Uni e sidad de Málaga
Facul ad de Ciencias
Depa amen o de Biología Molecula y Bioquímica
GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE
MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS PARA EL
ANÁLISIS FUNCIONAL DE GLUTAMINASAS
CEREBRALES
TESIS DOCTORAL
P og ama de Doc o ado en Bio ecnología A anzada
Ana Peñal e Alonso
Di ec o es:
Ja ie Má quez Gómez
F ancisco J. Alonso Ca ión
Málaga, 2016
AUTOR: Ana Peñal e Alonso
h p://o cid.o g/0000-0002-5799-6780
EDITA: Publicaciones y Di ulgación Cien í ica. Uni e sidad de Málaga
Es a ob a es á bajo una licencia de C ea i e Commons Reconocimien o-NoCome cial-
SinOb aDe i ada 4.0 In e nacional:
h p://c ea i ecommons.o g/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode
Cualquie pa e de es a ob a se puede ep oduci sin au o ización
pe o con el econocimien o y a ibución de los au o es.
No se puede hace uso come cial de la ob a y no se puede al e a , ans o ma o hace
ob as de i adas.
Es a Tesis Doc o al es á deposi ada en el Reposi o io Ins i ucional de la Uni e sidad de
Málaga (RIUMA): iuma.uma.es
Facul ad de Ciencias
Depa amen o de Biología Molecula y Bioquímica
MIGUEL ÁNGEL MEDINA TORRES, Di ec o del Depa amen o de Biología
Molecula y Bioquímica de la Facul ad de Ciencias de la Uni e sidad de Málaga,
ACREDITA QUE: la Tesis Doc o al i ulada: “GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE
GLUTAMINASAS CEREBRALES”, que p esen a Dña. ANA PEÑALVER ALONSO pa a
op a al í ulo de Doc o en Ciencias, ha sido ealizada bajo la di ección de los
doc o es D. Ja ie Má quez Gómez, Ca ed á ico de Uni e sidad, y D. F ancisco J.
Alonso Ca ión, Ca ed á ico de Uni e sidad, ambos del Depa amen o de Biología
Molecula y Bioquímica de la Facul ad de Ciencias de la Uni e sidad de Málaga.
Y pa a que así cons e a los e ec os opo unos, i mo el p esen e en Málaga a 20 de
Junio de 2016.
Fdo.: Miguel Ángel Medina To es
JAVIER MÁRQUEZ GÓMEZ, Ca ed á ico de Uni e sidad del Depa amen o de
Biología Molecula y Bioquímica de la Uni e sidad de Málaga y
FRANCISCO JOSÉ ALONSO CARRIÓN, Ca ed á ico de Uni e sidad del
Depa amen o de Biología Molecula y Bioquímica de la Uni e sidad de Málaga,
CERTIFICAN que Dña. ANA PEÑALVER ALONSO, Licenciada en Biología po la
Uni e sidad Complu ense de Mad id, ha ealizado bajo nues a di ección los
abajos ecogidos en la p esen e Memo ia pa a op a al G ado de Doc o en
Ciencias po la Uni e sidad de Málaga. Así mismo, el p o eso J. Má quez ha sido el
u o de la doc o anda du an e oda su e apa p edoc o al.
Y pa a que así cons e a los e ec os opo unos, i man el p esen e en Málaga a 20 de
Junio de 2016.
Fdo. Ja ie Má quez Gómez Fdo. F ancisco J. Alonso Ca ión
Ca ed á ico Bioquímica y Biol. Molecula Ca ed á ico Bioquímica y Biol.
Molecula

Es e abajo ha sido sub encionado po el p oyec o de excelencia CVI-6656 de la
Conseje ía Inno ación, Ciencia y Emp esa, Jun a de Andalucía, po el p oyec o
RD12/0028/0013 de la ed de as o nos adic i os (RTA, p og ama RETICS,
Ins i u o de Salud Ca los III) y po el p oyec o SAF2015-64501-R del Minis e io de
Economía y Compe i i idad. La Conseje ía de Inno ación, Ciencia y Emp esa
(Jun a de Andalucía) concedió una beca p edoc o al del Plan de Fo mación de
In es igado es, de cua o años de du ación (2013-2016), a la in es igado a Dña.
Ana Peñal e Alonso. Pa e de los esul ados y me odologías ecogidas en la
p esen e Memo ia han dado luga a las siguien es publicaciones y comunicaciones:
 PEÑALVER, A., Campos-Sando al, J.A., Blanco, E., Ca dona, C., Cas illa, L.,
Ma ín-Ru ián, M., Es i ill-To ús, G., Sánchez-Va o, R., Alonso, F.J., Pé ez-
He nández, M., Colado, M.I., Gu ié ez, A., Rod íguez de Fonseca, F.,
Má quez, J. maLPA1 ecep o knockou mice ha e s ong de ici s on
b ain glu aminase (KGA) and MMP-9 enzymes wi h al e ed
hippocampal dend i ic spine mo phology o glu ama e gic py amidal
cells (en e isión en Jou nal o Neu ochemis y).
 Má quez, J., Campos-Sando al, J.A., PEÑALVER, A., Ma és, J.M., Segu a, J.A.,
Alonso, F.J., Rod íguez de Fonseca, F. B ain glu aminases and d ug
addic ion (en e isión en Neu ochemical Resea ch).
 Má quez, J., Ca dona, C., Ma ín-Ru ián, M., Lobo, C., PEÑALVER, A., Campos-
Sando al, J.A. Glu aminases in b ain: mul iple iso o ms o many
pu poses. Neu ochemis y In e na ional 8:1-5 (2015).
 PEÑALVER, A., Tosina, M., Ma ín-Ru ián, M., Campos-Sando al, J.A., Alonso,
F.J., Segu a, J.A., Ma és, J.M., Ramí ez, M.A., Gu ié ez-Adán, A., Má quez, J.
Design and gene a ion o a glu aminase GLS2 condi ional knockou
mice. T ansgenic Resea ch 23(5):901-902 (2014).
 Má quez, J., Ca dona, C., Campos-Sando al, J.A., PEÑALVER, A., Tosina, M.,
Ma és, J.M., Ma ín-Ru ián, M. Mammalian glu aminase isozymes in
b ain. Me ab. B ain Dis. 28: 133-137 (2013).
 PEÑALVER, A., Tosina, M., Ma ín-Ru ián, M., Campos-Sando al, J.A., Segu a,
J.A., Ma és, J.M., Ramí ez, M.A., Alonso, F.J., Gu ié ez-Adán, A., Má quez, J.
Design and gene a ion o a glu aminase Gls2 condi ional knockou mice.
P esen ación o al en el Cong eso conjun o Red RETICS de T as o nos
Adic i os RTA-SENC. G anada (2015).
 PEÑALVER, A., Campos-Sando al, J.A., SánchezVa o, R., Ca dona, C., Cas illa,
L., Blanco, E., Ma ín-Ru ián, M., Segu a, J.A., Ma és, J.M., Alonso, F.J.,
Gu ié ez, A., Rod íguez de Fonseca, F., Má quez, J. LPA1 ecep o
knockou mice show s ong de ici on glu ama e biosyn he ic enzyme
glu aminase (GLS, KGA) and al e ed mo phology o hippocampal and
co ical dend i ic spines. Pós e en el Cong eso conjun o Red RETICS de
T as o nos Adic i os RTA-SENC. G anada (2015).
 PEÑALVER, A., Tosina, M., Ma ín-Ru ián, M., Campos-Sando al, J.A., Alonso,
F.J., Segu a, J.A., Ma és, J.M., Ramí ez, M.A., Gu ié ez-Adán, A., Má quez, J.
Diseño y gene ación de dos modelos knock ou condicionales de
glu aminasa Gls2 y su implicación en p ocesos de adicción. P esen ación
o al en el Cong eso conjun o Red RETICS de T as o nos Adic i os RTA-SENC.
O iedo (2013).
JAVIER MÁRQUEZ GÓMEZ, Ca ed á ico de Uni e sidad del Depa amen o de
Biología Molecula y Bioquímica de la Uni e sidad de Málaga y
FRANCISCO JOSÉ ALONSO CARRIÓN, Ca ed á ico de Uni e sidad del
Depa amen o de Biología Molecula y Bioquímica de la Uni e sidad de Málaga,
AUTORIZAN a Dña. ANA PEÑALVER ALONSO a la lec u a y de ensa de es a
memo ia de Tesis Doc o al.
Así mismo, los co-di ec o es de la Tesis ce i ican que odas las publicaciones (y
comunicaciones a Cong esos) que a alan la p esen e memo ia de Tesis Doc o al no
han sido u ilizadas en esis an e io es y han sido gene adas, pa cial o o almen e, a
pa i de esul ados y me odologías desa ollados du an e la ealización de la
Tesis Doc o al de Dña. Ana Peñal e Alonso.
Y pa a que así cons e a los e ec os opo unos, i man el p esen e en Málaga a 20 de
Junio de 2016.
Fdo. Ja ie Má quez Gómez Fdo. F ancisco J. Alonso Ca ión
Ca ed á ico Bioquímica y Biol. Molecula Ca ed á ico Bioquímica y Biol.
Molecula
Tu o y Di ec o de la Tesis Co-di ec o de la Tesis
3. Elec opo ación de células ES mu inas con el ec o de ansgénesis 46
3.1 Diges ión enzimá ica del DNA plasmídico 46
3.2 Elec opo ación de las células ES mu inas con el ec o de ansgénesis 47
4. Selección y geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas 48
4.1 Selección con gene icina (G418) 48
4.2 Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas 48
5. Mic oinyección de células ES mu inas ansgénicas en emb iones en es adio
de 8 células 55
5.1 Supe o ulación de a ones Swiss 55
5.2 Ob ención de emb iones de a ones Swiss 56
5.3 Mic oinyección de las células ES mu inas ansgénicas 56
6. T ans e encia de los emb iones mic oinyec ados con células ES ansgénicas
a a ones 57
7. Geno ipado de a ones 58
8. Análisis de iabilidad de los a ones homocigo os Gls2 m1a/ m1a 59
9. C uce de la colonia Gls2 m1a/+ gene ada con animales que exp esan la Flp
ecombinasa 60
10. C uce de la colonia Gls2 m1c/ m1c con animales que exp esan la C e
ecombinasa 61
ANÁLISIS FENOTÍPICO MOLECULAR DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS
1. Análisis de los ansc i os GA median e qRT-PCR 62
1.1 Cuan i icación de los ansc i os GLS2 en animales WT,Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+ 62
1.2 Cuan i icación del ansc i o KGA en animales KOLPA1 63
2. Análisis de exp esión p o eica po inmuno ans e encia Wes e n 64
2.1 Ex acción y cuan i icación de p o eínas 64
2.2 Inmuno ans e encia Wes e n 66
3. Análisis de exp esión de isoenzimas GA median e cuan i icación de la
ac i idad enzimá ica 67
4. Inmunohis oquímica de iso o mas GA en animales KOLPA1 68
5. Ca ac e ización de la mo ología de espinas dend í icas en a ones KOLPA1 69
6. Análisis po zimog a ía en gel pa a la de e minación de la ac i idad
enzimá ica 70
6.1 De e minación de la ac i idad gela inasa de MMP-2 y MMP-9 70
6.2 De e minación de la ac i idad p o eolí ica del ac i ado isula del
plasminógeno 71

Resul ados y Discusión
PARTE I: GENERACIÓN DE UN MODELO MURINO KO CONDICIONAL PARA Gls2
1. Validación del ec o de ansgénesis 75
2. Cul i o de las células mad e emb iona ias mu inas 77
3. Elec opo ación de células ES mu inas con el ec o de ansgénesis 79
4. Selección y geno ipado de células ES mu inas ansgénicas 79
4.1 Geno ipado po Long-Range PCR (LRPCR o long-PCR) de células ES
mu inas ansgénicas 81
4.2 Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas median e
ans e encia Sou he n 83
5. Mic oinyección de células ES mu inas ansgénicas en emb iones en es adio
de 8 células 84
6. Geno ipado de a ones ansgénicos 86
7. Análisis de iabilidad de a ones homocigo os Gls2 m1a/ m1a 87
8. C uces de la colonia Gls2 m1a/+ gene ada con animales que exp esan la Flp
ecombinasa 89
9. Análisis eno ípico molecula de los animales he e ocigo os Gls2 m1a/+ 92
9.1 Análisis de exp esión de isoenzimas GA en animales WT, Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+ median e qRT-PCR 92
9.2 Análisis de exp esión de isoenzimas GA en animales WT, Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+ median e inmuno ans e encias Wes e n 95
9.3 Análisis de exp esión de isoenzimas GA en colonias WT, Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+ median e cuan i icación de la ac i idad GA 96
10. C uce de la colonia Gls2 m1c/ m1c con animales que exp esan la C e
ecombinasa 99
PARTE II: CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ISOENZIMAS GA EN EL
MODELO MURINO KOLPA1
1. Inmunohis oquímica de iso o mas GA en animales KOLPA1 100
2. E aluación de los ni eles de p o eína KGA median e inmuno ans e encia
Wes e n en animales KOLPA1 104
3. Cuan i icación del ansc i o KGA en egiones ce eb ales de animales
KOLPA1 105
4. E aluación de la ac i idad enzimá ica glu aminasa en animales KOLPA1 106
5. Ca ac e ización de la mo ología de espinas dend í icas en a ones KOLPA1 109
6. Análisis de la exp esión de ma cado es p o eicos de espinas dend í icas 112
7. El silenciamien o génico de LPA1 educe la exp esión y ac i idad gela inasa
MMP-9, pe o no la MMP-2 113
8. Función de las isoenzimas GA en el desa ollo y la di e enciación neu onal 119
Conclusiones 121
Anexos 125
Bibliog a ía 141
In oducción
In oducción
3
1. Análisis uncional de genes con modelos mu inos ansgénicos
La secuenciación del genoma humano ha dado luga a la gene ación de
nue as p egun as como cuál es la unción que se de i a de cada gen, cuáles son las
p o eínas que exp esan y cómo eje cen sus posibles in e acciones. De los más de
20.000 genes humanos iden i icados has a la echa, aún se desconoce la unción de
ap oximadamen e dos e ce as pa es. Pa a ap oxima nos al conocimien o de su
unción esul a muy ú il abaja con modelos animales. Dado que las especies
Homo sapiens y Mus musculus compa en casi el 100% de los genes, y que su
o ganización genómica y mecanismos de exp esión es án es echamen e
elacionados, esul a e iden e que los modelos mu inos son especialmen e idóneos
pa a mime iza la mayo ía de los p ocesos biológicos (Capecchi, 1994) y pa a el
es udio de la base gené ica de las en e medades humanas. En es e con ex o, la
ca ac e ización eno ípica y molecula , empleando écnicas de Genómica Funcional
y P o eómica de modelos mu inos ansgénicos de icien es o knockou (KO) de
genes conc e os, es una de las p incipales he amien as que pe mi en elucida la
unción génica.
Ya en la década de los 70, B ins e ob u o el p ime a ón quimé ico
median e la inyección en blas ocis os de células de di e en es cepas, pa a
pos e io men e obse a su con ibución a la o mación de los di e en es ejidos
del animal du an e el desa ollo (B ins e & Tenb oeck, 1969). En 1978, Jaenisch
empleó po p ime a ez la mic oinyección en blas ocis os mu inos de ec o es
e o i ales de i ados del i us SV40 (Simian Vi us 40) (Jaenisch & Min z, 1974).
Dos años más a de se acuñó po p ime a ez el é mino ansgénico, cuando
Go don y Ruddle lle a on a cabo la p ime a mic oinyección de DNA en p onúcleos
de ó ulos e ilizados y comp oba on que dicha modi icación se inco po aba a la
línea ge minal (Go don e al., 1980). En la ac ualidad, se en iende po animal
ansgénico aquel que ha adqui ido en su línea ge minal un DNA exógeno (sea
p opio o ex año) y que, po an o, puede ansmi i lo a su p ogenie. En 1986,
Gossle demos ó que las células mad e emb iona ias (ES, emb yonic s em cell)
podían u iliza se como ehículo de ansgénesis, pe mi iendo además la selección
de aquellas que p esen aban modi icaciones especí icas incluso an es de se
mic oinyec adas en los blas ocis os (Gossle e al., 1986). En 1987, Capecchi log ó

In oducción
4
inac i a el gen de la hipoxan ina-guanina- os o ibosil- ans e asa (Hp )
empleando ecombinación homóloga en células ES mu inas (Thomas & Capecchi,
1987;
La impo ancia de los modelos mu inos como base pa a la in es igación de
la unción de genes in i o y como modelos de en e medades humanas, queda
e lejada en el desa ollo de dos p oyec os in e nacionales que p e enden
consegui en los p óximos años una amplia ep esen ación de líneas ES mu inas,
ec o es y a ones ansgénicos. Uno de es os p oyec os es no eame icano, el
p oyec o KOMP (Knockou Mouse P ojec ), y el o o eu opeo, p oyec o EUCOMM
(Eu opean Condi ional Mouse Mu agenesis). En julio de 2006 se inició el p oyec o
KOMP, como una inicia i a de los Ins i u os Nacionales de Salud Ame icanos (NIH)
pa a gene a una colección pública de células ES de la cepa C57BL/6 (la más
comúnmen e empleada en in es igación) y a ones ansgénicos con mu aciones
nulas (KO) pa a odos y cada uno de los genes mu inos (Ska nes e al., 2011). El
p og ama EUCOMM se inició en 2005 como al e na i a complemen a ia al
p oyec o KOMP, euniendo las inicia i as en es e campo de di e sos países
eu opeos, con la pa icipación de once g andes cen os de Genómica Funcional de
Alemania, Ingla e a, F ancia e I alia. P e ende gene a líneas de células ES
mu inas (cepa 129S ), con eniendo mu aciones condicionales de al menos 20.000
genes. Una es a egia simila se puso en ma cha en Canadá con el nomb e de
p og ama NORCOMM (Ringwald e al., 2011).
An es de que ue a posible ans e i ma e ial génico a las células animales,
la unción de los genes se es udiaba obse ando los eno ipos pa icula es que
esul aban al p o oca mu aciones alea o ias median e el empleo de adiaciones o
sus ancias químicas. Es as écnicas e an poco ú iles y poco p ecisas pa a genomas
diploides y, po ello, se han desa ollado o os mé odos como: ecnología
an isen ido, ibozimas, RNAi, e c.
Cuando el obje i o conc e o es modi ica , eemplaza o des ui secuencias
endógenas especí icas con DNAs exógenos, se equie e lle a a cabo
manipulaciones p ecisas y se emplean écnicas denominadas de gene a ge ing.
Es as écnicas explo an el p incipio de la ecombinación homóloga. La
In oducción
5
ecombinación homóloga es un p oceso de in e cambio génico que ocu e en odas
las células y en la que in e ienen dos moléculas de DNA con secuencias simila es,
aunque no necesa iamen e idén icas. No se equie en secuencias de DNA
especí icas pe o, al menos en células animales, se necesi a que és as sean de g an
longi ud pa a que el in e cambio génico sea e icien e (los denominados b azos de
homología). La ecuencia de ecombinación homóloga en células animales es
gene almen e muy baja, en compa ación con la ecombinación al aza (de 103 a 105
eces meno ); po es e mo i o se equie en es a egias de selección complicadas
pa a iden i ica las células que adqui ie on el DNA exógeno co ec amen e
(Mel on, 2002).
O o mecanismo de ecombinación empleado en las écnicas de gene
a ge ing ( ecuen emen e u ilizadas en conjunción con la ecombinación
homóloga) es la ecombinación luga especí ica. Los di e en es o ganismos ienen
sis emas p opios de ecombinación luga especí icos, pe o pueden se expo ados
a o os sis emas, como po ejemplo células animales, pa a el con ol p eciso de los
ansgenes. Los sis emas de ecombinación luga especí ico más u ilizados son: el
sis ema C e/loxP y el Flp/FRT. La ecombinasa C e (cycliza ion ecombina ion),
que de i a del bac e ió ago P1, escinde cualquie egión de DNA localizada en e
dos si ios loxP (locus o c ossing o e in P1). Po su pa e, la ecombinasa Flp
( lipasa) se aisló de Saccha omyces ce e isae, y escinde igualmen e el DNA
lanqueado en e sus secuencias consenso FRT (Flp ecombinase a ge ). Ambas
secuencias, loxP y FRT, ienen una amaño de 34 pb y es án o madas po dos
epe iciones in e idas de 13 pb lanquean es y una zona cen al no palind ómica
de 8 pb (Dymecki, 1996; Buchholz e al., 1998). Es as secuencias suelen
inco po a se en ec o es de eemplazamien o, que explo an la ecombinación
homóloga, y se si úan lanqueando exones o secuencias que pueden se eliminadas
de mane a especí ica median e el apo e exógeno de la ecombinasa
co espondien e. La u ilización de es os ec o es en células ES de a ón puede
conduci a la ob ención de animales ansgénicos KO o KO condicionales (Aus in e
al., 1981; S e nbe g & Hamil on, 1981; Kwan, 2002; Hall e al., 2009).
Recien emen e, se ha implemen ado una nue a écnica pa a la ob ención de
animales ansgénicos basada en el uso de p o easas guiadas po RNA; de és as, la
In oducción
6
más ampliamen e u ilizada es la llamada Clus e ed Regula ly In e paced Sho
Palind omic Repea s-C isp Associa ed genes 9 o ab e iadamen e CRISPR-Cas9
(Fig.1). Es e mé odo se basa en el sis ema inmuni a io u ilizado po p oca io as
como mecanismo de de ensa en e a i us in ec i os exógenos. La écnica CRISPR-
Cas9 aplicada a células ES mu inas ha pe mi ido ob ene modelos animales de
mane a más ápida y e icien e que con los sis emas con encionales. (Ran e al.,
2013; Humph ey & Kasinski, 2015).
Figu a 1. Sis ema CRISPR-Cas desc i o en S ep ococcus pyogenes. En caso de in ección
po i us, el DNA exógeno es agmen ado e inco po ado al locus CRISPR en medio de una se ie de
epe iciones co as. Es e loci se ansc ibe y p ocesa pa a gene a RNAs de pequeño amaño,
denominados CRISPR RNA (c RNA), que se u ilizan como guía pa a selecciona las dianas que se án
co adas po las endonucleasas Cas. Es os c RNA se unen a un RNA pa cialmen e complemen a io:
el CRIPSR RNA ans-ac i ado ( RNA), cuya unción es man ene el complejo c RNA-Cas en la
egión de econocimien o. Es e sis ema se ha adap ado al campo de la bio ecnología median e la
gene ación de RNAs sin é icos (guide RNA, gRNA), cons i uidos po la secuencia diana, el c RNA, el
RNA y la nucleasa Cas9. Cuando el gRNA se mic oinyec a en células ES mu inas media á un co e
di igido del DNA, pe mi iendo la gene ación de modi icaciones p ecisas (Humph ey & Kasinski,
2015).
In oducción
7
2. Glu aminasa de mamí e os: genes y ansc i os
La glu amina (Gln) es uno de los aminoácidos lib es más abundan es en el
cue po humano, ep esen ando has a un 25% del o al de aminoácidos en plasma
(Labow & Souba, 2000). Aunque se ha desc i o p incipalmen e como aminoácido
no esencial, en de e minadas si uaciones de es és, eje cicio ex enuan e, cie as
en e medades, e c., donde los eque imien os del o ganismo supe an su biosín esis
de no o, puede conside a se un aminoácido condicionalmen e esencial (Lacey &
Wilmo e, 1990).
En e el g an núme o de unciones que ealiza la Gln en mamí e os (Fig.2),
des aca su papel como anspo ado de amonio en e ejidos, educiendo la
oxicidad asociada a es a molécula y a o eciendo la homeos asis del ni ógeno
(Souba, 1987). A pa i del ni ógeno de su g upo amida se pueden sin e iza
moléculas de di e en e na u aleza, ales como nucleó idos, aminoácidos,
aminoazúca es y p o eínas. Su esquele o ca bonado si e como uen e oxidable
pa a apo a ene gía a las células en di isión. En neu onas, no sólo se u iliza como
uen e de ene gía, sino ambién pa a la sín esis de neu o ansmiso es exci a o ios
e inhibi o ios como el glu ama o (Glu) y el ácido γ-aminobu í ico (GABA),
espec i amen e (Walls e al., 2014). En hígado, la Gln ambién es un sus a o del
ciclo de la u ea, implicada en la homeos asis del amonio y el bica bona o
(Häussinge e al., 1992).
In oducción
14
Tabla 1. Genes, ansc i os e iso o mas GA en humanos. (Adap ado de Má quez e al.,
2009)
Genes, ansc i os e iso o mas de GA en humanos
KGA
GAC
GAB
LGA
Gen
GLS
GLS
GLS2
GLS2
Longi ud del
ansc i o
18 exones
15 exones
18 exones
17 exones
Mecanismo
ansc ipcional
Ayus e
al e na i o
Ayus e
al e na i o
Canónico
Inicio al e na i o
de la
ansc ipción
Regulación
ansc ipcional
c-Myc,
c-Jun
---
p53, TAp63,
TAp73
---
Exp esión
Ubicua en ejidos
ex ahepá icos de
mamí e os y
células de cánce
humano
Músculo
ca diaco,
pánc eas,
placen a, iñón,
pulmón y células
de cánce
humano
Hígado, ce eb o,
pánc eas,
sis ema inmune y
células de cánce
humano
Hígado, ce eb o,
pánc eas, sis ema
inmune y células
de cánce
humano
Tamaño
p o eína
669 aa
598 aa
602 aa
565 aa
Dependencia de
Pi
Al a
Al a
Baja
Baja
Ac i ación po
amonio
No
No
Baja
Fue e
Inhibición po
glu ama o
Fue e
---
Mode ada
No
In e acción
p o eica
Cai axina,
BMCC1s
---
GIP, SNT, Rac1
---
2.4 P o eínas que in e accionan con isoenzimas GA
Las p incipales di e encias des acables en e los genes GLS y GLS2 se
cen an en los exones 1 y 18. Ambos genes compa en un 62% de homología en el
exón 1; sin emba go, en el gen GLS codi ica 129 aminoácidos y en el GLS2 sólo 61.
La impo ancia de es a di e encia adica en que es as secuencias son las implicadas
en los p ocesos de anslocación y en ío a des inos subcelula es, además de ac ua

In oducción
15
como módulos de in e acción p o eína-p o eína (Gómez-Fab e e al., 2000) (Fig.
6).
Figu a 6. P incipales dominios y secuencias consenso (mo i os) de las iso o mas GA
de mamí e os. Se indican las di e encias en e las p o eínas codi icadas po los genes GLS y GLS2,
las cuales se cen an p incipalmen e en los exones 1 y 18 donde se localizan las secuencias
implicadas en la in e acción p o eína-p o eína y los p ocesos de anslocación subcelula
(Adap ado de Má quez e al., 2016).
La secuencia codi icada po el exón 18 mues a igualmen e di e encias
en e ambos genes: en GLS2, la egión C- e minal, conc e amen e los cua o
úl imos aminoácidos, es án implicados en el econocimien o de dominios PDZ (Fig.
6) (Olalla e al., 2001), denominados así po las es p ime as p o eínas donde se
iden i ica on: PSD-95, D osophila discs la ge p o ein y Zona occludens p o ein 1
(Cho e al., 1992). Es os dominios son mo i os p o eicos de 80-100 esiduos de
aminoácidos, muy conse ados, que se pueden uni an o a secuencias consenso
(X-Se /Th -X-Val) en egiones C- e minal de p o eínas diana, como a o as
p o eínas PDZ (Pon ing, 1997). El es udio de la in e acción en e p o eínas es de
especial in e és ya que pe mi e comp ende su papel uncional, egulación y
localización. Las isoenzimas GLS2 poseen la secuencia ESMV eque ida en las
in e acciones con p o eínas PDZ, siendo la alina inal esencial pa a el
In oducción
16
man enimien o de la in e acción (Olalla e al., 2001). Has a el momen o, se han
desc i o dos p o eínas PDZ que in e ac úan con la iso o ma GAB: la p o eína GIP
(Glu aminase-In e ac ing P o ein) y la al a-1-sin o ina (SNT).
Cuando se analizó la exp esión de GIP ( ambién denominada Tax-
in e ac ing p o ein 1, TIP-1) en ce eb o de a a y mono, se pudo obse a que
es aba p esen e an o en el soma de neu onas y as oci os como en los pies
as oci a ios pe i ascula es. Fue en es a úl ima localización donde se exp esaba de
o ma conjun a con GAB, po lo que se ha p opues o un posible papel del Glu
p oducido po es a isoenzima como asodila ado , al uni se a su co espondien e
ecep o de las células endo eliales (Olalla e al., 2008). Asimismo, se han desc i o
casos en que los dominios PDZ de e minan la localización nuclea de las p o eínas
(Rie le & Fi es ein, 2001), po lo que no puede desca a se que uno de los
mecanismos de impo e de GAB al núcleo de neu onas y as oci os enga luga a
a és de su dominio PDZ y su in e acción con GIP. De hecho, GIP ambién se ha
localizado en núcleo celula (Olalla e al., 2008) y se ha demos ado que puede
eje ce un papel egulado de la ansc ipción, en conc e o median e su in e acción
con β-ca enina, p o eína implicada en di e en es p ocesos como mig ación,
p oli e ación y mue e celula . Es a asociación inhibi ía la pos e io in e acción de
β-ca enina con el ac o de ansc ipción 4 (TCF-4) en núcleo, necesa ia pa a la
ac i ación de los genes Wn (Wingless/In ) (Kanamo i e al., 2003). Igualmen e, en
el ex emo C- e minal de su es uc u a p ima ia, GLS2 p esen a epe iciones de
anqui inas (Má quez e al., 2006), que en o os casos ambién se han elacionado
con el impo e nuclea de p o eínas (Sachde e al., 1998).
Las sin o inas, po su pa e, son una amilia de p o eínas pe i é icas de
memb ana que abundan pa icula men e en células gliales ce eb ales (Ahn e al.,
1996; Adams e al., 2001). Las p incipales iso o mas son α-1, β-1 y β-2, que es án
codi icadas po di e en es genes y se exp esan en ejidos como músculo
esquelé ico, co azón y ce eb o (Ahn e al., 1996; Gee e al., 1998). El dominio PDZ
de SNT puede uni se a la acuopo ina 4 (AQP-4) en ce eb o (Adams e al., 2001);
es a in e acción se ha desc i o conc e amen e en los pies a oci a ios
pe i ascula es (Inoue e al., 2002), donde pod ía ac ua egulando la
pe meabilidad de la memb ana (F ige i e al., 1995).
In oducción
17
En cuan o a p o eínas que in e ac úan con las iso o mas GLS, se ha
demos ado que KGA in e acciona con la p o eína cai axina o BNIP-H. Es a
p o eína, codi icada po el gen ATCAY, se exp esa en ejido ne ioso, siendo
especialmen e abundan e en hipocampo, có ex, ce ebelo, núcleos ce ebela es
p o undos y núcleo pon ino (Boma e al., 2003; Buschdo e al., 2006). La
in e acción de KGA y cai axina se lle a a cabo a a és del dominio BCH (BNIP-2
and Cdc42GAP Homology) (Low e al.1, 2000; Low e al.2, 2000), egulando de es a
mane a su dis ibución espacial en ce eb o. En expe imen os de co- ans ección de
KGA y cai axina en células P12, inducidas a di e encia se a un eno ipo neu onal
po es imulación con el ac o de c ecimien o ne ioso (NGF), se obse ó una
edis ibución de KGA hacia los e minales de las neu i as, de mane a
independien e y sepa ada de cualquie mig ación mi ocond ial. Po consiguien e,
la cai axina pa ece se capaz de e-localiza KGA desde el cue po celula hacia las
neu i as. Apa e de es e á ico neu onal, la cai axina edujo los ni eles de Glu a
a és de la inhibición de la ac i idad GA (Buschdo e al., 2006). En esumen, la
in e acción KGA-cai axina pa ece ene un papel ele an e en la egulación de la
homeos asis de la sín esis de Glu, esencial pa a una neu o ansmisión co ec a y
un adecuado desa ollo neu onal.
O o miemb o de la amilia de p o eínas que con ienen dominios BCH,
capaces de in e acciona con la iso o ma KGA, es la p o eína BMCC1. Es e
polipép ido posee dis in as iso o mas, una de las cuales, BMCC1s, se exp esa
mayo i a iamen e en ce eb o de a ón y es á implicada en la egulación de la
dinámica del ci oesquele o y la supe i encia celula (A ama e al., 2012). Un
análisis p o eómico o ien ado a busca p o eínas que in e ac úan con BMCC1s
iden i icó a KGA como una de ellas. Cuando se lle a on a cabo cul i os p ima ios de
neu onas co icales ans ec adas con ambas p o eínas, se obse ó que la
dis ibución subcelula de KGA ue d amá icamen e al e ada: la mi ad de las
células ans ec adas mos a on a KGA no sólo en mi ocond ia, sino ambién en el
ci oplasma (Boulay e al., 2012). Los au o es concluye on que BMCC1s
in e acciona p e e en emen e con la o ma p ecu so a monomé ica de KGA (74
kDa) en ci oplasma, impidiendo que alcance la mi ocond ia y e i ando su
p ocesamien o has a la o ma madu a ca alí icamen e ac i a.
In oducción
18
2.5 Glu aminasa en ce eb o
El Glu es el p incipal neu o ansmiso exci a o io del sis ema ne ioso
cen al (SNC) (Fonnum, 1984), y ap oximadamen e el 80-90% de odas las sinapsis
ce eb ales son glu ama é gicas (B ai enbe g & Schüz, 1998; A well & Laughlin,
2001). Dicho aminoácido juega además un papel cla e en la plas icidad sináp ica y
en la neu ogénesis (Velle i e al., 2013), lujo sanguíneo ce eb al (A well e al.,
2010), me abolismo ene gé ico ce eb al (E ecinska & Sil e , 1990), pa ogénesis de
en e medades neu opsiquiá icas (Con i & Weinbe g, 1999), en la sín esis del
neu o ansmiso inhibido GABA (Walls e al., 2014) y en la de muchos o os
impo an es me aboli os.
Dado que el Glu no a a iesa ácilmen e la ba e a hema oence álica (BBB)
(Hawkins, 2009), debe se sin e izado en las neu onas a pa i de p ecu so es
locales, es ableciéndose un con ol p eciso en e la neu ona p esináp ica,
pos sináp ica y el as oci o. En es as sinapsis ipa i as (Fig. 7), se es ablece el
denominado ciclo Glu/Gln (He z, 1979), po el cual, el exceso de Glu libe ado en la
hendidu a sináp ica es cap u ado po los as oci os gliales, que median e la enzima
GS, de localización exclusi amen e as oci a ia (Ma ínez-He nández e al., 1977),
se ans o ma en Gln. Es a Gln es libe ada del as oci o y ecap u ada po las
neu onas, donde uel e a me aboliza se a Glu po la enzima GA. Es e ciclo Glu/Gln
en e las neu onas y los as oci os es á conside ado como una u a cen al pa a el
eciclaje de neu o ansmiso es y pa a egula la neu o oxicidad in ínseca del Glu
(He z, 1979; Be l & Cla ke, 1983).
Como se ha indicado, en la sinapsis ipa i a la GA juega un papel
imp escindible en la homeos asis glu ama é gica como la uen e más impo an e
de Glu p esináp ico libe ado (Nicklas e al., 1987). A pesa de nume osas
in es igaciones, el o igen del Glu neu o ansmiso no ha sido comple amen e
esuel o. Aunque se econoce a la GA como la uen e p incipal de Glu, no debe se
la única u a implicada (Shen e al., 2009). Se ha demos ado sín esis del
neu o ansmiso Glu median e ansaminación de aminoácidos con α-
ce oglu a a o, componen e del ciclo de los ácidos ica boxílicos (Waagepe e sen
e al., 2005).
In oducción
19
Figu a 7. Esquema la sinapsis ipa i a en e neu onas y as oci os. La Gln libe ada po
el as oci o es anspo ada al in e io de las neu onas p esináp icas ía anspo ado SLC38A7
(miemb o de la amilia de anspo ado es de aminoácidos acoplados a sodio, SNAT). En el in e io
de la neu ona p esináp ica la GA ca aliza el paso de Gln a Glu, que se almacena en las esículas
sináp icas has a su pos e io libe ación. En la hendidu a sináp ica el Glu es ecap u ado po el
as oci o a a és de los anspo ado es dependien es de sodio, EAAT1 y EAAT2, y con e ido de
nue o en Gln po la acción de la enzima GS (Adap ado de Má quez e al., 2009).
El modelo adicional de exp esión de GA acep aba que la única isoenzima
p esen e en ce eb o, y esponsable de la gene ación del Glu neu o ansmiso , e a
la iso o ma KGA (GLS) (Hase e al., 1985; Cu hoys & Wa o d, 1995). Nues o
g upo ue el p ime o en descub i la exp esión simul ánea de ansc i os de mRNA
pa a KGA y GLS2 en ce eb o humano (Aledo e al., 2000; Gómez-Fab e e al., 2000).
Pos e io men e, demos amos la coexp esión de mRNA de KGA y GLS2 en ce eb o
de o as especies de mamí e os como aca, a ón, conejo y a a (Olalla e al., 2002).
Es a coexp esión ue e i icada a ni el de p o eína po mé odos bioquímicos e
inmunológicos median e inmuno ans e encias Wes e n e elados con
an icue pos isoenzima-especí icos (Olalla e al., 2002). Además de ce eb o,
ambién se ha demos ado la coexp esion de ambas isoenzimas en las siguien es

In oducción
20
líneas celula es humanas: células de umo colo ec al (Tu ne & McGi an, 2003),
células de hepa oma HepG2, células de leucemia mieloide KU812F y las células de
cánce de mama MCF7 y ZR75 (Pé ez-Gómez e al., 2005). En elación a la
p oli e ación, el papel desempeñado po las di e en es isoenzimas GA en células
umo ales pa ece se opues o. Así, los ni eles de KGA se encuen an ele ados en
es ados p oli e a i os, mien as que en es ados de quiescencia p e alecen las
iso o mas GLS2 (Pé ez-Gómez e al., 2005). Es e compo amien o se ha
con i mado en cánce de hígado y en umo es gliales, que mues an un pa ón de
exp esión ele ado de GAC y KGA y no exp esan LGA (Szeliga e al., 2005).
Expe imen os de ans ección de células T98G de glioblas oma humano con el
cDNA de GAB, pe mi e obse a una e e sión del eno ipo ans o mado,
ca ac e izado po una meno mig ación celula , p oli e ación y una disminución de
la supe i encia (Szeliga e al., 2009). Como consecuencia del papel undamen al
que desempeñan las iso o mas GA en la biología del cánce , se han pos ulado a
es as p o eínas como dianas e apéu icas pa a inhibi la ep og amación
me abólica que conduce a la ca cinogénesis.
Pa a cues iona aún más el modelo adicional de exp esión de GAs en
ce eb o, hemos apo ado sólidas e idencias expe imen ales de una seg egación
subcelula de GA en neu onas, la isoenzima KGA es á p esen e en mi ocond ias,
mien as que la GA GLS2 se localiza en núcleo (Olalla e al., 2002). La localización
nuclea de la GA GLS2 (GAB y/o LGA) ue comple amen e inespe ada, cambiando
d ás icamen e el pa adigma de exp esión acep ado de GA en mamí e os, siendo la
p ime a ez que se desc ibía una localización ex ami ocond ial pa a una GA. La
isión de la GA como una p o eína mono uncional, con un papel ele an e pe o
exclusi amen e ca alí ico, pa ece no esponde a su au én ica po encialidad
uncional. Es e hecho iene apoyado ambién po la desc ipción ya comen ada de
las iso o mas GLS2 con p o eínas PDZ. Respec o a la localización nuclea , ambién
con iene señala que el análisis bioin o má ico de las p o eínas GLS2 e eló la
exis encia de un dominio de dedos de Zn, conc e amen e del ipo Cys2His2,
ca ac e ís ico de muchos ac o es de ansc ipción (Fig. 6), dejando abie a la
posibilidad de que es as isoenzimas uncionen di ec amen e como un ac o de
ansc ipción. Además, aún cuando es as p o eínas no poseen secuencias
In oducción
21
especí icas de localización nuclea , sí poseen un mo i o LXXLL que cons i uye una
secuencia de in e acción con ecep o es nuclea es (Fig. 6). Conc e amen e, la
iso o ma GAB posee es e mo i o consenso en los aminoácidos 72-76 (LGDLL). Un
caso simila es el de la enzima mi ocond ial 3-hid oxi-3-me ilglu a ilCoA sin asa
(EC 4.1.3.5), que se ha de ec ado en el núcleo, y cuya anslocación implica la
in e acción con un ecep o ho monal nuclea a a és de un mo i o LXXLL
p esen e en la enzima (Mee ens e al., 1998). La egulación de la ansc ipción
génica a a és de ecep o es nuclea es equie e la pa icipación de co ep eso es
y coac i ado es, de es a o ma GAB pod ía o ma pa e de un complejo
ansc ipcional, ac uando como co egulado . La pa icipación de GLS2 en núcleo
pod ía se , no obs an e, indi ec a, al ac ua egulando los ni eles de Gln/Glu en el
nucleoplasma. Hoy en día, se acep a que los aminoácidos juegan un papel
impo an e, jun o con las ho monas, en el con ol de la exp esión génica; aunque,
los mecanismos molecula es implicados son oda ía poco conocidos. En conc e o,
la Gln induce la exp esión de p o eínas HSP (hea shock p o eins), an o a ni el de
mRNA como de p o eína (Sande s & Kon, 1992), y ep ime la exp esión de GS. De
es a o ma, la impo ancia de la localización nuclea de GAB adica ía en el con ol
in si u de los ni eles de Gln/Glu, cuyas luc uaciones inciden en la egulación de la
exp esión génica.
Se ha iden i icado ambién la p esencia de GA en as oci os (Má quez e al.,
2016). Expe imen os inmunohis oquímicos ealizados en ejidos de ce eb o
humano y a a, con an icue pos iso o ma especí icos, han pues o de mani ies o la
exp esión de isoenzimas GLS (KGA) y GLS2 (GAB/LGA) en neu onas y as oci os,
aunque mos ando di e en es localizaciones subcelula es: mi ocond ial pa a la
KGA y nuclea y mi ocond ial pa a GLS2 (Má quez e al., 2016). La exp esión de GA
en as oci os ambién se ha demos ado a ni el de mRNA y se ha p obado la
exis encia de ac i idad enzimá ica en cie as poblaciones as oci a ias (Ca dona e
al., 2015). La p esencia de GA con ac i idad ca alí ica en as oci os es ele an e
pa a la es equiome ía del ciclo Glu/Gln en la sinapsis, lo que sugie e la posibilidad
de nue as unciones pa a las dis in as iso o mas GA.
Las nue as localizaciones subcelula es descubie as en ce eb o pa a las
iso o mas GA sugie en nue as unciones pa a la isoenzima GLS2 no elacionadas
In oducción
22
con la neu o ansmisión, sino con la egulación ansc ipcional y la di e enciación
celula (Campos-Sando al e al., 2015). El hecho de que en ce eb o se exp esen
cua o isoenzimas di e en es codi icadas po dos genes dis in os aún no ha sido
explicado. No se conoce la con ibución de cada isoenzima al pool de Glu
neu o ansmiso , así como el papel de alguna de es as isoenzimas, pa icula men e
las GLS2, en unciones di e en es a las me amen e ca alí icas. Pa a acla a es os
aspec os, en es e abajo decidimos gene a un modelo animal ansgénico
de icien e en el gen Gls2 que nos pe mi a a oja luz sob e algunas de es as
cues iones, p o undizando así en la unción ce eb al de las isoenzimas GA.
2.6 Neu o ansmisión glu ama é gica en la adicción a d ogas
E idencias expe imen ales ob enidas desde 1970 han gene ado un
consenso en el campo cien í ico de la adicción a d ogas de abuso, que señalan a la
dopamina (DA) como neu o ansmiso cla e en sus e ec os adic i os (Lüsche ,
2016). De es a o ma, la hipó esis dopaminé gica en el mecanismo de la adicción
es ablece que las d ogas eje cen una ue e es imulación de dicho neu o ansmiso
en la u a mesoco icolímbica (Di Chia a & Impe a o, 1988), un asgo gene alizado
y de ini i o de odas las d ogas adic i as, dando cuen a de los agudos e ec os
e o zado es que eje cen. No obs an e, es a hipó esis no es capaz de explica los
e ec os a la go plazo y las al e aciones compo amen ales, como el ansia po la
d oga (c a ing) y la ecaída, que apa ecen cuando la d oga ya se ha eliminado del
o ganismo y los ni eles de DA uel en a los alo es no males. Po es e mo i o, se
ha suge ido que el consumo de d ogas conlle a una se ie de neu oadap aciones en
di e en es á eas ce eb ales que desempeñan un papel causal en el
compo amien o pa ológico de los pacien es adic i os (Lü hi & Lüsche , 2014).
Aunque muchos ipos de sinapsis pueden se modi icadas po el consumo
de d ogas, el oco se ha cen ado sob e la ansmisión glu ama é gica que eje ce un
papel impo an e en la plas icidad sináp ica (Lüsche , 2013). Resul ados de
es udios p eclínicos con modelos animales de adicción sen a on las bases de la
denominada hipó esis del Glu en la adicción, que p opone la exis encia de cambios
en la neu oplas icidad inducidos po un desequilib io en e el Glu sináp ico y el no-
sináp ico en los ci cui os en e la co eza p e on al (PFC), el núcleo accumbens
In oducción
23
(NAc) y el á ea egmen al en al (VTA), lo que p o oca una meno capacidad pa a
inhibi el compo amien o de búsqueda de la d oga y una mayo ulne abilidad a
la ecaída (Kali as, 2009; S eke ee & Kali as, 2011; Palomino e al., 2014). De en e
las modi icaciones glu ama é gicas, cabe des aca el papel de los ecep o es
me abo ópicos de Glu (mGluR) y las p o eínas Home en los as oci os del NAc
(Fig. 8) (Ronesi & Hube , 2008). Las p o eínas Home ac úan como un componen e
in eg al del complejo de señalización in acelula de los mGluR, mediando la
libe ación de calcio endoplasmá ico a a és de la unión a ecep o es inosi ol
i os a o (IP3Rs) (Yamamo o e al., 2006). El as oci o u iliza es e inc emen o del
calcio in acelula pa a la libe ación de Glu median e el in e cambiado
es equiomé ico de cis ina-Glu (sis ema Xc-) (Mala key & Pa pu a, 2008). Se ha
demos ado que la adminis ación c ónica de cocaína disminuye la exp esión de
las p o eínas Home y del anspo ado Xc- en el NAc, lo que p o oca una meno
libe ación de Glu desde el as oci o. Los bajos ni eles de Glu ex acelula conlle an
un bajo ono de los au o ecep o es mGluR2/3 p esináp icos, que as la exposición
epe ida a d ogas como cocaína, expe imen an modi icaciones en su es ado de
os o ilación, educiendo el ono inhibido que eje cen sob e la libe ación
p esináp ica de Glu (Xi e al., 2000; Kali as, 2004) (Fig. 8). Además, el inc emen o
de Glu libe ado en la hendidu a sináp ica ampoco se elimina e icien emen e,
pues o que el anspo ado GLT-1 as oci a io ambién es á in a-exp esado en el
NAc as la exposición c ónica a cocaína, nico ina, e anol y he oína (Sco ield &
Kali as, 2014).
In oducción
30
locomoción condicionada y la sensibilización compo amen al. La locomoción
condicionada se de ine como el aumen o en la locomoción basal en un con ex o
asociado a la adminis ación de d ogas. La sensibilización compo amen al
consis e en el p og esi o aumen o de la espues a conduc ual como esul ado de la
adminis ación epe ida de la d oga. Las bases ana ómicas que subyacen ambos
p ocesos son di e en es; así, la ansmisión dopaminé gica en ganglios basales es á
implicada en la sensibilización compo amen al, mien as que la locomoción
condicionada es á egulada po la ansmisión glu ama é gica en el hipocampo
(Pie ce & Kali as, 1997; Tzschen ke & Schmid , 2003; Mohn e al., 2004). Es os
pa áme os se e alua on en el modelo KO maLPA1 y se obse ó que la locomoción
condicionada e a meno en los animales KO que en los WT, como consecuencia del
dé ici de memo ia con ex ual que p esen aban. La ansmisión glu ama é gica en
hipocampo do sal es aba al e ada, con una exp esión educida del ecep o
me abo ópico mGlu3 y la subunidad GLUR3 de los ecep o es AMPA (Blanco e
al2., 2012). Po el con a io, ni la sensibilización compo amen al, ni la ansmisión
dopaminé gica se ie on al e adas espec o a los animales WT. Los au o es
concluye on que LPA1 pod ía ac ua como un modulado de la espues a
condicionada po su papel en la egulación de la ansmisión glu ama é gica
(Blanco e al2., 2012).
3.5 Modelo ansgénico mu ino KO maLPA1 y neu ogénesis
El ecep o LPA1 iene un papel muy impo an e en la plas icidad sináp ica
po su e ec o di ec o en los cambios mo ológicos y uncionales de las espinas
dend í icas. Median e ans ecciones de cons ucciones LPA1-GFP en neu onas
hipocampales se ha obse ado la p esencia de es e ecep o en células pi amidales
de la egión CA1, conc e amen e en dend i as apicales y una localización pun eada
ca ac e ís ica de espinas dend í icas (Pipel e al, 2006).
En mamí e os, el ce eb o p esen a dos egiones donde la neu ogénesis se
man iene ac i a du an e la edad adul a: la zona sub en icula y la zona
subg anula del gi o den ado (DG) del hipocampo (Ál a ez-Buylla & Lim, 2004). Es
en es a segunda zona donde los a ones KO maLPA1 ienen una meno
neu ogénesis y meno a bo ización dend í ica (Ma as-Rico e al., 2008). La

In oducción
31
neu ogénesis hipocampal adul a es á en es echa elación con la asculogénesis
(Palme e al., 2000) y con ac o es ó icos como el BDNF ( ac o neu o ó ico
de i ado de ce eb o) y el ac o de c ecimien o insulínico ipo 1 (IGF-1)
(Wa e house e al., 2012). Aunque no se han is o modi icaciones en los asos
sanguíneos del DG de animales KO maLPA1, sí hay a iaciones en los ni eles de los
ac o es ó icos, conc e amen e as una exposición a eje cicio (p oceso que
incen i a la neu ogénesis adul a), los ni eles de BDNF disminuyen y aumen an los
de IGF-1 en compa ación con los animales WT (Ma as-Rico e al., 2008). Es os
animales ambién ienen una exp esión disminuida de GAP43 en la co eza
(Es i ill-To ús e al., 2008). Dicha p o eína se exp esa du an e el desa ollo y es á
implicada en la guía axonal, la libe ación de neu o ansmiso es y la plas icidad
sináp ica (Jacobson e al., 1986).
En el modelo KOLPA1 desa ollado po Ha ison e al. (2003) se han
desc i o al e aciones neu oquímicas en el sis ema se o oniné gico de di e en es
á eas ce eb ales (PFC, hipocampo, hipo álamo y NAc) y una educción en la
exp esión de di e sos aminoácidos en el hipocampo. Es as ca ac e ís icas son
comunes a las exis en es en modelos de esquizo enia humanos, que p esen an
al e aciones en las sinapsis glu ama é gicas y disminución en el núme o de espinas
dend í icas (Hayashi-Takagi e al., 2010).
Obje i os
Obje i os
35
De acue do con los an eceden es expues os en la in oducción, es pa en e que aún
quedan un g an núme o de cues iones de calado po descub i en elación con la
unción ce eb al de las dis in as isoenzimas GA; en e ellas, la con ibución de cada
iso o ma al ace o de Glu neu o ansmiso , el papel ó ico de las GAs en el
desa ollo y di e enciación neu onal, la unción nuclea de GLS2 en neu onas y
as oci os, el signi icado isiológico de sus in e acciones con p o eínas PDZ y BCH,
su implicación en la egulación ascula de asos sanguíneos y a e iolas y,
inalmen e, su des egulación en desó denes neu ológicos y en e medades
neu odegene a i as. Todos es os in e ogan es hacen pa en e que la gene ación y
ca ac e ización de modelos animales ansgénicos con exp esión al e ada de
isoenzimas GA es una he amien a undamen al pa a elucida la unción ce eb al
de es as isoenzimas.
A la is a de es os an eceden es, nos plan eamos los siguien es obje i os en
es a Memo ia:
Gene ación de un modelo mu ino ansgénico nulo condicional pa a el gen
Gls2.
Ca ac e ización de al e aciones en las sinapsis glu ama é gicas en a ones
knockou pa a el ecep o LPA1 del ácido liso os a ídico.

Ma e iales y Mé odos
Ma e iales y Mé odos
38
MATERIALES
1. Vec o de ansgénesis
Con el in de silencia el gen Gls2, en la elabo ación de es e abajo se
empleó un ec o de ansgénesis de eemplazamien o adqui ido del In e na ional
Mouse Pheno yping Conso ium (IMPC; EUCOMM). En la Fig. 1 se ep esen an sus
p incipales ca ac e ís icas. El ec o es á diseñado sob e el plásmido pBR322 e
inco po a dos b azos de homología. El b azo la go, de 5.3 kb, es á cons i uido po
el exón 1 y un segmen o del in ón 1 del gen Gls2 mu ino; el b azo co o, po el
espacio génico comp endido po los exones del 2 al 12 (3.9 kb). Los si ios loxP
lanquean el agmen o del gen a elimina , co espondien e a los exones del 2 al 7,
( loxed sequence), po lo que al ac ua la ecombinasa C e se escindi á el
agmen o, gene ándose el KO co espondien e. Es e plásmido pe mi e lle a a
cabo la selección de las bac e ias que lo han inco po ado, ya que posee un gen de
esis encia a ampicilina y o o a blas icidina. La in eg ación del ec o esul an e
de la elec opo ación de las células ES mu inas se selecciona median e un gen de
esis encia a gene icina (gen neo ), po su pa e, los e en os de ecombinación
homóloga se disc imina án de los de ecombinación ilegí ima g acias a la
exp esión de un gen de la oxina de la di e ia codi icado po el gen DTA. Los si ios
FRT, que lanquean la casse e Neo, son luga es de econocimien o pa a la
ecombinasa Flp. Cuando es a ecombinasa se exp ese pe mi i á la escisión de la
casse e Neo.
Ma e iales y Mé odos
39
Figu a 1. Rep esen ación esquemá ica de las p incipales ca ac e ís icas del ec o de
ansgénesis. Se mues an las p incipales ca ac e ís icas del ec o : en ama illo los exones del gen
Gls2; los si ios de econocimien o de la ecombinasa Flp en e de (FRT); el En2SA (Eng ailed-2
splice accep o ) apa ece como un ec ángulo blanco, seguido del si io de econocimien o in e no
ibosómico (IRES), el gen lacZ (en azul), y la señal de poliadenilación SV40 (pA); los si ios de
econocimien o de la ecombinasa C e (loxP) es án ep esen ados po iángulos ojos; en mo ado
el p omo o de β-ac ina humano, y el gen de esis encia a neomicina (neo ). En la pa e in e io del
ec o , en blanco apa ecen los genes de esis encia a blas icidina y ampicilina, pa a la selección en
bac e ias; y en osa el gen de la oxina de la di e ia (DTA) con su espec i o p omo o y secuencia
pA (Adap ado de la in o mación suminis ada po el Conso cio IMPC).
El ec o de ansgénesis sigue una es a egia denominada ‘knockou i s
allele’ (Ska nes e al., 2011) ya que al in eg a se en el gen co espondien e
gene a á un alelo KO (denominado m1a), como consecuencia de la p esencia de
una ampa génica que conlle a la in e upción del p oceso de ansc ipción
(Fig.2). La ampa génica es á cons i uida po una secuencia En2SA-IRES-LacZ-pA,
que p o oca la e minación p ema u a del p oceso de ansc ipción po la
p esencia an o de un acep o de ayus e en la zona 3’ (En2SA), como de una
secuencia de poliadenilación (pA). El esul ado de es e p oceso es una p o eína de
usión cons i uida po el exón 1 del gen Gls2 y la ß-galac osidasa. Una de las
en ajas que p esen a es e sis ema, además de pode ob ene un alelo KO de o ma
di ec a al in eg a se el ec o en el genoma, es que pe mi e es udia el pa ón de
exp esión de nues o gen, ya que el gen lacZ se encuen a bajo el con ol de su
mismo p omo o .
De o ma esumida, los pasos que hab ía que lle a a cabo cuando se
u ilicen ec o es de ansgénesis de es e ipo implican que, as la inse ción del
Ma e iales y Mé odos
46
2.2 Cul i o de células ES mu inas
Dado que las células ES p esen an una asa de di isión ele ada, es
impo an e ealiza subcul i os pe iódicamen e e i ando que alcancen la
con luencia, ya que el con ac o en e ellas pod ía lle a a su di e enciación y con
ello a la pé dida de su plu ipo encia.
Se pa ió de un s ock congelado a -80ºC, po lo que se descongeló a 37ºC y
se diluyó en 9 ml de medio de cul i o EF. A con inuación, se cen i ugó a 1.500 pm
(He ich Ro o ix 32A, o o 1619) du an e 5 min. Más a de, el p ecipi ado de
células se esuspendió en 2 ml de medio de cul i o de ES (Anexo I), has a consegui
una suspensión unicelula , y se deposi a on sob e los MEF inac i ados en una
placa P35. Las células se incuban a 37ºC en una a mós e a al 5% de CO2
cambiándose el medio dia iamen e.
No es con enien e man ene los cul i os de células ES du an e un pe iodo
de iempo p olongado, po lo que los expe imen os se p og ama on pa a ealiza
el mínimo núme o de pases.
3. Elec opo ación de células ES mu inas con el ec o de
ansgénesis
3.1 Diges ión enzimá ica del DNA plasmídico
An es de la elec opo ación de las células ES es necesa io hace lineal el
ec o de ansgénesis, median e diges ión enzimá ica, seleccionando una
endonucleasa de es icción que gene e un co e único ue a de la zona de
homología del ec o . Se u iliza on la enzima AsiSI (S aAI, The moFishe ) y
ap oximadamen e unos 20 μg de DNA plasmídico. Como en casos an e io es, la
eacción se lle ó a cabo en el ampón ecomendado po la casa come cial, el
ampón Tango, a 37ºC. La diges ión ue analizada po elec o o esis en geles de
aga osa al 0.6 % (p/ ).
A con inuación, se lle ó a cabo una ex acción con enol-clo o o mo ( enol
pH8, P4557, Sigma) y se p ecipi ó el DNA con e anol. Pa a ello, se añadió un
olumen de enol-clo o o mo y se agi ó en ó ex has a ob ene una sola ase. Se

Ma e iales y Mé odos
47
cen i ugó a 14.000 pm (He ich Uni e sal 320R, o o 1420) du an e 5 min y se
ecogió la ase supe io . Se añadió un olumen de clo o o mo, se mezcló y se
cen i ugó a 14.000 pm du an e 1 min. Pos e io men e, el DNA se p ecipi ó con
dos olúmenes de e anol 100% y ace a o po ásico (pH 5.2) a una concen ación
inal de 0.3 M, se agi ó po in e sión y se dejó a -20ºC al menos 1h. Después se
cen i ugó a 4ºC du an e 40 min a 14.000 pm y se la ó dos eces con e anol al
70% (14.000 pm du an e 10 min). El p ecipi ado se esuspendió en el medio de
elec opo ación (Gene Pulse Elec opo a ion Bu e , Bio- ad)
3.2 Elec opo ación de las células ES mu inas con el ec o de
ansgénesis
Pa a lle a a cabo la elec opo ación se pa ió de células ES en ase de
c ecimien o exponencial a día, a las que se les había e escado el medio unas 3 h
an es. Las células se cen i uga on a 300 g (IEC HN-S Cen i uge, o o 815)
du an e 6 min, se la a on con PBS y se cen i uga on de nue o en las mismas
condiciones. T as elimina el sob enadan e se esupendie on en 750 μl del medio
especí ico pa a la elec opo ación y se añadió el ec o de ansgénesis lineal.
La mezcla se añadió a la cube a (Mic oPulse Elec opo a ion Cu e es, Bio-
Rad) e i ando la o mación de bu bujas. Pa a la elec opo ación (Gene Pulse Xcell
Elec opo a ion Sys em, Bio-Rad) se emplea on las siguien es condiciones: un
pulso de 300 V du an e 500 μs a empe a u a ambien e (RT). Pos e io men e, la
mezcla se dejó 5 min a RT an es de pasa las células a 5 placas P35 (en las que
p e iamen e se habían dispues o ib oblas os inac i ados). Las placas, se
incuba on a 37º C y 5% de CO2.
Como con ol nega i o se u iliza on células ES a las que no se les adicionó el
ec o de ansgénesis, pe o que se a a on bajo las mismas condiciones indicadas
an e io men e.
Ma e iales y Mé odos
48
4. Selección y geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas
4.1 Selección con gene icina (G418)
T as 24 h desde la elec opo ación ( iempo su icien e pa a que la
inco po ación y ansc ipción del ec o se haya lle ado a cabo), se cambió el
medio de cul i o a las células ES po medio esco con G418 (A1720, Sigma) a 150
μg/ml. La adición de es e an ibió ico pe mi e elimina las células que no hayan
inco po ado la casse e ansgénica. El p oceso de selección se p olongó du an e 8
días, momen o en el que no se obse a on células ES en las placas con ol. Las
células que sob e i ie on al p oceso de selección se some ie on a un pos e io
análisis po PCR. Pa a ello, dichas células se pica on con una pun a de pipe a P20 y
se ans i ie on a placas de 96 pocillos (P96). Se adiciona on 50 μl de ipsina, la
cual se dejó ac ua 2 min ap oximadamen e y se inac i ó con 50 μl de medio ES
esco, as lo cual se esuspendie on has a consegui una suspensión unicelula .
Los 100 μl de la mezcla an e io se ans i ie on a nue as placas P96 con MEF
inac i ados. Finalmen e se añadió medio has a 200 μl y se incubó a 37º C y 5% CO2.
T as 3-4 días (cambiando el medio dia iamen e) las células ES es án
ap oximadamen e al 80 % de con luencia y se pueden congela y analiza su DNA.
Pa a ello, se la a on con 200 μl de PBS, se añadie on 30 μl de ipsina y
pos e io men e se adiciona on 70 μl de medio ES. De cada pocillo se oma on 50 μl
y se deposi a on en una placa mu ipocillo P24 a adas con MEF inac i ados (se
comple ó has a 1 ml de medio ES) pa a su pos e io análisis po PCR. Los 50 μl
es an es se congela on a -80ºC en medio de congelación (medio ES con FBS al
50% y DMSO al 10%).
4.2 Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas
4.2.1 Ex acción del DNA de las células ES mu inas ansgénicas
Cuando las células c ecie on lo su icien e se ecolec a on de o ma
equi alen e a la desc i a en los apa ados an e io es. Se desca ó el sob enadan e y
se la ó el p ecipi ado dos eces con PBS. Pos e io men e, las células se
esuspendie on en 100 μl de ampón de diges ión (50 mM T is-HCl pH 8, 20 mM
NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) y p o einasa K (Roche), a una concen ación inal de
Ma e iales y Mé odos
49
100 μg/ml, as lo cual se incuba on a 55ºC du an e 1 h. A con inuación, se ealizó
una ex acción con enol-clo o o mo, seguida de una p ecipi ación con e anol y
ace a o po ásico, al como se ha desc i o en apa ados an e io es. Finalmen e, el
p ecipi ado se esuspendió en 50 μl de ampón TE (Anexo I).
4.2.2 Geno ipado po PCR de las células ES mu inas ansgénicas
Las eacciones de PCR se lle a on a cabo u ilizando la enzima GoTaq Flexi
DNA Polyme ase (P omega) con el bu e 5x Colo less GoTaq Flexi Bu e y 25mM
MgCl2. La eacción se lle ó a cabo en un olumen inal de mezcla de 25 μl,
con eniendo: 2 mM MgCl2, mezcla de los cua o desoxinucleó idos i os a o (s ock
dNTPs a 100 mM, Roche) 0.1 mM, cebado es a 0.4 μM y 0.7 U de la enzima Taq
polime asa.
En la Tabla 2 se indican las secuencias de los cebado es u ilizados pa a la
PCR. El cebado In 1-Fw apa ea con una secuencia especí ica del in ón 1 de Gls2,
mien as que LaR3R apa ea especí icamen e con la casse e ansgénica, po lo
que el amplicón de 270 pb sólo se ampli ica á en las células que hayan inco po ado
la casse e. De o ma análoga, los cebado es que ampli ican el gen neo econocen la
secuencia especí ica de es e gen, gene ando un amplicón de 492 pb. Ambos
agmen os se pu i ica on de geles de aga osa median e el ki Ilus a GFX PCR DNA
and Gel Band Pu i ica ion (GE Hel hca e) y se secuencia on (Anexo II).
Tabla 2. Nomb e y secuencia de los cebado es u ilizados pa a el geno ipado po PCR de las células
ES mu inas ansgénicas.
Cebado es
Secuencia 5’-3’
In 1-Fw
TCCACCTGAGTGAGGTAGACATCC
LaR3-R
CAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC
Neo-FW
GGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGC
Neo-R
AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG
Como con ol nega i o de la eacción se u ilizó DNA de a ón WT, agua
como con ol de con aminación y el p opio ec o de ansgénesis como con ol
posi i o.
Ma e iales y Mé odos
50
La eacción se lle ó a cabo en un e mociclado de Bio-Rad (MyCycle ,
he mal cycle ) bajo las siguien es condiciones:
- Pa a la ampli icación con la pa eja de cebado es In 1-Fw y LaR3-R : 94 ºC
du an e 5 min, seguido de 30 ciclos con el siguien e p og ama: 94ºC 50 s, 63ºC 30 s
y 72ºC du an e 1 min. Se adicionó un ciclo inal de ex ensión de 10 min a 72 ºC.
- Pa a la ampli icación con la pa eja de cebado es Neo-Fw y Neo-R : 94 ºC
du an e 3 min, seguido de 35 ciclos con el siguien e p og ama: 94ºC 15 s, 65ºC 20 s
y 72ºC du an e 1 min. Se adicionó un ciclo inal de ex ensión de 5 min a 72 ºC.
Siguiendo las ecomendaciones del conso cio IMPC, y an es de ealiza la
long ange PCR (LRPCR) y el Sou he n blo , que pe mi en con i ma que la
ecombinación en e el ec o de ansgénesis y el genoma de las ES mu inas ue
homóloga, se lle ó a cabo una PCR pa a con i ma la p esencia del si io loxP
si uado en la egión 3’, y con ello demos a la comple a in eg ación del ec o .
Pa a ello, se u iliza on los cebado es indicados en la Tabla 3 y el siguien e
p og ama de ampli icación: 94 ºC du an e 3 min, 35 ciclos de: 94ºC 15 s, 63ºC 20 s
y 72ºC du an e 1 min. Se adicionó un ciclo inal de ex ensión de 5 min a 72 ºC.
Tabla 3. Nomb e y secuencia de los cebado es u ilizados pa a el geno ipado po PCR de la egión 3’
loxP de las células ES mu inas ansgénicas.
Cebado es loxP
Secuencia 5’-3’
Ex7-FW
CTGGTGCCATTGTGGTCAGC
In7-RV
GCCTGATGGTGTTGTCCTC
El cebado Ex7-Fw apa ea con una secuencia del exón 7 y el In7-R lo hace
en el in ón 7, en e los cuales se si úa la secuencia loxP, ampli icándose un
agmen o de 318 pb. La banda se pu i icó del gel de aga osa con el ki Ilus a GFX
PCR DNA and Gel Band Pu i ica ion (GE Hel hca e) y se en ió a secuencia pa a
asegu a la p esencia del si io loxP ( éase Anexo II).
Ma e iales y Mé odos
51
4.2.3 Geno ipado po Long Range PCR (LRPCR) de las células ES
mu inas ansgénicas
Se ealizó un geno ipado median e análisis po LRPCR pa a asegu a que la
ecombinación en e el ec o de ansgénesis y el genoma de la célula ES ue
homóloga. Pa a la ealización de la LRPCR se u ilizó el ki Expand Long Templa e
PCR Sys em (Roche). És e con iene una mezcla enzimá ica de Taq DNA polime asa
y Tgo DNA polime asa, una polime asa e moes able con ac i idad co ec o a. Es a
mezcla de polime asas pe mi en ampli ica has a 20 kb de DNA genómico con al o
endimien o.
La eacción se lle ó a cabo en un olumen inal de 25 μl, dejando el ampón
a una concen ación inal de 1x (s ock a 10x con 17.5 mM de MgCl2), empleando:
mezcla de desoxinucleó idos i os a o 0.35 mM, cebado es 0.3 μM y 2 U de Taq
DNA polime asa.
El ciclo u ilizado pa a la LRPCR es lige amen e dis in o al de una PCR de
secuencias de meno amaño. La empe a u a de hib idación se suele ija en e los
55 y 60ºC, independien emen e de la Tm de los cebado es y la empe a u a de
ex ensión se ija en 68ºC, po debajo de los 72ºC no malmen e u ilizados en una
PCR con encional.
El p og ama de ampli icación u ilizado ue: 93º du an e 3 min, 10 ciclos de:
94ºC 10 s, 63ºC 30 s y 68ºC du an e 5 min, seguido de 25 ciclos de: 94ºC 10 s, 60ºC
30 s y 68ºC du an e 5 min (20 s ex a po ciclo). Se adicionó un ciclo inal de
ex ensión de 5 min a 68 ºC.
Tabla 4. Nomb e y secuencia de los cebado es u ilizados pa a la LRPCR de las colonias ES mu inas
ansgénicas.
Cebado es
Secuencia 5’-3’
LRPCR-Fw
AGTGCTGTGAGGGCTGAGGTCAGGTGAGTGAAAG
LRPCR-R
TGTGGAGGGTGGTGTGGGAAAGGGTTCGAAGTTC

Ma e iales y Mé odos
52
4.2.4 Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas median e
ans e encia Sou he n
Se ealizó un análisis po ans e encia Sou he n de las células ES
ansgénicas pa a con i ma que el p oceso de ecombinación ue homólogo. Pa a
ello se lle o a cabo una ex acción de DNA con enol/clo o o mo, al y como se ha
desc i o en apa ados an e io es. Una ez con i mada la in eg idad de dicho DNA
po elec o o esis en geles de aga osa al 0.6% (p/ ), se p ocedió a la diges ión
enzimá ica del DNA con la enzima Bs EII (The mo Fishe Scien i ic). Es a enzima
ealiza un co e en la egión 5’ lanquean e del gen Gls2, an e io a la zona de
homología especí ica del ec o , y o o co e en la casse e ansgénica,
conc e amen e en el exón 2 ( éase Anexo II pa a un mayo de alle de la es a egia
seguida).
Pa a la diges ión se u iliza on ap oximadamen e 15 μg de DNA que se
lle a on a un olumen inal de 200 μl en agua. Se añadió el olumen ap opiado de
ampón de la enzima de es icción (concen ación inal 1x) y la mezcla se agi ó
a ios minu os a 4ºC, dejando incuba 1 h. Pos e io men e se añadie on 20 U de
enzima y se dejó a 4ºC a ios minu os. Seguidamen e, la mues a se incubó a 37ºC
du an e media ho a, as lo cual se añadie on 20 U de enzima adicionales. La
mezcla de diges ión se dejó du an e 16 ho as a 37ºC. A la mañana siguien e se
comp obó en un gel de aga osa que la diges ión enzimá ica del DNA genómico se
hubie a comple ado en su o alidad, as lo cual, se p ocedió a p ecipi a la
mues a con ace a o sódico 0,3 M (pH 5.2) y dos olúmenes de e anol absolu o.
Después de la a con e anol 70%, la mues a se secó al ai e du an e 10 min y se
esuspendió en 30 μl de agua, dejándose a 4ºC O/N.
La elec o o esis de DNA se ealizó en geles de aga osa al 0,7% (p/ ) en una
cama de 20 cm de longi ud en ampón TBE 0.5x (Anexo I), con 7.5 μl de GelRed.
Como pa ón de masa molecula se u ilizó el dige ido de DNA del ago lambda con
la enzima HindIII. La elec o o esis se lle ó a cabo a 15 V du an e la p ime a media
ho a, seguido de 30 V du an e 2 días a 4ºC, has a que se ob u o la sepa ación
necesa ia en e las bandas pa a esol e los agmen os.
Ma e iales y Mé odos
53
4.2.4.a T a amien o del gel de aga osa y ans e encia a memb anas de
nylon
An es de lle a a cabo la ans e encia, el gel de aga osa se sume gió
du an e 10 min en una solución de 0.25 M HCl. A con inuación, se sume gió en
solución desna u alizan e (1.5 M NaCl y 0.5 M NaOH) du an e 40 min, con un
cambio de medio, y, inalmen e, se neu alizó en 1.5 M NaCl y 0.5 M T is base (pH
8) du an e 40 minu os, cambiando el medio a los 20 min.
La ans e encia se lle ó a cabo po capila idad du an e 16 h empleando
memb anas de nylon (Hybond+, GE Heal hca e), siguiendo el p o ocolo desc i o
po Da ies e al. (1986) y Ausubel e al. (1989). Como ampón se empleó SSC 20x
(3 M NaCl y 0.3 M ci a o sódico, pH 7). Pos e io men e las memb anas se la a on
con ampón SSC 2x, se seca on y el DNA se ijó po la acción de luz UV (UVC 500
C osslinke , Ame sham Bioscience).
4.2.4.b Ob ención de la sonda de hib idación
La sonda de DNA u ilizada en los expe imen os de Sou he n blo se ob u o
median e ampli icación po PCR, pa a lo que se u iliza on los cebado es (Tabla 5) y
ciclos indicados a con inuación. La sonda pe mi e di e encia en e el alelo WT y el
alelo m1a, de mane a que en las células ES WT hib ida á con un agmen o de 9 kb
y en las células ES que hayan inco po ado la casse e ansgénica de 16 kb.
Tabla 5. Nomb e y secuencia de los cebado es empleados y u ilizados pa a la sín esis de la sonda
de hib idación empleada en el geno ipado median e ans e encia Sou he n.
Cebado es
Secuencia 5’-3’
Bs E-Fw
CTCAGCCACTCTGGAGACTTCGGC
Bs E-R
GCTATGAGATAGTCATGGGAGCTGTC
El p og ama u ilizado pa a la pa eja de cebado es Bs EII ue: 94ºC 3 min,
seguido de 30 ciclos de 94ºC 15 s, 65ºC 20 s y 1 min a 72ºC y un úl imo ciclo de
72ºC 5 min. El amaño del agmen o ampli icado ue de 702 pb.
La DNA polime asa empleada pa a gene a po PCR la sonda de hib idación
ue la enzima Ad an age 2 Polyme ase Mix (Clon ech), que in oduce una adenina
Ma e iales y Mé odos
54
en el ex emo 3’ ampli icado, lo que acili a la pos e io subclonación en el
plásmido pGEMT (pGEM-T Easy Vec o , P omega), pa a lo que se siguió el
p o ocolo ecomendado po el ab ican e. Es o pe mi ió ob ene y pu i ica nue a
sonda sin necesidad de p epa aciones de DNA genómico, e i ando posibles
ampli icaciones espu ias.
4.2.4.c Ma caje adiac i o de la sonda de hib idación
Pa a el ma caje de la sonda de hib idación se empleó el sis ema HighP ime
(Roche), basado en la sín esis de una cadena complemen a ia de DNA u ilizando
cebado es hexanucleó idos, en p esencia del agmen o Klenow de la DNA
polime asa I. Ap oximadamen e 30 ng de sonda de DNA (a una concen ación de 5
ng/μl) se lle a on has a un olumen de 14 μl. La mues a se desna u alizó a 95ºC
du an e 10 min y se puso en hielo. Se añadie on 4 μl del High P ime ki , y 5 μl de
[α-32P]-dCTP (3000Ci/mmol, 10 mCi/ml, 500 μCi, Pe kin Elme ) y se incubó
du an e 1 h a 37ºC. La eacción se pa ó con 2 μl de 0.2 M EDTA, añadiendo
seguidamen e TE has a comple a 100 μl. Pa a elimina el exceso de
desoxinucleó ido i os a o adiac i o no inco po ado en el DNA, la mues a se
pasó po una columna de il ación en gel Sephadex G-50 p epa ada en je inguillas
de insulina de 1 ml, equilib ada p e iamen e con ampón TE, la cual se cen i ugó
pos e io men e a 1.500 pm (Cen omix P-Selec a) du an e 3 min. Todas las
manipulaciones que in oluc a on manejo de compues os adiac i os, con ue e
pode de emisión de pa ículas β, se ealiza on en las ins alaciones de
adioisó opos del SCAI.
4.2.4.d Hib idación, la ado y exposición de la memb ana
Las memb anas de nylon se incuba on en o ación a 65ºC du an e un
mínimo de una ho a en solución de p ehib idación: 5x SSC, 1% SDS, 5x Denha d ’s
( éase Anexo I) y 100 μg/ml de DNA de espe ma de salmón desna u alizado
(D1626, Sigma). El olumen empleado dependió del amaño de la memb ana,
eniendo en cuen a que és a debe se cubie a po comple o. T ascu ido es e
iempo, se cambió la solución po la de hib idación (5x SSC, 1% SDS y 100 μg/ml
de DNA de espe ma de salmón desna u alizado) jun o con la sonda adiac i a,
Ma e iales y Mé odos
55
p e iamen e desna u alizada, a una concen ación inal de 1x106 cpm/ml. La
hib idación se ealizó en o ación a 65ºC O/N.
T as la hib idación las memb anas se la a on a RT con disoluciones de
as ingencia c ecien e; 2x SSC y 0.1% SDS du an e 10 minu os, as los cuales se
cambió el medio epi iéndose el la ado du an e o os 10 min adicionales. A
con inuación el medio se cambió po 0.2x SSC y 01% SDS y se la ó de la misma
o ma desc i a an e io men e, p ime o a RT y luego a 42ºC. Po úl imo, se ealizó
un la ado con 0.1x SSC y 0.1% SDS a 65ºC. T as seca las memb anas se
en ol ie on con un plás ico anspa en e y se deja on 24 h en un case e de
au o adiog a ía jun o a una IP o osensible. Es e e elado ápido (en un apa a o
Fuji ilm FLA 7000) nos pe mi ió alo a si la memb ana p esen aba ondo y la
in ensidad del ma caje, p e io a su exposición en películas Ame sham Hype ilmTM
ECL que se dispusie on jun o con dos pan allas in ensi icado as en case es
me álicas y se man u ie on a -80ºC du an e 3 días de exposición.
5. Mic oinyección de células ES mu inas ansgénicas en
emb iones en es adio de 8 células
Es os expe imen os se lle a on a cabo en el INIA (Mad id) de acue do con
los p o ocolos implemen ados de Ins i ución In e na de Cuidado Animal y Comi é
de Uso del INIA (Mad id).
5.1 Supe o ulación de a ones Swiss
Pa a la ob ención de los emb iones se supe o ula on a ones Swiss hemb a,
ía in ape i oneal con gonado opina co iónica equina (PMSG o eCG; In e e ,
Boxmee ) a una concen ación de 7.5 UI, y 48 h más a de, con gonado opina
co iónica humana (hCG, Fa ma-Lepo i) a una concen ación inal de 5 UI.
T as la inyección de la hCG se p oduce el pico de ho mona lu einizan e (LH)
momen o en el que se lle a a cabo el c uce con los machos. Los emb iones en
es adio de 8 células se ex aje on qui ú gicamen e a los 2.5 días pos coi um (dpc).
Ma e iales y Mé odos
62
ANÁLISIS FENOTÍPICO MOLECULAR DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS
1. Análisis de los ansc i os GA median e qRT-PCR
1.1 Cuan i icación de los ansc i os GLS2 en animales WT,
Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+
El mRNA se aisló siguiendo las ecomendaciones del ab ican e (AllP ep
DNA/RNA/P o ein Mini Ki , QUIAGEN), a pa i de no más de 30 mg de ce eb o e
hígado de animales Gls2 m1a/+, WT y Gls2 m1c/+ (6 animales po geno ipo).
La cuan i icación del RNA se lle o a cabo con espec o o óme o y la calidad
del RNA se comp obó median e gel desna u alizan e al 1.5 % (p/ ) de
aga osa/ o maldehido ( éase Anexo I). La in eg idad del RNA se alo ó as
obse a las bandas co espondien es a los RNA ibosómicos, 28S y 18S, que
apa ecen ap oximadamen e en un a io 2:1 de in ensidad.
Mues as de 1 ug de RNA se e o ansc ibie on a cDNA siguiendo el
p o ocolo ecomendado po el ab ican e (Quan iTec Re e se T ansc ip ion Ki ,
Quiagen). A con inuación, se ealizó la PCR a iempo eal con el ki Pe ec a SYBR-
G een Supe mix (Quan a Biosciences), incluyendo los con oles nega i os
co espondien es: con ol de la e o ansc ipción ( alo a la con aminación de
DNA genómico) y con ol sin RNA molde (con aminación po eac i os y
ae osoles).
Los cebado es y condiciones del ciclo empleados ue on los desc i os
an e io men e po Ma ín-Ru ián e al., 2012. Se ealiza on cu as es ánda a
pa i de concen aciones conocidas de RNA pa a, pos e io men e, ep esen a el
loga i mo de la concen ación (ng) en e al alo C (cycle h eshold). La pendien e
de las mues as (slope) pe mi ió calcula la e iciencia de ampli icación (E)
median e la siguien e ó mula: % E iciencia = (E-1) × 100; donde E se calcula como,
E = 10-1/slope.

Ma e iales y Mé odos
63
Tabla 10. Secuencia de los cebado es empleados en qRT-PCR (Ma ín-Ru ián e al., 2012).
Cebado es
Secuencia 5’-3’
Secuencia 3’-5’
pb
GAB
GCACTCGGATCATGACGCCTCAC
TTGGACCATGCGCTGCATCTTG
190
LGA
GCCAGATGGTTCAAAGAGGAGG
GTGGTGAACTTGTGGATAGGG
230
β-ac ina
CTTTGCAGCTCCTTCGTTGCC
GCGAAGCCGGCTTTGCACAT
111
Las condiciones del p og ama u ilizado ue on: 95ºC du an e 4 min, 40
ciclos de 95ºC 15 s, 61ºC 45 s y 72ºC 30 s. Las medidas de luo escencia se
ealiza on a 72ºC. El so wa e pa a analiza los esul ados ue CFX de Bio-Rad.
La exp esión ela i a de cada una de las iso o mas se calculó en base al
mé odo 2-∆∆C (Li ak & Schmi gen, 2001), no malizando los esul ados en e a β-
ac ina.
Los amplicones ue on analizados en geles de aga osa, pa a con i ma
igualmen e la p esencia de un único p oduc o de ampli icación y la ausencia de
díme os y/o con aminación po DNA genómico.
1.2 Cuan i icación del ansc i o KGA en animales KOLPA1
Los animales ue on sac i icados po decapi ación y una ez ex aído el
ce eb o, és e se congeló ápidamen e a -80ºC has a la ob ención de las di e en es
egiones de in e és. Se ealiza on co es de 2 mm de g oso con una ma iz Zi ic de
ce eb o (Zi ic Ins umen s). Siguiendo las indicaciones del Mouse B ain in
S e eo axic Coo dina es (Paxinos and F anklin 2001) y Blanco e al2., 2012, se
aisla on las egiones de in e és, co espondien es a es iado, hipocampo, co eza
p e on al (PFC), pa ie al mo o a (PM) y ce ebelo.
La ex acción de RNA y la e o ansc ipción se lle a on a cabo como se
desc ibe en el apa ado an e io . Los cebado es u ilizados se mues an en la Tabla
11. Las condiciones del p og ama u ilizado ue on las mismas que pa a los
ansc i os GLS2.
Ma e iales y Mé odos
64
Tabla 11. Secuencia de los cebado es empleados en qRT-PCR (Ma ín-Ru ián e al., 2012)
Nomb e
Secuencia 5’-3’
Secuencia 3’-5’
pb
KGA
CAGAACAGCCCTGCATGTTGCTG
CCACCTGTCCTTGGGGAAGGGGT
179
Pa a la cuan i icación absolu a del ansc i o KGA, se ealiza on cu as
es ánda empleando can idades conocidas de cada uno de los amplicones
especí icos. Dichos amplicones ue on ob enidos p e ia ampli icación po PCR,
sepa ados y pu i icados de geles de aga osa al 2%. Las concen aciones se
es ima on po espec o o ome ía. A con inuación, se hicie on diluciones de cada
es ánda (1/10) y pa a cada una de ella se de e minó el C . La cu a se ob u o
ep esen ando el C de cada dilución en e al loga i mo de la can idad inicial. Los
esul ados se ob u ie on in e polando en la cu a, y se exp esa on como núme o
de moléculas de mRNA ± SEM po ng de RNA o al. Finalmen e, el núme o de
copias se calculó eniendo en cuen a el núme o de A ogad o y la co espondien e
masa molecula del mRNA (Samb ook e al., 1989)
2. Análisis de exp esión p o eica po inmuno ans e encia
Wes e n
2.1 Ex acción y cuan i icación de p o eínas
La ex acción de p o eínas pa a el análisis de isoenzimas GA en animales
WT, Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+ (n=6 po geno ipo), se lle ó a cabo en ío median e
homogenización del ejido en un ampón de ex acción (a azón de es olúmenes
de ampón po peso de ejido), compues o po : T i ón X-100 1% (p/ ), 2mM EDTA,
50 mM T is (pH 8) e inhibido es de p o easas (Comple e Mini P o ease Inhibi o
Cock ail, Roche). A con inuación, se incubó a 4ºC du an e 1 h en agi ación y se
cen i ugó a 14.000 pm (He ich Uni e sal 320R, o o 1420) du an e 15 min a
4ºC.
La cuan i icación de p o eínas en el sob enadan e se es imó median e el
mé odo de B ad o d (1976). Pa a lo cual se lle ó a cabo una in e polación sob e
una ec a pa ón ealizada con concen aciones conocidas de albúmina de sue o
bo ino (BSA, F ac ion V, Sigma). Las abso bancias se midie on a 595 nm
(Mic opla e Reade 680, Bio-Rad).
Ma e iales y Mé odos
65
En animales KOLPA1 se analiza on ma cado es p o eicos de espinas
dend í icas: PSD-95 y sinap o isina (n=5 po geno ipo), KGA (n=9 po geno ipo) y
MMP-9 p o-ac i a y ac i a (n= 8 WT; n= 11 KOLPA1). Los animales ue on
sac i icados po decapi ación y se les ex ajo el ce eb o y an es de su congelación a
-80ºC, se disecciona on las dos á eas de es udio: co eza e hipocampo.
La ex acción de p o eínas pa a el análisis de ma cado es p o eicos de
espinas dend í icas (PSD-95 y sinap o isina) y KGA, se lle ó a cabo median e
homogenización con ampón RIPA (150 mM clo u o sódico, 1% NP-40, 0.25%
sodio deoxicola o, 0.1% SDS, 1 mM EGTA y 50 mM T is pH 7.4 e inhibido es de
p o easas), que esul a óp imo pa a la ex acción de p o eínas de memb ana. La
homogenización del ejido en el ampón de ex acción se ealizó en hielo, la
incubación a 4ºC se man u o 20 minu os y pos e io men e se cen i ugó 20
minu os a 30.000g. En el caso de MMP-9 las mues as se homogeneiza on en 20
olúmenes de ampón de lisis (50 mM T is, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 %
NP-40) con eniendo inhibido es de p o easas al 5 % y os a asas al 1 % (p5726,
Sigma, Mad id, España). La mues a se hizo pasa a a és de la aguja de una
je inga hipodé mica (26G) pa a ompe las acciones isula es que pe manecie on
en e as.
La de e minación de la concen ación de p o eína de las mues as en
ampón de homogenización con eniendo Nonide P40 se ealizó median e una
modi icación del mé odo de Low y (Ma kwell e al., 1978). Pa a ello se mezcla on
200 L de una dilución de la mues a con 600 L de eac i o C, compues o po una
mezcla en p opo ción 100:1 de eac i o A (2% Na2CO3, 0.4% NaOH, 0,16% a a o
sódico y 1% SDS) con sul a o de cob e al 4% ( eac i o B). La mezcla se incubó
du an e 10 min a RT. A con inuación se adiciona on 60 µl de eac i o de Folin-
Ciocal eau (diluido en agua a azón 1:1). T as 45 minu os de incubación, se
de e minó la abso bancia a una longi ud de onda de 660 nm (Mic opla e Reade
680, Bio-Rad) de cada mues a y se in e poló es e alo en una ec a pa ón
ealizada a pa i de concen aciones conocidas de albúmina de sue o bo ino.
Ma e iales y Mé odos
66
2.2 Inmuno ans e encia Wes e n
Las p o eínas se sepa a on median e elec o o esis en condiciones
desna u alizan es en p esencia de SDS, según el mé odo desc i o po Laemmli
(1970). Pa a ello se emplea on 45 μg de p o eínas p oceden es de ejido ce eb al
y 30 μg de p o eínas hepá icas. Las mues as se calen a on du an e 5 min a 95ºC
en ampón de ca ga ( éase Anexo I) y se analiza on en geles de poliac ilamida al
10%. El ma cado u ilizado ue el Low Molecula Weigh Calib a ion Ki o SDS (GE
Heal hca e).
Pos e io men e, se ealizó la ans e encia a memb anas de ni ocelulosa
empleando el Mini T ans-Blo cell (Bio-Rad) du an e 1 h a 100V. Finalizada la
ans e encia, la memb ana se iñó con Red Ponceau pa a asegu a que las
p o eínas se habían ans e ido co ec amen e. El exceso de inción se eliminó con
agua.
El p ocedimien o pa a la incubación de los an icue pos ue el mismo pa a
odas las mues as. Las memb anas se bloquea on con BSA al 5% en ampón TTBS
(Anexo I) du an e 1 h a RT. A con inuación, los an icue pos p ima ios se incuba on
en agi ación sua e a 4ºC (O/N). A la mañana siguien e se la ó la memb ana es
eces du an e 10 min con TTBS y se añadió el an icue po secunda io
co espondien e, el cual se dejó du an e 1 h a RT. Después de la a la memb ana,
se e eló con el eac i o quimioluminiscen e Supe Signal Wes Pico
Chemiluminescen Subs a e (The moFishe ) y la imagen se egis ó en un equipo
de o odocumen ación de geles y memb anas (ChemiDoc MP Sys em, Bio-Rad). Se
e i ó el exceden e de eac i o quimioluminiscen e y se añadió el an icue po an i-
GAPDH o an i-β-ac ina como con ol de ca ga, y la memb ana se dejó a 4ºC O/N. A
la mañana siguien e se p ocedió de o ma equi alen e a la desc i a pa a la
incubación del an icue po secunda io.
La cuan i icación de la densidad de las bandas se ealizó u ilizando el
p og ama Image J. El alo de cada mues a se no malizó en e e encia a la
inmuno eac i idad de la β-ac ina o GAPDH según co esponda.
Ma e iales y Mé odos
67
Tabla 12. An icue pos y diluciones u ilizadas en los expe imen os de inmuno ans e encia Wes e n
con animales WT, Gl2 m1a/+, Gls2 m1c/+ y KOLPA1.
An icue po p ima io
Dilución
An icue po secunda io
Dilución
GAB
1:500
An i-IgG de a ón
1:40.000
PSD-95
1 μg/ml
An i-IgG de cab a
1:80.000
Syn
1:2.500
An i-IgG de conejo
1:80.000
KGA
1:1.000
An i-IgG de conejo
1:80.000
MMP-9
1:1.000
An i-IgG de conejo
1:80.000
GAPDH
1:500
An i-IgG de a ón
1:40.000
β-ac ina
1:10.000
An i-IgG de a ón
1:40.000
Los an icue pos p ima ios u ilizados ue on: an icue po an i-GAB y an i-KGA, p e iamen e
desa ollados y ca ac e izados en es e labo a o io (Olalla e al. 2002; Campos e al. 2003; Olalla e
al. 2008; Ca dona e al. 2012); PSD-95 (12093, Abcam); Syn (14692, Abcam); MMP-9 (19016,
Millipo e); GAPDH (9484, Abcam); β-ac ina (A5441, Sigma). Los an icue pos secunda ios
(conjugados a pe oxidasa de ábano, HRP) u ilizados ue on: An i-IgG de a ón (A9044, Sigma);
An i-IgG de cab a (ab5420, Abcam); An i-IgG de conejo (A0545, Sigma).
3. Análisis de exp esión de isoenzimas GA median e cuan i icación
de la ac i idad enzimá ica
La ac i idad GA se lle ó a cabo po el mé odo OPA (o- alaldehído) desc i o
po Heini e al. (1987) y basado en la de e minación del amonio p oducido po la
enzima GA al ac ua sob e su sus a o y pos e io eacción del mismo con el OPA.
La ac i idad especí ica se exp esó en unidades in e nacionales de ac i idad
enzimá ica (U, can idad de enzima que ca aliza la p oducción de 1 µmol de
p oduc o po minu o) po g amo de p o eína.
El ejido se homogenizó empleando es olúmenes de ampón de eacción:
25 mM T is–HCl (pH 8), 0.2 mM EDTA, 0.33 M saca osa, inhibido es de p o easas
(Roche) y de e gen e no iónico T i ón X-100 1% (p/ ). Se cen i ugó a 100.000g
(Op ima TL Ul acen í uga) du an e 30 min a 4ºC.
La eacción GA se lle ó a cabo du an e 1 h a 37ºC as añadi 25 μL de
mues a a 35 μL de ampón de eacción. La eacción se pa ó con 10 μL de ácido

Ma e iales y Mé odos
68
iclo oacé ico (TCA) al 10% (p/ ), se man u o en hielo du an e 15 min y se
cen i ugó a 12.000 g 5 min. Pa a los blancos de la eacción, las mues as y el
sus a o se incuba on po sepa ado y, p e io a la adición de TCA, se mezcla on.
Pa a la medida del amonio se u iliza on 5 μL del sob enadan e que se mezcla on
con 150 μL de eac i o OPA (10 mL de os a o po ásico 0.2 M, pH 7.4; 0.56 mL de
me cap oe anol 72 mM en e anol; y 0.56 mL de OPA 186 mM). La mezcla de
eacción se man u o a empe a u a ambien e du an e 45 minu os en oscu idad y
se midió la abso bancia a 410 nm (Mic opla e Reade 680, Bio-Rad). Las
concen aciones de amonio de las mues as se ex apola on en una ec a pa ón de
NH4Cl.
Pa a la cuan i icación de la ac i idad GA en a ones WT, Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+, se u iliza on 6 animales po geno ipo. Se lle a on a cabo dos ipos de
ensayos de ac i idad basándose en las dis in as p opiedades ciné icas de las
isoenzimas KGA y GLS2 (GAB/LGA). Se cuan i icó la ac i idad o al GA, u ilizando
como ampón de eacción 150 mM os a o po ásico pH 8, 171 mM L-Gln y 1 mM
NH4Cl. La ac i idad asociada a GLS2 se midió con un ampón 50 mM os a o
po ásico pH 8, 100 mM L-Gln, 100 mM ácido glu ámico y 1 mM NH4Cl, al y como
es á desc i o en Campos-Sando al e al., 2007.
La cuan i icación de ac i idad GA en animales KOLPA1 se ealizó en las
siguien es egiones ce eb ales: co eza PM (WT n= 9; KOLPA1 n= 5), PFC (WT n=
12; KOLPA1 n= 8), hipocampo (WT n= 16; KOLPA1 n= 12), es iado, gi o den ado y
ce ebelo (en es as egiones el núme o de animales analizados es u o comp endido
en e 8 y 15 pa a ambos geno ipos).
4. Inmunohis oquímica de iso o mas GA en animales KOLPA1
Pa a el análisis inmohis oquímico de los animales KOLPA1, un o al de 8
a ones ue on anes esiados con pen oba bi al sódico (60 mg/kg) y pe undidos
ansca dialmen e con 0.1 M PBS (pH 7.4), seguido de solución de ijación ía (4%
pa a o maldehído, 75 mM lisina y 10 mM de me ape ioda o sódico, en ampón
os a o 0.1 M, pH 7.4). El ejido se dejó O/N a 4ºC en solución de ijación y
pos e io men e se sume gió en saca osa al 30%. Los co es de 40 µm se ealiza on
Ma e iales y Mé odos
69
con un mic ó omo de congelación (Leica, modelo CM 1325) y se gua da on en PBS
con azida sódica al 0.02%.
La ac i idad pe oxidasa endógena se inac i ó con una disolución del 3% de
H2O2 y 10% de me anol en ampón 0.1M PBS (pH 7.4) du an e 20 minu os a RT. A
con inuación el ejido se la ó du an e 1 ho a en ampón PBS y se p ocedió a la
inac i ación de la bio ina y a idina endógenas, así como las p o eínas de unión a
bio ina median e la incubación de las secciones con el ki de bloqueo de Vec o
Labs (SP-2001) du an e 30 minu os. Pos e io men e, el ejido se incubó con los
an icue pos policlonales de conejo an i-KGA y an i-GAB, desa ollados y
ca ac e izados en nues o labo a o io. El an icue po an i-KGA se u ilizó a una
dilución 1:1000, y el an i-GAB a 1:500. Ambas incubaciones se p olonga on 48 h a
RT. T as ealiza es la ados de 10 min con PBS se añadió el an icue po
secunda io bio inilado, an i-IgG de conejo (Vec o Labs) a 1:500 (en PBS con 0.3%
T i ón X-100 y 0.1% azida sódica) y se dejó incubado du an e 1 h RT. T as ealiza
a ios la ados con PBS se incubó con ex a idina acoplada a pe oxidasa de ábano
(Sigma-Ald ich) a 1:2000 du an e 1 h a RT. El e elado se lle ó a cabo
empleando e ahid oclo u o 3-3’-diaminobenzidina (DAB; Sigma) al 0.05% (p/ )
y 0.03% (p/ ) sul a o amónico de níquel en H2O2 al 0.01% ( / ) en PBS. Los co es
se mon a on en po aobje os gela inizados, que pos e io men e ue on
deshid a ados en g aduación c ecien e de e anol, se acla a on con xileno y
cub ie on con medio DPX (VWR In e na ional, BDH P olabo).
Como con ol nega i o de la écnica se u iliza on secciones que no habían
sido incubadas con an icue po p ima io.
Pa a la adquisición de las imágenes se u ilizó un mic oscopio Nikon Eclipse
80i acoplado a una cáma a Nikon DS-5M de al a esolución.
5. Ca ac e ización de la mo ología de espinas dend í icas en
a ones KOLPA1
La inción de Golgi-Cox (FD Rapid GolgiS ain™ ki ; FD Neu o echnologies) se
lle ó a cabo pa a de ec a las al e aciones mo ológicas de las dend i as y de las
espinas dend í icas. Pa a ello, a ones macho adul os de cada uno de los geno ipos
Ma e iales y Mé odos
70
es udiados, WT (n=5) y KOLPA1 (n=5), ue on anes esiados con pen oba bi al
sódico (60 mg/kg) e inmedia amen e se les ex aje on los ce eb os. El ejido se
la ó con agua des ilada y se sume gió en solución de ijación (A+B) du an e dos
semanas en oscu idad. Pos e io men e, los ce eb os se ans i ie on a la solución C
du an e 4 días. El ejido se congeló en isopen ano (en iado a -70ºC) y se co ó en
un mic o omo de congelación (Leica, CM 1325) en secciones de 150 μm. Los co es
se mon a on en la solución C en po as gela inizados y se deja on seca a RT. Pa a
la inción de las mues as se siguió el p o ocolo ecomendado po el ab ican e,
seguido de un p oceso de deshid a ación en e anol en g aduación c ecien e,
acla ado con xileno y mon aje con medio DPX (BDH).
Pa a la adquisición de las mic o o og a ías de las dend i as basales
pi amidales de la egión CA1 (s a um o iens) de hipocampo, se u ilizó un
mic oscopio SP5 II (Leica) y un obje i o de inme sión en acei e 63x (láse 405
diodo), con un zoom 2.5x (z-s ack 0.3 µm). Pa a la cuan i icación y el análisis
mo ológico se u ilizó el so wa e LAS AF Li e (Leica). Se analiza on an o la
densidad de las espinas dend í icas ( alo ado como el núme o de espinas en 10
µm de longi ud) en dend i as secunda ias y e cia ias (analizándose un o al de 30
dend i as po geno ipo), como su mo ología y longi ud (e aluando un o al
ap oximado de 120 espinas/geno ipo), y el ancho de la dend i a. Se siguie on los
siguien es c i e ios: 1) la calidad de la inción; 2) el aislamien o de las dend i as
analizadas; 3) espinas cla amen e dis inguibles. El análisis es adís ico se lle ó a
cabo con el p og ama S a g aphics usando la p ueba de S uden o el es no
pa amé ico de Mann-Whi ney.
6. Análisis po zimog a ía en gel pa a la de e minación de la
ac i idad enzimá ica
6.1 De e minación de la ac i idad gela inasa de MMP-2 y MMP-9
La de e minación de la ac i idad gela inasa se lle ó a cabo sob e las mismas
mues as u ilizadas pa a el es udio de la exp esión p o eica, po lo que el p o ocolo
de ob ención y homogenización, así como la de e minación de la concen ación de
p o eína o al se encuen an de allados en el apa ado an e io .
Ma e iales y Mé odos
71
La sepa ación de MMP-2 y de MMP-9 se lle ó a cabo median e geles de
poliac ilamida/bis-ac ilamida al 7 %, con eniendo gela ina al 5 % como sus a o
enzimá ico especí ico de dichas me alop o einasas.
Las mues as ue on diluidas 3:1 en ampón de ca ga no educ o (25 mM
T is, pH 6,8, 10 % glice ol, azul de b omo enol) y se calen a on du an e 15 min a
37 °C, ca gándose 20 µg de cada una de las mues as. La elec o o esis se
desa olló en condiciones de ol aje cons an e, a 120 V du an e 110 min.
T as la elec o o esis, los geles se incuba on dos eces en ampón de la ado
(50 mM T is-HCl, pH 7,4, 6 mM CaCl2, 1,5 µM ZnCl2, 2,5% Tween-20) du an e 30
min a in de elimina la unión e e sible del SDS a las p o eínas de las mues as, así
como pe mi i la ena u alización de las p o eínas y ecupe a su ac i idad
enzimá ica. Pos e io men e, se incuba on los geles en ampón de ac i ación (50
mM T is-HCl, pH 7,4, 6 mM CaCl2, 1,5 µM ZnCl2) du an e 48 h a 37°C. T as la
incubación, los geles ue on eñidos con azul de Coomassie (Coomassie B illian
Blue R-250, Bio-Rad) y, pos e io men e, se des iñie on con solución de ácido
acé ico al 10% y me anol al 40%, lo que pe mi ió isualiza bandas decolo adas
debido a la ausencia de gela ina, co espondien es a la ac i idad enzimá ica de las
gela inasas ensayadas.
Los geles e elados de es e modo ue on escaneados como nega i os. La
in ensidad de las bandas co espondien es a la deg adación de sus a o se
cuan i icó median e el p og ama Image J So wa e.
6.2 De e minación de la ac i idad p o eolí ica del ac i ado isula
del plasminógeno
El es udio de la ac i idad p o eolí ica del ac i ado isula del plasminógeno
( PA) se lle ó a cabo median e zimog a ía en geles de poliac ilamida/bis-
ac ilamida al 9 %, con eniendo caseína al 0,1 % y plasminógeno al 0,1 % como
sus a o enzimá ico especí ico.
Las mues as se p epa a on de igual mane a que en el caso an e io con la
di e encia de que se ca ga on 10 µg de p o eína o al.
Resul ados y Discusión
78
emb iona ias (endode mo, mesode mo y ec ode mo) (Nagy & Vin e s en, 2006).
Uno de los pun os c í icos en el cul i o de células ES es man ene su es ado
plu ipo en e, ya que no malmen e ienden a di e encia se. Pa a consegui es e
obje i o, es necesa io el co-cul i o con MEF inac i ados o STO (una línea de
ib oblas os mu inos ans o mados) y el ac o inhibido de la leucemia (LIF), una
ci oquina del ipo in e leukina 6 (IL6) que inhibe la di e enciación celula (E ans &
Kau man, 1981).
El LIF eje ce su acción a a és de gp130, una subunidad del ecep o de
ci oquinas esencial en la ansducción de señales. La cascada de ac i ación implica
a las quinasas Janus (JAKS) que os o ilan a STAT3, que ac úa como un ac o de
ansc ipción ac i ando genes que se enca gan de po encia la au o- eno ación de
las células ES (Hi ano e al., 2000). Aunque la unción del ac o de c ecimien o de
ib oblas os (FGF) es menos cla a, pa ece que cuando se apo an señales
ex acelula es, como LIF, ambién p omue e la ac i ación de la ía JAK/STAT3
(Lanne & Rossan , 2010).
Figu a 3. Cul i o de células mad e emb iona ias (ES) mu inas. Las células ES c ecen
o mando colonias edondeadas y compac as de pequeñas células, sob e una capa de ib oblas os

Resul ados y Discusión
79
emb iona ios de a ón (MEF). En la igu a C, se indica con una lecha blanca una de las colonias
di e enciadas, que se puede e en aumen o en la igu a D. Se u ilizó un mic oscopio Nikon Diapho ,
con obje i o 4 x (A-C) y 10x (D).
3. Elec opo ación de células ES mu inas con el ec o de
ansgénesis
P e io a la elec opo ación de las células ES, se debe ealiza una diges ión
enzimá ica que pe mi a hace lineal al ec o de ansgénesis, lo que a o ece á los
e en os de eemplazamien o en e los de inse ción, además de p o ege el
ma cado de selección nega i o de la acción de nucleasas (Cheah & Beh inge ,
2001). Pa a ello se seleccionó una enzima de es icción con un único pun o de
co e ue a de la zona de homología, conc e amen e se u ilizó AsiSI. La banda única
ob enida as la diges ión del ec o , de ap oximadamen e 24 kb, coincide con el
amaño eó ico espe ado del ec o lineal (Fig. 4).
Figu a 4. Análisis de es icción del ec o de ansgénesis con AsiSI. (1) Ma cado
λHindIII, (2) Ma cado Mass Rule High Range DNA Ladde . (3 y 4) Diges iones de di e en es
Midip eps del ec o de ansgénesis con la enzima AsiSI.
4. Selección y geno ipado de células ES mu inas ansgénicas
Los ma cado es de selección pe mi en iden i ica aquellas células que han
inco po ado la casse e ansgénica median e la exp esión de esis encia a
an ibió icos. El ec o de ansgénesis po a un gen neo , que codi ica pa a la
enzima aminoglucósido os o ans e asa, con i iendo esis encia a an ibió icos de
la amilia de los aminoglucósidos (gene icina, kanamicina, neomicina) que ac úan
inhibiendo la sín esis p o eica (Hall e al., 2009). Además, es e ec o de
Resul ados y Discusión
80
ansgénesis po a un ma cado de selección nega i a, el gen DTA ( agmen o A de
la oxina di é ica), que pe mi e selecciona los e en os de ecombinación no
homólogos, median e la inhibición de la sín esis p o eica en las células que lo
inco po en (Yagi e al., 1990).
Figu a 5. Selección de células ES mu inas ansgénicas con el an ibió ico G418. La
selección con gene icina se lle ó a cabo du an e 8 días, momen o en el que ya se obse aba mue e
celula . Las células ES mu inas esis en es al a amien o se selecciona on pa a su geno ipado po
PCR. En la imagen se mues a una colonia ES mu ina con g an núme o de acuolas (obje i o 10x).
Pa a con i ma la p esencia de la casse e ansgénica en las células ES
mu inas esis en es a G418 se lle a on a cabo es PCR, una en la egión de
homología 5’, o a especí ica del gen neo y la e ce a especí ica del b azo co o del
ec o ( egión 3’). Los cebado es In1-Fw y La 3-R econocen la secuencia
comp endida en e el in ón 1 y la secuencia En2SA (Fig. 6), lo que pe mi e
asegu a la p esencia de la casse e ansgénica, ya que el cebado an isen ido es
especí ico de es a egión. Los cebado es Neo-Fw y Neo-R ampli ican la egión
co espondien e al gen de esis encia a gene icina. Pues o que se han desc i o
casos en que los ec o es de eemplazamien o se in eg an en el genoma median e
un único e en o de ecombinación (Be nelo -Moens e al., 2016), se chequeó la
p esencia del b azo de homología 3’ median e una PCR que ampli ica el si io loxP
de es a egión (cebado es Ex7-Fw e In7-R ).
Resul ados y Discusión
81
Figu a 6. Región de econocimien o de los cebado es u ilizados pa a el geno ipado
de las ES mu inas ansgénicas. En la igu a se indican las es pa ejas de cebado es u ilizadas
pa a el geno ipado de las ES mu inas mu an es.
Figu a 7. Geno ipado median e PCR de las células ES mu inas esis en es a G418 con
los cebado es (A) In 1Fw-LaR3R , (B) NeoFw-NeoR y (C) Ex7Fw-In7R . Las células ES
esis en es a G418 se geno ipa on con cebado es especí icos de la casse e ansgénica. (A) Los
clones 3, 4 y 6 ampli ica on el agmen o espe ado de 270 pb, co espondien e al b azo de
homología 5’. (B) Se ealizó una PCR de las células ES mu inas pa a de ec a la egión del gen neo .
Los clones 3, 4 y 6, an e io men e seleccionados, ampli ica on el agmen o espe ado de 492 pb. (C)
El análisis de la egión 3’ de la casse e ansgénica pe mi ió con i ma la p esencia del agmen o
co espondien e al loxP (318 pb) en los clones 3, 4 y 6. Las bandas se pu i ica on del gel y el DNA de
odos los agmen os ampli icados se secuenció ( éase Anexo II). (1) Ma cado de masa molecula
GeneRule 50 bp DNA Ladde
4.1 Geno ipado po Long-Range PCR (LRPCR o long-PCR) de células
ES mu inas ansgénicas
El geno ipado median e PCR con encional mos ado en el apa ado an e io
sólo pe mi e con i ma la ausencia o p esencia de la casse e ansgénica, pe o no
su localización en el genoma, po lo que se lle ó a cabo un geno ipado adicional,
an o po LRPCR como po ans e encia Sou he n. Es as écnicas nos pe mi i án
asegu a que la in eg ación de la casse e ansgénica ocu ió po ecombinación
homóloga en la egión adecuada del c omosoma 10 del genoma mu ino. Pa a ello,
la es a egia seguida en la LRPCR implica que un cebado sea especí ico de la
casse e y o o del DNA genómico, co espondien e a nues o gen (Fig. 8).
Resul ados y Discusión
82
Figu a 8. Región de econocimien o de los cebado es u ilizados pa a el geno ipado
de las ES mu inas ansgénicas po LRPCR. El cebado LRPCR-Fw es complemen a io de la
egión 5’ que queda po delan e del in ón 1, y que no se encuen a incluida en el ec o de
ansgénesis. LRPCR-R es complemen a io de la egión En2SA de la casse e ansgénica. El
agmen o ampli icado, de 5.6 kb, indica á que las células ES mu inas han inco po ado la casse e
ansgénica po ecombinación homóloga, en la egión adecuada del c omosoma 10
co espondien e al gen Gls2.
Los esul ados ob enidos median e el geno ipado po LRPCR (Fig. 9) nos
pe mi en con i ma la in eg ación de la casse e ansgénica en la egión
c omosómica co espondien e al gen Gls2. Se ob u ie on dos bandas (Fig.9.A), una
del amaño espe ado, 5.6 kb, y o a, inespecí ica, de meno amaño
(ap oximadamen e 2.5 kb). Aunque en el con ol nega i o u ilizado, DNA de células
ES mu inas WT, no se obse ó la banda de 5.6 kb, se asegu ó que és a con u ie a la
casse e ansgénica, median e Nes ed PCR con los cebado es In 1-Fw y LaR3-R
(Fig.6). El esul ado de es a PCR (Fig.9.B) con i ma la p esencia de la casse e
ansgénica, al ampli ica el agmen o co espondien e de 270 pb.
Figu a 9. Geno ipado median e LRPCR de las células ES mu inas esis en es a G418
con los cebado es LRPCR-Fw y LRPCR-R . (A) El amaño espe ado es de ap oximadamen e 5.6
kb pa a las células ES mu inas que hayan inco po ado la casse e ansgénica median e
ecombinación homóloga. En la igu a se indica la banda que se pu i icó del gel pa a ealiza la
nes ed PCR. El ma cado de masa molecula es λDNA-HindIII. (B) Nes ed PCR del agmen o de 5.6
kb con los cebado es In 1-Fw y LaR3-R . La ampli icación del agmen o de 270 pb con i ma la
Resul ados y Discusión
83
p esencia de la casse e ansgénica en las células ES mu inas. El ma cado de masa molecula es
Gene Rule 50 bp.
4.2 Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas median e
ans e encia Sou he n
Se ealizó una ans e encia Sou he n de odas las células ES mu inas
aisladas como posi i as as la selección po an ibió ico y geno ipado po PCR
con encional. Median e diges ión del DNA genómico aislado de las células ES con
la enzima de es icción Bs EII, y pos e io hib idación con la sonda especí ica,
cabe espe a dos agmen os de ap oximadamen e 16 kb y 9 kb. El p ime o
co espondien e al alelo que ha inco po ado la casse e ansgénica en el loci
adecuado, y el de 9 kb co espondien e al alelo WT ( éase Anexo II pa a un mayo
de alle de la es a egia seguida). Po an o, las células ES que hayan inco po ado la
casse e ansgénica p esen a án dos bandas, una de 16 kb y o a de 9 kb, mien as
que las células ES WT sólo p esen a án la banda co espondien e a dicho alelo (9
kb).
Figu a 10. Geno ipado de las células ES mu inas ansgénicas median e ans e encia
Sou he n. (A) Fo og a ía del gel de aga osa donde se ealizó la sepa ación del DNA genómico
dige ido con Bs EII. Se puede obse a el smea ing ca ac e ís ico que deno a que la diges ión
enzimá ica del DNA u o luga a un ni el acep able. El ma cado u ilizado es λDNA/HindIII. (B)
Au o adiog a ía de la memb ana Sou he n hib idada con la sonda especí ica. A la izquie da de la

Resul ados y Discusión
84
igu a, con un guión neg o, se indican las masas molecula es del ma cado λDNA/HindIII
co espondien es a 23, 9.4 y 6.5 kb. Las calles 1 y 5 co esponden a dos células ES que han
inco po ado la casse e ansgénica, ya que p esen an la banda co espondien e al alelo WT (9 kb) y
al alelo mu ado (16 kb), mien as que 2, 3 y 4 co esponden a células ES WT.
5. Mic oinyección de células ES mu inas ansgénicas en
emb iones en es adio de 8 células
Las hemb as Swiss supe o uladas ue on sac i icadas a 2.5 dpc pa a la
ob ención de los emb iones. Pa a ello, se aisla on los o iduc os y pa e del cue no
u e ino y a a és del in undíbulo se inyec ó la solución amo iguado a M2 pa a
libe a al medio los emb iones (Fig. 11). Pos e io men e, se la a on median e
di e en es pases po el medio M2 y se p ocedió a la mic oinyección de las células
ES mu inas ansgénicas.
Figu a 11. Ob ención de emb iones y mic oinyección de células ES mu inas
ansgénicas. (A) T as el sac i icio se ealizó una incisión en la zona de la línea alba. Una ez
localizados los o a ios, se eliminó la mayo pa e de la g asa y ejido conec i o con ayuda de unas
pinzas y se co ó el o iduc o y pa e del cue no u e ino. (B) El la ado se ealizó a a és del
in undíbulo pa a libe a los emb iones en es adio de 8 células, localizados ce ca de la unión ú e o-
ubal. (C y D) Se inyec a on en o no a 10 células ES mu an es po cada uno de los emb iones.
La mic oinyección de células ES puede ealiza se en emb iones en es adio
de ocho células o en blas ocis os. Cuando la ICM ya es á o mada, las células ES
ansgénicas inyec adas deben compe i con las células de la masa in e na pa a
Resul ados y Discusión
85
o ma el emb ión, mien as que al inyec a se en emb iones en es adio de 8
blas óme as las células ES pueden ene una en aja compe i i a espec o el es o
de células indi e enciadas (Huang e al., 2008).
O as p emisas, apa e del es adio del desa ollo emb iona io, pueden
mejo a la e iciencia del p oceso, como po ejemplo la ac i ación de las células ES.
Sinc oniza las células en su ase exponencial de c ecimien o, p e io a inyec a las
en el emb ión, inc emen a el po cen aje de a ones con más del 75% de
quime ismo, lo que a su ez a o ece a con ibui a la línea ge minal. Se puede
conclui que la p oducción de a ones ansgénicos a pa i de células ES híb idas
es más e icien e cuando se ac i an las células ES y se mic oinyec an en emb iones
de 8 blas óme as (Ramí ez e al., 2009).
Los emb iones se man u ie on 24 ho as en medio KSOM suplemen ado con
4% de medio ES y se ans i ie on al ú e o de hemb as pseudoges an es. Se ha
desc i o que es os dos p ocesos p opo cionan una en aja a las células ES en e a
los blas óme os exis en es en la con ibución de la ICM (Ramí ez e al., 2009).
Se adjun a una abla (Tabla 1) con uno de los expe imen os lle ados a cabo,
donde se mues a el núme o de células ES inyec adas po emb ión y los emb iones
ans e idos po a ona. Del núme o de nacimien os se de e mina cuán os de ellos
son quimé icos y el g ado de quime ismo que p esen an, al y como se indica en el
apa ado de Mé odos.
Tabla 1. Tabla que ejempli ica algunos de los expe imen os de mic oinyección.
Emb iones
inyec ados
Nº ES
Nacimien os
Quimé icos
Ni el
16
8
5
0
-
25
8
1
0
-
38
9
1
0
-
40
9
6
3
4
25
11
0
1
3
Resul ados y Discusión
86
Figu a 12. C ías quimé icas. El pelaje neg o indica una mayo con ibución de las células
ES ansgénicas en el desa ollo del emb ión. Median e c uces y geno ipado pos e io se
comp oba á si las células ES mu an es con ibuye on a la línea ge minal.
6. Geno ipado de a ones ansgénicos
Una ez se ob u ie on los undado es (F1) de la colonia, he e ocigo os pa a
el ansgén (HT; Gls2 m1a/+), se ealiza on los c uces consecu i os pa a ob ene las
c ías homocigo as que hubie an inco po ado la casse e ansgénica en ambos
alelos (Gls2 m1a/ m1a). La es a egia de geno ipado se basó en es cebado es, dos
especí icos del DNA genómico del gen Gls2 mu ino y uno de la cons ucción
ansgénica. Los animales WT (Gls2+/+) ampli ica án el agmen o comp endido
en e los cebado es In 1Fw e In 1R , con un amaño eó ico de 432 pb. Los a ones
Gls2 m1a/ m1a p esen a án un amplicón de 270 pb, co espondien e a la
ampli icación de los cebado es In 1Fw y LaR3R ; mien as que los animales
Gls2 m1a/+ p esen a án ambos agmen os.
Figu a 13. Región de econocimien o de los cebado es u ilizados pa a el geno ipado
de los a ones ansgénicos. El cebado In 1-Fw se une a la egión del in ón 1, mien as que el
cebado LaR3-R lo hace en la secuencia En2SA del ec o , e In 1-R a la egión del in ón 1 que
queda po de ás (3’-cadena abajo) de la casse e ansgénica. Cabe des aca que la pa eja de
cebado es In 1Fw-In1R econoce un agmen o de mayo amaño en los animales que han
inco po ado la casse e; sin emba go, debido a las condiciones del p og ama de PCR (1 min de
ex ensión) es e agmen o no se ampli icó.
Resul ados y Discusión
87
Figu a 14. Geno ipado median e PCR de los a ones ansgénicos con los cebado es
In 1-Fw, In 1-R y LaR3-R . Se puede obse a la p esencia de a ones Gls2 m1a/+ (2, 3, 4, 6, 7, 9,
10) y Gls2+/+ (5 y 8) en la camada. Los con oles u ilizados ue on: DNA genómico de animal WT
(11), el ec o de ansgénesis (12) y agua como con ol de con aminación (13). Se indica la banda
WT y la co espondien e a la ampli icación de la casse e ansgénica (Mu ). (1) Ma cado de masa
molecula GeneRule 50 bp DNA Ladde .
7. Análisis de iabilidad de a ones homocigo os Gls2 m1a/ m1a
Se ealiza on múl iples c uces en e animales Gls2 m1a/+ sin llega a
ob ene se la modi icación en homocigosis, pese a que la p opo ción de animales
WT y HT se ajus aba a una dis ibución mendeliana. Pues o que el ec o de
ansgénesis sigue una es a egia denominada “KO i s allele”, al in eg a se en el
genoma se gene a á un alelo nulo como consecuencia de la p esencia de una
secuencia acep o a de ayus e (En2Sa), que bloquea el p oceso de ansc ipción, y
de una señal de poliadenilación (pA) del i us SV40, que unca el ansc i o.
Aunque se han desc i o casos en los que animales homocigó icos m1a/ m1a son
iables y pueden, de hecho, u iliza se como modelos KO de es udio (Li e al.,
2014), la pe sis en e ausencia de c ías Gls2 m1a/ m1a as múl iples c uces en e HT
nos obligó a conclui que, en nues o caso, la modi icación en homocigosis esul a
le al, si bien no podemos de e mina si el p oblema se encuen a en el papel de
es a iso o ma du an e el desa ollo emb iona io.
Pa a analiza si los homocigo os mo ían du an e el pe iodo de ges ación, se
sac i ica on 3 a ones a día 10, 12 y 15 de ges ación y se examinó si había
eabso ciones e ales ( e os e anescen es). La Fig. 15 demues a que no se obse ó
pé dida e al y el geno ipado de los e os es an es de e minó que odos e an WT o
HT.
Resul ados y Discusión
94
Figu a 23. Di e encias en el núme o de copias de mRNA de KGA, GAB y LGA en hígado
y ce eb o de a ón. La isoenzima KGA es la más abundan e en ce eb o, siendo 15 eces supe io a
la suma de los ansc i os GLS2. En hígado, la iso o ma GLS2 mayo i a ia es GAB (11 eces supe io
a LGA), mien as que los ni eles de KGA son p ác icamen e nulos (Ma ín-Ru ián e al., 2012).
Se lle ó a cabo una cuan i icación ela i a de mRNA compa ando la
exp esión de GAB y LGA en Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+ espec o los animales WT (n=6
po geno ipo), exp esándose la a iación como un inc emen o o disminución en la
exp esión. Como gen cons i u i o no malizado se u ilizó la ß-ac ina, dado que en
los es geno ipos analizados el ciclo umb al (C ) al que empezó a de ec a se ue
simila (en o no al ciclo 20-23, dependiendo de la éplica), se conside ó un buen
gen cons i u i o pa a nues o es udio. Es a misma me odología y gen cons i u i o
ue la empleada en la cuan i icación de los ansc i os GLS en a ones KO (Gls-/-)
pa a dicho gen (Masson e al., 2006).
Mien as que no se de ec a on cambios signi ica i os en e los animales WT
y los Gls2 m1c/+, los a ones Gls2 m1a/+ mos a on una disminución signi ica i a en
ce eb o de los ni eles de mRNA de GAB (**p=0.0038, K uskal-Wallis) y LGA
(**p=0.0011, K uskal-Wallis) y del ansc i o GAB en hígado (**p=0.0026, K uskal-
Wallis)(Fig. 24). Se puede conclui que la inco po ación de la casse e ansgénica
en he e ocigosis, con la consecuen e in e upción de la ansc ipción, conlle a a
una disminución de ap oximadamen e el 50% de las iso o mas GLS2 en el geno ipo
Gls2 m1a/+ s las colonias Gls2 m1c/+ y WT .
Figu a 24. Ni eles de mRNA de GAB y LGA en ce eb o e hígado de animales Gls2 m1a/+
s WT y Gls2 m1c/+. Hay una disminución signi ica i a en los ni eles de ansc i os GLS2 en ce eb o

Resul ados y Discusión
95
en los animales Gls2 m1a/+ en compa ación con los animales WT y Gls2 m1c/+, mien as que en hígado
sólo se edujo ap eciablemen e la iso o ma GAB (n=6/geno ipo; **p<0.005).
9.2 Análisis de exp esión de isoenzimas GA en animales WT,
Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+ median e inmuno ans e encias Wes e n
Se ealizó un análisis de exp esión de la p o eína GAB po
inmuno ans e encia Wes e n pa a e alua las posibles di e encias a ni el de
p o eína en los es geno ipos. Pa a ello se u iliza on an icue pos isoenzima-
especí icos an i-GAB, desa ollados en nues o labo a o io (Fig. 25). Como con ol
posi i o se u ilizó p o eína GAB humana ecombinan e pu i icada (Campos-
Sando al e al., 2003).
Figu a 25. Inmuno ans e encia Wes e n de GAB en hígado (panel izquie do) y
ce eb o (panel de echo) de animales WT (n=6), Gls2 m1a/+ ( m1a, n=6) y Gls2 m1c/+ ( m1c,
n=6). Se ealizó un análisis cuan i a i o de GAB (66 kDa) median e densi ome ía, u ilizando como
con ol de ca ga GAPDH (36 kDa). No se ie on di e encias signi ica i as en e los geno ipos
analizados. En ambos paneles, la calle no o ulada co esponde al con ol posi i o de p o eína GAB
humana ecombinan e.
No se obse a on di e encias signi ica i as en e los g upos analizados en
ninguno de los dos ejidos (ANOVA p=0.99) (Fig. 26). Po an o, la conclusión del
análisis conjun o de exp esión de mRNA y p o eína GAB, codi icada po el gen Gls2,
es que no exis e una co elación en e los ni eles de ansc i o (que se educen
signi ica i amen e) y p o eína (que se man ienen esencialmen e in a iables) en el
geno ipo Gls2 m1a/+. Di e en es mecanismos pos ansc ipcionales y/o
pos aduccionales pueden explica es a al a de co elación que, po o a pa e, ha
sido ecuen emen e de ec ada en un g an núme o de análisis masi os de
exp esión de genes de mamí e os ( éase, como ejemplo, P ade -Balade e al.,
2001). Además, con iene esal a que en es udios de exp esión de GA en ce eb o
Resul ados y Discusión
96
de a ones some idos a p o ocolos de adicción a cocaína ya se obse ó una
ma cada disociación en e ni eles de mRNA y p o eína (Blanco e al1., 2012). Po
úl imo, en el segundo bloque de esul ados de es a memo ia, en la ca ac e ización
de un modelo ansgénico KO pa a el ecep o del ácido liso os a ídico LPA1,
ol e emos a encon a nos con es a disociación pa a la iso o ma KGA, codi icada
po el gen Gls.
WT
m1a/+
m1c/+
WT
m1a/+
m1c/+
0.0
0.5
1.0
1.5
Ce eb o Hígado
GAB/GAPDH
Figu a 26. Di e encias en el ni el de p o eína GAB (no malizada en e a GAPDH)
en e animales WT, Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+ en ce eb o e hígado. En ce eb o, los animales WT
p esen a on un alo GAB/GAPDH medio de 1±0.05, los Gls2 m1a/+ de 1±0.02 y los animales
Gls2 m1c/+ de 1±0.06. En hígado, la media de WT ue de 1±0.15, en Gls2 m1a/+ de 1±0.07 y en Gls2 m1c/+
de 0.9±0.13. Los alo es son media ± SEM (n = 6 animales po cada geno ipo).
9.3 Análisis de exp esión de isoenzimas GA en colonias WT,
Gls2 m1a/+ y Gls2 m1c/+ median e cuan i icación de la ac i idad
enzimá ica
Como se ha indicado, las medidas de ac i idad GA se ealiza on en los es
geno ipos analizados (Tabla 3 y Fig. 27), además de lle a a cabo dos alo aciones
di e en es, una en p esencia de Glu (inhibido compe i i o de las isoenzimas GLS)
y o a en su ausencia (en la abla 3 se ep esen an los alo es ob enidos en los
ensayos sin Glu).
Resul ados y Discusión
97
Tabla 2. Medidas de ac i idad GA (exp esadas como mU/mg de p o eína) en hígado y ce eb o de
los es geno ipos analizados (*p=0.022; Los alo es se mues an como media ± SEM)
Ac i idad GA en ce eb o
(mU/mg)
Ac i idad GA en hígado
(mU/mg)
WT
15.6±2.5
11,2±2.6
Gls2 m1a/+
10.8±2.6
9.3±1.1
Gls2 m1c/+
14±0.75
18.2±2.2*
En hígado, la ac i idad GA (medida en ausencia de Glu) mos ó di e encias
signi ica i as en e los geno ipos analizados (*p=0.022, ANOVA). Median e un
análisis pos -hoc (LSD de Fishe ) se dis inguen dos g upos que di ie en en e sí, WT
s Gls2 m1c/+ y Gls2 m1a/+ s Gls2 m1c/+ (Tabla 3, Fig. 27). Al compa a los esul ados
ob enidos en las medidas de ac i idad GA en hígado en p esencia y ausencia de
Glu, no se obse an di e encias signi ica i as, lo que con i ma el papel de GLS2
como isoenzima p incipal en es e ó gano (la ausencia de disminución en la
ac i idad en p esencia de Glu a es igua la ca encia de isoenzimas GLS).
En ce eb o, las di e encias de ac i idad en e geno ipos no ue on
signi ica i as (p= 0.68, K uskal-Wallis) (Tabla 3 y Fig. 27). Sin emba go, en es e
caso el a amien o con Glu conlle a una inhibición o al de la ac i idad GA en
ce eb o, (***p<0.0001, - es ). Es os esul ados con i man que la KGA es la
isoenzima p incipal en ce eb o de a ón, como se ha de allado p e iamen e (Olalla
e al., 2002; Ma ín-Ru ián e al., 2012).
Resul ados y Discusión
98
Figu a 27. Ac i idad GA (mU/mg) en ce eb o e hígado de animales WT, Gls2 m1a/+ y
Gls2 m1c/+. Los alo es co esponden a ensayos ealizados en ausencia de Glu. En hígado se
obse a on di e encias signi ica i as en e los es geno ipos analizados (*p=0.022). Los alo es se
ep esen an como media ± SEM (n = 6 animales po geno ipo).
En p incipio, pod ían espe a se di e encias en e WT y el geno ipo
Gls2 m1a/+ y alo es equi alen es de ac i idad GA en e WT y el geno ipo Gls2 m1c/+;
sin emba go, cabe des aca que en los es udios eno ípicos el ondo gené ico de los
animales es de especial impo ancia. Jackson Labo a o y iene disponible una base
de da os con di e encias en e dis in as cepas de animales, y aunque aún no hay
egis ada in o mación e e en e a la ac i idad enzimá ica GA, a ios g upos de
in es igación sí han con i mado es e hecho pa a o as enzimas. Po ejemplo, se ha
is o una mayo ac i idad de la enzima alcohol deshid ogenasa en hígado de
animales C57BL/6 (41 U/g) compa ados con DBA/2J (23 U/g) y con cepas
híb idas, que ob enían medidas in e medias (Balak e al., 1982). Se han desc i o
esul ados simila es en cuan o a la ac i idad de la enzima málica al compa a
animales C57BL/6 y DBA/2J (Coleman & Kuza a, 1991).
T as el es udio ealizado a ni el de mRNA, p o eína y ac i idad enzimá ica,
se de e mina la necesidad de ob ene el homocigo o Gls2 m1c/ m1c como modelo
mu ino a ca ac e iza , an o po la posible acción compensa o ia del alelo WT en la
unción GA, como po el e ec o que conlle a abaja con di e en es cepas a la ho a
de ealiza es udios compa a i os, siendo necesa io es ablece un ondo gené ico
homogéneo.
Resul ados y Discusión
99
10. C uce de la colonia Gls2 m1c/ m1c con animales que exp esan la
C e ecombinasa
Ac ualmen e hemos ijado la colonia de a ones que exp esan la
ecombinasa C e bajo un p omo o de sinapsina de a a (especí ico de ce eb o)
(Fig. 28). La exp esión comienza a día emb iona io 11.5 (E11.5) pa a alcanza un
pico a E12.5, an o en neu onas de co eza, hipocampo, diencé alo (hipo álamo,
álamo, sub álamo, epi álamo y III en ículo), médula espinal, como en algunas
células de Pu kinje de ce ebelo (Ma e al., 1999; Zhu e al., 2001).
Figu a 28. Geno ipado median e PCR de los a ones que exp esan la ecombinasa C e
con los cebado es C e-Fw y C e-R . Se puede obse a la banda co espondien e al ansgén de
100 pb en la mayo ía de los animales de la colonia analizada. Como ma cado de masa molecula se
u ilizó GeneRule 50 bp DNA Ladde .
Cuando se ob engan los a ones homocigo os Gls2 m1c/ m1c, los c uza emos
con los animales que exp esan la ecombinasa C e bajo el p omo o de sinapsina,
lo que pe mi i á ob ene un animal KO (Gls2-/-) pa a el gen Gls2 en ce eb o,
conc e amen e en las egiones donde se ha is o una mayo exp esión de es a
isoenzima: co eza, hipocampo, ce ebelo (Olalla e al., 2012), pe mi iendo elucida
la unción ce eb al de es as isoenzimas GLS2.

Resul ados y Discusión
100
PARTE II: CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ISOENZIMAS
GA EN EL MODELO MURINO KOLPA1
1. Inmunohis oquímica de iso o mas GA en animales KOLPA1
Con el in de analiza el e ec o que el silenciamien o del ecep o LPA1
puede ene en la exp esión de las isoenzimas GA en ce eb o, se lle ó a cabo un
análisis de la exp esión de KGA y GLS2 (GAB y LGA) median e
inmunohis oquímica. Los an icue pos an i-KGA empleados son especí icos de es a
iso o ma, ya que es án di igidos con a la egión C- e minal, y po an o, no
econocen la iso o ma GAC. Los an icue pos an i-GAB u ilizados econocen ambas
iso o mas, GAB y LGA (Olalla e al. 2002; Campos e al. 2003; Olalla e al. 2008;
Ca dona e al. 2015).
El ma caje ob enido con los an icue pos an i-KGA mos ó una localización
ci oplasmá ica de aspec o pun eado, ípica mi ocond ial, de acue do con esul ados
p e ios de localización de KGA en ce eb o de mamí e os (Olalla e al., 2002;
Ca dona e al., 2015). Sin emba go, cabe des aca di e encias en la in ensidad del
ma caje en a ias egiones ce eb ales al compa a en e los geno ipos analizados.
Se obse a una cla a disminución de la exp esión de KGA en co eza e hipocampo
de animales HT (Fig. 29, B,E,H,K) y KOLPA1 (Fig.29 C,F,I,L) en compa ación con las
mismas á eas de ce eb os WT (Fig.29 A,D,G,J). Conc e amen e, las egiones más
a ec adas ue on: las neu onas pi amidales de la egión CA3 y el neu opilo del
es a o lacunoso-molecula de CA1 de hipocampo, y el gi o den ado (Fig.29 J,K,L).
En ce ebelo, no se obse a on cambios en la exp esión de KGA. Las di e encias
obse adas en la in ensidad del ma caje ue on g aduales desde animales WT a
KOLPA1, lo que pod ía implica una educción p opo cional en los ni eles de la
iso o ma KGA cuando los ni eles del ecep o LPA1 disminuyen. Asimismo, se
de ec ó un cambio en el ma caje pe i ascula en los animales con meno exp esión
de LPA1, especialmen e en KOLPA1 (Fig.29 M,N,Ñ).
La disminución en los ni eles de exp esión de KGA, la isoenzima GA más
abundan e en ejido ce eb al (Blanco e al., 2012; Ma ín-Ru ián e al., 2012), ue
comple amen e inespe ada y no puede explica se en base a esul ados p e ios que
Resul ados y Discusión
101
han demos ado al e aciones en el ce eb o de es os animales KOLPA1. Así, po
ejemplo, se ha publicado p e iamen e que los animales KOLPA1 p esen an una
educción de neu onas co icales, pe o dicho descenso sólo ocu e en las capas
I/III, V y VI de la co eza ce eb al (Es i ill-To ús e al., 2008), po lo que esul a
insu icien e pa a jus i ica la educción de ec ada de la p o eína KGA en co eza y
es o de egiones, pa icula men e hipocampo. De o ma análoga, se ha desc i o
una meno neu ogénesis en el gi o den ado de los a ones KOLPA1 (Ma as-Rico e
al., 2008), que pod ía con ibui pa cialmen e al dé ici de KGA en es a sub egión
ce eb al, pe o que, sin duda, no explica el silenciamien o de la exp esión de KGA en
o as egiones hipocampales.
Resul ados y Discusión
102
Fig 29. Localización inmunohis oquímica de KGA en animales WT, he e ocigo os
(HT) y KOLPA1. Se puede obse a una educción p og esi a en el ma caje de KGA de animales WT
a KOLPA1, con un eno ipo in e medio en los HT. (A-C) Pano ámica de la co eza (Cx) y es iado
(S ), las lechas indican asos sanguíneos inmuno eac i os pa a KGA. (D-F) De alle del cambio
p og esi o en el ma caje pe i ascula de la co eza insula . (G-I) Pano ámica del hipocampo, las
lechas indican los cambios en el ma caje de CA1 y CA3. (J-L) Disminución en el ma caje del slm y
Resul ados y Discusión
103
DG en HT y KOLPA1 y en neu onas de CA3. (M-Ñ) En á eas sub alámicas, ce ca del III en ículo se
obse a un cambio en el ma caje pe i ascula en animales KOLPA1. En ce ebelo no se obse a on
di e encias (no se mues an esul ados de es a egión). Cx, co eza; S , es iado; VS, aso
sanguíneo; CA1, CA3 subcampos hipocampales; sp es a o pi amidal; slm, es a o lacunoso-
molecula ; DG, gi o den ado; m, capa molecula ; 3V, e ce en ículo. Ba as de escala: A-C, 1 mm;
D-F, 100 µm; de alle D, 25 µm; de alle E, 40 µm; J-L, 500 µm; M-Ñ 200 µm.
En con aposición con KGA, los pa ones de inmunoma caje en e a las
iso o mas GLS2 ue on esencialmen e idén icos pa a los es geno ipos de
animales es udiados (Fig. 30). No se de ec a on cambios apa en es en la exp esión
de GLS2 en las di e en es egiones ce eb ales analizadas po inmunohis oquímica,
ales como co eza, es iado (Fig. 20 A-C), hipocampo (Fig. 30 D-F) o ce ebelo (Fig.
30 G-I). La inmuno inción GLS2 e eló un pa ón dis in i o con elación a KGA,
mos ando un ma caje ca ac e ís ico mayo i a iamen e nuclea , de acue do con
esul ados p e ios de inmunolocalización de GLS2 en ce eb o de mamí e os (Olalla
e al., 2002; Ca dona e al., 2015).
Resul ados y Discusión
110
Figu a 34. Tinción de Golgi-Cox de las dend i as basales de neu onas pi amidales de
CA1 en animales WT(A-D) y KOLPA1 (E-H). (A) Pano ámica de neu ona pi amidal de animal WT,
y (B) de alle de la dend i a indicada. (C y D) Dend i as secunda ias de animales WT. (E) Pano ámica
de neu ona pi amidal de animal KOLPA1, los de alles se mues an en las igu as F y G. (H) Espinas
dend í icas de un animal KOLPA1. Las espinas dend í icas de los animales KOLPA1 ienen una
mo ología más ala gada y delgada en compa ación con los WT. Ba a de escala: Pano ámias (A y E)
10 μm; B-D y F-H 5 μm.
Se ealiza on di e en es medidas, en e ellas la densidad de espinas
dend í icas, que se alo ó como el núme o de espinas po cada 10 μm de longi ud,
en dend i as secunda ias y e cia ias. Aunque no se obse a on di e encias
signi ica i as en es e pa áme o, ni en el ancho de la dend i a de animales WT y
KOLPA1 (p alo =0.097 y 0.086 espec i amen e, - es ), sí se obse a on
al e aciones mo ológicas en las espinas dend í icas.
Pos e io men e, se lle o a cabo un análisis mo omé ico que e eló la
p esencia de un mayo núme o de espinas ala gadas, delgadas y de eco ido más

Resul ados y Discusión
111
o uoso (gi os y dobleces) en los animales KOLPA1 (Fig. 34, E-H) en compa ación
con los WT (Fig. 34, A-D), ca ac e ís icas de es adios inmadu os (Eb ahimi &
Okabe, 2014). Se cuan i ica on el núme o de espinas po sub ipo (champiñón,
delgadas, co as y ilopodia) y geno ipo, obse ándose una mayo ecuencia de las
ipo ilopodia en a ones KOLPA1 (***p=0.004, - es ) en de imen o de las ipo
champiñón y co as (Fig. 35). Además, la longi ud de las espinas dend í icas e eló
di e encias signi ica i as (***p=0.0004, Mann-Whi ney), con un aumen o en el
sub ipo delgada en los a ones KOLPA1 (*p=0.0104, Mann-Whi ney) (Fig. 35). O o
de los pa áme os que ambién se al e ó ue el diáme o de la cabeza de la espina
dend í ica, conc e amen e en las espinas ipo champiñón con un meno amaño en
los KOLPA1 (***p< 0.0001, Mann-Whi ney).
Figu a 35. Di e encias en las longi udes de las espinas dend í icas y en la
dis ibución mo ológica de és as en animales WT y KOLPA1. Se obse a on di e encias
signi ica i as en la longi ud de las espinas dend í icas en e animales WT (1.4±0.9) y KOLPA1
(1.9±1.1), y una mayo ecuencia de espinas ipo ilopodia en los KOLPA1 en de imen o de las
espinas ipo champiñón y co as. En p omedio, más de 60 espinas de cada geno ipo ue on
analizadas (***p<0.0004).
Po úl imo, en es e análisis po inción de Golgi-Cox, compa amos las
longi udes de los dis in os sub ipos de espinas en e geno ipos (Tabla 3). Se
encon a on di e encias signi ica i as pa a las espinas delgadas al compa a los
animales WT s KOLPA1 (*p=0.0104, Mann-Whi ney).
Resul ados y Discusión
112
Tabla 3. Análisis de las longi udes de los sub ipos de espinas dend í icas en la egión CA1
hipocampal de animales WT y KOLPA1. Los da os ep esen an la media de los angos de
longi udes±SEM. Se indica el núme o espinas dend í icas analizado pa a cada geno ipo(n=123 WT;
n=104 KOLPA1) (*p=0.0104, Mann-Whi ney).
Sub ipo
de espina dend í ica
WT
(n=123)
KOLPA1
(n=104)
Champiñón
0.8-2 ±0.3
0.78-2±0.28
Delgada*
0.86-2.76±0.44
1.24-3.6±0.5
Co a
0.3-0.9±0.1
0.4-0.9±0.1
Filopodia
1.13-5.5±1.4
1.22-5.3±1.16
Es os esul ados sugie en que la o mación y/o madu ación de las espinas
dend í icas de las neu onas pi amidales de hipocampo es á des egulada en el
modelo KOLPA1. Es á bien documen ado el papel modulado de LPA en la
o mación de sinapsis a a és de la modulación de la dinámica es uc u al de las
espinas dend í icas. Po ejemplo, en cul i os de neu onas de hipocampo el
ecep o LPA1 se localiza de mane a pun eada en las espinas dend í icas y su
sob eexp esión conlle a un inc emen o de la densidad y amaño de las espinas
(Pilpel & Segal, 2006). Nues a hipó esis, a eno de los esul ados aquí desc i os,
en la egión CA1 del hipocampo es que los animales KOLPA1 poseen cambios
mo ológicos en las espinas de sus p incipales sinapsis exci a o ias. Los esul ados
de la inción de Golgi-Cox mues an unas espinas dend í icas hipocampales con un
ma cado eno ipo inmadu o en el geno ipo KOLPA1.
6. Análisis de la exp esión de ma cado es p o eicos de espinas
dend í icas
Pa a iden i ica la base molecula que subyace al cambio mo ológico-
es uc u al de las espinas dend í icas, in es igamos si exis ían al e aciones en los
pe iles de exp esión p o eica de ma cado es dend í icos conocidos y de p o eínas
bien ca ac e izadas po su papel en la o mación y modulación de las sinapsis
es ablecidas en e espinas. Se examina on di e en es ma cado es como la p o eína
de la densidad pos sináp ica 95 (PSD-95) (ma cado pos -sináp ico) y una p o eína
de esículas, sinap o isina (Syn; ma cado p esináp ico). El análisis median e
Resul ados y Discusión
113
inmuno ans e encias Wes e n de ambas p o eínas no demos ó ninguna a iación
signi ica i a en sus ni eles de exp esión en e animales WT y KOLPA1 (Fig. 36 y
37).
Figu a 36. Análisis de la exp esión de ma cado es de espinas dend í icas po
inmuno ans e encias Wes e n. Se lle ó a cabo un análisis cuan i a i o po densi ome ía de
PSD-95 (105 kDa) y Syn (42 kDa), empleando como con ol de ca ga GAPDH.
WT
KOLPA1
WT
KOLPA1
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Co eza Hipocampo
PSD95/GAPDH
WT
KOLPA1
WT
KOLPA1
0.0
0.5
1.0
1.5
Co eza Hipocampo
Syn/GAPDH
Figu a 37. Exp esión de PSD-95 y Syn en co eza e hipocampo de animales WT y
KOLPA1. A pesa de los cambios obse ados en la mo ología de las espinas dend í icas, con un
eno ipo más inmadu o en los KOLPA1, no hay di e encias signi ica i as en los ma cado es
p o eicos analizados en e WT y KOLPA1.
7. El silenciamien o génico de LPA1 educe la exp esión y ac i idad
gela inasa MMP-9, pe o no la MMP-2
Las me alop o einasas de ma iz han a aído ecien emen e mucha a ención
como impo an es modulado es de la mo ología de las espinas dend í icas, jun o
con o as p o eínas cons i u i as que se conoce pa icipan en la o mación de las
sinapsis. Dado el impo an e papel que eje ce la me alop o einasa de ma iz 9
(MMP-9) en la po enciación a la go plazo, a o eciendo el ala gamien o y con ac o
Resul ados y Discusión
114
de las espinas dend í icas (Michaluk e al., 2011; Dziembowska & Wloda czyk,
2012) ( éase Fig. 38), se analizó la ac i idad de las me alop o einasas MMP-2 y
MMP-9 en co eza e hipocampo, con la inalidad de e si los a ones KOLPA1
p esen aban alguna al e ación como base molecula de sus p oblemas cogni i os y
de memo ia. Con es a inalidad, se analizó medio hemis e io de ambos geno ipos
(WT n=8 y KOLPA1 n=11) median e zimog a ía en gela ina, obse ándose
di e encias en los ni eles de ac i idad p o eolí ica de MMP-9 en ambas egiones
ce eb ales (con una disminución signi ica i a en los animales KOLPA1, ***p<
0.0001), mien as que los ni eles de MMP-2 pe manecían es ables (Fig. 39).
Figu a 38. Modo de ac uación de MMP-9. T as un es ímulo, MMP-9 se libe a al medio
ex acelula donde se ac i a y eje ce su acción a a és de in eg inas-β1 p omo iendo cambios en el
ci oesquele o, que conlle an a la elongación de las espinas dend í icas y eo ganización de los
ecep o es NMDA (Michaluk e al., 2011). Es a ac i ación es b e e, y ápidamen e se inac i a po el
inhibido isula de me alop o einasas 1 (TIMP-1), lo que pe mi e la madu ación de las espinas y la
o mación de sinapsis ac i as (Wang e al., 2008; Dziembowska e al., 2013; S awa ski e al., 2014).
Du an e la madu ación de las espinas se es ablecen mo ologías asociadas con una mayo
es abilidad, y mayo densidad pos sináp ica, como las espinas ipo champiñón (Ho ulainen &
Hoogen aad, 2010). Imagen omada de Dziembowska e al., 2013.
Resul ados y Discusión
115
WT
KOLPA1
WT
KOLPA1
0
50
100
150
Co eza Hipocampo
Ac i idad p o eolí ica MMP-2
(% s WT)
Figu a 39. Zimog ama de MMP-2 y MMP-9 en co eza e hipocampo de animales WT y
KOLPA1. Se analizó medio hemis e io de animales WT (n= 8) y KOLPA1 (n=11) pa a es udia la
ac i idad de MMP-9 y MMP-2. Se obse a on di e encias signi ica i as en la ac i idad p o eolí ica
de MMP-9 en ambas egiones ce eb ales, con un descenso en la ac i idad de los KOLPA1
(***p<0.0001), mien as que no se obse a on cambios en la ac i idad de MMP-2.
Pa a comp oba si la educida ac i idad MMP-9 obse ada en los animales
KOLPA1 se debía a una disminución de la exp esión p o eica, ealizamos
inmuno ans e encias Wes e n pa a e alua los ni eles de MMP-9 ( an o el
zimógeno, 92 kDa, como la p o eína ac i a, 82 kDa) en co eza ce eb al e
hipocampo. Los esul ados ob enidos (Fig. 40) mos a on una disminución en la
exp esión de MMP-9 ac i a en los animales KOLPA1 compa ado con los WT
(*p<0.05), mien as que no se obse ó a iación en los ni eles del zimógeno.

Resul ados y Discusión
116
Figu a 40. Inmuno ans e encia Wes e n de p o-MMP9 y MMP-9 en co eza ce eb al
e hipocampo de animales WT (n=4) y KOLPA1 (n=5). Se ealizó un análisis cuan i a i o de MMP-
9 p o-ac i a (92 kDa) y ac i a (82 kDa) median e densi ome ía usando β-ac ina como con ol de
ca ga. Los animales KOLPA1 mos a on una educción en los ni eles de MMP-9 ac i a (*p<0.05).
Po úl imo, se e aluó la ac i idad p o eolí ica del ac i ado isula de
plasminógeno ( PA), enca gado de ca aliza el paso de plasminógeno a plasmina,
donde la úl ima ac úa como po en e ac i ado de las MMPs (Van Wa & Bi kedal-
Hansel, 1990). Aunque el sis ema PA/plasmina ha sido implicado en nume osos
aspec os de la unción ce eb al, incluyendo la emodelación de las dend i as en
hipocampo (Pawlak e al., 2015) y co eza isual (Ma aga e al., 2014) de a ón,
además de pa icipa en la ac i ación p o eolí ica de MMP-9 desde su o ma
zimógena (Wang e al., 2008), no se obse a on di e encias signi ica i as en su
ac i idad en e animales KOLPA1 y WT ni en co eza ni en hipocampo (Fig. 41).
Resul ados y Discusión
117
Figu a 41. Zimog ama de PA en co eza e hipocampo de animales WT (n=4) y
KOLPA1 (n=6). El análisis po densi ome ía de la ac i idad PA no e eló di e encias en e
animales KOLPA1 y WT.
Los esul ados ob enidos apun an a una pa icipación signi ica i a de la
señalización LPA en la ac i ación de MMP-9. Se ha desc i o una elación en e LPA
y MMP-9 en células de ca cinoma hepa ocelula , donde el LPA ex acelula
sin e izado po ATX, a a és de su unión al ecep o LPA1, es capaz de ac i a
di e en es cascadas que lle an a la inducción de la exp esión de MMP-9, en e las
que des acan la ía PI3K/Ak y PKC/MPAK (Pa k e al., 2010). Es os an eceden es
concue dan con nues os esul ados en a ones de icien es pa a el ecep o LPA1
que expe imen an una disminución en la ac i idad MMP-9. Sin emba go, los
ni eles de zimógeno no a ían, disminuyendo exclusi amen e los de MMP-9 ac i a,
lo que pod ía implica la ac uación de e ce os en es a ía. La plasmina es un
induc o na u al poco e icien e de MMP-9, pe o puede ac i a a o as MMPs, como
MMP-3, que eje ce una po en e acción ca alí ica sob e p o-MMP9 (Ramos-
DeSimone e al., 1999). Así pues, podemos hipo e iza un posible papel de LPA1
sob e la ac i ación de MMP-9, que a su ez ac ua ía en la po enciación a la go plazo
y en la adquisición de ap endizaje espacial, unción en la que ambién se ha is o
implicada MMP-3 (Meighan e al., 2006).
Resul ados y Discusión
118
Po o a pa e, la implicación de MMP-9 (Ri e a e al., 2010; Michaluk e al.,
2011), y o as p o easas ex acelula es como PA (Ma aga e al., 2004), en la
emodelación de sinapsis, plas icidad sináp ica y p ocesos cogni i os es á
ampliamen e documen ada. En neu onas, MMP-9 es á localizada en los dominios
pos sináp icos de las sinapsis exci a o ias; su inhibición se ha elacionado con
dé ici s de memo ia en pa adigmas de ap endizaje compo amen al (Nagy e al.,
2007). Y, po supues o, como ya se ha mencionado, MMP-9 es un egulado cla e
de la mo ología de las espinas dend í icas (Michaluk e al., 2011; Dziembowska &
Wloda czyk, 2012). Los esul ados mos ados aquí sob e MMP-9 sugie en que la
educción de su ac i idad en a ones KOLPA1 pod ía debe se, al menos
pa cialmen e, a una disminución de la o ma ac i a p o ocada po mecanismos
pos aduccionales (disminución de su p ocesamien o p o eolí ico a o ma ac i a o
di ec a modi icación de algún esiduo sob e la p o eína madu a).
La educción de la ac i idad MMP-9 pod ía explica cambios a co o plazo
de la plas icidad sináp ica (con epe cusión sob e las p opiedades cogni i as y de
memo ia), debido a la ausencia de un adecuado p oceso de emodelado de las
espinas dend í icas en las neu onas hipocampales, y como pa e del eno ipo
neu o isiológico mos ado po los animales KOLPA1. No obs an e, MMP-9 eje ce
una unción dual en la mo ología de las espinas: mien as que ni eles locales
basales de ac i idad MMP-9 p omue en el ala gamien o de las espinas y la
po enciación sináp ica concomi an e (Wang e al. 2008), un exceso de ac i idad
MMP-9, como las que acon ecen en si uaciones pa ológicas como el in a o o la
epilepsia, p o oca la ans o mación de las espinas dend í icas desde el ipo
champiñón has a p o usiones ipo- ilopodio ( eno ipo inmadu o) (Bilouso a e al.,
2009); de hecho, la inhibición de es e inc emen o no ansi o io de ac i idad MMP-
9 p o ocó la emodelación de las espinas dend í icas hacia el eno ipo madu o ipo
champiñón (Bilouso a e al., 2009). De es a o ma, nues os esul ados indican que
una ac i idad MMP-9 educida pod ía su gi como un e ec o cadena-debajo de la
ausencia de señalización Rho/ROCK inducida po LPA1, u a que se conoce
p oduce la ac i ación de enzimas p o eolí icas como MMP-9 (Yu e al., 2014). Como
una consecuencia, la al a de plas icidad sináp ica, p o ocada po la emodelación
de las espinas hipocampales eje cida po MMP-9, pod ía explica los dé ici s
Resul ados y Discusión
119
cogni i os y de memo ia mos ados po los animales KOLPA1. Sin emba go, o os
au o es han encon ado que la mo ología de las espinas dend í icas se a ec a po
LPA1 pe o de mane a independien e de sus es p incipales cascadas de
señalización, sugi iendo al e na i amen e que es e e ec o ue debido a
in e acciones con o as p o eínas (el ecep o LPA1 iene un módulo de
econocimien o de p o eínas PDZ en su egión C- e minal) (Pilpel & Segal, 2006).
8. Función de las isoenzimas GA en el desa ollo y la
di e enciación neu onal
Po úl imo, aunque se desconoce el mecanismo pos ansc ipcional po el
que LPA1 lle a al silenciamien o de KGA en ce eb o, la disminución de es a
iso o ma puede o igina al e aciones en el desa ollo de las neu onas co icales e
hipocampales que, seguidamen e, pueden con ibui a no ables dé ici s en el
c ecimien o de neu i as, axones y en la madu ación de espinas dend í icas. De
hecho, KGA se ha asociado a di e enciación neu onal y p oli e ación de células
neu onales. Ambas iso o mas GLS (KGA y GAC) aumen an du an e la neu ogénesis
de células p ogeni o as neu ales humanas (NPCs), y su pa ón de exp esión
co elaciona posi i amen e con el ma cado neu onal MAP-2 (p o eína asociada al
mic o úbulo-2) (Wang e al., 2014). Hay que des aca que es udios ealizados con
cul i os de NPCs humanas median e silenciamien o génico de GLS con siRNA,
sugie en un papel c í ico de las iso o mas GLS en la p oli e ación y supe i encia
de NPCs (Wang e al., 2014). Más aún, la inhibición de la ac i idad GA en cul i os de
neu onas co icales emb iona ias de a ón p o ocó inhibición de la neu ogénesis
(Velle i e al., 2013), mien as que los ni eles de mRNA y p o eína KGA
aumen a on de o ma no able cuando células g anula es del ce ebelo se
di e encian en cul i o (Thomas e al., 1989). Es e úl imo es udio ambién demos ó
una sob e-exp esión de KGA, en pa alelo con la libe ación de Glu dependien e de
Ca2+ y la o mación de neu i as, esículas sináp icas y sinapsis (Thomas e al.,
1989).
En los úl imos años, se ha pues o de mani ies o la implicación de KGA en la
ep og amación me abólica subyacen e a la di e enciación neu onal. Así, du an e
la di e enciación ex i o de neu onas co icales p ima ias, el ciclo Glu/Gln aumen ó

Anexo I
127
1. Medios de cul i o pa a bac e ias
Medio LB (Lu ia-Be ani)
Ex ac o de le adu a 5 g
Bac o ip ona 10 g
NaCl 10 g
El pH se ajus ó a 7.4 y el olumen a 1 li o. A con inuación se es e ilizó en
au ocla e.
LB-Aga
Ex ac o de le adu a 2.5 g
Bac o ip ona 5 g
NaCl 5 g
Aga 7.5 g
El pH se ajus ó a 7.4 y el olumen a 500 ml. Se es e ilizó en au ocla e. Se dejó
en ia has a ap oximadamen e 50ºC y se añadió la ampicilina a una concen ación
de 50μg/ml.
2. Medios y soluciones pa a el cul i o de células de mamí e o
Medio EF
Medio Eagle modi icado de Dulbecco (DMEM; 4500 mg/l glucosa, glu aMAX, y 110
mg/L pi u a o sódico)
FBS 10% ( / )
Penicilina/Es ep omicina 1 mM
Glu amina 2 mM
Aminoácidos no esenciales 1 mM
Medio ES
Medio Eagle modi icado de Dulbecco (DMEM; 4500 mg/l glucosa, glu aMAX, y 110
mg/L pi u a o sódico)
FBS 15% ( / )
Penicilina/Es ep omicina 1 mM
Glu amina 2 mM
Aminoácidos no esenciales 1 mM
Anexo I
128
β-me cap oe anol 1 mM
Fac o inhibido de leucemia (LIF) 1000 U/ml
PBS 10x
NaH2PO4.H2O 2.28 g
KCl 4.6 g
Na2HPO4.2H2O 16.6 g
NaCl 87.7 g
El pH se ajus ó a 7.4 y el olumen a 1 li o. Se es e ilizó en au ocla e.
3. Soluciones pa a DNA
TAE 50x
T is Base 242 g
Ácido acé ico glacial 57.1 ml
EDTA 0.5 M 100 ml
Se u ilizó EDTA 0.5M (pH 8) p e iamen e es e ilizado en au ocla e. Se ajus ó el
olumen a 1 li o.
TBE 10x
T is Base 121.1 g
Ácido bó ico 52.3 ml
EDTA 0.5 M 20 ml
Se u ilizó EDTA 0.5M (pH8) p e iamen e es e ilizado en au ocla e. Se ajus ó el
olumen a 1 li o.
TE
T is 1M 2.5 ml
EDTA 0.5 M 0.5 ml
Se u ilizó EDTA 0.5M (pH8) y T is 1 M (pH 8) p e iamen e es e ilizados en
au ocla e. El olumen se ajus ó a 250 ml.
STES (Tampón de ex acción de DNA)
T is- HCl (pH 8) 50mM
NaCl 20 mM
EDTA 1 mM
Anexo I
129
SDS 0.1 %
Denha d ’s 50x
Poli inilpi olidona 1% (p/ )
Ficoll 1% (p/ )
BSA 1% (p/ )
Se es e ilizan con au ocla e los dos p ime os en un pequeño olumen y luego se
añade la disolución de albúmina es e ilizada po il ación has a comple a 500 ml.
Se hacen alícuo as que se man ienen has a su u ilización a -20ºC.
4. Soluciones pa a RNA
MOPS 10x
MOPS 0.2 mM
NaC2H3O2 80 mM
EDTA 10 mM
Pa a la p epa ación de geles desna u alizan es se u ilizó aga osa al 1.5%
(p/ ) en 40.66 ml de agua. Cuando la empe a u a descendió se añadie on 5 ml de
ampón MOPS 10x, 3.34 ml de o maldehido 37% (p/ ) y RedSa e 1x. El ampón de
mues a se p epa ó mezclando 720 μL de o mamida, 160 μL de o maldehído
37% y 180 μL de MOPS 10x. Una ez se p epa a on las mues as, la mezcla se
desna u alizó 15 min a 62ºC y se en ió 1 min en hielo.
5. Soluciones pa a p o eínas
Tampón de ca ga de p o eínas 6x
Glice ol 36% ( / )
Azul de b omo enol 0.012% (p/ )
β-me cap oe anol 5% ( / )
SDS 10% (p/ )
T is-HCl (pH 6.8) 350 mM
Tampón elec oli o 10x
Glicina 0.19 M
T is 0.025 M
SDS 0.1% (p/ )
Anexo I
130
Tampón de ans e encia
Glicina 190 mM
T is 25 mM
Me anol 20% (p/ )
TBS 10x
NaCl 90 g
T is 121 g
El pH se ajus ó a 7.5 y el olumen a 1 li o.
TTBS 1x
TBS 1x
Tween
0.1%
Anexo II
131
Validación del ec o de ansgénesis
In2Fw: Se une al in ón 2 y en sen ido 5’→3’ pe mi e secuencia has a el
in ón 3. Pe mi e iden i ica la diana de EcoRV del agmen o de es icción
de 1.2 kb. Los esul ados ob enidos coinciden con la secuencia eó ica an o
pa a la diana de la enzima de es icción, como pa a el agmen o
secuenciado.
Figu a 1. Resul ado de la secuenciación del ec o de ansgénesis con el cebado
In2Fw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los esul ados
de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.

Anexo II
132
In5Fw: Es e cebado se une al in ón 5 y pe mi e secuencia has a el in ón
7.
Figu a 2. Resul ado de la secuenciación del ec o de ansgénesis con el cebado
In5Fw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los esul ados
de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
LacZFW: Se comp ueba median e análisis de secuencia la p esencia del
agmen o de 2.5 kb, ausen e en la diges ión con la enzima de es icción
SacI. Pa a ello se diseña un cebado , LacZzFw, que pe mi i á con i ma la
in eg idad del ec o de ansgénesis.
Anexo II
133
Figu a 3. Resul ado de la secuenciación del ec o de ansgénesis con el cebado
LazZFw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los
esul ados de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Geno ipado de las células ES mu inas mu an es esis en es a G418
In 1Fw y La 3R : Los cebado es secuencian la egión especí ica de la casse e
ansgénica. El In 1Fw econoce al in ón 1, mien as que La 3R es homólogo
a la secuencia En2SA del ec o . En es a secuenciación se iden i ican el in ón 1,
la egión FRT (azul) y el En2SA ( ojo). Los zona de econocimien o de los
cebado es apa ece sub ayada.
ccacc gag gagg agaca cc a a c a cca aga aag aa a aag gggc cc aaaggcgca aacga accacga a c
aacaag g acaaaaaagcaggc ggcgccggaaccgaag cc a ccgaag cc a c c agaaag a aggaac cgaaccc
cccacaccaccc ccacac gccccaaacac gccaac a g aggaggaagggg gggac aacagaagaacccg g
Figu a 4. Resul ado de la secuenciación de las ES esis en es a G418 con el cebado
In 1Fw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los
esul ados de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Figu a 5. Resul ado de la secuenciación de las ES esis en es a G418 con el cebado
LaR3R . En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los
esul ados de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Anexo II
134
NeoFw: Pe mi e secuencia la egión co espondien e al gen neo del ec o de
ansgénesis.
Figu a 6. Resul ado de la secuenciación de las ES esis en es a G418 con el cebado
NeoFw. En la p ime a línea apa ece los esul ados de la secuenciación y en la segunda la
secuencia eó ica del ec o . Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Ex7Fw e In7R : Los cebado es secuencian la zona lanquean e al si io loxP del
b azo co o de homología. A con inuación se indica la zona ampli icada, donde
en osa se mues a pa e del exón 7 y en ojo el loxP. Sub ayado apa ece la
zona de unión de los cebado es.
ggaa cccca aacccca gg caa gc gg gcca g gg cagc ccc ga caagg cag gca c aacc c gaaagg aa
c caac cccc a ccc aca cccca a c g cag c ccaggcaga agggcaggggg ggggggg cc gag ca gagaa
aa aagaggca ggaaaaaa gca caggaag cc g gaga ggcgcaacgcaa aa ga aac cg a agca aca a acgaa
g a gg c gagc cgcca cag caagagccaaa gccaagggcagggggaggacaacacca caggc
Figu a 7. Resul ado de la secuenciación de las ES esis en es a G418 con el cebado
Ex7Fw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los
esul ados de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Anexo II
135
Figu a 8. Resul ado de la secuenciación de las ES esis en es a G418 con el cebado
In7Fw. En la p ime a línea apa ece la secuencia eó ica espe ada y en la segunda los esul ados
de la secuenciación. Po úl imo, en e ce a posición, la secuencia consenso.
Secuenciación del agmen o co espondien e al alelo m1c
In 1Fw e In 1R : Los cebado es (sub ayados) secuencian la egión donde ha
ac uado la ecombinasa FLP. Se con i ma la secuencia única FRT que esul a
as la acción de la ecombinasa (azul) y el si io loxP ( ojo).
ccacc gag gagg agaca cc a a c a cca aga aag aa a aag gggc cc aaaggcgca aacga accacga a
caacaag g acaaaaaagcaggc ggcgccggaaccgaag cc a ccgaag cc a c c agaaag a aggaac cg c
gaga aac cg a agca aca a acgaag a g cgaga a c agacccagc c g acaaag gg ga a c c a ag cg
cag aggcgg ag c aac cac gcagacgcagaa g gggaacag cagacgga gc g g cca c cg cccca cc cacg
ggaaacacaaagacacacacca gc gga gcac c g ccag g gccggaca cag acg gcaa ga aggagg ggc cg
aaa aaaggac gaaaag cagag cc aaaagagac agagag caga ggcaacc c cgcac gggg ggaag agga c
acagaacc gccaga gg
Figu a 9. Resul ado de la secuenciación del agmen o m1c ampli icado con los
cebado es In 1Fw e In 1R . En la p ime a línea apa ece el esul ado de la secuenciación y en
la segunda la secuencia eó ica espe ada. En e ce a posición, la secuencia consenso.