UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL
IMPACTO DE LA TECNOLOGÍA DE SECUENCIACIÓN MASIVA EN
EL CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO
G ado en Bio ecnología-T abajo Final de G ado
Cu so 2015/2016
Alumno: Robe o Téba Ma ínez
Di ec o a: Sa ai Palanca Suela
Tu o a académica: Eloisa Jan us Lewin e
Valencia, 7 de julio de 2016
II
Au o /Au ho : D. Robe o Téba Ma ínez
Tu o Académico/ Academic Supe iso : P o . Dña. Eloisa Jan us Lewin e
Di ec o -Co u o /Co u o : Dña. Sa ai Palanca Suela
Tí ulo: IMPACTO DE LA TECNOLOGÍA DE SECUENCIACIÓN MASIVA EN EL CÁNCER DE PULMÓN
NO MICROCÍTICO.
Resumen:
En el cánce de pulmón no mic ocí ico (CPNM) es necesa ia la iden i icación de bioma cado es
que pe mi an la ca ac e ización molecula del umo y, con ello, adecua el manejo de los
pacien es. En es e sen ido, el ecep o de c ecimien o epidé mico (EGFR) y la cinasa del
lin oma anaplásico (ALK) desempeñan un papel ele an e como ma cado es p edic i os de
espues a a la e apia oncológica, en conc e o a los inhibido es i osina cinasa (ITKs). Se han
desc i o di e en es ap oximaciones pa a su de e minación (mu aciones de EGFR y
aslocaciones de ALK) siendo la eal ime-PCR (qPCR) y la FISH, las écnicas más ampliamen e
u ilizadas, espec i amen e. Con el desa ollo de las ecnologías de nue a gene ación, como la
secuenciación masi a (Nex Gene a ion Sequencing; NGS), se ab e la posibilidad de analiza
simul áneamen e di e en es al e aciones oncogénicas d i e implicadas en la pa ogénesis del
CPNM. Asimismo, es a nue a ecnología pe mi e minimiza algunas complicaciones habi uales
de la u ina asis encial, como son los al os eque imien os de mues a, la disposición de
múl iples ecnologías pa a abo da los dis in os ma cado es y un impo an e consumo de
iempo pa a p opo ciona los esul ados al clínico.
Hipó esis y Obje i os: La NGS puede ayuda a clasi ica el umo al diagnós ico y guia a los
pacien es con CPNM a anzado en el a amien o con e apias dianas. Po ello, el obje i o del
siguien e abajo de in de g ado (TFG) se á una b e e con ex ualización de la medicina
pe sonalizada en el CPNM y la compa ación de los mé odos empleados ac ualmen e en el
labo a o io de diagnós ico en e a nue as ecnologías desa olladas, como la NGS.
Suje os de es udio: Se plan ea un es udio e ospec i o e ec uado sob e mues as
seleccionadas de ejido umo al (FFPE) de pacien es con CPNM a anzado a endidos en el
Se icio de Oncología Médica del Hospi al Uni e si a io y Poli écnico La Fe. Du an e el
desa ollo del p oyec o, se es ima el es udio de40 pacien es. Todos ellos debe án habe
mani es ado po esc i o su consen imien o in o mado.
Ins umen alización y de e minaciones:
 Ex acción de ácidos nucleicos (ADN y ARN) a pa i de ma e ial umo al incluido en
pa a ina (FFPE). Es e p o ocolo de abajo incluye el despa a inado de la mues a y la
ob ención y pu i icación de los ácidos nucleicos. Pa a ello se u iliza án los ki s
III
GeneReade DNA FFPE Ki (QUIAGEN) pa a ADN y Reco e All™ To al Nucleic Acid
Isola ion Ki o FFPE (The moFishe ) pa a ARN.
 De e minación de mu aciones en el gen EGFR median e cobas® EGFR Mu a ion Tes 2
(CE-IVD) de Roche Molecula en la pla a o ma Cobas® 480z Analyze , que pe mi e la
de ección de mu aciones pun uales, deleciones y/o inse ciones en los exones 18, 19,
20 y 21. Los casos posi i os se án con i mados po secuenciación di ec a (Applied
Biosys ems® 3130 Gene ic Analyze ) u ilizando los p o ocolos ecomendados po el
ab ican e.
 Secuenciación masi a median e la ecnología del IonTo en (secuenciación po
semiconduc o es) en la pla a o ma Pe sonal Genome Machine™ (PGM™; Applied
Biosys em). Inicialmen e, se equie e la p epa ación de las lib e ías, empleándose
pa a ello los paneles Ampliseq Oncomine Solid Tumo DNA ki y Oncomine® Solid
Tumou Fusion T ansc ip ki (The mo Fishe Scien i ic) que pe mi en el análisis de 22
oncogenes y cua o ansc i os de usión, espec i amen e.
Palab as cla es: biología molecula , cánce de pulmón, secuenciación masi a, EGFR.
Ti le: IMPACT OF THE MASSIVE SEQUENCING TECHNOLOGIES IN NON-SMALL CELL LUNG
CANCER
Summa y:
Iden i ica ion o bioma ke s ha allow he molecula cha ac e iza ion o he umo is
necessa y in non-small cell lung cance (NSCLC) in o de o p o ide he pa ien he mos
app op ia e ea men . In his sense, he epide mal g ow h ac o ecep o (EGFR) and he
anaplas ic lymphoma kinase (ALK) play an impo an ole like p edic i e bioma ke s in
esponse o oncology he apy, in special o y osine kinase inhibi o s (TKIs). Some app oaches
ha e been de ined in o de o de e mina e hose bioma ke s (EGFR mu a ions and ALK
ansloca ions), being eal- ime PCR (qPCR) and luo escence in si u hyb idiza ion (FISH),
espec i ely, he mos ele an echnologies used in clinic. Wi h he de elopmen o new
gene a ion echnologies like massi e sequencing (Nex Gene a ion Secuencing; NGS), i is
possible o iden i y oncogenic d i e mu a ions implica ed in he NSCLC pa hogenesis. This
ecen echnology can minimize some common complica ions o ou ine ca e, like high sample
equi emen , di e se echnologies used o iden i y di e en bioma ke s and he long imes
equi ed o p o ide esul s o he clinic
Hypo hesis and objec i es: NGS could help o classi y umo in diagnosis and guide ad anced
NSCLC pa ien s o app op ia e a ge ed he apies. Thus, he objec i e o his “T abajo inal de
g ado” (TFG) is con ex ualize pe sonalized medicine in NSCLC ea men and compa e he
habi ual me hods used in a diagnos ic labo a o y wi h new echnologies like NGS.
S udy subjec s: A e ospec i e s udy in o malin- ixed pa a in embedded (FFPE) issue
samples is p oposed. Samples o pa ien s wi h ad anced NSCLC a e om Medic Oncology
Se ice o “Hospi al Uni e si a io y Poli écnico La Fe”. Du ing he de elopmen o his p ojec ,
i is es ima ed o s udy 40 pa ien s who mus sign he in o med consen .
IV
Ins umen s and me hods:
 Nucleic acids isola ion (DNA and RNA) om FFPE issue samples. The p ocess includes
a p e ious s ep o pa a in emo al, and isola ion and pu i ica ion o he nucleic acids.
DNA will be ob ained using GeneReade DNA FFPE Ki (QUIAGEN) and RNA wi h
Reco e All™ To al Nucleic Acid Isola ion Ki o FFPE (The moFishe ).
 De ec ion o mu a ions in EGFR gene wi h cobas® EGFR Mu a ion Tes 2 (CE-IVD) o
Roche Molecula in he pla o m Cobas® 480z Analyze . This ki is able o de ec poin
mu a ions and indels in exons 18, 19, 20 and 21. Posi i e samples will be con i med by
capilla y sequencing (Applied Biosys ems® 3130 Gene ic Analyze ) acco ding o
ab ican p o ocols.
 Massi e sequencing using IonTo en echnology (sequencing by semiconduc o s) in
he pla o m Pe sonal Genome Machine™ (PGM™; Applied Biosys em). P e iously,
lib a ies a e p epa ed employing Ampliseq Oncomine Solid Tumo DNA ki and
Oncomine® Solid Tumou Fusion T ansc ip ki (The mo Fishe Scien i ic). The i s is
capable o iden i y 22 oncogenes and umo supp esso genes, and he second can
de ec he exp ession o ou usion ansc i s.
Key wo ds: Molecula biology, lung cance , massi e sequencing, EGFR.
Valencia, 7 de Julio de 2016
V
Ag adecimien os
Quie o ap o echa es e espacio pa a da le las g acias a la D a. Sa ai Palanca po la opo unidad
de ealiza es e TFG en un labo a o io como es el de Biología Molecula del Se icio de Análisis
Clínicos del Hospi al Uni e si a io y Poli écnico La Fe. Ag adece ambién a la D a. Rosa Mu ia
el apoyo que me ha dado du an e mi es ancia de p ác icas.
También ag adece a odas aquellas pe sonas que me han apoyado du an e es os 4 años: mis
compañe os de “la pue a 5”, mi he mano Edua do, mi pad e, mis p imos I is y Alejand o,
Maiden, el es o de mi amilia, y odos mis compañe os de los Scou s y a mis niños de la
Unidad Kimbe ley.
Pe o sob e odo, si de alguien me acue do en es e abajo, es de mi mad e. G acias a ella he
llegado has a aquí, aunque es e es solo el comienzo de un la go camino. Cada paso que he
dado, que doy y que da é se á po i.

VI
Con enido
1. In oducción ...................................................................................................................... 1
1.1. Cánce de pulmón ......................................................................................................... 1
1.2. Bioma cado es, Medicina pe sonalizada y Cánce ......................................................... 1
1.3. Genes implicados en CPNM ........................................................................................... 2
1.3.1. Recep o del ac o de c ecimien o epidé mico (EGFR) .............................................. 2
1.3.2. Cinasa del lin oma anaplásico (ALK) ........................................................................... 4
1.3.3. O os oncogenes o genes sup eso es de umo es ...................................................... 4
1.4. T a amien o con Inhibido es i osina cinasa (ITK) .......................................................... 5
1.5. De ección de bioma cado es ......................................................................................... 7
1.5.1. De ección de mu aciones en EGFR ............................................................................. 7
1.5.2. De ección de eo denamien os en ALK ...................................................................... 7
1.6. Secuenciación masi a .................................................................................................... 8
1.7. Secuenciación di igida en CPNM .................................................................................... 9
2. Obje i os ......................................................................................................................... 10
3. Ma e ial y mé odos ......................................................................................................... 10
3.1. Mues as ..................................................................................................................... 10
3.2. Ex acción de ácidos nucleicos ..................................................................................... 11
3.2.1. Ex acción de ADN ................................................................................................... 11
3.2.2. Ex acción de ARN ................................................................................................... 12
3.3. Cuan i icación de ácidos nucleicos ............................................................................... 12
3.4. De ección de mu ación median e PCR en iempo eal (pla a o ma Cobas®) ................. 13
3.5. De ección de mu ación median e PCR con encional y Secuenciación di ec a............... 15
3.6. De ección de mu ación median e secuenciación masi a (pla a o ma PGM®) ............... 16
3.6.1. Geno eca de ADN .................................................................................................... 16
3.6.2. Geno eca de ARN .................................................................................................... 17
3.6.3. Combina lib e ías ................................................................................................... 18
VII
3.6.4. PCR en emulsión ...................................................................................................... 18
3.6.5. En iquecimien o de la mues a en es e as con PCR clonal ........................................ 19
3.6.6. Ca ga del Chip y Secuenciación ................................................................................ 19
3.7. Análisis bioin o má ico ................................................................................................ 20
4. Resul ados ...................................................................................................................... 20
4.1. Resul ados ob enidos median e PCR en iempo eal (pla a o ma Cobas®) .................. 20
4.2. Con i mación de esul ados median e secuenciación di ec a ....................................... 21
4.3. Es udios de secuenciación masi a median e PGM ....................................................... 24
4.3.1. Mu aciones en el panel de ADN ............................................................................... 24
4.3.2. T aslocaciones en el panel de ARN ........................................................................... 27
4.4. Compa ación de esul ados en e los mé odos molecula es empleados ...................... 27
5. Discusión ......................................................................................................................... 29
5.1. Compa ación qPCR, secuenciación di ec a y NGS ......................................................... 29
5.2. Impac o de la ecnología de NGS ................................................................................. 31
6. Conclusiones ................................................................................................................... 33
7. Re e encias ..................................................................................................................... 35
7.1. Bibliog a ía .................................................................................................................. 35
7.2. Recu sos Web ............................................................................................................. 40
8. Anexos ............................................................................................................................ 41
8.1. Anexo I: Mues as p oceden es de un mismo pacien e ................................................ 41
8.2. Anexo II: chips empleados pa a la secuenciación median e PGM ................................. 42
8.3. Anexo III: Mu aciones de ec adas median e secuenciación en el PGM......................... 43
8.4. Anexo IV: Resul ados de la secuenciación de los ansc i os......................................... 46
VIII
Índice de Figu as
Figu a 1 - Ru as de señalización implicadas en el CPNM median e ac i ación po EGFR
Figu a 2 - Ejemplos de es uc u a química de ITK y su unión a sus dianas
Figu a 3 - Deaminación oxida i a de la ci osina en mues as FFPE
Figu a 4 - Esquema de la ca ga de una placa de 96 pocillos pa a el Cobas 480z Analyze
Figu a 5 - G á ico de sec o es de los esul ados ob enidos median e Cobas Analyze
Figu a 6 - Cap u a con odas las bandas de los geles ealizados pa a es a las PCRs
des inadas a secuenciación di ec a
Figu a 7 - Elec o e og amas de las egiones de in e és de los exones 18, 19, 20 y 21 de
las mues as y un con ol nega i o (w ), ob enidos median e secuenciación di ec a
Figu a 8 - Dis ibución de las mu aciones iden i icadas en EGFR a lo la go de odas las
mues as de NGS
Figu a 9 - Hea map de las mu aciones de las mues as analizadas median e PGM con el
Oncomine Solid Tumo DNA ki
Figu a 10 - Dis ibución de las mu aciones localizadas en KRAS median e NGS
Figu a 11 - Alineamien os de las lec u as ob enidas de dos de las mues as con lic i as
Índice de Tablas
Tabla 1 - Mu aciones de EGFR de ec adas median e la pla a o ma Cobas
Tabla 2 - Cebado es empleados pa a los dis in os exones del gen EGFR (18, 19, 20 y 21)
Tabla 3 - Compa ación de los esul ados ob enidos median e las écnicas de análisis del
gen EGFR.
IX
Lis ado al abé ico de las ab e ia u as empleadas
ADN – Ácido desoxi ibonucleico
ALK – Anaplas ic Lymphoma ecep o Kinase
ARN – Ácido ibonucleico
ATP – Adenosin T i os a o
BTC – Be acelulina
c – ci cula ing umo
COLD - co-ampli ica ion a lowe dena u a ion empe a u e
CP – Cánce de pulmón
CPM – Cánce de pulmón mic ocí ico
CPNM – Cánce de pulmón no mic ocí ico
DNA – Deoxy ibonucleic acid
EGF – Epi helial G ow h Fac o
EGFR – Epide mal G ow h Fac o Recep o
EML4 – Echinode m Mic o ubule associa ed p o ein-like 4
EMT- T ansición Epi elio Mesenquimal
FFPE – Fo malin- ixed, Pa a in-embedded
FISH – Fluo escence In Si u Hyb idiza ion
GTP –Guanidin T i os a o
HPLC – High P essu e Liquid Ch oma og aphy
HRM – High Resolu ion Mel ing
HUyP – Hospi al Uni e si a io y Poli écnico
ISP – Ion Sphe e Pa icle
JAK – Janus Kinase
MAP – Mi ogen Ac i a ed P o ein
mi - mic o
NCI – Na ional Cance Ins i u e
6
a amien o sea mucho más e icaz. Des aca el A a inib, el cual se une co alen emen e al
esiduo p.C797 del dominio TK cuando es á ac i o. Es a unión se es ablece median e la
o mación de un enlace en e la amida del compues o y el g upo sul u o de la cis eína
(Solca e al., 2012).
 3ª gene ación: en e a la apa ición de la mu ación p.T790M en EGFR, se han desa ollado
á macos capaces de supe a y ap o echa se de es a mu ación. Recien emen e ap obado
se encuen a el compues o AZD9291 (C oss e al., 2014), un compues o mono-anilino-
pi imidínico. Es a molécula p esen a una no able a inidad po las moléculas de EGFR con el
cambio p.T790M, uniéndose i e e siblemen e en el si io de unión del ATP median e un
enlace co alen e al esiduo p.C797.
Debido a los a amien os con ITK an o de 1ª como de 2ª gene ación en pacien es con EGFR
mu ado, las células desa ollan esis encia al a amien o median e la apa ición de una
mu ación en el codón 790, en conc e o la p.T790M, que educe d ás icamen e la a inidad de
los á macos po EGFR mu ados, encon ándose en el 50% de los casos. La mu ación p oduce
un aumen o de la a inidad po el ATP, educiendo la que p esen aba po los ITK. O os
mecanismos de esis encia incluyen la ampli icación de EGFR (8%), mu aciones ac i an es en el
gen PIK3CA (5%), ampli icación del gen MET (5 -19%) y sob eexp esión del ligando GAS6 y su
ecep o AXL (25%). De es a o ma, la célula umo al es capaz de man ene la “adicción” a es a
señalización (Ga away y Jänne, 2012; González de Cas o e al., 2015). Recien emen e, se han
epo ado casos de esis encia a inhibido es de e ce a gene ación a a és de mu aciones que
a ec an a la unión co alen e del inhibido a la molécula (Yu e al., 2015) o median e alguno de
los mecanismos ya ci ados, como la ampli icación de MET (Plancha d e al., 2015)
Figu a 2: Ejemplos de es uc u a química de ITK y su unión a sus dianas. (A) - Es uc u a 2D del Ge i inib
y unión po in e acciones débiles al dominio i osina cinasa de un EGFR con mu ación ac i an e (PDB
code 3UG2). (B) - Es uc u a 2D del E lo inib y es uc u a 3D de la in e acción con un EGFR con
mu aciones ac i an es (PDB code 4HJO). (C) - Es uc u a 2D del A a inib y es uc u a 3D de su unión
co alen e a p.C797 (en colo na anja) a EGFR con la mu ación p.T790M (PDB code 4G5J).Tomada de
Gonzalez de Cas o e al. (2012)
Asimismo, los pacien es con CPNM po ado es de aslocaciones en ALK poseen una medicina
de p ecisión con ITK (C izo inib). También se han desc i o mecanismos de esis encia a

7
C izo inib en las células con o mas abe an es de ALK, los cuales son muy pa ecidos a los de
EGFR en cuan o a undamen o: la es a egia se basa en segui man eniendo la ac i idad pese a
la p esencia del inhibido . Así, ALK adquie e esis encia median e ampli icación génica,
mu aciones en el dominio i osina cinasa que eduzcan la a inidad de la molécula po el
inhibido o la apa ición de nue os oncogenes d i e que pe mi an man ene el eno ipo
umo al (Doebele e al., 2012; Ga away y Jänne, 2012).
1.5.De ección de bioma cado es
1.5.1. De ección de mu aciones en EGFR
Algunos de los mé odos empleados en el diagnós ico y de e minación de las p incipales
mu aciones en el gen EGFR son (Lindeman e al., 2013):
 De ección du an e la PCR: la qPCR o la ampli icación especí ica de alelo son écnicas
que pe mi en de ec a con una simple ampli icación del gADN la p esencia de
mu aciones especí icas.
 De ección pos -PCR: la elec o o esis capila , la Nex Gene a ion Sequencing (NGS) o la
pi osecuenciación son écnicas que pe mi en sabe con p ecisión, a pa i de una
mues a p e ia y adecuadamen e ampli icada, cuál es la mu ación que ha sucedido.
En e ellas a ia á la sensibilidad de cada mé odo.
 Escaneo de mu aciones: el High Resolu ion Mel ing (HRM) o el High P essu e Liquid
Ch oma og aphy (HPLC) en condiciones desna u alizan es an a pe mi i e si una
mues a p esen a o no mu ación. Aunque es as écnicas solo in o man de si hay
mu ación o no, pe mi en desca a las mues as no mu adas an es de p ocesa las po
o a écnica pa a iden i ica la mu ación.
 En iquecimien o del alelo mu an e: la co-ampli ica ion a lowe dena u a ion
empe a u e (COLD) PCR o la Pep ide Nucleic Acid (PNA) Ampli ica ion pueden se
écnicas ú iles cuando la mues a ca ece de una población umo al ele ada. Median e
la ampli icación a o able (no especí ica) de la a ian e mu ada, se p e ende iguala las
p opo ciones de ADN mu ado y ADN wild- ype (w ).
1.5.2. De ección de eo denamien os en ALK
Pa a la de ección de los ansc i os de usión del gen ALK, se emplean ac ualmen e las
siguien es écnicas (Tuononen e al., 2013):
 Fluo escence In Si u Hyb idiza ion (FISH): median e el empleo de pa ejas de sondas
(sondas de o u a), se isualiza si ambas es án lo su icien e sepa adas debido a la
p esencia de un eo denamien o. El pa de sondas es á diseñada pa a de ec a
eo denamien os conc e os.
 Real-Time PCR: pa iendo del ADNc de la mues a, se puede emplea cebado es y
sondas que pe mi an de ec a si exis e ampli icación o no de un eo denamien o
8
conc e o. Es impo an e de ini a pa i de que ciclo umb al (C ) se conside a que se ha
p oducido el eo denamien o.
 Inmunohis oquímica: es e ensayo se di ige hacia la p o eína abe an e, empleando
pa a ello una mues a ijada y un an icue po monoclonal di igido especí icamen e
con a ALK abe an es.
 Secuenciación masi a o Nex -Gene a ion Sequencing (NGS): el uso de los cebado es
adecuados pe mi e la secuenciación de cualquie o ma de ALK. La secuenciación
puede i di igida an o con a el ADN como con a los ansc i os. Hay que ene en
cuen a que en un único análisis podemos secuencia ambién o os genes de in e és.
1.6.Secuenciación masi a
El desa ollo de las ecnologías de secuenciación de ADN ha pe mi ido un g an a ance desde la
secuenciación del p ime genoma humano, en el cual ue necesa ia la in e ención de
nume osos g upos de in es igación y la in e sión de un g an capi al y de iempo. En la
ac ualidad, la secuenciación de un genoma humano equie e mucho menos iempo y es mucho
menos cos osa (Bubno , 2008; Tucke e al., 2009). En la úl ima década, se ha demos ado que
el cánce puede se debido al exceso de ac i idad de las p o eínas de i adas de oncogenes o a
la ausencia de los denominados TSG, desembocando en que la célula adquie a ca ac e ís icas
umo ales. Es necesa io, po an o, iden i ica y dis ingui las mu aciones que apa ecen en los
umo es, y, eniendo en cuen a la ines abilidad genómica ca ac e ís ica de los umo es, cuáles
de ellas do an a los umo es de su eno ipo (mu aciones d i e s) y cuáles no (mu aciones
passenge ) (Vols eing e al., 2013). El desa ollo ecnológico de la secuenciación de úl ima
gene ación (NGS) nos pe mi e ob ene oda es a in o mación an o a ni el de whole genome
sequencing (WGS), whole exome sequencing (WES) o incluso a ge ed sequencing.
En gene al, el undamen o de odas las NGS es la capacidad de lle a millones de eacciones de
ampli icación de cadena de o ma pa alela jun o a un mé odo de iden i icación del nucleó ido
in oducido en la cadena (Bubno , 2008). Así, la pi osecuenciación in oduce nucleó idos en
cada ciclo, de ec ando luz en un pocillo solo si se inco po a a la cadena; la secuenciación
median e e minado es de Ilumina de ec a el luo ó o o del dNTP in oducido en cada spo de
cadenas sob e un chip (Tucke e al., 2009); y la secuenciación po semiconduc o es in oduce
un dNTP en cada ciclo, de ec ando la inco po ación del nucleó ido a a és de las a iaciones
de pH p oducidas en la polime ización (The moFishe , 2014).
Algunas en ajas p esen adas po las NGS son que pe mi en gene a g an can idad de
in o mación bajo un mismo p ocedimien o; necesi an muy poca mues a pa a p ocede ,
pudiendo algunas pa i de 10ng de mues a en condiciones adecuadas pa a gene a una
secuencia consis en e, y el iempo empleado en la eacción es meno que la de e minación de
cada uno de los bioma cado es indi idualmen e (Tucke e al., 2009; Ho leson e al., 2015).
Pe o ambién amos a encon a algunas di icul ades en el empleo de las NGS: p o ocolos y
écnicas que equie en de pe sonal con expe iencia y p epa ados, incapacidad de dis ingui las
mu aciones d i e de las passenge an e la p esencia de nue as mu aciones, en ende cómo la
9
mu ación a ec a a la ac i idad de la p o eína o la pé dida de da os du an e el p ocesado
debido a e o es in o má icos (Tucke e al., 2009; Vols eing e al., 2013; Raphael e al., 2014).
1.7.Secuenciación di igida en CPNM
Cuando se secuencia el genoma de un pacien e con una de e minada en e medad, exis en
es udios p e ios de qué al e aciones es án elacionadas con la en e medad del pacien e. En un
caso como es e, no es necesa io secuencia los más de 25.000 genes humanos, siendo más ú il
en oca la secuenciación en los genes ya p e iamen e co elacionados con la pa ogénesis.
Es as p opues as de secuenciación, denominadas en gene al como Ta ge ed Sequencing,
p e enden ex ae únicamen e la in o mación necesa ia o solici ada del genoma a secuencia .
En la ac ualidad, g acias a la labo de conso cios in e nacionales como el The Cance Genome
A las (TCGA) o a bases de da os como Oncomine (Rhodes e al., 2007), se conocen odo ipo de
al e aciones elacionadas con de e minados ipos de cánce . En unción de las necesidades de
in o mación a ob ene , la mues a eque ida y las capacidades de los equipos, en e o os
ac o es, en oncología se plan ean a ios ipos de ensayos (Ho elson e al., 2015):
 Secuenciación del genoma, exoma o ansc ip oma
 Paneles basados en hib idación
 Paneles basados en ampli icación median e PCR
Uno de los ki s disponibles en el me cado, pa a la pla a o ma PGM de Ion To en
(The moFishe , USA), es el de Oncomine Solid Tumou DNA ki (The moFishe , USA). Es e ki
pe mi e la secuenciación de una se ie de 22 genes implicados an o en CP como cánce de
colon. Al abé icamen e, es os genes son: AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2,
ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, KRAS, MAP2K1, MET, NOTCH1, NRAS, PIK3CA, PTEN,
SMAD4, STK11, TP53. Es os genes son es ados a a és de 92 amplicones que pe mi en un
Ta ge ed sequencing a pa i de 10 ng de gADN del pacien e.
Pa a la secuenciación del ARN, exis e el panel Oncomine Solid Tumou Fusion T ansc ip
(The moFishe , USA), el cual pe mi e, a a és de 85 amplicones, de e mina la p esencia de
di e en es ansc i os de usión de los genes ALK, RET, ROS1 y NRTK1 a pa i de 10 ng de ARN
ex aído de las células del pacien e.
El CPNM es una en e medad he e ogénea, donde coexis en umo es o mados a a és de
dis in as ías de ca cinogénesis y, como se ha comen ado, el a amien o pe sonalizado del
CPNM se di ige a a és del es a us mu acional del gen EGFR o eo denamien os de ALK. La
p esencia de es as al e aciones iden i ica a pacien es con umo es de pulmón sensibles al
a amien o con ITK. Sin emba go, ap oximadamen e un 20-25% de los pacien es así
seleccionados no esponden a la e apia. La espues a a es a di e gencia debe busca se en la
he e ogeneidad in a umo al, en la di e sidad en e el umo p ima io y sus me ás asis, y en la
sensibilidad de los mé odos empleados pa a iden i ica las mu aciones. El cánce es un p oceso
dinámico y es en es e con ex o en el que se deben conside a los concep os de e olución
clonal y he e ogeneidad in a umo al, así como alo a la epe cusión clínica que conlle an en
una ap oximación pe sonalizada del a amien o de es a en e medad, c eemos que
10
ecnologías como la secuenciación masi a pueden o ece in o mación ele an e pa a adecua
el a amien o del pacien e.
2. Obje i os
Es e T abajo Final de G ado p e ende compa a los di e en es mé odos ac uales empleados en
CPNM en la labo asis encial del Labo a o io de Biología Molecula del Hospi al Uni e si a io y
Poli écnico La Fe (HUyP) y discu i el alcance y las limi aciones de cada uno de ellos. Pa a la
consecución de es e in, se p oponen los siguien es obje i os:
 De e minación de las al e aciones molecula es en el gen EGFR en pacien es con CPNM
median e la u ilización de es mé odos: Secuenciación di ec a, qPCR median e Cobas
Analyze y a ge ed sequencing median e Pe sonal Genome Machine (PGM;
The moFishe , USA).
 Compa ación de la conco dancia de los esul ados ob enidos a a és de los di e en es
mé odos empleados.
3. Ma e ial y mé odos
3.1.Mues as
Las mues as empleadas pa a es e es udio e ospec i o co esponden a biopsias sólidas de
umo es localizados en pulmón o de posibles me ás asis de los mismos de pacien es a endidos
po el Se icio de Oncología Médica del HUyP La Fe en e los años 2015-2016.Todas es as
mues as han sido au o izadas pa a su empleo en es e p oyec o a a és del consen imien o
in o mado y i mado po los pacien es, median e el cual ceden el exceden e de mues a as
inaliza el análisis pa a su uso en in es igación, au o izado po el Comi é de É ica del Hospi al
La Fe.
T as la oma de la biopsia, el se icio de Ana omía Pa ológica se ha enca gado de la
conse ación de la mues a, median e ijación en o mol e inclusión en bloques de pa a ina
(Fo malin- ixed, Pa a in-embedded (FFPE)) y han ealizado los co es de 5-10m necesa ios
pa a los es udios molecula es en ADN y ARN. Los equisi os de ep esen ación umo al (>50%)
y celula idad umo al o al (> 150-300 células) han sido es ablecidos po el pa ólogo
esponsable en odos los casos.
El Labo a o io de Biología Molecula del Se icio de Análisis Clínicos del HUyP La Fe ha ecibido
un o al de 40 mues as pa a es e es udio. Como algunas mues as co espondían a segundas
biopsias o me ás asis (Anexo I), el o al de pacien es es de 36. Aquellas mues as
pe enecien es a un mismo pacien e, han sido iden i icadas po núme os con misma pa e
en e a pe o di e en e decimal e e enciando o den de llegada.
11
3.2.Ex acción de ácidos nucleicos
3.2.1. Ex acción de ADN
El ADN de las mues as es aislado median e el GeneRead DNA FFPE ki (QUIAGEN, Alemania).
En el labo a o io se eciben co es o “punchs” de la mues a pa a inada. A cada mues a a
ex ae se le añade un olumen supe io a 160l de Solución de Despa a inado que cub a la
mues a. T as o ea , se incuban a 56ºC unos 3min. An es de añadi 100l a cada mues a de
una mezcla compues a de 55l RNase-F ee wá e , 25l Bu e FTB y 20l de p o einasa K, se
espe a a que la mues a se a empe e. Una ez añadido y o eado, se deja calen a oda la
noche a 56ºC. A p ime a ho a de la jo nada, se aspasa a un bloque ya calien e a 90ºC du an e
una ho a. Sin excede el iempo, se e i a y se da un golpe de cen í uga a la mues a. Se
obse a á una ase supe io azul con la pa a ina y una anspa en e in e io . Es a segunda ase
se ans e i á un nue o ubo de 1,5 ml. Se añaden 115 l de RNase-F ee wa e y 35 l de
U acil-N-Glycolasa, un enzima que e ie e las modi icaciones de las ci osinas causadas po el
p oceso de inclusión en pa a ina (Figu a 3). La mezcla se incuba a 50ºC du an e una ho a.
A con inuación, se añaden 2l de RNase A y se deja incuba 2 min a Tª ambien e. Al pasa el
iempo, se añaden 250l de Bu e AL y 250l de e anol pu o. T as o ea y da un golpe de
cen í uga, se pasa un máximo olumen de 700 l po una columna de pu i icación. Si hubie a
un exceso, debe ía emplea se una segunda columna. Se cen i uga un minu o a máxima
elocidad (13000 pm ap óx.) y se desca a el luido. A con inuación se la a la mues a es
eces, añadiendo una solución y cen i ugando a máxima elocidad du an e un minu o,
desca ando después el luido il ado. P ime o se la a con 500l de Bu e AW 1 y luego con
500 l de Bu e AW 2. La columna se ans ie e a un ubo nue o pa a elimina posibles
esiduos median e cen i ugación. Finalmen e, se pasa la columna a un nue o ubo de 1,5 ml, y
se le añaden 30 l de T is-EDTA (pH 7,5, T is 10 mM, EDTA 1 mM). T as una b e e incubación,
se cen i uga un minu o a máxima elocidad y se desca a la columna. Se ealiza án dos
eluciones en dos ubos di e en es.
Figu a 3: Deaminación oxida i a de la ci osina en mues as FFPE. El ambien e en el que se encuen a una
mues a FFPE da luga a es a modi icación química. Es e cambio p oduci á un misma ch en la cadena,
que en el momen o de una PCR da á luga a la ijación de la mu ación C>T. Tomada de
www.quiagen.com.

12
Con el in de conse a el ADN adecuadamen e, el olumen se aspasa a ubos de 200 l
debido a su comodidad pa a el almacenamien o. En caso de uso inmedia o, las mues as se
conse an a 4ºC no más de una semana. Pa a iempos más p olongados se man ienen en
congelado es a -80ºC.
3.2.2. Ex acción de ARN
El ARN se ex ae a pa i de co es p oceden es del mismo bloque de pa a ina que el ADN
co espondien e a la misma mues a. Pa a su ex acción, se emplea el Reco e AllTM To al
Nucleic Acid Isola ion Ki (The moFishe , USA). El p oceso se inicia con la adición de un mínimo
de 100l de Solución de despa a inado que ecub an comple amen e la mues a y
calen ándolo a 50ºC du an e 3 min. Se añaden 100l de Diges ion Bu e y se o ea odo el
con enido del ubo. En la ase anspa en e que se o me, se añadi án los 4l de P o ease y se
mezcla po pipe eo. Se incuba en bloque seco 3 h a 50ºC y 15 min a 80ºC. Du an e el p oceso,
se p epa a un mix que con end á un olumen de 395l po ubo, componiéndose de 120 l de
Isola ion adi i e y 275l de e anol pu o. Se añade el olumen a cada ubo, y se mezcla po
pipe eo. La mezcla se pasa po una columna de pu i icación, median e cen i ugación 30 s a
10000 pm. A con inuación, se ealiza un p ime la ado añadiendo 700l de Wash 1,
cen i ugando 30 s a 10000 pm y desca ando el il ado. El la ado se epi e una ez con
500l de Wash 2/3 y una úl ima ez sin añadi solución de la ado pa a elimina los es os que
hayan quedado en la columna.
En es e paso de la ex acción, la columna e iene ADN y ARN. Pa a conse a el ARN, se añade
a cada columna 60l de una solución compues a po 6l de 10X DNase Bu e , 4l de DNasa
y 50 l de agua lib e de RNasas. Se deja incuba en la memb ana 30 min a Tª ambien e. Pa a
elimina la DNasa, se epi en los la ados con 700 l de Wash 1, dos eces con 500 l de Wash
2/3 y un úl imo la ado sin solución pa a desca a los desechos es an es. Pa a elui la
mues a, se ans ie e la columna a un nue o ubo, se adicionan 30 l de agua lib e de
nucleasas y se incuba 5-10 min an es de cen i uga un minu o a máxima elocidad.
El ARN se conse a a -80ºC mien as no aya a se empleado. En caso de que se ayan a hace
lib e ías de ARN en el mismo día, se conse a a 4ºC has a que se inicia la eacción.
3.3.Cuan i icación de ácidos nucleicos
Pa a conoce la can idad y calidad de ADN, las mues as son cuan i icadas median e Qubi 3.0
luo ome e (The moFishe , USA). Debido a la concen ación con las que se ob ienen las
mues as as la ex acción, se emplea el Qubi dsDNA HS Assay ki (The moFishe , USA). El
p ime paso del ensayo se á p epa a solución de abajo pa a dos es ánda es y dos
cuan i icaciones po mues a a pa i de 1 l de Qubi dsDNA HS eagen diluido en 199 l de
dsDNA HS bu e . Una ez p epa ado, se gua da en oscu idad. Los es ánda es se p epa an
añadiendo 10 l de cada es ánda a 190 l de solución de abajo. Nada más inicia el Qubi 3.0
luome e e indica que que emos cuan i ica dsADN, en p ime luga se equie e calib a el
apa a o midiendo la concen ación en ambas soluciones con o me lo solici e. Pa a p epa a las
13
mues as, se diluye 1 l de es a en 199 l de solución de abajo. Rápidamen e, se coloca la
mues a en el apa a o y se de e mina la concen ación del ADN ex aído.
Pa a cuan i ica ARN, se u iliza el Qubi RNA HS Assay ki (The moFishe , USA), siguiendo el
mismo p o ocolo pe o con los eac i os co espondien es del ki .
3.4.De ección de mu ación median e PCR en iempo eal
(pla a o ma Cobas®)
La de e minación de la p esencia de mu aciones en los exones 18 a 21 del gen EGFR se
ealiza á median e el ki Cobas EGFR Mu a ion es 2 (Roche, Suiza). A pa i del ADN
ex aído, se p epa an diluciones de la mues a pa a ob ene una concen ación de 2 ng/l en
un olumen mínimo de 90 l. Las diluciones se ealizan con el Specimen Diluen del ki , en
base a una planilla que ealiza los cálculos de los olúmenes necesa ios. En caso de que las
mues as excedan los 70 ng/l, pa a no malgas a Specimen Diluen , se abaja como si no
excedie a el lími e y se emplean 5l de mues a y 170 l de diluyen e. Una ez p epa adas, se
enciende el Cobas 480z Analyze con la inalidad de inicializa el apa a o.
Se p epa an 3 mixes de las es soluciones del ki , mezclándose 20 l del MMX1, MMX2 o
MMX3 con 5 l de MGAC. Pa a cada mix se p epa an 75 l más 25 l po mues a. A
con inuación se ca ga la placa adecuadamen e (Figu a 4). Una ez ca gada, se sella la placa con
un adhesi o y se ca ga en el Cobas 480z Analyze . Po úl imo, se e mina de con igu a el
ensayo indicando el ki empleado, las mues as a analiza y la iden i icación de las mismas. El
ins umen o epo a á as ho a y media de eacción las mu aciones de ec adas, aunque sin
indica la posición co espondien e en el ADNc. En la abla 1 se indican las mu aciones
de ec adas con el ki .
Figu a 4: Esquema de la ca ga de una placa de 96 pocillos pa a el Cobas 480z Analyze . En o den, se
llena án dos pocillos más el equi alen e al núme o de mues as con 25 l de MMX1 ( ojo), MMX2
(ama illo) y MMX3 ( e de). Los pocillos A1, A2 y A3 (neg o) se llenan con el con ol Mu ado, los B1, B2 y
B3 (ma ón) con Specimen Diluen , y los siguien es g upos de es (C1, C2 y C3; D1, D2 y D3…) con 25 l
de la mues a p epa ada
14
Tabla 1: Mu aciones de EGFR de ec adas po Cobas EGFR Mu a ion es 2
Exón
Mu ación en EGFR
Va iación en el gen EGFR
COSMIC ID
Exón 18
G719X
2156G>C
6239
2155G>A
6252
2155G>T
6253
Exón 19
Ex19Del
2240_2251del12
6210
2239_2247del9
6218
2238_2255del18
6220
2235_2249del15
6223
2236_2250del15
6225
2239_2253del15
6254
2239_2256del18
6255
2237_2254del18
12367
2240_2254del15
12369
2240_2257del18
12370
2239_2248TTAAGAGAAG>C
12382
2239_2251>C
12383
2237_2255>T
12384
2235_2255>AAT
12385
2237_2252>T
12386
2239_2258>CA
12387
2239_2256>CAA
12403
2237_2253>TTGCT
12416
2238_2252>GCA
12419
2238_2248>GC
12422
2237_2251del15
12678
2236_2253del18
12728
2235_2248>AATTC
13550
2235_2252>AAT
13551
2235_2251>AATTC
13552
2253_2276del24
13556
2237_2257>TCT
18427
2238_2252del15
23571
2233_2247del15
26038
Exón 20
S768I
2303G>T
6241
T790M
2369C>T
6240
Ex20Ins
2307_2308ins9GCCAGCGTG
12376
2319_2320insCAC
12377
2310_2311insGGT
12378
2311_2312ins9GCGTGGACA
13428
2309_2310AC>CCAGCGTGGAT
13558
Exón 21
L858R
2573T>G
6224
2573_2574TG>GT
12429
L861Q
2582T>A
6213
15
3.5.De ección de mu ación median e PCR con encional y
Secuenciación di ec a
En el p esen e p oyec o, las mues as que han dado posi i o pa a una mu ación en Cobas han
sido con i madas median e secuenciación di ec a. Pa a ello se ealiza la ampli icación del exón
que p esen a la mu ación. La PCR se ealiza median e el ki Type-i mu a ion de ec ion (Roche,
USA). Cada ubo de eacción se compond á de 12,5 l de Type-i mul iplex PCR mas e mix X2,
2,5l de Q-solu ion X5, 0,5 l del cebado o wa d del exón co espondien e y 0,5l del
cebado e e se, ambos a una concen ación 10M (Tabla 2), y un olumen de 9 l compues o
po el olumen necesa io de mues a pa a alcanza 100ng de mues a y Rnase-F ee wa e
has a comple a el olumen. Po cada g upo de mues as analizadas simul áneamen e (2 a 4),
se p epa a a un blanco en el que los 9l se án agua pa a comp oba que no hay
con aminación y un con ol nega i o p e iamen e es ado en el que no se de ec e ninguna
mu ación. La PCR cons a de los siguien es pasos: Desna u alización inicial a 95ºC du an e 5
minu os; 40 ciclos, cada uno de ellos compues o po Desna u alización a 95ºC 45s, Hib idación
a 57ºC 45s y Elongación a 72ºC 1min; Ex ensión inal a 72ºC du an e 10 min.
Tabla 2: Cebado es empleados pa a los dis in os exones del gen EGFR.
Exón
Sen ido
Secuencia
Tª (ºC)
Amplicón (pb)
18
Fo wa d
CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC
57
372
Re e se
CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG
57
19
Fo wa d
GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC
57
366
Re e se
CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG
57
20
Fo wa d
TTTGAAACTCAAGATCGCATT
57
368
Re e se
CATATCCCCATGGCAAACTC
57
21
Fo wa d
CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG
57
372
Re e se
CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC
57
Una ez inalizada la PCR, se comp ueba que la ampli icación haya sido co ec a median e
elec o o esis en gel de aga osa. Pa a ello, se diluye la mues a con agua en p opo ción 3:17.
También se p epa a una dilución 1:9 del ma cado de pesos molecula es T ackI 50 bp Ladde
DNA (The moFishe , USA). Con las diluciones lis as, se coloca el gel E-gel Ex 2% aga ose
(The moFishe , USA) en el E-Gel Aga ose Sys em (The moFishe , USA). El gel, cons a de 11
pocillos, uno pa a el ma cado y el es o pa a mues as. Pa a ca ga el gel, la dilución del
ma cado se pipe ea di ec amen e en el pocillo de la de echa. En cambio, an es de se
ca gadas, las mues as se mezclan con 1l de ampón de ca ga. Una ez es á lis o el gel, se
selecciona en el apa a o el gel empleado y se deja co e du an e 12 min. Una ez inalizado,
se oma una imagen del gel.
Una ez comp obado que la ampli icación ha sido co ec a, se p epa a un nue o ubo po cada
mues a con 2 l del enzima ExoSAP y 8l del p oduc o de PCR, incubado du an e 15 min a
37ºC y 15 min a 80ºC. T as es e paso de eliminación de exceso de cebado es no consumidos en
la PCR, se p ocede con la eacción de secuencia. Po cada ubo de mues a, se p epa an dos
ubos, uno pa a la secuencia o wa d y o o pa a la secuencia e e se. Cada ubo de la eacción
22
Figu a 6: Cap u a con odas las bandas de los geles ealizados pa a es a las PCRs des inadas a
secuenciación di ec a. En odas las imágenes hay uno o dos nega i os (-) que se en cla amen e sin
con aminación y el mismo núme o de mues as w que mues an la ampli icación de una secuencia sin
mu a . (A) Bandas co espondien es al exón 18 de las mues as y el con ol. (B) y (C) Bandas
co espondien es al exón 19 de las mues as y los con oles. Se e cla amen e en las mues as una doble
banda, co espondien e a la deleción y a la secuencia wild ype. (D) Bandas co espondien es al exón 20
de los con oles y las mues as. (E) Bandas co espondien es al exón 21 de los con oles y las mues as.
Del o al de los 18 exones ampli icados, 17 mos a on (94,4%) alguna mu ación. Todas las
mu aciones de ec adas pa a los exones ampli icados ienen ecogidas en la Tabla 3 y en la
Figu a 7. En las bandas p oducidas as las elec o o esis (Figu a 6B y 6C) se e una doble
banda cla a en aquellas mues as que han mos ado ene una deleción. En el caso de la
mues a M03.1 (Figu a 6B), donde la mu ación no ha sido iden i icada median e es a écnica,
la banda supe io es mucho menos in ensa en compa ación que las de las o as mues as con
mu ación en el exón 19.
En elación con los esul ados ob enidos con el Cobas, solo dos mues as no mos a on
conco dancia en e ambas écnicas. La p ime a de ellas (M18) co esponde a una mues a que
mos ó un cambio polimó ico en homocigosis en el exón 20, la cual esul ó ene el cambio
p.T790M según el análisis median e Cobas y no mos a lo en la secuenciación di ec a. Es a es
la única mues a que posee el cambio polimó ico en homocigosis, habiéndose encon ado en
he e ocigosis en o as mues as analizadas que p esen aban ambién la mu ación p.T790M. El
o o caso de no conco dancia (M3.01) co esponde con una deleción del exón 19, el cual ue
iden i icado median e Cobas, pe o no median e la secuenciación di ec a. En el caso de M03.1,
la epe ición del p oceso desde la ampli icación de la mues a dio el mismo esul ado.
Al igual que con la ecnología Cobas, una de las mues as incluidas pa a su análisis no ue
secuenciada median e elec o o esis capila .

23
Figu a 7: Elec o e og amas de las egiones de in e és de los exones 18, 19, 20 y 21 de las mues as y un
con ol nega i o (w ), ob enidos median e secuenciación di ec a. (A) – Exón 18 de las mues as,
mos ando los codones 709 y 719. (B) – Exón 19 de las mues as, con el elec o e og ama cen ado en
los codones 745 a 748. (C) – Exón de las mues as seleccionadas, mos ando la posición c.2361G y el
codón T790. (D) – Exón 21 de las mues as posi i as pa a es e exón, con el elec o e og ama mos ando
el codón 858.
24
4.3.Es udios de secuenciación masi a median e PGM
En o al se ha ealizado la secuenciación de 40 mues as empleando pa a ello 8 chips (Anexo
II), en los que e an secuenciados simul áneamen e el ADN y los ansc i os de usión de has a 8
mues as. En o al, se mapea on 15907996 lec u as de ADN con una media de 397700 lec u as
po mues a, y 4841434 lec u as de ARN, con una media de 121036 lec u as po mues a.
Según los c i e ios es ablecidos, dos mues as de ADN queda on desca adas po no alcanza el
mínimo de lec u as eque ido (100000), al igual que dos mues as de ARN (20000). Po an o,
se dispone de ADN álido de 38 mues as y ARN de 38 mues as, mien as que de ambas solo
se dispone de esul ados de 36 mues as.
4.3.1. Mu aciones en el panel de ADN
En o al, median e PGM se han iden i icado un o al de 102 mu aciones ubicadas en 13 genes
di e en es: 19 en EGFR (18,62%), 1 en HER2 (0,98%), 2 En DDR2 (1,96%), 4 en MET (3,92%), 20
en KRAS (19,60%), 4 en PIK3CA (3,92%), 3 en BRAF (2,94%), 1 en AKT1 (0,98%), 1 en PTEN
(0,98%), 1 en STK11 (0,98%), 1 en CTNNB1 (0,98%) y 45 en TP53 (44,11%). En el es o de los 10
(45,45%) genes del panel pa a ADN (FBXW7, ERBB4, NOTCH 1, SMAD4, NRAS, MAP2K1, FGFR1,
FGFR2, FGFR3 y ALK) no se ha iden i icado mu ación alguna (Anexo III). En la Figu a 9 se
ep esen a como se dis ibuyen las mu aciones en las di e en es mues as.
En el gen EGFR se han de ec ado mu aciones en 13 (32,5%) de las 40 mues as, pe o dos de
ellas no llegaban al núme o de lec u as es ablecido, de o ma que han sido ob iadas. Po
an o, solo se han de ec ado mu aciones en 12 (31,57%) pacien es de los 38 álidos. T as el
análisis, se han iden i icado un o al de 19 mu aciones, compues as po un o al de 9
mu aciones di e en es: una ez las mu aciones p.E709K y p.G719C del exón 18; dos deleciones
p.E746-A750del, 2 mu aciones pun uales (p.A750P y p.T751A) y una mu ación compleja
p.L747-P753delinsS del exón 19; los cambios p.T790M y p.C797S del exón 20; y la mu ación
p.L858R del exón 21 (Figu a 8).
Figu a 8: Dis ibución de las mu aciones iden i icadas en EGFR a lo la go de odas las mues as de NGS.
Solo se incluyen mues as que hayan sido alo ables (más de 100000 lec u as).
25
Figu a 9: hea map de las mu aciones de las mues as analizadas median e PGM con el ki Oncomine Solid Tumo ADN ki . En g is las mues as de me ás asis.
M01.1
M01.2
M02
M03.1
M04.1
M04.2
M05
M06
M07
M08
M09
M10
M11.2
M12
M13
M14
M15
M16
M17
M18
M19
M20
M21
M22
M23
M24
M25
M26
M27
M28
M29
M30
M31
M32
M33
M34
M35
M36
89,5%
TP53
50,0%
KRAS
31,6%
EGFR
10,2%
MET
10,2%
PIK3CA
7,9%
BRAF
5,3%
DDR2
2,6%
CTNNB1
2,6%
ERBB2
2,6%
AKT1
2,6%
PTEN
2,6%
STK11
0,0%
NOTCH1
0,0%
ALK
0,0%
ERBB4
0,0%
FGFR1
0,0%
FGFR2
0,0%
FGFR3
0,0%
NRAS
0,0%
MAP2K1
0,0%
FBXW7
0,0%
SMAD4
26
En el oncogén KRAS se han iden i icado un o al de 20 mu aciones en 19 de las mues as
(50,0%). En o al, odas esas mu aciones a ec an a 4 codones: en el codón 12 se han obse ado
8 cambios p.G12C y 6 co espondien es a p.G12V, en la posición 13 se han encon ado 2
cambios p.G13D y una mu ación p.G13E, en el 61 se han egis ado 2 cambios p.Q61H y en el
58 un único cambio p.T58I (Figu a 10). Es e úl imo cambio se ha de ec ado simul áneamen e
con un cambio p.G12C. De las 19 mues as po ado as de al menos una mu ación en KRAS,
solo 1 (2,6%) mos aba simul áneamen e mu aciones en el gen KRAS y EGFR. Es a mues a
(M29) poseía las mu aciones p.G12C en KRAS y, según la NGS, la mu ación p.A750P en EGFR.
Además, la biopsia p ocede de una me ás asis de ec ada en el hígado.
Figu a 10: Dis ibución de las mu aciones localizadas en KRAS median e NGS. Sólo se incluyen aquellas
mu aciones de mues as alidas.
En el gen MET se han de ec ado 3 mu aciones di e en es en 4 pacien es (10,52%). Los cambios
iden i icados han sido p.E168D en dos mues as, p.M362T en una y p.N375S en o a. El cambio
p.M362T se da un pacien e que ambién posee la mu ación p.G12V en KRAS y uno de los dos
casos con p.G168E es la misma mues a que posee mu ación en KRAS y EGFR, comen ada en el
pá a o an e io .
Median e los il os aplicados pa a el análisis de las mu aciones, en el gen TP53 de las 38
mues as alidas se ha de ec ado el polimo ismo p.P72R (c.215C>G) en 33 de ellas.
Descon ando es a a ian e, se han encon ado 12 mues as (31,57%) con mu ación, odas ellas
di e en es. De es as 12, solo una de ellas es un cambio no pun ual siendo esponsable de un
ame shi .
En e e encia al es o de genes, en AKT1 se ha encon ado la mu ación p.D46E, en BRAF,
p.V600E y p.G469V; en CTNNB1, la p.S37C; en DDR2, p.R260L y p.M441I; en ERBB2, p.I767M;
en PIK3CA, la p.E542Q, la p.G1049R y la p.H1047L; en PTEN un pa ón de splicing al e na i o; y
en STK11 un ame shi desde la posición p.P280.
27
4.3.2. T aslocaciones en el panel de ARN
Del o al de 40 mues as pa a las que se analiza on los ansc i os de usión, solo 2 no han
alcanzado las 20.000 lec u as mínimas, esul ando no alo ables. Doce de las 38 mues as
álidas han mos ado posee alguna al e ación, e i icada median e el p og ama de análisis o
no. Los dos casos e i icados poseen eo denamien os del gen ALK con dis in os pun os de
o u a, M14 posee el ansc i o EML4(13)-ALK(20) y M25 el EML4(6)-ALK(20). Las es an es 10
mues as, son eo denamien os dudosos que es án pendien es de con i ma po un mé odo
al e na i o: 5 (13,15% de las mues as álidas) de ellas poseen eo denamien os en el gen
ROS1 y las es an es 5 (13,15% de las mues as álidas) en el gen RET, sin que el so wa e
indique el pa ne con quien se eo denan. Exis en cla os indicios de que es os 10 casos de
eo denamien os dudosos sean nega i os al coexis i con al e aciones somá icas en o os
oncogenes del panel de ADN. Las mues as con eo denamien os con i mados en ALK no han
mos ado mu aciones en genes como EGFR o KRAS. En cambio, ambas mues as poseen
mu ación en TP53 y una de ellas posee un cambio en el gen DDR2.
4.4.Compa ación de esul ados en e los mé odos molecula es
empleados
De las 14 mues as que han sido analizadas median e Cobas, secuenciación di ec a y
secuenciación masi a, dos de ellas han sido ob iadas debido a las bajas lec u as ob enidas en
la secuenciación masi a, lo que las con ie e en no alo ables. De las 12 es an es, 7 mues as
(58,3%) han ob enido en los es análisis esul ados conco dan es (Tabla 3).
De los di e en es casos disco dan es, el de la mues a M18 co esponde a una de ección de la
mu ación p.T790M en el exón 20 median e cobas, pe o su no iden i icación median e las o as
dos ecnologías. En su luga se iden i ica el polimo ismo c.2391G>A en homocigosis (p.Q787Q)
median e ambas ecnologías.
En o os dos casos (M02 y M29), an o Cobas como la secuenciación di ec a iden i ican una
deleción en el exón 19, mien as que po secuenciación masi a solo se de ec a una mu ación
pun ual en el codón 750 (M29) o 751 (M02). En ambos sacos se examinó el a chi o BAM
gene ado as la secuenciación median e el p og ama In eg a i e Genome Viewe (IGV). En
ambos casos se e i icó la deleción co espondien e a cada secuencia y la ausencia de la
mu ación pun ual que e óneamen e había in e p e ado Ion Repo e . (Figu a 11A y 11B).
O o de los casos disco dan es (M32) ue debido a que la NGS no ue capaz de de ec a la
mu ación p.L858R, de ec ada median e Cobas y secuenciación di ec a.
El úl imo de los casos (M03.1) ue debido a que la secuenciación di ec a no de ec o una
mu ación que an o el Cobas como la NGS econocie on. Pos e io es epe iciones de la
secuenciación di ec a de la mues a, an o de la p ime a como de la segunda alícuo a die on el
mismo esul ado.

28
Tabla 3: Compa ación de los esul ados o ecidos po las écnicas de análisis de EGFR. Cada línea
co esponde a las mu aciones en un mismo exón. (MND – Mu ación no de ec ada / (NV) -
Mues a No Valo able / * - Mues a con disco dancias)
Mues a
Exón
Resul ado
Cobas
Resul ado
Secuenciación di ec a
Secuenciación masi a
Resul ado
Mapped
Reads
M01.1
21
p.L858R
p.L858R (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
519,807
M01.2
21
p.L858R
p.L858R (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
554,289
20
p.T790M
p.T790M (c.2369 C>T)
p.T790M (c.2369 C>T)
M02*
19
Ex19 del
p.E746-T751delinsVA
(c.2237-2253delinsTTGCT)
p.T751A (c.2251A>G)
551,861
M03.1*
19
Ex19 del
MND
p.E746-A750del
(c.2235-2249del)
518,364
M03.2
19
Ex19 del
p.E746-A750del
(c.2235-2249del)
-
6,351
(NV)
20
p.T790M
p.T790M (c.2369 C>T)
-
M04.1
21
p.L858R
p.L858R (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
402,052
M04.2
21
p.L858R
p.L858R (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
503,515
20
p.T790M
p.T790M (c.2369 C>T)
p.T790M (c.2369 C>T)
M11.1
18
p.G719X
p.E709K (c.2125 G>A)
p.G719C (c.2155 G>T)
-
47,478
(NV)
M11.2
18
p.G719X
p.E709K (c.2125 G>A)
p.G719C (c.2155 G>T)
p.E709K (c.2125 G>A)
p.G719C (c.2155 G>T)
330,619
M12
21
p.L858R
p.L858R (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
303,224
M18*
20
p.T790M
MND [p.Q787Q
(c.2361G>A)]
MND [p.Q787Q
(c.2361G>A)]
431,259
M29*
19
Ex19 del
p.L747-A750delinsP
(c.2238-2248delinsGC)
p.A750P (c.2248G>C)
448,994
M31
10
Ex19 del
p.E746-A750del
(c.2235-2249del)
p.E746-A750del
(c.2235-2249del)
348,584
20
p.T790M
p.T790M (c.2369 C>T)
p.T790M (c.2369 C>T)
M32*
21
p.L858R
p.L858 (c.2573 T>G)
p.L858R (c.2573 T>G)
300,795
Figu a 11: alineamien os de las lec u as ob enidas de dos de las mues as con lic i as. (A) –
Alineamien os de la secuencia del exón 19 de EGFR en M02. Se e cla amen e la p esencia de una
deleción y del cambio ACA>GCT, es e segundo epo ado po el Ion Repo e . (B) – Alineamien os de la
secuencia del exón 19 de EGFR en M51. Es posible e la deleción y el cambio epo ado (GCA>CCA) en
una p opo ción educida en e a la secuencia w .
A
B
29
En el caso álido M04.2 con mu ación en el exón 18, la secuenciación masi a y la
secuenciación di ec a iden i ica on una segunda mu ación: p.E709K (c.2125G>A) que no e a
epo ada po Cobas. Del mismo modo, en M04.1 (mapped eads<100000), del mismo
pacien e, la secuenciación capila de ec a es a misma segunda mu ación.
5. Discusión
5.1.Compa ación qPCR, secuenciación di ec a y NGS
El siguien e abajo ha mos ado el desa ollo de es ap oximaciones pa a el es udio de las
al e aciones del gen EGFR, impo an e pa a el a amien o del CPNM (Ga cía-Foncillas e al.,
2011; Gómez e al., 2012; Lindeman e al., 2013). En conc e o, es e abajo p e ende compa a
dos mé odos habi uales de abajo implan ados en el Labo a o io de Biología Molecula del
HUyP La Fe, como son la secuenciación di ec a y la de ección median e qPCR, con una nue a
me odología como es la a ge ed sequencing median e NGS, que poco a poco a
implan ándose en la clínica. En los años ecien es, con la apa ición e implan ación de es e ipo
de ecnologías, ya se han ealizado es udios que p e enden mos a como las NGS pueden
iguala e incluso apo a más in o mación que ecnologías de uso en la u ina clínica (Chin e
al., 2013; Tuononen e al., 2013; Ce nomaz e al., 2016).
Hemos p esen ado un po cen aje de mu ación del gen EGFR del 35,0% (14/40) muy supe io a
la p e alencia mu acional desc i a pa a es e gen en pacien es con CPNM. Es necesa io des aca
que es e abajo no p e ende es ablece las p e alencias mu acionales de cada una de las
al e aciones desc i as en pacien es con CPNM. Po el con a io in en a pone a pun o un
nue o mé odo de análisis, como es la secuenciación masi a, e inco po a lo en la u ina
asis encial. Po ello, ha sido necesa io selecciona mues as de pacien es cuyos esul ados e an
p e iamen e conocidos.
De las 12 mues as que p esen a on mu aciones en EGFR median e qPCR, se han encon ado
disco dancias con la secuenciación di ec a y con la NGS en 5 de ellas. Dos de ellas (M02 y M29)
e an debidas a deleciones que a a és de qPCR y de secuenciación di ec a ue on
iden i icadas, pe o la NGS no las epo aba. La e isión ealizada en el IGV de ambas mues as
(Figu a 11 A y 11 B) mues a como la deleción sí es á p esen e. La posible causa de que en
ambas deleciones ue an epo adas como un cambio aminoacídico eside en el alineamien o
ealizado de la secuencia. Debido al uncionamien o del so wa e Ion Repo e , cuando el
p og ama analiza una posición conc e a, in en a iden i ica una se ie de a ian es. Si no es
capaz de encon a alguna de las a ian es que iene p ede e minadas, el p og ama no epo a
que se haya p oducido una deleción. Debido a que en ambos casos apa ecen a ios
nucleó idos alineados en mi ad de la deleción, el p og ama no lo asocia a ninguna a ian e y
no es capaz de epo a el cambio. Pa a u u os casos, se á necesa io p opone una mejo a en
el so wa e de análisis que sea capaz de econoce es a a iación en el núme o de copias. En el
caso conc e o de EGFR, se á impo an e una e isión manual de las secuencias gene adas en
30
caso de que en el exón 19 se de ec e un cambio que no sea una deleción, la a iación más
p e alen e en dicha egión (Lindeman e al., 2013).
O o de los casos de disco dancia ha sido la mues a M03.1, en la cual no se de ec aba
median e secuenciación di ec a la mu ación de ec ada po qPCR y NGS. Analizando los
esul ados de la NGS se ha iden i icado que la ecuencia del alelo mu ado e a del 3,03%
(Anexo III). Debido a que an o la qPCR como la NGS p esen an una ele ada sensibilidad, la
mu ación ha podido se iden i icada. En cambio, la secuenciación di ec a no es capaz de
de ec a po cen ajes an bajos, es ableciéndose su lími e de de ección en o no al 25%
(Ga cia-Foncillas e al., 2011; Gómez e al., 2012). En un á ea como la oncología, y en conc e o
en mues as FFPE donde la población umo al puede apa ece en muy baja p opo ción, la
secuenciación di ec a puede se uen e de alsos nega i os, con i iéndola en una ecnología
suscep ible de se sus i uida po o as de mayo sensibilidad. Po o o lado, ambién es
impo an e la calidad de la mues a ob enida, en el caso de la M32, donde a pa i de una
misma ex acción se habían gene ado dos eluciones, la mu ación p.L858R solo se de ec aba en
la p ime a alícuo a, e aluada as ob ene esul ados nega i os al analiza la segunda elución.
En es e sen ido, siemp e, la segunda elución a a se de peo calidad, aunque en ocasiones es
in e esan e dispone de es e segundo olumen de mues a, la calidad puede comp ome e los
esul ados de la p ueba y lle a a alsos nega i os.
La úl ima disco dancia co esponde a un indi iduo (M18) homocigo o pa a el polimo ismo
c.2361G>C (p.Q787Q) que median e Cobas se de ec ó la mu ación p.T790M, mien as que la
secuenciación di ec a y la NGS no epo a on el mismo esul ado. A ni el de ensayo, el
desconocimien o de la composición de la sonda impide es ablece cla amen e el mo i o del
e o en la qPCR, aunque es posible que sea esponsable de una mala hib idación de la sonda,
a o eciendo el also posi i o. Se eque i ían o o ipo de ensayos pa a comp oba al
hipó esis. Es e polimo ismo ( s1050171) es una mu ación ge minal de al a p e alencia en la
población (Ce nomaz e al., 2016) que se encuen a an o en pe sonas sanas como en
pacien es de CP, no malmen e en he e ocigosis. Un ecien e es udio ealizado po Koh e al.
(2016) elaciona la p esencia de es a mu ación con un peo p onós ico en pacien es en e apas
emp anas de CP de células escamosas.
Los esul ados ob enidos en el es o de mues as han sido conco dan es en e los es ensayos.
Cabe esal a como en las mues as en las que exis e una segunda biopsia (sal o M03.1 y
M03.2) la mu ación de ec ada en la p ime a mues a es ambién de ec ada en la segunda.
Incluso en los casos donde los esul ados de la NGS no son alo ables, la mu ación es
de ec ada. Fue a de la coincidencia, ealmen e no se puede conside a como álido el
esul ado po incumplimien o del c i e io de las lec u as. Es impo an e des aca la apa ición
de la mu ación p.T790M en algunas de las segundas biopsias. Es a mu ación es á elacionada
con las esis encias a los ITK de p ime a gene ación y es capaz de se supe ada po los de
e ce a gene ación. Denominada mu ación ga ekeepe , apa ece en pacien es que es án
siendo a ados con ITK de p ime gene ación, siendo posible que p e alezca po selección
posi i a (Gazda , 2009). Apa eciendo inicialmen e en baja p opo ción, los es de baja
sensibilidad no se ían capaces de de ec a la has a que el a amien o hace aumen a la
población umo al con la esis encia. Una ez más se des aca la necesidad de mé odos
31
sensibles que nos pe mi an de ec a las mu aciones en sus concen aciones más bajas.
Ac ualmen e, se es á abajando en mé odos que pe mi an aumen a la sensibilidad (Zhao e
al., 2016), así como que pe mi an de ec a la mu ación en o o ipo de mues as, como la
biopsia líquida. Es as me odologías equie en mayo sensibilidad debido a la baja can idad de
ci cula ing umo ADN (c DNA) que hay en la sang e (Mu aza e al., 2013; Jiang e al., 2015;
Th ess e al., 2015).
5.2.Impac o de la ecnología de NGS
Mien as que la qPCR es un ensayo limi ado po la especi icidad de las sondas empleadas y la
secuenciación di ec a po los amplicones seleccionados, la NGS es á menos limi ada en es e
sen ido po la capacidad de mul iplexa di e sos amplicones que nos p opo ciona an una
in o mación in eg al y más p o unda del umo a analiza . Po su pa e, con una sonda de qPCR
podemos es a una mu ación o conjun o de mu aciones muy conc e as, a eces sin ni siquie a
conoce qué mu ación es amos de ec ando. En cambio, las ecnologías de secuenciación
pe mi en de alla cualquie a iación en una secuencia, siemp e y cuando es é en la su icien e
can idad pa a pode se iden i icada po los de ec o es del apa a o. En el caso de la
secuenciación di ec a, es a sensibilidad es baja y en una misma elec o o esis el núme o de
amplicones analizados simul áneamen e depende á del núme o de capila es disponibles en el
apa a o. En la secuenciación masi a es e incon enien e desapa ece; la ele ada sensibilidad de
la ecnología y el poco eque imien o de mues a pe mi en que con poca can idad de ADN se
pueda de ec a con acilidad cualquie mu ación. Además, la na u aleza del p oceso de
gene ación de las lib e ías pe mi e, po un lado, mul iplexa el ensayo a a és del uso de
adap ado es iden i ica i os, y po o o, analiza a ios amplicones median e el uso de a ios
pa es de cebado es, que g acias a su pos e io alineamien o, se pueden analiza a la ez sin
miedo de que sean con undidos con egiones de secuencias que no es la co espondien e. Po
es os mo i os, la NGS se p esen a como una ecnología po en e desde la que un único ensayo
nos pe mi e ob ene mucha más in o mación que las o as ecnologías a la ez que alcanza una
ele ada sensibilidad. Así, en es e es udio, además de las mu aciones exis en es en EGFR, se
han podido de ec a mu aciones en o os 11 genes, así como aslocaciones y
eo denamien os.
Las mu aciones en el gen EGFR se han encon ado en un 31,6% de las mues as seleccionadas.
Las deleciones en el exón 19 son conside adas mu aciones de clase I, mien as que las
mu aciones pun uales como p.G719C o p.L858R son de clase II. Ambos ipos de mu aciones
son conside adas ac i an es y a ec an al dominio TK, gene ando un EGFR con mayo a inidad
po el ATP. Es as mu aciones ac úan como ma cado es p edic i os de espues a a ITK, de
o ma que aquellos pacien es con es as mu aciones se pod án bene icia de ellos (Gazda ,
2009). Es impo an e esal a como en segundas biopsias de pacien es con es as mu aciones
ac i an es (M01.2 y M11.2), han acabado mani es ando la mu ación p.T790M su gida como
esis encia a es os a amien os (Ga away y Jänne, 2012; González de Cas o e al., 2015).
Pe o al igual que hay á macos ú iles que pe mi en supe a es a mu ación (ITKs de e ce a
gene ación), ya han su gido casos en los que han apa ecido esis encias. Es el caso de la
mues a de me ás asis hepá ica M36, en el que se obse a además la p esencia de la mu ación
38
(2013) Non-in asi e analysis o acqui ed esis ance o cance he apy by sequencing o plasma
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41
8. Anexos
8.1.Anexo I: Mues as p oceden es de un mismo pacien e
Mues a
P ocedencia
Mu aciones di e gen es
(EGFR)
Mu aciones comunes
(EGFR)
M01.1
Pulmón
(-)
p.L858R
M01.2
Pulmón
p.T790M
M03.1
Pulmón
(-)
p.E746-A750del
M03.2
M x: Pe i oneo
p.T790M
M04.1
Pulmón
(-)
p.L858R
M04.2
Pulmón
p.T790M
M11.1
Pulmón
(-)
p.E709K, p.G719C
M11.2
Pleu a
(-)
42
8.2.Anexo II: chips empleados pa a la secuenciación median e PGM
Chip
Mues as
Po cen aje de
pocillos
ocupados (%)
Reads
To ales
Reads
Validos
Po cen aje
de lec u as
alidas (%)
Media de
bases po
Read (bp)
1
M01.1, M01.2, M02,
M03.1, M03.2,
M04.1, M04.2, M05
69
7841057
5121500
65,31
110
2
M10, M11.1, M11.2,
M12, M13, M25
67
7536289
2673687
35,48
114
3
M15, M16, M17
67
7517968
4008658
53,32
115
4
M18, M19, M20, M21,
M22
78
8775044
3579861
40,79
110
5
M06, M07, M08, M23,
M24
77
8639955
3121595
36,13
111
6
M14, M26, M27, M28
49
7646706
3664597
47,92
113
7
M09, M29, M30, M32
50
7944207
3911866
49,24
112
8
M31, M33, M34, M35,
M36
75
8468926
4014029
47,39
112
43
8.3.Anexo III: Mu aciones de ec adas median e secuenciación en el
PGM
(NV – No alo able)
Mues a
P ocedencia
Chip
Nº Lec u as
Gen
Mu ación
F ecuencia
alélica (%)
M01.1
Pulmón
1
519,807
EGFR
p.L858R
20,20
PIK3CA
p.G1049R
19,35
M01.2
Pulmón
1
554,289
EGFR
p.L858R
25,60
p.T790M
12,37
PIK3CA
p.G1049R
26,60
M02
Pulmón
1
551,861
EGFR
p.T751A
58,28
M03.1
Pulmón
1
518,364
EGFR
p.E746-A750del
3,03
TP53
p.P72R
96,99
M03.2
M x:
Pe i oneo
1
6,351
NV
NV
(-)
M04.1
Pulmón
1
402,052
EGFR
p.L858R
11,00
TP53
p.P72R
95,23
M04.2
Pulmón
1
503,515
EGFR
p.L858R
50,49
p.T790M
9,22
TP53
p.P72R
97,00
p.G105V
63,22
M05
Pulmón
1
524,024
PIK3CA
p.H1047L
76,41
TP53
p.P72R
95,60
p.Y220C
66,34
M06
Pulmón
5
366,069
PTEN
c.635-1G>C
28,34
TP53
p.P72R
84,10
p.R158L
69,93
M07
Pulmón
5
274,085
KRAS
p.G12V
39,38
AKT1
p.D46E
42,31
TP53
p.P72R
96,02
p.Y163C
49,69
M08
Pulmón
5
292,515
KRAS
p.Q61H
39,23
TP53
p.P72R
44,79
M09
Ganglio
7
298,611
KRAS
p.G12C
23,67
TP53
p.P72R
97,77
M10
Pulmón
2
374,272
KRAS
p.G13E
31,89
TP53
p.G154 s
20,37
M11.1
Pulmón
2
47,478
NV
NV
(-)
M11.2
Pulmón
2
330,619
EGFR
p.E709K
62,35
p.G719C
63,03
CTNNB1
p.S37C
44,51
TP53
p.P72R
53,80
M12
Pulmón
2
303,224
EGFR
p.L858R
6,81
TP53
p.P72R
51,52
p.L194F
8,59

44
M13
Pulmón
2
404,913
KRAS
p.G13D
17,05
TP53
p.P72R
42,47
p.V157F
25,13
M14
Pulmón
6
288,119
TP53
p.P72R
57,11
M15
Pulmón
3
561,364
BRAF
p.V600E
3,20
TP53
p.P72R
97,84
M16
Pulmón
3
613,012
KRAS
p.Q61H
13,14
BRAF
p.V600E
5,13
TP53
p.P72R
97,70
M17
Pulmón
3
581,215
KRAS
p.G12V
12,29
TP53
p.P72R
97,44
M18
Pulmón
4
431,259
EGFR
c.2361G>C
100,00
BRAF
p.G469V
26,23
TP53
p.P72R
38,16
M19
Pulmón
4
377,753
KRAS
p.G12C
14,96
TP53
p.P72R
100,00
M20
Pulmón
4
389,443
MET
p.M362T
52,90
KRAS
p.G12V
27,50
STK11
p.P281 s
16,20
TP53
p.P72R
97,74
p.R248L
28,60
M21
Pulmón
4
359,729
KRAS
p.G12V
25,00
TP53
p.P72R
97,75
M22
M x: ce eb o
4
369,296
MET
p.E168D
50,40
TP53
p.P72R
35,10
p.G154V
70,74
M23
M x: ejido
lin oide
5
331,411
KRAS
p.G12C
59,69
TP53
p.P72R
80,19
p.R273L
52,14
M24
Pulmón
5
327,735
KRAS
p.G12C
8,63
TP53
p.P72R
100,00
M25
Pleu a
2
362,708
DDR2
p.R260L
44,99
TP53
p.P72R
50,65
M26
Pulmón
6
326,226
KRAS
p.G12V
6,00
TP53
p.P72R
55,02
M27
Pulmón
6
415,556
KRAS
p.G12V
22,40
TP53
p.P72R
50,62
M28
Pulmón
6
335,933
ERBB2
p.I767M
9,90
DDR2
p.M441I
51,77
PIK3CA
p.E542Q
7,69
TP53
p.P72R
98,07
p.V157F
9,82
M29
M x: Hígado
7
448,994
EGFR
p.A750P
4,83
MET
p.E168D
30,04
KRAS
p.G12C
79,69
TP53
p.P72R
97,16
M30
Pulmón
7
443,395
KRAS
p.G13E
45,12
TP53
p.P72R
98,01
M31
Pulmón
8
348,584
EGFR
p.E746-A750del
42,18
45
p.T790M
23,44
TP53
p.P72R
100,00
M32
Pulmón
7
300,795
EGFR
p.L858R
15,32
TP53
p.P72R
100,00
M33
Pulmón
8
540,709
KRAS
p.G12C
16,03
M34
Pulmón
8
333,021
KRAS
p.G12C
50,90
TP53
p.P72R
100,00
p.R249S
36,00
M35
Pulmón
8
445,948
KRAS
p.Gly12Cys
28,34
p.Th 58Ile
2,45
TP53
p.P o72A g
100,00
M36
M x: Hígado
8
347,891
EGFR
p.L747-
P753delinsS
51,00
p.T790M
12,50
p.C797S
12,50
MET
p.N375S
77,00
TP53
p.P72R
78,55
46
8.4.Anexo IV: Resul ados de la secuenciación de los ansc i os
(NV – No alo able)
Mues a
Chip
Mapped
Reads
T aslocación
iden i icada/ alidada
M01.1
1
154,903
M01.2
1
157,106
M02
1
3,499
NV
M03.1
1
121,073
M03.2
1
107,044
M04.1
1
29,839
M04.2
1
124,945
M05
1
153,58
M06
5
154,201
M07
5
120,828
M08
5
200,810
M09
7
177,102
M10
2
218,315
M11.1
2
221,595
M11.2
2
147,269
M12
2
291,415
M13
2
168,582
M14
6
144,357
EML4(13) - ALK(20)
M15
3
113,784
M16
3
100,978
M17
3
122,335
M18
4
116,243
M19
4
65,368
M20
4
79,330
M21
4
130,086
M22
4
104,748
M23
5
75,829
M24
5
159
NV
M25
2
249,939
EML4(6) - ALK(20)
M26
6
102,082
M27
6
87,849
M28
6
53,343
M29
7
88,457
M30
7
79,743
M31
8
67,713
M32
7
49,351
M33
8
114,948
M34
8
112,940
M35
8
163,197
M36
8
112,394