos de inducción de senescencia di e en es al cons i uido po el aco amien o de los elóme os. Algunos de los desencadenan es de senescencia apa ecen esquema izados en la Figu a 1. Figu a 1. Mecanismos molecula es de senescencia celula . Las di e en es señales (aco amien o de elóme os, daño al DNA, ac i ación de oncogenes) inducen el eno ipo senescen e a a és de p o eínas inhibido as del ciclo celula y del sup eso umo al p o eína del e inoblas oma (Rb). ROS: especies eac i as de oxígeno. SASP: eno ipo sec e o asociado a senescencia (Muñoz-Espín & Se ano, 2014). 1| In oducción 4 Es os nue os mecanismos incluyen la inducción de senescencia como espues a al daño al DNA (DDR), po es és y especies eac i as de oxígeno (ROS), po pe u bación de la c oma ina, po señales mi ogénicas ue es, po de ep esión del locus CDKN2A (que codi ica pa a los inhibido es del ciclo celula p16 y ARF), inducida po oncogén, o incluso po la acción pa ac ina de o as células senescen es (po SASP) ( e isado po Campisi & d’Adda di Fagagna (2007) y Muñoz-Espín & Se ano (2014)). En gene al, dichas causas con e gen en la ac i ación de genes sup eso es de umo es e inhibido es del ciclo celula como p16, p15, p21, p27 y la o ma hipo- os o ilada de la p o eína del e iboblas oma (Rb). 1.1.2 Ca ac e ís icas eno ípicas de las células senescen es. A pesa de es a a iedad en las causas de la inducción de senescencia, exis en una se ie de ca ac e ís icas eno ípicas y bioma cado es acep ados como comunes a las células senescen es. Es as ca ac e ís icas incluyen la ausencia de ma cado es p oli e a i os (p o eína Ki67 o no inco po ación de 5-b omodeoxiu idina (B dU)), exp esión de inhibido es del ciclo celula y sup eso es de umo es (p16, p15, p21, p27, p53, Rb hipo os o ilada, en e o os), un aumen o en la ac i idad β–galac osidasa (senescence–associa ed  –galac osidase, SA–β–gal); ma cado es de daño del DNA, ocis nuclea es de he e oc oma ina asociados a senescencia (SAHF), un eno ipo hipe sec e o p o-in lama o io (senescence-associa ed sec e o y pheno ype (SASP), con exp esión de moléculas como el ac o de c ecimien o ans o man e β (TGF–β), el ac o nuclea κB (NF–κB), in e leuquinas 6 y 8 (IL-6, IL-8) o p o eínas in lama o ias de mac ó agos (MIP), en e muchas o as), al e aciones me abólicas o mac oau o agia (Muñoz-Espín & Se ano, 2014; Pé ez-Mance a e al., 2014). El conocimien o de es as ca ac e ís icas eno ípicas p opias de las células senescen es es imp escindible pa a su de ección y pa a el desa ollo de e apias di igidas hacia es as células. Ac ualmen e, de odas ellas, la ac i idad SA–β–gal adquie e especial ele ancia, pues ha sido y es ex ensamen e empleada pa a su de ección (Dim i e al., 1995). 1.1.3 Senescencia en isiología y pa ología. En condiciones isiológicas, la senescencia juega un papel cla e en la emodelación isula . Ac ualmen e se sabe que pa icipa en el desa ollo emb iona io, donde elimina es uc u as ansi o ias y egula la p opo ción de di e en es ipos celula es (Muñoz-Espín e al., 2013; S o e e al., 2013), ac uando como un mecanismo complemen a io a la apop osis. Asimismo, se sabe que la senescencia ocu e ambién en ejidos adul os no males, siendo un mecanismo de madu ación de megaca ioci os (Besanceno e al., 2010) y sinci io o oblas os de la placen a (Chup in e al., 2013). 1| In oducción 5 Pe o la senescencia no solo es á p esen e en condiciones isiológicas como las has a aho a expues as, sino que ambién se ha desc i o en pa ologías. Muñox-Espín & Se ano (2014) p oponen que el in úl imo de la senescencia es con ibui a la eliminación de células dañadas, es ingi la p oli e ación del daño isula y p omo e la egene ación del ejido. La secuencia de pasos pa a consegui al p opósi o consis e en un p ime paso de inducción de senescencia de las células dañadas, seguido de la eliminación de es as células senescen es po pa e del sis ema inmune (Hoenicke & Zende , 2012) – paso al que con ibuye el eno ipo hipe sec e o y p o-in lama o io de dichas células – y inalmen e egene ación del ejido dañado. En ese mismo a ículo, los au o es hacen una e isión de aquellas condiciones pa ológicas en las que se cumple dicha secuencia y la inducción de senescencia ac úa como un mecanismo p o ec o y de de ención de la p og esión de la pa ología, siendo algunos ejemplos la ib osis hepá ica, enal, o al y ca diaca; la a e oscle osis, la hipe ensión pulmona y el cánce , en el cual la senescencia de iene la p opagación de las lesiones p e-cance osas. Sin emba go no siemp e se p oduce una eliminación e ec i a de las células senescen es, debido an o a la ac uación de ec uosa del sis ema inmune como a la inducción de senescencia en células mad e (Muñoz-Espín & Se ano, 2014). Es a acumulación es á ue emen e elacionada con el en ejecimien o, pe o ambién con ibuye a o as en e medades como la ib osis pulmona idiopá ica (IPF), la obesidad, la diabe es ipo 2, las ca a a as o incluso el cánce , en el que a pesa de ac ua inicialmen e como una ba e a con a su p og esión, as la acumulación de células senescen es su eno ipo hipe sec e o (SASP) induce umo igénesis (Pé ez-Mance a e al., 2014). Es e concep o de la senescencia como a ma de doble ilo apa ece e lejado en la Figu a 2. Figu a 2. Modelo de senescencia. T as el daño celula se induce senescencia como mecanismo de de ensa, se eclu a al sis ema inmune g acias al SASP y se eliminan las células senescen es. Sin emba go, en cie as pa ologías o po el en ejecimien o se acumulan es as células y se p oduce dis unción isula (Muñoz-Espín & Se ano, 2014). SASP: eno ipo sec e o asociado a senescencia. 1| In oducción 6 1.1.4 Te apias an i-senescen es. Es e abajo se cen a en las e apias an i-senescen es, que buscan la eliminación de células senescen es pa a a a pa ologías como el cánce o la IPF. Ac ualmen e los dos pun os de acción p incipales de es as e apias pasan po la inmuno e apia senescen e y el diseño de pequeñas moléculas le ales pa a las células senescen es, campo en el que se ha p oducido un g an a ance al descub i la ue e demanda y dependencia ene gé ica que p esen an las células senescen es, y que se puede explo a median e inhibido es me abólicos del ca abolismo de la glucosa (Dö e al., 2013; O adya & K izhano sky, 2014). Sin emba go, en cualquie a de los casos es necesa io encon a una es a egia que pe mi a una e apia di igida especí icamen e hacia células senescen es, sin que gene e e ec os secunda ios en el es o del o ganismo. En es e pun o en a en juego la nano ecnología y la nanomedicina, ciencias capaces de apo a soluciones que cumplen es os eque imien os. 1.2 NANOTECNOLOGÍA Y NANOMEDICINA La nano ecnología es la ciencia que, median e la manipulación de á omos y moléculas, consigue cons ui es uc u as de un amaño nanomé ico (100 nm o menos) con unas p opiedades ísicas y químicas únicas, a menudo mejo es o adicalmen e di e en es a las de la ma e ia inicial (Climen Te ol, 2012; Moghimi e al., 2005). Den o de es a amplia disciplina su ge la nanomedicina, una nue a ama de la nano ecnología que busca la aplicación de nanopa ículas y nanoma e iales pa a el a amien o, diagnós ico, moni o ización y con ol de sis emas biológicos (Moghimi e al., 2005). Algunas de es as aplicaciones biomédicas incluyen el desa ollo de nanodisposi i os como biosenso es pa a el diagnós ico, nanopa ículas magné icas pa a imagen biomédica o bioma e iales pa a implan es biomédicos (Wagne e al., 2006). Sin emba go, la angua dia en el mundo de la nanomedicina es el empleo de nanodisposi i os pa a consegui la en ega di igida y con olada de á macos de mane a especí ica (Moghimi e al., 2005; Wagne e al., 2006). 1.2.1 Nanodisposi i os como sis ema con olado de libe ación de á macos. Exis e una amplia a iedad de nanodisposi i os que pe mi en la en ega y libe ación de á macos (d ug deli e y sys em, DDS), como son políme os, liposomas, dend íme os, micelas polimé icas, nanopa ículas de i adas de cápsula de i us o nanopa ículas ce ámicas (Bawa ski e al., 2008; Moghimi e al., 2005). Es os nano anspo ado es apo an un g an núme o de en ajas espec o al uso de á macos en o mulación lib e. Median e la nano o mulación de moléculas e apéu icas se 1| In oducción 7 consigue mejo a sus p opiedades a macociné icas y a macodinámicas, se aumen a su solubilidad y su biodisponibilidad y se consigue un e ec o e apéu ico más inmedia o educiendo además los e ec os secunda ios (Med ede a e al., 2007; Valle -Regí e al., 2007). Conc e amen e, en el p esen e abajo se emplea án nanopa ículas mesopo osas de sílice como disposi i os pa a un a amien o di igido. Es os nanodisposi i os p esen an en ajas adicionales además de las ya expues as, que se desa olla án con más de alle. Su educido amaño (en e 80 y 100 nm) pe mi e aspasa ba e as biológicas y una mayo pene ación celula (Da is e al., 2008; Med ede a e al., 2007), siendo posible po ejemplo que a a iesen la ba e a hema oence álica (Fiand a e al., 2015). Además, y como se p o undiza á más adelan e, es e ipo de ma e iales pe mi e su uncionalización con biomoléculas pa a di igi las nanopa ículas especí icamen e hacia células o ejidos diana, consiguiendo mejo a la e ec i idad a macológica de moléculas e apéu icas y educi sus e ec os secunda ios (Moghimi e al., 2005; Slowing e al., 2008). 1.2.2 Nanopa ículas Mesopo osas de Sílice (MSNs). Ac ualmen e, los ma e iales mesopo osos de sílice (MSNs) su gen como naodisposi i os de en ega y libe ación de á macos con mucho po encial (Valle -Regí e al., 2006; Yang e al., 2012). Es o se debe al g an núme o de en ajas que p esen an pa a dicho in, ampliamen e e isado en la bibliog a ía. Po un lado, se a a de moléculas biocompa ibles que no p esen an oxicidad (Yang e al., 2012). Además, son es ables química y é micamen e (Slowing e al., 2008). Po o o lado, es e ipo de ma e iales se ca ac e izan po posee una ed o denada y homogénea de po os (2-10 nm) que pe mi en un amplio con ol en la ca ga y la ciné ica de libe ación del con enido de los nanodisposi i os. Además, cons an de un al o olumen de po o (1 cm3g -1) y supe icie especí ica (500–1000 m2 g-1), pe mi iendo la ca ga y adso ción de mayo es can idades de á maco. Finalmen e, el hecho de p esen a g upos silanoles (Si–OH) sin eacciona en su supe icie pe mi e su uncionalización con moléculas y biomoléculas o gánicas, que pe mi an con ola la ca ga encapsulada en los po os y el p oceso y luga de su libe ación (Figu a 3). Finalmen e, es e ipo de ma e iales pe mi en un g an con ol en la es uc u a y po osidad del sólido inal, a a és del cambio de las condiciones de concen ación, pH, empe a u a o su ac an e empleadas en la sín esis (Climen Te ol, 2012; Valle -Regí e al., 2007). Figu a 3. Funcionalización de MSNs. Los silanoles de MSNs eaccionan con g upos ialcoxisilano (modi icada de Ho mann e al., 2006). 1| In oducción 8 De en e es e ipo de ma e iales MSN, des acan las es uc u as MCM-41, MCM-48 y MCM- 50, que pe enecen a la amilia mesopo osa M41S desa ollada en 1992 y p esen an un diáme o de po o de en e 2 y 10 nm (Ho mann e al., 2006). En la Figu a 4 apa ecen ep esen adas las es uc u as de es os es ma e iales. Conc e amen e el ma e ial MCM-41, con el que se abaja á en es e p oyec o, se empleó po p ime a ez como anspo ado de á macos en 2001 (Valle -Regi e al., 2001). Figu a 4. Es uc u a de los ma e iales mesopo osos de la amilia M41S. a) MCM-41 con dis ibución hexagonal de po os; b) MCM-48 con dis ibución cúbica; y c) MCM-50 con es uc u a lamina (Ho mann e al., 2006). 1.2.3 Pue as molecula es. El concep o de pue a molecula de ine un sis ema nanoscópico capaz de con ola el anspo e y en ega de ma e ia, que se inicia en espues a a un es ímulo ex e no. Los nanodisposi i os con pue a molecula cons an de una es uc u a ino gánica, que apo a los po os en los que encapsula la ca ga de in e és, uncionalizada con una pue a molecula ex e na que man iene dicha ca ga ence ada y únicamen e la libe a as la acción de un es ímulo ex e no. Po an o, es as pue as p esen an un es ado ce ado, en el que idealmen e exis e una libe ación ce o; y o o abie o, en el que únicamen e as la aplicación de un es ímulo ex e no la pue a se ab e y libe a el con enido a apado en los po os de los ma e iales MSNs (Coll e al., 2013; Climen Te ol, 2012). Es as pue as molecula es pueden se de na u aleza muy di e sa (pé idos, sacá idos, DNA, políme os…), ob eniéndose como esul ado un ma e ial híb ido o gánico-ino gánico. Asimismo, se han desc i o un amplio abanico de sis emas con pue as molecula es capaces de esponde a es ímulos muy di e sos (pH, empe a u a, luz, p esencia de enzimas, po encial edox), ampliamen e e isados en la bibliog a ía (Coll e al., 2013; Climen Te ol, 2012; Yang e al., 2012; Slowing e al., 2008). Sumando oda la in o mación has a aho a expues a, el diseño de un nanodisposi i o mesopo oso de sílice uncionalizado con una biomolécula capaz de di igi lo selec i amen e hacia células senescen es se plan ea como una es a egia e apéu ica iable pa a el a amien o de en e medades elacionadas con la acumulación de dichas células. 2 2| | O OB BJ JE ET TI IV VO OS S 3| Ma e iales y mé odos 16 ac i idad β–galac osidasa. Todos los polisacá idos empleados es aban disponibles come cialmen e, y su es uc u a se puede obse a en la igu a 5. Así pues, Galac an es un oligosacá ido o mado po dos isacá idos de galac osa unidos po un enlace σ-glicosídico. Po su pa e, Glucidex-47 es un hid olizado de almidón (polisacá ido que consis e en un g an núme o de moléculas de glucosa unidas po enlaces σ-glicosídicos) que cons a de un 5% de glucosa, 50% de mal osa y 45% de oligosacá idos y polisacá idos de glucosa. Figu a 5. Es uc u a química básica de Galac an (izquie da, ChemicalBook CAS 39300-87-3) y Glucidex- 47 (de echa, Be na dos e al., 2010). 3.2.3 Sín esis de la es uc u a mesopo osa ino gánica de sílice MCM-41. Pa a la sín esis de la es uc u a MCM-41 se pesó 1 g (2.74 mmol) del su ac an e CTAB y se añadie on 480 mL de agua desionizada en un aso de p ecipi ados, muy despacio pa a que no se c ease espuma. Sob e una placa cale ac o a con un e mopa pa a con ola la empe a u a se aumen ó la empe a u a a 28oC con agi ación pa a disol e o almen e el CTAB. En ese momen o se añadie on 3.5 mL de NaOH 2M en agua desionizada, ápidamen e pa a e i a la ca bona ación. Se apó el aso de p ecipi ados en el que se p oducía la eacción con un id io de eloj y se ajus ó la empe a u a a 80oC, man eniendo la agi ación. Al llega a los 80oC se añadie on 5 mL de TEOS (2.57 x 10-2 mol) go a a go a con una pipe a Pas eu . Cubie a con el id io de eloj, se dejó anscu i la eacción du an e 2 ho as a 80oC, man eniendo la agi ación. T as es e pe iodo se ob u o un p ecipi ado blanco, el cual ue cen i ugado 20 minu os a 9500 pm. T as es a p ime a cen i ugación se eliminó el sob enadan e y se la ó epe idamen e el sólido con agua des ilada has a que se alcanzó un pH de 7 en las aguas de la ado. En es e momen o, se dejó seca el sólido MCM-41 a 60oC du an e la noche pa a elimina la humedad. Finalmen e se calcinó el ma e ial en la mu la pa a elimina el CTAB y deja lib es los po os del sólido, pa a pode ca ga lo pos e io men e con el compues o deseado. Pa a ello el p og ama de calcinación que se empleó consis ió en llega a 550oC y man ene esa empe a u a du an e 5 ho as en a mos e a oxidan e. 3| Ma e iales y mé odos 17 En esumen, se empleó una p opo ción mola de 2 TEOS: 0.52 CTAB: 0.5 NaOH: 180 H2O pa a p oduci la es uc u a mesopo osa MCM-41. De mane a más isual, en la igu a 6 se puede obse a cómo du an e el p oceso el su ac an e CTAB o ma micelas que se disponen en o ma de cilind o y que adquie en una dis ibución hexagonal. És e ac úa como “ empla e” al ededo del cual se condensa el p ecu so ino gánico TEOS. Finalmen e, el su ac an e es eliminado median e calcinación, dejando disponibles los po os de la es uc u a MCM-41. Figu a 6. Esquema de la sín esis del nanodisposi i o mesopo oso de sílice MCM-41. El su ac an e CTAB o ma micelas que se disponen en o ma de cilind os con a eglo hexagonal, al ededo del cual se condensa el TEOS. Finalmen e, el su ac an e es eliminado po calcinación (modi icada a pa i de Yang e al., 2012). TEOS: e ae ilo osilica o. 3.2.4 Ca ga del ma e ial MCM-41 con odamina B: ob ención de los sólidos S1. A pa i del ma e ial MCM-41 p epa ado se sin e iza on dos sólidos S1 di e en es, que pos e io men e llama emos S1-GAL y S1-GLU en unción de la pue a molecula empleada en cada uno de ellos (Galac an en el p ime caso, Glucidex-47 en el segundo). Los dos ma e iales sin e izados se ca ga on con el colo an e luo escen e odamina B (Figu a 7), que po sus ca ac e ís icas (ausencia de oxicidad celula , ácil cuan i icación y posibilidad de encapsula en MCM-41) es idóneo pa a ealiza ensayos de pues a a pun o de nue os sis emas y si ió como ma cado pa a de ec a la libe ación de la ca ga de las nanopa ículas. El p oceso de ca ga ue lige amen e di e en e pa a cada sólido. En ambos casos se pesa on 700 mg de MCM-41 y 268.25 mg de odamina B (0.8 mmol odamina B/g MCM-41). En el caso del sólido S1-GAL las nanopa ículas y el colo an e se esuspendie on en 56 mL de e anol (80 mL e anol/g MCM-41), mien as que en el caso de S1-GLU la suspensión se ealizó en el mismo olumen pe o de agua des ilada (80 mL agua des inada/g MCM-41). La suspensión se dejó en un balón agi ándose a empe a u a ambien e du an e 24 ho as. 3| Ma e iales y mé odos 18 Figu a 7. Es uc u a química de la odamina B (PubChem CID: 6694). 3.2.5 Funcionalización de los sólidos S1 pa a ob ene S1-GAL y S1-GLU: anclaje de la pue a molecula . La uncionalización de los sólidos con los polisacá idos que ac úan como pue a molecula se lle ó a cabo median e p e ia eacción de de i a ización. Es o signi ica que se hizo eacciona p ime amen e el g upo amina del APTES con los oligosacá idos Galac an y Glucidex- 47, ob eniéndose así un p oduc o de i ado que pos e io men e se ancló a la supe icie del sólido S1. Pa a lle a a cabo la eacción de de i a ización el p ime paso consis ió en pone a acío 1 g amo de cada sacá ido du an e unas ho as, pa a elimina la humedad. A con inuación, a cada balón que con enía el sacá ido se le añadie on 50 mL de e anol, en a mós e a de ni ógeno y agi ación a empe a u a ambien e. T as la disolución de los azúca es se añadie on 1.17 mL de APTES (10 mmol APTES/g MCM-41), y se deja on anscu i ambas eacciones du an e 24 ho as en agi ación. T as es o se aumen ó la empe a u a a 40oC en el caso del balón con Galac an y se man u o du an e 1 ho a, y a 60oC en el del Glucidex-47, du an e 30 minu os. Finalmen e, se elimina on los disol en es de ambas eacciones median e o a apo ación, y los p oduc os esul an es se man u ie on a acío du an e la noche. A con inuación se p ocedió a lle a a cabo el anclaje de las pue as molecula es ecién sin e izadas a los sólidos S1. En el caso del sólido S1-GAL se añadie on 3.5 mg del p oduc o Galac an de i a izado, p e iamen e mol u ado, a su espec i a eacción de ca ga de la MCM- 41 desc i a en el apa ado 3.2.3 (5 g p oduc o/g MCM-41). En el caso del sólido S1-GLU se añadie on 0.7 mg del p oduc o Glucidex-47 de i a izado y mol u ado a su espec i a eacción de ca ga de MCM-41 (apa ado 3.2.3) (1 g/g MCM-41). Es as suspensiones se man u ie on en agi ación du an e 24 ho as y se cen i uga on pos e io men e du an e 10 minu os a 9500 pm pa a ecupe a los sólidos S1-GAL y S1-GLU, que se seca on en es u a a 37oC. Finalmen e las nanopa ículas ob enidas se la a on con agua median e epe idas il aciones (pa a elimina 3| Ma e iales y mé odos 19 los es os de odamina B adhe idos a la supe icie ex e na de las nanopa ículas) y se seca on a acío, ob eniéndose así los sólidos S1-GAL y S1-GLU inales. 3.2.6 Ca ac e ización de los sólidos S1-GAL y S1-GLU. Una ez ob enidos los sólidos inales, la MCM-41 sin calcina y calcinada y los sólidos S1- GAL y S1-GLU se analiza on pa a comp oba la co ec a sín esis, ca ga y uncionalización de los ma e iales, así como pa a e si p esen aban las p opiedades ca ac e ís icas de es e ipo de ma e iales. La ca ac e ización cons ó de un análisis de di acción de ayos X en pol o (DRX), análisis e mog a imé ico (TG), cuan i icación de la ca ga de odamina B po espec oscopía UV/V y mic oscopía elec ónica de ansmisión (TEM), ealizados en el Cen o de Reconocimien o Molecula y Desa ollo Tecnológico (IDM) de la Uni e sidad Poli écnica de Valencia (UPV); es udio de adso ción-deso ción de N2 en la Uni e sidad Complu ense de Mad id (UCM); y análisis elemen al en el Ins i u o de Ciencia de los Ma e iales de la Uni e sidad de Valencia (ICMUV). El análisis de di acción de ayos X se ealizó pa a los cua o sólidos. Se empleó un di ac óme o B uke D8 Ad ance con adiación CuKα. Unos 200 mg de cada sólido (en caso de dispone se de ellos, o en su de ec o la can idad máxima posible) se mol u a on y coloca on o mando una pas illa en el disco del equipo. El p og ama empleado u iliza unas en anas de bajo ángulo ( en ana de di e gencia de 0.2 mm, en ana de dispe sión de 3 mm y en ana del de ec o de 1 mm), sin gi o de la mues a, con una du ación de 11 minu os. El análisis e mog a imé ico ealizado a los sólidos inales pa a calcula la can idad de ma e ia o gánica que con enían se lle ó a cabo en un analizado de Me le Toledo en a mós e a oxidan e (ai e, 80 mL/min). El p og ama de calo empleado consis ió en una ampa de 10 g ados/min, comenzando en 393 K y acabando en 1273 K, y 30 minu os iso é micos a 1273 K. El cálculo de la ca ga de odamina en los sólidos S1 inales se lle ó a cabo median e la cuan i icación de la can idad de odamina pe dida en las aguas de ca ga y la ado de los sólidos, y su sus acción a la can idad de odamina inicial añadida a la eacción de ca ga de las nanopa ículas. La cuan i icación se lle ó a cabo po espec oscopía de ul a iole a- isible en un equipo JASCO V-650. Las imágenes de TEM de las 4 nanopa ículas pa a obse a su es uc u a a ni el mic oscópico ue on ob enidas en el Se icio de Mic oscopía de la UPV, en un mic oscopio Philips CM10. Pa a la p epa ación de las mues as se suspendió una pequeña can idad de cada sólido en diclo oe ano, y unas go as de dicha suspensión se deposi a on sob e una ejilla de 3| Ma e iales y mé odos 20 cob e ecubie a de 300 mallas de ca bono, quedando lis as pa a su obse ación una ez se secó el disol en e. Las iso e mas de adso ción-deso ción de N2 pa a los cua o sólidos se ob u ie on en el equipo Mic ome i ics ASAP2010 Au oma ed So p ion Analyse del ICMUV, p e ia desgasi icación de las mues as a acío a 120oC du an e la noche. Los esul ados de uel os incluyen la dis ibución del amaño de po o, calculado siguiendo el mé odo Ba e -Joyne - Halenda (BJH) (Ba e e al., 1951), y el á ea de supe icie especí ica a pa i de los da os de adso ción en el ango de p esiones meno es empleando el modelo B unaue -Emme -Telle (BET) (B unaue e al., 1938). El análisis elemen al pa a de e mina el con enido en ca bono, ni ógeno e hid ógeno de S1-GAL y S1-GLU se lle ó a cabo en un equipo CE Ins umen EA-1110 CHN Elemen al Analyze en el Cen o de Mic oanálisis Elemen al de la UCM. 3.3 VALIDACIÓN FUNIONAL: ENSAYOS DE LIBERACIÓN IN VITRO DE LOS MATERIALES HÍBRIDOS T as la ca ac e ización es uc u al de los sólidos se lle ó a cabo la alidación uncional, que se ealizó median e es udios de libe ación de odamina B in i o. Pa a ello se emplea on es ímulos capaces de p o oca la libe ación de la ca ga de los sólidos po o u a de la pue a molecula , el enzima galac osidasa en el caso de S1-GAL y panc ea ina de S1-GLU. 3.3.1 Reac i os. Las enzimas -galac osidasa de Kluy e omyces lac is y panc ea ina de pánc eas po cino, que se án los es ímulos pa a la up u a de los polisacá idos que ac úan como pue a molecula , se ob u ie on de Sigma-Ald ich. 3.3.2 Ensayos de libe ación in i o. Pa a lle a a cabo las p uebas de libe ación in i o de los ma e iales sin e izados, el p ime paso ue p epa a las disoluciones enzimá icas. Pa a ello, po un lado se disol ie on 300 μL de la enzima -galac osidasa en 9.7 mL de agua des ilada a pH 7.5, y po o o lado 30 mg de la enzima panc ea ina en 7.5 mL de agua des ilada a pH 7.5 (4 mg/mL). A con inuación, 6.25 mL de cada disolución enzimá ica se lle a on a 25 mL con agua des ilada a pH 7.5. A es as disoluciones enzimá icas se les añadie on 10 mg de nanopa ículas (S1-GAL en el caso de la disolución con -galac osidasa, y S1-GLU en el caso de la de panc ea ina), y se suspendie on median e una b e e sonicación. De mane a pa alela, 10 mg de 3| Ma e iales y mé odos 21 cada nanopa ícula se suspendie on en 25 mL de agua des ilada a pH 7.5 sin enzima, pa a ac ua como blanco sin libe ación. Las cua o eacciones se pusie on en agi ación a 200 pm. A pa i de ese momen o se ue on omando alícuo as de 1 mL a di e en es iempos (1 min, 2.5, 4, 7.5 y 24 ho as), que se il a on en il os de e lón (PTFE 17 mm, 0.45 μm). Finalmen e, se midió la luo escencia de cada alícuo a en un espec o o óme o JASCO FP- 8500 pa a de e mina la libe ación de odamina B que se había p oducido, empleando la longi ud de onda de emisión ca ac e ís ica del colo an e (λexci ación = 555 nm, λemisión = 580 nm). 3.4 ENSAYOS EN UN MODELO CELULAR DE SENESCENCIA Finalmen e se p e endió alida el uncionamien o de los sólidos S1-GAL y S1-GLU sin e izados y ca ac e izados en un modelo celula de senescencia. Pa a ello, en p ime luga se lle a on a cabo ensayos de inducción de senescencia pa a comp oba la idoneidad del modelo celula , así como se comp obó la ausencia de oxicidad de los sólidos en las células. Una ez el modelo celula es u o pues o a pun o, se emplea on los sólidos pa a e alua la p esencia de ecep o es de azúca es especí icos pa a galac o-oligosacá idos en células senescen es. Pa a comenza se es udió el ni el de in e nalización no mal de ambos sólidos po pa e de células senescen es y no senescen es, median e la cuan i icación de la libe ación de odamina B en las células po mic oscopia con ocal. A con inuación, y como p ueba de concep o, se es udió si dicha in e nalización se eía a ec ada po la adición p e ia de un azúca con galac osa en su composición (como la lac osa), pa a de e mina si és e e a capaz de bloquea los ecep o es de azúca es y po an o a ec aba a la in e nalización de nanopa ículas en las células. 3.4.1 Reac i os. El medio de cul i o Dulbecco’s Modi ied Eagle’s Medium 1X sin ojo enol (DMEM), la ipsina-EDTA 0.05% (1X), el sue o bo ino e al (FBS) y el an ibió ico-an imicó ico 100X (compues o po penicilina, es ep omicina y an o e icina B) ue on adqui idos de Gibco Li e Technologies. Sigma-Ald ich p opo cionó el Dulbecco’s Phospha e Bu e ed Saline Mod ied (PBS), T ypan Blue, el colo an e c is al iole a, la lac osa, el 4',6-diamino-2- enilindol (DAPI), el pa a o maldehído (PFA) y el análogo de es ógenos 4-hid oxi amoxi eno (4OHT). De Scha lau se adqui ió el e anol, y de Calbiochem el mowiol 4-88. El ki de inción de células senescen es Senescence  -galac osidase S aining Ki se ob u o de CellSignalling. 3| Ma e iales y mé odos 22 3.4.2 Línea celula , condiciones de cul i o y siemb a. La línea celula empleada ue ITM ( ib oblas os pulmona es humanos), p opo cionada amablemen e po el D . Manuel Se ano del g upo de Sup esión Tumo al del Cen o Nacional de In es igaciones Oncológicas (CNIO), Mad id (España). Es a línea de i a de la línea p ima ia IMR-90, inmo alizada median e la exp esión o zada de la unidad ca alí ica de la elome asa (hTERT), la cual p esen a ac i idad ansc ip asa in e sa (Bodna e al., 1998; Collado e al., 2005; Vazi i & Benchimol, 1998). Además, es a nue a línea denominada IT ha sido ansducida e o i almen e con una e sión inducible del oncogén MEK1, que se encuen a usionado a un dominio de unión a ho monas del ecep o de es ógenos humano ( usión MEK-ER), consiguiendo inalmen e la línea celula ITM. De es a o ma, median e inducción del dominio ER se consigue la ac i ación del oncogén y se desencadena una espues a de OIS. Dicho dominio de unión a ho monas es á modi icado pa a no esponde a es ógenos, sino al á maco 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) (Figu a 8), un an agonis a del ecep o de es ógenos. Así, al adiciona el compues o 4OHT en la línea celula ITM se consigue un modelo de senescencia celula en 72 ho as, ap opiado pa a es e abajo (Collado e al., 2005; Lin e al., 1998). Figu a 8. Es uc u a química del 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) (D ugBank, Accession Numbe DB04468). Las células se cul i a on en medio DMEM sin ojo enol suplemen ado con 10% FBS (o 0.5% según el ensayo celula ) y 1% de an ibió ico-an imicó ico, a 37oC en a mós e a húmeda con 5% CO2. La ausencia de ojo enol se debe a que dicho compues o in e acciona con el ecep o de es ógenos ( usión MEK-ER), desencadenando el eno ipo senescen e en la p esen e línea celula . El le an amien o de las células pa a ealiza los subcul i os y siemb as se lle ó a cabo con 2 mL de ipsina y 5 minu os de incubación a 37oC. Los pases de man enimien o se ealiza on 3 eces po semana a diluciones 1:2 o 1:3 en unción del g ado de con luencia. 3| Ma e iales y mé odos 23 Las siemb as se ealiza on a pa i de células que se encon aban en con luencia en e los pases 3 y 12. El cálculo de la concen ación celula pa a las siemb as se ealizó median e inción con el colo an e de exclusión T ypan Blue (pa a de e mina iabilidad) y con aje en cáma a Neubaue . Pa a los ensayos en los que se ecu ió a mic oscopía con ocal, las células se semb a on sob e cub eobje os de c is al pa a que pudiesen se obse adas y o og a iadas al mic oscopio. Du an e los pe iodos de incubación con 4OHT pa a inducción de senescencia se empleó medio suplemen ado con 0.5% FBS (en luga de 10%) pa a e i a el c ecimien o desmedido de las células ehículo (sin 4OHT) espec o a las células senescen es (con 4OHT), pues las segundas cesan su p oli e ación. También con es e in se semb ó un meno núme o de células en los pocillos de células ehículo en la mayo ía de los ensayos. 3.4.3 Inducción de senescencia con 4-hid oxi amoxi eno en células ITM y comp obación median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal. Al comenza a abaja con la línea celula ue imp escindible ealiza ensayos de inducción de senescencia pa a pode es ablece el modelo de senescencia en el cual ealiza los es udios con las nanopa ículas sin e izadas. Pa a lle a los a cabo, la línea celula ITM se semb ó en placas mul ipocillo de 35 mm de diáme o (6 pocillos) sob e cub eobje os ci cula es de c is al de 24 mm de diáme o, pa a que las células c eciesen sob e ellos y pode así obse a las pos e io men e al mic oscopio. La concen ación de siemb a ue de 60000 células/pocillo, 2 mL/pocillo, en medio DMEM suplemen ado con 10% FBS. El diseño de placa empleado en el ensayo apa ece ep esen ado en la igu a 9. Figu a 9. Diseño de la placa mul ipocillo pa a el ensayo ‘Inducción de senescencia con 4- hid oxi amoxi eno (4OHT) y comp obación median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal’. La ila supe io son células con ol a adas con e anol ( ehículo en el que es á disuel o el 4OHT). La ila in e io son células a las que se les añadió 4OHT 100 nM pa a induci senescencia. En ambos casos se semb a on 60000 células/pocillo. T as 24 ho as de incubación a 37oC y 5% de CO2, se cambió el medio a DMEM suplemen ado con 0.5% FBS, p e io la ado con PBS, y se añadió el á maco 4OHT a concen ación 100 nM disuel o en e anol 96% pa a induci senescencia. A las células con ol no 3| Ma e iales y mé odos 24 senescen es se les añadió el mismo olumen de e anol, pues e a el ehículo en el que es aba disuel o el 4OHT, pe o sin el á maco. T as 72 ho as de incubación bajo las condiciones desc i as se p ocedió a la ijación de las células con PFA 4%, pa a pode ealiza la inción con el ki de de ección de senescencia en el momen o deseado. Pa a ello, se e i ó el medio, se la a on las células con PBS y se incuba on a empe a u a ambien e du an e 10-15 minu os con 1 mL de PFA. Finalmen e se e i ó la solución de PFA, se la ó con PBS dos eces y se ol ie on a añadi 2 mL de PBS nue os, con los que se gua dó la placa en ne e a a 4oC has a el día de su inción, en caso de pospone se po disponibilidad de mic oscopía. Pa a ealiza la inción se empleó el ki Senescence  -Galac osidase S aining Ki , de Cell Signalling Technologies, USA. Las soluciones se p epa a on de acue do al p o ocolo de la casa come cial con los eac i os p opo cionados en el ki . Es imp escindible ajus a el pH de la β– galac osidase S aining Solu ion a 6. Pa a p ocede con la inción se e i ó el PBS en el que se encon aban las células y se añadió 1 mL de β–Galac osidase S aining Solu ion a cada pocillo. La placa se selló con pa a ilm pa a e i a la e apo ación de la solución y se incubó du an e la noche en es u a a 37oC. Pasada la incubación se e i ó la solución de inción y se la ó dos eces con PBS. Finalmen e se ecupe a on los cub eobje os de la placa con la ayuda de unas pinzas, se la a on con agua des ilada y se deposi a on en un po aobje os sob e una go a de mowiol. Finalmen e se odea on los cub eobje os con laca de uñas pa a sella los al po aobje os. Las células se obse a on y o og a ia on en un mic oscopio óp ico Nikon Eclipse E600, con cáma a DS-Ri1. El esumen del ensayo apa ece ecogido en la Tabla 1. Tabla 1. Esquema po días del ensayo ‘Inducción de senescencia con 4-hid oxi amoxi eno (4OHT) y comp obación median e inción con el sus a o colo imé ico X-Gal’. Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 · Semb ado · Adición 4OHT (72h) - - · Fijación · Tinción X-Gal · Mic oscopía 3.4.4 Ensayo de iabilidad con los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU. Con el obje i o de comp oba que las nanopa ículas inales S1-GAL y S1-GLU no esul aban óxicas pa a las células, se lle a on a cabo ensayos de iabilidad celula ep oduciendo las condiciones con las que luego se a a ían las células con los sólidos. Pa a lle a a cabo el ensayo de iabilidad se ealizó una siemb a de la línea celula ITM en placa mul ipocillo de 24 pocillos. En el caso de las células ehículo no senescen es la 3| Ma e iales y mé odos 25 concen ación de siemb a ue de 40000 células/pocillo, y 150000 células/pocillo en el caso de las células senescen es a adas con 4OHT, pa a consegui un c ecimien o simila al inal del ensayo. El medio empleado ue DMEM suplemen ado con 10% FBS, 1mL/pocillo. Los pasos seguidos du an e el p esen e ensayo apa ecen ecogidos en la Tabla 2. Tabla 2. Esquema po días del ensayo ‘Ensayo de iabilidad con los sólidos S1-GAL y S1-GLU’. 4OHT: 4- hid oxi amoxi eno. Día 1 Día 2 Día 3 Día 4 Día 5 Día 6 Día 7 ·Semb ado - · Adición 4OHT (72h) - - · Adición S1-GAL y S1-GLU (24h) · Tinción c is al iole a T as la siemb a, las células se incuba on du an e 48 ho as a 37oC y 5%CO2, un pe iodo más la go que en el caso del ensayo an e io pa a ga an iza una mayo adhe encia celula . T as ese pe iodo se la a on con PBS y se añadió 1 mL de medio DMEM suplemen ado con 0.5% FBS y con 4OHT 100 nM pa a induci senescencia, inducción que du ó 72 ho as. En el caso de las células ehículo no senescen es se añadió la misma p opo ción de e anol en DMEM 0.5% FBS. T as las 72 ho as de incubación se ealizó un la ado con PBS pa a e i a el 4OHT, se ol ió a añadi 1 mL de DMEM 10% FBS y se añadie on los sólidos S1-GAL y S1-GLU, suspendidos en PBS median e p e ia sonicación. Las concen aciones inales en los pocillos ue on de 50 μg de sólido/mL. El diseño de la placa apa ece ecogido en la Figu a 10. Figu a 10. Diseño de la placa mul ipocillo pa a el ensayo ‘Ensayo de iabilidad con los sólidos S1-GAL y S1-GLU’. Las ilas p ime a y e ce a son células con ol a adas con e anol ( ehículo en el que es á disuel o el 4OHT), semb adas a una concen ación de 40000 células/mL. Las ilas segunda y cua a son células senescen es po la adición de 4OHT 100 nM, semb adas a una concen ación de 150000 células/pocillo. Las nanopa ículas S1-GLU y S1-GAL se añadie on a 50μg/mL en los pocillos indicados. Unos pocillos se deja on sin adición de nanopa ículas pa a ene los como e e encia de 100% de iabilidad. 4OHT: 4-hid oxi amoxi eno. La incubación con las nanopa ículas u o 24 ho as de du ación, momen o en el que se p ocedió a la medida de la iabilidad celula . Pa a ello se e i ó el medio celula y las células 4| Resul ados y discusión 33 El p oceso global de ob ención de los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU, desc i o en el apa ado de Ma e iales y Mé odos, consis ió en un p ime paso de sín esis de la es uc u a mesopo osa ino gánica MCM-41. Dicho ma e ial se ca gó pos e io men e con el colo an e odamina B, dando luga así al ma e ial híb ido ino gánico-o gánico S1. Finalmen e dicho sólido se uncionalizó con dos pue as molecula es di e en es, los oligosacá idos Galac an y Glucidex-47, capaces de apa los po os del ma e ial man eniendo en su in e io la odamina B. Dichas moléculas que ac úan como pue as son capaces de esponde a es ímulos ex e nos (conc e amen e a los enzimas β–galac osidasa y panc ea ina, espec i amen e), de mane a que pueden se hid olizadas a monosacá idos dejando así los po os lib es pa a la libe ación del colo an e encapsulado. El sólido S1-GAL unciona ía como un nanodisposi i o capaz de di igi se selec i amen e a células senescen es, ya que és as p esen an un al o con enido en el enzima β–galac osidasa espec o a las células no senescen es (senescen -associa ed  –galac osidase, SA–β–gal). Es e enzima es capaz de deg ada la pue a molecula del sólido y libe a su con enido, que en es e caso se a a del colo an e odamina B pe o que en un u u o pod ía se un á maco ci o óxico (Figu a 13). La exis encia de selec i idad po pa e de nanopa ículas uncionalizadas con galac o-oligosacá idos (GOS) ya ha sido demos ada po miemb os de es e g upo, aunque con un azúca di e en e al Galac an (Agos ini e al., 2012). Si se comp obaba que las p esen es nanopa ículas S1-GAL ambién se di igían selec i amen e a células senescen es, se p e endía es udia si dicha especi icidad e a debida únicamen e a la p esencia de SA–β–gal, o bien si podía debe se ambién a la exis encia de ecep o es de azúca es especí icos pa a galac o- oligosacá idos en la supe icie de las células senescen es (que acili asen la endoci osis de nanopa ículas uncionalizadas con GOS, como se plan ea en el p esen e abajo). En la p ueba de concep o pa a comenza a es udia dicha eo ía se a a ía de bloquea los hipo é icos ecep o es median e la adición de un azúca . Dicho azúca debe ía cons a de galac osa en su es uc u a, y las células no debe ían posee anspo ado es pa a su in e nalización, pa a ga an iza su acción ex acelula . Pos e io men e se adiciona ían las nanopa ículas S1-GAL y se es udia ía si su in e nalización y ape u a se eía educida. Po su pa e, S1-GLU unciona ía como un con ol posi i o, que se espe aba que libe ase su con enido independien emen e en células senescen es y no senescen es, dado que ambas p esen an equi a i amen e el enzima lisosomal amilasa capaz de deg ada la pue a molecula . 4| Resul ados y discusión 34 Figu a 13. Esquema de una MCM-41 ca gada con odamina B y uncionalizada con un galac o- oligosacá ido. Debido a la acción del enzima β-galac osidasa asociada a senescencia (SA-β-gal) el galac o-oligosacá ido es hid olizado y se libe a la odamina B, p e e en emen e en células senescen es con dicha ac i idad enzimá ica. 4.1 VALIDACIÓN ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL DE S1-GAL Y S1-GLU Las p uebas de ca ac e ización y alidación ienen el obje i o de comp oba que an o las nanopa ículas MCM-41 como los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU sin e izados p esen an las p opiedades ca ac e ís icas de es e ipo de ma e iales. Po un lado se ealizó una ca ac e ización es uc u al, con la que se p e endió con i ma que la sín esis anscu ió co ec amen e y las nanopa ículas p esen aban la es uc u a idimensional ca ac e ís ica de MCM-41. Pa a ello se ecu ió a écnicas como DRX, TEM y po osime ía po adso ción-deso ción de N2. Po o o lado, median e po osime ía, análisis elemen al, TGA y cuan i icación de odamina B en las aguas de la ado se comp obó que los sólidos inales se habían ca gado adecuadamen e, y se cuan i icó dicha ca ga de colo an e. En cuan o a la alidación uncional, se ealiza on es udios de libe ación in i o con los sólidos en p esencia y ausencia de los enzimas capaces de deg ada las pue as molecula es. En ausencia del enzima se espe aba una “libe ación ce o”, signo de que la pue a e a capaz de apa los po os; y en p esencia del enzima e a de espe a una libe ación con olada del colo an e a medida que anscu ía el iempo, señal de que la nanopa ícula espondía co ec amen e al es ímulo de ape u a de la pue a (es deci , que e a uncional). Pa a comenza se ealiza on los es udios de di acción de ayos X (DRX) y TEM pa a comp oba la co ec a dis ibución espacial p opia de la MCM-41 (Figu as 14 y 15). En cuan o al di ac og ama de los sólidos (Figu a 14), en a) se puede obse a el pa ón de di acción ca ac e ís ico de una MCM-41 sin calcina , en el que apa ecen cua o picos de B agg 4| Resul ados y discusión 35 co espondien es a las cua o e lexiones de bajo ángulo p opias de la p esen e es uc u a hexagonal. En cambio, en la MCM-41 calcinada b) se obse a un desplazamien o de dichos picos, que se debe a la con acción de la es uc u a del ma e ial po la condensación de los silanoles que se p oduce du an e el p oceso de calcinación. Sin emba go, a pesa de que es e desplazamien o implica una pé dida pa cial del o den, el man enimien o de las e lexiones indica que se p ese a la sime ía mesopo osa. Finalmen e, en c) y d) (co espondien es a los sólidos S1-GAL y S1-GLU espec i amen e) desapa ecen las 3 e lexiones meno es, así como disminuye la señal de mayo in ensidad, siendo es o signo de que se p oduce una educción del con as e al es a los po os ca gados de odamina B. Aún así, el man enimien o del p ime pico sugie e que no se ha modi icado sus ancialmen e la es uc u a mesopo osa hexagonal (Agos ini e al., 2012; Be na dos e al., 2009). Figu a 14. Di ac og ama de ayos X en pol o de MCM-41 sin calcina a), MCM-41 calcinada b), S1- GAL c) y S1-GLU d). En a) y b) se obse an las 4 e lexiones ca ac e ís icas de MCM-41. En c) y d) se pie den las 3 e lexiones meno es debido a la ca ga de los ma e iales. En b), c) y d) el p ime pico se desplaza hacia la de echa, debido a la compac ación de los po os po la condensación de los silanoles as la calcinación. Como o a o ma de comp obación adicional de la co ec a es uc u a de los ma e iales, se obse a on los sólidos en el mic oscopio elec ónico de ansmisión (TEM) (Figu a 15). Así, se pudie on ap ecia los canales y la po osidad hexagonal que con o man la MCM-41, con i mando la co ec a sín esis. Es a con i mación ue de especial impo ancia en el caso de S1-GAL y S1-GLU (c) y d) espec i amen e), ya que a i maba el man enimien o de la es uc u a hexagonal a pesa de habe se pe dido las 3 e lexiones meno es en el di ac og ama as la ca ga de la nanopa ícula con odamina B. Asimismo se obse a un mayo con as e de los po os en la MCM-41 calcinada b) espec o al es o de sólidos, ya que es el único sólido en el que los po os se conse an acíos. 4| Resul ados y discusión 36 Figu a 15. Fo og a ías ep esen a i as de MCM-41 sin calcina a), MCM-41 calcinada b), S1-GAL c) y S1-GLU d), ob enidas po TEM. Se pueden obse a los po os y canales hexagonales p opios de la p esen e es uc u a mesopo osa, con mayo con as e en b) – dado que la MCM-41 calcinada iene los po os lib es – espec o a la MCM-41 sin calcina (que aún con iene el ensoac i o CTAB en sus po os) y S1-GAL y S1-GLU (que con ienen Rodamina B). Así pues, eniendo en cuen a la in o mación apo ada po la di acción de ayos X en pol o y el TEM, se concluyó que la sín esis de los sólidos S1-GAL y S1-GLU ue co ec a y que los ma e iales p esen aban la es uc u a ca ac e ís ica del ma e ial MCM-41. Po o o lado, se analiza on las iso e mas de adso ción-deso ción de N2 de los ma e iales MCM-41 calcinada, S1-GAL y S1-GLU (Figu a 16), a pa i de las cuales se ob u o in o mación sob e el amaño, olumen y supe icie especí ica de po o de los sólidos (Tabla 5). Figu a 16. Iso e mas de adso ción-deso ción de N2 de la MCM-41 calcinada a), S1-GAL b) y S1-GLU c). La MCM-41 calcinada mues a un aumen o a bajas p esiones pa ciales en la adso ción de N2, debido a la in e nalización del gas en los po os; mien as que los sólidos inales mues an una o ma plana, signo de que los po os se encuen an bloqueados con el colo an e odamina B que impide la en ada de N2. 4| Resul ados y discusión 37 Tabla 5. Tamaño, olumen de po o (calculados median e el mé odo BJH) y supe icie especí ica de po o (calculada median e el modelo BET) de MCM-41 calcinada, S1-GAL y S1-GLU. Sólido Tamaño de po o (nm) Volumen de po o (cm3 g-1) Supe icie especí ica (m2 g-1) MCM-41calcinada 2.51 0.72 995.6 S1-GAL - 0.418082 372.6037 S1-GLU - 0.266134 131.8791 Las iso e mas ob enidas pa a MCM-41 (Figu a 16, a)) son p opias de es e ipo de ma e ial. A p esiones pa ciales bajas-medias (P/P0 < 0.3) se obse a un aumen o del ni ógeno adso bido debido a su condensación po capila idad en los mesopo os, y a al as p esiones pa ciales se uel e a ap ecia un aumen o de la adso ción de N2, iso e ma conocida como de ipo IV. En el caso de los sólidos S1-GAL y S1-GLU (Figu a 16, b) y c) espec i amen e) no se obse a un aumen o apa en e en la adso ción de ni ógeno a bajas p esiones y la cu a p esen a una o ma plana espec o a la de la MCM-41. Es e hecho indica una educción ap eciable de la mesopo osidad, es deci , que los po os es án co ec amen e bloqueados con odamina B. Sin emba go, a al as p esiones uel e a obse a se un aumen o de la adso ción, signo de que la po osidad se conse a (Agos ini e al., 2012). Es os es udios de po osime ía, jun o con la disminución que se p oduce en el olumen de po o y en el á ea especí ica de los ma e iales inales espec o a la MCM-41 calcinada (Tabla 5), indican que el ca gado de las nanopa ículas con odamina B ha enido luga co ec amen e: los po os de los ma e iales uncionalizados es án llenos de colo an e y po an o la capacidad de adso ción de N2 es meno . Po úl imo, pa a log a una cuan i icación más exac a del con enido de odamina B encapsulado en los po os y de la can idad de pue a molecula con la que se uncionaliza on los sólidos, se ecu ió al análisis e mog a imé ico, análisis elemen al y a la cuan i icación de odamina pe dida en las aguas de ca ga y la ado median e espec oscopia de abso ción UV/V (a la longi ud de onda de máxima abso ción de la odamina B, λmáx = 555 nm). Los esul ados ob enidos a pa i de es os análisis ue on: pa a el sólido S1-GAL, 0.22 mmol odamina B/g sólido y 97.82 mg Galac an/g sólido; y pa a el sólido S1-GLU, 0.20 mmol odamina B/g sólido y 72.91 mg Glucidex-47/g sólido. Una ez los sólidos es u ie on ca ac e izados es uc u almen e se p ocedió a lle a a cabo su alidación uncional, que se ealizó median e es udios de libe ación in i o de odamina B. Las libe aciones se lle a on a cabo en solución acuosa a pH 7.5 pa a simila las condiciones isiológicas, en p esencia y ausencia de un es ímulo que uese capaz de ab i la pue a 4| Resul ados y discusión 38 molecula . En el caso de S1-GAL el es ímulo ue el enzima β–galac osidasa de le adu a Kluy e omyces lac is, el cual es capaz de hid oliza los enlaces glicosídicos que con o man el Galac an, pue a molecula de S1-GAL. En el caso de S1-GLU se ecu ió al complejo enzimá ico panc ea ina, que con iene di e en es enzimas hid olí icos en e los que des aca la amilasa, capaz de hid oliza el almidón que compone la pue a molecula de S1-GLU (Glucidex-47). Los esul ados de los es udios de libe ación se mues an en la Figu a 17. Figu a 17. Libe ación de odamina B en S1-GAL (izquie da) y S1-GLU (de echa), en p esencia y ausencia (blanco) de los enzimas β–galac osidasa y panc ea ina espec i amen e. En los blancos se obse a una libe ación de odamina B mínima, mien as que en p esencia del es ímulo enzimá ico se obse a una libe ación mucho mayo que alcanza su máximo a las 24 ho as. La libe ación de colo an e se midió median e luo escencia a λemisión = 580 nm. Los alo es es án ep esen ados como media ± s. En la Figu a 17 se mues a cómo en las condiciones de blanco, en las que no había p esen e enzima capaz de hid oliza la pue a molecula de los sólidos, la libe ación de odamina B es p óxima a ce o, señal de que las pue as bloquean co ec amen e los po os y son capaces de e ene el colo an e con enido en su in e io . Sin emba go, se obse a una mínima libe ación en ausencia de enzima, que puede se debida a la p esencia de es os de odamina B adso bida en la supe icie de los sólidos que no pudie on se eliminados median e los la ados. En cambio, en p esencia del es ímulo enzimá ico se obse a una libe ación mucho mayo de colo an e, no able ya a pa i de las 2.5 ho as (70% de la libe ación máxima) y que alcanza su máximo a las 24 ho as. Es os esul ados demues an que el anclaje de las pue as molecula es a la supe icie de los sólidos ca gados se lle ó a cabo co ec amen e, que dichas pue as son capaces de bloquea los po os y que esponden al es ímulo pa a el cual es aban diseñadas. Con odos los da os ob enidos se puede a i ma que los sólidos S1-GAL y S1-GLU p esen an la es uc u a p opia de una nanopa ícula mesopo osa de sílice MCM-41 y son uncionales, po lo que se puede p ocede a su empleo en sis emas celula es in i o. 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 %In Tiempo (h) Blanco b-Galac osidasa 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 %In Tiempo (h) Blanco Panc ea ina 4| Resul ados y discusión 39 4.2 ENSAYOS CELULARES Una ez se ca ac e iza on y alida on los sólidos S1-GAL y S1-GLU es uc u al y uncionalmen e, se p ocedió a es udia su espues a en un sis ema celula , conc e amen e en el modelo de senescencia cons i uido po la línea celula ITM y el compues o 4- hid oxi amoxi eno (4OHT), capaz de induci senescencia en dicha línea. Como ya se ha desc i o en el apa ado 3.4.2, la línea ITM con iene una usión de la o ma ac i a del oncogén MEK1 al dominio de unión a ho monas del ecep o de es ógeno humano, modi icado pa a que únicamen e econozca al análogo de es ógenos 4OHT. De es a o ma, al añadi 4OHT se ac i a el oncogén y se desencadena una espues a de senescencia inducida po oncogén. Los p ime os ensayos celula es se lle a on a cabo pa a comp oba que el modelo celula de senescencia inducida uncionaba. Pa a comenza se ealizó un ensayo de inducción de senescencia con 4OHT, y la inducción se comp obó a a és de los cambios eno ípicos en las células y del ensayo colo imé ico con X-Gal, que se explica á a con inuación. Una ez con i mado que el modelo e a adecuado, se p obó que las nanopa ículas sin e izadas no uesen óxicas pa a las células, y se p ocedió a con inuación a su alidación uncional en cul i o celula . Pa a ello se añadie on las nanopa ículas an o a células senescen es y como no senescen es, y se obse ó y cuan i icó la libe ación de odamina de ambos sólidos median e mic oscopía con ocal. Finalmen e, se epi ió es e ensayo de mic oscopía con ocal en es e caso habiendo a ado a las células p e iamen e con el disacá ido lac osa, pa a es udia si la adición de dicho azúca a ec aba a la in e nalización y ape u a del sólido S1-GAL. 4.2.1 Comp obación del modelo celula de senescencia. Uno de los asgos p opios de las células senescen es es su a es o del ciclo celula , po lo que no sin e izan DNA. Sin emba go, es a ca ac e ís ica no puede emplea se pa a su de ección, pues ambién es á p esen e en o as células del o ganismo, como las quiescen es o las di e enciadas e minalmen e. El asgo eno ípico que las dis ingue de es as células que ampoco se di iden, y que ha sido ex ensamen e empleado pa a su de ección desde que ue desc i o en 1995, es su ac i idad β–galac osidasa aumen ada (Dim i e al., 1995; I hana e al., 2013). Es a ac i idad se debe a un inc emen o en la masa lisosomal de las células senescen es, que posibili a la ac i idad de dicho enzima a un pH subóp imo de 6 en luga de pH 4 – 4.5, al que suele unciona de mane a óp ima no mal (Ku z e al., 2000). Así pues, es e asgo ue el empleado pa a comp oba que, siguiendo las condiciones desc i as po Collado e al. (2005), e ec i amen e se inducía el eno ipo senescen e en las células ITM. 4| Resul ados y discusión 40 El ensayo de de ección de senescencia ap o echando la ac i idad SA–β–Gal se basa en la hid ólisis del sus a o pe meable X-Gal (5-b omo-4-clo o-3-indolil-β-D-galac opi anósido) po pa e del enzima β–galac osidasa en condiciones de pH 6, libe ándose un compues o azulado de ec able a simple is a. El sus a o X-Gal es á compues o po una molécula de galac osa, econocida po el enzima β–galac osidasa, unida a 5-b omo-4-clo o-3-hid oxindol. Es e úl imo compues o, al se libe ado po la hid ólisis, se oxida y dime iza espon áneamen e o mando 5,5’-dib omo-4,4’-diclo o-indigo (Figu a 18) (Bu n, 2012), p ecipi ado insoluble de colo azul que iñe las células senescen es. La cla e del ensayo eside en el pH 6, que pe mi e que a pesa de que odas las células p esen en β–galac osidasa, solo las senescen es mues en ac i idad a es e pH subóp imo debido al al o con enido del enzima. Figu a 18. Reacción de hid ólisis de X-Gal po el enzima β-galac osidasa y libe ación de un compues o azulado. El ensayo se lle ó a cabo al y como se desc ibe en el apa ado 3.4.3, siendo cla e la inducción de senescencia du an e 72 ho as con 4OHT 100 nM. Fo og a ías celula es omadas al mic oscopio se mues an en la Figu a 19. En ellas se obse a cómo las células no senescen es (a, b y c) apenas mues an inción azul, mien as que un al o po cen aje de las células a las que se les ha añadido 4OHT pa a induci senescencia (d, e y ) p esen an una ue e colo ación azulada. Los esul ados de es e ensayo indican pues que la inducción de senescencia con 4OHT ue e icaz. Asimismo, pe mi en ap ecia los cambios eno ípicos que se p oducen en las células senescen es de la p esen e línea celula . Mien as que las células no senescen es p esen an la mo ología ala gada en o ma de huso ca ac e ís ica de los ib oblas os, las células ITM senescen es se encogen y adquie en una o ma edondeada, haciéndose más pequeñas. Así pues, el eno ipo de senescencia en es e modelo celula es ácilmen e econocible, además las células p esen an un g an núme o de pequeñas esículas de endoci osis y se ma ca mucho el núcleo, que se e más e ingen e y se obse a poco ci oplasma. 4| Resul ados y discusión 41 Figu a 19. Imágenes ep esen a i as de la inción con X-Gal de células no senescen es (sin 4OHT, a, b y c) y senescen es (con 4OHT, d, e y ). En las p ime as se obse a una inción azulada muy educida, en e al al o po cen aje de células eñidas en el caso de las células senescen es. 4OHT: 4- hid oxi amoxi eno. 4.2.2 Es udio de iabilidad celula con S1-GAL y S1-GLU. A pesa de la expe iencia del g upo de in es igación con nanopa ículas MCM-41 y de ya habe se comp obado que es os ma e iales son biocompa ibles y no causan oxicidad celula (Agos ini e al., 2012; Be na dos e al., 2010), se ealiza on ensayos de iabilidad en las células ITM a 24 ho as añadiendo los sólidos S1-GAL y S1-GLU a la concen ación empleada en el es o de ensayos (50 μg/mL). Como se expone en el apa ado 3.4.4, pa a es e ensayo se añadie on los sólidos S1-GAL y S1-GLU a células ITM no senescen es y senescen es (que habían sido incubadas 72 ho as con 4OHT 100 nM). T as 24 ho as de incubación con las nanopa ículas, la iabilidad celula se midió median e inción con c is al iole a. Los esul ados se mues an en la Figu a 20. Figu a 20. Ensayo de iabilidad de células senescen es (+4-hid oxi amoxi eno (4OHT)) y no senescen es (sin 4OHT) incubadas con S1-GAL (50 μg/mL) y S1-GLU (50 μg/mL) du an e 24 ho as. Los da os apa ecen e e enciados espec o a sus espec i os con oles (senescen es y no senescen es sin nanopa ículas), como media ± s. En ninguna de las condiciones se obse a una disminución ap eciable de la iabilidad celula en las células a adas con nanopa ículas espec o a los con oles (p > 0.05). 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 Con ol sin NP S1-GAL S1-GLU Abs/Abs0 50 ug/mL NP sin 4OHT + 4OHT 5| Conclusión 49 Los ensayos ealizados han pe mi ido ex ae las siguien es conclusiones… 1. Median e el p ocedimien o me odológico seguido se ha conseguido diseña , sin e iza y ca ac e iza co ec amen e dos nanodisposi i os mesopo osos de sílice o mados po el sopo e ino gánico MCM-41, ca gados con el luo ó o o odamina B y uncionalizados con dis in os polisacá idos como pue a molecula , ob eniendo los sólidos inales S1-GAL y S1-GLU. 2. Dichos nanodisposi i os son capaces de esponde al es ímulo enzimá ico ex e no pa a el que es aban diseñados, mos ando una libe ación p óxima a ce o en su ausencia. Asimismo, han demos ado se uncionales en los ensayos celula es, causando una oxicidad celula nula. El sólido S1-GAL ha p obado se especí ico pa a las células senescen es, mos ando una in e nalización y ape u a en dichas células es eces mayo a la ob enida en células no senescen es. Po su pa e, S1-GLU no p esen a ningún ipo de especi icidad po las células senescen es, libe ando su ca ga indisc iminadamen e ambién en células con ol. 3. Finalmen e, se ha podido demos a median e una p ueba de concep o que en las células senescen es exis e una exp esión/sob eexp esión de ecep o es de galac o-azúca es que posibili an la endoci osis del sólido S1-GAL, con ibuyendo a su mayo in e nalización en células senescen es. El abajo ealizado no solo desa olla un nanodisposi i o capaz de di igi se selec i amen e a las células senescen es, implicadas en un g an núme o de en e medades. También apo a nue a in o mación espec o a las ca ac e ís icas dis in i as de dichas células, pe mi iendo en un u u o un mayo conocimien o de su eno ipo y ab iendo la pue a al diseño de nue os nanodisposi i os que engan una mayo selec i idad y pe mi an educi los e ec os secunda ios de los a amien os a macológicos di igidos a la eliminación de células senescen es. 6 6| | R RE EF FE ER RE EN NC CI IA AS S B BI IB BL LI IO OG GR RÁ ÁF FI IC CA AS S 6| Re e encias bibliog á icas 53 AGOSTINI, A.; MONDRAGÕN, L.; BERNARDOS, A.; MARTÍNEZ-MÁÑEZ, R.; DOLORES MARCOS, M.; SANCENÓN, F.; SOTO, J.; COSTERO, A.; MANGUAN-GARCÍA, C; PEONA, R.; MORENO-TORRES, M.; APARICIO-SANCHIS, R. & MURGUÍA, J. R. (2012). Ta ge ed ca go deli e y in senescen cells using capped mesopo ous silica nanopa icles. Angewand e Chemie - In e na ional Edi ion, 51, 10556–10560. BARRETT, E. P.; JOYNER, L. G. & HALENDA, P. P. (1951). The De e mina ion o Po e Volume and A ea Dis ibu ions in Po ous Subs ances. I. Compu a ions om Ni ogen Iso he ms. Jou nal o he Ame ican Chemical Socie y, 73, 373–380. BERNARDOS, A.; AZNAR, E.; MARCOS, M. D.; MARTÍNEZ-MÁÑEZ, R.; SANCENÓN, F., SOTO, J.; BARAT, J. M. & AMORÓS, P. (2009). Enzyme-Responsi e Con olled Release Using Mesopo ous Silica Suppo s Capped wi h Lac ose **. Angewand e Chemie, 121, 5998–6001. BERNARDOS, A.; MONDRAGÓN, L.; AZNAR, E.; MARCOS, M. D.; MARTÍNEZ-MÁÑEZ, R.; SANCENÓN, F.; SOTO, J.; BARAT, J. M.; PÉREZ-PAYÁ, E.; GUILLEM, C. & AMORÓS, P. (2010). Enzyme- esponsi e in acellula con olled elease using nanome ic silica mesopo ous suppo s capped wi h “saccha ides.” ACS Nano, 4(11), 6353–6368. BAWARSKI, W. E.; CHIDLOWSKY, E.; BHARALI, D.J. & MOUSA, S.A. (2008). Eme ging nanopha maceu icals. Nanomedicine: Nano echnology, Biology, and Medicine, 4, 273-282. BESANCENOT, R.; CHALIGNÉ, R.; TONETTI, C.; PASQUIER, F.; MARTY C.; LÉCLUSE, Y.; VAINCHENKER, W.; CONSTANTINESCU, S. N. & GIRAUDIER, S. (2010). A senescence-like cell-cycle a es occu s du ing megaka yocy ic ma u a ion: Implica ions o physiological and pa hological megaka yocy ic p oli e a ion. PLoS Biology, 8(9), 1-11. BODNAR, A. G.; OUELLETTE, M.; FROLKIS, M.; HOLT, S. E.; CHIU, C. P.; MORIN, G. B.; HARLEY, C. B.; SHAY, J. W.; LICHTSTEINER, S. & WRIGHT, W. E. (1998). Ex ension o li e-span by in oduc ion o elome ase in o no mal human cells. Scienc , 279, 349–352. BRUNAUER, S.; EMMETT, P. H. & TELLER, E. (1938). Adso p ion o Gases in Mul imolecula Laye s. Jou nal o he Ame ican Chemical Socie y, 60, 309–319. BURN, S. F. (2012). De ec ion o β-Galac osidase Ac i i y: X-gal Sa ining. En Kidney De elopmen : Me hods and P o ocols. Me hods in Molecula Biology (Vol. 886). Edi o ial Odyseé Michos. New Yo k: págs. 241-250. CAMPISI, J. (1997). Aging and cance : he double-edged swo d o eplica i e senescence. Jou nal o he Ame ican Ge ia ics Socie y, 45(4), 482–488. CAMPISI, J. (1997). The biology o eplica i e senescence. Eu opean Jou nal o Cance Pa A, 33(5), 703–709. CAMPISI, J. (2005). Aging, umo supp ession and cance : High wi e-ac ! Mechanisms o Ageing and De elopmen , 126, 51–58. CAMPISI, J. & D’ADDA DI FAGAGNA, F. (2007). Cellula senescence: when bad hings happen o good cells. Na u e Re iews. Molecula Cell Biology, 8, 729–740. CHUPRIN, A.; GAL, H.; BIRON-SHENTAL, T.; BIRAN, A.; AMIEL, A.; ROZENBLATT, S. & KRIZHANOVSKY, V. (2013). Cell usion induced by ERVWE1 o measles i us causes cellula senescence. Genes and De elopmen , 27, 2356–2366. CLIMENT TEROL, E. (2012). Design o new hyb id ma e ials: S udy o i s applica ion in new de ec ion o ma s and in con olled elease applica ions. Tesis doc o al en Química. Edi o ial Uni e si a Poli ècnica de València. 6| Re e encias bibliog á icas 54 COLL, C.; BERNARDOS, A.; MARTÍNEZ-MÁÑEZ, R. & SANCENÓN, F. (2013). Ga ed silica mesopo ous suppo s o con olled elease and signaling applica ions. Accoun s o Chemical Resea ch, 46(2), 339–349. COLLADO, M.; GIL, J., EFEYAN, A.; GUERRA, C.; SCHUHMACHER, A. J.; BARRADAS, M.; BENGURÍA, A.; ZABALLOS, A.; FLORES, J. M.; BARBACID, M.; BEACH, D. & SERRANO, M. (2005). Tumou biology: senescence in p emalignan umou s. Na u e, 436, 642. DAVIS, M. E.; CHEN, Z. G. & SHIN, D. M. (2008). Nanopa icle he apeu ics : an eme ging ea men modali y o cance , 7, 771–782. DIMRI, G. P.; LEE, X.; BASILE, G.; ACOSTA, M.; SCOTT, G.; ROSKELLEY, C.; MEDRANO, E.E.; LINSKENS, M.; RUBELJ, I.; PEREIRA-SMITH, O.; PEACOCKE, M. & CAMPISI, J. (1995). A bioma ke ha iden i ies senescen human cells in cul u e and in aging skin in i o. P oceedings o he Na ional Academy o Sciences o he Uni ed S a es o Ame ica, 92, 9363–9367. DÖRR, J. R.; YU, Y.; MILANOVIC, M.; BEUSTER, G.; ZASADA, C.; DÄBRITZ, J. H. M.; LISEC, J.; LENZE, D.; GERHARDT, A.; SCHLEICHER, K.; KRATZAT, S; PURFÜRST, B.; WALENTA, S.; MUELLER-KLIESER, W.; GRÄLER, M.; HUMMEL, M.; KELLER, U.; BUCK, A. K.; DÖRKEN, B.; WILLMITZER, L.; REIMANN, M.; KEMPA, S.; LEE, S. & SCHMITT, C. A. (2013). Syn he ic le hal me abolic a ge ing o cellula senescence in cance he apy. Na u e, 501, 421–425. FIANDRA, L.; COLOMBO, M.; MAZZUCCHELLI, S.; TRUFFI, M.; SANTINI, B.; ALLEVI, R.; NEBULONI, M.; CAPETTI, A.; RIZZARDINI, G.; PROSPERI, D. & CORSI, F. (2015). Nano o mula ion o an i e o i al d ugs enhances hei pene a ion ac oss he blood b ain ba ie in mice. Nanomedicine: Nano echnology, Biology and Medicine, 11, 1387–1397. HARLEY, C. B.; FUTCHER, A. B. & GREIDER, C. W. (1990). Telome es sho en du ing ageing o human ib oblas s. Na u e, 345, 458-460. HAYFLICK, L. (1965). The limi ed in i o li e ime o human diploid cell s ains. Expe imen al Cell Resea ch, 37, 614– 636. HAYFLICK, L. & MOORHEAD, P. S. (1961). The se ial cul i a ion o human diploid cell s ains. Expe imen al Cell Resea ch, 25, 585-621. HOENICKE, L. & ZENDER, L. (2012). Immune su eillance o senescen cells-biological signi icance in cance -and non-cance pa hologies. Ca cinogenesis, 33(6), 1123–1126. HOFFMANN, F.; CORNELIUS, M.; MORELL, J. & FRÖBA, M. (2006). Silica-Based Mesopo ous O ganic – Ino ganic Hyb id Ma e ials. Angewand e Chemie - In e na ional Edi ion, 45, 3216–3251. ITAHANA, K.; ITAHANA, Y. & DIMRI, G. P. (2013). Colo ime ic de ec ion o senescence-associa ed (be a)- galac osidase. Me hods Mol Biol, 965, 143-156. KURZ, D. J.; DECARY, S.; HONG, Y. & ERUSALIMSKY, J. D. (2000). Senescence-associa ed (be a)-galac osidase e lec s an inc ease in lysosomal mass du ing eplica i e ageing o human endo helial cells. Jou nal o Cell Science, 113, 3613–3622. LIN, A. W.; BARRADAS, M.; STONE, J. C.; VAN AELST, L.; SERRANO, M. & LOWE, S. W. (1998). P ema u e senescence in ol ing p53 and p16 is ac i a ed in esponse o cons i u i e MEK/MAPK mi ogenic signaling. Genes and De elopmen , 12, 3008–3019. MEDVEDEVA, N. V.; IPATOVA, O. M.; IVANOV, Y. D.; DROZHZHIN, A. I. & ARCHAKOV, A. I. (2007). Nanobio echnology and Nanomedicine. Biochemis y (Moscow) Supplemen Se ies B: Biomedical Chemis y, 1(2), 114–124. 6| Re e encias bibliog á icas 55 MOGHIMI, S. M.; HUNTER, A. C. & MURRAY, J. C. (2005). Nanomedicine: cu en s a us and u u e p ospec s. The FASEB Jou nal, 19, 311–330. MUÑOZ-ESPÍN, D.; CAÑAMERO, M.; MARAVER, A.; GÓMEZ-LÓPEZ, G.; CONTRERAS, J.; MURILLO-CUESTA, S.; RODRÍGUEZ-BAEZA, A.; VARELA-NIETO, I.; RUBERTE, J.; COLLADO, M. & SERRANO, M. (2013). P og ammed cell senescence du ing mammalian emb yonic de elopmen . Cell, 155, 1104–1118. MUÑOZ-ESPÍN, D. & SERRANO, M. (2014). Cellula senescence: om physiology o pa hology. Na u e Re iews. Molecula Cell Biology, 15, 482–496. NARDELLA, C.; CLOHESSY, J. G.; ALIMONTI, A. & PANDOLFI, P. P. (2011). P o-senescence he apy o cance ea men . Na u e Re iews. Cance , 11, 503–511. OVADYA, Y. & KRIZHANOVSKY, V. (2014). Senescen cells: SASPec ed d i e s o age- ela ed pa hologies. Bioge on ology, 15, 627–642. PÉREZ-MANCERA, P. A.; YOUNG, A. R. J. & NARITA, M. (2014). Inside and ou : he ac i i ies o senescence in cance . Na u e Re iews Cance . SERRANO, M.; LIN, A.W.; MCCURRACH, M.E. & BEACH, D, L. S. (1997). Oncogenic as p o okes p ema u e cell senescence associa ed wi h accumula in o p53 and p16INK4a. Cell, 88, 593–602. SLOWING, I. I.; VIVERO-ESCOTO, J. L.; WU, C.-W. & LIN, V. S.-Y. (2008). Mesopo ous silica nanopa icles as con olled elease d ug deli e y and gene ans ec ion ca ie s. Ad anced D ug Deli e y Re iews, 60, 1278–1288. STORER, M.; MAS, A.; ROBERT-MORENO, A.; PECORARO, M.; ORTELLS, M. C., DI GIACOMO, V.; YOSEF, R.; PILPEL, N.; KRIZHANOVSKY, V.; SHARPE, J.& KEYES, W. M. (2013). Senescence is a de elopmen al mechanism ha con ibu es o emb yonic g ow h and pa e ning. Cell, 155, 1119–1130. VALLET-REGI, M;, RÁMILA, A.; DEL REAL, R. P. & PÉREZ-PARIENTE, J. (2001). A new p ope y o MCM-41: D ug deli e y sys em. Chemis y o Ma e ials, 13, 308–311. VALLET-REGÍ, M.; RUIZ-GONZÁLEZ, L.; IZQUIERDO-BARBA, I. & GONZÁLEZ-CALBET, J. M. (2006). Re isi ing silica based o de ed mesopo ous ma e ials: medical applica ions. Jou nal o Ma e ials Chemis y, 16, 26-31. VALLET-REGÍ, M.; BALAS, F. & ARCOS, D. (2007). Mesopo ous ma e ials o d ug deli e y. Angewand e Chemie - In e na ional Edi ion, 46, 7548–7558. VAZIRI, H. & BENCHIMOL, S. (1998). Recons i u ion o elome ase ac i i y in no mal human cells leads o elonga ion o elome es and ex ended eplica i e li e span. Cu en Biology, 8, 279–282. VEGA-AVILA, E. & PUGSLEY, M. K. (2011). An o e iew o colo ime ic assay me hods used o assess su i al o p oli e a ion o mammalian cells. P oceedings o he Wes e n Pha macology Socie y, 54, 10–14. WAGNER, V.; DULLAART, A.; BOCK, A.-K. & ZWECK, A. (2006). The eme ging nanomedicine landscape. Na u e Bio echnology, 24(10), 1211–1217. YANG, P.; GAI, S. & LIN, J. (2012). Func ionalized mesopo ous silica ma e ials o con olled d ug deli e y. Chemical Socie y Re iews, 41, 3679-3698. 7 7. . A AN NE EX XO OS S