Detección y análisis de miRNAs implicados en la regulación de la respuesta a estrés en Cucumis melo

UNIVERSITAT POLITÈCNICA DE VALÈNCIA ESCOLA TÈCNICA SUPERIOR D’ENGINYERIA AGRONÒMICA I DEL MEDI NATURAL Trabajo Fin de Grado en Biotecnología DETECCIÓN Y ANÁLISIS DE miRNAS IMPLICADOS EN LA REGULACIÓN DE LA RESPUESTA A ESTRÉS EN CUCUMIS MELO Autor/a: Beatriz Fernández Gómez Director/a: Dra. Mª Carmen Marqués Romero Tutor/a: Dr. José Javier Forment Millet Cotutor/a: Dr. José Miguel Mulet Salort Curso académico 2015-2016 VALENCIA, JULIO 2016 Título Detección y análisis de miRNAs implicados en la regulación de la respuesta a estrés en Cucumis melo. Resumen Las plantas, como organismos sésiles que son, necesitan desarrollar respuestas rápidas y eficientes para poder sobrevivir a los diferentes estreses medioambientales a los que pueden ser sometidas. Existen numerosos estudios acerca de estas respuestas basados en los principios clásicos de la biología molecular, sin embargo, a principios de los 90 se describieron diferentes especies de pequeños RNAs (sRNAs) no codificantes que presentaban actividad reguladora. Todavía queda mucho para comprender el modo de acción de estos sRNAs. La mayoría del conocimiento obtenido hasta el momento está basado en estudios realizados en organismos modelo, como es el caso de Arabidopsis thaliana, sin embargo, poco se conoce acerca de la importancia de estos elementos reguladores en especies cultivadas. Dado que el genoma de Cucumis melo ha sido completamente secuenciado y debido a la importancia económica de esa especie en España, en nuestro laboratorio se sometieron plantas de C. melo var. piel de sapo a diferentes condiciones potencialmente estresantes, y los sRNAs extraídos de ellas se secuenciaron de forma masiva (New Generation Sequencing). De esta forma se identificaron muchas especies diferentes de sRNAs, sin embargo, centramos nuestro estudio en una de ellas, los miRNAS, por ser su biosíntesis, estructura y modo de acción bien conocidas. En este ensayo se describe un método para la detección y amplificación específica de miRNAs maduros de C. melo, algunos de los cuales pueden estar implicados en la regulación de las respuestas a estrés. Además, se analizó la acumulación relativa de éstos en diferentes condiciones de estrés por RT-PCR cuantitativa, y los resultados obtenidos se emplearon para validar los datos obtenidos de la secuenciación masiva. Adicionalmente, se estudió la abundancia relativa de las posibles dianas de mRNA de estos miRNAs con el fin de poder establecer una correlación entre ellos e intentar inferir el modo de acción. Palabras clave Cucumis melo; Estrés abiótico; Estrés biótico; Pequeños RNAs no codificantes; miRNAs; Secuenciación masiva; RT-PCR a tiempo real/cuantitativa. Autor/a del TFG: Dña. Beatriz Fernández Gómez Director/a: Dña. Mª Carmen Marqués Romero Tutor/a: D. José Javier Forment Millet Cotutor/a: D. José Miguel Mulet Salort Localidad y fecha: Valencia, Julio de 2016 Title Detection and analysis of miRNAs involved in the regulation of stress response in Cucumis melo. Abstract Plants, as sessile organisms, need to develop rapid and efficient responses in order to survive to environmental stresses. Many studies were performed regarding this issue based on the classical principles of molecular biology, however in the early 90's new non-coding short RNAs (sRNAs) were identified having regulatory activities, and their mode of action is now starting to be deciphered. Most of the knowledge on sRNAs in plants rely on the studies performed in Arabidopsis thaliana or related model organisms, however little is known about the importance of these regulatory elements in crops. Taking advantage of the complete sequencing of the Cucumis melo genome and the economical importance of this crop in Spain, in our lab plants of C. melo var. piel de sapo were subjected to several stressful conditions and their sRNAs were extracted and subjected to New Generation Sequencing (NGS). Many different species of sRNAs were identified, however we centered our study in miRNAs, whose biosynthesis, structure and mode of action have been described in depth. In this essay we describe a method to detect and amplify specific mature miRNAs of C. melo putatively involved in the regulation of stress responses. Furthermore, their relative accumulation under different stress conditions was assayed by real-time RT-PCR and the results were used to validate the data obtained by NGS. Additionally, RT-qPCR was also employed to elucidate the effect of these miRNAs in the relative abundance of their mRNA targets in order to better understand their mode of action. Keywords Cucumis melo; abiotic stress; biotic stress; small non-coding RNAs; miRNAs; next generation sequencing; real-time/quantitative RT-PCR. Author: Dña. Beatriz Fernández Gómez Director: Mª Carmen Marqués Romero, PhD Academic tutor: José Javier Forment Millet, PhD Cotutor: José Miguel Mulet Salort, PhD City and date: Valencia, Julio de 2016 AGRADECIMIENTOS En primer lugar, me gustaría agradecer a Gustavo Gómez por aceptarme en el laboratorio para realizar este trabajo, y en especial a mi directora de proyecto, Mª Carmen Marqués, porque se ha involucrado totalmente con la realización del mismo. Gracias por la paciencia, el tiempo, los conocimientos, consejos y correcciones; sin ella este trabajo no hubiera sido posible. Gracias a ellos y a todos los demás miembros del laboratorio, que siempre me han ayudado en lo que he necesitado. Me gustaría agradecer también este trabajo a mi familia y a mis compañeros y amigos por el apoyo incondicional durante todos estos años, porque sin ellos todo habría sido mucho más difícil. ÍNDICE 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 1.1. El estrés en plantas. .......................................................................................................... 1 1.2. El cultivo del melón (Cucumis melo). ................................................................................ 2 1.3. RNAs no codificantes......................................................................................................... 3 1.3.1. MicroRNAs ................................................................................................................ 4 1.3.1.1. Biogénesis y mecanismos de acción de los miRNAs. ........................................ 4 1.3.1.2. Identificación de miRNAs. ................................................................................. 6 1.3.1.3. miRNAs y la respuesta a estrés. ...................................................................... 10 2. OBJETIVOS ....................................................................................................... 12 3. MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................ 13 3.1. Material vegetal. ............................................................................................................ 13 3.2. Extracción de sRNAs a partir de RNA total. .................................................................... 13 3.3. Reacción de Transcripción Reversa (RT) de los sRNAs. .................................................. 14 3.4. Amplificación de miRNAs por PCR. ................................................................................. 15 3.5. Secuenciación de los productos de PCR. ........................................................................ 16 3.6. Clonación en plásmidos bacterianos. ............................................................................. 17 3.6.1. Ligación. .................................................................................................................. 17 3.6.2. Transformación. ...................................................................................................... 18 3.6.3. PCR de colonia. ....................................................................................................... 18 3.7. Extracción del DNA plasmídico (Miniprep). ................................................................... 19 3.8. Secuenciación. ................................................................................................................ 20 3.9. PCR cuantitativa. ............................................................................................................ 20 3.9.1. Comprobación de la eficiencia de la reacción. ....................................................... 20 3.9.2. Reacción qPCR. ....................................................................................................... 21 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .............................................................................. 22 4.1. Detección de los miRNAs mediante RT-PCR. .................................................................. 22 4.1.1. RT pulsada. .............................................................................................................. 22 4.1.2. Amplificación por PCR. ............................................................................................ 23 4.1.3. Evaluación de los productos de PCR por secuenciación. ........................................ 24 4.1.4. Determinación de la cantidad mínima detectable por RT-PCR. ............................. 25 4.2. Validación de la acumulación diferencial de miRNAs por RT-qPCR. ............................... 26 4.2.1. Eficiencia de la qPCR para los miRNAs. ................................................................... 26 I 4.2.2. Análisis de la expresión diferencial de los miRNAs. ................................................ 27 4.3. Análisis de la acumulación diferencial de los mRNAs. .................................................... 31 4.3.1. Predicción de las potenciales dianas de los miRNAs estudiados ............................ 31 4.3.2. Eficiencia de la qPCR para los mRNAs dianas ......................................................... 31 4.3.3. Análisis de la expresión diferencial de los mRNAs dianas por RT-qPCR ................ 32 5. CONCLUSIONES ............................................................................................... 35 6. BIBLIOGRAFÍA .................................................................................................. 36 7. ANEXO ............................................................................................................ 40 ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Modelo simplificado de la biogénesis de los miRNAs en las plantas ............................. 6 Figura 2. Esquema que muestra el ensayo de RT-PCR stem-loop de los miRNAs ...................... 10 Figura 3. Representación esquemática de las alternativas metodologías de transcripción inversa de los miRNAs. ................................................................................................................ 10 Figura 4. Secuencia universal del cebador stem-loop para RT ................................................... 14 Figura 5. Protocolo de RT pulsada ............................................................................................... 15 Figura 6. Vector pTZ57R/T, utilizado para llevar a cabo la ligación. ........................................... 17 Figura 7.Placa de 96 pocillos para PCR cuantitativa .................................................................... 21 Figura 8. Diseño de los cebadores para la amplificación del miRNA166 por PCR ...................... 23 Figura 9. Resultados de la detección de los miRNAs por RT-PCR........................................... …..24 Figura 10. Resultado de la amplificación de los miRNAs 160, 166 y 168, a partir de distintas cantidades. ............................................................................................................................. …..26 Figura 11. Representación de los resultados obtenidos en el análisis de expresión de los controles endógenos para la validación de los miRNAs......................................................... …..28 Figura 12. Resultados de la validación biológica de los miRNAs por qPCR.. .......................... …..30 Figura 13. Representación de los resultados obtenidos en el análisis de expresión de los genes control para la validación de los mRNAs …………………………………………………………………………………32 Figura 14. Resultados de la validación biológica de los posibles mRNAs dianas de los miRNAs estudiados. .................................................................................................................................. 34 Figura S1. Producción mundial de melón entre los años 1993 y 2013 ....................................... 40 Figura S2. Resultados de la secuenciación realizada tras la PCR de algunos de los miRNAs estudiados . ............................................................................................................................ …..40 II Figura S3. Resultados de las electroforesis en gel de agarosa para la detección de los clones de los distintos miRNAs .................................................................................................................... 41 Figura S4. Curvas de eficiencia de la reacción qPCR para el miRNA 397 .................................... 42 ÍNDICE DE TABLAS Tabla 1. Comparación de los distintos métodos de identificación de miRNAs ............................. 7 Tabla 2. Evaluación de las principales técnicas de visualización de miRNAs ................................ 8 Tabla 3. Condiciones ambientales en las que crecieron las plantas de melón. .......................... 13 Tabla 4. Secuencias del cebador específico para la RT de cada miRNA analizado ..................... 15 Tabla 5. Secuencias del cebador directo de PCR específico de cada miRNA y del cebador reverso universal ......................................................................................................................... 16 Tabla 6. Secuencia del cebador M13/pUC directo y reverso. ..................................................... 19 Tabla 7. Secuencias del cebador directo y reverso de cada una de las posibles dianas de los miRNAs analizados por qPCR ...................................................................................................... 20 Tabla 8. Condiciones de la reacción qPCR ................................................................................... 21 Tabla 9. Valores de Log Fold Change de los miRNAs para cada una de las muestras ................ 27 Tabla 10. mRNAs dianas seleccionados como mejores candidatos a ser regulados por cada miRNA......................................................................................................................................... 31 III LISTADO DE ABREVIATURAS AGO Argonaute protein, proteína Argonauta Amp Ampicilina APS Persulfato amónico bp Pares de bases C. melo Cucumis melo cDNA Complementary DNA, DNA complementario CPM Cuentas por millón DCL Dicer-like, RNasa III semejante a Dicer ddA Didesoxiadenosina ddT Didesoxitimidina DNA Deoxyribonucleic acid, ácido desoxirribonucleico dNTPs Deoxynucleotide triphosphates, Desoxirribonucleótidos trifosfato EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid, ácido etilendiaminotetraacético EST Expressed sequence tag, marcador de secuencia expresada FC Fold Change HEN-1 Hua Enhancer 1, RNA metil transferasa. HST Proteína HASTY HSVd Hop stunt viroid, viroide del enanismo del lúpulo IBMCP Instituto de Biología molecular y celular de plantas LacZ Gen de la ß-galactosidasa LB Caldo de lisogenia LFC Log Fold Change LiCl Cloruro de litio lncRNA Long non-coding RNA, RNA no codificante largo Mb Megabases miRNA micro RNA mRNA Messenger RNA, RNA mensajero ncRNA Non-coding RNA, RNA no codificante nt Nucleótido PCR Polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa qPCR Quantitative polymerase chain reaction, PCR cuantitativa RISC RNA-induced silencing complex, complejo de silenciamiento inducido por RNA RNA Pol II Polimerasa II de RNA RNA Ribonucleic acid, ácido ribonucleico rRNA Ribosomal RNA, RNA ribosomal RT Reverse transcription, transcripción reversa RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction, reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa siRNA Small interfering RNA, pequeño RNA de interferencia sncRNA Small non-coding RNA, pequeño RNA no codificante snoRNA Small nucleolar RNAs, pequeño RNA nucleolar sRNA Small RNA, pequeño RNA Ssp. Subespecie TAE Tris acetate-EDTA, tampón tris-acetato EDTA TBE Tris/Borato/EDTA TEMED Tetramethylethylenediamine, tetrametiletilendiamina Tm Temperatura de melting Tris-HCl Tris(hidroximetil)aminometano-Hidrocloruro tRNA Transfer RNA, RNA de transferencia Ufc Unidades formadoras de colonia UPL Universal Probe Library UV Ultravioleta X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido 7 Inicialmente, los miRNAs fueron identificados por cribado genético. Pese a que este método fue útil para identificar algunos miRNAs, tales como lin-4 (Wightman et al., 1993) y lin7, su aplicación es limitada porque es caro y consume mucho tiempo. Para superar algunas de las deficiencias de los análisis genéticos, se desarrolló otro enfoque experimental, la clonación directa tras el aislamiento de los pequeños RNAs. En él, pequeñas moléculas de RNA son aisladas por fraccionamiento por tamaño, ligadas a adaptadores de RNA en ambos extremos y transcritos de forma inversa a cDNA, el cual es amplificado y secuenciado. Debido a que sólo los pequeños RNAs son aislados y examinados por este método, es una manera más eficiente de obtener miRNAs que la detección genética general y además, se puede cuantificar la abundancia del miRNA al mismo tiempo (Lu et al., 2005). Otro enfoque es el computacional tradicional, el cual se basa en el análisis de la secuencia del genoma. Varios laboratorios han diseñado programas computacionales, como MIRscan (Lim et al., 2003) y MIRAlign (Wang et al., 2005) y han predicho con éxito genes de miRNA. Sin embargo, presenta el inconveniente de resultar ligeramente ineficiente y no exhaustivo, y los miRNAs predichos necesitan ser confirmados por experimentos como la clonación o Northem blotting. Finalmente, también se puede llevar a cabo un análisis de marcador de secuencia expresada (EST). Debido a que muchos miRNAs están conservados evolutivamente de especie a especie, se pueden predecir miRNAs por homología a otros anteriormente descritos. Esto resulta muy útil en especies cuyo genoma no está secuenciado, aunque este método sólo puede identificar miRNAs conservados y la mayoría de los miRNAs son más propensos a ser no conservados (Zhang et al., 2006). Por lo tanto, los cuatro enfoques existentes tienen diferentes ventajas y deficiencias (Tabla 1), pero mediante la combinación de estos métodos, más miRNAs se descubrirán rápidamente. Tabla 1. Comparación de los distintos métodos de identificación de miRNAs basada en Zhang et al., 2006. Genetic screening Direct cloning after isolation of small RNAs Computational method EST analysis Specific software No No Yes No Require genome sequence No No Yes No Cost High High, but less than genetic screening Moderate Low Efficiency Low High Low High False positive possibility Low Low High Moderate Need experimental confirmation No No Yes Moderate Possibility for new miRNAs High High High Low Suitable to wide variety of species Yes Yes No Yes miRNAs quantitative information No Yes No Somewhat 8 Caracterización de miRNAs predichos. La detección fiable y la cuantificación de la expresión de los miRNAs en tejidos específicos es esencial para un mejor entendimiento de la regulación de los genes mediados por miRNAs. A diferencia de lo que ocurre en los mamíferos, los cuales tienen una población relativamente simple de pequeños RNAs que comprenden principalmente miRNAs y en la que no hay siRNAs, las plantas presentan una fracción compleja de pequeños RNAs. Esta complejidad hace que los miRNAs estén altamente subrepresentados en la fracción de RNA, afectando a los métodos de detección, ya que puede que no sean lo suficientemente sensibles debido a su poca abundancia (Varkonyi-Gasic et al., 2007). Entre los métodos tradicionales para detectar miRNAs se pueden distinguir el Northern Blot, RT-PCR, microarrays, secuenciación masiva e incluso, actualmente, se están desarrollando métodos basados en sondas derivadas de nanopartículas o métodos electroquímicos. No obstante, cada uno de estos métodos tiene sus propias limitaciones (Tabla 2). Tabla 2. Evaluación de las principales técnicas de visualización de miRNAs basada en Åkerblom et al., 2012. Technique Mechanism of activity Advantage Quantitative High throughput Limitations Northern blot Electrophoresis used to separate miRNA bound to hybridization probes Rare miRNA require long exposure times, leading to increased background Most reliable technique for miRNA detection Improved sensitivity with LNA probes Semi No Requires sorting cell populations Requires large amount of starting material miRNA RTPCR Quantitative analysis of a specific miRNA in a sample Quantitative analysis of miRNA Highly sensitive and selective with LNA probes Yes Yes Requires sorting cell populations Primers designed to detect precursor sequence, may not necessarily indicate the level of mature miRNA High cost miRNA microarray Chip based assay using miRNA hybridization probes High throughput technique to profile differential expression of known miRNA Yes Yes Lack of comparability due to differences between microarray chips No standard for hybridization based profiling Requires large amount of starting material Deep sequencing Chip based sequencing assay for miRNA profiling Can detect known as well as novel miRNA sequences within and sample Yes Yes Requires large amount of starting material 9 Por una parte, el Northern blot resulta un método complejo, ya que hay que someter la muestra a una electroforesis y a una posterior hibridación en una membrana con sondas radioactivas o marcadas químicamente. Además, consume mucho tiempo y requiere grandes cantidades de muestra de RNA (Li y Ruan, 2009). Otra de las principales tecnologías son los microarrays, basados en la hibridación entre los miRNAs, que son marcados con un colorante fluorescente, y sus correspondientes sondas complementarias, pudiendo detectar los distintos tipos de miRNAs y sus cantidades relativas en las muestras estudiadas midiendo la señal de fluorescencia emitida. Sin embargo, su uso se ve limitado por el alto coste del material y del equipo (Li y Ruan, 2009), y sobre todo, por el hecho de que sólo permite detectar miRNAs que ya se encuentran descritos. La identificación de los miRNAs también es posible mediante la secuenciación masiva de los pequeños RNAs. Para ello, se crean bibliotecas de cDNA, generado a partir de una reacción de retrotranscripción, gracias a la previa unión de adaptadores en ambos extremos del sRNA, y una posterior amplificación por PCR. A continuación, cada cDNA se une a un cluster distinto por los adaptadores. Dichos clusters consisten en regiones que contienen múltiples copias de oligos. La secuenciación de las librerías tiene lugar mediante un proceso en el que, al añadir los nucleótidos marcados fluorescentemente a las diferentes copias de cDNA de los clusters, se genera una emisión de luz que es registrada, pudiendo determinar también la abundancia de cada sRNA medida en CPM (cuentas por millón). A pesar de su elevado coste, la RT-PCR es una de las técnicas más ampliamente utilizadas, ya que presenta una mejor sensibilidad y especificidad respecto a las técnicas mencionadas anteriormente. Este método consiste en la conversión del miRNA en cDNA mediante una transcripción reversa, seguido de su amplificación por PCR (Fig. 2). Para ello, es necesario el previo alargamiento de la molécula de miRNA mediante la hibridación con cebadores específicos o la ligación de adaptadores, pues el reducido tamaño de la molécula de miRNA limita la aplicación directa de los protocolos convencionales de RT-PCR (Kramer, 2011). Algunos de los cebadores empleados para hacer la RT contienen una secuencia específica del miRNA a amplificar y se diseñan con una estructura lineal (Fig. 3A) o en forma de horquilla (stem-loop) (Fig. 3B). Otras estrategias consisten en añadir una cola común al extremo 3' de todos los miRNAs, como es el caso de la adición de poli(A) (Fig. 3C), o bien la ligación con una T4 RNA ligasa de un adaptador de secuencia conocida (Fig. 3D), en cuyo caso la reacción RT se llevaría a cabo a partir de un cebador oligo dT o un cebador universal complementario al adaptador, respectivamente. Uno de los sistemas más ampliamente utilizado es la retrotranscripción con un cebador en forma de horquilla (stem-loop), ya que su estructura presenta una serie de ventajas como son la mejora de la estabilidad del dúplex cebador/RNA, y además, a diferencia de los cebadores lineales, previene las uniones no específicas con otras moléculas de RNA y es capaz de discriminar entre miRNA maduro y sus precursores, mejorando la especificidad del método (Li y Ruan, 2009). 10 Figura 2. Esquema que muestra el ensayo de RT-PCR stem-loop de los miRNAs. Primero tiene lugar una RT (transcripción reversa) seguido de una PCR convencional. El cebador RT stem-loop se une al extremo 3' de la molécula de miRNA, iniciando su transcripción reversa. A continuación, el producto de RT es amplificado utilizando un cebador directo específico del miRNA y un cebador reverso universal. (Varkonyi-Gasic, 2007) Figura 3. Representación esquemática de las alternativas metodologías de transcripción inversa de los miRNAs. (A) Cebador stem-loop (B) Cebador lineal. (C) Adición de cola poli(A). (D) Unión de adaptador por T4 RNA ligasa (Benes y Castoldi, 2010). 1.3.1.3. miRNAs y la respuesta a estrés. Los distintos estreses ambientales hacen que las plantas modifiquen la expresión de determinados miRNAs o sinteticen nuevos para hacer frente al estrés. El papel que juegan estos miRNAs en la respuesta de la planta frente a un estrés fue sugerido a partir de la predicción de las dianas de los miRNAs y los estudios de perfiles de expresión de miRNAs durante dicha respuesta. A D C B 11 Numerosos estudios realizados en plantas modelo sometidas a condiciones de estrés biótico y abiótico, incluyendo deficiencia de nutrientes, sequía, frío, salinidad, infecciones bacterianas, radiación UV y tensión mecánica, han permitido la identificación de miRNAs implicados en la regulación de las respuestas a estrés (Khraiwesh et al., 2012). Uno de los estudios iniciales fue el realizado por Sunkar y Zhu en 2004, quienes construyeron librerías de pequeños RNAs de plantas de Arabidopsis thaliana sometidas a estrés por frío, estrés salino, sequía y tratadas con diferentes hormonas, e identificaron miRNAs que se acumulaban de forma diferencial en los tratamientos. Entre otros estudios centrados en la investigación del papel de los miRNAs en la respuesta a estrés, destacan los realizados en cultivos de algodón con distinta resistencia a salinidad (Yin et al., 2012) y en plantas de melón tanto resistentes como susceptibles al pulgón herbívoro (Sattar et al., 2012), en los cuales se identificaron alteraciones en la expresión de estas moléculas. Según ha sido comprobado por diversos ensayos, puede ser que un miRNA responda a un mismo estrés de forma diferente dependiendo de la especie de planta, o que diferentes miRNAs respondan a un mismo estrés de una manera similar (Zhang, 2015). Por otra parte, el alto grado de complementariedad entre los miRNAs y sus dianas proporciona un poderoso enfoque para predecir y validar los genes diana de los miRNA en las plantas. Es bien sabido que la mayoría de los miRNAs sensibles a estrés se dirigen a factores de transcripción, por lo que dichos factores también juegan un papel importante durante la respuesta de la planta a diferentes estreses medioambientales. A pesar de que muchos estudios se han centrado en la expresión aberrante de ciertos miRNAs inducida por unos pocos estreses en diferentes especies, algunas de ellas de interés agronómico, la aplicación de estos conocimientos a nivel práctico resulta difícil, pues la información obtenida está incompleta. Hasta el momento no se ha realizado un análisis sistemático de la acumulación global de pequeñas especies de sRNAs en respuesta a muchos estreses sobre una única especie vegetal. El presente trabajo muestra un pequeño apartado de un estudio mucho mayor conducente a salvar este inconveniente en melón. Los resultados obtenidos podrían ser usados para desarrollar estrategias que permitieran mejorar el rendimiento de dicho cultivo cuando se desarrolla en condiciones de estrés, no sólo por medio de la manipulación de los genes de respuesta a estrés, sino también de los miRNAs que los regulan (Saini et al., 2012). 12 2. OBJETIVOS El objetivo general de este trabajo se centra en la puesta a punto de un método de detección y análisis de la expresión de miRNAs, con el fin de validar los resultados obtenidos de un estudio previo de secuenciación masiva de librerías de pequeños RNAs provenientes de plantas de melón (Cucumis melo) sometidas a diversos tipos de estreses tanto abióticos como bióticos. Con esta finalidad, se siguieron los siguientes objetivos parciales: 1. Amplificación por RT-PCR de algunos posibles miRNAs detectados en análisis previos de secuenciación masiva. 2. Clonación y secuenciación de los miRNAs amplificados para identificarlos y confirmar la validez de la técnica de RT-PCR empleada. 3. Análisis de la expresión diferencial de miRNAs por RT-PCR a tiempo real y validación de los resultados obtenidos por secuenciación masiva. 4. Predicción mediante aproximaciones bioinformáticas de los mRNAs de melón que son potenciales dianas de los miRNAs analizados. 5. Análisis por RT-PCR a tiempo real de los niveles de acumulación de los mRNAs diana de los miRNAs analizados. 13 3. MATERIALES Y MÉTODOS 3.1. Material vegetal. Los distintos análisis realizados en este trabajo se llevaron a cabo a partir de muestras de plantas de melón sometidas a diversos tratamientos, los cuales se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Condiciones ambientales en las que crecieron las plantas de melón. Las muestras se tomaron 24 días a partir de la siembra de las plantas y 11 días después de haber realizado el tratamiento. 3.2. Extracción de sRNAs a partir de RNA total. La purificación de los pequeños RNAs de las plantas control así como las sometidas a los diferentes estreses (apartado 3.1.) se realizó partiendo de muestras de RNA total siguiendo las instrucciones detalladas en el kit “REALTOTAL miRNA kit” (Durviz SL, Paterna, Valencia) con ligeras modificaciones. Al tratarse de RNA total previamente purificado se empleó el protocolo descrito en el manual para la extracción de miRNAs a partir de muestras de sangre. Esta extracción comienza con la adición de un tampón de lisis, que proporciona las sales necesarias para facilitar una posterior precipitación de los ácidos nucleicos con etanol. A continuación se añade etanol a una concentración final de 35%, que precipita selectivamente los RNAs de mayor tamaño, los cuales quedan retenidos en una columna (“LargeRNA renoval Spin Column”). Al eluido se le añade etanol, y es ensamblado en una columna “microRNA”, en la que quedan acumulados estos pequeños RNAs. Mediante un tampón de lavado de RNA se eliminan las sales residuales, y finalmente, con un tampón de elución de RNA, los microRNAs son recogidos en un tubo eppendorf, los cuales pueden ser almacenados a largo plazo a -70oC, o a corto plazo a -20oC. Condición ambiental Tratamiento Frío Temperatura día/noche (18oC/15oC) Salinidad Un riego con LiCl (200 mM) Día corto Ciclos de luz/oscuridad (12hs/12hs) Sequía Cese del riego Monosporascus Inoculación del sustrato con esporas (50000 ufc) HSVd Agrotransformación con plásmido de sobreexpresión del viroide Agrobacterium Inoculación de Agrobacterium tumefaciens 14 Por último, los sRNAs purificados son cuantificados en un espectrofotómetro NanoDrop® ND-1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EEUU). 3.3. Reacción de Transcripción Reversa (RT) de los sRNAs. Para la síntesis del cDNA de los miRNAs se empleó como cebador un oligo en forma de horquilla (stem-loop) (Fig. 4) con una secuencia en su extremo 3’ complementaria a los 6-7 nucleótidos de la secuencia del miRNA que se desea amplificar (Tabla 4) (apartado 1.3.1.2., “Caracterización de miRNAs predichos”). Como paso previo a la reacción se realizó una desnaturalización de estos cebadores (95oC durante 10 minutos) seguida de una lenta renaturalización con el fin de asegurar un correcto plegamiento del oligo. La RT se realizó utilizando el kit " RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit" (Thermo Scientific). Para llevar a cabo la reacción de transcripción reversa, se elaboró una mezcla que contenía: 1 µl de dNTPs Mix (10 mM), 2 µl de sRNA (conteniendo cantidades variables de entre 1 y 100 ng totales) y 2 µl de agua estéril. Esta mezcla se incubó a 65oC durante 5 minutos, con el objetivo de romper la estructura secundaria de los sRNAs y evitar así la detención de la RT. A continuación, a esta misma mezcla se le añadieron 2 µl de tampón de reacción 5x, 0,2 µl de RiboLock RNase Inhibitor (200 U/µl), 0,2 µl de RevertAid M-MuLV RT (20 U/µl), 1 µl del cebador RT específico (1µM) y 2 µl de agua estéril. Para aumentar la eficiencia de la reacción, se realizó una RT pulsada, cuyo protocolo de incubación se muestra en la Figura 5. Asimismo se llevaron a cabo controles de reacción negativos a los que no se añadía transcriptasa reversa. Figura 4. Secuencia universal del cebador stem-loop para RT. Incluye una secuencia para la unión de la sonda UPL#21 (Universal ProbeLibrary Probe 21) que permite el uso de sondas TaqMan para la detección en PCR cuantitativa. (Varkonyi-Gasic y Hellens, 2010) UPL probe #21 STEM-LOOP PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAAC-3’ 15 Tabla 4. Secuencias del cebador específico para la RT de cada miRNA analizado. En minúsculas, la secuencia específica del miRNA. Figura 5. Protocolo de RT pulsada. En la parte de arriba se representa la temperatura y en la de abajo el tiempo. 3.4. Amplificación de miRNAs por PCR. El cDNA correspondiente a cada miRNA y de cada una de las muestras fue amplificado por PCR. Para ello, se partió de una dilución 1:10 en agua MiliQ de cada uno de los productos de RT y se añadieron en tubos eppendorf los reactivos necesarios para que tenga lugar la reacción, incluyendo: 2 μl de cDNA, 5 μl de cebador directo (1 μM), 0,5 μl de cebador reverso (10 μM), 0,5 μl de dNTPs (10 mM), 1,5 μl de buffer 10x, 0,5 μl de Taq-polimerasa Netzyme® (1U/ μl) y 5 μl de agua estéril, resultando un volumen final de 15 μl para cada miRNA. Las secuencias del cebador directo específico para cada miRNA así como el reverso universal se muestran en la Tabla 5. miRNA miRNA sequence RT Primer sequence miR159 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACtagagc miR160 TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACtggcat miR162 TCGATAAACCTCTGCATCCAG GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACtagagc miR166 TCGGACCAGGCTTCATTCCCC GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACggggaa miR168 TCGCTTGGTGCAGGTCGGGAA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACttcccg miR397 CATTGAGTGCAGCGTTGATGT GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACacatca miR398 TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACcagggg miR408 ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACgccagg 16 Tabla 5. Secuencias del cebador directo de PCR específico de cada miRNA y del cebador reverso universal. En mayúsculas, la secuencia específica del miRNA; en minúsculas, la cola de nucleótidos que se añade para equiparar las Tm. Los tubos se introdujeron en un termociclador de PCR Mastercycler® pro S (Eppendorf, Hamburgo, Alemania), donde se completó la amplificación siguiendo el proceso que se muestra a continuación: 1. Desnaturalización inicial 94oC 2 minutos 2. Desnaturalización 94oC 20 segundos 3. Alineamiento 58oC 30 segundos 4. Extensión 72oC 20 segundos 5. Extensión final 72oC 5 minutos 6. Conservación 4oC ∞ minutos Una vez terminada la reacción, se comprobó la detección de estos miRNAs mediante una electroforesis en gel de acrilamida al 10% en tampón TBE 10x. El gel se preparó a partir de una mezcla de 5 ml de acrilamida en una proporción 29:1 (acrilamida/bisacrilamida), 750 μl de TBE 10x, 9 ml de agua estéril, 200 μl de persulfato amónico (APS) al 10% y 10 μl de TEMED. Las muestras corrieron 30 minutos a 200 voltios, el gel fue incubado en una solución de bromuro de etidio y finalmente, las bandas se observaron en un transiluminador con luz ultravioleta a 250 nm. 3.5. Secuenciación de los productos de PCR. Los productos de PCR fueron tratados con exonucleasas (ExoSAP-IT®). Para ello, se mezclaron 5 µl de producto de PCR y 2 µl de exonucleasas y se incubó, primero a 37oC durante 15 minutos para degradar los cebadores y nucleótidos restantes, y luego a 80oC durante 15 minutos para inactivar el reactivo ExoSAP-IT. Posteriormente, se procedió a la secuenciación miRNA Forward Primer sequence Universal Reverse Primer sequence miR159 gcgccTTTGGATTGAAGGGAG GTGCAGGGTCCGAGGTATTC miR160 ctagtTTGCCTGGCTCCCTG miR162 gcgccTTTGGATTGAAGGGAG miR166 gcgaaTCGGACCAGGCTTC miR168 gggtatTCGCTTGGTGCAGG miR397 ccatgcCATTGAGTGCAGCG miR398 gcgcaTGTGTTCTCAGGTCG miR408 ccgcaATGCACTGCCTCTTC 35 ciclos 23 a lo observado en la bibliografía existente relacionada con la detección de miRNAs (Kramer et al., 2011; Czimmerer et al., 2013). Normalmente, las reacciones RT son llevadas a cabo entre 40-50oC y estas bajas temperaturas pueden contribuir a la no especificidad relativa de la reacción. Esto, además, resulta un problema cuando las concentraciones de la muestra de partida son muy bajas. Es por ello, que en una RT normal, las reacciones secundarias no específicas pueden competir fuera de la reacción deseada y, si la concentración de la verdadera diana es suficientemente baja, se produce la inhibición completa del producto específico de amplificación (Bustin, 2002). Por esta razón, se realizó una reacción RT pulsada (apartado 3.3.), en la que los tiempos de exposición a las diferentes temperaturas son menores y en la que se estabiliza el cebador al hibridar a baja temperatura, con el fin de incrementar la eficiencia de la RT y reducir también las interacciones no específicas entre los cebadores para los diferentes miRNAs. Asimismo, este tipo de reacción proporciona una mejor sensibilidad de detección comparado con una condición no pulsada (Tang et al., 2006). 4.1.2. Amplificación por PCR. El segundo paso consiste en la amplificación por PCR del cDNA. Para ello se empleó un cebador reverso universal presente en la horquilla del oligo empleado en la transcripción reversa y un cebador directo específico del miRNA consistente en la secuencia de miRNA (excepto los seis últimos nucleótidos del extremo 3’) con la adición de una cola de 5-7 nucleótidos en el extremo 5’ necesaria para equiparar la Tm a la del cebador reverso universal (Fig. 8). El producto de la reacción fue visualizado por tinción con bromuro de etidio de un gel de poliacrilamida. Según puede observarse en la figura 9 se obtuvo un producto específico para todos los miRNAs ensayados con el tamaño esperado de amplicón (60 nucleótidos); si bien la cantidad de producto observada para cada uno de ellos no se correspondía con la abundancia determinada en las librerías (Fig. 9B), ello podría deberse a diferencias en la eficiencia de unión del cebador para la RT o la amplificación de los diferentes oligos. Por otra parte, los controles negativos (reacciones de RT sin transcriptasa reversa) no dieron lugar a productos visibles en las mismas condiciones (datos no mostrados). 24 Figura 8. Ejemplo de diseño de los cebadores para la amplificación de miRNAs por RT-PCR. Caso particular del miRNA166. La secuencia del cebador reverso universal obtenido a partir de la secuencia del cebador RT stem-loop. La secuencia del cebador directo específico es la complementaria del miRNA con 5 nucleótidos añadidos para conferir una Tm de 60oC. Por último, diseño del oligo para secuenciar el producto de PCR. Figura 9. Resultados de la detección de los miRNA por RT-PCR. (A) Resultado en gel de poliacrilamida de la presencia de los miRNAs seleccionados en una muestra de melón de planta sana. (B) Datos en CPM de la abundancia de cada miRNA obtenidos mediante herramientas informáticas a partir de los datos de secuenciación masiva. 4.1.3. Evaluación de los productos de PCR por secuenciación. Si bien los productos de la reacción de PCR tenían el tamaño esperado, para verificar que la secuencia amplificada se correspondía con el miRNA en cuestión y no era un producto inespecífico o un artefacto se procedió a secuenciar los amplicones obtenidos. En primera instancia se llevó a secuenciar el producto de PCR tratado con exonucleasas utilizando como cebador una pequeña secuencia diseñada en el extremo 5’ (apartado 4.1.2., Fig. 8). Al tratarse de una secuencia tan pequeña, se encuentra por debajo del límite mínimo requerido para obtener una secuencia de calidad, no pudo leerse la secuencia completa del miRNA, a pesar de ello, con esta aproximación se obtuvieron secuencias únicas con una homología de miRNA166 5’-TCGGACCAGGCTTCATTCCCC-3’ STEM-LOOP PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAAC-3’ RT-PRIMER 5’-GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACggggaa cDNA 5’- GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACGGGGAATGAAGCCTGGTCCGA-3’ UNIVERSAL PRIMER 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’ ESPECIFIC PRIMER 3’-CTTCGGACCAGGCTaagcg-5’ PRODUCTO PCR 5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACGAGCCAACGGGGAATGAAGCCTGGTCCGAttcgc-3’ SECUENCIACIÓN 5’-tgttaGTGCAGGGTCCG-3’ UPL #21 159 160 162 166 168 397 398 408 miRNA CPM Mir159 1170 Mir160 145 Mir162 606 Mir166 8200 Mir168 640 Mir397 35 Mir398 18 Mir408 75 AB A B B 25 aproximadamente el 80% a la secuencia esperada (Fig. S2). Así, podía decirse que se trataba de productos específicos para cada miRNA. Corroborada de forma aproximada la bondad de la técnica empleada y con el fin de obtener la secuencia exacta del miRNA amplificado se procedió a clonar los amplicones en un vector bacteriano para su posterior secuenciación. El vector empleado fue el pTZ57R/T, que inserta fragmentos con extremos de adenina dentro un gen lacZ, interrumpiendo generalmente su expresión e impidiendo, por tanto, la producción de β-galactosidasa. Por esta razón, las bacterias transformadas por un plásmido recombinante y crecidas en un medio con X-gal aparecerían de color blanco, mientras que las que contuvieran el plásmido vacío adquirirían un tono azulado. Los resultados obtenidos tras la transformación mostraron que prácticamente la totalidad de las colonias crecidas eran azules, y sólo en unos pocos casos, y después de reducir la concentración de X-gal en las placas unas 4 veces, se obtenían colonias blancas. Por esta razón, la presencia del inserto se confirmó mediante una PCR de colonia. Este análisis estructural tanto de los plásmidos recombinantes como de los no recombinantes no sólo tiene este objetivo, sino que también determina la orientación de dichos insertos. Para cada miRNA se analizaron un total de 8 colonias utilizando un cebador específico del miRNA (apartado 3.4., Tabla 5, cebador directo) junto con un cebador específico del vector (M13 directo o M13 reverso)(aparatado 3.6.3., Tabla 6). La práctica totalidad de las colonias azules analizadas por PCR de colonia contenían un plásmido con inserto (Fig. S3). Ello se debería a que la secuencia introducida, de 60 nucleótidos, no sólo no altera la pauta de lectura del gen lacZ, sino que además, la adición de esos 20 aminoácidos extra a la secuencia de la β-galactosidasa no afecta a su actividad, resultando en colonias azules. A continuación se llevaron a secuenciar 5 minipreps procedentes de colonias que habían dado positivo en la PCR de colonia utilizando el oligo M13 directo como cebador, resultando que el 100% de ellas contenían una secuencia idéntica al miRNA sobre el cual se había realizado la RT-PCR. Así, pudimos comprobar que la técnica de stem-loop RT-PCR empleada resulta efectiva para la detección y amplificación específica de miRNAs. 4.1.4. Determinación de la cantidad mínima detectable por RT-PCR. Una vez comprobada la amplificación de los miRNAs de las bandas a partir de 50 ng de un extracto de pequeños RNAs, se estudió cuál sería la cantidad mínima de RNA necesaria para su detección, ya que se trata de muestras valiosas y, además, hay que consumir RNA por cada miRNA a estudiar debido a que son reacciones específicas. Para ello, se realizaron RT a partir de distintas cantidades de RNA (50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng y 1 ng), amplificando de forma específica los miRNAs 160, 166 y 168 (Fig. 10), seleccionados por presentar diferentes niveles de acumulación según los datos obtenidos de las librerías de sRNAs secuenciadas (Fig. 10B). 26 Los resultados obtenidos reflejan que los tres miRNAs son detectados a partir de tan sólo 1 ng de RNA inicial. Además, si bien no se observan diferencias en la intensidad de las bandas para cada miRNA amplificado a partir de 50 y 25 ng de sRNA, éstas empiezan a hacerse patentes cuando se disminuye la cantidad de RNA de partida, existiendo una correlación entre la cantidad de producto de PCR y la abundancia del miRNA observada en las librerías de sRNAs (CPM). Todo ello apunta a una eficaz amplificación de los miRNAs, lo cual hace posible un análisis cuantitativo de los mismos en las diferentes muestras. Figura 10. Resultado de la amplificación de los miRNAs 160, 166 y 168, partiendo de distintas cantidades de sRNAs. (A) Resultado de las electroforesis en gel de poliacrilamida de las RT realizadas a partir de distintas cantidades de RNA (50 ng, 25 ng, 10 ng, 5 ng y 1 ng). (B) Datos de la abundancia de los miRNAs 160, 166 y 168 obtenidos a partir de las librerías de sRNAs medida en cuentas por millón. 4.2. Validación de la acumulación diferencial de miRNAs por RT-qPCR. 4.2.1. Eficiencia de la qPCR para los miRNAs. Aunque observamos que por RT-PCR convencional se pueden detectar miRNAs a partir de 1 ng de sRNA (apartado 4.1.4), estudios previos realizados en el laboratorio pusieron de manifiesto que para obtener unos niveles detectables de un determinado miRNA en qPCR es preciso partir de al menos 100 ng de sRNA. Ello podría deberse a que el amplicón resultante de la reacción de PCR (60 nt) se encuentra por debajo del umbral para el cual ha sido diseñada la técnica. Así, esa es la cantidad de sRNA que se emplea en la RT para los análisis de acumulación relativa de miRNAs en las diferentes muestras. Para determinar experimentalmente la eficiencia de la qPCR, se generó una curva estándar para cada miRNA a estudiar, así como de sus respectivos mRNAs dianas, mediante la realización de una qPCR a partir de diluciones seriadas de una mezcla de las distintas muestras. La determinación de esta eficiencia resulta una herramienta excelente para probar la eficiencia del ensayo, la precisión, la sensibilidad y el rango de trabajo, y es calculada a partir de la pendiente de la recta usando la ecuación: Eficiencia = 10 (-1 / pendiente) -1. 1 112 1 123 2 2 23 3 3 3 50 ng 25 ng 10 ng 5ng 1ng miRNA CPM 1 miRNA166 8200 2 miRNA168 640 3 miRNA160 145 A B 1 112 1 123 2 2 23 3 3 3 50 ng 25 ng 10 ng 5ng 1ng miRNA CPM 1 miRNA166 8200 2 miRNA168 640 3 miRNA160 145 A B AB miRNA CPM 1 miR166 8200 2 miR168 640 3 miR160 145 B 27 Si, finalmente, la PCR es 100% eficiente, la cantidad de cDNA se doblará con cada ciclo y la pendiente de la curva estándar será -3.33 (100 = 100% = 10 (-1 / -3,33) -1). Por tanto, una pendiente entre -3.9 y -3,0 (Eficiencia 80 a 110%) es aceptable. En general, los resultados obtenidos mostraron una eficiencia del 90-110% (Fig. S4), salvo los miRNAs 160 y 166, cuyos valores eran mayores debido a su baja abundancia, por lo que nos encontramos en el límite de detección. 4.2.2. Análisis de la expresión diferencial de los miRNAs. Uno de los objetivos principales de este estudio consiste en la validación biológica mediante el método RT-qPCR de una serie de miRNAs obtenidos previamente por secuenciación masiva y que se encuentran diferencialmente representados en librerías. El análisis bioinformático de la acumulación relativa de las secuencias en las librerías de sRNAs no forma parte del ámbito de este trabajo, no obstante, a continuación hago una presentación somera de aquellos resultados previos obtenidos en nuestro laboratorio que son necesarios para la comprensión de los resultados. Las secuencias fueron analizadas por el Servicio de Bioinformática del IBMCP, y a partir de ellas se detectaron diferencias significativas basándose en el número de lecturas (CPM) obtenidas para cada una de ellas. Estas diferencias fueron medidas en valores de LogFoldChange (logaritmo en base dos del ratio muestra tratada/control) (Tabla 9), el cual indica la variación producida en la acumulación de una secuencia sometida a un determinado tratamiento respecto a la muestra no tratada. Por una parte, que este valor sea positivo o negativo indica una mayor expresión en las muestras procedentes de plantas sometidas a una situación potencialmente estresante o en plantas control, respectivamente. Tabla 9. Valores de Log Fold Change de los miRNAs para cada una de las muestras. Los valores que se encuentran en celdas coloreadas presentan un p-value < 0,05, es decir, son estadíticamente significativos. Los distintos colores representan el nivel de acumulación de los miRNAs en cada una de las muestra respecto al control, reflejado en la escala de colores, debajo de la tabla. miRNA Sequence COLD DROUGH T SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO. miR159 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA -0,68 -0,25 0,46 0,02 0,10 -0,01 -0,15 miR160 TGCCTGGCTCCCTGTATGCCA -2,20 -0,77 0,02 0,29 -0,84 -1,21 -0,15 miR162 TCGATAAACCTCTGCATCCAG 1,27 -0,26 0,09 0,44 0,24 -0,05 0,52 miR166 TCGGACCAGGCTTCATTCCCC -2,63 -0,02 1,11 -0,27 0,51 -0,63 0,31 miR168 TCGCTTGGTGCAGGTCGGGA A -4,04 -2,58 0,02 -0,72 -1,07 -1,78 -0,51 miR397 CATTGAGTGCAGCGTTGATGT 8,50 11,64 10,81 9,85 miR398 TGTGTTCTCAGGTCGCCCCTG 8,09 9,17 -0,69 -0,74 -0,44 10,62 9,30 miR408 ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC 1,89 6,43 0,38 -1,93 -1,80 6,13 7,38 ≥3 2 1 0 -1 -2 ≤-3 28 Para obtener una cuantificación relativa precisa de los miRNAs es necesario evaluar también el nivel de acumulación de una pequeña secuencia que se mantenga constante en las diferentes muestras analizadas y que actúe como control endógeno. Usando este control como una referencia activa, es posible normalizar la cuantificación de los miRNAs y así compensar las diferencias existentes como consecuencia de variaciones en la cantidad de cDNA en cada reacción. Algunos de los factores que causan las diferencias en la cantidad de cDNA haciendo necesaria esta normalización son la imprecisión en la medida del RNA tras la extracción, las diferencias en la integridad del RNA, así como errores durante el pipeteo. Puesto que a priori no disponíamos de información acerca de miRNAs que permanecieran estables en las diferentes muestras analizadas, los buscamos en la información procedente de la secuenciación de las diferentes librerías de sRNAs. Así, seleccionamos los miRNAs 159 y 162 como controles de referencia, por mostrar una homología del 100% con miRNAs previamente descritos (lo cual los identificaba como verdaderos miRNAs), tener unos niveles medios de abundancia, y no presentar diferencias importantes (LFC <1,2) en los valores de expresión entre las muestras sometidas a estrés y el control. La acumulación relativa de ambos miRNAs fue analizada por qPCR observándose que los valores de expresión se encuentran alrededor de 1 en todas las muestras, es decir, no difieren con los observados en las muestras procedentes de las plantas no sometidas a condiciones de estrés. A continuación se realizó la media geométrica de los valores observados en cada uno de los miRNAs de referencia para cada muestra. Estos datos son los que se utilizaron para normalizar los resultados de los miRNAs a validar (Fig. 11). Figura 11. Representación de los resultados obtenidos en el análisis de expresión de los controles endógenos para la validación de los miRNAs. Es un control normalizador que resulta de la media geométrica obtenida a partir de los miRNAs 159 y 162, habiendo realizado dos réplicas para cada uno de ellos. A continuación, para validar la predicción bioinformática, se analizó la expresión diferencial de cuatro miRNAs distintos por qPCR (miR160, miR166, miR397 y miR398). Los datos de expresión relativa se calcularon mediante el método ΔΔCt, en el que primero se normaliza con el control de referencia y luego con la muestra no tratada. Los resultados se muestran en la figura 12. 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORTDAY MONOSP. HSVd AGRO 29 En primer lugar, se estudió el miRNA 397. Como se puede observar existe una sobrexpresión de este miRNA en las muestras sometidas a estrés por frío y sequía y en respuesta a la infección con HSVd y Agrobacterium, mientras que en el resto de muestras no se producen cambios significativos respecto al control. Estos resultados se correlacionan con los datos provenientes de las librerías, ya que éstos muestran unos valores positivos y elevados de LFC para aquellas muestras en las que se refleja gráficamente un mayor cambio (FC) (Fig. 12A). Por otra parte, los niveles de acumulación de este miRNA en las librerías procedentes de muestras crecidas en condiciones de salinidad, día corto e infección con Monosporascus no fueron lo suficientemente abundantes y/o consistentes como para reflejar un valor, y se consideró no detectable. Sin embargo, por qPCR somos capaces de detectar una leve expresión; ello podría deberse a que cuando los niveles de expresión son tan bajos que se encuentran cerca del límite de detección aumenta la señal debida a productos de reacción inespecíficos. Resultados similares presenta el miRNA 398 (Fig. 12B). Al igual que en el caso anterior, en éste también se observa una alta expresión en frío, sequía, HSVd y Agrobacterium, mientras que en salinidad, día corto y Monosporascus apenas era detectado. En general, existe una cierta correlación entre los resultados de la qPCR y los de las librerías, aunque ésta no es exacta, ya que gráficamente, debería mostrar mayor abundancia las muestras tratadas con HSVd en vez de sequía. En el caso de los miRNAs 160 (Fig. 12C) y 166 (Fig. 12D), los cambios de expresión producidos en las distintas muestras son mucho menores en comparación con los dos miRNAs anteriores. Respecto al primero de ellos, se puede apreciar una cierta correlación con los valores obtenidos de la secuenciación masiva, pues en todos los tratamientos se muestra una menor expresión que en el control, mientras que en el segundo miRNA, esta correlación no es del todo percibida. Esto podría deberse al tamaño de las secuencias que se pretenden detectar, el cual es mucho menor que el mínimo que requiere esta técnica para asegurar una buena cuantificación, por lo que la sensibilidad de la qPCR se ve afectada. Por esta razón, resultará más difícil la detección de un miRNA en aquellas muestras en las que el cambio de expresión frente al control no es lo suficientemente grande. Por otra parte, según se vio en el apartado 4.2.1., la eficiencia de la reacción para estos miRNAs estaba fuera de los límites aceptables, lo cual hace que sea menos precisa la evaluación del cambio. En general observamos que la amplitud del cambio observado por qPCR es mucho menor a lo detectado en la secuenciación masiva de las librerías de sRNAs. Así, se pone de manifiesto que la segunda técnica es mucho más eficiente y sensible en la detección de pequeñas secuencias. Asimismo, se pone en entredicho la bondad de la validación biológica utilizando técnicas como la qPCR, pues sólo permite detectar de forma fiable aquellas secuencias con una magnitud de cambio entre las muestras considerablemente grande. Una posible solución para aumentar la sensibilidad de la qPCR y mejorar así la detección podría ser el uso de sondas Taqman en lugar de realizar la cuantificación a partir de fluoróforos que se intercalan como en este caso lo es el EVA Green empleado en la reacción. 30 Figura 12. Resultados de la validación biológica de los miRNAs por qPCR. Las gráficas muestran la expresión diferencial de los miRNAs obtenida mediante qPCR en cada uno de los diferentes estreses. Esta expresión está medida en magnitudes de cambio (FC) y representada en escala logarítmica en base 2. Las tablas muestran los valores de LFC pertenecientes a las librerías. Las celdas coloreadas presentan un p-value < 0,05, por lo que representan valores significativos. (A) Validación del miRNA397. (B) Validación del miRNA398. (C) Validacón del miRNA160. (D) Validación del miRNA166. 0,3 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 16,0 32,0 64,0 128,0 256,0 MIR398 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO 8,09 9,17 -0,69 -0,74 -0,44 10,62 9,30 MIR397 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO 8,50 11,64 10,81 9,85 0,5 1,0 2,0 4,0 8,0 16,0 32,0 64,0 0,3 0,5 1,0 2,0 MIR160 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO -2,20 -0,77 0,02 0,29 -0,84 -1,21 -0,15 0,5 1,0 2,0 MIR166 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO -2,63 -0,02 1,11 -0,27 0,51 -0,63 0,31 A B C D 31 4.3. Análisis de la acumulación diferencial de los mRNAs. 4.3.1. Predicción de las potenciales dianas de los miRNAs estudiados. A continuación, se procedió a la búsqueda de los posibles mRNAs diana cuya acumulación podría estar regulada por los miRNAs estudiados en el apartado anterior. Con esta finalidad, se utilizó la herramienta psRNA Target (Dai y Zhao, 2011), que permite analizar distintas secuencias mediante la realización de una serie de alineamientos, obteniendo así los mejores candidatos como posibles mRNA diana. Este análisis se basa en dos parámetros principales que son, la expectativa y la UPE, los cuales miden la complementariedad entre el miRNA y su diana, y accesibilidad del mRNA por su correspondiente miRNA, respectivamente. Una vez obtenidas aquellas secuencias que se presentan como mejores candidatos a ser mRNAs dianas de los miRNAs anteriores, se determinó la función de cada uno de ellos mediante la búsqueda de secuencias homólogas bien en melón o en otras especies. Para ello, se utilizó la herramienta bioinformática BLASTx (Altschul et al., 1997). Los resultados obtenidos quedan recogidos en la Tabla 10. Tabla 10. mRNAs dianas seleccionados como mejores candidatos a ser regulados por cada miRNA. 4.3.2. Eficiencia de la qPCR para los mRNAs dianas. Del mismo modo a como se procedió en el caso de la validación biológica de los miRNAs, como paso previo a la evaluación de la expresión de los mRNAs diana se realizó un análisis de la eficiencia de la qPCR. Los detalles de la reacción se muestran en el apartado 3.9.1. de materiales y métodos. En esas condiciones se observó que la eficiencia de la reacción oscilaba miRNA DIANA FUNCIÓN miR160 Cucumis melo auxin response factor 17 (ARF17) (XM_008447139.1) Regula los genes de respuesta temprana a la auxina, encargada de la elongación de las células. miR166 Cucumis melo DNA-directed RNA polymerase I subunit RPA12-like (XM_008447114.1) Enzima encargada del proceso de transcripción produciendo RNA. miR397 Cucumis melo laccase-4-like (XM_008444242.1) Enzima encargada de catalizar la oxidación de un substrato y de la reducción de oxígeno a agua. miR398 Cucumber peeling cupredoxin-like (XM_008458647.1) Enzima que contiene uno o más iones de cobre y que participa en procesos de óxido reducción y en el transporte de oxígeno. 32 en torno a 100 y 110% en todos los transcritos analizados, salvo en el caso del factor de respuesta a auxinas ARF17, que rondaba el 160%. Ello se debía a que los niveles de expresión de dicho gen eran muy bajos en las muestras analizadas, y tuvo que incrementarse la cantidad de cDNA de partida en 4 veces para que la eficiencia de la reacción llegara a límites aceptables. 4.3.3. Análisis de la expresión diferencial de los mRNAs dianas por RT-qPCR. Los mRNAs predichos a través de herramientas bioinformáticas se validaron biológicamente. Como en el caso de los miRNAs, éstos fueron normalizados con genes control, como el factor de ribosilación del ADP (Cucumis melo ADP-ribosylation factor-like; XM_008463181.1), la proteína profilina (Cucumis melo profilin; NM_001297545.1) o la actina (Cucumis melo actin-7; XM_008442791.1) (Fig. 13), cuya expresión no presenta cambios significativos entre las muestras sometidas a los distintos tratamientos de estrés (Kong et al., 2014). Figura 13. Representación de los resultados obtenidos en el análisis de expresión de los genes de referencia para la validación de los mRNAs. El factor de ribosilación del ADP, la proteína profilina y la actina son los genes control, ya que su expresión no presenta cambios significativos entre las distintas muestras. 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO. 1.0 0.5 2.0 ADP 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO. 1.0 0.5 2.0 PROFILINA 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 0,50 1,00 2,00 NT COLD DROUGHT SALINITY SHORT DAY MONOSP. HSVd AGRO. 1.0 0.5 2.0 ACTINA 39 ZHANG, B.; PAN, X.; COBB, G.P.; ANDERSON, T.A. (2006). Plant microRNA: a small regulatory molecule with big impact. Developmental Biology, 289(1): 3-16. ZHANG, B. (2015). MicroRNA: a new target for improving plant tolerance to abiotic stress. Journal of Experimental Botany, 66: 1749–1761. 40 7. ANEXO Figura S1. Producción mundial de melón entre los años 1993 y 2013. (FAOSTAT, 2015) Figura S2. Resultados de la secuenciación realizada tras la PCR de algunos de los miRNAs estudiados. La primera secuencia es la obtenida a partir de las librerías; la segunda es la obtenida tras la secuenciación después de haber realizado la amplificación. En azul se muestran las partes de las secuencias que coinciden. miR159 TTTGGATTGAAGGGAGCTCTA GCGCCTTGGATGAAGGAGCTCTAGTGTCCAGATTCAATT miR168 TCGCTTGGTGCAGGTCGGGAA ACATTGGGTATTCGCTTGGTGCAGGTCGGAAGTGTAAGAAC miR398 TGTGTTCTCCAGGTCGCCCCTG TATTGCGCATGTGTCTCAGGTCGCTCCCTGTGTCCCTCCTATAATA miR408 ATGCACTGCCTCTTCCCTGGC AAAACCGCAATGCACTGCCTCTGACCTGGCGTGACTATGCACATA 41 Figura S3. Resultados de las electroforesis en gel de agarosa para la detección de los clones de los distintos miRNAs. (A) Clones del miRNA 159; en la parte izquierda, a partir del cebador M13 directo y en la derecha, a partir del cebador M13 reverso. (B) Clones del miRNA 160. (C) Clones del miRNA 162. (D) Clones del miRNA 166. (E) Clones del miRNA 168. (F) Clones del miRNA 397. (G) Clones del miRNA 398. (H) Clones del miRNA 408. A C B 162 162 C D E F G H 42 Figura S4. Curva de eficiencia del miRNA159. Cada una de las curvas representa una dilución, siendo la primera curva la muestra menos diluida. Se observa como la distancia entre las diferentes curvas es proporcional por lo que la eficiencia de la reacción es aceptable.