UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA
ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL
MEDI NATURAL
T abajo Fin de G ado en Bio ecnología
DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE miRNAS IMPLICADOS
EN LA REGULACIÓN DE LA RESPUESTA A ESTRÉS EN
CUCUMIS MELO
Au o /a:
Bea iz Fe nández Gómez
Di ec o /a:
D a. Mª Ca men Ma qués Rome o
Tu o /a:
D . José Ja ie Fo men Mille
Co u o /a:
D . José Miguel Mule Salo
Cu so académico 2015-2016
VALENCIA, JULIO 2016
Tí ulo
De ección y análisis de miRNAs implicados en la egulación de la espues a a es és en Cucumis
melo.
Resumen
Las plan as, como o ganismos sésiles que son, necesi an desa olla espues as ápidas
y e icien es pa a pode sob e i i a los di e en es es eses medioambien ales a los que pueden
se some idas. Exis en nume osos es udios ace ca de es as espues as basados en los
p incipios clásicos de la biología molecula , sin emba go, a p incipios de los 90 se desc ibie on
di e en es especies de pequeños RNAs (sRNAs) no codi ican es que p esen aban ac i idad
egulado a. Toda ía queda mucho pa a comp ende el modo de acción de es os sRNAs. La
mayo ía del conocimien o ob enido has a el momen o es á basado en es udios ealizados en
o ganismos modelo, como es el caso de A abidopsis haliana, sin emba go, poco se conoce
ace ca de la impo ancia de es os elemen os egulado es en especies cul i adas.
Dado que el genoma de Cucumis melo ha sido comple amen e secuenciado y debido a
la impo ancia económica de esa especie en España, en nues o labo a o io se some ie on
plan as de C. melo a . piel de sapo a di e en es condiciones po encialmen e es esan es, y los
sRNAs ex aídos de ellas se secuencia on de o ma masi a (New Gene a ion Sequencing). De
es a o ma se iden i ica on muchas especies di e en es de sRNAs, sin emba go, cen amos
nues o es udio en una de ellas, los miRNAS, po se su biosín esis, es uc u a y modo de
acción bien conocidas.
En es e ensayo se desc ibe un mé odo pa a la de ección y ampli icación especí ica de
miRNAs madu os de C. melo, algunos de los cuales pueden es a implicados en la egulación de
las espues as a es és. Además, se analizó la acumulación ela i a de és os en di e en es
condiciones de es és po RT-PCR cuan i a i a, y los esul ados ob enidos se emplea on pa a
alida los da os ob enidos de la secuenciación masi a. Adicionalmen e, se es udió la
abundancia ela i a de las posibles dianas de mRNA de es os miRNAs con el in de pode
es ablece una co elación en e ellos e in en a in e i el modo de acción.
Palab as cla e
Cucumis melo; Es és abió ico; Es és bió ico; Pequeños RNAs no codi ican es; miRNAs;
Secuenciación masi a; RT-PCR a iempo eal/cuan i a i a.
Au o /a del TFG: Dña. Bea iz Fe nández Gómez
Di ec o /a: Dña. Mª Ca men Ma qués Rome o
Tu o /a: D. José Ja ie Fo men Mille
Co u o /a: D. José Miguel Mule Salo
Localidad y echa: Valencia, Julio de 2016
Ti le
De ec ion and analysis o miRNAs in ol ed in he egula ion o s ess esponse in Cucumis
melo.
Abs ac
Plan s, as sessile o ganisms, need o de elop apid and e icien esponses in o de o
su i e o en i onmen al s esses. Many s udies we e pe o med ega ding his issue based on
he classical p inciples o molecula biology, howe e in he ea ly 90's new non-coding sho
RNAs (sRNAs) we e iden i ied ha ing egula o y ac i i ies, and hei mode o ac ion is now
s a ing o be deciphe ed. Mos o he knowledge on sRNAs in plan s ely on he s udies
pe o med in A abidopsis haliana o ela ed model o ganisms, howe e li le is known abou
he impo ance o hese egula o y elemen s in c ops.
Taking ad an age o he comple e sequencing o he Cucumis melo genome and he
economical impo ance o his c op in Spain, in ou lab plan s o C. melo a . piel de sapo we e
subjec ed o se e al s ess ul condi ions and hei sRNAs we e ex ac ed and subjec ed o New
Gene a ion Sequencing (NGS). Many di e en species o sRNAs we e iden i ied, howe e we
cen e ed ou s udy in miRNAs, whose biosyn hesis, s uc u e and mode o ac ion ha e been
desc ibed in dep h.
In his essay we desc ibe a me hod o de ec and ampli y speci ic ma u e miRNAs o C.
melo pu a i ely in ol ed in he egula ion o s ess esponses. Fu he mo e, hei ela i e
accumula ion unde di e en s ess condi ions was assayed by eal- ime RT-PCR and he
esul s we e used o alida e he da a ob ained by NGS. Addi ionally, RT-qPCR was also
employed o elucida e he e ec o hese miRNAs in he ela i e abundance o hei mRNA
a ge s in o de o be e unde s and hei mode o ac ion.
Keywo ds
Cucumis melo; abio ic s ess; bio ic s ess; small non-coding RNAs; miRNAs; nex gene a ion
sequencing; eal- ime/quan i a i e RT-PCR.
Au ho : Dña. Bea iz Fe nández Gómez
Di ec o : Mª Ca men Ma qués Rome o, PhD
Academic u o : José Ja ie Fo men Mille , PhD
Co u o : José Miguel Mule Salo , PhD
Ci y and da e: Valencia, Julio de 2016
AGRADECIMIENTOS
En p ime luga , me gus a ía ag adece a Gus a o Gómez po acep a me en el
labo a o io pa a ealiza es e abajo, y en especial a mi di ec o a de p oyec o, Mª Ca men
Ma qués, po que se ha in oluc ado o almen e con la ealización del mismo. G acias po la
paciencia, el iempo, los conocimien os, consejos y co ecciones; sin ella es e abajo no
hubie a sido posible. G acias a ellos y a odos los demás miemb os del labo a o io, que
siemp e me han ayudado en lo que he necesi ado.
Me gus a ía ag adece ambién es e abajo a mi amilia y a mis compañe os y amigos
po el apoyo incondicional du an e odos es os años, po que sin ellos odo hab ía sido mucho
más di ícil.
ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
1.1. El es és en plan as. .......................................................................................................... 1
1.2. El cul i o del melón (Cucumis melo). ................................................................................ 2
1.3. RNAs no codi ican es......................................................................................................... 3
1.3.1. Mic oRNAs ................................................................................................................ 4
1.3.1.1. Biogénesis y mecanismos de acción de los miRNAs. ........................................ 4
1.3.1.2. Iden i icación de miRNAs. ................................................................................. 6
1.3.1.3. miRNAs y la espues a a es és. ...................................................................... 10
2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 12
3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 13
3.1. Ma e ial ege al. ............................................................................................................ 13
3.2. Ex acción de sRNAs a pa i de RNA o al. .................................................................... 13
3.3. Reacción de T ansc ipción Re e sa (RT) de los sRNAs. .................................................. 14
3.4. Ampli icación de miRNAs po PCR. ................................................................................. 15
3.5. Secuenciación de los p oduc os de PCR. ........................................................................ 16
3.6. Clonación en plásmidos bac e ianos. ............................................................................. 17
3.6.1. Ligación. .................................................................................................................. 17
3.6.2. T ans o mación. ...................................................................................................... 18
3.6.3. PCR de colonia. ....................................................................................................... 18
3.7. Ex acción del DNA plasmídico (Minip ep). ................................................................... 19
3.8. Secuenciación. ................................................................................................................ 20
3.9. PCR cuan i a i a. ............................................................................................................ 20
3.9.1. Comp obación de la e iciencia de la eacción. ....................................................... 20
3.9.2. Reacción qPCR. ....................................................................................................... 21
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 22
4.1. De ección de los miRNAs median e RT-PCR. .................................................................. 22
4.1.1. RT pulsada. .............................................................................................................. 22
4.1.2. Ampli icación po PCR. ............................................................................................ 23
4.1.3. E aluación de los p oduc os de PCR po secuenciación. ........................................ 24
4.1.4. De e minación de la can idad mínima de ec able po RT-PCR. ............................. 25
4.2. Validación de la acumulación di e encial de miRNAs po RT-qPCR. ............................... 26
4.2.1. E iciencia de la qPCR pa a los miRNAs. ................................................................... 26
I

4.2.2. Análisis de la exp esión di e encial de los miRNAs. ................................................ 27
4.3. Análisis de la acumulación di e encial de los mRNAs. .................................................... 31
4.3.1. P edicción de las po enciales dianas de los miRNAs es udiados ............................ 31
4.3.2. E iciencia de la qPCR pa a los mRNAs dianas ......................................................... 31
4.3.3. Análisis de la exp esión di e encial de los mRNAs dianas po RT-qPCR ................ 32
5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 35
6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 36
7. ANEXO ............................................................................................................ 40
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Modelo simpli icado de la biogénesis de los miRNAs en las plan as ............................. 6
Figu a 2. Esquema que mues a el ensayo de RT-PCR s em-loop de los miRNAs ...................... 10
Figu a 3. Rep esen ación esquemá ica de las al e na i as me odologías de ansc ipción
in e sa de los miRNAs. ................................................................................................................ 10
Figu a 4. Secuencia uni e sal del cebado s em-loop pa a RT ................................................... 14
Figu a 5. P o ocolo de RT pulsada ............................................................................................... 15
Figu a 6. Vec o pTZ57R/T, u ilizado pa a lle a a cabo la ligación. ........................................... 17
Figu a 7.Placa de 96 pocillos pa a PCR cuan i a i a .................................................................... 21
Figu a 8. Diseño de los cebado es pa a la ampli icación del miRNA166 po PCR ...................... 23
Figu a 9. Resul ados de la de ección de los miRNAs po RT-PCR........................................... …..24
Figu a 10. Resul ado de la ampli icación de los miRNAs 160, 166 y 168, a pa i de dis in as
can idades. ............................................................................................................................. …..26
Figu a 11. Rep esen ación de los esul ados ob enidos en el análisis de exp esión de los
con oles endógenos pa a la alidación de los miRNAs......................................................... …..28
Figu a 12. Resul ados de la alidación biológica de los miRNAs po qPCR.. .......................... …..30
Figu a 13. Rep esen ación de los esul ados ob enidos en el análisis de exp esión de los genes
con ol pa a la alidación de los mRNAs …………………………………………………………………………………32
Figu a 14. Resul ados de la alidación biológica de los posibles mRNAs dianas de los miRNAs
es udiados. .................................................................................................................................. 34
Figu a S1. P oducción mundial de melón en e los años 1993 y 2013 ....................................... 40
Figu a S2. Resul ados de la secuenciación ealizada as la PCR de algunos de los miRNAs
es udiados . ............................................................................................................................ …..40
II
Figu a S3. Resul ados de las elec o o esis en gel de aga osa pa a la de ección de los clones de
los dis in os miRNAs .................................................................................................................... 41
Figu a S4. Cu as de e iciencia de la eacción qPCR pa a el miRNA 397 .................................... 42
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Compa ación de los dis in os mé odos de iden i icación de miRNAs ............................. 7
Tabla 2. E aluación de las p incipales écnicas de isualización de miRNAs ................................ 8
Tabla 3. Condiciones ambien ales en las que c ecie on las plan as de melón. .......................... 13
Tabla 4. Secuencias del cebado especí ico pa a la RT de cada miRNA analizado ..................... 15
Tabla 5. Secuencias del cebado di ec o de PCR especí ico de cada miRNA y del cebado
e e so uni e sal ......................................................................................................................... 16
Tabla 6. Secuencia del cebado M13/pUC di ec o y e e so. ..................................................... 19
Tabla 7. Secuencias del cebado di ec o y e e so de cada una de las posibles dianas de los
miRNAs analizados po qPCR ...................................................................................................... 20
Tabla 8. Condiciones de la eacción qPCR ................................................................................... 21
Tabla 9. Valo es de Log Fold Change de los miRNAs pa a cada una de las mues as ................ 27
Tabla 10. mRNAs dianas seleccionados como mejo es candida os a se egulados po cada
miRNA......................................................................................................................................... 31
III
LISTADO DE ABREVIATURAS
AGO A gonau e p o ein, p o eína A gonau a
Amp Ampicilina
APS Pe sul a o amónico
bp Pa es de bases
C. melo Cucumis melo
cDNA Complemen a y DNA, DNA complemen a io
CPM Cuen as po millón
DCL Dice -like, RNasa III semejan e a Dice
ddA Didesoxiadenosina
ddT Didesoxi imidina
DNA Deoxy ibonucleic acid, ácido desoxi ibonucleico
dNTPs Deoxynucleo ide iphospha es, Desoxi ibonucleó idos i os a o
EDTA E hylenediamine e aace ic acid, ácido e ilendiamino e aacé ico
EST Exp essed sequence ag, ma cado de secuencia exp esada
FC Fold Change
HEN-1 Hua Enhance 1, RNA me il ans e asa.
HST P o eína HASTY
HSVd Hop s un i oid, i oide del enanismo del lúpulo
IBMCP Ins i u o de Biología molecula y celula de plan as
LacZ Gen de la ß-galac osidasa
LB Caldo de lisogenia
LFC Log Fold Change
LiCl Clo u o de li io
lncRNA Long non-coding RNA, RNA no codi ican e la go
Mb Megabases
miRNA mic o RNA
mRNA Messenge RNA, RNA mensaje o
ncRNA Non-coding RNA, RNA no codi ican e
n Nucleó ido
PCR Polyme ase chain eac ion, eacción en cadena de la polime asa
qPCR Quan i a i e polyme ase chain eac ion, PCR cuan i a i a
RISC RNA-induced silencing complex, complejo de silenciamien o inducido
po RNA
RNA Pol II Polime asa II de RNA
RNA Ribonucleic acid, ácido ibonucleico
RNA Ribosomal RNA, RNA ibosomal
RT Re e se ansc ip ion, ansc ipción e e sa
RT-PCR Re e se ansc ip ion polyme ase chain eac ion, eacción en cadena
de la polime asa con ansc ip asa in e sa
siRNA Small in e e ing RNA, pequeño RNA de in e e encia
sncRNA Small non-coding RNA, pequeño RNA no codi ican e
snoRNA Small nucleola RNAs, pequeño RNA nucleola
sRNA Small RNA, pequeño RNA
Ssp. Subespecie
TAE T is ace a e-EDTA, ampón is-ace a o EDTA
TBE T is/Bo a o/EDTA
TEMED Te ame hyle hylenediamine, e ame ile ilendiamina
Tm Tempe a u a de mel ing
T is-HCl T is(hid oxime il)aminome ano-Hid oclo u o
RNA T ans e RNA, RNA de ans e encia
U c Unidades o mado as de colonia
UPL Uni e sal P obe Lib a y
UV Ul a iole a
X-Gal 5-b omo-4-clo o-3-indolil-β-D-galac opi anósido
7
Inicialmen e, los miRNAs ue on iden i icados po c ibado gené ico. Pese a que es e
mé odo ue ú il pa a iden i ica algunos miRNAs, ales como lin-4 (Wigh man e al., 1993) y lin-
7, su aplicación es limi ada po que es ca o y consume mucho iempo.
Pa a supe a algunas de las de iciencias de los análisis gené icos, se desa olló o o
en oque expe imen al, la clonación di ec a as el aislamien o de los pequeños RNAs. En él,
pequeñas moléculas de RNA son aisladas po accionamien o po amaño, ligadas a
adap ado es de RNA en ambos ex emos y ansc i os de o ma in e sa a cDNA, el cual es
ampli icado y secuenciado. Debido a que sólo los pequeños RNAs son aislados y examinados
po es e mé odo, es una mane a más e icien e de ob ene miRNAs que la de ección gené ica
gene al y además, se puede cuan i ica la abundancia del miRNA al mismo iempo (Lu e al.,
2005).
O o en oque es el compu acional adicional, el cual se basa en el análisis de la
secuencia del genoma. Va ios labo a o ios han diseñado p og amas compu acionales, como
MIRscan (Lim e al., 2003) y MIRAlign (Wang e al., 2005) y han p edicho con éxi o genes de
miRNA. Sin emba go, p esen a el incon enien e de esul a lige amen e ine icien e y no
exhaus i o, y los miRNAs p edichos necesi an se con i mados po expe imen os como la
clonación o No hem blo ing.
Finalmen e, ambién se puede lle a a cabo un análisis de ma cado de secuencia
exp esada (EST). Debido a que muchos miRNAs es án conse ados e olu i amen e de especie
a especie, se pueden p edeci miRNAs po homología a o os an e io men e desc i os. Es o
esul a muy ú il en especies cuyo genoma no es á secuenciado, aunque es e mé odo sólo
puede iden i ica miRNAs conse ados y la mayo ía de los miRNAs son más p opensos a se no
conse ados (Zhang e al., 2006).
Po lo an o, los cua o en oques exis en es ienen di e en es en ajas y de iciencias
(Tabla 1), pe o median e la combinación de es os mé odos, más miRNAs se descub i án
ápidamen e.
Tabla 1. Compa ación de los dis in os mé odos de iden i icación de miRNAs basada en Zhang e al., 2006.
Gene ic
sc eening
Di ec cloning a e
isola ion o small RNAs
Compu a ional
me hod
EST analysis
Speci ic so wa e
No
No
Yes
No
Requi e genome
sequence
No
No
Yes
No
Cos
High
High, bu less han
gene ic sc eening
Mode a e
Low
E iciency
Low
High
Low
High
False posi i e
possibili y
Low
Low
High
Mode a e
Need expe imen al
con i ma ion
No
No
Yes
Mode a e
Possibili y o new
miRNAs
High
High
High
Low
Sui able o wide
a ie y o species
Yes
Yes
No
Yes
miRNAs quan i a i e
in o ma ion
No
Yes
No
Somewha

8
Ca ac e ización de miRNAs p edichos.
La de ección iable y la cuan i icación de la exp esión de los miRNAs en ejidos
especí icos es esencial pa a un mejo en endimien o de la egulación de los genes mediados
po miRNAs. A di e encia de lo que ocu e en los mamí e os, los cuales ienen una población
ela i amen e simple de pequeños RNAs que comp enden p incipalmen e miRNAs y en la que
no hay siRNAs, las plan as p esen an una acción compleja de pequeños RNAs. Es a
complejidad hace que los miRNAs es én al amen e sub ep esen ados en la acción de RNA,
a ec ando a los mé odos de de ección, ya que puede que no sean lo su icien emen e sensibles
debido a su poca abundancia (Va konyi-Gasic e al., 2007).
En e los mé odos adicionales pa a de ec a miRNAs se pueden dis ingui el No he n
Blo , RT-PCR, mic oa ays, secuenciación masi a e incluso, ac ualmen e, se es án desa ollando
mé odos basados en sondas de i adas de nanopa ículas o mé odos elec oquímicos. No
obs an e, cada uno de es os mé odos iene sus p opias limi aciones (Tabla 2).
Tabla 2. E aluación de las p incipales écnicas de isualización de miRNAs basada en Åke blom e al., 2012.
Technique
Mechanism o ac i i y
Ad an age
Quan i a i e
High
h oughpu
Limi a ions
No he n
blo
Elec opho esis used
o sepa a e miRNA
bound o hyb idiza ion
p obes
Ra e miRNA equi e
long exposu e imes,
leading o inc eased
backg ound
Mos eliable
echnique o
miRNA de ec ion
Imp o ed
sensi i i y wi h
LNA p obes
Semi
No
Requi es so ing cell
popula ions
Requi es la ge amoun
o s a ing ma e ial
miRNA RT-
PCR
Quan i a i e analysis
o a speci ic miRNA in
a sample
Quan i a i e
analysis o miRNA
Highly sensi i e
and selec i e wi h
LNA p obes
Yes
Yes
Requi es so ing cell
popula ions
P ime s designed o
de ec p ecu so
sequence, may no
necessa ily indica e he
le el o ma u e miRNA
High cos
miRNA
mic oa ay
Chip based assay using
miRNA hyb idiza ion
p obes
High h oughpu
echnique o
p o ile di e en ial
exp ession o
known miRNA
Yes
Yes
Lack o compa abili y
due o di e ences
be ween mic oa ay
chips
No s anda d o
hyb idiza ion based
p o iling
Requi es la ge amoun
o s a ing ma e ial
Deep
sequencing
Chip based sequencing
assay o miRNA
p o iling
Can de ec known
as well as no el
miRNA sequences
wi hin and sample
Yes
Yes
Requi es la ge amoun
o s a ing ma e ial
9
Po una pa e, el No he n blo esul a un mé odo complejo, ya que hay que some e la
mues a a una elec o o esis y a una pos e io hib idación en una memb ana con sondas
adioac i as o ma cadas químicamen e. Además, consume mucho iempo y equie e g andes
can idades de mues a de RNA (Li y Ruan, 2009).
O a de las p incipales ecnologías son los mic oa ays, basados en la hib idación en e
los miRNAs, que son ma cados con un colo an e luo escen e, y sus co espondien es sondas
complemen a ias, pudiendo de ec a los dis in os ipos de miRNAs y sus can idades ela i as
en las mues as es udiadas midiendo la señal de luo escencia emi ida. Sin emba go, su uso se
e limi ado po el al o cos e del ma e ial y del equipo (Li y Ruan, 2009), y sob e odo, po el
hecho de que sólo pe mi e de ec a miRNAs que ya se encuen an desc i os.
La iden i icación de los miRNAs ambién es posible median e la secuenciación masi a de
los pequeños RNAs. Pa a ello, se c ean biblio ecas de cDNA, gene ado a pa i de una eacción
de e o ansc ipción, g acias a la p e ia unión de adap ado es en ambos ex emos del sRNA, y
una pos e io ampli icación po PCR. A con inuación, cada cDNA se une a un clus e dis in o
po los adap ado es. Dichos clus e s consis en en egiones que con ienen múl iples copias de
oligos. La secuenciación de las lib e ías iene luga median e un p oceso en el que, al añadi los
nucleó idos ma cados luo escen emen e a las di e en es copias de cDNA de los clus e s, se
gene a una emisión de luz que es egis ada, pudiendo de e mina ambién la abundancia de
cada sRNA medida en CPM (cuen as po millón).
A pesa de su ele ado cos e, la RT-PCR es una de las écnicas más ampliamen e
u ilizadas, ya que p esen a una mejo sensibilidad y especi icidad espec o a las écnicas
mencionadas an e io men e. Es e mé odo consis e en la con e sión del miRNA en cDNA
median e una ansc ipción e e sa, seguido de su ampli icación po PCR (Fig. 2). Pa a ello, es
necesa io el p e io ala gamien o de la molécula de miRNA median e la hib idación con
cebado es especí icos o la ligación de adap ado es, pues el educido amaño de la molécula de
miRNA limi a la aplicación di ec a de los p o ocolos con encionales de RT-PCR (K ame , 2011).
Algunos de los cebado es empleados pa a hace la RT con ienen una secuencia especí ica del
miRNA a ampli ica y se diseñan con una es uc u a lineal (Fig. 3A) o en o ma de ho quilla
(s em-loop) (Fig. 3B). O as es a egias consis en en añadi una cola común al ex emo 3' de
odos los miRNAs, como es el caso de la adición de poli(A) (Fig. 3C), o bien la ligación con una
T4 RNA ligasa de un adap ado de secuencia conocida (Fig. 3D), en cuyo caso la eacción RT se
lle a ía a cabo a pa i de un cebado oligo dT o un cebado uni e sal complemen a io al
adap ado , espec i amen e.
Uno de los sis emas más ampliamen e u ilizado es la e o ansc ipción con un cebado
en o ma de ho quilla (s em-loop), ya que su es uc u a p esen a una se ie de en ajas como
son la mejo a de la es abilidad del dúplex cebado /RNA, y además, a di e encia de los
cebado es lineales, p e iene las uniones no especí icas con o as moléculas de RNA y es capaz
de disc imina en e miRNA madu o y sus p ecu so es, mejo ando la especi icidad del mé odo
(Li y Ruan, 2009).
10
Figu a 2. Esquema que mues a el ensayo de RT-PCR s em-loop de los miRNAs. P ime o iene luga una RT
( ansc ipción e e sa) seguido de una PCR con encional. El cebado RT s em-loop se une al ex emo 3' de la
molécula de miRNA, iniciando su ansc ipción e e sa. A con inuación, el p oduc o de RT es ampli icado u ilizando
un cebado di ec o especí ico del miRNA y un cebado e e so uni e sal. (Va konyi-Gasic, 2007)
Figu a 3. Rep esen ación esquemá ica de las al e na i as me odologías de ansc ipción in e sa de los miRNAs.
(A) Cebado s em-loop (B) Cebado lineal. (C) Adición de cola poli(A). (D) Unión de adap ado po T4 RNA ligasa
(Benes y Cas oldi, 2010).
1.3.1.3. miRNAs y la espues a a es és.
Los dis in os es eses ambien ales hacen que las plan as modi iquen la exp esión de
de e minados miRNAs o sin e icen nue os pa a hace en e al es és. El papel que juegan
es os miRNAs en la espues a de la plan a en e a un es és ue suge ido a pa i de la
p edicción de las dianas de los miRNAs y los es udios de pe iles de exp esión de miRNAs
du an e dicha espues a.
A
D
C
B
11
Nume osos es udios ealizados en plan as modelo some idas a condiciones de es és
bió ico y abió ico, incluyendo de iciencia de nu ien es, sequía, ío, salinidad, in ecciones
bac e ianas, adiación UV y ensión mecánica, han pe mi ido la iden i icación de miRNAs
implicados en la egulación de las espues as a es és (Kh aiwesh e al., 2012). Uno de los
es udios iniciales ue el ealizado po Sunka y Zhu en 2004, quienes cons uye on lib e ías de
pequeños RNAs de plan as de A abidopsis haliana some idas a es és po ío, es és salino,
sequía y a adas con di e en es ho monas, e iden i ica on miRNAs que se acumulaban de
o ma di e encial en los a amien os.
En e o os es udios cen ados en la in es igación del papel de los miRNAs en la
espues a a es és, des acan los ealizados en cul i os de algodón con dis in a esis encia a
salinidad (Yin e al., 2012) y en plan as de melón an o esis en es como suscep ibles al pulgón
he bí o o (Sa a e al., 2012), en los cuales se iden i ica on al e aciones en la exp esión de
es as moléculas.
Según ha sido comp obado po di e sos ensayos, puede se que un miRNA esponda a
un mismo es és de o ma di e en e dependiendo de la especie de plan a, o que di e en es
miRNAs espondan a un mismo es és de una mane a simila (Zhang, 2015).
Po o a pa e, el al o g ado de complemen a iedad en e los miRNAs y sus dianas
p opo ciona un pode oso en oque pa a p edeci y alida los genes diana de los miRNA en las
plan as. Es bien sabido que la mayo ía de los miRNAs sensibles a es és se di igen a ac o es de
ansc ipción, po lo que dichos ac o es ambién juegan un papel impo an e du an e la
espues a de la plan a a di e en es es eses medioambien ales.
A pesa de que muchos es udios se han cen ado en la exp esión abe an e de cie os
miRNAs inducida po unos pocos es eses en di e en es especies, algunas de ellas de in e és
ag onómico, la aplicación de es os conocimien os a ni el p ác ico esul a di ícil, pues la
in o mación ob enida es á incomple a. Has a el momen o no se ha ealizado un análisis
sis emá ico de la acumulación global de pequeñas especies de sRNAs en espues a a muchos
es eses sob e una única especie ege al. El p esen e abajo mues a un pequeño apa ado de
un es udio mucho mayo conducen e a sal a es e incon enien e en melón. Los esul ados
ob enidos pod ían se usados pa a desa olla es a egias que pe mi ie an mejo a el
endimien o de dicho cul i o cuando se desa olla en condiciones de es és, no sólo po medio
de la manipulación de los genes de espues a a es és, sino ambién de los miRNAs que los
egulan (Saini e al., 2012).
12
2. OBJETIVOS
El obje i o gene al de es e abajo se cen a en la pues a a pun o de un mé odo de
de ección y análisis de la exp esión de miRNAs, con el in de alida los esul ados ob enidos
de un es udio p e io de secuenciación masi a de lib e ías de pequeños RNAs p o enien es de
plan as de melón (Cucumis melo) some idas a di e sos ipos de es eses an o abió icos como
bió icos.
Con es a inalidad, se siguie on los siguien es obje i os pa ciales:
1. Ampli icación po RT-PCR de algunos posibles miRNAs de ec ados en análisis p e ios de
secuenciación masi a.
2. Clonación y secuenciación de los miRNAs ampli icados pa a iden i ica los y con i ma la
alidez de la écnica de RT-PCR empleada.
3. Análisis de la exp esión di e encial de miRNAs po RT-PCR a iempo eal y alidación de los
esul ados ob enidos po secuenciación masi a.
4. P edicción median e ap oximaciones bioin o má icas de los mRNAs de melón que son
po enciales dianas de los miRNAs analizados.
5. Análisis po RT-PCR a iempo eal de los ni eles de acumulación de los mRNAs diana de los
miRNAs analizados.

13
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1. Ma e ial ege al.
Los dis in os análisis ealizados en es e abajo se lle a on a cabo a pa i de mues as
de plan as de melón some idas a di e sos a amien os, los cuales se mues an en la Tabla 3.
Tabla 3. Condiciones ambien ales en las que c ecie on las plan as de melón.
Las mues as se oma on 24 días a pa i de la siemb a de las plan as y 11 días después
de habe ealizado el a amien o.
3.2. Ex acción de sRNAs a pa i de RNA o al.
La pu i icación de los pequeños RNAs de las plan as con ol así como las some idas a los
di e en es es eses (apa ado 3.1.) se ealizó pa iendo de mues as de RNA o al siguiendo las
ins ucciones de alladas en el ki “REALTOTAL miRNA ki ” (Du iz SL, Pa e na, Valencia) con
lige as modi icaciones.
Al a a se de RNA o al p e iamen e pu i icado se empleó el p o ocolo desc i o en el
manual pa a la ex acción de miRNAs a pa i de mues as de sang e. Es a ex acción comienza
con la adición de un ampón de lisis, que p opo ciona las sales necesa ias pa a acili a una
pos e io p ecipi ación de los ácidos nucleicos con e anol. A con inuación se añade e anol a
una concen ación inal de 35%, que p ecipi a selec i amen e los RNAs de mayo amaño, los
cuales quedan e enidos en una columna (“La geRNA eno al Spin Column”). Al eluido se le
añade e anol, y es ensamblado en una columna “mic oRNA”, en la que quedan acumulados
es os pequeños RNAs. Median e un ampón de la ado de RNA se eliminan las sales esiduales,
y inalmen e, con un ampón de elución de RNA, los mic oRNAs son ecogidos en un ubo
eppendo , los cuales pueden se almacenados a la go plazo a -70oC, o a co o plazo a -20oC.
Condición ambien al
T a amien o
F ío
Tempe a u a día/noche (18oC/15oC)
Salinidad
Un iego con LiCl (200 mM)
Día co o
Ciclos de luz/oscu idad (12hs/12hs)
Sequía
Cese del iego
Monospo ascus
Inoculación del sus a o con espo as (50000 u c)
HSVd
Ag o ans o mación con plásmido de
sob eexp esión del i oide
Ag obac e ium
Inoculación de Ag obac e ium ume aciens
14
Po úl imo, los sRNAs pu i icados son cuan i icados en un espec o o óme o
NanoD op® ND-1000 (The mo Fishe Scien i ic, Wal ham, Massachuse s, EEUU).
3.3. Reacción de T ansc ipción Re e sa (RT) de los sRNAs.
Pa a la sín esis del cDNA de los miRNAs se empleó como cebado un oligo en o ma de
ho quilla (s em-loop) (Fig. 4) con una secuencia en su ex emo 3’ complemen a ia a los 6-7
nucleó idos de la secuencia del miRNA que se desea ampli ica (Tabla 4) (apa ado 1.3.1.2.,
“Ca ac e ización de miRNAs p edichos”). Como paso p e io a la eacción se ealizó una
desna u alización de es os cebado es (95oC du an e 10 minu os) seguida de una len a
ena u alización con el in de asegu a un co ec o plegamien o del oligo.
La RT se ealizó u ilizando el ki " Re e Aid Fi s S and cDNA Syn hesis Ki " (The mo
Scien i ic).
Pa a lle a a cabo la eacción de ansc ipción e e sa, se elabo ó una mezcla que
con enía: 1 µl de dNTPs Mix (10 mM), 2 µl de sRNA (con eniendo can idades a iables de en e
1 y 100 ng o ales) y 2 µl de agua es é il. Es a mezcla se incubó a 65oC du an e 5 minu os, con
el obje i o de ompe la es uc u a secunda ia de los sRNAs y e i a así la de ención de la RT.
A con inuación, a es a misma mezcla se le añadie on 2 µl de ampón de eacción 5x, 0,2
µl de RiboLock RNase Inhibi o (200 U/µl), 0,2 µl de Re e Aid M-MuLV RT (20 U/µl), 1 µl del
cebado RT especí ico (1µM) y 2 µl de agua es é il. Pa a aumen a la e iciencia de la eacción,
se ealizó una RT pulsada, cuyo p o ocolo de incubación se mues a en la Figu a 5.
Asimismo se lle a on a cabo con oles de eacción nega i os a los que no se añadía
ansc ip asa e e sa.
Figu a 4. Secuencia uni e sal del cebado s em-loop pa a RT. Incluye una secuencia pa a la unión de la sonda
UPL#21 (Uni e sal P obeLib a y P obe 21) que pe mi e el uso de sondas TaqMan pa a la de ección en PCR
cuan i a i a. (Va konyi-Gasic y Hellens, 2010)
UPL p obe #21
STEM-LOOP PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAAC-3’
15
Tabla 4. Secuencias del cebado especí ico pa a la RT de cada miRNA analizado. En minúsculas, la secuencia
especí ica del miRNA.
Figu a 5. P o ocolo de RT pulsada. En la pa e de a iba se ep esen a la empe a u a y en la de abajo el iempo.
3.4. Ampli icación de miRNAs po PCR.
El cDNA co espondien e a cada miRNA y de cada una de las mues as ue ampli icado
po PCR. Pa a ello, se pa ió de una dilución 1:10 en agua MiliQ de cada uno de los p oduc os
de RT y se añadie on en ubos eppendo los eac i os necesa ios pa a que enga luga la
eacción, incluyendo: 2 μl de cDNA, 5 μl de cebado di ec o (1 μM), 0,5 μl de cebado e e so
(10 μM), 0,5 μl de dNTPs (10 mM), 1,5 μl de bu e 10x, 0,5 μl de Taq-polime asa Ne zyme®
(1U/ μl) y 5 μl de agua es é il, esul ando un olumen inal de 15 μl pa a cada miRNA. Las
secuencias del cebado di ec o especí ico pa a cada miRNA así como el e e so uni e sal se
mues an en la Tabla 5.
miRNA
miRNA sequence
RT P ime sequence
miR159
TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC agagc
miR160
TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC ggca
miR162
TCGATAAACCTCTGCATCCAG
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC agagc
miR166
TCGGACCAGGCTTCATTCCCC
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACggggaa
miR168
TCGCTTGGTGCAGGTCGGGAA
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAAC cccg
miR397
CATTGAGTGCAGCGTTGATGT
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACaca ca
miR398
TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACcagggg
miR408
ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC
GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACgccagg
16
Tabla 5. Secuencias del cebado di ec o de PCR especí ico de cada miRNA y del cebado e e so uni e sal. En
mayúsculas, la secuencia especí ica del miRNA; en minúsculas, la cola de nucleó idos que se añade pa a equipa a
las Tm.
Los ubos se in oduje on en un e mociclado de PCR Mas e cycle ® p o S (Eppendo ,
Hambu go, Alemania), donde se comple ó la ampli icación siguiendo el p oceso que se
mues a a con inuación:
1. Desna u alización inicial 94oC 2 minu os
2. Desna u alización 94oC 20 segundos
3. Alineamien o 58oC 30 segundos
4. Ex ensión 72oC 20 segundos
5. Ex ensión inal 72oC 5 minu os
6. Conse ación 4oC ∞ minu os
Una ez e minada la eacción, se comp obó la de ección de es os miRNAs median e
una elec o o esis en gel de ac ilamida al 10% en ampón TBE 10x. El gel se p epa ó a pa i de
una mezcla de 5 ml de ac ilamida en una p opo ción 29:1 (ac ilamida/bisac ilamida), 750 μl de
TBE 10x, 9 ml de agua es é il, 200 μl de pe sul a o amónico (APS) al 10% y 10 μl de TEMED. Las
mues as co ie on 30 minu os a 200 ol ios, el gel ue incubado en una solución de b omu o
de e idio y inalmen e, las bandas se obse a on en un ansiluminado con luz ul a iole a a
250 nm.
3.5. Secuenciación de los p oduc os de PCR.
Los p oduc os de PCR ue on a ados con exonucleasas (ExoSAP-IT®). Pa a ello, se
mezcla on 5 µl de p oduc o de PCR y 2 µl de exonucleasas y se incubó, p ime o a 37oC du an e
15 minu os pa a deg ada los cebado es y nucleó idos es an es, y luego a 80oC du an e 15
minu os pa a inac i a el eac i o ExoSAP-IT. Pos e io men e, se p ocedió a la secuenciación
miRNA
Fo wa d P ime sequence
Uni e sal Re e se P ime sequence
miR159
gcgccTTTGGATTGAAGGGAG
GTGCAGGGTCCGAGGTATTC
miR160
c ag TTGCCTGGCTCCCTG
miR162
gcgccTTTGGATTGAAGGGAG
miR166
gcgaaTCGGACCAGGCTTC
miR168
ggg a TCGCTTGGTGCAGG
miR397
cca gcCATTGAGTGCAGCG
miR398
gcgcaTGTGTTCTCAGGTCG
miR408
ccgcaATGCACTGCCTCTTC
35 ciclos
23
a lo obse ado en la bibliog a ía exis en e elacionada con la de ección de miRNAs (K ame e
al., 2011; Czimme e e al., 2013).
No malmen e, las eacciones RT son lle adas a cabo en e 40-50oC y es as bajas
empe a u as pueden con ibui a la no especi icidad ela i a de la eacción. Es o, además,
esul a un p oblema cuando las concen aciones de la mues a de pa ida son muy bajas. Es
po ello, que en una RT no mal, las eacciones secunda ias no especí icas pueden compe i
ue a de la eacción deseada y, si la concen ación de la e dade a diana es su icien emen e
baja, se p oduce la inhibición comple a del p oduc o especí ico de ampli icación (Bus in, 2002).
Po es a azón, se ealizó una eacción RT pulsada (apa ado 3.3.), en la que los iempos
de exposición a las di e en es empe a u as son meno es y en la que se es abiliza el cebado al
hib ida a baja empe a u a, con el in de inc emen a la e iciencia de la RT y educi ambién
las in e acciones no especí icas en e los cebado es pa a los di e en es miRNAs. Asimismo,
es e ipo de eacción p opo ciona una mejo sensibilidad de de ección compa ado con una
condición no pulsada (Tang e al., 2006).
4.1.2. Ampli icación po PCR.
El segundo paso consis e en la ampli icación po PCR del cDNA. Pa a ello se empleó un
cebado e e so uni e sal p esen e en la ho quilla del oligo empleado en la ansc ipción
e e sa y un cebado di ec o especí ico del miRNA consis en e en la secuencia de miRNA
(excep o los seis úl imos nucleó idos del ex emo 3’) con la adición de una cola de 5-7
nucleó idos en el ex emo 5’ necesa ia pa a equipa a la Tm a la del cebado e e so uni e sal
(Fig. 8).
El p oduc o de la eacción ue isualizado po inción con b omu o de e idio de un gel de
poliac ilamida. Según puede obse a se en la igu a 9 se ob u o un p oduc o especí ico pa a
odos los miRNAs ensayados con el amaño espe ado de amplicón (60 nucleó idos); si bien la
can idad de p oduc o obse ada pa a cada uno de ellos no se co espondía con la abundancia
de e minada en las lib e ías (Fig. 9B), ello pod ía debe se a di e encias en la e iciencia de unión
del cebado pa a la RT o la ampli icación de los di e en es oligos.
Po o a pa e, los con oles nega i os ( eacciones de RT sin ansc ip asa e e sa) no
die on luga a p oduc os isibles en las mismas condiciones (da os no mos ados).

24
Figu a 8. Ejemplo de diseño de los cebado es pa a la ampli icación de miRNAs po RT-PCR. Caso pa icula del
miRNA166. La secuencia del cebado e e so uni e sal ob enido a pa i de la secuencia del cebado RT s em-loop.
La secuencia del cebado di ec o especí ico es la complemen a ia del miRNA con 5 nucleó idos añadidos pa a
con e i una Tm de 60oC. Po úl imo, diseño del oligo pa a secuencia el p oduc o de PCR.
Figu a 9. Resul ados de la de ección de los miRNA po RT-PCR. (A) Resul ado en gel de poliac ilamida de la
p esencia de los miRNAs seleccionados en una mues a de melón de plan a sana. (B) Da os en CPM de la
abundancia de cada miRNA ob enidos median e he amien as in o má icas a pa i de los da os de secuenciación
masi a.
4.1.3. E aluación de los p oduc os de PCR po secuenciación.
Si bien los p oduc os de la eacción de PCR enían el amaño espe ado, pa a e i ica
que la secuencia ampli icada se co espondía con el miRNA en cues ión y no e a un p oduc o
inespecí ico o un a e ac o se p ocedió a secuencia los amplicones ob enidos. En p ime a
ins ancia se lle ó a secuencia el p oduc o de PCR a ado con exonucleasas u ilizando como
cebado una pequeña secuencia diseñada en el ex emo 5’ (apa ado 4.1.2., Fig. 8). Al a a se
de una secuencia an pequeña, se encuen a po debajo del lími e mínimo eque ido pa a
ob ene una secuencia de calidad, no pudo lee se la secuencia comple a del miRNA, a pesa de
ello, con es a ap oximación se ob u ie on secuencias únicas con una homología de
miRNA166 5’-TCGGACCAGGCTTCATTCCCC-3’
STEM-LOOP PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAAC-3’
RT-PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACggggaa
cDNA 5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACGGGGAATGAAGCCTGGTCCGA-3’
UNIVERSAL PRIMER 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’
ESPECIFIC PRIMER 3’-CTTCGGACCAGGCTaagcg-5’
PRODUCTO PCR 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACGGGGAATGAAGCCTGGTCCGA cgc-3’
SECUENCIACIÓN 5’- g aGTGCAGGGTCCG-3’
UPL #21
159 160 162 166 168 397 398 408
miRNA
CPM
Mi 159
1170
Mi 160
145
Mi 162
606
Mi 166
8200
Mi 168
640
Mi 397
35
Mi 398
18
Mi 408
75
AB
A B
B
25
ap oximadamen e el 80% a la secuencia espe ada (Fig. S2). Así, podía deci se que se a aba de
p oduc os especí icos pa a cada miRNA.
Co obo ada de o ma ap oximada la bondad de la écnica empleada y con el in de
ob ene la secuencia exac a del miRNA ampli icado se p ocedió a clona los amplicones en un
ec o bac e iano pa a su pos e io secuenciación.
El ec o empleado ue el pTZ57R/T, que inse a agmen os con ex emos de adenina
den o un gen lacZ, in e umpiendo gene almen e su exp esión e impidiendo, po an o, la
p oducción de β-galac osidasa. Po es a azón, las bac e ias ans o madas po un plásmido
ecombinan e y c ecidas en un medio con X-gal apa ece ían de colo blanco, mien as que las
que con u ie an el plásmido acío adqui i ían un ono azulado.
Los esul ados ob enidos as la ans o mación mos a on que p ác icamen e la
o alidad de las colonias c ecidas e an azules, y sólo en unos pocos casos, y después de educi
la concen ación de X-gal en las placas unas 4 eces, se ob enían colonias blancas.
Po es a azón, la p esencia del inse o se con i mó median e una PCR de colonia. Es e
análisis es uc u al an o de los plásmidos ecombinan es como de los no ecombinan es no
sólo iene es e obje i o, sino que ambién de e mina la o ien ación de dichos inse os. Pa a
cada miRNA se analiza on un o al de 8 colonias u ilizando un cebado especí ico del miRNA
(apa ado 3.4., Tabla 5, cebado di ec o) jun o con un cebado especí ico del ec o (M13
di ec o o M13 e e so)(apa a ado 3.6.3., Tabla 6).
La p ác ica o alidad de las colonias azules analizadas po PCR de colonia con enían un
plásmido con inse o (Fig. S3). Ello se debe ía a que la secuencia in oducida, de 60
nucleó idos, no sólo no al e a la pau a de lec u a del gen lacZ, sino que además, la adición de
esos 20 aminoácidos ex a a la secuencia de la β-galac osidasa no a ec a a su ac i idad,
esul ando en colonias azules.
A con inuación se lle a on a secuencia 5 minip eps p oceden es de colonias que habían
dado posi i o en la PCR de colonia u ilizando el oligo M13 di ec o como cebado , esul ando
que el 100% de ellas con enían una secuencia idén ica al miRNA sob e el cual se había
ealizado la RT-PCR.
Así, pudimos comp oba que la écnica de s em-loop RT-PCR empleada esul a e ec i a
pa a la de ección y ampli icación especí ica de miRNAs.
4.1.4. De e minación de la can idad mínima de ec able po RT-PCR.
Una ez comp obada la ampli icación de los miRNAs de las bandas a pa i de 50 ng de
un ex ac o de pequeños RNAs, se es udió cuál se ía la can idad mínima de RNA necesa ia pa a
su de ección, ya que se a a de mues as aliosas y, además, hay que consumi RNA po cada
miRNA a es udia debido a que son eacciones especí icas. Pa a ello, se ealiza on RT a pa i
de dis in as can idades de RNA (50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng y 1 ng), ampli icando de o ma
especí ica los miRNAs 160, 166 y 168 (Fig. 10), seleccionados po p esen a di e en es ni eles
de acumulación según los da os ob enidos de las lib e ías de sRNAs secuenciadas (Fig. 10B).
26
Los esul ados ob enidos e lejan que los es miRNAs son de ec ados a pa i de an
sólo 1 ng de RNA inicial. Además, si bien no se obse an di e encias en la in ensidad de las
bandas pa a cada miRNA ampli icado a pa i de 50 y 25 ng de sRNA, és as empiezan a hace se
pa en es cuando se disminuye la can idad de RNA de pa ida, exis iendo una co elación en e
la can idad de p oduc o de PCR y la abundancia del miRNA obse ada en las lib e ías de sRNAs
(CPM). Todo ello apun a a una e icaz ampli icación de los miRNAs, lo cual hace posible un
análisis cuan i a i o de los mismos en las di e en es mues as.
Figu a 10. Resul ado de la ampli icación de los miRNAs 160, 166 y 168, pa iendo de dis in as can idades de
sRNAs. (A) Resul ado de las elec o o esis en gel de poliac ilamida de las RT ealizadas a pa i de dis in as
can idades de RNA (50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng y 1 ng). (B) Da os de la abundancia de los miRNAs 160, 166 y 168
ob enidos a pa i de las lib e ías de sRNAs medida en cuen as po millón.
4.2. Validación de la acumulación di e encial de miRNAs po RT-qPCR.
4.2.1. E iciencia de la qPCR pa a los miRNAs.
Aunque obse amos que po RT-PCR con encional se pueden de ec a miRNAs a pa i
de 1 ng de sRNA (apa ado 4.1.4), es udios p e ios ealizados en el labo a o io pusie on de
mani ies o que pa a ob ene unos ni eles de ec ables de un de e minado miRNA en qPCR es
p eciso pa i de al menos 100 ng de sRNA. Ello pod ía debe se a que el amplicón esul an e de
la eacción de PCR (60 n ) se encuen a po debajo del umb al pa a el cual ha sido diseñada la
écnica. Así, esa es la can idad de sRNA que se emplea en la RT pa a los análisis de
acumulación ela i a de miRNAs en las di e en es mues as.
Pa a de e mina expe imen almen e la e iciencia de la qPCR, se gene ó una cu a
es ánda pa a cada miRNA a es udia , así como de sus espec i os mRNAs dianas, median e la
ealización de una qPCR a pa i de diluciones se iadas de una mezcla de las dis in as mues as.
La de e minación de es a e iciencia esul a una he amien a excelen e pa a p oba la e iciencia
del ensayo, la p ecisión, la sensibilidad y el ango de abajo, y es calculada a pa i de la
pendien e de la ec a usando la ecuación: E iciencia = 10 (-1 / pendien e) -1.
1 112 1 123 2 2 23 3 3 3
50 ng 25 ng 10 ng 5ng 1ng
miRNA
CPM
1
miRNA166
8200
2
miRNA168
640
3
miRNA160
145
A B
1 112 1 123 2 2 23 3 3 3
50 ng 25 ng 10 ng 5ng 1ng
miRNA
CPM
1
miRNA166
8200
2
miRNA168
640
3
miRNA160
145
A B
AB
miRNA
CPM
1 miR166
8200
2 miR168
640
3 miR160
145
B
27
Si, inalmen e, la PCR es 100% e icien e, la can idad de cDNA se dobla á con cada ciclo y
la pendien e de la cu a es ánda se á -3.33 (100 = 100% = 10 (-1 / -3,33) -1). Po an o, una
pendien e en e -3.9 y -3,0 (E iciencia 80 a 110%) es acep able.
En gene al, los esul ados ob enidos mos a on una e iciencia del 90-110% (Fig. S4),
sal o los miRNAs 160 y 166, cuyos alo es e an mayo es debido a su baja abundancia, po lo
que nos encon amos en el lími e de de ección.
4.2.2. Análisis de la exp esión di e encial de los miRNAs.
Uno de los obje i os p incipales de es e es udio consis e en la alidación biológica
median e el mé odo RT-qPCR de una se ie de miRNAs ob enidos p e iamen e po
secuenciación masi a y que se encuen an di e encialmen e ep esen ados en lib e ías.
El análisis bioin o má ico de la acumulación ela i a de las secuencias en las lib e ías de
sRNAs no o ma pa e del ámbi o de es e abajo, no obs an e, a con inuación hago una
p esen ación some a de aquellos esul ados p e ios ob enidos en nues o labo a o io que son
necesa ios pa a la comp ensión de los esul ados.
Las secuencias ue on analizadas po el Se icio de Bioin o má ica del IBMCP, y a pa i
de ellas se de ec a on di e encias signi ica i as basándose en el núme o de lec u as (CPM)
ob enidas pa a cada una de ellas. Es as di e encias ue on medidas en alo es de
LogFoldChange (loga i mo en base dos del a io mues a a ada/con ol) (Tabla 9), el cual
indica la a iación p oducida en la acumulación de una secuencia some ida a un de e minado
a amien o espec o a la mues a no a ada. Po una pa e, que es e alo sea posi i o o
nega i o indica una mayo exp esión en las mues as p oceden es de plan as some idas a una
si uación po encialmen e es esan e o en plan as con ol, espec i amen e.
Tabla 9. Valo es de Log Fold Change de los miRNAs pa a cada una de las mues as. Los alo es que se encuen an
en celdas colo eadas p esen an un p- alue < 0,05, es deci , son es adí icamen e signi ica i os. Los dis in os colo es
ep esen an el ni el de acumulación de los miRNAs en cada una de las mues a espec o al con ol, e lejado en la
escala de colo es, debajo de la abla.
miRNA
Sequence
COLD
DROUGH
T
SALINITY
SHORT DAY
MONOSP.
HSVd
AGRO.
miR159
TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA
-0,68
-0,25
0,46
0,02
0,10
-0,01
-0,15
miR160
TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA
-2,20
-0,77
0,02
0,29
-0,84
-1,21
-0,15
miR162
TCGATAAACCTCTGCATCCAG
1,27
-0,26
0,09
0,44
0,24
-0,05
0,52
miR166
TCGGACCAGGCTTCATTCCCC
-2,63
-0,02
1,11
-0,27
0,51
-0,63
0,31
miR168
TCGCTTGGTGCAGGTCGGGA
A
-4,04
-2,58
0,02
-0,72
-1,07
-1,78
-0,51
miR397
CATTGAGTGCAGCGTTGATGT
8,50
11,64
10,81
9,85
miR398
TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG
8,09
9,17
-0,69
-0,74
-0,44
10,62
9,30
miR408
ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC
1,89
6,43
0,38
-1,93
-1,80
6,13
7,38
≥3 2 1 0 -1 -2 ≤-3
28
Pa a ob ene una cuan i icación ela i a p ecisa de los miRNAs es necesa io e alua
ambién el ni el de acumulación de una pequeña secuencia que se man enga cons an e en las
di e en es mues as analizadas y que ac úe como con ol endógeno. Usando es e con ol como
una e e encia ac i a, es posible no maliza la cuan i icación de los miRNAs y así compensa las
di e encias exis en es como consecuencia de a iaciones en la can idad de cDNA en cada
eacción. Algunos de los ac o es que causan las di e encias en la can idad de cDNA haciendo
necesa ia es a no malización son la imp ecisión en la medida del RNA as la ex acción, las
di e encias en la in eg idad del RNA, así como e o es du an e el pipe eo.
Pues o que a p io i no disponíamos de in o mación ace ca de miRNAs que
pe manecie an es ables en las di e en es mues as analizadas, los buscamos en la in o mación
p oceden e de la secuenciación de las di e en es lib e ías de sRNAs. Así, seleccionamos los
miRNAs 159 y 162 como con oles de e e encia, po mos a una homología del 100% con
miRNAs p e iamen e desc i os (lo cual los iden i icaba como e dade os miRNAs), ene unos
ni eles medios de abundancia, y no p esen a di e encias impo an es (LFC <1,2) en los alo es
de exp esión en e las mues as some idas a es és y el con ol.
La acumulación ela i a de ambos miRNAs ue analizada po qPCR obse ándose que los
alo es de exp esión se encuen an al ededo de 1 en odas las mues as, es deci , no di ie en
con los obse ados en las mues as p oceden es de las plan as no some idas a condiciones de
es és.
A con inuación se ealizó la media geomé ica de los alo es obse ados en cada uno de
los miRNAs de e e encia pa a cada mues a. Es os da os son los que se u iliza on pa a
no maliza los esul ados de los miRNAs a alida (Fig. 11).
Figu a 11. Rep esen ación de los esul ados ob enidos en el análisis de exp esión de los con oles endógenos pa a
la alidación de los miRNAs. Es un con ol no malizado que esul a de la media geomé ica ob enida a pa i de los
miRNAs 159 y 162, habiendo ealizado dos éplicas pa a cada uno de ellos.
A con inuación, pa a alida la p edicción bioin o má ica, se analizó la exp esión
di e encial de cua o miRNAs dis in os po qPCR (miR160, miR166, miR397 y miR398). Los
da os de exp esión ela i a se calcula on median e el mé odo ΔΔC , en el que p ime o se
no maliza con el con ol de e e encia y luego con la mues a no a ada. Los esul ados se
mues an en la igu a 12.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
NT
COLD
DROUGHT
SALINITY
SHORTDAY
MONOSP.
HSVd
AGRO

29
En p ime luga , se es udió el miRNA 397. Como se puede obse a exis e una
sob exp esión de es e miRNA en las mues as some idas a es és po ío y sequía y en
espues a a la in ección con HSVd y Ag obac e ium, mien as que en el es o de mues as no
se p oducen cambios signi ica i os espec o al con ol. Es os esul ados se co elacionan con
los da os p o enien es de las lib e ías, ya que és os mues an unos alo es posi i os y ele ados
de LFC pa a aquellas mues as en las que se e leja g á icamen e un mayo cambio (FC) (Fig.
12A). Po o a pa e, los ni eles de acumulación de es e miRNA en las lib e ías p oceden es de
mues as c ecidas en condiciones de salinidad, día co o e in ección con Monospo ascus no
ue on lo su icien emen e abundan es y/o consis en es como pa a e leja un alo , y se
conside ó no de ec able. Sin emba go, po qPCR somos capaces de de ec a una le e
exp esión; ello pod ía debe se a que cuando los ni eles de exp esión son an bajos que se
encuen an ce ca del lími e de de ección aumen a la señal debida a p oduc os de eacción
inespecí icos.
Resul ados simila es p esen a el miRNA 398 (Fig. 12B). Al igual que en el caso an e io ,
en és e ambién se obse a una al a exp esión en ío, sequía, HSVd y Ag obac e ium, mien as
que en salinidad, día co o y Monospo ascus apenas e a de ec ado. En gene al, exis e una
cie a co elación en e los esul ados de la qPCR y los de las lib e ías, aunque és a no es
exac a, ya que g á icamen e, debe ía mos a mayo abundancia las mues as a adas con
HSVd en ez de sequía.
En el caso de los miRNAs 160 (Fig. 12C) y 166 (Fig. 12D), los cambios de exp esión
p oducidos en las dis in as mues as son mucho meno es en compa ación con los dos miRNAs
an e io es. Respec o al p ime o de ellos, se puede ap ecia una cie a co elación con los
alo es ob enidos de la secuenciación masi a, pues en odos los a amien os se mues a una
meno exp esión que en el con ol, mien as que en el segundo miRNA, es a co elación no es
del odo pe cibida. Es o pod ía debe se al amaño de las secuencias que se p e enden
de ec a , el cual es mucho meno que el mínimo que equie e es a écnica pa a asegu a una
buena cuan i icación, po lo que la sensibilidad de la qPCR se e a ec ada. Po es a azón,
esul a á más di ícil la de ección de un miRNA en aquellas mues as en las que el cambio de
exp esión en e al con ol no es lo su icien emen e g ande. Po o a pa e, según se io en el
apa ado 4.2.1., la e iciencia de la eacción pa a es os miRNAs es aba ue a de los lími es
acep ables, lo cual hace que sea menos p ecisa la e aluación del cambio.
En gene al obse amos que la ampli ud del cambio obse ado po qPCR es mucho
meno a lo de ec ado en la secuenciación masi a de las lib e ías de sRNAs. Así, se pone de
mani ies o que la segunda écnica es mucho más e icien e y sensible en la de ección de
pequeñas secuencias. Asimismo, se pone en en edicho la bondad de la alidación biológica
u ilizando écnicas como la qPCR, pues sólo pe mi e de ec a de o ma iable aquellas
secuencias con una magni ud de cambio en e las mues as conside ablemen e g ande.
Una posible solución pa a aumen a la sensibilidad de la qPCR y mejo a así la de ección
pod ía se el uso de sondas Taqman en luga de ealiza la cuan i icación a pa i de luo ó o os
que se in e calan como en es e caso lo es el EVA G een empleado en la eacción.
30
Figu a 12. Resul ados de la alidación biológica de los miRNAs po qPCR. Las g á icas mues an la exp esión
di e encial de los miRNAs ob enida median e qPCR en cada uno de los di e en es es eses. Es a exp esión es á
medida en magni udes de cambio (FC) y ep esen ada en escala loga í mica en base 2. Las ablas mues an los
alo es de LFC pe enecien es a las lib e ías. Las celdas colo eadas p esen an un p- alue < 0,05, po lo que
ep esen an alo es signi ica i os. (A) Validación del miRNA397. (B) Validación del miRNA398. (C) Validacón del
miRNA160. (D) Validación del miRNA166.
0,3
0,5
1,0
2,0
4,0
8,0
16,0
32,0
64,0
128,0
256,0
MIR398 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO
8,09 9,17 -0,69 -0,74 -0,44 10,62 9,30
MIR397 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO
8,50 11,64 10,81 9,85
0,5
1,0
2,0
4,0
8,0
16,0
32,0
64,0
0,3
0,5
1,0
2,0
MIR160 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO
-2,20 -0,77 0,02 0,29 -0,84 -1,21 -0,15
0,5
1,0
2,0
MIR166 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO
-2,63 -0,02 1,11 -0,27 0,51 -0,63 0,31
A
B
C
D
31
4.3. Análisis de la acumulación di e encial de los mRNAs.
4.3.1. P edicción de las po enciales dianas de los miRNAs es udiados.
A con inuación, se p ocedió a la búsqueda de los posibles mRNAs diana cuya
acumulación pod ía es a egulada po los miRNAs es udiados en el apa ado an e io . Con
es a inalidad, se u ilizó la he amien a psRNA Ta ge (Dai y Zhao, 2011), que pe mi e analiza
dis in as secuencias median e la ealización de una se ie de alineamien os, ob eniendo así los
mejo es candida os como posibles mRNA diana. Es e análisis se basa en dos pa áme os
p incipales que son, la expec a i a y la UPE, los cuales miden la complemen a iedad en e el
miRNA y su diana, y accesibilidad del mRNA po su co espondien e miRNA, espec i amen e.
Una ez ob enidas aquellas secuencias que se p esen an como mejo es candida os a se
mRNAs dianas de los miRNAs an e io es, se de e minó la unción de cada uno de ellos
median e la búsqueda de secuencias homólogas bien en melón o en o as especies. Pa a ello,
se u ilizó la he amien a bioin o má ica BLASTx (Al schul e al., 1997). Los esul ados ob enidos
quedan ecogidos en la Tabla 10.
Tabla 10. mRNAs dianas seleccionados como mejo es candida os a se egulados po cada miRNA.
4.3.2. E iciencia de la qPCR pa a los mRNAs dianas.
Del mismo modo a como se p ocedió en el caso de la alidación biológica de los miRNAs,
como paso p e io a la e aluación de la exp esión de los mRNAs diana se ealizó un análisis de
la e iciencia de la qPCR. Los de alles de la eacción se mues an en el apa ado 3.9.1. de
ma e iales y mé odos. En esas condiciones se obse ó que la e iciencia de la eacción oscilaba
miRNA
DIANA
FUNCIÓN
miR160
Cucumis melo auxin esponse
ac o 17 (ARF17)
(XM_008447139.1)
Regula los genes de espues a emp ana a
la auxina, enca gada de la elongación de
las células.
miR166
Cucumis melo DNA-di ec ed RNA
polyme ase I subuni RPA12-like
(XM_008447114.1)
Enzima enca gada del p oceso de
ansc ipción p oduciendo RNA.
miR397
Cucumis melo laccase-4-like
(XM_008444242.1)
Enzima enca gada de ca aliza la oxidación
de un subs a o y de la educción de
oxígeno a agua.
miR398
Cucumbe peeling cup edoxin-like
(XM_008458647.1)
Enzima que con iene uno o más iones de
cob e y que pa icipa en p ocesos de óxido
educción y en el anspo e de oxígeno.
32
en o no a 100 y 110% en odos los ansc i os analizados, sal o en el caso del ac o de
espues a a auxinas ARF17, que ondaba el 160%. Ello se debía a que los ni eles de exp esión
de dicho gen e an muy bajos en las mues as analizadas, y u o que inc emen a se la can idad
de cDNA de pa ida en 4 eces pa a que la e iciencia de la eacción llega a a lími es acep ables.
4.3.3. Análisis de la exp esión di e encial de los mRNAs dianas po RT-qPCR.
Los mRNAs p edichos a a és de he amien as bioin o má icas se alida on
biológicamen e. Como en el caso de los miRNAs, és os ue on no malizados con genes con ol,
como el ac o de ibosilación del ADP (Cucumis melo ADP- ibosyla ion ac o -like;
XM_008463181.1), la p o eína p o ilina (Cucumis melo p o ilin; NM_001297545.1) o la ac ina
(Cucumis melo ac in-7; XM_008442791.1) (Fig. 13), cuya exp esión no p esen a cambios
signi ica i os en e las mues as some idas a los dis in os a amien os de es és (Kong e al.,
2014).
Figu a 13. Rep esen ación de los esul ados ob enidos en el análisis de exp esión de los genes de e e encia pa a
la alidación de los mRNAs. El ac o de ibosilación del ADP, la p o eína p o ilina y la ac ina son los genes con ol,
ya que su exp esión no p esen a cambios signi ica i os en e las dis in as mues as.
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO.
1.0
0.5
2.0
ADP
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO.
1.0
0.5
2.0
PROFILINA
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
0,50
1,00
2,00
NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO.
1.0
0.5
2.0
ACTINA
39
ZHANG, B.; PAN, X.; COBB, G.P.; ANDERSON, T.A. (2006). Plan mic oRNA: a small egula o y
molecule wi h big impac . De elopmen al Biology, 289(1): 3-16.
ZHANG, B. (2015). Mic oRNA: a new a ge o imp o ing plan ole ance o abio ic
s ess. Jou nal o Expe imen al Bo any, 66: 1749–1761.

40
7. ANEXO
Figu a S1. P oducción mundial de melón en e los años 1993 y 2013. (FAOSTAT, 2015)
Figu a S2. Resul ados de la secuenciación ealizada as la PCR de algunos de los miRNAs es udiados. La p ime a
secuencia es la ob enida a pa i de las lib e ías; la segunda es la ob enida as la secuenciación después de habe
ealizado la ampli icación. En azul se mues an las pa es de las secuencias que coinciden.
miR159 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA
GCGCCTTGGATGAAGGAGCTCTAGTGTCCAGATTCAATT
miR168 TCGCTTGGTGCAGGTCGGGAA
ACATTGGGTATTCGCTTGGTGCAGGTCGGAAGTGTAAGAAC
miR398 TGTGTTCTCCAGGTCGCCCCTG
TATTGCGCATGTGTCTCAGGTCGCTCCCTGTGTCCCTCCTATAATA
miR408 ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC
AAAACCGCAATGCACTGCCTCTGACCTGGCGTGACTATGCACATA
41
Figu a S3. Resul ados de las elec o o esis en gel de aga osa pa a la de ección de los clones de los dis in os
miRNAs. (A) Clones del miRNA 159; en la pa e izquie da, a pa i del cebado M13 di ec o y en la de echa, a pa i
del cebado M13 e e so. (B) Clones del miRNA 160. (C) Clones del miRNA 162. (D) Clones del miRNA 166. (E) Clones
del miRNA 168. (F) Clones del miRNA 397. (G) Clones del miRNA 398. (H) Clones del miRNA 408.
A
C
B
162 162
C
D
E
F
G
H
42
Figu a S4. Cu a de e iciencia del miRNA159. Cada una de las cu as ep esen a una dilución, siendo la p ime a
cu a la mues a menos diluida. Se obse a como la dis ancia en e las di e en es cu as es p opo cional po lo que
la e iciencia de la eacción es acep able.