Impacto de la tecnología de secuenciación masiva en el cáncer de pulmón no microcítico

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL IMPACTO DE LA TECNOLOGÍA DE SECUENCIACIÓN MASIVA EN EL CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO Grado en Biotecnología-Trabajo Final de Grado Curso 2015/2016 Alumno: Roberto Tébar Martínez Directora: Sarai Palanca Suela Tutora académica: Eloisa Jantus Lewintre Valencia, 7 de julio de 2016 II Autor/Author: D. Roberto Tébar Martínez Tutor Académico/ Academic Supervisor: Prof. Dña. Eloisa Jantus Lewintre Director-Cotutor/Cotutor: Dña. Sarai Palanca Suela Título: IMPACTO DE LA TECNOLOGÍA DE SECUENCIACIÓN MASIVA EN EL CÁNCER DE PULMÓN NO MICROCÍTICO. Resumen: En el cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) es necesaria la identificación de biomarcadores que permitan la caracterización molecular del tumor y, con ello, adecuar el manejo de los pacientes. En este sentido, el receptor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la cinasa del linfoma anaplásico (ALK) desempeñan un papel relevante como marcadores predictivos de respuesta a la terapia oncológica, en concreto a los inhibidores tirosina cinasa (ITKs). Se han descrito diferentes aproximaciones para su determinación (mutaciones de EGFR y traslocaciones de ALK) siendo la real time-PCR (qPCR) y la FISH, las técnicas más ampliamente utilizadas, respectivamente. Con el desarrollo de las tecnologías de nueva generación, como la secuenciación masiva (Next Generation Sequencing; NGS), se abre la posibilidad de analizar simultáneamente diferentes alteraciones oncogénicas driver implicadas en la patogénesis del CPNM. Asimismo, esta nueva tecnología permite minimizar algunas complicaciones habituales de la rutina asistencial, como son los altos requerimientos de muestra, la disposición de múltiples tecnologías para abordar los distintos marcadores y un importante consumo de tiempo para proporcionar los resultados al clínico. Hipótesis y Objetivos: La NGS puede ayudar a clasificar el tumor al diagnóstico y guiar a los pacientes con CPNM avanzado en el tratamiento con terapias dianas. Por ello, el objetivo del siguiente trabajo de fin de grado (TFG) será una breve contextualización de la medicina personalizada en el CPNM y la comparación de los métodos empleados actualmente en el laboratorio de diagnóstico frente a nuevas tecnologías desarrolladas, como la NGS. Sujetos de estudio: Se plantea un estudio retrospectivo efectuado sobre muestras seleccionadas de tejido tumoral (FFPE) de pacientes con CPNM avanzado atendidos en el Servicio de Oncología Médica del Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Durante el desarrollo del proyecto, se estima el estudio de40 pacientes. Todos ellos deberán haber manifestado por escrito su consentimiento informado. Instrumentalización y determinaciones:  Extracción de ácidos nucleicos (ADN y ARN) a partir de material tumoral incluido en parafina (FFPE). Este protocolo de trabajo incluye el desparafinado de la muestra y la obtención y purificación de los ácidos nucleicos. Para ello se utilizarán los kits III GeneReader DNA FFPE Kit (QUIAGEN) para ADN y RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (ThermoFisher) para ARN.  Determinación de mutaciones en el gen EGFR mediante cobas® EGFR Mutation Test v2 (CE-IVD) de Roche Molecular en la plataforma Cobas® 480z Analyzer, que permite la detección de mutaciones puntuales, deleciones y/o inserciones en los exones 18, 19, 20 y 21. Los casos positivos serán confirmados por secuenciación directa (Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer) utilizando los protocolos recomendados por el fabricante.  Secuenciación masiva mediante la tecnología del IonTorrent (secuenciación por semiconductores) en la plataforma Personal Genome Machine™ (PGM™; Applied Biosystem). Inicialmente, se requiere la preparación de las librerías, empleándose para ello los paneles Ampliseq Oncomine Solid Tumor DNA kit y Oncomine® Solid Tumour Fusion Transcript kit (Thermo Fisher Scientific) que permiten el análisis de 22 oncogenes y cuatro transcritos de fusión, respectivamente. Palabras claves: biología molecular, cáncer de pulmón, secuenciación masiva, EGFR. Title: IMPACT OF THE MASSIVE SEQUENCING TECHNOLOGIES IN NON-SMALL CELL LUNG CANCER Summary: Identification of biomarkers that allow the molecular characterization of the tumor is necessary in non-small cell lung cancer (NSCLC) in order to provide the patient the most appropriate treatment. In this sense, the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the anaplastic lymphoma kinase (ALK) play an important role like predictive biomarkers in response to oncology therapy, in special to tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Some approaches have been defined in order to determinate those biomarkers (EGFR mutations and ALK translocations), being real-time PCR (qPCR) and fluorescence in situ hybridization (FISH), respectively, the most relevant technologies used in clinic. With the development of new generation technologies like massive sequencing (Next Generation Secuencing; NGS), it is possible to identify oncogenic driver mutations implicated in the NSCLC pathogenesis. This recent technology can minimize some common complications of routine care, like high sample requirement, diverse technologies used to identify different biomarkers and the long times required to provide results to the clinic Hypothesis and objectives: NGS could help to classify tumor in diagnosis and guide advanced NSCLC patients to appropriate targeted therapies. Thus, the objective of this “Trabajo final de grado” (TFG) is contextualize personalized medicine in NSCLC treatment and compare the habitual methods used in a diagnostic laboratory with new technologies like NGS. Study subjects: A retrospective study in formalin-fixed paraffin embedded (FFPE) tissue samples is proposed. Samples of patients with advanced NSCLC are from Medic Oncology Service of “Hospital Universitario y Politécnico La Fe”. During the development of this project, it is estimated to study 40 patients who must sign the informed consent. IV Instruments and methods:  Nucleic acids isolation (DNA and RNA) from FFPE tissue samples. The process includes a previous step of paraffin removal, and isolation and purification of the nucleic acids. DNA will be obtained using GeneReader DNA FFPE Kit (QUIAGEN) and RNA with RecoverAll™ Total Nucleic Acid Isolation Kit for FFPE (ThermoFisher).  Detection of mutations in EGFR gene with cobas® EGFR Mutation Test v2 (CE-IVD) of Roche Molecular in the platform Cobas® 480z Analyzer. This kit is able to detect point mutations and indels in exons 18, 19, 20 and 21. Positive samples will be confirmed by capillary sequencing (Applied Biosystems® 3130 Genetic Analyzer) according to fabricant protocols.  Massive sequencing using IonTorrent technology (sequencing by semiconductors) in the platform Personal Genome Machine™ (PGM™; Applied Biosystem). Previously, libraries are prepared employing Ampliseq Oncomine Solid Tumor DNA kit and Oncomine® Solid Tumour Fusion Transcript kit (Thermo Fisher Scientific). The first is capable to identify 22 oncogenes and tumor suppressor genes, and the second can detect the expression of four fusion transcrits. Key words: Molecular biology, lung cancer, massive sequencing, EGFR. Valencia, 7 de Julio de 2016 V Agradecimientos Quiero aprovechar este espacio para darle las gracias a la Dra. Sarai Palanca por la oportunidad de realizar este TFG en un laboratorio como es el de Biología Molecular del Servicio de Análisis Clínicos del Hospital Universitario y Politécnico La Fe. Agradecer también a la Dra. Rosa Murria el apoyo que me ha dado durante mi estancia de prácticas. También agradecer a todas aquellas personas que me han apoyado durante estos 4 años: mis compañeros de “la puerta 5”, mi hermano Eduardo, mi padre, mis primos Iris y Alejandro, Maiden, el resto de mi familia, y todos mis compañeros de los Scouts y a mis niños de la Unidad Kimberley. Pero sobretodo, si de alguien me acuerdo en este trabajo, es de mi madre. Gracias a ella he llegado hasta aquí, aunque este es solo el comienzo de un largo camino. Cada paso que he dado, que doy y que daré será por ti. VI Contenido 1. Introducción ...................................................................................................................... 1 1.1. Cáncer de pulmón ......................................................................................................... 1 1.2. Biomarcadores, Medicina personalizada y Cáncer ......................................................... 1 1.3. Genes implicados en CPNM ........................................................................................... 2 1.3.1. Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) .............................................. 2 1.3.2. Cinasa del linfoma anaplásico (ALK) ........................................................................... 4 1.3.3. Otros oncogenes o genes supresores de tumores ...................................................... 4 1.4. Tratamiento con Inhibidores tirosina cinasa (ITK) .......................................................... 5 1.5. Detección de biomarcadores ......................................................................................... 7 1.5.1. Detección de mutaciones en EGFR ............................................................................. 7 1.5.2. Detección de reordenamientos en ALK ...................................................................... 7 1.6. Secuenciación masiva .................................................................................................... 8 1.7. Secuenciación dirigida en CPNM .................................................................................... 9 2. Objetivos ......................................................................................................................... 10 3. Material y métodos ......................................................................................................... 10 3.1. Muestras ..................................................................................................................... 10 3.2. Extracción de ácidos nucleicos ..................................................................................... 11 3.2.1. Extracción de ADN ................................................................................................... 11 3.2.2. Extracción de ARN ................................................................................................... 12 3.3. Cuantificación de ácidos nucleicos ............................................................................... 12 3.4. Detección de mutación mediante PCR en tiempo real (plataforma Cobas®) ................. 13 3.5. Detección de mutación mediante PCR convencional y Secuenciación directa............... 15 3.6. Detección de mutación mediante secuenciación masiva (plataforma PGM®) ............... 16 3.6.1. Genoteca de ADN .................................................................................................... 16 3.6.2. Genoteca de ARN .................................................................................................... 17 3.6.3. Combinar librerías ................................................................................................... 18 VII 3.6.4. PCR en emulsión ...................................................................................................... 18 3.6.5. Enriquecimiento de la muestra en esferas con PCR clonal ........................................ 19 3.6.6. Carga del Chip y Secuenciación ................................................................................ 19 3.7. Análisis bioinformático ................................................................................................ 20 4. Resultados ...................................................................................................................... 20 4.1. Resultados obtenidos mediante PCR en tiempo real (plataforma Cobas®) .................. 20 4.2. Confirmación de resultados mediante secuenciación directa ....................................... 21 4.3. Estudios de secuenciación masiva mediante PGM ....................................................... 24 4.3.1. Mutaciones en el panel de ADN ............................................................................... 24 4.3.2. Traslocaciones en el panel de ARN ........................................................................... 27 4.4. Comparación de resultados entre los métodos moleculares empleados ...................... 27 5. Discusión ......................................................................................................................... 29 5.1. Comparación qPCR, secuenciación directa y NGS ......................................................... 29 5.2. Impacto de la tecnología de NGS ................................................................................. 31 6. Conclusiones ................................................................................................................... 33 7. Referencias ..................................................................................................................... 35 7.1. Bibliografía .................................................................................................................. 35 7.2. Recursos Web ............................................................................................................. 40 8. Anexos ............................................................................................................................ 41 8.1. Anexo I: Muestras procedentes de un mismo paciente ................................................ 41 8.2. Anexo II: chips empleados para la secuenciación mediante PGM ................................. 42 8.3. Anexo III: Mutaciones detectadas mediante secuenciación en el PGM......................... 43 8.4. Anexo IV: Resultados de la secuenciación de los transcritos......................................... 46 VIII Índice de Figuras Figura 1 - Rutas de señalización implicadas en el CPNM mediante activación por EGFR Figura 2 - Ejemplos de estructura química de ITK y su unión a sus dianas Figura 3 - Deaminación oxidativa de la citosina en muestras FFPE Figura 4 - Esquema de la carga de una placa de 96 pocillos para el Cobas 480z Analyzer Figura 5 - Gráfico de sectores de los resultados obtenidos mediante Cobas Analyzer Figura 6 - Captura con todas las bandas de los geles realizados para testar las PCRs destinadas a secuenciación directa Figura 7 - Electroferogramas de las regiones de interés de los exones 18, 19, 20 y 21 de las muestras y un control negativo (wt), obtenidos mediante secuenciación directa Figura 8 - Distribución de las mutaciones identificadas en EGFR a lo largo de todas las muestras de NGS Figura 9 - Heatmap de las mutaciones de las muestras analizadas mediante PGM con el Oncomine Solid Tumor DNA kit Figura 10 - Distribución de las mutaciones localizadas en KRAS mediante NGS Figura 11 - Alineamientos de las lecturas obtenidas de dos de las muestras conflictivas Índice de Tablas Tabla 1 - Mutaciones de EGFR detectadas mediante la plataforma Cobas Tabla 2 - Cebadores empleados para los distintos exones del gen EGFR (18, 19, 20 y 21) Tabla 3 - Comparación de los resultados obtenidos mediante las técnicas de análisis del gen EGFR. IX Listado alfabético de las abreviaturas empleadas ADN – Ácido desoxirribonucleico ALK – Anaplastic Lymphoma receptor Kinase ARN – Ácido ribonucleico ATP – Adenosin Trifosfato BTC – Betacelulina ct – circulating tumor COLD - co-amplification at lower denaturation temperature CP – Cáncer de pulmón CPM – Cáncer de pulmón microcítico CPNM – Cáncer de pulmón no microcítico DNA – Deoxyribonucleic acid EGF – Epithelial Growth Factor EGFR – Epidermal Growth Factor Receptor EML4 – Echinoderm Microtubule associated protein-like 4 EMTTransición Epitelio Mesenquimal FFPE – Formalin-fixed, Paraffin-embedded FISH – Fluorescence In Situ Hybridization GTP –Guanidin Trifosfato HPLC – High Pressure Liquid Chromatography HRM – High Resolution Melting HUyP – Hospital Universitario y Politécnico ISP – Ion Sphere Particle JAK – Janus Kinase MAP – Mitogen Activated Protein mi - micro NCI – National Cancer Institute 6 tratamiento sea mucho más eficaz. Destaca el Afatinib, el cual se une covalentemente al residuo p.C797 del dominio TK cuando está activo. Esta unión se establece mediante la formación de un enlace entre la amida del compuesto y el grupo sulfuro de la cisteína (Solca et al., 2012).  3ª generación: frente a la aparición de la mutación p.T790M en EGFR, se han desarrollado fármacos capaces de superar y aprovecharse de esta mutación. Recientemente aprobado se encuentra el compuesto AZD9291 (Cross et al., 2014), un compuesto mono-anilinopirimidínico. Esta molécula presenta una notable afinidad por las moléculas de EGFR con el cambio p.T790M, uniéndose irreversiblemente en el sitio de unión del ATP mediante un enlace covalente al residuo p.C797. Debido a los tratamientos con ITK tanto de 1ª como de 2ª generación en pacientes con EGFR mutado, las células desarrollan resistencia al tratamiento mediante la aparición de una mutación en el codón 790, en concreto la p.T790M, que reduce drásticamente la afinidad de los fármacos por EGFR mutados, encontrándose en el 50% de los casos. La mutación produce un aumento de la afinidad por el ATP, reduciendo la que presentaba por los ITK. Otros mecanismos de resistencia incluyen la amplificación de EGFR (8%), mutaciones activantes en el gen PIK3CA (5%), amplificación del gen MET (5 -19%) y sobreexpresión del ligando GAS6 y su receptor AXL (25%). De esta forma, la célula tumoral es capaz de mantener la “adicción” a esta señalización (Garraway y Jänne, 2012; González de Castor et al., 2015). Recientemente, se han reportado casos de resistencia a inhibidores de tercera generación a través de mutaciones que afectan a la unión covalente del inhibidor a la molécula (Yu et al., 2015) o mediante alguno de los mecanismos ya citados, como la amplificación de MET (Planchard et al., 2015) Figura 2: Ejemplos de estructura química de ITK y su unión a sus dianas. (A) - Estructura 2D del Gefitinib y unión por interacciones débiles al dominio tirosina cinasa de un EGFR con mutación activante (PDB code 3UG2). (B) - Estructura 2D del Erlotinib y estructura 3D de la interacción con un EGFR con mutaciones activantes (PDB code 4HJO). (C) - Estructura 2D del Afatinib y estructura 3D de su unión covalente a p.C797 (en color naranja) a EGFR con la mutación p.T790M (PDB code 4G5J).Tomada de Gonzalez de Castro et al. (2012) Asimismo, los pacientes con CPNM portadores de traslocaciones en ALK poseen una medicina de precisión con ITK (Crizotinib). También se han descrito mecanismos de resistencia a 7 Crizotinib en las células con formas aberrantes de ALK, los cuales son muy parecidos a los de EGFR en cuanto a fundamento: la estrategia se basa en seguir manteniendo la actividad pese a la presencia del inhibidor. Así, ALK adquiere resistencia mediante amplificación génica, mutaciones en el dominio tirosina cinasa que reduzcan la afinidad de la molécula por el inhibidor o la aparición de nuevos oncogenes driver que permitan mantener el fenotipo tumoral (Doebele et al., 2012; Garraway y Jänne, 2012). 1.5.Detección de biomarcadores 1.5.1. Detección de mutaciones en EGFR Algunos de los métodos empleados en el diagnóstico y determinación de las principales mutaciones en el gen EGFR son (Lindeman et al., 2013):  Detección durante la PCR: la qPCR o la amplificación específica de alelo son técnicas que permiten detectar con una simple amplificación del gADN la presencia de mutaciones específicas.  Detección post-PCR: la electroforesis capilar, la Next Generation Sequencing (NGS) o la pirosecuenciación son técnicas que permiten saber con precisión, a partir de una muestra previa y adecuadamente amplificada, cuál es la mutación que ha sucedido. Entre ellas variará la sensibilidad de cada método.  Escaneo de mutaciones: el High Resolution Melting (HRM) o el High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) en condiciones desnaturalizantes van a permitir ver si una muestra presenta o no mutación. Aunque estas técnicas solo informan de si hay mutación o no, permiten descartar las muestras no mutadas antes de procesarlas por otra técnica para identificar la mutación.  Enriquecimiento del alelo mutante: la co-amplification at lower denaturation temperature (COLD) PCR o la Peptide Nucleic Acid (PNA) Amplification pueden ser técnicas útiles cuando la muestra carece de una población tumoral elevada. Mediante la amplificación favorable (no específica) de la variante mutada, se pretende igualar las proporciones de ADN mutado y ADN wild-type (wt). 1.5.2. Detección de reordenamientos en ALK Para la detección de los transcritos de fusión del gen ALK, se emplean actualmente las siguientes técnicas (Tuononen et al., 2013):  Fluorescence In Situ Hybridization (FISH): mediante el empleo de parejas de sondas (sondas de rotura), se visualiza si ambas están lo suficiente separadas debido a la presencia de un reordenamiento. El par de sondas está diseñada para detectar reordenamientos concretos.  Real-Time PCR: partiendo del ADNc de la muestra, se puede emplear cebadores y sondas que permitan detectar si existe amplificación o no de un reordenamiento 8 concreto. Es importante definir a partir de que ciclo umbral (Ct) se considera que se ha producido el reordenamiento.  Inmunohistoquímica: este ensayo se dirige hacia la proteína aberrante, empleando para ello una muestra fijada y un anticuerpo monoclonal dirigido específicamente contra ALK aberrantes.  Secuenciación masiva o Next-Generation Sequencing (NGS): el uso de los cebadores adecuados permite la secuenciación de cualquier forma de ALK. La secuenciación puede ir dirigida tanto contra el ADN como contra los transcritos. Hay que tener en cuenta que en un único análisis podemos secuenciar también otros genes de interés. 1.6.Secuenciación masiva El desarrollo de las tecnologías de secuenciación de ADN ha permitido un gran avance desde la secuenciación del primer genoma humano, en el cual fue necesaria la intervención de numerosos grupos de investigación y la inversión de un gran capital y de tiempo. En la actualidad, la secuenciación de un genoma humano requiere mucho menos tiempo y es mucho menos costosa (Bubnoff, 2008; Tucker et al., 2009). En la última década, se ha demostrado que el cáncer puede ser debido al exceso de actividad de las proteínas derivadas de oncogenes o a la ausencia de los denominados TSG, desembocando en que la célula adquiera características tumorales. Es necesario, por tanto, identificar y distinguir las mutaciones que aparecen en los tumores, y, teniendo en cuenta la inestabilidad genómica característica de los tumores, cuáles de ellas dotan a los tumores de su fenotipo (mutaciones drivers) y cuáles no (mutaciones passenger) (Volsteing et al., 2013). El desarrollo tecnológico de la secuenciación de última generación (NGS) nos permite obtener toda esta información tanto a nivel de whole genome sequencing (WGS), whole exome sequencing (WES) o incluso targeted sequencing. En general, el fundamento de todas las NGS es la capacidad de llevar millones de reacciones de amplificación de cadena de forma paralela junto a un método de identificación del nucleótido introducido en la cadena (Bubnoff, 2008). Así, la pirosecuenciación introduce nucleótidos en cada ciclo, detectando luz en un pocillo solo si se incorpora a la cadena; la secuenciación mediante terminadores de Ilumina detecta el fluoróforo del dNTP introducido en cada spot de cadenas sobre un chip (Tucker et al., 2009); y la secuenciación por semiconductores introduce un dNTP en cada ciclo, detectando la incorporación del nucleótido a través de las variaciones de pH producidas en la polimerización (ThermoFisher, 2014). Algunas ventajas presentadas por las NGS son que permiten generar gran cantidad de información bajo un mismo procedimiento; necesitan muy poca muestra para proceder, pudiendo algunas partir de 10ng de muestra en condiciones adecuadas para generar una secuencia consistente, y el tiempo empleado en la reacción es menor que la determinación de cada uno de los biomarcadores individualmente (Tucker et al., 2009; Hovleson et al., 2015). Pero también vamos a encontrar algunas dificultades en el empleo de las NGS: protocolos y técnicas que requieren de personal con experiencia y preparados, incapacidad de distinguir las mutaciones driver de las passenger ante la presencia de nuevas mutaciones, entender cómo la 9 mutación afecta a la actividad de la proteína o la pérdida de datos durante el procesado debido a errores informáticos (Tucker et al., 2009; Volsteing et al., 2013; Raphael et al., 2014). 1.7.Secuenciación dirigida en CPNM Cuando se secuencia el genoma de un paciente con una determinada enfermedad, existen estudios previos de qué alteraciones están relacionadas con la enfermedad del paciente. En un caso como este, no es necesario secuenciar los más de 25.000 genes humanos, siendo más útil enfocar la secuenciación en los genes ya previamente correlacionados con la patogénesis. Estas propuestas de secuenciación, denominadas en general como Targeted Sequencing, pretenden extraer únicamente la información necesaria o solicitada del genoma a secuenciar. En la actualidad, gracias a la labor de consorcios internacionales como el The Cancer Genome Atlas (TCGA) o a bases de datos como Oncomine (Rhodes et al., 2007), se conocen todo tipo de alteraciones relacionadas con determinados tipos de cáncer. En función de las necesidades de información a obtener, la muestra requerida y las capacidades de los equipos, entre otros factores, en oncología se plantean varios tipos de ensayos (Hovelson et al., 2015):  Secuenciación del genoma, exoma o transcriptoma  Paneles basados en hibridación  Paneles basados en amplificación mediante PCR Uno de los kits disponibles en el mercado, para la plataforma PGM de Ion Torrent (ThermoFisher, USA), es el de Oncomine Solid Tumour DNA kit (ThermoFisher, USA). Este kit permite la secuenciación de una serie de 22 genes implicados tanto en CP como cáncer de colon. Alfabéticamente, estos genes son: AKT1, ALK, BRAF, CTNNB1, DDR2, EGFR, ERBB2, ERBB4, FBXW7, FGFR1, FGFR2, FGFR3, KRAS, MAP2K1, MET, NOTCH1, NRAS, PIK3CA, PTEN, SMAD4, STK11, TP53. Estos genes son testados a través de 92 amplicones que permiten un Targeted sequencing a partir de 10 ng de gADN del paciente. Para la secuenciación del ARN, existe el panel Oncomine Solid Tumour Fusion Transcript (ThermoFisher, USA), el cual permite, a través de 85 amplicones, determinar la presencia de diferentes transcritos de fusión de los genes ALK, RET, ROS1 y NRTK1 a partir de 10 ng de ARN extraído de las células del paciente. El CPNM es una enfermedad heterogénea, donde coexisten tumores formados a través de distintas vías de carcinogénesis y, como se ha comentado, el tratamiento personalizado del CPNM se dirige a través del estatus mutacional del gen EGFR o reordenamientos de ALK. La presencia de estas alteraciones identifica a pacientes con tumores de pulmón sensibles al tratamiento con ITK. Sin embargo, aproximadamente un 20-25% de los pacientes así seleccionados no responden a la terapia. La respuesta a esta divergencia debe buscarse en la heterogeneidad intratumoral, en la diversidad entre el tumor primario y sus metástasis, y en la sensibilidad de los métodos empleados para identificar las mutaciones. El cáncer es un proceso dinámico y es en este contexto en el que se deben considerar los conceptos de evolución clonal y heterogeneidad intratumoral, así como valorar la repercusión clínica que conllevan en una aproximación personalizada del tratamiento de esta enfermedad, creemos que 10 tecnologías como la secuenciación masiva pueden ofrecer información relevante para adecuar el tratamiento del paciente. 2. Objetivos Este Trabajo Final de Grado pretende comparar los diferentes métodos actuales empleados en CPNM en la labor asistencial del Laboratorio de Biología Molecular del Hospital Universitario y Politécnico La Fe (HUyP) y discutir el alcance y las limitaciones de cada uno de ellos. Para la consecución de este fin, se proponen los siguientes objetivos:  Determinación de las alteraciones moleculares en el gen EGFR en pacientes con CPNM mediante la utilización de tres métodos: Secuenciación directa, qPCR mediante Cobas Analyzer y targeted sequencing mediante Personal Genome Machine (PGM; ThermoFisher, USA).  Comparación de la concordancia de los resultados obtenidos a través de los diferentes métodos empleados. 3. Material y métodos 3.1.Muestras Las muestras empleadas para este estudio retrospectivo corresponden a biopsias sólidas de tumores localizados en pulmón o de posibles metástasis de los mismos de pacientes atendidos por el Servicio de Oncología Médica del HUyP La Fe entre los años 2015-2016.Todas estas muestras han sido autorizadas para su empleo en este proyecto a través del consentimiento informado y firmado por los pacientes, mediante el cual ceden el excedente de muestra tras finalizar el análisis para su uso en investigación, autorizado por el Comité de Ética del Hospital La Fe. Tras la toma de la biopsia, el servicio de Anatomía Patológica se ha encargado de la conservación de la muestra, mediante fijación en formol e inclusión en bloques de parafina (Formalin-fixed, Paraffin-embedded (FFPE)) y han realizado los cortes de 5-10m necesarios para los estudios moleculares en ADN y ARN. Los requisitos de representación tumoral (>50%) y celularidad tumoral total (> 150-300 células) han sido establecidos por el patólogo responsable en todos los casos. El Laboratorio de Biología Molecular del Servicio de Análisis Clínicos del HUyP La Fe ha recibido un total de 40 muestras para este estudio. Como algunas muestras correspondían a segundas biopsias o metástasis (Anexo I), el total de pacientes es de 36. Aquellas muestras pertenecientes a un mismo paciente, han sido identificadas por números con misma parte entera pero diferente decimal referenciando orden de llegada. 11 3.2.Extracción de ácidos nucleicos 3.2.1. Extracción de ADN El ADN de las muestras es aislado mediante el GeneRead DNA FFPE kit (QUIAGEN, Alemania). En el laboratorio se reciben cortes o “punchs” de la muestra parafinada. A cada muestra a extraer se le añade un volumen superior a 160l de Solución de Desparafinado que cubra la muestra. Tras vortear, se incuban a 56ºC unos 3min. Antes de añadir 100l a cada muestra de una mezcla compuesta de 55l RNase-Free wáter, 25l Buffer FTB y 20l de proteinasa K, se espera a que la muestra se atempere. Una vez añadido y vorteado, se deja calentar toda la noche a 56ºC. A primera hora de la jornada, se traspasa a un bloque ya caliente a 90ºC durante una hora. Sin exceder el tiempo, se retira y se da un golpe de centrífuga a la muestra. Se observará una fase superior azul con la parafina y una transparente inferior. Esta segunda fase se transferirá un nuevo tubo de 1,5 ml. Se añaden 115 l de RNase-Free water y 35 l de Uracil-N-Glycolasa, un enzima que revierte las modificaciones de las citosinas causadas por el proceso de inclusión en parafina (Figura 3). La mezcla se incuba a 50ºC durante una hora. A continuación, se añaden 2l de RNase A y se deja incubar 2 min a Tª ambiente. Al pasar el tiempo, se añaden 250l de Buffer AL y 250l de etanol puro. Tras vortear y dar un golpe de centrífuga, se pasa un máximo volumen de 700 l por una columna de purificación. Si hubiera un exceso, debería emplearse una segunda columna. Se centrifuga un minuto a máxima velocidad (13000 rpm apróx.) y se descarta el fluido. A continuación se lava la muestra tres veces, añadiendo una solución y centrifugando a máxima velocidad durante un minuto, descartando después el fluido filtrado. Primero se lava con 500l de Buffer AW 1 y luego con 500 l de Buffer AW 2. La columna se transfiere a un tubo nuevo para eliminar posibles residuos mediante centrifugación. Finalmente, se pasa la columna a un nuevo tubo de 1,5 ml, y se le añaden 30 l de Tris-EDTA (pH 7,5, Tris 10 mM, EDTA 1 mM). Tras una breve incubación, se centrifuga un minuto a máxima velocidad y se descarta la columna. Se realizarán dos eluciones en dos tubos diferentes. Figura 3: Deaminación oxidativa de la citosina en muestras FFPE. El ambiente en el que se encuentra una muestra FFPE da lugar a esta modificación química. Este cambio producirá un mismatch en la cadena, que en el momento de una PCR dará lugar a la fijación de la mutación C>T. Tomada de www.quiagen.com. 12 Con el fin de conservar el ADN adecuadamente, el volumen se traspasa a tubos de 200 l debido a su comodidad para el almacenamiento. En caso de uso inmediato, las muestras se conservan a 4ºC no más de una semana. Para tiempos más prolongados se mantienen en congeladores a -80ºC. 3.2.2. Extracción de ARN El ARN se extrae a partir de cortes procedentes del mismo bloque de parafina que el ADN correspondiente a la misma muestra. Para su extracción, se emplea el RecoverAllTM Total Nucleic Acid Isolation Kit (ThermoFisher, USA). El proceso se inicia con la adición de un mínimo de 100l de Solución de desparafinado que recubran completamente la muestra y calentándolo a 50ºC durante 3 min. Se añaden 100l de Digestion Buffer y se vortea todo el contenido del tubo. En la fase transparente que se forme, se añadirán los 4l de Protease y se mezcla por pipeteo. Se incuba en bloque seco 3 h a 50ºC y 15 min a 80ºC. Durante el proceso, se prepara un mix que contendrá un volumen de 395l por tubo, componiéndose de 120 l de Isolation aditive y 275l de etanol puro. Se añade el volumen a cada tubo, y se mezcla por pipeteo. La mezcla se pasa por una columna de purificación, mediante centrifugación 30 s a 10000 rpm. A continuación, se realiza un primer lavado añadiendo 700l de Wash 1, centrifugando 30 s a 10000 rpm y descartando el filtrado. El lavado se repite una vez con 500l de Wash 2/3 y una última vez sin añadir solución de lavado para eliminar los restos que hayan quedado en la columna. En este paso de la extracción, la columna retiene ADN y ARN. Para conservar el ARN, se añade a cada columna 60l de una solución compuesta por 6l de 10X DNase Buffer, 4l de DNasa y 50 l de agua libre de RNasas. Se deja incubar en la membrana 30 min a Tª ambiente. Para eliminar la DNasa, se repiten los lavados con 700 l de Wash 1, dos veces con 500 l de Wash 2/3 y un último lavado sin solución para descartar los desechos restantes. Para eluir la muestra, se transfiere la columna a un nuevo tubo, se adicionan 30 l de agua libre de nucleasas y se incuba 5-10 min antes de centrifugar un minuto a máxima velocidad. El ARN se conserva a -80ºC mientras no vaya a ser empleado. En caso de que se vayan a hacer librerías de ARN en el mismo día, se conserva a 4ºC hasta que se inicia la reacción. 3.3.Cuantificación de ácidos nucleicos Para conocer la cantidad y calidad de ADN, las muestras son cuantificadas mediante Qubit 3.0 fluorometer (ThermoFisher, USA). Debido a la concentración con las que se obtienen las muestras tras la extracción, se emplea el Qubit dsDNA HS Assay kit (ThermoFisher, USA). El primer paso del ensayo será preparar solución de trabajo para dos estándares y dos cuantificaciones por muestra a partir de 1 l de Qubit dsDNA HS reagent diluido en 199 l de dsDNA HS buffer. Una vez preparado, se guarda en oscuridad. Los estándares se preparan añadiendo 10 l de cada estándar a 190 l de solución de trabajo. Nada más iniciar el Qubit 3.0 fluometer e indicar que queremos cuantificar dsADN, en primer lugar se requiere calibrar el aparato midiendo la concentración en ambas soluciones conforme lo solicite. Para preparar las 13 muestras, se diluye 1 l de esta en 199 l de solución de trabajo. Rápidamente, se coloca la muestra en el aparato y se determina la concentración del ADN extraído. Para cuantificar ARN, se utiliza el Qubit RNA HS Assay kit (ThermoFisher, USA), siguiendo el mismo protocolo pero con los reactivos correspondientes del kit. 3.4.Detección de mutación mediante PCR en tiempo real (plataforma Cobas®) La determinación de la presencia de mutaciones en los exones 18 a 21 del gen EGFR se realizará mediante el kit Cobas EGFR Mutation test v2 (Roche, Suiza). A partir del ADN extraído, se preparan diluciones de la muestra para obtener una concentración de 2 ng/l en un volumen mínimo de 90 l. Las diluciones se realizan con el Speciment Diluent del kit, en base a una planilla que realiza los cálculos de los volúmenes necesarios. En caso de que las muestras excedan los 70 ng/l, para no malgastar Speciment Diluent, se trabaja como si no excediera el límite y se emplean 5l de muestra y 170 l de diluyente. Una vez preparadas, se enciende el Cobas 480z Analyzer con la finalidad de inicializar el aparato. Se preparan 3 mixes de las tres soluciones del kit, mezclándose 20 l del MMX1, MMX2 o MMX3 con 5 l de MGAC. Para cada mix se preparan 75 l más 25 l por muestra. A continuación se carga la placa adecuadamente (Figura 4). Una vez cargada, se sella la placa con un adhesivo y se carga en el Cobas 480z Analyzer. Por último, se termina de configurar el ensayo indicando el kit empleado, las muestras a analizar y la identificación de las mismas. El instrumento reportará tras hora y media de reacción las mutaciones detectadas, aunque sin indicar la posición correspondiente en el ADNc. En la tabla 1 se indican las mutaciones detectadas con el kit. Figura 4: Esquema de la carga de una placa de 96 pocillos para el Cobas 480z Analyzer. En orden, se llenarán dos pocillos más el equivalente al número de muestras con 25 l de MMX1 (rojo), MMX2 (amarillo) y MMX3 (verde). Los pocillos A1, A2 y A3 (negro) se llenan con el control Mutado, los B1, B2 y B3 (marrón) con Speciment Diluent, y los siguientes grupos de tres (C1, C2 y C3; D1, D2 y D3…) con 25 l de la muestra preparada 14 Tabla 1: Mutaciones de EGFR detectadas por Cobas EGFR Mutation test v2 Exón Mutación en EGFR Variación en el gen EGFR COSMIC ID Exón 18 G719X 2156G>C 6239 2155G>A 6252 2155G>T 6253 Exón 19 Ex19Del 2240_2251del12 6210 2239_2247del9 6218 2238_2255del18 6220 2235_2249del15 6223 2236_2250del15 6225 2239_2253del15 6254 2239_2256del18 6255 2237_2254del18 12367 2240_2254del15 12369 2240_2257del18 12370 2239_2248TTAAGAGAAG>C 12382 2239_2251>C 12383 2237_2255>T 12384 2235_2255>AAT 12385 2237_2252>T 12386 2239_2258>CA 12387 2239_2256>CAA 12403 2237_2253>TTGCT 12416 2238_2252>GCA 12419 2238_2248>GC 12422 2237_2251del15 12678 2236_2253del18 12728 2235_2248>AATTC 13550 2235_2252>AAT 13551 2235_2251>AATTC 13552 2253_2276del24 13556 2237_2257>TCT 18427 2238_2252del15 23571 2233_2247del15 26038 Exón 20 S768I 2303G>T 6241 T790M 2369C>T 6240 Ex20Ins 2307_2308ins9GCCAGCGTG 12376 2319_2320insCAC 12377 2310_2311insGGT 12378 2311_2312ins9GCGTGGACA 13428 2309_2310AC>CCAGCGTGGAT 13558 Exón 21 L858R 2573T>G 6224 2573_2574TG>GT 12429 L861Q 2582T>A 6213 15 3.5.Detección de mutación mediante PCR convencional y Secuenciación directa En el presente proyecto, las muestras que han dado positivo para una mutación en Cobas han sido confirmadas mediante secuenciación directa. Para ello se realiza la amplificación del exón que presenta la mutación. La PCR se realiza mediante el kit Type-it mutation detection (Roche, USA). Cada tubo de reacción se compondrá de 12,5 l de Type-it multiplex PCR master mix X2, 2,5l de Q-solution X5, 0,5 l del cebador forward del exón correspondiente y 0,5l del cebador reverse, ambos a una concentración 10M (Tabla 2), y un volumen de 9 l compuesto por el volumen necesario de muestra para alcanzar 100ng de muestra y Rnase-Free water hasta completar el volumen. Por cada grupo de muestras analizadas simultáneamente (2 a 4), se preparara un blanco en el que los 9l serán agua para comprobar que no hay contaminación y un control negativo previamente testado en el que no se detecte ninguna mutación. La PCR consta de los siguientes pasos: Desnaturalización inicial a 95ºC durante 5 minutos; 40 ciclos, cada uno de ellos compuesto por Desnaturalización a 95ºC 45s, Hibridación a 57ºC 45s y Elongación a 72ºC 1min; Extensión final a 72ºC durante 10 min. Tabla 2: Cebadores empleados para los distintos exones del gen EGFR. Exón Sentido Secuencia Tª (ºC) Amplicón (pb) 18 Forward CAAGTGCCGTGTCCTGGCACCCAAGC 57 372 Reverse CCAAACACTCAGTGAAACAAAGAG 57 19 Forward GCAATATCAGCCTTAGGTGCGGCTC 57 366 Reverse CATAGAAAGTGAACATTTAGGATGTG 57 20 Forward TTTGAAACTCAAGATCGCATT 57 368 Reverse CATATCCCCATGGCAAACTC 57 21 Forward CAGCCATAAGTCCTCGACGTGG 57 372 Reverse CATCCTCCCCTGCATGTGTTAAAC 57 Una vez finalizada la PCR, se comprueba que la amplificación haya sido correcta mediante electroforesis en gel de agarosa. Para ello, se diluye la muestra con agua en proporción 3:17. También se prepara una dilución 1:9 del marcador de pesos moleculares TrackIt 50 bp Ladder DNA (ThermoFisher, USA). Con las diluciones listas, se coloca el gel E-gel Ex 2% agarose (ThermoFisher, USA) en el E-Gel Agarose System (ThermoFisher, USA). El gel, consta de 11 pocillos, uno para el marcador y el resto para muestras. Para cargar el gel, la dilución del marcador se pipetea directamente en el pocillo de la derecha. En cambio, antes de ser cargadas, las muestras se mezclan con 1l de tampón de carga. Una vez está listo el gel, se selecciona en el aparato el gel empleado y se deja correr durante 12 min. Una vez finalizado, se toma una imagen del gel. Una vez comprobado que la amplificación ha sido correcta, se prepara un nuevo tubo por cada muestra con 2 l del enzima ExoSAP y 8l del producto de PCR, incubado durante 15 min a 37ºC y 15 min a 80ºC. Tras este paso de eliminación de exceso de cebadores no consumidos en la PCR, se procede con la reacción de secuencia. Por cada tubo de muestra, se preparan dos tubos, uno para la secuencia forward y otro para la secuencia reverse. Cada tubo de la reacción 22 Figura 6: Captura con todas las bandas de los geles realizados para testar las PCRs destinadas a secuenciación directa. En todas las imágenes hay uno o dos negativos (-) que se ven claramente sin contaminación y el mismo número de muestras wt que muestran la amplificación de una secuencia sin mutar. (A) Bandas correspondientes al exón 18 de las muestras y el control. (B) y (C) Bandas correspondientes al exón 19 de las muestras y los controles. Se ve claramente en las muestras una doble banda, correspondiente a la deleción y a la secuencia wild type. (D) Bandas correspondientes al exón 20 de los controles y las muestras. (E) Bandas correspondientes al exón 21 de los controles y las muestras. Del total de los 18 exones amplificados, 17 mostraron (94,4%) alguna mutación. Todas las mutaciones detectadas para los exones amplificados vienen recogidas en la Tabla 3 y en la Figura 7. En las bandas producidas tras las electroforesis (Figura 6B y 6C) se ve una doble banda clara en aquellas muestras que han mostrado tener una deleción. En el caso de la muestra M03.1 (Figura 6B), donde la mutación no ha sido identificada mediante esta técnica, la banda superior es mucho menos intensa en comparación que las de las otras muestras con mutación en el exón 19. En relación con los resultados obtenidos con el Cobas, solo dos muestras no mostraron concordancia entre ambas técnicas. La primera de ellas (M18) corresponde a una muestra que mostró un cambio polimórfico en homocigosis en el exón 20, la cual resultó tener el cambio p.T790M según el análisis mediante Cobas y no mostrarlo en la secuenciación directa. Esta es la única muestra que posee el cambio polimórfico en homocigosis, habiéndose encontrado en heterocigosis en otras muestras analizadas que presentaban también la mutación p.T790M. El otro caso de no concordancia (M3.01) corresponde con una deleción del exón 19, el cual fue identificado mediante Cobas, pero no mediante la secuenciación directa. En el caso de M03.1, la repetición del proceso desde la amplificación de la muestra dio el mismo resultado. Al igual que con la tecnología Cobas, una de las muestras incluidas para su análisis no fue secuenciada mediante electroforesis capilar. 23 Figura 7: Electroferogramas de las regiones de interés de los exones 18, 19, 20 y 21 de las muestras y un control negativo (wt), obtenidos mediante secuenciación directa. (A) – Exón 18 de las muestras, mostrando los codones 709 y 719. (B) – Exón 19 de las muestras, con el electroferograma centrado en los codones 745 a 748. (C) – Exón de las muestras seleccionadas, mostrando la posición c.2361G y el codón T790. (D) – Exón 21 de las muestras positivas para este exón, con el electroferograma mostrando el codón 858. 24 4.3.Estudios de secuenciación masiva mediante PGM En total se ha realizado la secuenciación de 40 muestras empleando para ello 8 chips (Anexo II), en los que eran secuenciados simultáneamente el ADN y los transcritos de fusión de hasta 8 muestras. En total, se mapearon 15907996 lecturas de ADN con una media de 397700 lecturas por muestra, y 4841434 lecturas de ARN, con una media de 121036 lecturas por muestra. Según los criterios establecidos, dos muestras de ADN quedaron descartadas por no alcanzar el mínimo de lecturas requerido (100000), al igual que dos muestras de ARN (20000). Por tanto, se dispone de ADN válido de 38 muestras y ARN de 38 muestras, mientras que de ambas solo se dispone de resultados de 36 muestras. 4.3.1. Mutaciones en el panel de ADN En total, mediante PGM se han identificado un total de 102 mutaciones ubicadas en 13 genes diferentes: 19 en EGFR (18,62%), 1 en HER2 (0,98%), 2 En DDR2 (1,96%), 4 en MET (3,92%), 20 en KRAS (19,60%), 4 en PIK3CA (3,92%), 3 en BRAF (2,94%), 1 en AKT1 (0,98%), 1 en PTEN (0,98%), 1 en STK11 (0,98%), 1 en CTNNB1 (0,98%) y 45 en TP53 (44,11%). En el resto de los 10 (45,45%) genes del panel para ADN (FBXW7, ERBB4, NOTCH 1, SMAD4, NRAS, MAP2K1, FGFR1, FGFR2, FGFR3 y ALK) no se ha identificado mutación alguna (Anexo III). En la Figura 9 se representa como se distribuyen las mutaciones en las diferentes muestras. En el gen EGFR se han detectado mutaciones en 13 (32,5%) de las 40 muestras, pero dos de ellas no llegaban al número de lecturas establecido, de forma que han sido obviadas. Por tanto, solo se han detectado mutaciones en 12 (31,57%) pacientes de los 38 válidos. Tras el análisis, se han identificado un total de 19 mutaciones, compuestas por un total de 9 mutaciones diferentes: una vez las mutaciones p.E709K y p.G719C del exón 18; dos deleciones p.E746-A750del, 2 mutaciones puntuales (p.A750P y p.T751A) y una mutación compleja p.L747-P753delinsS del exón 19; los cambios p.T790M y p.C797S del exón 20; y la mutación p.L858R del exón 21 (Figura 8). Figura 8: Distribución de las mutaciones identificadas en EGFR a lo largo de todas las muestras de NGS. Solo se incluyen muestras que hayan sido valorables (más de 100000 lecturas). 25 Figura 9: heatmap de las mutaciones de las muestras analizadas mediante PGM con el kit Oncomine Solid Tumor ADN kit. En gris las muestras de metástasis. M01.1 M01.2 M02 M03.1 M04.1 M04.2 M05 M06 M07 M08 M09 M10 M11.2 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 M33 M34 M35 M36 89,5% TP53 50,0% KRAS 31,6% EGFR 10,2% MET 10,2% PIK3CA 7,9% BRAF 5,3% DDR2 2,6% CTNNB1 2,6% ERBB2 2,6% AKT1 2,6% PTEN 2,6% STK11 0,0% NOTCH1 0,0% ALK 0,0% ERBB4 0,0% FGFR1 0,0% FGFR2 0,0% FGFR3 0,0% NRAS 0,0% MAP2K1 0,0% FBXW7 0,0% SMAD4 26 En el oncogén KRAS se han identificado un total de 20 mutaciones en 19 de las muestras (50,0%). En total, todas esas mutaciones afectan a 4 codones: en el codón 12 se han observado 8 cambios p.G12C y 6 correspondientes a p.G12V, en la posición 13 se han encontrado 2 cambios p.G13D y una mutación p.G13E, en el 61 se han registrado 2 cambios p.Q61H y en el 58 un único cambio p.T58I (Figura 10). Este último cambio se ha detectado simultáneamente con un cambio p.G12C. De las 19 muestras portadoras de al menos una mutación en KRAS, solo 1 (2,6%) mostraba simultáneamente mutaciones en el gen KRAS y EGFR. Esta muestra (M29) poseía las mutaciones p.G12C en KRAS y, según la NGS, la mutación p.A750P en EGFR. Además, la biopsia procede de una metástasis detectada en el hígado. Figura 10: Distribución de las mutaciones localizadas en KRAS mediante NGS. Sólo se incluyen aquellas mutaciones de muestras validas. En el gen MET se han detectado 3 mutaciones diferentes en 4 pacientes (10,52%). Los cambios identificados han sido p.E168D en dos muestras, p.M362T en una y p.N375S en otra. El cambio p.M362T se da un paciente que también posee la mutación p.G12V en KRAS y uno de los dos casos con p.G168E es la misma muestra que posee mutación en KRAS y EGFR, comentada en el párrafo anterior. Mediante los filtros aplicados para el análisis de las mutaciones, en el gen TP53 de las 38 muestras validas se ha detectado el polimorfismo p.P72R (c.215C>G) en 33 de ellas. Descontando esta variante, se han encontrado 12 muestras (31,57%) con mutación, todas ellas diferentes. De estas 12, solo una de ellas es un cambio no puntual siendo responsable de un frame shift. En referencia al resto de genes, en AKT1 se ha encontrado la mutación p.D46E, en BRAF, p.V600E y p.G469V; en CTNNB1, la p.S37C; en DDR2, p.R260L y p.M441I; en ERBB2, p.I767M; en PIK3CA, la p.E542Q, la p.G1049R y la p.H1047L; en PTEN un patrón de splicing alternativo; y en STK11 un frame shift desde la posición p.P280. 27 4.3.2. Traslocaciones en el panel de ARN Del total de 40 muestras para las que se analizaron los transcritos de fusión, solo 2 no han alcanzado las 20.000 lecturas mínimas, resultando no valorables. Doce de las 38 muestras válidas han mostrado poseer alguna alteración, verificada mediante el programa de análisis o no. Los dos casos verificados poseen reordenamientos del gen ALK con distintos puntos de rotura, M14 posee el transcrito EML4(13)-ALK(20) y M25 el EML4(6)-ALK(20). Las restantes 10 muestras, son reordenamientos dudosos que están pendientes de confirmar por un método alternativo: 5 (13,15% de las muestras válidas) de ellas poseen reordenamientos en el gen ROS1 y las restantes 5 (13,15% de las muestras válidas) en el gen RET, sin que el software indique el partner con quien se reordenan. Existen claros indicios de que estos 10 casos de reordenamientos dudosos sean negativos al coexistir con alteraciones somáticas en otros oncogenes del panel de ADN. Las muestras con reordenamientos confirmados en ALK no han mostrado mutaciones en genes como EGFR o KRAS. En cambio, ambas muestras poseen mutación en TP53 y una de ellas posee un cambio en el gen DDR2. 4.4.Comparación de resultados entre los métodos moleculares empleados De las 14 muestras que han sido analizadas mediante Cobas, secuenciación directa y secuenciación masiva, dos de ellas han sido obviadas debido a las bajas lecturas obtenidas en la secuenciación masiva, lo que las convierte en no valorables. De las 12 restantes, 7 muestras (58,3%) han obtenido en los tres análisis resultados concordantes (Tabla 3). De los diferentes casos discordantes, el de la muestra M18 corresponde a una detección de la mutación p.T790M en el exón 20 mediante cobas, pero su no identificación mediante las otras dos tecnologías. En su lugar se identifica el polimorfismo c.2391G>A en homocigosis (p.Q787Q) mediante ambas tecnologías. En otros dos casos (M02 y M29), tanto Cobas como la secuenciación directa identifican una deleción en el exón 19, mientras que por secuenciación masiva solo se detecta una mutación puntual en el codón 750 (M29) o 751 (M02). En ambos sacos se examinó el archivo BAM generado tras la secuenciación mediante el programa Integrative Genome Viewer (IGV). En ambos casos se verificó la deleción correspondiente a cada secuencia y la ausencia de la mutación puntual que erróneamente había interpretado Ion Reporter. (Figura 11A y 11B). Otro de los casos discordantes (M32) fue debido a que la NGS no fue capaz de detectar la mutación p.L858R, detectada mediante Cobas y secuenciación directa. El último de los casos (M03.1) fue debido a que la secuenciación directa no detecto una mutación que tanto el Cobas como la NGS reconocieron. Posteriores repeticiones de la secuenciación directa de la muestra, tanto de la primera como de la segunda alícuota dieron el mismo resultado. 28 Tabla 3: Comparación de los resultados ofrecidos por las técnicas de análisis de EGFR. Cada línea corresponde a las mutaciones en un mismo exón. (MND – Mutación no detectada / (NV) - Muestra No Valorable / * - Muestra con discordancias) Muestra Exón Resultado Cobas Resultado Secuenciación directa Secuenciación masiva Resultado Mapped Reads M01.1 21 p.L858R p.L858R (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 519,807 M01.2 21 p.L858R p.L858R (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 554,289 20 p.T790M p.T790M (c.2369 C>T) p.T790M (c.2369 C>T) M02* 19 Ex19 del p.E746-T751delinsVA (c.2237-2253delinsTTGCT) p.T751A (c.2251A>G) 551,861 M03.1* 19 Ex19 del MND p.E746-A750del (c.2235-2249del) 518,364 M03.2 19 Ex19 del p.E746-A750del (c.2235-2249del) - 6,351 (NV) 20 p.T790M p.T790M (c.2369 C>T) - M04.1 21 p.L858R p.L858R (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 402,052 M04.2 21 p.L858R p.L858R (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 503,515 20 p.T790M p.T790M (c.2369 C>T) p.T790M (c.2369 C>T) M11.1 18 p.G719X p.E709K (c.2125 G>A) p.G719C (c.2155 G>T) - 47,478 (NV) M11.2 18 p.G719X p.E709K (c.2125 G>A) p.G719C (c.2155 G>T) p.E709K (c.2125 G>A) p.G719C (c.2155 G>T) 330,619 M12 21 p.L858R p.L858R (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 303,224 M18* 20 p.T790M MND [p.Q787Q (c.2361G>A)] MND [p.Q787Q (c.2361G>A)] 431,259 M29* 19 Ex19 del p.L747-A750delinsP (c.2238-2248delinsGC) p.A750P (c.2248G>C) 448,994 M31 10 Ex19 del p.E746-A750del (c.2235-2249del) p.E746-A750del (c.2235-2249del) 348,584 20 p.T790M p.T790M (c.2369 C>T) p.T790M (c.2369 C>T) M32* 21 p.L858R p.L858 (c.2573 T>G) p.L858R (c.2573 T>G) 300,795 Figura 11: alineamientos de las lecturas obtenidas de dos de las muestras conflictivas. (A) – Alineamientos de la secuencia del exón 19 de EGFR en M02. Se ve claramente la presencia de una deleción y del cambio ACA>GCT, este segundo reportado por el Ion Reporter. (B) – Alineamientos de la secuencia del exón 19 de EGFR en M51. Es posible ver la deleción y el cambio reportado (GCA>CCA) en una proporción reducida frente a la secuencia wt. A B 29 En el caso válido M04.2 con mutación en el exón 18, la secuenciación masiva y la secuenciación directa identificaron una segunda mutación: p.E709K (c.2125G>A) que no era reportada por Cobas. Del mismo modo, en M04.1 (mapped reads<100000), del mismo paciente, la secuenciación capilar detecta esta misma segunda mutación. 5. Discusión 5.1.Comparación qPCR, secuenciación directa y NGS El siguiente trabajo ha mostrado el desarrollo de tres aproximaciones para el estudio de las alteraciones del gen EGFR, importante para el tratamiento del CPNM (García-Foncillas et al., 2011; Gómez et al., 2012; Lindeman et al., 2013). En concreto, este trabajo pretende comparar dos métodos habituales de trabajo implantados en el Laboratorio de Biología Molecular del HUyP La Fe, como son la secuenciación directa y la detección mediante qPCR, con una nueva metodología como es la targeted sequencing mediante NGS, que poco a poco va implantándose en la clínica. En los años recientes, con la aparición e implantación de este tipo de tecnologías, ya se han realizado estudios que pretenden mostrar como las NGS pueden igualar e incluso aportar más información que tecnologías de uso en la rutina clínica (Chin et al., 2013; Tuononen et al., 2013; Cernomaz et al., 2016). Hemos presentado un porcentaje de mutación del gen EGFR del 35,0% (14/40) muy superior a la prevalencia mutacional descrita para este gen en pacientes con CPNM. Es necesario destacar que este trabajo no pretende establecer las prevalencias mutacionales de cada una de las alteraciones descritas en pacientes con CPNM. Por el contrario intenta poner a punto un nuevo método de análisis, como es la secuenciación masiva, e incorporarlo en la rutina asistencial. Por ello, ha sido necesario seleccionar muestras de pacientes cuyos resultados eran previamente conocidos. De las 12 muestras que presentaron mutaciones en EGFR mediante qPCR, se han encontrado discordancias con la secuenciación directa y con la NGS en 5 de ellas. Dos de ellas (M02 y M29) eran debidas a deleciones que a través de qPCR y de secuenciación directa fueron identificadas, pero la NGS no las reportaba. La revisión realizada en el IGV de ambas muestras (Figura 11 A y 11 B) muestra como la deleción sí está presente. La posible causa de que en ambas deleciones fueran reportadas como un cambio aminoacídico reside en el alineamiento realizado de la secuencia. Debido al funcionamiento del software Ion Reporter, cuando el programa analiza una posición concreta, intenta identificar una serie de variantes. Si no es capaz de encontrar alguna de las variantes que tiene predeterminadas, el programa no reporta que se haya producido una deleción. Debido a que en ambos casos aparecen varios nucleótidos alineados en mitad de la deleción, el programa no lo asocia a ninguna variante y no es capaz de reportar el cambio. Para futuros casos, será necesario proponer una mejora en el software de análisis que sea capaz de reconocer esta variación en el número de copias. En el caso concreto de EGFR, será importante una revisión manual de las secuencias generadas en 30 caso de que en el exón 19 se detecte un cambio que no sea una deleción, la variación más prevalente en dicha región (Lindeman et al., 2013). Otro de los casos de discordancia ha sido la muestra M03.1, en la cual no se detectaba mediante secuenciación directa la mutación detectada por qPCR y NGS. Analizando los resultados de la NGS se ha identificado que la frecuencia del alelo mutado era del 3,03% (Anexo III). Debido a que tanto la qPCR como la NGS presentan una elevada sensibilidad, la mutación ha podido ser identificada. En cambio, la secuenciación directa no es capaz de detectar porcentajes tan bajos, estableciéndose su límite de detección en torno al 25% (Garcia-Foncillas et al., 2011; Gómez et al., 2012). En un área como la oncología, y en concreto en muestras FFPE donde la población tumoral puede aparecer en muy baja proporción, la secuenciación directa puede ser fuente de falsos negativos, convirtiéndola en una tecnología susceptible de ser sustituida por otras de mayor sensibilidad. Por otro lado, también es importante la calidad de la muestra obtenida, en el caso de la M32, donde a partir de una misma extracción se habían generado dos eluciones, la mutación p.L858R solo se detectaba en la primera alícuota, evaluada tras obtener resultados negativos al analizar la segunda elución. En este sentido, siempre, la segunda elución va a ser de peor calidad, aunque en ocasiones es interesante disponer de este segundo volumen de muestra, la calidad puede comprometer los resultados de la prueba y llevar a falsos negativos. La última discordancia corresponde a un individuo (M18) homocigoto para el polimorfismo c.2361G>C (p.Q787Q) que mediante Cobas se detectó la mutación p.T790M, mientras que la secuenciación directa y la NGS no reportaron el mismo resultado. A nivel de ensayo, el desconocimiento de la composición de la sonda impide establecer claramente el motivo del error en la qPCR, aunque es posible que sea responsable de una mala hibridación de la sonda, favoreciendo el falso positivo. Se requerirían otro tipo de ensayos para comprobar tal hipótesis. Este polimorfismo (rs1050171) es una mutación germinal de alta prevalencia en la población (Cernomaz et al., 2016) que se encuentra tanto en personas sanas como en pacientes de CP, normalmente en heterocigosis. Un reciente estudio realizado por Koh et al. (2016) relaciona la presencia de esta mutación con un peor pronóstico en pacientes en etapas tempranas de CP de células escamosas. Los resultados obtenidos en el resto de muestras han sido concordantes entre los tres ensayos. Cabe resaltar como en las muestras en las que existe una segunda biopsia (salvo M03.1 y M03.2) la mutación detectada en la primera muestra es también detectada en la segunda. Incluso en los casos donde los resultados de la NGS no son valorables, la mutación es detectada. Fuera de la coincidencia, realmente no se puede considerar como válido el resultado por incumplimiento del criterio de las lecturas. Es importante destacar la aparición de la mutación p.T790M en algunas de las segundas biopsias. Esta mutación está relacionada con las resistencias a los ITK de primera generación y es capaz de ser superada por los de tercera generación. Denominada mutación gatekeeper, aparece en pacientes que están siendo tratados con ITK de primer generación, siendo posible que prevalezca por selección positiva (Gazdar, 2009). Apareciendo inicialmente en baja proporción, los test de baja sensibilidad no serían capaces de detectarla hasta que el tratamiento hace aumentar la población tumoral con la resistencia. Una vez más se destaca la necesidad de métodos 31 sensibles que nos permitan detectar las mutaciones en sus concentraciones más bajas. Actualmente, se está trabajando en métodos que permitan aumentar la sensibilidad (Zhao et al., 2016), así como que permitan detectar la mutación en otro tipo de muestras, como la biopsia líquida. Estas metodologías requieren mayor sensibilidad debido a la baja cantidad de circulating tumor ADN (ctDNA) que hay en la sangre (Murtaza et al., 2013; Jiang et al., 2015; Thress et al., 2015). 5.2.Impacto de la tecnología de NGS Mientras que la qPCR es un ensayo limitado por la especificidad de las sondas empleadas y la secuenciación directa por los amplicones seleccionados, la NGS está menos limitada en este sentido por la capacidad de multiplexar diversos amplicones que nos proporcionaran una información integral y más profunda del tumor a analizar. Por su parte, con una sonda de qPCR podemos testar una mutación o conjunto de mutaciones muy concretas, a veces sin ni siquiera conocer qué mutación estamos detectando. En cambio, las tecnologías de secuenciación permiten detallar cualquier variación en una secuencia, siempre y cuando esté en la suficiente cantidad para poder ser identificada por los detectores del aparato. En el caso de la secuenciación directa, esta sensibilidad es baja y en una misma electroforesis el número de amplicones analizados simultáneamente dependerá del número de capilares disponibles en el aparato. En la secuenciación masiva este inconveniente desaparece; la elevada sensibilidad de la tecnología y el poco requerimiento de muestra permiten que con poca cantidad de ADN se pueda detectar con facilidad cualquier mutación. Además, la naturaleza del proceso de generación de las librerías permite, por un lado, multiplexar el ensayo a través del uso de adaptadores identificativos, y por otro, analizar varios amplicones mediante el uso de varios pares de cebadores, que gracias a su posterior alineamiento, se pueden analizar a la vez sin miedo de que sean confundidos con regiones de secuencias que no es la correspondiente. Por estos motivos, la NGS se presenta como una tecnología potente desde la que un único ensayo nos permite obtener mucha más información que las otras tecnologías a la vez que alcanza una elevada sensibilidad. Así, en este estudio, además de las mutaciones existentes en EGFR, se han podido detectar mutaciones en otros 11 genes, así como traslocaciones y reordenamientos. Las mutaciones en el gen EGFR se han encontrado en un 31,6% de las muestras seleccionadas. Las deleciones en el exón 19 son consideradas mutaciones de clase I, mientras que las mutaciones puntuales como p.G719C o p.L858R son de clase II. Ambos tipos de mutaciones son consideradas activantes y afectan al dominio TK, generando un EGFR con mayor afinidad por el ATP. Estas mutaciones actúan como marcadores predictivos de respuesta a ITK, de forma que aquellos pacientes con estas mutaciones se podrán beneficiar de ellos (Gazdar, 2009). Es importante resaltar como en segundas biopsias de pacientes con estas mutaciones activantes (M01.2 y M11.2), han acabado manifestando la mutación p.T790M surgida como resistencia a estos tratamientos (Garraway y Jänne, 2012; González de Castor et al., 2015). Pero al igual que hay fármacos útiles que permiten superar esta mutación (ITKs de tercera generación), ya han surgido casos en los que han aparecido resistencias. Es el caso de la muestra de metástasis hepática M36, en el que se observa además la presencia de la mutación 38 (2013) Non-invasive analysis of acquired resistance to cancer therapy by sequencing of plasma DNA. Nature, 497: 108–112 OLIVIER, M.; HOLLSTEIN, M.; HAINAUT, P. (2010) TP53 Mutations in Human Cancers: Origins, Consequences, and Clinical Use. Cold Spring Harb Perspect Biol., 2(1): 1-13 PETRINI, I. (2015) Biology of MET: a double life between normal tissue repair and tumor progression. 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Anexos 8.1.Anexo I: Muestras procedentes de un mismo paciente Muestra Procedencia Mutaciones divergentes (EGFR) Mutaciones comunes (EGFR) M01.1 Pulmón (-) p.L858R M01.2 Pulmón p.T790M M03.1 Pulmón (-) p.E746-A750del M03.2 Mtx: Peritoneo p.T790M M04.1 Pulmón (-) p.L858R M04.2 Pulmón p.T790M M11.1 Pulmón (-) p.E709K, p.G719C M11.2 Pleura (-) 42 8.2.Anexo II: chips empleados para la secuenciación mediante PGM Chip Muestras Porcentaje de pocillos ocupados (%) Reads Totales Reads Validos Porcentaje de lecturas validas (%) Media de bases por Read (bp) 1 M01.1, M01.2, M02, M03.1, M03.2, M04.1, M04.2, M05 69 7841057 5121500 65,31 110 2 M10, M11.1, M11.2, M12, M13, M25 67 7536289 2673687 35,48 114 3 M15, M16, M17 67 7517968 4008658 53,32 115 4 M18, M19, M20, M21, M22 78 8775044 3579861 40,79 110 5 M06, M07, M08, M23, M24 77 8639955 3121595 36,13 111 6 M14, M26, M27, M28 49 7646706 3664597 47,92 113 7 M09, M29, M30, M32 50 7944207 3911866 49,24 112 8 M31, M33, M34, M35, M36 75 8468926 4014029 47,39 112 43 8.3.Anexo III: Mutaciones detectadas mediante secuenciación en el PGM (NV – No valorable) Muestra Procedencia Chip Nº Lecturas Gen Mutación Frecuencia alélica (%) M01.1 Pulmón 1 519,807 EGFR p.L858R 20,20 PIK3CA p.G1049R 19,35 M01.2 Pulmón 1 554,289 EGFR p.L858R 25,60 p.T790M 12,37 PIK3CA p.G1049R 26,60 M02 Pulmón 1 551,861 EGFR p.T751A 58,28 M03.1 Pulmón 1 518,364 EGFR p.E746-A750del 3,03 TP53 p.P72R 96,99 M03.2 Mtx: Peritoneo 1 6,351 NV NV (-) M04.1 Pulmón 1 402,052 EGFR p.L858R 11,00 TP53 p.P72R 95,23 M04.2 Pulmón 1 503,515 EGFR p.L858R 50,49 p.T790M 9,22 TP53 p.P72R 97,00 p.G105V 63,22 M05 Pulmón 1 524,024 PIK3CA p.H1047L 76,41 TP53 p.P72R 95,60 p.Y220C 66,34 M06 Pulmón 5 366,069 PTEN c.635-1G>C 28,34 TP53 p.P72R 84,10 p.R158L 69,93 M07 Pulmón 5 274,085 KRAS p.G12V 39,38 AKT1 p.D46E 42,31 TP53 p.P72R 96,02 p.Y163C 49,69 M08 Pulmón 5 292,515 KRAS p.Q61H 39,23 TP53 p.P72R 44,79 M09 Ganglio 7 298,611 KRAS p.G12C 23,67 TP53 p.P72R 97,77 M10 Pulmón 2 374,272 KRAS p.G13E 31,89 TP53 p.G154fs 20,37 M11.1 Pulmón 2 47,478 NV NV (-) M11.2 Pulmón 2 330,619 EGFR p.E709K 62,35 p.G719C 63,03 CTNNB1 p.S37C 44,51 TP53 p.P72R 53,80 M12 Pulmón 2 303,224 EGFR p.L858R 6,81 TP53 p.P72R 51,52 p.L194F 8,59 44 M13 Pulmón 2 404,913 KRAS p.G13D 17,05 TP53 p.P72R 42,47 p.V157F 25,13 M14 Pulmón 6 288,119 TP53 p.P72R 57,11 M15 Pulmón 3 561,364 BRAF p.V600E 3,20 TP53 p.P72R 97,84 M16 Pulmón 3 613,012 KRAS p.Q61H 13,14 BRAF p.V600E 5,13 TP53 p.P72R 97,70 M17 Pulmón 3 581,215 KRAS p.G12V 12,29 TP53 p.P72R 97,44 M18 Pulmón 4 431,259 EGFR c.2361G>C 100,00 BRAF p.G469V 26,23 TP53 p.P72R 38,16 M19 Pulmón 4 377,753 KRAS p.G12C 14,96 TP53 p.P72R 100,00 M20 Pulmón 4 389,443 MET p.M362T 52,90 KRAS p.G12V 27,50 STK11 p.P281fs 16,20 TP53 p.P72R 97,74 p.R248L 28,60 M21 Pulmón 4 359,729 KRAS p.G12V 25,00 TP53 p.P72R 97,75 M22 Mtx: cerebro 4 369,296 MET p.E168D 50,40 TP53 p.P72R 35,10 p.G154V 70,74 M23 Mtx: tejido linfoide 5 331,411 KRAS p.G12C 59,69 TP53 p.P72R 80,19 p.R273L 52,14 M24 Pulmón 5 327,735 KRAS p.G12C 8,63 TP53 p.P72R 100,00 M25 Pleura 2 362,708 DDR2 p.R260L 44,99 TP53 p.P72R 50,65 M26 Pulmón 6 326,226 KRAS p.G12V 6,00 TP53 p.P72R 55,02 M27 Pulmón 6 415,556 KRAS p.G12V 22,40 TP53 p.P72R 50,62 M28 Pulmón 6 335,933 ERBB2 p.I767M 9,90 DDR2 p.M441I 51,77 PIK3CA p.E542Q 7,69 TP53 p.P72R 98,07 p.V157F 9,82 M29 Mtx: Hígado 7 448,994 EGFR p.A750P 4,83 MET p.E168D 30,04 KRAS p.G12C 79,69 TP53 p.P72R 97,16 M30 Pulmón 7 443,395 KRAS p.G13E 45,12 TP53 p.P72R 98,01 M31 Pulmón 8 348,584 EGFR p.E746-A750del 42,18 45 p.T790M 23,44 TP53 p.P72R 100,00 M32 Pulmón 7 300,795 EGFR p.L858R 15,32 TP53 p.P72R 100,00 M33 Pulmón 8 540,709 KRAS p.G12C 16,03 M34 Pulmón 8 333,021 KRAS p.G12C 50,90 TP53 p.P72R 100,00 p.R249S 36,00 M35 Pulmón 8 445,948 KRAS p.Gly12Cys 28,34 p.Thr58Ile 2,45 TP53 p.Pro72Arg 100,00 M36 Mtx: Hígado 8 347,891 EGFR p.L747P753delinsS 51,00 p.T790M 12,50 p.C797S 12,50 MET p.N375S 77,00 TP53 p.P72R 78,55 46 8.4.Anexo IV: Resultados de la secuenciación de los transcritos (NV – No valorable) Muestra Chip Mapped Reads Traslocación identificada/validada M01.1 1 154,903 M01.2 1 157,106 M02 1 3,499 NV M03.1 1 121,073 M03.2 1 107,044 M04.1 1 29,839 M04.2 1 124,945 M05 1 153,58 M06 5 154,201 M07 5 120,828 M08 5 200,810 M09 7 177,102 M10 2 218,315 M11.1 2 221,595 M11.2 2 147,269 M12 2 291,415 M13 2 168,582 M14 6 144,357 EML4(13) - ALK(20) M15 3 113,784 M16 3 100,978 M17 3 122,335 M18 4 116,243 M19 4 65,368 M20 4 79,330 M21 4 130,086 M22 4 104,748 M23 5 75,829 M24 5 159 NV M25 2 249,939 EML4(6) - ALK(20) M26 6 102,082 M27 6 87,849 M28 6 53,343 M29 7 88,457 M30 7 79,743 M31 8 67,713 M32 7 49,351 M33 8 114,948 M34 8 112,940 M35 8 163,197 M36 8 112,394