Estudio de modificaciones postraduccionales de histonas y su efecto citotóxico sobre células endoteliales

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D´ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Estudio de modificaciones postraduccionales de histonas y su efecto citotóxico sobre células endoteliales TRABAJO FIN DE GRADO EN BIOTECNOLOGÍA DANIEL VOLTOLINI GONZÁLEZ TUTORA: ROSA MARÍA PEIRÓ BARBER COTUTOR: CARLOS ROMÁ MATEO Curso Académico: 2015-2016 VALENCIA, septiembre de 2016 Licencia Creative Commons “Reconocimiento no Comercial - Sin Obra Derivada” ESTUDIO DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE HISTONAS Y SU EFECTO CITOTÓXICO SOBRE CÉLULAS ENDOTELIALES Autor: Daniel Voltolini González Tutora: Rosa María Peiró Barber Cotutor: Carlos Romá Mateo Valencia, septiembre de 2016 RESUMEN En los últimos años se ha descrito la participación de las histonas en procesos extracelulares implicados en inflamación. Las histonas, liberadas de forma controlada por neutrófilos, contribuyen a la inmovilización y eliminación de patógenos por las células del sistema inmunológico a través de las llamadas redes extracelulares de neutrófilos (NETs). Además, las propias histonas presentan un efecto citotóxico mediado por mecanismos aún no esclarecidos que facilitan el proceso inflamatorio y la respuesta inmunológica. Sin embargo, la presencia de histonas produce así mismo efectos nocivos sobre las células del endotelio de los vasos sanguíneos, por lo que las histonas circulantes se han visto involucradas en procesos patológicos que cursan con una respuesta inflamatoria prolongada, como por ejemplo en sepsis. No obstante, hasta la fecha se desconoce qué tipo de modificaciones postraduccionales concretas sufren las histonas implicadas en enfermedad, más allá de una participación de histonas citrulinadas o hiperacetiladas en lupus sistémico eritomatoso, por ejemplo. Las modificaciones postraduccionales de histonas contribuyen a la modulación de la expresión génica permitiendo o bloqueando el acceso de la maquinaria de transcripción a la cromatina, constituyendo uno de los mecanismos clave de la regulación epigenética y, por tanto, de gran relevancia para el estudio de la respuesta celular a condiciones ambientales específicas. En el presente trabajo se analizarán los patrones de modificaciones presentes en histonas obtenidas a partir de extractos celulares y se pondrá a punto una metodología de purificación para histonas con modificaciones postraduccionales específicas, con vistas a evaluar las diferencias en la capacidad citotóxica sobre células endoteliales humanas de los distintos tipos de histonas y en función de las modificaciones postraduccionales que presenten. PALABRAS CLAVE Histonas, modificaciones postraduccionales, FPLC, citotoxicidad STUDY OF HISTONE POSTRANSLATIONAL MODIFICATIONS AND THEIR CYTOTOXIC EFFECT ON ENDOTHELIAL CELLS Author: Daniel Voltolini González Tutor: Rosa María Peiró Barber Co-tutor: Carlos Romá Mateo Valencia, September 2016 ABSTRACT Participation of histones in extracellular processes related to inflammation has been described in recent years. Through their release in a controlled manner by neutrophils, histones take part in the immobilization and elimination of pathogens by immune cells, being key components in the so-called neutrophil extracellular traps (NETs). Besides, histones themselves show a cytotoxic effect induced by mechanisms not fully understood, that contributes to the inflammatory processes and immune responses. However, the presence of histones yields at the same time noxious effects on the endothelial cells of blood vessels, in such a way that plasma histones have been demonstrated to be involved in pathological processes like sepsis, in which prolonged inflammatory response occurs. Nevertheless, which kind of specific postranslational modifications in histones are implicated in disease remains currently unknown, with the exception of the presence of some citrullinated or hyperacetylated histones in systemic lupus erythematosus, for instance. Postranslational modifications of histones contribute to the modulation of gene expression either by allowing or blocking the access to chromatin for the transcription machinery, being one of the key mechanisms underlying epigenetic regulation and, hence, of great relevance for the study of cellular responses to specific environmental conditions. In the present work, the modification pattern present in histones obtained from human cell extracts will be analyzed, and a purification methodology for histones with specific postranslational modifications will be set, in order to evaluate the differences in the cytotoxic capability of the distinct histone types, and the diverse postranslational modifications they might show, on human endothelial cells. KEYWORDS Histones, postranslational modifications, FPLC, cytotoxicity I ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ............................................................................................................ 1 1.1. LAS HISTONAS ............................................................................................................... 2 1.2. MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES DE HISTONAS .............................................. 2 1.3. HISTONAS EXTRACELULARES ......................................................................................... 5 1.4. CITOTOXICIDAD MEDIADA POR HISTONAS ................................................................... 5 2. OBJETIVOS ................................................................................................................... 9 3. MATERIALES Y MÉTODOS ........................................................................................... 11 3.1. CULTIVOS CELULARES .................................................................................................. 11 3.2. ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD ...................................................................................... 11 3.3. OBTENCIÓN DE HISTONAS .......................................................................................... 12 3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS ................................................................................ 12 3.5. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT ................................................. 13 3.6. ANÁLISIS DE LA CARBONILACIÓN DE PROTEÍNAS ....................................................... 14 3.7. CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA .......................................................................... 15 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................... 17 4.1. INDUCCIÓN DE MODIFICACIONES POSTRADUCCIONALES EN HISTONAS ................... 17 4.1.1. Inducción de carbonilación y ubiquitinación con MG 132 .................................. 17 4.1.2. Inducción de metilación con IOX1 ....................................................................... 21 4.1.3. Inducción de acetilación con TSA ........................................................................ 22 4.2. PURIFICACIÓN DE HISTONAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA ........ 24 4.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Y PERSPECTIVAS FUTURAS ............................................ 26 5. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 27 6. BIBLIOGRAFÍA ............................................................................................................ 29 II ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Mecanismos considerados de carácter epigenético y las interacciones entre ellos ..... 1 Figura 2. Esquema de interacción entre proteínas modificadoras de histonas ............................ 4 Figura 3. Esquema del papel de las histonas extracelulares en la citotoxicidad de las NETs ....... 6 Figura 4. Oxy-Western Blot para la detección de residuos carbonilados ................................... 18 Figura 5. Western Blot para la detección de ubiquitinas y poliubiquitinas ................................ 19 Figura 6. Western Blot para la detección de ubiquitinas y poliubiquitinas ................................ 20 Figura 7. Curva de citotoxicidad del IOX1 ................................................................................... 21 Figura 8. Western Blot para la detección de residuos metilados ............................................... 22 Figura 9. Curva de citotoxicidad del TSA ..................................................................................... 23 Figura 10. Western Blot para la detección de residuos acetilados ............................................. 23 Figura 11. Western Blot para la detección de residuos acetilados ............................................. 24 Figura 12. Purificación de histonas mediante FPLC .................................................................... 25 III LISTA DE ABREVIATURAS APC: proteína C activada APS: persulfato de amonio BSA: seralbúmina bovina CO 2 : dióxido de carbono DAMP: patrón molecular asociado a daño DMEM: Dulbecco’s modified Eagle’s medium DMSO: dimetilsulfóxido DNA: ácido desoxirribonucleico DNPH: 2,4-dinitrofenilhidracina EDTA: ácido etilendiaminotetraacético FPLC: Fast Protein Liquid Chromatography H 2 SO 4 : ácido sulfúrico HAT: acetil transferasa de histonas HDAC: desacetilasa de histonas HKMT: metiltransferasa de lisinas de histonas HMT: metiltransferasa de histonas IOX1: ácido 8-hidroxi-5-quinolin-carboxílico/5-carboxi-8-hidroxiquinolina KCl: cloruro de potasio KDM: desmetilasa de lisinas de histonas/proteínas LD 50 : dosis letal mediana MAPK: quinasa de proteínas activada por mitógenos MgCl 2 : cloruro de magnesio NaCl: cloruro sódico NET: red extracelular de neutrófilos NF-κB: factor necrótico κB PAGE: electroforesis en gel de poliacrilamida PBS: tampón fosfato salino PRMT: metiltransferasa de argininas de histonas/proteínas PTM: modificación postraduccional IV RNA: ácido ribonucleico miRNA: micro RNA ncRNA: RNA no codificante ROS: especie reactiva de oxígeno SDS: dodecilsulfato sódico TCA: ácido tricloroacético TEMED: tetrametiletilendiamina TFA: ácido trifluoroacético TLR: receptor tipo Toll Tris: tris hidroximetilaminometano TSA: tricostatina A UV: ultravioleta WB: Western Blot 7 Introducción Wang et al., 2009) o la correlación entre niveles de histonas citrulinadas e hiperacetiladas en lupus eritematoso sistémico (Dwivedi et al., 2014; Pieterse et al., 2015). La relación entre los daños producidos en el endotelio de los vasos sanguíneos y las características de las histonas que participan es, a fecha de hoy, un frente abierto cuyo estudio puede proporcionar importante información en cuanto a los detalles mecanísticos, así como servir de base para el diseño de biomarcadores epigenéticos específicos. En el presente trabajo se desarrolla un protocolo de inducción de modificaciones postraduccionales en histonas y su posterior purificación, en vistas a la evaluación de las propiedades citotóxicas de estas formas específicas en relación al daño endotelial producido por la presencia de histonas circulantes. 9 Objetivos 2. OBJETIVOS 1. El primer objetivo del presente trabajo consiste en la inducción de modificaciones postraduccionales específicas en histonas, mediante la utilización de distintos compuestos: 1.1. MG 132 para la inducción de ubiquitinaciones/carbonilaciones. 1.2. IOX1 para la inducción de metilaciones. 1.3. TSA para la inducción de acetilaciones. 2. El segundo objetivo es la obtención de extractos celulares puros de histonas individuales a partir de extractos complejos obtenidos en las condiciones descritas en el objetivo primero mediante técnicas cromatográficas. 11 Materiales y métodos 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. CULTIVOS CELULARES Para la realización de todos los experimentos se emplearon células HeLa, línea celular de cáncer cervical humano. Éstas se crecieron en medio de cultivo DMEM (Invitrogen, San Diego, CA, EEUU) suplementado con un 10% de suero bovino fetal (Invitrogen, San Diego, CA, EEUU) y un 1% de penicilina/estreptomicina (Invitrogen, San Diego, CA, EEUU). Las células se mantuvieron en frascos de cultivo celular T75 a una densidad de 20000 células/cm 2 aproximadamente, a 37ºC en atmósfera humidificada y con un 5% de CO 2 en la incubadora Heracell 150i CO 2 (Thermo Scientific, New York, NY, EEUU). 3.2. ENSAYOS DE CITOTOXICIDAD Para determinar el grado de citotoxicidad de los compuestos empleados se utilizó el método de la sulforhodamina B. Este compuesto tiñe de un color rosado el contenido proteico de las células. Por tanto, solo se teñirán aquellas células cuya membrana se encuentre dañada como consecuencia de muerte celular, ya que esta es la única manera en la que la sulforhodamina tiene acceso a las proteínas contenidas en el interior de las células. Midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 570 nm se pueden cuantificar las proteínas, cuyo número es directamente proporcional al número de células supervivientes antes de comenzar el método de la sulforhodamina. El procedimiento realizado comenzó por el cultivo de células HeLa en una placa de 96 pocillos para cada compuesto, con 1000 células por pocillo en un volumen de 95 μl. Cada placa se guardó en la incubadora mencionada previamente y al día siguiente se sacó y se añadieron los respectivos tratamientos en un volumen de 5 μl, alcanzando un volumen total en cada pocillo de 100 μl. Al finalizar el tratamiento, se guardó la placa en la incubadora y tras 24 h cada pocillo recibió el mismo tratamiento en el mismo volumen. Tras 24 h más en la incubadora se añadió 50 μl de ácido tricloroacético (TCA) al 50% frío (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) en cada pocillo para fijar las células y provocar la precipitación de las proteínas en el fondo de la placa. Inmediatamente se incubaron las células en la misma placa a 4ºC durante 1 h. Pasado este tiempo se eliminó el sobrenadante y se realizaron cinco lavados con agua, de 200 μl cada lavado. Tras haber eliminado meticulosamente el sobrenadante y haber esperado a que se secara la placa, se pipeteó un volumen de 100 μl de sulforhodamina B (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) al 0,4% en ácido acético al 1% en cada pocillo y se incubó durante 20 min a temperatura ambiente y en oscuridad. Posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se llevó a cabo un lavado quíntuple con ácido acético al 1% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) con volúmenes de 150 μl por pocillo. Este paso sirvió para eliminar el colorante que no había quedado fijado a las proteínas. Una vez más se eliminó el sobrenadante y se dejó secar la placa. Hecho esto se añadió 100 μl por pocillo de trizma 10 mM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) con tal de solubilizar el colorante fijado a las proteínas y poder así después leer la absorbancia. Tras unos minutos de reposo se introdujo la placa en el espectrofotómetro SpectraMax Plus 384 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, EEUU) y se realizó mediciones tanto a 570 nm de longitud de onda como a 620 12 Materiales y métodos nm. Todas las condiciones y concentraciones ensayadas se llevaron a cabo por triplicado. Para el cálculo de la LD 50 , se representó gráficamente el promedio de los porcentajes de células vivas en cada condición respecto a la condición control, y se calculó el ajuste de los puntos a una curva de tipo hiperbólica obteniendo una R 2 de 0,948. 3.3. OBTENCIÓN DE HISTONAS Para la obtención de histonas se procedió a la lisis de unas 3·10 6 células, previamente tratadas con TSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU), IOX1 (Abcam, Cambridge, RU) o DMSO a las 24 h y a las 48 h tras la siembra en placas T150; y con MG 132 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) o DMSO a las 4 h tras la siembra en placas T150. Para ello, se eliminó el medio de cultivo y se lavó cada placa dos veces con 5 ml de PBS. Una vez eliminados los restos de PBS, se añadieron 3 ml de tripsina y se incubaron las placas durante 5 min a 37ºC en atmósfera humidificada con un 5% de CO 2 . Seguidamente, la tripsina fue inactivada añadiendo 3 ml de medio DMEM. Nada más inactivada la tripsina se transfirió el contenido de las placas a tubos Corning y se realizó una centrifugación a 1500 rpm durante 5 min a temperatura ambiente. El sobrenadante fue eliminado y los “pellets” se resuspendieron en 1 ml de PBS, tras lo cual el contenido se transfirió a tubos de 1,5 ml y se volvió a centrifugar a 1500 rpm durante 5 min. Eliminando el sobrenadante una vez más, se añadió a los tubos 1 ml de tampón de lisis hipotónico (Tris-Cl pH=8 10 mM, KCl 1 mM, MgCl 2 1,5 mM y ditiotreitol 1 mM) y se dejaron rotando en la noria a 4ºC durante 30 min para favorecer la lisis mecánica y el hinchado hipotónico de las células. A continuación, se centrifugaron los tubos a 10000 rpm a 4ºC durante 10 min y, posteriormente, se eliminó el sobrenadante y se resuspendió el contenido de cada tubo en 400 μl de H 2 SO 4 0,4 N. El siguiente paso fue dejar los tubos en rotación constante en la cámara fría (a 4ºC) durante toda la noche. Al día siguiente se volvieron a centrifugar los tubos a 13000 rpm a 4ºC durante 10 min y la fase líquida se transfirió a tubos de 1,5 ml nuevos. Inmediatamente se añadió 132 μl de ácido tricloroacético al 100% (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) gota a gota y se invirtieron los tubos varias veces para facilitar la precipitación de las histonas, tras lo cual se dejaron reposar en hielo durante unos 30 min. Pasado este tiempo, se llevó a cabo otra centrifugación a 13000 rpm a 4ºC de 10 min. Para eliminar el ácido se aspiró cuidadosamente el sobrenadante con la pipeta y se lavó el “pellet” con 0,5 ml de acetona fría. La centrifugación y la adición de acetona se repitieron una vez más y, tras una última centrifugación, se eliminó el sobrenadante con la pipeta y se dejó secar el “pellet” de histonas purificadas durante unos 30 min. Por último, el “pellet” se disolvió en un volumen determinado de agua bidestilada, dependiendo de la cantidad de “pellet” presente en cada tubo (entre 50 μl y 100 μl). 3.4. CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS Para cuantificar la cantidad de proteína se utilizó el método de Bradford, una técnica colorimétrica que permite medir cantidades de proteínas en disolución. En primer lugar, con el fin de obtener una recta patrón, se preparó una serie de muestras estándar de seralbúmina bovina (BSA) de concentraciones conocidas: 0,25; 1; 2; 4; 5 y 10 (mg/ml). Al mismo tiempo, en una microcubeta Plastibran standard disposable cuvette (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EEUU) se introdujo 1 ml de agua bidestilada, que sirvió como blanco para calibrar el espectrofotómetro. 13 Materiales y métodos A continuación se añadió en cada microcubeta de espectrofotometría, incluyendo las que contendrían las muestras cuya concentración se deseaba conocer, 800 μl de agua bidestilada y 200 μl de Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate (Bio-Rad Laboratories GmbH, München, Alemania), cuya mezcla se había preparado previamente para todas las cubetas en un tubo Falcon de 50 ml. Justo después se añadió un 1 μl de muestra en las correspondientes cubetas, tanto de las de BSA como las que contenían el extracto de histonas. Seguidamente se invirtieron todas las microcubetas tapándolas antes con film para que la mezcla quedara bien homogénea y se incubaron en completa oscuridad durante unos pocos minutos para que los componentes reaccionaran entre ellos. Transcurrido este tiempo se midió la absorbancia a una longitud de onda de 595 nm en el espectrofotómetro Jenway 7315 Spectrophotometer (Bibby Scientific Ltd, Stone, Staffs, RU). Con los datos obtenidos de las muestras de concentración conocida se procedió a la elaboración de una recta patrón. Con la ecuación de la recta se obtuvieron las concentraciones desconocidas de las muestras de histonas. 3.5. ANÁLISIS DE PROTEÍNAS MEDIANTE WESTERN BLOT Para poder detectar específicamente las proteínas (modificadas o no) presentes en los extractos de histonas se llevaron a cabo varios ensayos de Western Blot con distintas muestras y anticuerpos. En primer lugar, para que la detección de las diferentes histonas fuese posible, éstas se separaron según su peso molecular mediante una electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE). Con tal fin, se preparó un gel de poliacrilamida al 15% para cada ensayo, cuyo contenido era: 3,55 ml de agua bidestilada; 3,75 ml de acrilamida al 40%; 2,5 ml de Tris pH=8,8 1,5 M; 0,1 ml de SDS al 10%; 0,1 ml de APS y 0,004 ml de TEMED. Mientras el gel polimerizaba se prepararon las muestras que más tarde se cargarían en el mismo. Se dispuso, en tubos de 1,5 ml nuevos, el volumen necesario de disolución de histonas para que hubiera un total de 5 μg de proteína, 4 μl de tampón de carga (Tris 40 mM, EDTA 4 mM, azul de bromofenol al 0,01%, sacarosa al 40%, SDS al 4% y β-mercaptoetanol al 10%) y el volumen necesario de agua bidestilada para alcanzar los 20 μl. Posteriormente, se pusieron los tubos a calentar en un termobloque a 95ºC durante unos 5 min, transcurridos los cuales se llevó a cabo un “spin” en la centrífuga para asegurar que todo el contenido del tubo se encontrara en el fondo. Finalmente, se cargaron los 20 μl de cada tubo en los distintos pocillos del gel ya polimerizado dentro de una cubeta MiniPROTEAN Tetra cell (Biorad, Hercules, CA, EEUU) con “running buffer” (Tris 0,25 M, glicina 2 M y SDS al 1%) y se dio comienzo a la electroforesis corriendo a 120 V durante una hora. Una vez el frente de bandas alcanzó la parte más inferior del gel, se detuvo la electroforesis y se montó el gel y una membrana Nitrocellulose Blotting Membrane de 0,45 μm (GE Healthcare Life Sciences) entre dos papeles, estos a su vez envueltos en dos estropajos, sobre un soporte que mantuviera el gel completamente pegado a la membrana para llevar a cabo la transferencia de las histonas del gel a la membrana. Instalando el montaje en una cubeta de transferencia se añadió tampón de transferencia (Tris 25 mM, glicina pH=8,3 192 mM y un 20% de metanol puro) y se aplicó un voltaje constante de 120 V a 4ºC durante 1 h aproximadamente. Finalizada esta fase y una vez separado el gel de la membrana se dejó teñir al primero en azul de Coomassie (1,25 g de Coomassie R-250, 250 ml de metanol, 50 ml de ácido acético y 1200 ml de agua bidestilada), mientras que la membrana se sumergió en tampón de bloqueo 14 Materiales y métodos compuesto por BSA, con una concentración dependiente del anticuerpo utilizado posteriormente (0,01 g/ml o 0,05 g/ml), en TBS-Tween (Tris 20 mM, NaCl pH=7,6 137 mM y un 0,1% de Tween 20) o PBS-Tween, según el anticuerpo empleado después, durante 1 h. Este bloqueo sirve para reducir las uniones inespecíficas de los anticuerpos. Tras el bloqueo se procedió a la hibridación de los anticuerpos primarios con las histonas. Los anticuerpos utilizados se unían específicamente a: H3K27me3 (1:1000, Diagenode, Denville, NJ, EEUU), H3K9ac (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA, EEUU), H2AK5ac (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA, EEUU), H3 (1:25000, MerckMillipore, Darmstadt, Alemania), H2A (1:1000, Cell Signaling, Danvers, MA, EEUU) y ubiquitina (MerckMillipore, Darmstadt, Alemania). Cada anticuerpo se diluyó, según las indicaciones de las respectivas casas comerciales, en TBSTween o PBS-Tween con BSA, dependiendo del tipo de anticuerpo, antes de dejar cada membrana en sus correspondientes disoluciones durante toda la noche a 4ºC en agitación suave. Al día siguiente se lavó cada membrana con 0,01 g/ml o 0,05 g/ml de BSA en TBS-Tween o PBS-Tween, según el anticuerpo utilizado, para eliminar el exceso de anticuerpo primario que no se hubiera unido a la membrana. A continuación se volvió a incubar las membranas, esta vez con anticuerpo secundario, conjugado con el enzima peroxidasa de rábano, de cabra anti-ratón (1:7500, Merck KGaA, Darmstadt, Alemania) o de cabra anti-conejo (1:2500, Cell Signaling, Danvers, MA, EEUU) en función del anticuerpo primario empleado, durante 1 h en agitación suave. Tras esta incubación se lavó nuevamente por triplicado cada membrana con los mismos tampones de los lavados precedentes y se procedió a la detección quimioluminiscente de las proteínas. Para ello, se incubó cada membrana con 1 ml de mezcla 1:1 de los reactivos del kit de revelado ECL™ Western Blotting Detection Reagents (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, RU) y tras unos minutos se introdujeron en el escáner densitométrico ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare UK Limited, Little Chalfont, Buckinghamshire, RU). Finalmente, los resultados se analizaron mediante el programa de análisis de imágenes ImageJ. 3.6. ANÁLISIS DE LA CARBONILACIÓN DE PROTEÍNAS Para el estudio de la carbonilación en proteínas se llevó a cabo una variante de Western Blot conocida como OxyBlot u Oxy-Western Blot. Una de las diferencias respecto al WB original es la necesidad de derivatizar antes las muestras, para lo cual se emplearon los reactivos del OxyBlot™ Protein Oxidation Detection Kit (Millipore, Billerica, MA, EEUU). La derivatización de las muestras se realizó mediante la desnaturalización de 5 μl de cada muestra al añadir 5 μl de SDS al 12%. Seguidamente, se añadieron 10 μl de 2,4dinitrofenilhidracina (DNPH) 10 mM en TFA al 10% a cada disolución, menos al control negativo, al cual se añadieron 10 μl de Derivatization-Control Solution. Tras esto, se incubaron todas las muestras en oscuridad durante 15 min aproximadamente, con cuidado de no dejar que las reacciones continuaran más tiempo para evitar reacciones secundarias no deseadas. Después se añadieron 7,5 μl de Neutralization Solution (Tris 2 M en glicerol al 30%) a cada muestra para neutralizar la reacción y 1 μl de β-mercaptoetanol. A continuación las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida al 15% para continuar con el procedimiento clásico de WB sin necesidad de añadir tampón de carga ni de desnaturalizar la muestras en un termobloque. 15 Materiales y métodos Tras la transferencia la membrana fue bloqueada con BSA al 5% en PBS-Tween durante 1 h. Finalizado el bloqueo, se incubó con anticuerpo anti-DNP (provisto también en el OxyBlot™ Protein Oxidation Detection Kit) según las indicaciones del fabricante. 3.7. CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA Para la separación cromatógrafica de los extractos de histonas se utilizó un equipo cromatográfico de FPLC (“Fast Protein Liquid Chromatography”) ÄKTA™ pure (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia), con los siguientes tampones de trabajo: - Eluente A (5% de acetonitrilo y 0,1% de TFA). - Eluente B (90% de acetonitrilo y 0,1% de TFA). - Tampón de limpieza (0,1% de TFA). - Tampón de mantenimiento de la columna (20% de etanol). Antes de proceder se desgasificaron todos los tampones en un sonicador para evitar daños al equipo y a la columna. Posteriormente, se conectó la columna SOURCE™ 15RPC ST 4.6/100 (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) al equipo y se llevó a cabo un lavado de todo el circuito con el tampón de limpieza. Seguidamente se dio comienzo al programa de elución partiendo de una concentración de eluente B igual a 0, que iría aumentando gradualmente con un flujo constante hasta llegar a una concentración del 100% y se inyectó el volumen correspondiente a un 1 mg de muestra directamente en el “loop”. Las proteínas se mezclan con los tampones correspondientes en un mezclador y, al separarse en la columna según su hidrofobicidad, van pasando por un lector UV que mide la conductividad (concentración de sales), el pH y la absorbancia (concentración de proteínas) y muestra los resultados en forma de picos. Al salir del bloque del lector UV, las proteínas se dividen mediante el colector Fraction collector F9-R (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Suecia) acoplado al equipo de FPLC en diferentes fracciones en tubos de 1,5 ml, mientras que las impurezas se vierten por otra salida a un tubo de desechos. Por último, una vez el programa de elución hubo finalizado, se llevó a cabo otro lavado del circuito con tampón de limpieza, para asegurar que no quedara ningún resto de muestra a lo largo del circuito. Cuando el lavado hubo terminado, se inyectó etanol al 20% y se invirtió el flujo para el posterior almacenamiento de la columna. De esta manera, la columna pudo ser almacenada con etanol en su interior evitando la entrada de aire. Tras esto, el flujo se detuvo y se obtuvo el cromatograma con el programa Unicorn. 23 Resultados y discusión Figura 9. Curva de citotoxicidad del TSA. Porcentaje de células vivas frente al rango de concentraciones empleado. La línea negra con círculos corresponde a los valores obtenidos con el vehículo DMSO. La línea roja con cuadrados corresponde a los valores obtenidos con TSA. Mediante esta curva de toxicidad se calculó matemáticamente un valor de LD 50 de 4,18 ng/ml; por lo tanto, se decidió utilizar una concentración de TSA de 2 ng/ml, valor que se encuentra aproximadamente un 50 % por debajo del umbral de toxicidad, con el fin de inducir altos niveles de acetilación en las histonas, alterando lo menos posible la viabilidad celular. Tras el tratamiento, se extrajeron las histonas de las células y se estudiaron las acetilaciones inducidas mediante WB (figura 10). Concretamente, se estudiaron dos residuos donde puede darse acetilación: la lisina 5 de la histona H2A y la lisina 9 de la histona H3. Figura 10. Western Blot para la detección de residuos acetilados. Patrón de la acetilación de las histonas H3 y H2A en los residuos K9 y K5, respectivamente, obtenido a partir de extractos de células HeLa, correspondiendo “Ø” a controles y “TSA” a extractos de células tratadas con 2 ng/ml de TSA. A la luz de estos resultados se puede afirmar que ambas PTMs no se han visto significativamente aumentadas tras el tratamiento con TSA. Al haber utilizado también anticuerpos contra H2A y H3 sin modificaciones, se puede comprobar que el TSA tampoco ha inducido una mayor expresión de H2A y H3 totales en comparación con las muestras control, constituyendo un buen control de carga. Con el fin de intentar obtener una inducción significativa de las histonas, aun pudiendo afectar a la viabilidad celular, se llevó a cabo otro experimento ensayando concentraciones más altas de TSA. Se trataron los cultivos celulares con un rango de concentraciones entre 20 y 100 ng/ml, a pesar de lo cual la tasa de muerte celular no fue tan elevada como para no permitir la obtención de extractos de histonas para ser analizados. A partir de dichos extractos se realizó Anti - H3 Anti - H2A Ø TSA Anti - H3K9ac Anti - H2AK5ac 24 Resultados y discusión un WB y en este caso sí que puede apreciarse un incremento gradual de la intensidad de las bandas de las membranas incubadas con anticuerpos contra histonas acetiladas, proporcional a la concentración de TSA, tanto en aquellas con anti-H3K9ac como con anti-H2AK5ac, si bien este último en menor medida (figura 11). Respecto a las bandas con anticuerpos contra histonas totales (anti-H3 y anti-H2A) no hay cambios apreciables, por lo que se deduce que los niveles de estas histonas no se vieron afectados por el TSA y por tanto puede concluirse que el aumento de intensidad de las bandas correspondientes a residuos acetilados es debido al efecto del TSA. Figura 11. Western Blot para la detección de residuos acetilados. Patrón de la acetilación de las histonas H3 y H2A en los residuos K9 y K5, respectivamente, obtenido a partir de extractos de células HeLa, correspondiendo “Ø” a un control y “TSA” a extractos de células tratadas con TSA con el siguiente gradiente de concentraciones: 20, 50 y 100 ng/ml. A pesar de que, en este caso, se trabajó con valores de concentración muy superiores a los sugeridos por el ensayo de toxicidad, el hecho de haber obtenido inducción de la acetilación en dos histonas diferentes apunta a que podría obtenerse, de escalar lo suficiente el proceso, una cantidad suficiente de extracto de histonas hiperacetiladas como para utilizarlo en un proceso de purificación que permita su aislamiento. 4.2. PURIFICACIÓN DE HISTONAS MEDIANTE CROMATOGRAFÍA DE FASE REVERSA En paralelo a la inducción de las PTMs específicas en histonas, se diseñó un protocolo de purificación utilizando la técnica de cromatografía de fase reversa. Dado que las histonas presentan un tamaño molecular y unas propiedades bioquímicas muy similares, esta técnica se presenta como una opción adecuada para separar los distintos tipos en función de las diferencias en el carácter hidrofóbico de sus dominios globulares. Para ello, se cultivaron células HeLa sin inducir, a mayor escala que en los experimentos descritos anteriormente, con vistas a obtener extractos de histonas lo suficientemente concentrados como para separar sus componentes cromatográficamente. Obtenidos estos extractos, se cargó un volumen correspondiente a 1 mg de extracto total de histonas en un equipo de FPLC equipado con una columna de fase reversa, para eluir con un gradiente de acetonitrilo (incrementando la proporción de tampón B), según el protocolo detallado en el apartado “Materiales y métodos”. En la figura 12A se muestra el cromatograma obtenido, en el cual se observa que la mayoría de proteínas se eluyen de la columna en el tramo incluido entre el 40% y el 60%, Anti - H3 Anti - H3K9ac Anti - H2A Anti - H2AK5ac Ø TSA 25 Resultados y discusión aproximadamente, de tampón B. Tras la elución, se recogieron las proteínas en diferentes fracciones (tubos de 1,5 ml) y se cargaron geles para evaluar el contenido total en proteínas mediante tinción de Coomassie (no mostrado). Se seleccionaron las fracciones que contenían bandas con tamaño correspondiente a las histonas (coincidentes con algunos de los picos discretos observados en el recuadro de la figura 12A; fracciones 25-30), y tras concentrarlas se cargó un nuevo gel que permitiese comparar la cantidad de proteína obtenida en cada fracción una vez normalizada la carga (figura 12B). La tinción con Coomassie permite constatar que las bandas de mayor intensidad, separadas en fracciones independientes, corresponden al tamaño de las histonas al compararlas con una muestra proveniente del extracto total antes de su paso por la columna. A continuación, se analizó mediante WB la identidad de dichas bandas (figura 12C). Figura 12. Purificación de histonas mediante FPLC. Cromatograma del extracto de histonas introducido en el FPLC (A). Gel teñido con azul de Coomassie del mismo extracto de histonas una vez realizada la transferencia del WB a la membrana de nitrocelulosa (B). Análisis mediante WB de histonas H3 y H2A en distintas fracciones del extracto de histonas (C). En la incubación de la membrana (dividida para poder usar dos anticuerpos diferentes a la vez) se emplearon anticuerpos contra H3 y H2A. Sin embargo, a pesar de que tanto para H3 como para H2A hay detección (calles 29 y 30), las bandas aparecen en las dos calles indistintamente, detectándose H3 y H2A al mismo tiempo en las dos fracciones. Es posible que la aparición de señal en ambas calles se deba más bien a una reacción cruzada de los anticuerpos con las histonas, cosa relativamente frecuente. De la misma manera, en la figura 12A, la tinción de Coomassie sugiere que más que una reacción cruzada de los anticuerpos, las diferentes C Anti - H3 Anti - H2A H3 H2A/H2B H4 H1 E.T. M 25 26 27 28 29 30 FRACCIONES 25 26 27 28 29 30 FRACCIONES A B 26 Resultados y discusión histonas no llegaron a separarse adecuadamente en la cromatografía, obteniendo las mismas histonas en fracciones diferentes. Por lo tanto, aunque la técnica se muestra adecuada para la separación de histonas, se requiere una modificación del gradiente y en general del protocolo de purificación para asegurar la correcta separación de los diferentes tipos de histonas, especialmente de la H2A, la H3 y la H4. Además, se deberán realizar WB contra una batería de anticuerpos más amplia para asegurar la identidad de todas las bandas aparecidas. 4.3. LIMITACIONES DEL ESTUDIO Y PERSPECTIVAS FUTURAS En conjunto, los experimentos realizados para cada uno de los objetivos planteados en el presente trabajo constituyen un buen punto de partida para la elaboración de un protocolo de aislamiento de histonas con modificaciones postraduccionales específicas. Como se ha comentado en los apartados anteriores, la inducción de modificaciones concretas como la ubiquitinación, carbonilación o metilación requiere estudios en mayor profundidad. Una de las cuestiones a dilucidar, de gran interés, sería determinar el grado de influencia de la presencia de DMSO en las condiciones de cultivo ensayadas, puesto que parece influir de forma inespecífica en la aparición de formas de histonas modificadas, especialmente en el caso de las ubiquitinaciones y carbonilaciones. Si bien no se ha conseguido una clara inducción de muchas de las PTMs estudiadas, en el caso de los experimentos con TSA se han hallado unas condiciones que permiten observar un incremento en la marca de acetilación de las histonas H2A y H3. Dado que también se ha puesto a punto un protocolo de purificación que permite obtener fracciones enriquecidas con dichas histonas, el siguiente paso sería la combinación de ambas estrategias para, finalmente, obtener una fracción con H3 y H2A acetiladas que permita ser comparada frente a fracciones de histonas en condiciones control. La utilización de estas fracciones purificadas en ensayos de citotoxicidad frente a células endoteliales – estrategia que se desarrolla en nuestro laboratorio en colaboración con el grupo de Investigación en Células Endoteliales del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina y Odontología (UV) – aportaría datos muy relevantes acerca de la posible función de las PTMs en los mecanismos fisiopatológicos relacionados con la presencia de histonas circulantes. 27 Conclusiones 5. CONCLUSIONES 1. La inhibición del proteasoma con MG 132 en cultivos de células HeLa no es suficiente para inducir un incremento en los niveles de carbonilación ni ubiquitinación en histonas. 2. El tratamiento de células HeLa con IOX1, incluso en concentraciones superiores a la LD 50 , no permite inducir la trimetilación de la histona H3 en el residuo K27. 3. El tratamiento con TSA sólo es capaz de inducir la acetilación de los residuos K9 y K5 de las histonas H3 y H2A, respectivamente, cuando se utiliza en concentraciones superiores a la LD 50 calculada experimentalmente. 4. Mediante un protocolo de cromatografía en fase reversa es posible separar la histona H1 de las histonas H2, H3 y H4, así como obtener una fracción mayoritaria de H3 y otra de H2A/H2B y H4. 29 Bibliografía 6. BIBLIOGRAFÍA Bach, S.V., Hegde, A.N., 2016. The proteasome and epigenetics: zooming in on histone modifications. Biomol. Concepts 7, 215–227. doi:10.1515/bmc-2016-0016 Bannister, A.J., Kouzarides, T., 2011. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Res. 21, 381–395. doi:10.1038/cr.2011.22 Brandl, A., Heinzel, T., Krämer, O.H., 2009. Histone deacetylases: salesmen and customers in the post-translational modification market. Biol. Cell Auspices Eur. Cell Biol. Organ. 101, 193–205. doi:10.1042/BC20080158 Chen, R., Kang, R., Fan, X.-G., Tang, D., 2014. 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