UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE
VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA
AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
Es udio de modi icaciones
pos aduccionales de his onas y su e ec o
ci o óxico sob e células endo eliales
TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA
DANIEL VOLTOLINI GONZÁLEZ
TUTORA: ROSA MARÍA PEIRÓ BARBER
COTUTOR: CARLOS ROMÁ MATEO
Cu so Académico: 2015-2016
VALENCIA, sep iemb e de 2016
Licencia C ea i e Commons “Reconocimien o no Come cial - Sin Ob a De i ada”
ESTUDIO DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE HISTONAS Y SU EFECTO
CITOTÓXICO SOBRE CÉLULAS ENDOTELIALES
Au o : Daniel Vol olini González
Tu o a: Rosa Ma ía Pei ó Ba be
Co u o : Ca los Romá Ma eo
Valencia, sep iemb e de 2016
RESUMEN
En los úl imos años se ha desc i o la pa icipación de las his onas en p ocesos ex acelula es
implicados en in lamación. Las his onas, libe adas de o ma con olada po neu ó ilos,
con ibuyen a la inmo ilización y eliminación de pa ógenos po las células del sis ema
inmunológico a a és de las llamadas edes ex acelula es de neu ó ilos (NETs). Además, las
p opias his onas p esen an un e ec o ci o óxico mediado po mecanismos aún no escla ecidos
que acili an el p oceso in lama o io y la espues a inmunológica. Sin emba go, la p esencia de
his onas p oduce así mismo e ec os noci os sob e las células del endo elio de los asos
sanguíneos, po lo que las his onas ci culan es se han is o in oluc adas en p ocesos pa ológicos
que cu san con una espues a in lama o ia p olongada, como po ejemplo en sepsis. No
obs an e, has a la echa se desconoce qué ipo de modi icaciones pos aduccionales conc e as
su en las his onas implicadas en en e medad, más allá de una pa icipación de his onas
ci ulinadas o hipe ace iladas en lupus sis émico e i oma oso, po ejemplo. Las modi icaciones
pos aduccionales de his onas con ibuyen a la modulación de la exp esión génica pe mi iendo
o bloqueando el acceso de la maquina ia de ansc ipción a la c oma ina, cons i uyendo uno de
los mecanismos cla e de la egulación epigené ica y, po an o, de g an ele ancia pa a el
es udio de la espues a celula a condiciones ambien ales especí icas. En el p esen e abajo se
analiza án los pa ones de modi icaciones p esen es en his onas ob enidas a pa i de ex ac os
celula es y se pond á a pun o una me odología de pu i icación pa a his onas con modi icaciones
pos aduccionales especí icas, con is as a e alua las di e encias en la capacidad ci o óxica
sob e células endo eliales humanas de los dis in os ipos de his onas y en unción de las
modi icaciones pos aduccionales que p esen en.
PALABRAS CLAVE
His onas, modi icaciones pos aduccionales, FPLC, ci o oxicidad
STUDY OF HISTONE POSTRANSLATIONAL MODIFICATIONS AND THEIR CYTOTOXIC EFFECT ON
ENDOTHELIAL CELLS
Au ho : Daniel Vol olini González
Tu o : Rosa Ma ía Pei ó Ba be
Co- u o : Ca los Romá Ma eo
Valencia, Sep embe 2016
ABSTRACT
Pa icipa ion o his ones in ex acellula p ocesses ela ed o in lamma ion has been desc ibed
in ecen yea s. Th ough hei elease in a con olled manne by neu ophils, his ones ake pa
in he immobiliza ion and elimina ion o pa hogens by immune cells, being key componen s in
he so-called neu ophil ex acellula aps (NETs). Besides, his ones hemsel es show a
cy o oxic e ec induced by mechanisms no ully unde s ood, ha con ibu es o he
in lamma o y p ocesses and immune esponses. Howe e , he p esence o his ones yields a he
same ime noxious e ec s on he endo helial cells o blood essels, in such a way ha plasma
his ones ha e been demons a ed o be in ol ed in pa hological p ocesses like sepsis, in which
p olonged in lamma o y esponse occu s. Ne e heless, which kind o speci ic pos ansla ional
modi ica ions in his ones a e implica ed in disease emains cu en ly unknown, wi h he
excep ion o he p esence o some ci ullina ed o hype ace yla ed his ones in sys emic lupus
e y hema osus, o ins ance. Pos ansla ional modi ica ions o his ones con ibu e o he
modula ion o gene exp ession ei he by allowing o blocking he access o ch oma in o he
ansc ip ion machine y, being one o he key mechanisms unde lying epigene ic egula ion and,
hence, o g ea ele ance o he s udy o cellula esponses o speci ic en i onmen al
condi ions. In he p esen wo k, he modi ica ion pa e n p esen in his ones ob ained om
human cell ex ac s will be analyzed, and a pu i ica ion me hodology o his ones wi h speci ic
pos ansla ional modi ica ions will be se , in o de o e alua e he di e ences in he cy o oxic
capabili y o he dis inc his one ypes, and he di e se pos ansla ional modi ica ions hey
migh show, on human endo helial cells.
KEYWORDS
His ones, pos ansla ional modi ica ions, FPLC, cy o oxici y

I
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1
1.1. LAS HISTONAS ............................................................................................................... 2
1.2. MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE HISTONAS .............................................. 2
1.3. HISTONAS EXTRACELULARES ......................................................................................... 5
1.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR HISTONAS ................................................................... 5
2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 9
3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 11
3.1. CULTIVOS CELULARES .................................................................................................. 11
3.2. ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD ...................................................................................... 11
3.3. OBTENCIÓN DE HISTONAS .......................................................................................... 12
3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ................................................................................ 12
3.5. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT ................................................. 13
3.6. ANÁLISIS DE LA CARBONILACIÓN DE PROTEÍNAS ....................................................... 14
3.7. CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA .......................................................................... 15
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 17
4.1. INDUCCIÓN DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES EN HISTONAS ................... 17
4.1.1. Inducción de ca bonilación y ubiqui inación con MG 132 .................................. 17
4.1.2. Inducción de me ilación con IOX1 ....................................................................... 21
4.1.3. Inducción de ace ilación con TSA ........................................................................ 22
4.2. PURIFICACIÓN DE HISTONAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA ........ 24
4.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Y PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................ 26
5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 27
6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 29
II
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Mecanismos conside ados de ca ác e epigené ico y las in e acciones en e ellos ..... 1
Figu a 2. Esquema de in e acción en e p o eínas modi icado as de his onas ............................ 4
Figu a 3. Esquema del papel de las his onas ex acelula es en la ci o oxicidad de las NETs ....... 6
Figu a 4. Oxy-Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos ca bonilados ................................... 18
Figu a 5. Wes e n Blo pa a la de ección de ubiqui inas y poliubiqui inas ................................ 19
Figu a 6. Wes e n Blo pa a la de ección de ubiqui inas y poliubiqui inas ................................ 20
Figu a 7. Cu a de ci o oxicidad del IOX1 ................................................................................... 21
Figu a 8. Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos me ilados ............................................... 22
Figu a 9. Cu a de ci o oxicidad del TSA ..................................................................................... 23
Figu a 10. Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos ace ilados ............................................. 23
Figu a 11. Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos ace ilados ............................................. 24
Figu a 12. Pu i icación de his onas median e FPLC .................................................................... 25
III
LISTA DE ABREVIATURAS
APC: p o eína C ac i ada
APS: pe sul a o de amonio
BSA: se albúmina bo ina
CO
2
: dióxido de ca bono
DAMP: pa ón molecula asociado a daño
DMEM: Dulbecco’s modi ied Eagle’s medium
DMSO: dime ilsul óxido
DNA: ácido desoxi ibonucleico
DNPH: 2,4-dini o enilhid acina
EDTA: ácido e ilendiamino e aacé ico
FPLC: Fas P o ein Liquid Ch oma og aphy
H
2
SO
4
: ácido sul ú ico
HAT: ace il ans e asa de his onas
HDAC: desace ilasa de his onas
HKMT: me il ans e asa de lisinas de his onas
HMT: me il ans e asa de his onas
IOX1: ácido 8-hid oxi-5-quinolin-ca boxílico/5-ca boxi-8-hid oxiquinolina
KCl: clo u o de po asio
KDM: desme ilasa de lisinas de his onas/p o eínas
LD
50
: dosis le al mediana
MAPK: quinasa de p o eínas ac i ada po mi ógenos
MgCl
2
: clo u o de magnesio
NaCl: clo u o sódico
NET: ed ex acelula de neu ó ilos
NF-κB: ac o nec ó ico κB
PAGE: elec o o esis en gel de poliac ilamida
PBS: ampón os a o salino
PRMT: me il ans e asa de a gininas de his onas/p o eínas
PTM: modi icación pos aduccional
IV
RNA: ácido ibonucleico
miRNA: mic o RNA
ncRNA: RNA no codi ican e
ROS: especie eac i a de oxígeno
SDS: dodecilsul a o sódico
TCA: ácido iclo oacé ico
TEMED: e ame ile ilendiamina
TFA: ácido i luo oacé ico
TLR: ecep o ipo Toll
T is: is hid oxime ilaminome ano
TSA: icos a ina A
UV: ul a iole a
WB: Wes e n Blo
7
In oducción
Wang e al., 2009) o la co elación en e ni eles de his onas ci ulinadas e hipe ace iladas en
lupus e i ema oso sis émico (Dwi edi e al., 2014; Pie e se e al., 2015). La elación en e los
daños p oducidos en el endo elio de los asos sanguíneos y las ca ac e ís icas de las his onas
que pa icipan es, a echa de hoy, un en e abie o cuyo es udio puede p opo ciona impo an e
in o mación en cuan o a los de alles mecanís icos, así como se i de base pa a el diseño de
bioma cado es epigené icos especí icos. En el p esen e abajo se desa olla un p o ocolo de
inducción de modi icaciones pos aduccionales en his onas y su pos e io pu i icación, en is as
a la e aluación de las p opiedades ci o óxicas de es as o mas especí icas en elación al daño
endo elial p oducido po la p esencia de his onas ci culan es.

9
Obje i os
2. OBJETIVOS
1. El p ime obje i o del p esen e abajo consis e en la inducción de modi icaciones
pos aduccionales especí icas en his onas, median e la u ilización de dis in os compues os:
1.1. MG 132 pa a la inducción de ubiqui inaciones/ca bonilaciones.
1.2. IOX1 pa a la inducción de me ilaciones.
1.3. TSA pa a la inducción de ace ilaciones.
2. El segundo obje i o es la ob ención de ex ac os celula es pu os de his onas indi iduales a
pa i de ex ac os complejos ob enidos en las condiciones desc i as en el obje i o p ime o
median e écnicas c oma og á icas.
11
Ma e iales y mé odos
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. CULTIVOS CELULARES
Pa a la ealización de odos los expe imen os se emplea on células HeLa, línea celula
de cánce ce ical humano. És as se c ecie on en medio de cul i o DMEM (In i ogen, San Diego,
CA, EEUU) suplemen ado con un 10% de sue o bo ino e al (In i ogen, San Diego, CA, EEUU) y
un 1% de penicilina/es ep omicina (In i ogen, San Diego, CA, EEUU).
Las células se man u ie on en ascos de cul i o celula T75 a una densidad de 20000
células/cm
2
ap oximadamen e, a 37ºC en a mós e a humidi icada y con un 5% de CO
2
en la
incubado a He acell 150i CO
2
(The mo Scien i ic, New Yo k, NY, EEUU).
3.2. ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD
Pa a de e mina el g ado de ci o oxicidad de los compues os empleados se u ilizó el
mé odo de la sul o hodamina B. Es e compues o iñe de un colo osado el con enido p o eico
de las células. Po an o, solo se eñi án aquellas células cuya memb ana se encuen e dañada
como consecuencia de mue e celula , ya que es a es la única mane a en la que la
sul o hodamina iene acceso a las p o eínas con enidas en el in e io de las células. Midiendo la
abso bancia a una longi ud de onda de 570 nm se pueden cuan i ica las p o eínas, cuyo núme o
es di ec amen e p opo cional al núme o de células supe i ien es an es de comenza el mé odo
de la sul o hodamina.
El p ocedimien o ealizado comenzó po el cul i o de células HeLa en una placa de 96
pocillos pa a cada compues o, con 1000 células po pocillo en un olumen de 95 μl. Cada placa
se gua dó en la incubado a mencionada p e iamen e y al día siguien e se sacó y se añadie on
los espec i os a amien os en un olumen de 5 μl, alcanzando un olumen o al en cada pocillo
de 100 μl. Al inaliza el a amien o, se gua dó la placa en la incubado a y as 24 h cada pocillo
ecibió el mismo a amien o en el mismo olumen. T as 24 h más en la incubado a se añadió
50 μl de ácido iclo oacé ico (TCA) al 50% ío (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU) en cada
pocillo pa a ija las células y p o oca la p ecipi ación de las p o eínas en el ondo de la placa.
Inmedia amen e se incuba on las células en la misma placa a 4ºC du an e 1 h. Pasado es e
iempo se eliminó el sob enadan e y se ealiza on cinco la ados con agua, de 200 μl cada la ado.
T as habe eliminado me iculosamen e el sob enadan e y habe espe ado a que se seca a la
placa, se pipe eó un olumen de 100 μl de sul o hodamina B (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO,
EEUU) al 0,4% en ácido acé ico al 1% en cada pocillo y se incubó du an e 20 min a empe a u a
ambien e y en oscu idad. Pos e io men e, se eliminó el sob enadan e y se lle ó a cabo un la ado
quín uple con ácido acé ico al 1% (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU) con olúmenes de 150 μl
po pocillo. Es e paso si ió pa a elimina el colo an e que no había quedado ijado a las
p o eínas. Una ez más se eliminó el sob enadan e y se dejó seca la placa. Hecho es o se añadió
100 μl po pocillo de izma 10 mM (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU) con al de solubiliza el
colo an e ijado a las p o eínas y pode así después lee la abso bancia. T as unos minu os de
eposo se in odujo la placa en el espec o o óme o Spec aMax Plus 384 (Molecula De ices,
Sunny ale, CA, EEUU) y se ealizó mediciones an o a 570 nm de longi ud de onda como a 620
12
Ma e iales y mé odos
nm. Todas las condiciones y concen aciones ensayadas se lle a on a cabo po iplicado. Pa a
el cálculo de la LD
50
, se ep esen ó g á icamen e el p omedio de los po cen ajes de células i as
en cada condición espec o a la condición con ol, y se calculó el ajus e de los pun os a una cu a
de ipo hipe bólica ob eniendo una R
2
de 0,948.
3.3. OBTENCIÓN DE HISTONAS
Pa a la ob ención de his onas se p ocedió a la lisis de unas 3·10
6
células, p e iamen e
a adas con TSA (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU), IOX1 (Abcam, Camb idge, RU) o DMSO a
las 24 h y a las 48 h as la siemb a en placas T150; y con MG 132 (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO,
EEUU) o DMSO a las 4 h as la siemb a en placas T150. Pa a ello, se eliminó el medio de cul i o
y se la ó cada placa dos eces con 5 ml de PBS. Una ez eliminados los es os de PBS, se
añadie on 3 ml de ipsina y se incuba on las placas du an e 5 min a 37ºC en a mós e a
humidi icada con un 5% de CO
2
. Seguidamen e, la ipsina ue inac i ada añadiendo 3 ml de
medio DMEM. Nada más inac i ada la ipsina se ans i ió el con enido de las placas a ubos
Co ning y se ealizó una cen i ugación a 1500 pm du an e 5 min a empe a u a ambien e. El
sob enadan e ue eliminado y los “pelle s” se esuspendie on en 1 ml de PBS, as lo cual el
con enido se ans i ió a ubos de 1,5 ml y se ol ió a cen i uga a 1500 pm du an e 5 min.
Eliminando el sob enadan e una ez más, se añadió a los ubos 1 ml de ampón de lisis
hipo ónico (T is-Cl pH=8 10 mM, KCl 1 mM, MgCl
2
1,5 mM y di io ei ol 1 mM) y se deja on
o ando en la no ia a 4ºC du an e 30 min pa a a o ece la lisis mecánica y el hinchado
hipo ónico de las células. A con inuación, se cen i uga on los ubos a 10000 pm a 4ºC du an e
10 min y, pos e io men e, se eliminó el sob enadan e y se esuspendió el con enido de cada
ubo en 400 μl de H
2
SO
4
0,4 N. El siguien e paso ue deja los ubos en o ación cons an e en la
cáma a ía (a 4ºC) du an e oda la noche.
Al día siguien e se ol ie on a cen i uga los ubos a 13000 pm a 4ºC du an e 10 min
y la ase líquida se ans i ió a ubos de 1,5 ml nue os. Inmedia amen e se añadió 132 μl de ácido
iclo oacé ico al 100% (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU) go a a go a y se in i ie on los ubos
a ias eces pa a acili a la p ecipi ación de las his onas, as lo cual se deja on eposa en hielo
du an e unos 30 min. Pasado es e iempo, se lle ó a cabo o a cen i ugación a 13000 pm a 4ºC
de 10 min. Pa a elimina el ácido se aspi ó cuidadosamen e el sob enadan e con la pipe a y se
la ó el “pelle ” con 0,5 ml de ace ona ía. La cen i ugación y la adición de ace ona se epi ie on
una ez más y, as una úl ima cen i ugación, se eliminó el sob enadan e con la pipe a y se dejó
seca el “pelle ” de his onas pu i icadas du an e unos 30 min. Po úl imo, el “pelle ” se disol ió
en un olumen de e minado de agua bides ilada, dependiendo de la can idad de “pelle ”
p esen e en cada ubo (en e 50 μl y 100 μl).
3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Pa a cuan i ica la can idad de p o eína se u ilizó el mé odo de B ad o d, una écnica
colo imé ica que pe mi e medi can idades de p o eínas en disolución. En p ime luga , con el
in de ob ene una ec a pa ón, se p epa ó una se ie de mues as es ánda de se albúmina
bo ina (BSA) de concen aciones conocidas: 0,25; 1; 2; 4; 5 y 10 (mg/ml). Al mismo iempo, en
una mic ocube a Plas ib an s anda d disposable cu e e (Sigma-Ald ich, S . Louis, MO, EEUU) se
in odujo 1 ml de agua bides ilada, que si ió como blanco pa a calib a el espec o o óme o.

13
Ma e iales y mé odos
A con inuación se añadió en cada mic ocube a de espec o o ome ía, incluyendo las que
con end ían las mues as cuya concen ación se deseaba conoce , 800 μl de agua bides ilada y
200 μl de Bio-Rad P o ein Assay Dye Reagen Concen a e (Bio-Rad Labo a o ies GmbH,
München, Alemania), cuya mezcla se había p epa ado p e iamen e pa a odas las cube as en
un ubo Falcon de 50 ml. Jus o después se añadió un 1 μl de mues a en las co espondien es
cube as, an o de las de BSA como las que con enían el ex ac o de his onas. Seguidamen e se
in i ie on odas las mic ocube as apándolas an es con ilm pa a que la mezcla queda a bien
homogénea y se incuba on en comple a oscu idad du an e unos pocos minu os pa a que los
componen es eacciona an en e ellos. T anscu ido es e iempo se midió la abso bancia a una
longi ud de onda de 595 nm en el espec o o óme o Jenway 7315 Spec opho ome e (Bibby
Scien i ic L d, S one, S a s, RU). Con los da os ob enidos de las mues as de concen ación
conocida se p ocedió a la elabo ación de una ec a pa ón. Con la ecuación de la ec a se
ob u ie on las concen aciones desconocidas de las mues as de his onas.
3.5. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT
Pa a pode de ec a especí icamen e las p o eínas (modi icadas o no) p esen es en los
ex ac os de his onas se lle a on a cabo a ios ensayos de Wes e n Blo con dis in as mues as
y an icue pos. En p ime luga , pa a que la de ección de las di e en es his onas uese posible,
és as se sepa a on según su peso molecula median e una elec o o esis en gel de poliac ilamida
con dodecilsul a o sódico (SDS-PAGE). Con al in, se p epa ó un gel de poliac ilamida al 15%
pa a cada ensayo, cuyo con enido e a: 3,55 ml de agua bides ilada; 3,75 ml de ac ilamida al 40%;
2,5 ml de T is pH=8,8 1,5 M; 0,1 ml de SDS al 10%; 0,1 ml de APS y 0,004 ml de TEMED.
Mien as el gel polime izaba se p epa a on las mues as que más a de se ca ga ían en
el mismo. Se dispuso, en ubos de 1,5 ml nue os, el olumen necesa io de disolución de his onas
pa a que hubie a un o al de 5 μg de p o eína, 4 μl de ampón de ca ga (T is 40 mM, EDTA 4
mM, azul de b omo enol al 0,01%, saca osa al 40%, SDS al 4% y β-me cap oe anol al 10%) y el
olumen necesa io de agua bides ilada pa a alcanza los 20 μl. Pos e io men e, se pusie on los
ubos a calen a en un e mobloque a 95ºC du an e unos 5 min, anscu idos los cuales se lle ó
a cabo un “spin” en la cen í uga pa a asegu a que odo el con enido del ubo se encon a a en
el ondo. Finalmen e, se ca ga on los 20 μl de cada ubo en los dis in os pocillos del gel ya
polime izado den o de una cube a MiniPROTEAN Te a cell (Bio ad, He cules, CA, EEUU) con
“ unning bu e ” (T is 0,25 M, glicina 2 M y SDS al 1%) y se dio comienzo a la elec o o esis
co iendo a 120 V du an e una ho a.
Una ez el en e de bandas alcanzó la pa e más in e io del gel, se de u o la
elec o o esis y se mon ó el gel y una memb ana Ni ocellulose Blo ing Memb ane de 0,45 μm
(GE Heal hca e Li e Sciences) en e dos papeles, es os a su ez en uel os en dos es opajos,
sob e un sopo e que man u ie a el gel comple amen e pegado a la memb ana pa a lle a a
cabo la ans e encia de las his onas del gel a la memb ana. Ins alando el mon aje en una cube a
de ans e encia se añadió ampón de ans e encia (T is 25 mM, glicina pH=8,3 192 mM y un
20% de me anol pu o) y se aplicó un ol aje cons an e de 120 V a 4ºC du an e 1 h
ap oximadamen e.
Finalizada es a ase y una ez sepa ado el gel de la memb ana se dejó eñi al p ime o
en azul de Coomassie (1,25 g de Coomassie R-250, 250 ml de me anol, 50 ml de ácido acé ico y
1200 ml de agua bides ilada), mien as que la memb ana se sume gió en ampón de bloqueo
14
Ma e iales y mé odos
compues o po BSA, con una concen ación dependien e del an icue po u ilizado
pos e io men e (0,01 g/ml o 0,05 g/ml), en TBS-Tween (T is 20 mM, NaCl pH=7,6 137 mM y un
0,1% de Tween 20) o PBS-Tween, según el an icue po empleado después, du an e 1 h. Es e
bloqueo si e pa a educi las uniones inespecí icas de los an icue pos.
T as el bloqueo se p ocedió a la hib idación de los an icue pos p ima ios con las
his onas. Los an icue pos u ilizados se unían especí icamen e a: H3K27me3 (1:1000, Diagenode,
Den ille, NJ, EEUU), H3K9ac (1:1000, Cell Signaling, Dan e s, MA, EEUU), H2AK5ac (1:1000, Cell
Signaling, Dan e s, MA, EEUU), H3 (1:25000, Me ckMillipo e, Da ms ad , Alemania), H2A
(1:1000, Cell Signaling, Dan e s, MA, EEUU) y ubiqui ina (Me ckMillipo e, Da ms ad , Alemania).
Cada an icue po se diluyó, según las indicaciones de las espec i as casas come ciales, en TBS-
Tween o PBS-Tween con BSA, dependiendo del ipo de an icue po, an es de deja cada
memb ana en sus co espondien es disoluciones du an e oda la noche a 4ºC en agi ación
sua e.
Al día siguien e se la ó cada memb ana con 0,01 g/ml o 0,05 g/ml de BSA en TBS-Tween
o PBS-Tween, según el an icue po u ilizado, pa a elimina el exceso de an icue po p ima io que
no se hubie a unido a la memb ana. A con inuación se ol ió a incuba las memb anas, es a ez
con an icue po secunda io, conjugado con el enzima pe oxidasa de ábano, de cab a an i- a ón
(1:7500, Me ck KGaA, Da ms ad , Alemania) o de cab a an i-conejo (1:2500, Cell Signaling,
Dan e s, MA, EEUU) en unción del an icue po p ima io empleado, du an e 1 h en agi ación
sua e. T as es a incubación se la ó nue amen e po iplicado cada memb ana con los mismos
ampones de los la ados p eceden es y se p ocedió a la de ección quimioluminiscen e de las
p o eínas. Pa a ello, se incubó cada memb ana con 1 ml de mezcla 1:1 de los eac i os del ki de
e elado ECL™ Wes e n Blo ing De ec ion Reagen s (GE Heal hca e UK Limi ed, Li le Chal on ,
Buckinghamshi e, RU) y as unos minu os se in oduje on en el escáne densi omé ico
ImageQuan LAS 4000 (GE Heal hca e UK Limi ed, Li le Chal on , Buckinghamshi e, RU).
Finalmen e, los esul ados se analiza on median e el p og ama de análisis de imágenes ImageJ.
3.6. ANÁLISIS DE LA CARBONILACIÓN DE PROTEÍNAS
Pa a el es udio de la ca bonilación en p o eínas se lle ó a cabo una a ian e de Wes e n
Blo conocida como OxyBlo u Oxy-Wes e n Blo . Una de las di e encias espec o al WB o iginal
es la necesidad de de i a iza an es las mues as, pa a lo cual se emplea on los eac i os del
OxyBlo ™ P o ein Oxida ion De ec ion Ki (Millipo e, Bille ica, MA, EEUU).
La de i a ización de las mues as se ealizó median e la desna u alización de 5 μl de
cada mues a al añadi 5 μl de SDS al 12%. Seguidamen e, se añadie on 10 μl de 2,4-
dini o enilhid acina (DNPH) 10 mM en TFA al 10% a cada disolución, menos al con ol nega i o,
al cual se añadie on 10 μl de De i a iza ion-Con ol Solu ion. T as es o, se incuba on odas las
mues as en oscu idad du an e 15 min ap oximadamen e, con cuidado de no deja que las
eacciones con inua an más iempo pa a e i a eacciones secunda ias no deseadas. Después
se añadie on 7,5 μl de Neu aliza ion Solu ion (T is 2 M en glice ol al 30%) a cada mues a pa a
neu aliza la eacción y 1 μl de β-me cap oe anol. A con inuación las mues as se ca ga on en
un gel de poliac ilamida al 15% pa a con inua con el p ocedimien o clásico de WB sin necesidad
de añadi ampón de ca ga ni de desna u aliza la mues as en un e mobloque.
15
Ma e iales y mé odos
T as la ans e encia la memb ana ue bloqueada con BSA al 5% en PBS-Tween du an e
1 h. Finalizado el bloqueo, se incubó con an icue po an i-DNP (p o is o ambién en el OxyBlo ™
P o ein Oxida ion De ec ion Ki ) según las indicaciones del ab ican e.
3.7. CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
Pa a la sepa ación c oma óg a ica de los ex ac os de his onas se u ilizó un equipo
c oma og á ico de FPLC (“Fas P o ein Liquid Ch oma og aphy”) ÄKTA™ pu e (GE Heal hca e
Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia), con los siguien es ampones de abajo:
- Eluen e A (5% de ace oni ilo y 0,1% de TFA).
- Eluen e B (90% de ace oni ilo y 0,1% de TFA).
- Tampón de limpieza (0,1% de TFA).
- Tampón de man enimien o de la columna (20% de e anol).
An es de p ocede se desgasi ica on odos los ampones en un sonicado pa a e i a
daños al equipo y a la columna. Pos e io men e, se conec ó la columna SOURCE™ 15RPC ST
4.6/100 (GE Heal hca e Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) al equipo y se lle ó a cabo un la ado
de odo el ci cui o con el ampón de limpieza. Seguidamen e se dio comienzo al p og ama de
elución pa iendo de una concen ación de eluen e B igual a 0, que i ía aumen ando
g adualmen e con un lujo cons an e has a llega a una concen ación del 100% y se inyec ó el
olumen co espondien e a un 1 mg de mues a di ec amen e en el “loop”. Las p o eínas se
mezclan con los ampones co espondien es en un mezclado y, al sepa a se en la columna
según su hid o obicidad, an pasando po un lec o UV que mide la conduc i idad
(concen ación de sales), el pH y la abso bancia (concen ación de p o eínas) y mues a los
esul ados en o ma de picos. Al sali del bloque del lec o UV, las p o eínas se di iden median e
el colec o F ac ion collec o F9-R (GE Heal hca e Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) acoplado al
equipo de FPLC en di e en es acciones en ubos de 1,5 ml, mien as que las impu ezas se
ie en po o a salida a un ubo de desechos. Po úl imo, una ez el p og ama de elución hubo
inalizado, se lle ó a cabo o o la ado del ci cui o con ampón de limpieza, pa a asegu a que no
queda a ningún es o de mues a a lo la go del ci cui o. Cuando el la ado hubo e minado, se
inyec ó e anol al 20% y se in i ió el lujo pa a el pos e io almacenamien o de la columna. De
es a mane a, la columna pudo se almacenada con e anol en su in e io e i ando la en ada de
ai e. T as es o, el lujo se de u o y se ob u o el c oma og ama con el p og ama Unico n.
23
Resul ados y discusión
Figu a 9. Cu a de ci o oxicidad del TSA. Po cen aje de células i as en e al ango de concen aciones empleado. La
línea neg a con cí culos co esponde a los alo es ob enidos con el ehículo DMSO. La línea oja con cuad ados
co esponde a los alo es ob enidos con TSA.
Median e es a cu a de oxicidad se calculó ma emá icamen e un alo de LD
50
de 4,18
ng/ml; po lo an o, se decidió u iliza una concen ación de TSA de 2 ng/ml, alo que se
encuen a ap oximadamen e un 50 % po debajo del umb al de oxicidad, con el in de induci
al os ni eles de ace ilación en las his onas, al e ando lo menos posible la iabilidad celula . T as
el a amien o, se ex aje on las his onas de las células y se es udia on las ace ilaciones
inducidas median e WB ( igu a 10). Conc e amen e, se es udia on dos esiduos donde puede
da se ace ilación: la lisina 5 de la his ona H2A y la lisina 9 de la his ona H3.
Figu a 10. Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos ace ilados. Pa ón de la ace ilación de las his onas H3 y H2A
en los esiduos K9 y K5, espec i amen e, ob enido a pa i de ex ac os de células HeLa, co espondiendo “Ø” a
con oles y “TSA” a ex ac os de células a adas con 2 ng/ml de TSA.
A la luz de es os esul ados se puede a i ma que ambas PTMs no se han is o
signi ica i amen e aumen adas as el a amien o con TSA. Al habe u ilizado ambién
an icue pos con a H2A y H3 sin modi icaciones, se puede comp oba que el TSA ampoco ha
inducido una mayo exp esión de H2A y H3 o ales en compa ación con las mues as con ol,
cons i uyendo un buen con ol de ca ga.
Con el in de in en a ob ene una inducción signi ica i a de las his onas, aun pudiendo
a ec a a la iabilidad celula , se lle ó a cabo o o expe imen o ensayando concen aciones más
al as de TSA. Se a a on los cul i os celula es con un ango de concen aciones en e 20 y 100
ng/ml, a pesa de lo cual la asa de mue e celula no ue an ele ada como pa a no pe mi i la
ob ención de ex ac os de his onas pa a se analizados. A pa i de dichos ex ac os se ealizó
An i
-
H3
An i
-
H2A
Ø
TSA
An i
-
H3K9ac
An i
-
H2AK5ac

24
Resul ados y discusión
un WB y en es e caso sí que puede ap ecia se un inc emen o g adual de la in ensidad de las
bandas de las memb anas incubadas con an icue pos con a his onas ace iladas, p opo cional a
la concen ación de TSA, an o en aquellas con an i-H3K9ac como con an i-H2AK5ac, si bien es e
úl imo en meno medida ( igu a 11). Respec o a las bandas con an icue pos con a his onas
o ales (an i-H3 y an i-H2A) no hay cambios ap eciables, po lo que se deduce que los ni eles de
es as his onas no se ie on a ec ados po el TSA y po an o puede conclui se que el aumen o
de in ensidad de las bandas co espondien es a esiduos ace ilados es debido al e ec o del TSA.
Figu a 11. Wes e n Blo pa a la de ección de esiduos ace ilados. Pa ón de la ace ilación de las his onas H3 y H2A
en los esiduos K9 y K5, espec i amen e, ob enido a pa i de ex ac os de células HeLa, co espondiendo “Ø” a un
con ol y “TSA” a ex ac os de células a adas con TSA con el siguien e g adien e de concen aciones: 20, 50 y 100
ng/ml.
A pesa de que, en es e caso, se abajó con alo es de concen ación muy supe io es a
los suge idos po el ensayo de oxicidad, el hecho de habe ob enido inducción de la ace ilación
en dos his onas di e en es apun a a que pod ía ob ene se, de escala lo su icien e el p oceso,
una can idad su icien e de ex ac o de his onas hipe ace iladas como pa a u iliza lo en un
p oceso de pu i icación que pe mi a su aislamien o.
4.2. PURIFICACIÓN DE HISTONAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA
En pa alelo a la inducción de las PTMs especí icas en his onas, se diseñó un p o ocolo
de pu i icación u ilizando la écnica de c oma og a ía de ase e e sa. Dado que las his onas
p esen an un amaño molecula y unas p opiedades bioquímicas muy simila es, es a écnica se
p esen a como una opción adecuada pa a sepa a los dis in os ipos en unción de las
di e encias en el ca ác e hid o óbico de sus dominios globula es. Pa a ello, se cul i a on células
HeLa sin induci , a mayo escala que en los expe imen os desc i os an e io men e, con is as a
ob ene ex ac os de his onas lo su icien emen e concen ados como pa a sepa a sus
componen es c oma og á icamen e. Ob enidos es os ex ac os, se ca gó un olumen
co espondien e a 1 mg de ex ac o o al de his onas en un equipo de FPLC equipado con una
columna de ase e e sa, pa a elui con un g adien e de ace oni ilo (inc emen ando la
p opo ción de ampón B), según el p o ocolo de allado en el apa ado “Ma e iales y mé odos”.
En la igu a 12A se mues a el c oma og ama ob enido, en el cual se obse a que la
mayo ía de p o eínas se eluyen de la columna en el amo incluido en e el 40% y el 60%,
An i
-
H3
An i
-
H3K9ac
An i
-
H2A
An i
-
H2AK5ac
Ø
TSA
25
Resul ados y discusión
ap oximadamen e, de ampón B. T as la elución, se ecogie on las p o eínas en di e en es
acciones ( ubos de 1,5 ml) y se ca ga on geles pa a e alua el con enido o al en p o eínas
median e inción de Coomassie (no mos ado). Se selecciona on las acciones que con enían
bandas con amaño co espondien e a las his onas (coinciden es con algunos de los picos
disc e os obse ados en el ecuad o de la igu a 12A; acciones 25-30), y as concen a las se
ca gó un nue o gel que pe mi iese compa a la can idad de p o eína ob enida en cada acción
una ez no malizada la ca ga ( igu a 12B). La inción con Coomassie pe mi e cons a a que las
bandas de mayo in ensidad, sepa adas en acciones independien es, co esponden al amaño
de las his onas al compa a las con una mues a p o enien e del ex ac o o al an es de su paso
po la columna. A con inuación, se analizó median e WB la iden idad de dichas bandas ( igu a
12C).
Figu a 12. Pu i icación de his onas median e FPLC. C oma og ama del ex ac o de his onas in oducido en el FPLC
(A). Gel eñido con azul de Coomassie del mismo ex ac o de his onas una ez ealizada la ans e encia del WB a la
memb ana de ni ocelulosa (B). Análisis median e WB de his onas H3 y H2A en dis in as acciones del ex ac o de
his onas (C).
En la incubación de la memb ana (di idida pa a pode usa dos an icue pos di e en es a
la ez) se emplea on an icue pos con a H3 y H2A. Sin emba go, a pesa de que an o pa a H3
como pa a H2A hay de ección (calles 29 y 30), las bandas apa ecen en las dos calles
indis in amen e, de ec ándose H3 y H2A al mismo iempo en las dos acciones. Es posible que
la apa ición de señal en ambas calles se deba más bien a una eacción c uzada de los an icue pos
con las his onas, cosa ela i amen e ecuen e. De la misma mane a, en la igu a 12A, la inción
de Coomassie sugie e que más que una eacción c uzada de los an icue pos, las di e en es
C
An i
-
H3
An i
-
H2A
H3
H2A/H2B
H4
H1
E.T.
M
25
26
27
28
29
30
FRACCIONES
25
26
27
28
29
30
FRACCIONES
A
B
26
Resul ados y discusión
his onas no llega on a sepa a se adecuadamen e en la c oma og a ía, ob eniendo las mismas
his onas en acciones di e en es. Po lo an o, aunque la écnica se mues a adecuada pa a la
sepa ación de his onas, se equie e una modi icación del g adien e y en gene al del p o ocolo
de pu i icación pa a asegu a la co ec a sepa ación de los di e en es ipos de his onas,
especialmen e de la H2A, la H3 y la H4. Además, se debe án ealiza WB con a una ba e ía de
an icue pos más amplia pa a asegu a la iden idad de odas las bandas apa ecidas.
4.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Y PERSPECTIVAS FUTURAS
En conjun o, los expe imen os ealizados pa a cada uno de los obje i os plan eados en
el p esen e abajo cons i uyen un buen pun o de pa ida pa a la elabo ación de un p o ocolo
de aislamien o de his onas con modi icaciones pos aduccionales especí icas. Como se ha
comen ado en los apa ados an e io es, la inducción de modi icaciones conc e as como la
ubiqui inación, ca bonilación o me ilación equie e es udios en mayo p o undidad. Una de las
cues iones a dilucida , de g an in e és, se ía de e mina el g ado de in luencia de la p esencia
de DMSO en las condiciones de cul i o ensayadas, pues o que pa ece in lui de o ma
inespecí ica en la apa ición de o mas de his onas modi icadas, especialmen e en el caso de las
ubiqui inaciones y ca bonilaciones.
Si bien no se ha conseguido una cla a inducción de muchas de las PTMs es udiadas, en
el caso de los expe imen os con TSA se han hallado unas condiciones que pe mi en obse a un
inc emen o en la ma ca de ace ilación de las his onas H2A y H3. Dado que ambién se ha pues o
a pun o un p o ocolo de pu i icación que pe mi e ob ene acciones en iquecidas con dichas
his onas, el siguien e paso se ía la combinación de ambas es a egias pa a, inalmen e, ob ene
una acción con H3 y H2A ace iladas que pe mi a se compa ada en e a acciones de his onas
en condiciones con ol. La u ilización de es as acciones pu i icadas en ensayos de ci o oxicidad
en e a células endo eliales – es a egia que se desa olla en nues o labo a o io en
colabo ación con el g upo de In es igación en Células Endo eliales del Depa amen o de
Fisiología de la Facul ad de Medicina y Odon ología (UV) – apo a ía da os muy ele an es ace ca
de la posible unción de las PTMs en los mecanismos isiopa ológicos elacionados con la
p esencia de his onas ci culan es.
27
Conclusiones
5. CONCLUSIONES
1. La inhibición del p o easoma con MG 132 en cul i os de células HeLa no es su icien e pa a
induci un inc emen o en los ni eles de ca bonilación ni ubiqui inación en his onas.
2. El a amien o de células HeLa con IOX1, incluso en concen aciones supe io es a la LD
50
, no
pe mi e induci la ime ilación de la his ona H3 en el esiduo K27.
3. El a amien o con TSA sólo es capaz de induci la ace ilación de los esiduos K9 y K5 de las
his onas H3 y H2A, espec i amen e, cuando se u iliza en concen aciones supe io es a la LD
50
calculada expe imen almen e.
4. Median e un p o ocolo de c oma og a ía en ase e e sa es posible sepa a la his ona H1 de
las his onas H2, H3 y H4, así como ob ene una acción mayo i a ia de H3 y o a de H2A/H2B y
H4.

29
Bibliog a ía
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