Generación y caracterización de modelos murinos transgénicos para el análisis de glutaminasas cerebrales

Universidad de Málaga Facultad de Ciencias Departamento de Biología Molecular y Bioquímica GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE GLUTAMINASAS CEREBRALES TESIS DOCTORAL Programa de Doctorado en Biotecnología Avanzada Ana Peñalver Alonso Directores: Javier Márquez Gómez Francisco J. Alonso Carrión Málaga, 2016 AUTOR: Ana Peñalver Alonso http://orcid.org/0000-0002-5799-6780 EDITA: Publicaciones y Divulgación Científica. Universidad de Málaga Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercialSinObraDerivada 4.0 Internacional: http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/legalcode Cualquier parte de esta obra se puede reproducir sin autorización pero con el reconocimiento y atribución de los autores. No se puede hacer uso comercial de la obra y no se puede alterar, transformar o hacer obras derivadas. Esta Tesis Doctoral está depositada en el Repositorio Institucional de la Universidad de Málaga (RIUMA): riuma.uma.es Facultad de Ciencias Departamento de Biología Molecular y Bioquímica MIGUEL ÁNGEL MEDINA TORRES, Director del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga, ACREDITA QUE: la Tesis Doctoral titulada: “GENERACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS PARA EL ANÁLISIS FUNCIONAL DE GLUTAMINASAS CEREBRALES”, que presenta Dña. ANA PEÑALVER ALONSO para optar al título de Doctor en Ciencias, ha sido realizada bajo la dirección de los doctores D. Javier Márquez Gómez, Catedrático de Universidad, y D. Francisco J. Alonso Carrión, Catedrático de Universidad, ambos del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Facultad de Ciencias de la Universidad de Málaga. Y para que así conste a los efectos oportunos, firmo el presente en Málaga a 20 de Junio de 2016. Fdo.: Miguel Ángel Medina Torres JAVIER MÁRQUEZ GÓMEZ, Catedrático de Universidad del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga y FRANCISCO JOSÉ ALONSO CARRIÓN, Catedrático de Universidad del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga, CERTIFICAN que Dña. ANA PEÑALVER ALONSO, Licenciada en Biología por la Universidad Complutense de Madrid, ha realizado bajo nuestra dirección los trabajos recogidos en la presente Memoria para optar al Grado de Doctor en Ciencias por la Universidad de Málaga. Así mismo, el profesor J. Márquez ha sido el tutor de la doctoranda durante toda su etapa predoctoral. Y para que así conste a los efectos oportunos, firman el presente en Málaga a 20 de Junio de 2016. Fdo. Javier Márquez Gómez Fdo. Francisco J. Alonso Carrión Catedrático Bioquímica y Biol. Molecular Catedrático Bioquímica y Biol. Molecular Este trabajo ha sido subvencionado por el proyecto de excelencia CVI-6656 de la Consejería Innovación, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucía, por el proyecto RD12/0028/0013 de la red de trastornos adictivos (RTA, programa RETICS, Instituto de Salud Carlos III) y por el proyecto SAF2015-64501-R del Ministerio de Economía y Competitividad. La Consejería de Innovación, Ciencia y Empresa (Junta de Andalucía) concedió una beca predoctoral del Plan de Formación de Investigadores, de cuatro años de duración (2013-2016), a la investigadora Dña. Ana Peñalver Alonso. Parte de los resultados y metodologías recogidas en la presente Memoria han dado lugar a las siguientes publicaciones y comunicaciones:  PEÑALVER, A., Campos-Sandoval, J.A., Blanco, E., Cardona, C., Castilla, L., Martín-Rufián, M., Estivill-Torrús, G., Sánchez-Varo, R., Alonso, F.J., PérezHernández, M., Colado, M.I., Gutiérrez, A., Rodríguez de Fonseca, F., Márquez, J. maLPA1 receptor knockout mice have strong deficits on brain glutaminase (KGA) and MMP-9 enzymes with altered hippocampal dendritic spine morphology of glutamatergic pyramidal cells (en revisión en Journal of Neurochemistry).  Márquez, J., Campos-Sandoval, J.A., PEÑALVER, A., Matés, J.M., Segura, J.A., Alonso, F.J., Rodríguez de Fonseca, F. Brain glutaminases and drug addiction (en revisión en Neurochemical Research).  Márquez, J., Cardona, C., Martín-Rufián, M., Lobo, C., PEÑALVER, A., CamposSandoval, J.A. Glutaminases in brain: multiple isoforms for many purposes. Neurochemistry International 8:1-5 (2015).  PEÑALVER, A., Tosina, M., Martín-Rufián, M., Campos-Sandoval, J.A., Alonso, F.J., Segura, J.A., Matés, J.M., Ramírez, M.A., Gutiérrez-Adán, A., Márquez, J. Design and generation of a glutaminase GLS2 conditional knockout mice. Transgenic Research 23(5):901-902 (2014).  Márquez, J., Cardona, C., Campos-Sandoval, J.A., PEÑALVER, A., Tosina, M., Matés, J.M., Martín-Rufián, M. Mammalian glutaminase isozymes in brain. Metab. Brain Dis. 28: 133-137 (2013).  PEÑALVER, A., Tosina, M., Martín-Rufián, M., Campos-Sandoval, J.A., Segura, J.A., Matés, J.M., Ramírez, M.A., Alonso, F.J., Gutiérrez-Adán, A., Márquez, J. Design and generation of a glutaminase Gls2 conditional knockout mice. Presentación oral en el Congreso conjunto Red RETICS de Trastornos Adictivos RTA-SENC. Granada (2015).  PEÑALVER, A., Campos-Sandoval, J.A., SánchezVaro, R., Cardona, C., Castilla, L., Blanco, E., Martín-Rufián, M., Segura, J.A., Matés, J.M., Alonso, F.J., Gutiérrez, A., Rodríguez de Fonseca, F., Márquez, J. LPA1 receptor knockout mice show strong deficit on glutamate biosynthetic enzyme glutaminase (GLS, KGA) and altered morphology of hippocampal and cortical dendritic spines. Póster en el Congreso conjunto Red RETICS de Trastornos Adictivos RTA-SENC. Granada (2015).  PEÑALVER, A., Tosina, M., Martín-Rufián, M., Campos-Sandoval, J.A., Alonso, F.J., Segura, J.A., Matés, J.M., Ramírez, M.A., Gutiérrez-Adán, A., Márquez, J. Diseño y generación de dos modelos knock out condicionales de glutaminasa Gls2 y su implicación en procesos de adicción. Presentación oral en el Congreso conjunto Red RETICS de Trastornos Adictivos RTA-SENC. Oviedo (2013). JAVIER MÁRQUEZ GÓMEZ, Catedrático de Universidad del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga y FRANCISCO JOSÉ ALONSO CARRIÓN, Catedrático de Universidad del Departamento de Biología Molecular y Bioquímica de la Universidad de Málaga, AUTORIZAN a Dña. ANA PEÑALVER ALONSO a la lectura y defensa de esta memoria de Tesis Doctoral. Así mismo, los co-directores de la Tesis certifican que todas las publicaciones (y comunicaciones a Congresos) que avalan la presente memoria de Tesis Doctoral no han sido utilizadas en tesis anteriores y han sido generadas, parcial o totalmente, a partir de resultados y metodologías desarrollados durante la realización de la Tesis Doctoral de Dña. Ana Peñalver Alonso. Y para que así conste a los efectos oportunos, firman el presente en Málaga a 20 de Junio de 2016. Fdo. Javier Márquez Gómez Fdo. Francisco J. Alonso Carrión Catedrático Bioquímica y Biol. Molecular Catedrático Bioquímica y Biol. Molecular Tutor y Director de la Tesis Co-director de la Tesis 3. Electroporación de células ES murinas con el vector de transgénesis 46 3.1 Digestión enzimática del DNA plasmídico 46 3.2 Electroporación de las células ES murinas con el vector de transgénesis 47 4. Selección y genotipado de las células ES murinas transgénicas 48 4.1 Selección con geneticina (G418) 48 4.2 Genotipado de las células ES murinas transgénicas 48 5. Microinyección de células ES murinas transgénicas en embriones en estadio de 8 células 55 5.1 Superovulación de ratones Swiss 55 5.2 Obtención de embriones de ratones Swiss 56 5.3 Microinyección de las células ES murinas transgénicas 56 6. Transferencia de los embriones microinyectados con células ES transgénicas a ratones 57 7. Genotipado de ratones 58 8. Análisis de viabilidad de los ratones homocigotos Gls2tm1a/tm1a 59 9. Cruce de la colonia Gls2tm1a/+ generada con animales que expresan la Flp recombinasa 60 10. Cruce de la colonia Gls2tm1c/tm1c con animales que expresan la Cre recombinasa 61 ANÁLISIS FENOTÍPICO MOLECULAR DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS 1. Análisis de los transcritos GA mediante qRT-PCR 62 1.1 Cuantificación de los transcritos GLS2 en animales WT,Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ 62 1.2 Cuantificación del transcrito KGA en animales KOLPA1 63 2. Análisis de expresión proteica por inmunotransferencia Western 64 2.1 Extracción y cuantificación de proteínas 64 2.2 Inmunotransferencia Western 66 3. Análisis de expresión de isoenzimas GA mediante cuantificación de la actividad enzimática 67 4. Inmunohistoquímica de isoformas GA en animales KOLPA1 68 5. Caracterización de la morfología de espinas dendríticas en ratones KOLPA1 69 6. Análisis por zimografía en gel para la determinación de la actividad enzimática 70 6.1 Determinación de la actividad gelatinasa de MMP-2 y MMP-9 70 6.2 Determinación de la actividad proteolítica del activador tisular del plasminógeno 71 Resultados y Discusión PARTE I: GENERACIÓN DE UN MODELO MURINO KO CONDICIONAL PARA Gls2 1. Validación del vector de transgénesis 75 2. Cultivo de las células madre embrionarias murinas 77 3. Electroporación de células ES murinas con el vector de transgénesis 79 4. Selección y genotipado de células ES murinas transgénicas 79 4.1 Genotipado por Long-Range PCR (LRPCR o long-PCR) de células ES murinas transgénicas 81 4.2 Genotipado de las células ES murinas transgénicas mediante transferencia Southern 83 5. Microinyección de células ES murinas transgénicas en embriones en estadio de 8 células 84 6. Genotipado de ratones transgénicos 86 7. Análisis de viabilidad de ratones homocigotos Gls2tm1a/tm1a 87 8. Cruces de la colonia Gls2tm1a/+ generada con animales que expresan la Flp recombinasa 89 9. Análisis fenotípico molecular de los animales heterocigotos Gls2tm1a/+ 92 9.1 Análisis de expresión de isoenzimas GA en animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ mediante qRT-PCR 92 9.2 Análisis de expresión de isoenzimas GA en animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ mediante inmunotransferencias Western 95 9.3 Análisis de expresión de isoenzimas GA en colonias WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ mediante cuantificación de la actividad GA 96 10. Cruce de la colonia Gls2tm1c/tm1c con animales que expresan la Cre recombinasa 99 PARTE II: CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ISOENZIMAS GA EN EL MODELO MURINO KOLPA1 1. Inmunohistoquímica de isoformas GA en animales KOLPA1 100 2. Evaluación de los niveles de proteína KGA mediante inmunotransferencia Western en animales KOLPA1 104 3. Cuantificación del transcrito KGA en regiones cerebrales de animales KOLPA1 105 4. Evaluación de la actividad enzimática glutaminasa en animales KOLPA1 106 5. Caracterización de la morfología de espinas dendríticas en ratones KOLPA1 109 6. Análisis de la expresión de marcadores proteicos de espinas dendríticas 112 7. El silenciamiento génico de LPA1 reduce la expresión y actividad gelatinasa MMP-9, pero no la MMP-2 113 8. Función de las isoenzimas GA en el desarrollo y la diferenciación neuronal 119 Conclusiones 121 Anexos 125 Bibliografía 141 Introducción Introducción 3 1. Análisis funcional de genes con modelos murinos transgénicos La secuenciación del genoma humano ha dado lugar a la generación de nuevas preguntas como cuál es la función que se deriva de cada gen, cuáles son las proteínas que expresan y cómo ejercen sus posibles interacciones. De los más de 20.000 genes humanos identificados hasta la fecha, aún se desconoce la función de aproximadamente dos terceras partes. Para aproximarnos al conocimiento de su función resulta muy útil trabajar con modelos animales. Dado que las especies Homo sapiens y Mus musculus comparten casi el 100% de los genes, y que su organización genómica y mecanismos de expresión están estrechamente relacionados, resulta evidente que los modelos murinos son especialmente idóneos para mimetizar la mayoría de los procesos biológicos (Capecchi, 1994) y para el estudio de la base genética de las enfermedades humanas. En este contexto, la caracterización fenotípica y molecular, empleando técnicas de Genómica Funcional y Proteómica de modelos murinos transgénicos deficientes o knockout (KO) de genes concretos, es una de las principales herramientas que permiten elucidar la función génica. Ya en la década de los 70, Brinster obtuvo el primer ratón quimérico mediante la inyección en blastocistos de células de diferentes cepas, para posteriormente observar su contribución a la formación de los diferentes tejidos del animal durante el desarrollo (Brinster & Tenbroeck, 1969). En 1978, Jaenisch empleó por primera vez la microinyección en blastocistos murinos de vectores retrovirales derivados del virus SV40 (Simian Virus 40) (Jaenisch & Mintz, 1974). Dos años más tarde se acuñó por primera vez el término transgénico, cuando Gordon y Ruddle llevaron a cabo la primera microinyección de DNA en pronúcleos de óvulos fertilizados y comprobaron que dicha modificación se incorporaba a la línea germinal (Gordon et al., 1980). En la actualidad, se entiende por animal transgénico aquel que ha adquirido en su línea germinal un DNA exógeno (sea propio o extraño) y que, por tanto, puede transmitirlo a su progenie. En 1986, Gossler demostró que las células madre embrionarias (ES, embryonic stem cell) podían utilizarse como vehículo de transgénesis, permitiendo además la selección de aquellas que presentaban modificaciones específicas incluso antes de ser microinyectadas en los blastocistos (Gossler et al., 1986). En 1987, Capecchi logró Introducción 4 inactivar el gen de la hipoxantina-guanina-fosforribosil-transferasa (Hprt) empleando recombinación homóloga en células ES murinas (Thomas & Capecchi, 1987; La importancia de los modelos murinos como base para la investigación de la función de genes in vivo y como modelos de enfermedades humanas, queda reflejada en el desarrollo de dos proyectos internacionales que pretenden conseguir en los próximos años una amplia representación de líneas ES murinas, vectores y ratones transgénicos. Uno de estos proyectos es norteamericano, el proyecto KOMP (Knockout Mouse Project), y el otro europeo, proyecto EUCOMM (European Conditional Mouse Mutagenesis). En julio de 2006 se inició el proyecto KOMP, como una iniciativa de los Institutos Nacionales de Salud Americanos (NIH) para generar una colección pública de células ES de la cepa C57BL/6 (la más comúnmente empleada en investigación) y ratones transgénicos con mutaciones nulas (KO) para todos y cada uno de los genes murinos (Skarnes et al., 2011). El programa EUCOMM se inició en 2005 como alternativa complementaria al proyecto KOMP, reuniendo las iniciativas en este campo de diversos países europeos, con la participación de once grandes centros de Genómica Funcional de Alemania, Inglaterra, Francia e Italia. Pretende generar líneas de células ES murinas (cepa 129Sv), conteniendo mutaciones condicionales de al menos 20.000 genes. Una estrategia similar se puso en marcha en Canadá con el nombre de programa NORCOMM (Ringwald et al., 2011). Antes de que fuera posible transferir material génico a las células animales, la función de los genes se estudiaba observando los fenotipos particulares que resultaban al provocar mutaciones aleatorias mediante el empleo de radiaciones o sustancias químicas. Estas técnicas eran poco útiles y poco precisas para genomas diploides y, por ello, se han desarrollado otros métodos como: tecnología antisentido, ribozimas, RNAi, etc. Cuando el objetivo concreto es modificar, reemplazar o destruir secuencias endógenas específicas con DNAs exógenos, se requiere llevar a cabo manipulaciones precisas y se emplean técnicas denominadas de gene targeting. Estas técnicas explotan el principio de la recombinación homóloga. La Introducción 5 recombinación homóloga es un proceso de intercambio génico que ocurre en todas las células y en la que intervienen dos moléculas de DNA con secuencias similares, aunque no necesariamente idénticas. No se requieren secuencias de DNA específicas pero, al menos en células animales, se necesita que éstas sean de gran longitud para que el intercambio génico sea eficiente (los denominados brazos de homología). La frecuencia de recombinación homóloga en células animales es generalmente muy baja, en comparación con la recombinación al azar (de 103 a 105 veces menor); por este motivo se requieren estrategias de selección complicadas para identificar las células que adquirieron el DNA exógeno correctamente (Melton, 2002). Otro mecanismo de recombinación empleado en las técnicas de gene targeting (frecuentemente utilizadas en conjunción con la recombinación homóloga) es la recombinación lugar específica. Los diferentes organismos tienen sistemas propios de recombinación lugar específicos, pero pueden ser exportados a otros sistemas, como por ejemplo células animales, para el control preciso de los transgenes. Los sistemas de recombinación lugar específico más utilizados son: el sistema Cre/loxP y el Flp/FRT. La recombinasa Cre (cyclization recombination), que deriva del bacteriófago P1, escinde cualquier región de DNA localizada entre dos sitios loxP (locus of crossing over in P1). Por su parte, la recombinasa Flp (flipasa) se aisló de Saccharomyces cerevisae, y escinde igualmente el DNA flanqueado entre sus secuencias consenso FRT (Flp recombinase target). Ambas secuencias, loxP y FRT, tienen una tamaño de 34 pb y están formadas por dos repeticiones invertidas de 13 pb flanqueantes y una zona central no palindrómica de 8 pb (Dymecki, 1996; Buchholz et al., 1998). Estas secuencias suelen incorporarse en vectores de reemplazamiento, que explotan la recombinación homóloga, y se sitúan flanqueando exones o secuencias que pueden ser eliminadas de manera específica mediante el aporte exógeno de la recombinasa correspondiente. La utilización de estos vectores en células ES de ratón puede conducir a la obtención de animales transgénicos KO o KO condicionales (Austin et al., 1981; Sternberg & Hamilton, 1981; Kwan, 2002; Hall et al., 2009). Recientemente, se ha implementado una nueva técnica para la obtención de animales transgénicos basada en el uso de proteasas guiadas por RNA; de éstas, la Introducción 6 más ampliamente utilizada es la llamada Clustered Regularly Interpaced Short Palindromic Repeats-Crispr Associated genes 9 o abreviadamente CRISPR-Cas9 (Fig.1). Este método se basa en el sistema inmunitario utilizado por procariotas como mecanismo de defensa frente a virus infectivos exógenos. La técnica CRISPRCas9 aplicada a células ES murinas ha permitido obtener modelos animales de manera más rápida y eficiente que con los sistemas convencionales. (Ran et al., 2013; Humphrey & Kasinski, 2015). Figura 1. Sistema CRISPR-Cas descrito en Streptococcus pyogenes. En caso de infección por virus, el DNA exógeno es fragmentado e incorporado al locus CRISPR en medio de una serie de repeticiones cortas. Este loci se transcribe y procesa para generar RNAs de pequeño tamaño, denominados CRISPR RNA (crRNA), que se utilizan como guía para seleccionar las dianas que serán cortadas por las endonucleasas Cas. Estos crRNA se unen a un RNA parcialmente complementario: el CRIPSR RNA trans-activador (trRNA), cuya función es mantener el complejo crRNA-Cas en la región de reconocimiento. Este sistema se ha adaptado al campo de la biotecnología mediante la generación de RNAs sintéticos (guide RNA, gRNA), constituidos por la secuencia diana, el crRNA, el trRNA y la nucleasa Cas9. Cuando el gRNA se microinyecta en células ES murinas mediará un corte dirigido del DNA, permitiendo la generación de modificaciones precisas (Humphrey & Kasinski, 2015). Introducción 7 2. Glutaminasa de mamíferos: genes y transcritos La glutamina (Gln) es uno de los aminoácidos libres más abundantes en el cuerpo humano, representando hasta un 25% del total de aminoácidos en plasma (Labow & Souba, 2000). Aunque se ha descrito principalmente como aminoácido no esencial, en determinadas situaciones de estrés, ejercicio extenuante, ciertas enfermedades, etc., donde los requerimientos del organismo superan su biosíntesis de novo, puede considerarse un aminoácido condicionalmente esencial (Lacey & Wilmore, 1990). Entre el gran número de funciones que realiza la Gln en mamíferos (Fig.2), destaca su papel como transportador de amonio entre tejidos, reduciendo la toxicidad asociada a esta molécula y favoreciendo la homeostasis del nitrógeno (Souba, 1987). A partir del nitrógeno de su grupo amida se pueden sintetizar moléculas de diferente naturaleza, tales como nucleótidos, aminoácidos, aminoazúcares y proteínas. Su esqueleto carbonado sirve como fuente oxidable para aportar energía a las células en división. En neuronas, no sólo se utiliza como fuente de energía, sino también para la síntesis de neurotransmisores excitatorios e inhibitorios como el glutamato (Glu) y el ácido γ-aminobutírico (GABA), respectivamente (Walls et al., 2014). En hígado, la Gln también es un sustrato del ciclo de la urea, implicada en la homeostasis del amonio y el bicarbonato (Häussinger et al., 1992). Introducción 14 Tabla 1. Genes, transcritos e isoformas GA en humanos. (Adaptado de Márquez et al., 2009) Genes, transcritos e isoformas de GA en humanos KGA GAC GAB LGA Gen GLS GLS GLS2 GLS2 Longitud del transcrito 18 exones 15 exones 18 exones 17 exones Mecanismo transcripcional Ayuste alternativo Ayuste alternativo Canónico Inicio alternativo de la transcripción Regulación transcripcional c-Myc, c-Jun --- p53, TAp63, TAp73 --- Expresión Ubicua en tejidos extrahepáticos de mamíferos y células de cáncer humano Músculo cardiaco, páncreas, placenta, riñón, pulmón y células de cáncer humano Hígado, cerebro, páncreas, sistema inmune y células de cáncer humano Hígado, cerebro, páncreas, sistema inmune y células de cáncer humano Tamaño proteína 669 aa 598 aa 602 aa 565 aa Dependencia de Pi Alta Alta Baja Baja Activación por amonio No No Baja Fuerte Inhibición por glutamato Fuerte --- Moderada No Interacción proteica Caitaxina, BMCC1s --- GIP, SNT, Rac1 --- 2.4 Proteínas que interaccionan con isoenzimas GA Las principales diferencias destacables entre los genes GLS y GLS2 se centran en los exones 1 y 18. Ambos genes comparten un 62% de homología en el exón 1; sin embargo, en el gen GLS codifica 129 aminoácidos y en el GLS2 sólo 61. La importancia de esta diferencia radica en que estas secuencias son las implicadas en los procesos de translocación y envío a destinos subcelulares, además de actuar Introducción 15 como módulos de interacción proteína-proteína (Gómez-Fabre et al., 2000) (Fig. 6). Figura 6. Principales dominios y secuencias consenso (motivos) de las isoformas GA de mamíferos. Se indican las diferencias entre las proteínas codificadas por los genes GLS y GLS2, las cuales se centran principalmente en los exones 1 y 18 donde se localizan las secuencias implicadas en la interacción proteína-proteína y los procesos de translocación subcelular (Adaptado de Márquez et al., 2016). La secuencia codificada por el exón 18 muestra igualmente diferencias entre ambos genes: en GLS2, la región C-terminal, concretamente los cuatro últimos aminoácidos, están implicados en el reconocimiento de dominios PDZ (Fig. 6) (Olalla et al., 2001), denominados así por las tres primeras proteínas donde se identificaron: PSD-95, Drosophila discs large protein y Zona occludens protein 1 (Cho et al., 1992). Estos dominios son motivos proteicos de 80-100 residuos de aminoácidos, muy conservados, que se pueden unir tanto a secuencias consenso (X-Ser/Thr-X-Val) en regiones C-terminal de proteínas diana, como a otras proteínas PDZ (Ponting, 1997). El estudio de la interacción entre proteínas es de especial interés ya que permite comprender su papel funcional, regulación y localización. Las isoenzimas GLS2 poseen la secuencia ESMV requerida en las interacciones con proteínas PDZ, siendo la valina final esencial para el Introducción 16 mantenimiento de la interacción (Olalla et al., 2001). Hasta el momento, se han descrito dos proteínas PDZ que interactúan con la isoforma GAB: la proteína GIP (Glutaminase-Interacting Protein) y la alfa-1-sintrofina (SNT). Cuando se analizó la expresión de GIP (también denominada Taxinteracting protein 1, TIP-1) en cerebro de rata y mono, se pudo observar que estaba presente tanto en el soma de neuronas y astrocitos como en los pies astrocitarios perivasculares. Fue en esta última localización donde se expresaba de forma conjunta con GAB, por lo que se ha propuesto un posible papel del Glu producido por esta isoenzima como vasodilatador, al unirse a su correspondiente receptor de las células endoteliales (Olalla et al., 2008). Asimismo, se han descrito casos en que los dominios PDZ determinan la localización nuclear de las proteínas (Riefler & Firestein, 2001), por lo que no puede descartarse que uno de los mecanismos de importe de GAB al núcleo de neuronas y astrocitos tenga lugar a través de su dominio PDZ y su interacción con GIP. De hecho, GIP también se ha localizado en núcleo celular (Olalla et al., 2008) y se ha demostrado que puede ejercer un papel regulador de la transcripción, en concreto mediante su interacción con β-catenina, proteína implicada en diferentes procesos como migración, proliferación y muerte celular. Esta asociación inhibiría la posterior interacción de β-catenina con el factor de transcripción 4 (TCF-4) en núcleo, necesaria para la activación de los genes Wnt (Wingless/Int) (Kanamori et al., 2003). Igualmente, en el extremo C-terminal de su estructura primaria, GLS2 presenta repeticiones de anquirinas (Márquez et al., 2006), que en otros casos también se han relacionado con el importe nuclear de proteínas (Sachdev et al., 1998). Las sintrofinas, por su parte, son una familia de proteínas periféricas de membrana que abundan particularmente en células gliales cerebrales (Ahn et al., 1996; Adams et al., 2001). Las principales isoformas son α-1, β-1 y β-2, que están codificadas por diferentes genes y se expresan en tejidos como músculo esquelético, corazón y cerebro (Ahn et al., 1996; Gee et al., 1998). El dominio PDZ de SNT puede unirse a la acuoporina 4 (AQP-4) en cerebro (Adams et al., 2001); esta interacción se ha descrito concretamente en los pies atrocitarios perivasculares (Inoue et al., 2002), donde podría actuar regulando la permeabilidad de la membrana (Frigeri et al., 1995). Introducción 17 En cuanto a proteínas que interactúan con las isoformas GLS, se ha demostrado que KGA interacciona con la proteína caitaxina o BNIP-H. Esta proteína, codificada por el gen ATCAY, se expresa en tejido nervioso, siendo especialmente abundante en hipocampo, córtex, cerebelo, núcleos cerebelares profundos y núcleo pontino (Bomar et al., 2003; Buschdorf et al., 2006). La interacción de KGA y caitaxina se lleva a cabo a través del dominio BCH (BNIP-2 and Cdc42GAP Homology) (Low et al.1, 2000; Low et al.2, 2000), regulando de esta manera su distribución espacial en cerebro. En experimentos de co-transfección de KGA y caitaxina en células P12, inducidas a diferenciarse a un fenotipo neuronal por estimulación con el factor de crecimiento nervioso (NGF), se observó una redistribución de KGA hacia los terminales de las neuritas, de manera independiente y separada de cualquier migración mitocondrial. Por consiguiente, la caitaxina parece ser capaz de re-localizar KGA desde el cuerpo celular hacia las neuritas. Aparte de este tráfico neuronal, la caitaxina redujo los niveles de Glu a través de la inhibición de la actividad GA (Buschdorf et al., 2006). En resumen, la interacción KGA-caitaxina parece tener un papel relevante en la regulación de la homeostasis de la síntesis de Glu, esencial para una neurotransmisión correcta y un adecuado desarrollo neuronal. Otro miembro de la familia de proteínas que contienen dominios BCH, capaces de interaccionar con la isoforma KGA, es la proteína BMCC1. Este polipéptido posee distintas isoformas, una de las cuales, BMCC1s, se expresa mayoritariamente en cerebro de ratón y está implicada en la regulación de la dinámica del citoesqueleto y la supervivencia celular (Arama et al., 2012). Un análisis proteómico orientado a buscar proteínas que interactúan con BMCC1s identificó a KGA como una de ellas. Cuando se llevaron a cabo cultivos primarios de neuronas corticales transfectadas con ambas proteínas, se observó que la distribución subcelular de KGA fue dramáticamente alterada: la mitad de las células transfectadas mostraron a KGA no sólo en mitocondria, sino también en el citoplasma (Boulay et al., 2012). Los autores concluyeron que BMCC1s interacciona preferentemente con la forma precursora monomérica de KGA (74 kDa) en citoplasma, impidiendo que alcance la mitocondria y evitando su procesamiento hasta la forma madura catalíticamente activa. Introducción 18 2.5 Glutaminasa en cerebro El Glu es el principal neurotransmisor excitatorio del sistema nervioso central (SNC) (Fonnum, 1984), y aproximadamente el 80-90% de todas las sinapsis cerebrales son glutamatérgicas (Braitenberg & Schüz, 1998; Attwell & Laughlin, 2001). Dicho aminoácido juega además un papel clave en la plasticidad sináptica y en la neurogénesis (Velletri et al., 2013), flujo sanguíneo cerebral (Attwell et al., 2010), metabolismo energético cerebral (Erecinska & Silver, 1990), patogénesis de enfermedades neuropsiquiátricas (Conti & Weinberg, 1999), en la síntesis del neurotransmisor inhibidor GABA (Walls et al., 2014) y en la de muchos otros importantes metabolitos. Dado que el Glu no atraviesa fácilmente la barrera hematoencefálica (BBB) (Hawkins, 2009), debe ser sintetizado en las neuronas a partir de precursores locales, estableciéndose un control preciso entre la neurona presináptica, postsináptica y el astrocito. En estas sinapsis tripartitas (Fig. 7), se establece el denominado ciclo Glu/Gln (Hertz, 1979), por el cual, el exceso de Glu liberado en la hendidura sináptica es capturado por los astrocitos gliales, que mediante la enzima GS, de localización exclusivamente astrocitaria (Martínez-Hernández et al., 1977), se transforma en Gln. Esta Gln es liberada del astrocito y recapturada por las neuronas, donde vuelve a metabolizarse a Glu por la enzima GA. Este ciclo Glu/Gln entre las neuronas y los astrocitos está considerado como una ruta central para el reciclaje de neurotransmisores y para regular la neurotoxicidad intrínseca del Glu (Hertz, 1979; Berl & Clarke, 1983). Como se ha indicado, en la sinapsis tripartita la GA juega un papel imprescindible en la homeostasis glutamatérgica como la fuente más importante de Glu presináptico liberado (Nicklas et al., 1987). A pesar de numerosas investigaciones, el origen del Glu neurotransmisor no ha sido completamente resuelto. Aunque se reconoce a la GA como la fuente principal de Glu, no debe ser la única ruta implicada (Shen et al., 2009). Se ha demostrado síntesis del neurotransmisor Glu mediante transaminación de aminoácidos con αcetoglutarato, componente del ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Waagepetersen et al., 2005). Introducción 19 Figura 7. Esquema la sinapsis tripartita entre neuronas y astrocitos. La Gln liberada por el astrocito es transportada al interior de las neuronas presinápticas vía transportador SLC38A7 (miembro de la familia de transportadores de aminoácidos acoplados a sodio, SNAT). En el interior de la neurona presináptica la GA cataliza el paso de Gln a Glu, que se almacena en las vesículas sinápticas hasta su posterior liberación. En la hendidura sináptica el Glu es recapturado por el astrocito a través de los transportadores dependientes de sodio, EAAT1 y EAAT2, y convertido de nuevo en Gln por la acción de la enzima GS (Adaptado de Márquez et al., 2009). El modelo tradicional de expresión de GA aceptaba que la única isoenzima presente en cerebro, y responsable de la generación del Glu neurotransmisor, era la isoforma KGA (GLS) (Haser et al., 1985; Curthoys & Watford, 1995). Nuestro grupo fue el primero en descubrir la expresión simultánea de transcritos de mRNA para KGA y GLS2 en cerebro humano (Aledo et al., 2000; Gómez-Fabre et al., 2000). Posteriormente, demostramos la coexpresión de mRNA de KGA y GLS2 en cerebro de otras especies de mamíferos como vaca, ratón, conejo y rata (Olalla et al., 2002). Esta coexpresión fue verificada a nivel de proteína por métodos bioquímicos e inmunológicos mediante inmunotransferencias Western revelados con anticuerpos isoenzima-específicos (Olalla et al., 2002). Además de cerebro, también se ha demostrado la coexpresion de ambas isoenzimas en las siguientes Introducción 20 líneas celulares humanas: células de tumor colorrectal (Turner & McGivan, 2003), células de hepatoma HepG2, células de leucemia mieloide KU812F y las células de cáncer de mama MCF7 y ZR75 (Pérez-Gómez et al., 2005). En relación a la proliferación, el papel desempeñado por las diferentes isoenzimas GA en células tumorales parece ser opuesto. Así, los niveles de KGA se encuentran elevados en estados proliferativos, mientras que en estados de quiescencia prevalecen las isoformas GLS2 (Pérez-Gómez et al., 2005). Este comportamiento se ha confirmado en cáncer de hígado y en tumores gliales, que muestran un patrón de expresión elevado de GAC y KGA y no expresan LGA (Szeliga et al., 2005). Experimentos de transfección de células T98G de glioblastoma humano con el cDNA de GAB, permite observar una reversión del fenotipo transformado, caracterizado por una menor migración celular, proliferación y una disminución de la supervivencia (Szeliga et al., 2009). Como consecuencia del papel fundamental que desempeñan las isoformas GA en la biología del cáncer, se han postulado a estas proteínas como dianas terapéuticas para inhibir la reprogramación metabólica que conduce a la carcinogénesis. Para cuestionar aún más el modelo tradicional de expresión de GAs en cerebro, hemos aportado sólidas evidencias experimentales de una segregación subcelular de GA en neuronas, la isoenzima KGA está presente en mitocondrias, mientras que la GA GLS2 se localiza en núcleo (Olalla et al., 2002). La localización nuclear de la GA GLS2 (GAB y/o LGA) fue completamente inesperada, cambiando drásticamente el paradigma de expresión aceptado de GA en mamíferos, siendo la primera vez que se describía una localización extramitocondrial para una GA. La visión de la GA como una proteína monofuncional, con un papel relevante pero exclusivamente catalítico, parece no responder a su auténtica potencialidad funcional. Este hecho viene apoyado también por la descripción ya comentada de las isoformas GLS2 con proteínas PDZ. Respecto a la localización nuclear, también conviene señalar que el análisis bioinformático de las proteínas GLS2 reveló la existencia de un dominio de dedos de Zn, concretamente del tipo Cys2His2, característico de muchos factores de transcripción (Fig. 6), dejando abierta la posibilidad de que estas isoenzimas funcionen directamente como un factor de transcripción. Además, aún cuando estas proteínas no poseen secuencias Introducción 21 específicas de localización nuclear, sí poseen un motivo LXXLL que constituye una secuencia de interacción con receptores nucleares (Fig. 6). Concretamente, la isoforma GAB posee este motivo consenso en los aminoácidos 72-76 (LGDLL). Un caso similar es el de la enzima mitocondrial 3-hidroxi-3-metilglutarilCoA sintasa (EC 4.1.3.5), que se ha detectado en el núcleo, y cuya translocación implica la interacción con un receptor hormonal nuclear a través de un motivo LXXLL presente en la enzima (Meertens et al., 1998). La regulación de la transcripción génica a través de receptores nucleares requiere la participación de correpresores y coactivadores, de esta forma GAB podría formar parte de un complejo transcripcional, actuando como corregulador. La participación de GLS2 en núcleo podría ser, no obstante, indirecta, al actuar regulando los niveles de Gln/Glu en el nucleoplasma. Hoy en día, se acepta que los aminoácidos juegan un papel importante, junto con las hormonas, en el control de la expresión génica; aunque, los mecanismos moleculares implicados son todavía poco conocidos. En concreto, la Gln induce la expresión de proteínas HSP (heat shock proteins), tanto a nivel de mRNA como de proteína (Sanders & Kon, 1992), y reprime la expresión de GS. De esta forma, la importancia de la localización nuclear de GAB radicaría en el control in situ de los niveles de Gln/Glu, cuyas fluctuaciones inciden en la regulación de la expresión génica. Se ha identificado también la presencia de GA en astrocitos (Márquez et al., 2016). Experimentos inmunohistoquímicos realizados en tejidos de cerebro humano y rata, con anticuerpos isoforma específicos, han puesto de manifiesto la expresión de isoenzimas GLS (KGA) y GLS2 (GAB/LGA) en neuronas y astrocitos, aunque mostrando diferentes localizaciones subcelulares: mitocondrial para la KGA y nuclear y mitocondrial para GLS2 (Márquez et al., 2016). La expresión de GA en astrocitos también se ha demostrado a nivel de mRNA y se ha probado la existencia de actividad enzimática en ciertas poblaciones astrocitarias (Cardona et al., 2015). La presencia de GA con actividad catalítica en astrocitos es relevante para la estequiometría del ciclo Glu/Gln en la sinapsis, lo que sugiere la posibilidad de nuevas funciones para las distintas isoformas GA. Las nuevas localizaciones subcelulares descubiertas en cerebro para las isoformas GA sugieren nuevas funciones para la isoenzima GLS2 no relacionadas Introducción 22 con la neurotransmisión, sino con la regulación transcripcional y la diferenciación celular (Campos-Sandoval et al., 2015). El hecho de que en cerebro se expresen cuatro isoenzimas diferentes codificadas por dos genes distintos aún no ha sido explicado. No se conoce la contribución de cada isoenzima al pool de Glu neurotransmisor, así como el papel de alguna de estas isoenzimas, particularmente las GLS2, en funciones diferentes a las meramente catalíticas. Para aclarar estos aspectos, en este trabajo decidimos generar un modelo animal transgénico deficiente en el gen Gls2 que nos permita arrojar luz sobre algunas de estas cuestiones, profundizando así en la función cerebral de las isoenzimas GA. 2.6 Neurotransmisión glutamatérgica en la adicción a drogas Evidencias experimentales obtenidas desde 1970 han generado un consenso en el campo científico de la adicción a drogas de abuso, que señalan a la dopamina (DA) como neurotransmisor clave en sus efectos adictivos (Lüscher, 2016). De esta forma, la hipótesis dopaminérgica en el mecanismo de la adicción establece que las drogas ejercen una fuerte estimulación de dicho neurotransmisor en la ruta mesocorticolímbica (Di Chiara & Imperato, 1988), un rasgo generalizado y definitivo de todas las drogas adictivas, dando cuenta de los agudos efectos reforzadores que ejercen. No obstante, esta hipótesis no es capaz de explicar los efectos a largo plazo y las alteraciones comportamentales, como el ansia por la droga (craving) y la recaída, que aparecen cuando la droga ya se ha eliminado del organismo y los niveles de DA vuelven a los valores normales. Por este motivo, se ha sugerido que el consumo de drogas conlleva una serie de neuroadaptaciones en diferentes áreas cerebrales que desempeñan un papel causal en el comportamiento patológico de los pacientes adictivos (Lüthi & Lüscher, 2014). Aunque muchos tipos de sinapsis pueden ser modificadas por el consumo de drogas, el foco se ha centrado sobre la transmisión glutamatérgica que ejerce un papel importante en la plasticidad sináptica (Lüscher, 2013). Resultados de estudios preclínicos con modelos animales de adicción sentaron las bases de la denominada hipótesis del Glu en la adicción, que propone la existencia de cambios en la neuroplasticidad inducidos por un desequilibrio entre el Glu sináptico y el nosináptico en los circuitos entre la corteza prefrontal (PFC), el núcleo accumbens Introducción 23 (NAc) y el área tegmental ventral (VTA), lo que provoca una menor capacidad para inhibir el comportamiento de búsqueda de la droga y una mayor vulnerabilidad a la recaída (Kalivas, 2009; Steketee & Kalivas, 2011; Palomino et al., 2014). De entre las modificaciones glutamatérgicas, cabe destacar el papel de los receptores metabotrópicos de Glu (mGluR) y las proteínas Homer en los astrocitos del NAc (Fig. 8) (Ronesi & Huber, 2008). Las proteínas Homer actúan como un componente integral del complejo de señalización intracelular de los mGluR, mediando la liberación de calcio endoplasmático a través de la unión a receptores inositol trifosfato (IP3Rs) (Yamamoto et al., 2006). El astrocito utiliza este incremento del calcio intracelular para la liberación de Glu mediante el intercambiador estequiométrico de cistina-Glu (sistema Xc-) (Malarkey & Parpura, 2008). Se ha demostrado que la administración crónica de cocaína disminuye la expresión de las proteínas Homer y del transportador Xcen el NAc, lo que provoca una menor liberación de Glu desde el astrocito. Los bajos niveles de Glu extracelular conllevan un bajo tono de los autoreceptores mGluR2/3 presinápticos, que tras la exposición repetida a drogas como cocaína, experimentan modificaciones en su estado de fosforilación, reduciendo el tono inhibidor que ejercen sobre la liberación presináptica de Glu (Xi et al., 2000; Kalivas, 2004) (Fig. 8). Además, el incremento de Glu liberado en la hendidura sináptica tampoco se elimina eficientemente, puesto que el transportador GLT-1 astrocitario también está infra-expresado en el NAc tras la exposición crónica a cocaína, nicotina, etanol y heroína (Scofield & Kalivas, 2014). Introducción 30 locomoción condicionada y la sensibilización comportamental. La locomoción condicionada se define como el aumento en la locomoción basal en un contexto asociado a la administración de drogas. La sensibilización comportamental consiste en el progresivo aumento de la respuesta conductual como resultado de la administración repetida de la droga. Las bases anatómicas que subyacen ambos procesos son diferentes; así, la transmisión dopaminérgica en ganglios basales está implicada en la sensibilización comportamental, mientras que la locomoción condicionada está regulada por la transmisión glutamatérgica en el hipocampo (Pierce & Kalivas, 1997; Tzschentke & Schmidt, 2003; Mohn et al., 2004). Estos parámetros se evaluaron en el modelo KO maLPA1 y se observó que la locomoción condicionada era menor en los animales KO que en los WT, como consecuencia del déficit de memoria contextual que presentaban. La transmisión glutamatérgica en hipocampo dorsal estaba alterada, con una expresión reducida del receptor metabotrópico mGlu3 y la subunidad GLUR3 de los receptores AMPA (Blanco et al2., 2012). Por el contrario, ni la sensibilización comportamental, ni la transmisión dopaminérgica se vieron alteradas respecto a los animales WT. Los autores concluyeron que LPA1 podría actuar como un modulador de la respuesta condicionada por su papel en la regulación de la transmisión glutamatérgica (Blanco et al2., 2012). 3.5 Modelo transgénico murino KO maLPA1 y neurogénesis El receptor LPA1 tiene un papel muy importante en la plasticidad sináptica por su efecto directo en los cambios morfológicos y funcionales de las espinas dendríticas. Mediante transfecciones de construcciones LPA1-GFP en neuronas hipocampales se ha observado la presencia de este receptor en células piramidales de la región CA1, concretamente en dendritas apicales y una localización punteada característica de espinas dendríticas (Pipel et al, 2006). En mamíferos, el cerebro presenta dos regiones donde la neurogénesis se mantiene activa durante la edad adulta: la zona subventricular y la zona subgranular del giro dentado (DG) del hipocampo (Álvarez-Buylla & Lim, 2004). Es en esta segunda zona donde los ratones KO maLPA1 tienen una menor neurogénesis y menor arborización dendrítica (Matas-Rico et al., 2008). La Introducción 31 neurogénesis hipocampal adulta está en estrecha relación con la vasculogénesis (Palmer et al., 2000) y con factores tróficos como el BDNF (factor neurotrófico derivado de cerebro) y el factor de crecimiento insulínico tipo 1 (IGF-1) (Waterhouse et al., 2012). Aunque no se han visto modificaciones en los vasos sanguíneos del DG de animales KO maLPA1, sí hay variaciones en los niveles de los factores tróficos, concretamente tras una exposición a ejercicio (proceso que incentiva la neurogénesis adulta), los niveles de BDNF disminuyen y aumentan los de IGF-1 en comparación con los animales WT (Matas-Rico et al., 2008). Estos animales también tienen una expresión disminuida de GAP43 en la corteza (Estivill-Torrús et al., 2008). Dicha proteína se expresa durante el desarrollo y está implicada en la guía axonal, la liberación de neurotransmisores y la plasticidad sináptica (Jacobson et al., 1986). En el modelo KOLPA1 desarrollado por Harrison et al. (2003) se han descrito alteraciones neuroquímicas en el sistema serotoninérgico de diferentes áreas cerebrales (PFC, hipocampo, hipotálamo y NAc) y una reducción en la expresión de diversos aminoácidos en el hipocampo. Estas características son comunes a las existentes en modelos de esquizofrenia humanos, que presentan alteraciones en las sinapsis glutamatérgicas y disminución en el número de espinas dendríticas (Hayashi-Takagi et al., 2010). Objetivos Objetivos 35 De acuerdo con los antecedentes expuestos en la introducción, es patente que aún quedan un gran número de cuestiones de calado por descubrir en relación con la función cerebral de las distintas isoenzimas GA; entre ellas, la contribución de cada isoforma al acervo de Glu neurotransmisor, el papel trófico de las GAs en el desarrollo y diferenciación neuronal, la función nuclear de GLS2 en neuronas y astrocitos, el significado fisiológico de sus interacciones con proteínas PDZ y BCH, su implicación en la regulación vascular de vasos sanguíneos y arteriolas y, finalmente, su desregulación en desórdenes neurológicos y enfermedades neurodegenerativas. Todos estos interrogantes hacen patente que la generación y caracterización de modelos animales transgénicos con expresión alterada de isoenzimas GA es una herramienta fundamental para elucidar la función cerebral de estas isoenzimas. A la vista de estos antecedentes, nos planteamos los siguientes objetivos en esta Memoria: Generación de un modelo murino transgénico nulo condicional para el gen Gls2. Caracterización de alteraciones en las sinapsis glutamatérgicas en ratones knockout para el receptor LPA1 del ácido lisofosfatídico. Materiales y Métodos Materiales y Métodos 38 MATERIALES 1. Vector de transgénesis Con el fin de silenciar el gen Gls2, en la elaboración de este trabajo se empleó un vector de transgénesis de reemplazamiento adquirido del International Mouse Phenotyping Consortium (IMPC; EUCOMM). En la Fig. 1 se representan sus principales características. El vector está diseñado sobre el plásmido pBR322 e incorpora dos brazos de homología. El brazo largo, de 5.3 kb, está constituido por el exón 1 y un segmento del intrón 1 del gen Gls2 murino; el brazo corto, por el espacio génico comprendido por los exones del 2 al 12 (3.9 kb). Los sitios loxP flanquean el fragmento del gen a eliminar, correspondiente a los exones del 2 al 7, (floxed sequence), por lo que al actuar la recombinasa Cre se escindirá el fragmento, generándose el KO correspondiente. Este plásmido permite llevar a cabo la selección de las bacterias que lo han incorporado, ya que posee un gen de resistencia a ampicilina y otro a blasticidina. La integración del vector resultante de la electroporación de las células ES murinas se selecciona mediante un gen de resistencia a geneticina (gen neor), por su parte, los eventos de recombinación homóloga se discriminarán de los de recombinación ilegítima gracias a la expresión de un gen de la toxina de la difteria codificado por el gen DTA. Los sitios FRT, que flanquean la cassette Neo, son lugares de reconocimiento para la recombinasa Flp. Cuando esta recombinasa se exprese permitirá la escisión de la cassette Neo. Materiales y Métodos 39 Figura 1. Representación esquemática de las principales características del vector de transgénesis. Se muestran las principales características del vector: en amarillo los exones del gen Gls2; los sitios de reconocimiento de la recombinasa Flp en verde (FRT); el En2SA (Engrailed-2 splice acceptor) aparece como un rectángulo blanco, seguido del sitio de reconocimiento interno ribosómico (IRES), el gen lacZ (en azul), y la señal de poliadenilación SV40 (pA); los sitios de reconocimiento de la recombinasa Cre (loxP) están representados por triángulos rojos; en morado el promotor de β-actina humano, y el gen de resistencia a neomicina (neor). En la parte inferior del vector, en blanco aparecen los genes de resistencia a blasticidina y ampicilina, para la selección en bacterias; y en rosa el gen de la toxina de la difteria (DTA) con su respectivo promotor y secuencia pA (Adaptado de la información suministrada por el Consorcio IMPC). El vector de transgénesis sigue una estrategia denominada ‘knockout first allele’ (Skarnes et al., 2011) ya que al integrarse en el gen correspondiente generará un alelo KO (denominado tm1a), como consecuencia de la presencia de una trampa génica que conlleva la interrupción del proceso de transcripción (Fig.2). La trampa génica está constituida por una secuencia En2SA-IRES-LacZ-pA, que provoca la terminación prematura del proceso de transcripción por la presencia tanto de un aceptor de ayuste en la zona 3’ (En2SA), como de una secuencia de poliadenilación (pA). El resultado de este proceso es una proteína de fusión constituida por el exón 1 del gen Gls2 y la ß-galactosidasa. Una de las ventajas que presenta este sistema, además de poder obtener un alelo KO de forma directa al integrarse el vector en el genoma, es que permite estudiar el patrón de expresión de nuestro gen, ya que el gen lacZ se encuentra bajo el control de su mismo promotor. De forma resumida, los pasos que habría que llevar a cabo cuando se utilicen vectores de transgénesis de este tipo implican que, tras la inserción del Materiales y Métodos 46 2.2 Cultivo de células ES murinas Dado que las células ES presentan una tasa de división elevada, es importante realizar subcultivos periódicamente evitando que alcancen la confluencia, ya que el contacto entre ellas podría llevar a su diferenciación y con ello a la pérdida de su pluripotencia. Se partió de un stock congelado a -80ºC, por lo que se descongeló a 37ºC y se diluyó en 9 ml de medio de cultivo EF. A continuación, se centrifugó a 1.500 rpm (Hettich Rotofix 32A, rotor 1619) durante 5 min. Más tarde, el precipitado de células se resuspendió en 2 ml de medio de cultivo de ES (Anexo I), hasta conseguir una suspensión unicelular, y se depositaron sobre los MEF inactivados en una placa P35. Las células se incuban a 37ºC en una atmósfera al 5% de CO2 cambiándose el medio diariamente. No es conveniente mantener los cultivos de células ES durante un periodo de tiempo prolongado, por lo que los experimentos se programaron para realizar el mínimo número de pases. 3. Electroporación de células ES murinas con el vector de transgénesis 3.1 Digestión enzimática del DNA plasmídico Antes de la electroporación de las células ES es necesario hacer lineal el vector de transgénesis, mediante digestión enzimática, seleccionando una endonucleasa de restricción que genere un corte único fuera de la zona de homología del vector. Se utilizaron la enzima AsiSI (SfaAI, ThermoFisher) y aproximadamente unos 20 μg de DNA plasmídico. Como en casos anteriores, la reacción se llevó a cabo en el tampón recomendado por la casa comercial, el tampón Tango, a 37ºC. La digestión fue analizada por electroforesis en geles de agarosa al 0.6 % (p/v). A continuación, se llevó a cabo una extracción con fenol-cloroformo (fenol pH8, P4557, Sigma) y se precipitó el DNA con etanol. Para ello, se añadió un volumen de fenol-cloroformo y se agitó en vórtex hasta obtener una sola fase. Se Materiales y Métodos 47 centrifugó a 14.000 rpm (Hettich Universal 320R, rotor 1420) durante 5 min y se recogió la fase superior. Se añadió un volumen de cloroformo, se mezcló y se centrifugó a 14.000 rpm durante 1 min. Posteriormente, el DNA se precipitó con dos volúmenes de etanol 100% y acetato potásico (pH 5.2) a una concentración final de 0.3 M, se agitó por inversión y se dejó a -20ºC al menos 1h. Después se centrifugó a 4ºC durante 40 min a 14.000 rpm y se lavó dos veces con etanol al 70% (14.000 rpm durante 10 min). El precipitado se resuspendió en el medio de electroporación (Gene Pulser Electroporation Buffer, Bio-rad) 3.2 Electroporación de las células ES murinas con el vector de transgénesis Para llevar a cabo la electroporación se partió de células ES en fase de crecimiento exponencial tardía, a las que se les había refrescado el medio unas 3 h antes. Las células se centrifugaron a 300 g (IEC HN-S Centrifuge, rotor 815) durante 6 min, se lavaron con PBS y se centrifugaron de nuevo en las mismas condiciones. Tras eliminar el sobrenadante se resupendieron en 750 μl del medio específico para la electroporación y se añadió el vector de transgénesis lineal. La mezcla se añadió a la cubeta (MicroPulser Electroporation Cuvettes, BioRad) evitando la formación de burbujas. Para la electroporación (Gene Pulser Xcell Electroporation System, Bio-Rad) se emplearon las siguientes condiciones: un pulso de 300 V durante 500 μs a temperatura ambiente (RT). Posteriormente, la mezcla se dejó 5 min a RT antes de pasar las células a 5 placas P35 (en las que previamente se habían dispuesto fibroblastos inactivados). Las placas, se incubaron a 37º C y 5% de CO2. Como control negativo se utilizaron células ES a las que no se les adicionó el vector de transgénesis, pero que se trataron bajo las mismas condiciones indicadas anteriormente. Materiales y Métodos 48 4. Selección y genotipado de las células ES murinas transgénicas 4.1 Selección con geneticina (G418) Tras 24 h desde la electroporación (tiempo suficiente para que la incorporación y transcripción del vector se haya llevado a cabo), se cambió el medio de cultivo a las células ES por medio fresco con G418 (A1720, Sigma) a 150 μg/ml. La adición de este antibiótico permite eliminar las células que no hayan incorporado la cassette transgénica. El proceso de selección se prolongó durante 8 días, momento en el que no se observaron células ES en las placas control. Las células que sobrevivieron al proceso de selección se sometieron a un posterior análisis por PCR. Para ello, dichas células se picaron con una punta de pipeta P20 y se transfirieron a placas de 96 pocillos (P96). Se adicionaron 50 μl de tripsina, la cual se dejó actuar 2 min aproximadamente y se inactivó con 50 μl de medio ES fresco, tras lo cual se resuspendieron hasta conseguir una suspensión unicelular. Los 100 μl de la mezcla anterior se transfirieron a nuevas placas P96 con MEF inactivados. Finalmente se añadió medio hasta 200 μl y se incubó a 37º C y 5% CO2. Tras 3-4 días (cambiando el medio diariamente) las células ES están aproximadamente al 80 % de confluencia y se pueden congelar y analizar su DNA. Para ello, se lavaron con 200 μl de PBS, se añadieron 30 μl de tripsina y posteriormente se adicionaron 70 μl de medio ES. De cada pocillo se tomaron 50 μl y se depositaron en una placa mutipocillo P24 tratadas con MEF inactivados (se completó hasta 1 ml de medio ES) para su posterior análisis por PCR. Los 50 μl restantes se congelaron a -80ºC en medio de congelación (medio ES con FBS al 50% y DMSO al 10%). 4.2 Genotipado de las células ES murinas transgénicas 4.2.1 Extracción del DNA de las células ES murinas transgénicas Cuando las células crecieron lo suficiente se recolectaron de forma equivalente a la descrita en los apartados anteriores. Se descartó el sobrenadante y se lavó el precipitado dos veces con PBS. Posteriormente, las células se resuspendieron en 100 μl de tampón de digestión (50 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS) y proteinasa K (Roche), a una concentración final de Materiales y Métodos 49 100 μg/ml, tras lo cual se incubaron a 55ºC durante 1 h. A continuación, se realizó una extracción con fenol-cloroformo, seguida de una precipitación con etanol y acetato potásico, tal como se ha descrito en apartados anteriores. Finalmente, el precipitado se resuspendió en 50 μl de tampón TE (Anexo I). 4.2.2 Genotipado por PCR de las células ES murinas transgénicas Las reacciones de PCR se llevaron a cabo utilizando la enzima GoTaq Flexi DNA Polymerase (Promega) con el buffer 5x Colorless GoTaq Flexi Buffer y 25mM MgCl2. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de mezcla de 25 μl, conteniendo: 2 mM MgCl2, mezcla de los cuatro desoxinucleótidos trifosfato (stock dNTPs a 100 mM, Roche) 0.1 mM, cebadores a 0.4 μM y 0.7 U de la enzima Taq polimerasa. En la Tabla 2 se indican las secuencias de los cebadores utilizados para la PCR. El cebador Int1-Fw aparea con una secuencia específica del intrón 1 de Gls2, mientras que LaR3Rv aparea específicamente con la cassette transgénica, por lo que el amplicón de 270 pb sólo se amplificará en las células que hayan incorporado la cassette. De forma análoga, los cebadores que amplifican el gen neor reconocen la secuencia específica de este gen, generando un amplicón de 492 pb. Ambos fragmentos se purificaron de geles de agarosa mediante el kit Ilustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Helthcare) y se secuenciaron (Anexo II). Tabla 2. Nombre y secuencia de los cebadores utilizados para el genotipado por PCR de las células ES murinas transgénicas. Cebadores Secuencia 5’-3’ Int1-Fw TCCACCTGAGTGAGGTAGACATCC LaR3-Rv CAACGGGTTCTTCTGTTAGTCC Neo-FW GGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGC Neo-Rv AAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCG Como control negativo de la reacción se utilizó DNA de ratón WT, agua como control de contaminación y el propio vector de transgénesis como control positivo. Materiales y Métodos 50 La reacción se llevó a cabo en un termociclador de Bio-Rad (MyCycler, thermal cycler) bajo las siguientes condiciones: - Para la amplificación con la pareja de cebadores Int1-Fw y LaR3-Rv: 94 ºC durante 5 min, seguido de 30 ciclos con el siguiente programa: 94ºC 50 s, 63ºC 30 s y 72ºC durante 1 min. Se adicionó un ciclo final de extensión de 10 min a 72 ºC. - Para la amplificación con la pareja de cebadores Neo-Fw y Neo-Rv: 94 ºC durante 3 min, seguido de 35 ciclos con el siguiente programa: 94ºC 15 s, 65ºC 20 s y 72ºC durante 1 min. Se adicionó un ciclo final de extensión de 5 min a 72 ºC. Siguiendo las recomendaciones del consorcio IMPC, y antes de realizar la long range PCR (LRPCR) y el Southern blot, que permiten confirmar que la recombinación entre el vector de transgénesis y el genoma de las ES murinas fue homóloga, se llevó a cabo una PCR para confirmar la presencia del sitio loxP situado en la región 3’, y con ello demostrar la completa integración del vector. Para ello, se utilizaron los cebadores indicados en la Tabla 3 y el siguiente programa de amplificación: 94 ºC durante 3 min, 35 ciclos de: 94ºC 15 s, 63ºC 20 s y 72ºC durante 1 min. Se adicionó un ciclo final de extensión de 5 min a 72 ºC. Tabla 3. Nombre y secuencia de los cebadores utilizados para el genotipado por PCR de la región 3’ loxP de las células ES murinas transgénicas. Cebadores loxP Secuencia 5’-3’ Ex7-FW CTGGTGCCATTGTGGTCAGC In7-RV GCCTGATGGTGTTGTCCTC El cebador Ex7-Fw aparea con una secuencia del exón 7 y el In7-Rv lo hace en el intrón 7, entre los cuales se sitúa la secuencia loxP, amplificándose un fragmento de 318 pb. La banda se purificó del gel de agarosa con el kit Ilustra GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Helthcare) y se envió a secuenciar para asegurar la presencia del sitio loxP (véase Anexo II). Materiales y Métodos 51 4.2.3 Genotipado por Long Range PCR (LRPCR) de las células ES murinas transgénicas Se realizó un genotipado mediante análisis por LRPCR para asegurar que la recombinación entre el vector de transgénesis y el genoma de la célula ES fue homóloga. Para la realización de la LRPCR se utilizó el kit Expand Long Template PCR System (Roche). Éste contiene una mezcla enzimática de Taq DNA polimerasa y Tgo DNA polimerasa, una polimerasa termoestable con actividad correctora. Esta mezcla de polimerasas permiten amplificar hasta 20 kb de DNA genómico con alto rendimiento. La reacción se llevó a cabo en un volumen final de 25 μl, dejando el tampón a una concentración final de 1x (stock a 10x con 17.5 mM de MgCl2), empleando: mezcla de desoxinucleótidos trifosfato 0.35 mM, cebadores 0.3 μM y 2 U de Taq DNA polimerasa. El ciclo utilizado para la LRPCR es ligeramente distinto al de una PCR de secuencias de menor tamaño. La temperatura de hibridación se suele fijar entre los 55 y 60ºC, independientemente de la Tm de los cebadores y la temperatura de extensión se fija en 68ºC, por debajo de los 72ºC normalmente utilizados en una PCR convencional. El programa de amplificación utilizado fue: 93º durante 3 min, 10 ciclos de: 94ºC 10 s, 63ºC 30 s y 68ºC durante 5 min, seguido de 25 ciclos de: 94ºC 10 s, 60ºC 30 s y 68ºC durante 5 min (20 s extra por ciclo). Se adicionó un ciclo final de extensión de 5 min a 68 ºC. Tabla 4. Nombre y secuencia de los cebadores utilizados para la LRPCR de las colonias ES murinas transgénicas. Cebadores Secuencia 5’-3’ LRPCR-Fw AGTGCTGTGAGGGCTGAGGTCAGGTGAGTGAAAG LRPCR-Rv TGTGGAGGGTGGTGTGGGAAAGGGTTCGAAGTTC Materiales y Métodos 52 4.2.4 Genotipado de las células ES murinas transgénicas mediante transferencia Southern Se realizó un análisis por transferencia Southern de las células ES transgénicas para confirmar que el proceso de recombinación fue homólogo. Para ello se llevo a cabo una extracción de DNA con fenol/cloroformo, tal y como se ha descrito en apartados anteriores. Una vez confirmada la integridad de dicho DNA por electroforesis en geles de agarosa al 0.6% (p/v), se procedió a la digestión enzimática del DNA con la enzima BstEII (Thermo Fisher Scientific). Esta enzima realiza un corte en la región 5’ flanqueante del gen Gls2, anterior a la zona de homología específica del vector, y otro corte en la cassette transgénica, concretamente en el exón 2 (véase Anexo II para un mayor detalle de la estrategia seguida). Para la digestión se utilizaron aproximadamente 15 μg de DNA que se llevaron a un volumen final de 200 μl en agua. Se añadió el volumen apropiado de tampón de la enzima de restricción (concentración final 1x) y la mezcla se agitó varios minutos a 4ºC, dejando incubar 1 h. Posteriormente se añadieron 20 U de enzima y se dejó a 4ºC varios minutos. Seguidamente, la muestra se incubó a 37ºC durante media hora, tras lo cual se añadieron 20 U de enzima adicionales. La mezcla de digestión se dejó durante 16 horas a 37ºC. A la mañana siguiente se comprobó en un gel de agarosa que la digestión enzimática del DNA genómico se hubiera completado en su totalidad, tras lo cual, se procedió a precipitar la muestra con acetato sódico 0,3 M (pH 5.2) y dos volúmenes de etanol absoluto. Después de lavar con etanol 70%, la muestra se secó al aire durante 10 min y se resuspendió en 30 μl de agua, dejándose a 4ºC O/N. La electroforesis de DNA se realizó en geles de agarosa al 0,7% (p/v) en una cama de 20 cm de longitud en tampón TBE 0.5x (Anexo I), con 7.5 μl de GelRed. Como patrón de masa molecular se utilizó el digerido de DNA del fago lambda con la enzima HindIII. La electroforesis se llevó a cabo a 15 V durante la primera media hora, seguido de 30 V durante 2 días a 4ºC, hasta que se obtuvo la separación necesaria entre las bandas para resolver los fragmentos. Materiales y Métodos 53 4.2.4.a Tratamiento del gel de agarosa y transferencia a membranas de nylon Antes de llevar a cabo la transferencia, el gel de agarosa se sumergió durante 10 min en una solución de 0.25 M HCl. A continuación, se sumergió en solución desnaturalizante (1.5 M NaCl y 0.5 M NaOH) durante 40 min, con un cambio de medio, y, finalmente, se neutralizó en 1.5 M NaCl y 0.5 M Tris base (pH 8) durante 40 minutos, cambiando el medio a los 20 min. La transferencia se llevó a cabo por capilaridad durante 16 h empleando membranas de nylon (Hybond+, GE Healthcare), siguiendo el protocolo descrito por Davies et al. (1986) y Ausubel et al. (1989). Como tampón se empleó SSC 20x (3 M NaCl y 0.3 M citrato sódico, pH 7). Posteriormente las membranas se lavaron con tampón SSC 2x, se secaron y el DNA se fijó por la acción de luz UV (UVC 500 Crosslinker, Amersham Bioscience). 4.2.4.b Obtención de la sonda de hibridación La sonda de DNA utilizada en los experimentos de Southern blot se obtuvo mediante amplificación por PCR, para lo que se utilizaron los cebadores (Tabla 5) y ciclos indicados a continuación. La sonda permite diferenciar entre el alelo WT y el alelo tm1a, de manera que en las células ES WT hibridará con un fragmento de 9 kb y en las células ES que hayan incorporado la cassette transgénica de 16 kb. Tabla 5. Nombre y secuencia de los cebadores empleados y utilizados para la síntesis de la sonda de hibridación empleada en el genotipado mediante transferencia Southern. Cebadores Secuencia 5’-3’ BstE-Fw CTCAGCCACTCTGGAGACTTCGGC BstE-Rv GCTATGAGATAGTCATGGGAGCTGTC El programa utilizado para la pareja de cebadores BstEII fue: 94ºC 3 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC 15 s, 65ºC 20 s y 1 min a 72ºC y un último ciclo de 72ºC 5 min. El tamaño del fragmento amplificado fue de 702 pb. La DNA polimerasa empleada para generar por PCR la sonda de hibridación fue la enzima Advantage 2 Polymerase Mix (Clontech), que introduce una adenina Materiales y Métodos 54 en el extremo 3’ amplificado, lo que facilita la posterior subclonación en el plásmido pGEMT (pGEM-T Easy Vector, Promega), para lo que se siguió el protocolo recomendado por el fabricante. Esto permitió obtener y purificar nueva sonda sin necesidad de preparaciones de DNA genómico, evitando posibles amplificaciones espurias. 4.2.4.c Marcaje radiactivo de la sonda de hibridación Para el marcaje de la sonda de hibridación se empleó el sistema HighPrime (Roche), basado en la síntesis de una cadena complementaria de DNA utilizando cebadores hexanucleótidos, en presencia del fragmento Klenow de la DNA polimerasa I. Aproximadamente 30 ng de sonda de DNA (a una concentración de 5 ng/μl) se llevaron hasta un volumen de 14 μl. La muestra se desnaturalizó a 95ºC durante 10 min y se puso en hielo. Se añadieron 4 μl del High Prime kit, y 5 μl de [α-32P]-dCTP (3000Ci/mmol, 10 mCi/ml, 500 μCi, Perkin Elmer) y se incubó durante 1 h a 37ºC. La reacción se paró con 2 μl de 0.2 M EDTA, añadiendo seguidamente TE hasta completar 100 μl. Para eliminar el exceso de desoxinucleótido trifosfato radiactivo no incorporado en el DNA, la muestra se pasó por una columna de filtración en gel Sephadex G-50 preparada en jeringuillas de insulina de 1 ml, equilibrada previamente con tampón TE, la cual se centrifugó posteriormente a 1.500 rpm (Centromix P-Selecta) durante 3 min. Todas las manipulaciones que involucraron manejo de compuestos radiactivos, con fuerte poder de emisión de partículas β, se realizaron en las instalaciones de radioisótopos del SCAI. 4.2.4.d Hibridación, lavado y exposición de la membrana Las membranas de nylon se incubaron en rotación a 65ºC durante un mínimo de una hora en solución de prehibridación: 5x SSC, 1% SDS, 5x Denhardt’s (véase Anexo I) y 100 μg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado (D1626, Sigma). El volumen empleado dependió del tamaño de la membrana, teniendo en cuenta que ésta debe ser cubierta por completo. Trascurrido este tiempo, se cambió la solución por la de hibridación (5x SSC, 1% SDS y 100 μg/ml de DNA de esperma de salmón desnaturalizado) junto con la sonda radiactiva, Materiales y Métodos 55 previamente desnaturalizada, a una concentración final de 1x106 cpm/ml. La hibridación se realizó en rotación a 65ºC O/N. Tras la hibridación las membranas se lavaron a RT con disoluciones de astringencia creciente; 2x SSC y 0.1% SDS durante 10 minutos, tras los cuales se cambió el medio repitiéndose el lavado durante otros 10 min adicionales. A continuación el medio se cambió por 0.2x SSC y 01% SDS y se lavó de la misma forma descrita anteriormente, primero a RT y luego a 42ºC. Por último, se realizó un lavado con 0.1x SSC y 0.1% SDS a 65ºC. Tras secar las membranas se envolvieron con un plástico transparente y se dejaron 24 h en un casete de autorradiografía junto a una IP fotosensible. Este revelado rápido (en un aparato Fujifilm FLA 7000) nos permitió valorar si la membrana presentaba fondo y la intensidad del marcaje, previo a su exposición en películas Amersham HyperfilmTM ECL que se dispusieron junto con dos pantallas intensificadoras en casetes metálicas y se mantuvieron a -80ºC durante 3 días de exposición. 5. Microinyección de células ES murinas transgénicas en embriones en estadio de 8 células Estos experimentos se llevaron a cabo en el INIA (Madrid) de acuerdo con los protocolos implementados de Institución Interna de Cuidado Animal y Comité de Uso del INIA (Madrid). 5.1 Superovulación de ratones Swiss Para la obtención de los embriones se superovularon ratones Swiss hembra, vía intraperitoneal con gonadotropina coriónica equina (PMSG o eCG; Intervet, Boxmeer) a una concentración de 7.5 UI, y 48 h más tarde, con gonadotropina coriónica humana (hCG, Farma-Lepori) a una concentración final de 5 UI. Tras la inyección de la hCG se produce el pico de hormona luteinizante (LH) momento en el que se lleva a cabo el cruce con los machos. Los embriones en estadio de 8 células se extrajeron quirúrgicamente a los 2.5 días post coitum (dpc). Materiales y Métodos 62 ANÁLISIS FENOTÍPICO MOLECULAR DE MODELOS MURINOS TRANSGÉNICOS 1. Análisis de los transcritos GA mediante qRT-PCR 1.1 Cuantificación de los transcritos GLS2 en animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ El mRNA se aisló siguiendo las recomendaciones del fabricante (AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit, QUIAGEN), a partir de no más de 30 mg de cerebro e hígado de animales Gls2tm1a/+, WT y Gls2tm1c/+ (6 animales por genotipo). La cuantificación del RNA se llevo a cabo con espectofotómetro y la calidad del RNA se comprobó mediante gel desnaturalizante al 1.5 % (p/v) de agarosa/formaldehido (véase Anexo I). La integridad del RNA se valoró tras observar las bandas correspondientes a los RNA ribosómicos, 28S y 18S, que aparecen aproximadamente en un ratio 2:1 de intensidad. Muestras de 1 ug de RNA se retrotranscribieron a cDNA siguiendo el protocolo recomendado por el fabricante (QuantiTect Reverse Transcription Kit, Quiagen). A continuación, se realizó la PCR a tiempo real con el kit Perfecta SYBRGreen Supermix (Quanta Biosciences), incluyendo los controles negativos correspondientes: control de la retrotranscripción (valora la contaminación de DNA genómico) y control sin RNA molde (contaminación por reactivos y aerosoles). Los cebadores y condiciones del ciclo empleados fueron los descritos anteriormente por Martín-Rufián et al., 2012. Se realizaron curvas estándar a partir de concentraciones conocidas de RNA para, posteriormente, representar el logaritmo de la concentración (ng) frente al valor Ct (cycle threshold). La pendiente de las muestras (slope) permitió calcular la eficiencia de amplificación (E) mediante la siguiente fórmula: % Eficiencia = (E-1) × 100; donde E se calcula como, E = 10-1/slope. Materiales y Métodos 63 Tabla 10. Secuencia de los cebadores empleados en qRT-PCR (Martín-Rufián et al., 2012). Cebadores Secuencia 5’-3’ Secuencia 3’-5’ pb GAB GCACTCGGATCATGACGCCTCAC TTGGACCATGCGCTGCATCTTG 190 LGA GCCAGATGGTTCAAAGAGGAGG GTGGTGAACTTGTGGATAGGG 230 β-actina CTTTGCAGCTCCTTCGTTGCC GCGAAGCCGGCTTTGCACAT 111 Las condiciones del programa utilizado fueron: 95ºC durante 4 min, 40 ciclos de 95ºC 15 s, 61ºC 45 s y 72ºC 30 s. Las medidas de fluorescencia se realizaron a 72ºC. El software para analizar los resultados fue CFX de Bio-Rad. La expresión relativa de cada una de las isoformas se calculó en base al método 2-∆∆Ct (Livak & Schmittgen, 2001), normalizando los resultados frente a βactina. Los amplicones fueron analizados en geles de agarosa, para confirmar igualmente la presencia de un único producto de amplificación y la ausencia de dímeros y/o contaminación por DNA genómico. 1.2 Cuantificación del transcrito KGA en animales KOLPA1 Los animales fueron sacrificados por decapitación y una vez extraído el cerebro, éste se congeló rápidamente a -80ºC hasta la obtención de las diferentes regiones de interés. Se realizaron cortes de 2 mm de grosor con una matriz Zivic de cerebro (Zivic Instruments). Siguiendo las indicaciones del Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates (Paxinos and Franklin 2001) y Blanco et al2., 2012, se aislaron las regiones de interés, correspondientes a estriado, hipocampo, corteza prefrontal (PFC), parietal motora (PM) y cerebelo. La extracción de RNA y la retrotranscripción se llevaron a cabo como se describe en el apartado anterior. Los cebadores utilizados se muestran en la Tabla 11. Las condiciones del programa utilizado fueron las mismas que para los transcritos GLS2. Materiales y Métodos 64 Tabla 11. Secuencia de los cebadores empleados en qRT-PCR (Martín-Rufián et al., 2012) Nombre Secuencia 5’-3’ Secuencia 3’-5’ pb KGA CAGAACAGCCCTGCATGTTGCTG CCACCTGTCCTTGGGGAAGGGGT 179 Para la cuantificación absoluta del transcrito KGA, se realizaron curvas estándar empleando cantidades conocidas de cada uno de los amplicones específicos. Dichos amplicones fueron obtenidos previa amplificación por PCR, separados y purificados de geles de agarosa al 2%. Las concentraciones se estimaron por espectofotometría. A continuación, se hicieron diluciones de cada estándar (1/10) y para cada una de ella se determinó el Ct. La curva se obtuvo representando el Ct de cada dilución frente al logaritmo de la cantidad inicial. Los resultados se obtuvieron interpolando en la curva, y se expresaron como número de moléculas de mRNA ± SEM por ng de RNA total. Finalmente, el número de copias se calculó teniendo en cuenta el número de Avogadro y la correspondiente masa molecular del mRNA (Sambrook et al., 1989) 2. Análisis de expresión proteica por inmunotransferencia Western 2.1 Extracción y cuantificación de proteínas La extracción de proteínas para el análisis de isoenzimas GA en animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ (n=6 por genotipo), se llevó a cabo en frío mediante homogenización del tejido en un tampón de extracción (a razón de tres volúmenes de tampón por peso de tejido), compuesto por: Tritón X-100 1% (p/v), 2mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8) e inhibidores de proteasas (Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail, Roche). A continuación, se incubó a 4ºC durante 1 h en agitación y se centrifugó a 14.000 rpm (Hettich Universal 320R, rotor 1420) durante 15 min a 4ºC. La cuantificación de proteínas en el sobrenadante se estimó mediante el método de Bradford (1976). Para lo cual se llevó a cabo una interpolación sobre una recta patrón realizada con concentraciones conocidas de albúmina de suero bovino (BSA, Fraction V, Sigma). Las absorbancias se midieron a 595 nm (Microplate Reader 680, Bio-Rad). Materiales y Métodos 65 En animales KOLPA1 se analizaron marcadores proteicos de espinas dendríticas: PSD-95 y sinaptofisina (n=5 por genotipo), KGA (n=9 por genotipo) y MMP-9 pro-activa y activa (n= 8 WT; n= 11 KOLPA1). Los animales fueron sacrificados por decapitación y se les extrajo el cerebro y antes de su congelación a -80ºC, se diseccionaron las dos áreas de estudio: corteza e hipocampo. La extracción de proteínas para el análisis de marcadores proteicos de espinas dendríticas (PSD-95 y sinaptofisina) y KGA, se llevó a cabo mediante homogenización con tampón RIPA (150 mM cloruro sódico, 1% NP-40, 0.25% sodio deoxicolato, 0.1% SDS, 1 mM EGTA y 50 mM Tris pH 7.4 e inhibidores de proteasas), que resulta óptimo para la extracción de proteínas de membrana. La homogenización del tejido en el tampón de extracción se realizó en hielo, la incubación a 4ºC se mantuvo 20 minutos y posteriormente se centrifugó 20 minutos a 30.000g. En el caso de MMP-9 las muestras se homogeneizaron en 20 volúmenes de tampón de lisis (50 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 % NP-40) conteniendo inhibidores de proteasas al 5 % y fosfatasas al 1 % (p5726, Sigma, Madrid, España). La muestra se hizo pasar a través de la aguja de una jeringa hipodérmica (26G) para romper las fracciones tisulares que permanecieron enteras. La determinación de la concentración de proteína de las muestras en tampón de homogenización conteniendo Nonidet P40 se realizó mediante una modificación del método de Lowry (Markwell et al., 1978). Para ello se mezclaron 200 L de una dilución de la muestra con 600 L de reactivo C, compuesto por una mezcla en proporción 100:1 de reactivo A (2% Na2CO3, 0.4% NaOH, 0,16% tartrato sódico y 1% SDS) con sulfato de cobre al 4% (reactivo B). La mezcla se incubó durante 10 min a RT. A continuación se adicionaron 60 µl de reactivo de FolinCiocalteau (diluido en agua a razón 1:1). Tras 45 minutos de incubación, se determinó la absorbancia a una longitud de onda de 660 nm (Microplate Reader 680, Bio-Rad) de cada muestra y se interpoló este valor en una recta patrón realizada a partir de concentraciones conocidas de albúmina de suero bovino. Materiales y Métodos 66 2.2 Inmunotransferencia Western Las proteínas se separaron mediante electroforesis en condiciones desnaturalizantes en presencia de SDS, según el método descrito por Laemmli (1970). Para ello se emplearon 45 μg de proteínas procedentes de tejido cerebral y 30 μg de proteínas hepáticas. Las muestras se calentaron durante 5 min a 95ºC en tampón de carga (véase Anexo I) y se analizaron en geles de poliacrilamida al 10%. El marcador utilizado fue el Low Molecular Weight Calibration Kit for SDS (GE Healthcare). Posteriormente, se realizó la transferencia a membranas de nitrocelulosa empleando el Mini Trans-Blot cell (Bio-Rad) durante 1 h a 100V. Finalizada la transferencia, la membrana se tiñó con Red Ponceau para asegurar que las proteínas se habían transferido correctamente. El exceso de tinción se eliminó con agua. El procedimiento para la incubación de los anticuerpos fue el mismo para todas las muestras. Las membranas se bloquearon con BSA al 5% en tampón TTBS (Anexo I) durante 1 h a RT. A continuación, los anticuerpos primarios se incubaron en agitación suave a 4ºC (O/N). A la mañana siguiente se lavó la membrana tres veces durante 10 min con TTBS y se añadió el anticuerpo secundario correspondiente, el cual se dejó durante 1 h a RT. Después de lavar la membrana, se reveló con el reactivo quimioluminiscente SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher) y la imagen se registró en un equipo de fotodocumentación de geles y membranas (ChemiDoc MP System, Bio-Rad). Se retiró el excedente de reactivo quimioluminiscente y se añadió el anticuerpo antiGAPDH o anti-β-actina como control de carga, y la membrana se dejó a 4ºC O/N. A la mañana siguiente se procedió de forma equivalente a la descrita para la incubación del anticuerpo secundario. La cuantificación de la densidad de las bandas se realizó utilizando el programa Image J. El valor de cada muestra se normalizó en referencia a la inmunoreactividad de la β-actina o GAPDH según corresponda. Materiales y Métodos 67 Tabla 12. Anticuerpos y diluciones utilizadas en los experimentos de inmunotransferencia Western con animales WT, Gl2tm1a/+, Gls2tm1c/+ y KOLPA1. Anticuerpo primario Dilución Anticuerpo secundario Dilución GAB 1:500 Anti-IgG de ratón 1:40.000 PSD-95 1 μg/ml Anti-IgG de cabra 1:80.000 Syn 1:2.500 Anti-IgG de conejo 1:80.000 KGA 1:1.000 Anti-IgG de conejo 1:80.000 MMP-9 1:1.000 Anti-IgG de conejo 1:80.000 GAPDH 1:500 Anti-IgG de ratón 1:40.000 β-actina 1:10.000 Anti-IgG de ratón 1:40.000 Los anticuerpos primarios utilizados fueron: anticuerpo anti-GAB y anti-KGA, previamente desarrollados y caracterizados en este laboratorio (Olalla et al. 2002; Campos et al. 2003; Olalla et al. 2008; Cardona et al. 2012); PSD-95 (12093, Abcam); Syn (14692, Abcam); MMP-9 (19016, Millipore); GAPDH (9484, Abcam); β-actina (A5441, Sigma). Los anticuerpos secundarios (conjugados a peroxidasa de rábano, HRP) utilizados fueron: Anti-IgG de ratón (A9044, Sigma); Anti-IgG de cabra (ab5420, Abcam); Anti-IgG de conejo (A0545, Sigma). 3. Análisis de expresión de isoenzimas GA mediante cuantificación de la actividad enzimática La actividad GA se llevó a cabo por el método OPA (o-ftalaldehído) descrito por Heini et al. (1987) y basado en la determinación del amonio producido por la enzima GA al actuar sobre su sustrato y posterior reacción del mismo con el OPA. La actividad específica se expresó en unidades internacionales de actividad enzimática (U, cantidad de enzima que cataliza la producción de 1 µmol de producto por minuto) por gramo de proteína. El tejido se homogenizó empleando tres volúmenes de tampón de reacción: 25 mM Tris–HCl (pH 8), 0.2 mM EDTA, 0.33 M sacarosa, inhibidores de proteasas (Roche) y detergente no iónico Tritón X-100 1% (p/v). Se centrifugó a 100.000g (Optima TL Ultracentrífuga) durante 30 min a 4ºC. La reacción GA se llevó a cabo durante 1 h a 37ºC tras añadir 25 μL de muestra a 35 μL de tampón de reacción. La reacción se paró con 10 μL de ácido Materiales y Métodos 68 tricloroacético (TCA) al 10% (p/v), se mantuvo en hielo durante 15 min y se centrifugó a 12.000 g 5 min. Para los blancos de la reacción, las muestras y el sustrato se incubaron por separado y, previo a la adición de TCA, se mezclaron. Para la medida del amonio se utilizaron 5 μL del sobrenadante que se mezclaron con 150 μL de reactivo OPA (10 mL de fosfato potásico 0.2 M, pH 7.4; 0.56 mL de mercaptoetanol 72 mM en etanol; y 0.56 mL de OPA 186 mM). La mezcla de reacción se mantuvo a temperatura ambiente durante 45 minutos en oscuridad y se midió la absorbancia a 410 nm (Microplate Reader 680, Bio-Rad). Las concentraciones de amonio de las muestras se extrapolaron en una recta patrón de NH4Cl. Para la cuantificación de la actividad GA en ratones WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+, se utilizaron 6 animales por genotipo. Se llevaron a cabo dos tipos de ensayos de actividad basándose en las distintas propiedades cinéticas de las isoenzimas KGA y GLS2 (GAB/LGA). Se cuantificó la actividad total GA, utilizando como tampón de reacción 150 mM fosfato potásico pH 8, 171 mM L-Gln y 1 mM NH4Cl. La actividad asociada a GLS2 se midió con un tampón 50 mM fosfato potásico pH 8, 100 mM L-Gln, 100 mM ácido glutámico y 1 mM NH4Cl, tal y como está descrito en Campos-Sandoval et al., 2007. La cuantificación de actividad GA en animales KOLPA1 se realizó en las siguientes regiones cerebrales: corteza PM (WT n= 9; KOLPA1 n= 5), PFC (WT n= 12; KOLPA1 n= 8), hipocampo (WT n= 16; KOLPA1 n= 12), estriado, giro dentado y cerebelo (en estas regiones el número de animales analizados estuvo comprendido entre 8 y 15 para ambos genotipos). 4. Inmunohistoquímica de isoformas GA en animales KOLPA1 Para el análisis inmohistoquímico de los animales KOLPA1, un total de 8 ratones fueron anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg/kg) y perfundidos transcardialmente con 0.1 M PBS (pH 7.4), seguido de solución de fijación fría (4% paraformaldehído, 75 mM lisina y 10 mM de metaperiodato sódico, en tampón fosfato 0.1 M, pH 7.4). El tejido se dejó O/N a 4ºC en solución de fijación y posteriormente se sumergió en sacarosa al 30%. Los cortes de 40 µm se realizaron Materiales y Métodos 69 con un micrótomo de congelación (Leica, modelo CM 1325) y se guardaron en PBS con azida sódica al 0.02%. La actividad peroxidasa endógena se inactivó con una disolución del 3% de H2O2 y 10% de metanol en tampón 0.1M PBS (pH 7.4) durante 20 minutos a RT. A continuación el tejido se lavó durante 1 hora en tampón PBS y se procedió a la inactivación de la biotina y avidina endógenas, así como las proteínas de unión a biotina mediante la incubación de las secciones con el kit de bloqueo de Vector Labs (SP-2001) durante 30 minutos. Posteriormente, el tejido se incubó con los anticuerpos policlonales de conejo anti-KGA y anti-GAB, desarrollados y caracterizados en nuestro laboratorio. El anticuerpo anti-KGA se utilizó a una dilución 1:1000, y el anti-GAB a 1:500. Ambas incubaciones se prolongaron 48 h a RT. Tras realizar tres lavados de 10 min con PBS se añadió el anticuerpo secundario biotinilado, anti-IgG de conejo (Vector Labs) a 1:500 (en PBS con 0.3% Tritón X-100 y 0.1% azida sódica) y se dejó incubado durante 1 h RT. Tras realizar varios lavados con PBS se incubó con extravidina acoplada a peroxidasa de rábano (Sigma-Aldrich) a 1:2000 durante 1 h a RT. El revelado se llevó a cabo empleando tetrahidrocloruro 3-3’-diaminobenzidina (DAB; Sigma) al 0.05% (p/v) y 0.03% (p/v) sulfato amónico de níquel en H2O2 al 0.01% (v/v) en PBS. Los cortes se montaron en portaobjetos gelatinizados, que posteriormente fueron deshidratados en graduación creciente de etanol, se aclararon con xileno y cubrieron con medio DPX (VWR International, BDH Prolabo). Como control negativo de la técnica se utilizaron secciones que no habían sido incubadas con anticuerpo primario. Para la adquisición de las imágenes se utilizó un microscopio Nikon Eclipse 80i acoplado a una cámara Nikon DS-5M de alta resolución. 5. Caracterización de la morfología de espinas dendríticas en ratones KOLPA1 La tinción de Golgi-Cox (FD Rapid GolgiStain™ kit; FD Neurotechnologies) se llevó a cabo para detectar las alteraciones morfológicas de las dendritas y de las espinas dendríticas. Para ello, ratones macho adultos de cada uno de los genotipos Materiales y Métodos 70 estudiados, WT (n=5) y KOLPA1 (n=5), fueron anestesiados con pentobarbital sódico (60 mg/kg) e inmediatamente se les extrajeron los cerebros. El tejido se lavó con agua destilada y se sumergió en solución de fijación (A+B) durante dos semanas en oscuridad. Posteriormente, los cerebros se transfirieron a la solución C durante 4 días. El tejido se congeló en isopentano (enfriado a -70ºC) y se cortó en un microtomo de congelación (Leica, CM 1325) en secciones de 150 μm. Los cortes se montaron en la solución C en portas gelatinizados y se dejaron secar a RT. Para la tinción de las muestras se siguió el protocolo recomendado por el fabricante, seguido de un proceso de deshidratación en etanol en graduación creciente, aclarado con xileno y montaje con medio DPX (BDH). Para la adquisición de las microfotografías de las dendritas basales piramidales de la región CA1 (stratum oriens) de hipocampo, se utilizó un microscopio SP5 II (Leica) y un objetivo de inmersión en aceite 63x (láser 405 diodo), con un zoom 2.5x (z-stack 0.3 µm). Para la cuantificación y el análisis morfológico se utilizó el software LAS AF Lite (Leica). Se analizaron tanto la densidad de las espinas dendríticas (valorado como el número de espinas en 10 µm de longitud) en dendritas secundarias y terciarias (analizándose un total de 30 dendritas por genotipo), como su morfología y longitud (evaluando un total aproximado de 120 espinas/genotipo), y el ancho de la dendrita. Se siguieron los siguientes criterios: 1) la calidad de la tinción; 2) el aislamiento de las dendritas analizadas; 3) espinas claramente distinguibles. El análisis estadístico se llevó a cabo con el programa Statgraphics usando la prueba t de Student o el test no paramétrico de Mann-Whitney. 6. Análisis por zimografía en gel para la determinación de la actividad enzimática 6.1 Determinación de la actividad gelatinasa de MMP-2 y MMP-9 La determinación de la actividad gelatinasa se llevó a cabo sobre las mismas muestras utilizadas para el estudio de la expresión proteica, por lo que el protocolo de obtención y homogenización, así como la determinación de la concentración de proteína total se encuentran detallados en el apartado anterior. Materiales y Métodos 71 La separación de MMP-2 y de MMP-9 se llevó a cabo mediante geles de poliacrilamida/bis-acrilamida al 7 %, conteniendo gelatina al 5 % como sustrato enzimático específico de dichas metaloproteinasas. Las muestras fueron diluidas 3:1 en tampón de carga no reductor (25 mM Tris, pH 6,8, 10 % glicerol, azul de bromofenol) y se calentaron durante 15 min a 37 °C, cargándose 20 µg de cada una de las muestras. La electroforesis se desarrolló en condiciones de voltaje constante, a 120 V durante 110 min. Tras la electroforesis, los geles se incubaron dos veces en tampón de lavado (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM CaCl2, 1,5 µM ZnCl2, 2,5% Tween-20) durante 30 min a fin de eliminar la unión reversible del SDS a las proteínas de las muestras, así como permitir la renaturalización de las proteínas y recuperar su actividad enzimática. Posteriormente, se incubaron los geles en tampón de activación (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 6 mM CaCl2, 1,5 µM ZnCl2) durante 48 h a 37°C. Tras la incubación, los geles fueron teñidos con azul de Coomassie (Coomassie Brilliant Blue R-250, Bio-Rad) y, posteriormente, se destiñieron con solución de ácido acético al 10% y metanol al 40%, lo que permitió visualizar bandas decoloradas debido a la ausencia de gelatina, correspondientes a la actividad enzimática de las gelatinasas ensayadas. Los geles revelados de este modo fueron escaneados como negativos. La intensidad de las bandas correspondientes a la degradación de sustrato se cuantificó mediante el programa Image J Sofware. 6.2 Determinación de la actividad proteolítica del activador tisular del plasminógeno El estudio de la actividad proteolítica del activador tisular del plasminógeno (tPA) se llevó a cabo mediante zimografía en geles de poliacrilamida/bisacrilamida al 9 %, conteniendo caseína al 0,1 % y plasminógeno al 0,1 % como sustrato enzimático específico. Las muestras se prepararon de igual manera que en el caso anterior con la diferencia de que se cargaron 10 µg de proteína total. Resultados y Discusión 78 embrionarias (endodermo, mesodermo y ectodermo) (Nagy & Vintersten, 2006). Uno de los puntos críticos en el cultivo de células ES es mantener su estado pluripotente, ya que normalmente tienden a diferenciarse. Para conseguir este objetivo, es necesario el co-cultivo con MEF inactivados o STO (una línea de fibroblastos murinos transformados) y el factor inhibidor de la leucemia (LIF), una citoquina del tipo interleukina 6 (IL6) que inhibe la diferenciación celular (Evans & Kaufman, 1981). El LIF ejerce su acción a través de gp130, una subunidad del receptor de citoquinas esencial en la transducción de señales. La cascada de activación implica a las quinasas Janus (JAKS) que fosforilan a STAT3, que actúa como un factor de transcripción activando genes que se encargan de potenciar la auto-renovación de las células ES (Hirano et al., 2000). Aunque la función del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) es menos clara, parece que cuando se aportan señales extracelulares, como LIF, también promueve la activación de la vía JAK/STAT3 (Lanner & Rossant, 2010). Figura 3. Cultivo de células madre embrionarias (ES) murinas. Las células ES crecen formando colonias redondeadas y compactas de pequeñas células, sobre una capa de fibroblastos Resultados y Discusión 79 embrionarios de ratón (MEF). En la figura C, se indica con una flecha blanca una de las colonias diferenciadas, que se puede ver en aumento en la figura D. Se utilizó un microscopio Nikon Diaphot, con objetivo 4 x (A-C) y 10x (D). 3. Electroporación de células ES murinas con el vector de transgénesis Previo a la electroporación de las células ES, se debe realizar una digestión enzimática que permita hacer lineal al vector de transgénesis, lo que favorecerá los eventos de reemplazamiento frente los de inserción, además de proteger el marcador de selección negativo de la acción de nucleasas (Cheah & Behringer, 2001). Para ello se seleccionó una enzima de restricción con un único punto de corte fuera de la zona de homología, concretamente se utilizó AsiSI. La banda única obtenida tras la digestión del vector, de aproximadamente 24 kb, coincide con el tamaño teórico esperado del vector lineal (Fig. 4). Figura 4. Análisis de restricción del vector de transgénesis con AsiSI. (1) Marcador λHindIII, (2) Marcador Mass Ruler High Range DNA Ladder. (3 y 4) Digestiones de diferentes Midipreps del vector de transgénesis con la enzima AsiSI. 4. Selección y genotipado de células ES murinas transgénicas Los marcadores de selección permiten identificar aquellas células que han incorporado la cassette transgénica mediante la expresión de resistencia a antibióticos. El vector de transgénesis porta un gen neor, que codifica para la enzima aminoglucósido fosfotransferasa, confiriendo resistencia a antibióticos de la familia de los aminoglucósidos (geneticina, kanamicina, neomicina) que actúan inhibiendo la síntesis proteica (Hall et al., 2009). Además, este vector de Resultados y Discusión 80 transgénesis porta un marcador de selección negativa, el gen DTA (fragmento A de la toxina diftérica), que permite seleccionar los eventos de recombinación no homólogos, mediante la inhibición de la síntesis proteica en las células que lo incorporen (Yagi et al., 1990). Figura 5. Selección de células ES murinas transgénicas con el antibiótico G418. La selección con geneticina se llevó a cabo durante 8 días, momento en el que ya se observaba muerte celular. Las células ES murinas resistentes al tratamiento se seleccionaron para su genotipado por PCR. En la imagen se muestra una colonia ES murina con gran número de vacuolas (objetivo 10x). Para confirmar la presencia de la cassette transgénica en las células ES murinas resistentes a G418 se llevaron a cabo tres PCR, una en la región de homología 5’, otra específica del gen neor y la tercera específica del brazo corto del vector (región 3’). Los cebadores In1-Fw y Lar3-Rv reconocen la secuencia comprendida entre el intrón 1 y la secuencia En2SA (Fig. 6), lo que permite asegurar la presencia de la cassette transgénica, ya que el cebador antisentido es específico de esta región. Los cebadores Neo-Fw y Neo-Rv amplifican la región correspondiente al gen de resistencia a geneticina. Puesto que se han descrito casos en que los vectores de reemplazamiento se integran en el genoma mediante un único evento de recombinación (Bernelot-Moens et al., 2016), se chequeó la presencia del brazo de homología 3’ mediante una PCR que amplifica el sitio loxP de esta región (cebadores Ex7-Fw e In7-Rv). Resultados y Discusión 81 Figura 6. Región de reconocimiento de los cebadores utilizados para el genotipado de las ES murinas transgénicas. En la figura se indican las tres parejas de cebadores utilizadas para el genotipado de las ES murinas mutantes. Figura 7. Genotipado mediante PCR de las células ES murinas resistentes a G418 con los cebadores (A) Int1Fw-LaR3Rv, (B) NeoFw-NeoRv y (C) Ex7Fw-In7Rv. Las células ES resistentes a G418 se genotiparon con cebadores específicos de la cassette transgénica. (A) Los clones 3, 4 y 6 amplificaron el fragmento esperado de 270 pb, correspondiente al brazo de homología 5’. (B) Se realizó una PCR de las células ES murinas para detectar la región del gen neor. Los clones 3, 4 y 6, anteriormente seleccionados, amplificaron el fragmento esperado de 492 pb. (C) El análisis de la región 3’ de la cassette transgénica permitió confirmar la presencia del fragmento correspondiente al loxP (318 pb) en los clones 3, 4 y 6. Las bandas se purificaron del gel y el DNA de todos los fragmentos amplificados se secuenció (véase Anexo II). (1) Marcador de masa molecular GeneRuler 50 bp DNA Ladder 4.1 Genotipado por Long-Range PCR (LRPCR o long-PCR) de células ES murinas transgénicas El genotipado mediante PCR convencional mostrado en el apartado anterior sólo permite confirmar la ausencia o presencia de la cassette transgénica, pero no su localización en el genoma, por lo que se llevó a cabo un genotipado adicional, tanto por LRPCR como por transferencia Southern. Estas técnicas nos permitirán asegurar que la integración de la cassette transgénica ocurrió por recombinación homóloga en la región adecuada del cromosoma 10 del genoma murino. Para ello, la estrategia seguida en la LRPCR implica que un cebador sea específico de la cassette y otro del DNA genómico, correspondiente a nuestro gen (Fig. 8). Resultados y Discusión 82 Figura 8. Región de reconocimiento de los cebadores utilizados para el genotipado de las ES murinas transgénicas por LRPCR. El cebador LRPCR-Fw es complementario de la región 5’ que queda por delante del intrón 1, y que no se encuentra incluida en el vector de transgénesis. LRPCR-Rv es complementario de la región En2SA de la cassette transgénica. El fragmento amplificado, de 5.6 kb, indicará que las células ES murinas han incorporado la cassette transgénica por recombinación homóloga, en la región adecuada del cromosoma 10 correspondiente al gen Gls2. Los resultados obtenidos mediante el genotipado por LRPCR (Fig. 9) nos permiten confirmar la integración de la cassette transgénica en la región cromosómica correspondiente al gen Gls2. Se obtuvieron dos bandas (Fig.9.A), una del tamaño esperado, 5.6 kb, y otra, inespecífica, de menor tamaño (aproximadamente 2.5 kb). Aunque en el control negativo utilizado, DNA de células ES murinas WT, no se observó la banda de 5.6 kb, se aseguró que ésta contuviera la cassette transgénica, mediante Nested PCR con los cebadores Int1-Fw y LaR3-Rv (Fig.6). El resultado de esta PCR (Fig.9.B) confirma la presencia de la cassette transgénica, al amplificar el fragmento correspondiente de 270 pb. Figura 9. Genotipado mediante LRPCR de las células ES murinas resistentes a G418 con los cebadores LRPCR-Fw y LRPCR-Rv. (A) El tamaño esperado es de aproximadamente 5.6 kb para las células ES murinas que hayan incorporado la cassette transgénica mediante recombinación homóloga. En la figura se indica la banda que se purificó del gel para realizar la nested PCR. El marcador de masa molecular es λDNA-HindIII. (B) Nested PCR del fragmento de 5.6 kb con los cebadores Int1-Fw y LaR3-Rv. La amplificación del fragmento de 270 pb confirma la Resultados y Discusión 83 presencia de la cassette transgénica en las células ES murinas. El marcador de masa molecular es Gene Ruler 50 bp. 4.2 Genotipado de las células ES murinas transgénicas mediante transferencia Southern Se realizó una transferencia Southern de todas las células ES murinas aisladas como positivas tras la selección por antibiótico y genotipado por PCR convencional. Mediante digestión del DNA genómico aislado de las células ES con la enzima de restricción BstEII, y posterior hibridación con la sonda específica, cabe esperar dos fragmentos de aproximadamente 16 kb y 9 kb. El primero correspondiente al alelo que ha incorporado la cassette transgénica en el loci adecuado, y el de 9 kb correspondiente al alelo WT (véase Anexo II para un mayor detalle de la estrategia seguida). Por tanto, las células ES que hayan incorporado la cassette transgénica presentarán dos bandas, una de 16 kb y otra de 9 kb, mientras que las células ES WT sólo presentarán la banda correspondiente a dicho alelo (9 kb). Figura 10. Genotipado de las células ES murinas transgénicas mediante transferencia Southern. (A) Fotografía del gel de agarosa donde se realizó la separación del DNA genómico digerido con BstEII. Se puede observar el smearing característico que denota que la digestión enzimática del DNA tuvo lugar a un nivel aceptable. El marcador utilizado es λDNA/HindIII. (B) Autorradiografía de la membrana Southern hibridada con la sonda específica. A la izquierda de la Resultados y Discusión 84 figura, con un guión negro, se indican las masas moleculares del marcador λDNA/HindIII correspondientes a 23, 9.4 y 6.5 kb. Las calles 1 y 5 corresponden a dos células ES que han incorporado la cassette transgénica, ya que presentan la banda correspondiente al alelo WT (9 kb) y al alelo mutado (16 kb), mientras que 2, 3 y 4 corresponden a células ES WT. 5. Microinyección de células ES murinas transgénicas en embriones en estadio de 8 células Las hembras Swiss superovuladas fueron sacrificadas a 2.5 dpc para la obtención de los embriones. Para ello, se aislaron los oviductos y parte del cuerno uterino y a través del infundíbulo se inyectó la solución amortiguadora M2 para liberar al medio los embriones (Fig. 11). Posteriormente, se lavaron mediante diferentes pases por el medio M2 y se procedió a la microinyección de las células ES murinas transgénicas. Figura 11. Obtención de embriones y microinyección de células ES murinas transgénicas. (A) Tras el sacrificio se realizó una incisión en la zona de la línea alba. Una vez localizados los ovarios, se eliminó la mayor parte de la grasa y tejido conectivo con ayuda de unas pinzas y se cortó el oviducto y parte del cuerno uterino. (B) El lavado se realizó a través del infundíbulo para liberar los embriones en estadio de 8 células, localizados cerca de la unión úterotubal. (C y D) Se inyectaron en torno a 10 células ES mutantes por cada uno de los embriones. La microinyección de células ES puede realizarse en embriones en estadio de ocho células o en blastocistos. Cuando la ICM ya está formada, las células ES transgénicas inyectadas deben competir con las células de la masa interna para Resultados y Discusión 85 formar el embrión, mientras que al inyectarse en embriones en estadio de 8 blastómeras las células ES pueden tener una ventaja competitiva respecto el resto de células indiferenciadas (Huang et al., 2008). Otras premisas, aparte del estadio del desarrollo embrionario, pueden mejorar la eficiencia del proceso, como por ejemplo la activación de las células ES. Sincronizar las células en su fase exponencial de crecimiento, previo a inyectarlas en el embrión, incrementa el porcentaje de ratones con más del 75% de quimerismo, lo que a su vez favorece a contribuir a la línea germinal. Se puede concluir que la producción de ratones transgénicos a partir de células ES híbridas es más eficiente cuando se activan las células ES y se microinyectan en embriones de 8 blastómeras (Ramírez et al., 2009). Los embriones se mantuvieron 24 horas en medio KSOM suplementado con 4% de medio ES y se transfirieron al útero de hembras pseudogestantes. Se ha descrito que estos dos procesos proporcionan una ventaja a las células ES frente a los blastómeros existentes en la contribución de la ICM (Ramírez et al., 2009). Se adjunta una tabla (Tabla 1) con uno de los experimentos llevados a cabo, donde se muestra el número de células ES inyectadas por embrión y los embriones transferidos por ratona. Del número de nacimientos se determina cuántos de ellos son quiméricos y el grado de quimerismo que presentan, tal y como se indica en el apartado de Métodos. Tabla 1. Tabla que ejemplifica algunos de los experimentos de microinyección. Embriones inyectados Nº ES Nacimientos Quiméricos Nivel 16 8 5 0 - 25 8 1 0 - 38 9 1 0 - 40 9 6 3 4 25 11 0 1 3 Resultados y Discusión 86 Figura 12. Crías quiméricas. El pelaje negro indica una mayor contribución de las células ES transgénicas en el desarrollo del embrión. Mediante cruces y genotipado posterior se comprobará si las células ES mutantes contribuyeron a la línea germinal. 6. Genotipado de ratones transgénicos Una vez se obtuvieron los fundadores (F1) de la colonia, heterocigotos para el transgén (HT; Gls2tm1a/+), se realizaron los cruces consecutivos para obtener las crías homocigotas que hubieran incorporado la cassette transgénica en ambos alelos (Gls2tm1a/tm1a). La estrategia de genotipado se basó en tres cebadores, dos específicos del DNA genómico del gen Gls2 murino y uno de la construcción transgénica. Los animales WT (Gls2+/+) amplificarán el fragmento comprendido entre los cebadores Int1Fw e Int1Rv, con un tamaño teórico de 432 pb. Los ratones Gls2tm1a/tm1a presentarán un amplicón de 270 pb, correspondiente a la amplificación de los cebadores Int1Fw y LaR3Rv; mientras que los animales Gls2tm1a/+ presentarán ambos fragmentos. Figura 13. Región de reconocimiento de los cebadores utilizados para el genotipado de los ratones transgénicos. El cebador Int1-Fw se une a la región del intrón 1, mientras que el cebador LaR3-Rv lo hace en la secuencia En2SA del vector, e Int1-Rv a la región del intrón 1 que queda por detrás (3’-cadena abajo) de la cassette transgénica. Cabe destacar que la pareja de cebadores Int1Fw-In1Rv reconoce un fragmento de mayor tamaño en los animales que han incorporado la cassette; sin embargo, debido a las condiciones del programa de PCR (1 min de extensión) este fragmento no se amplificó. Resultados y Discusión 87 Figura 14. Genotipado mediante PCR de los ratones transgénicos con los cebadores Int1-Fw, Int1-Rv y LaR3-Rv. Se puede observar la presencia de ratones Gls2tm1a/+ (2, 3, 4, 6, 7, 9, 10) y Gls2+/+ (5 y 8) en la camada. Los controles utilizados fueron: DNA genómico de animal WT (11), el vector de transgénesis (12) y agua como control de contaminación (13). Se indica la banda WT y la correspondiente a la amplificación de la cassette transgénica (Mut). (1) Marcador de masa molecular GeneRuler 50 bp DNA Ladder. 7. Análisis de viabilidad de ratones homocigotos Gls2tm1a/tm1a Se realizaron múltiples cruces entre animales Gls2tm1a/+ sin llegar a obtenerse la modificación en homocigosis, pese a que la proporción de animales WT y HT se ajustaba a una distribución mendeliana. Puesto que el vector de transgénesis sigue una estrategia denominada “KO first allele”, al integrarse en el genoma se generará un alelo nulo como consecuencia de la presencia de una secuencia aceptora de ayuste (En2Sa), que bloquea el proceso de transcripción, y de una señal de poliadenilación (pA) del virus SV40, que trunca el transcrito. Aunque se han descrito casos en los que animales homocigóticos tm1a/tm1a son viables y pueden, de hecho, utilizarse como modelos KO de estudio (Li et al., 2014), la persistente ausencia de crías Gls2tm1a/tm1a tras múltiples cruces entre HT nos obligó a concluir que, en nuestro caso, la modificación en homocigosis resulta letal, si bien no podemos determinar si el problema se encuentra en el papel de esta isoforma durante el desarrollo embrionario. Para analizar si los homocigotos morían durante el periodo de gestación, se sacrificaron 3 ratones a día 10, 12 y 15 de gestación y se examinó si había reabsorciones fetales (fetos evanescentes). La Fig. 15 demuestra que no se observó pérdida fetal y el genotipado de los fetos restantes determinó que todos eran WT o HT. Resultados y Discusión 94 Figura 23. Diferencias en el número de copias de mRNA de KGA, GAB y LGA en hígado y cerebro de ratón. La isoenzima KGA es la más abundante en cerebro, siendo 15 veces superior a la suma de los transcritos GLS2. En hígado, la isoforma GLS2 mayoritaria es GAB (11 veces superior a LGA), mientras que los niveles de KGA son prácticamente nulos (Martín-Rufián et al., 2012). Se llevó a cabo una cuantificación relativa de mRNA comparando la expresión de GAB y LGA en Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ respecto los animales WT (n=6 por genotipo), expresándose la variación como un incremento o disminución en la expresión. Como gen constitutivo normalizador se utilizó la ß-actina, dado que en los tres genotipos analizados el ciclo umbral (Ct) al que empezó a detectarse fue similar (en torno al ciclo 20-23, dependiendo de la réplica), se consideró un buen gen constitutivo para nuestro estudio. Esta misma metodología y gen constitutivo fue la empleada en la cuantificación de los transcritos GLS en ratones KO (Gls-/-) para dicho gen (Masson et al., 2006). Mientras que no se detectaron cambios significativos entre los animales WT y los Gls2tm1c/+, los ratones Gls2tm1a/+ mostraron una disminución significativa en cerebro de los niveles de mRNA de GAB (**p=0.0038, Kruskal-Wallis) y LGA (**p=0.0011, Kruskal-Wallis) y del transcrito GAB en hígado (**p=0.0026, KruskalWallis)(Fig. 24). Se puede concluir que la incorporación de la cassette transgénica en heterocigosis, con la consecuente interrupción de la transcripción, conlleva a una disminución de aproximadamente el 50% de las isoformas GLS2 en el genotipo Gls2tm1a/+ vs las colonias Gls2tm1c/+ y WT . Figura 24. Niveles de mRNA de GAB y LGA en cerebro e hígado de animales Gls2tm1a/+ vs WT y Gls2tm1c/+. Hay una disminución significativa en los niveles de transcritos GLS2 en cerebro Resultados y Discusión 95 en los animales Gls2tm1a/+ en comparación con los animales WT y Gls2tm1c/+, mientras que en hígado sólo se redujo apreciablemente la isoforma GAB (n=6/genotipo; **p<0.005). 9.2 Análisis de expresión de isoenzimas GA en animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ mediante inmunotransferencias Western Se realizó un análisis de expresión de la proteína GAB por inmunotransferencia Western para evaluar las posibles diferencias a nivel de proteína en los tres genotipos. Para ello se utilizaron anticuerpos isoenzimaespecíficos anti-GAB, desarrollados en nuestro laboratorio (Fig. 25). Como control positivo se utilizó proteína GAB humana recombinante purificada (CamposSandoval et al., 2003). Figura 25. Inmunotransferencia Western de GAB en hígado (panel izquierdo) y cerebro (panel derecho) de animales WT (n=6), Gls2tm1a/+ (tm1a, n=6) y Gls2tm1c/+ (tm1c, n=6). Se realizó un análisis cuantitativo de GAB (66 kDa) mediante densitometría, utilizando como control de carga GAPDH (36 kDa). No se vieron diferencias significativas entre los genotipos analizados. En ambos paneles, la calle no rotulada corresponde al control positivo de proteína GAB humana recombinante. No se observaron diferencias significativas entre los grupos analizados en ninguno de los dos tejidos (ANOVA p=0.99) (Fig. 26). Por tanto, la conclusión del análisis conjunto de expresión de mRNA y proteína GAB, codificada por el gen Gls2, es que no existe una correlación entre los niveles de transcrito (que se reducen significativamente) y proteína (que se mantienen esencialmente invariables) en el genotipo Gls2tm1a/+. Diferentes mecanismos postranscripcionales y/o postraduccionales pueden explicar esta falta de correlación que, por otra parte, ha sido frecuentemente detectada en un gran número de análisis masivos de expresión de genes de mamíferos (véase, como ejemplo, Pradet-Balade et al., 2001). Además, conviene resaltar que en estudios de expresión de GA en cerebro Resultados y Discusión 96 de ratones sometidos a protocolos de adicción a cocaína ya se observó una marcada disociación entre niveles de mRNA y proteína (Blanco et al1., 2012). Por último, en el segundo bloque de resultados de esta memoria, en la caracterización de un modelo transgénico KO para el receptor del ácido lisofosfatídico LPA1, volveremos a encontrarnos con esta disociación para la isoforma KGA, codificada por el gen Gls. WT tm1a/+ tm1c/+ WT tm1a/+ tm1c/+ 0.0 0.5 1.0 1.5 Cerebro Hígado GAB/GAPDH Figura 26. Diferencias en el nivel de proteína GAB (normalizada frente a GAPDH) entre animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ en cerebro e hígado. En cerebro, los animales WT presentaron un valor GAB/GAPDH medio de 1±0.05, los Gls2tm1a/+ de 1±0.02 y los animales Gls2tm1c/+ de 1±0.06. En hígado, la media de WT fue de 1±0.15, en Gls2tm1a/+ de 1±0.07 y en Gls2tm1c/+ de 0.9±0.13. Los valores son media ± SEM (n = 6 animales por cada genotipo). 9.3 Análisis de expresión de isoenzimas GA en colonias WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+ mediante cuantificación de la actividad enzimática Como se ha indicado, las medidas de actividad GA se realizaron en los tres genotipos analizados (Tabla 3 y Fig. 27), además de llevar a cabo dos valoraciones diferentes, una en presencia de Glu (inhibidor competitivo de las isoenzimas GLS) y otra en su ausencia (en la tabla 3 se representan los valores obtenidos en los ensayos sin Glu). Resultados y Discusión 97 Tabla 2. Medidas de actividad GA (expresadas como mU/mg de proteína) en hígado y cerebro de los tres genotipos analizados (*p=0.022; Los valores se muestran como media ± SEM) Actividad GA en cerebro (mU/mg) Actividad GA en hígado (mU/mg) WT 15.6±2.5 11,2±2.6 Gls2tm1a/+ 10.8±2.6 9.3±1.1 Gls2tm1c/+ 14±0.75 18.2±2.2* En hígado, la actividad GA (medida en ausencia de Glu) mostró diferencias significativas entre los genotipos analizados (*p=0.022, ANOVA). Mediante un análisis post-hoc (LSD de Fisher) se distinguen dos grupos que difieren entre sí, WT vs Gls2tm1c/+ y Gls2tm1a/+ vs Gls2tm1c/+ (Tabla 3, Fig. 27). Al comparar los resultados obtenidos en las medidas de actividad GA en hígado en presencia y ausencia de Glu, no se observan diferencias significativas, lo que confirma el papel de GLS2 como isoenzima principal en este órgano (la ausencia de disminución en la actividad en presencia de Glu atestigua la carencia de isoenzimas GLS). En cerebro, las diferencias de actividad entre genotipos no fueron significativas (p= 0.68, Kruskal-Wallis) (Tabla 3 y Fig. 27). Sin embargo, en este caso el tratamiento con Glu conlleva una inhibición total de la actividad GA en cerebro, (***p<0.0001, t-test). Estos resultados confirman que la KGA es la isoenzima principal en cerebro de ratón, como se ha detallado previamente (Olalla et al., 2002; Martín-Rufián et al., 2012). Resultados y Discusión 98 Figura 27. Actividad GA (mU/mg) en cerebro e hígado de animales WT, Gls2tm1a/+ y Gls2tm1c/+. Los valores corresponden a ensayos realizados en ausencia de Glu. En hígado se observaron diferencias significativas entre los tres genotipos analizados (*p=0.022). Los valores se representan como media ± SEM (n = 6 animales por genotipo). En principio, podrían esperarse diferencias entre WT y el genotipo Gls2tm1a/+ y valores equivalentes de actividad GA entre WT y el genotipo Gls2tm1c/+; sin embargo, cabe destacar que en los estudios fenotípicos el fondo genético de los animales es de especial importancia. Jackson Laboratory tiene disponible una base de datos con diferencias entre distintas cepas de animales, y aunque aún no hay registrada información referente a la actividad enzimática GA, varios grupos de investigación sí han confirmado este hecho para otras enzimas. Por ejemplo, se ha visto una mayor actividad de la enzima alcohol deshidrogenasa en hígado de animales C57BL/6 (41 U/g) comparados con DBA/2J (23 U/g) y con cepas híbridas, que obtenían medidas intermedias (Balak et al., 1982). Se han descrito resultados similares en cuanto a la actividad de la enzima málica al comparar animales C57BL/6 y DBA/2J (Coleman & Kuzava, 1991). Tras el estudio realizado a nivel de mRNA, proteína y actividad enzimática, se determina la necesidad de obtener el homocigoto Gls2tm1c/tm1c como modelo murino a caracterizar, tanto por la posible acción compensatoria del alelo WT en la función GA, como por el efecto que conlleva trabajar con diferentes cepas a la hora de realizar estudios comparativos, siendo necesario establecer un fondo genético homogéneo. Resultados y Discusión 99 10. Cruce de la colonia Gls2tm1c/tm1c con animales que expresan la Cre recombinasa Actualmente hemos fijado la colonia de ratones que expresan la recombinasa Cre bajo un promotor de sinapsina de rata (específico de cerebro) (Fig. 28). La expresión comienza a día embrionario 11.5 (E11.5) para alcanzar un pico a E12.5, tanto en neuronas de corteza, hipocampo, diencéfalo (hipotálamo, tálamo, subtálamo, epitálamo y III ventrículo), médula espinal, como en algunas células de Purkinje de cerebelo (Ma et al., 1999; Zhu et al., 2001). Figura 28. Genotipado mediante PCR de los ratones que expresan la recombinasa Cre con los cebadores Cre-Fw y Cre-Rv. Se puede observar la banda correspondiente al transgén de 100 pb en la mayoría de los animales de la colonia analizada. Como marcador de masa molecular se utilizó GeneRuler 50 bp DNA Ladder. Cuando se obtengan los ratones homocigotos Gls2tm1c/tm1c, los cruzaremos con los animales que expresan la recombinasa Cre bajo el promotor de sinapsina, lo que permitirá obtener un animal KO (Gls2-/-) para el gen Gls2 en cerebro, concretamente en las regiones donde se ha visto una mayor expresión de esta isoenzima: corteza, hipocampo, cerebelo (Olalla et al., 2012), permitiendo elucidar la función cerebral de estas isoenzimas GLS2. Resultados y Discusión 100 PARTE II: CARACTERIZACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE ISOENZIMAS GA EN EL MODELO MURINO KOLPA1 1. Inmunohistoquímica de isoformas GA en animales KOLPA1 Con el fin de analizar el efecto que el silenciamiento del receptor LPA1 puede tener en la expresión de las isoenzimas GA en cerebro, se llevó a cabo un análisis de la expresión de KGA y GLS2 (GAB y LGA) mediante inmunohistoquímica. Los anticuerpos anti-KGA empleados son específicos de esta isoforma, ya que están dirigidos contra la región C-terminal, y por tanto, no reconocen la isoforma GAC. Los anticuerpos anti-GAB utilizados reconocen ambas isoformas, GAB y LGA (Olalla et al. 2002; Campos et al. 2003; Olalla et al. 2008; Cardona et al. 2015). El marcaje obtenido con los anticuerpos anti-KGA mostró una localización citoplasmática de aspecto punteado, típica mitocondrial, de acuerdo con resultados previos de localización de KGA en cerebro de mamíferos (Olalla et al., 2002; Cardona et al., 2015). Sin embargo, cabe destacar diferencias en la intensidad del marcaje en varias regiones cerebrales al comparar entre los genotipos analizados. Se observa una clara disminución de la expresión de KGA en corteza e hipocampo de animales HT (Fig. 29, B,E,H,K) y KOLPA1 (Fig.29 C,F,I,L) en comparación con las mismas áreas de cerebros WT (Fig.29 A,D,G,J). Concretamente, las regiones más afectadas fueron: las neuronas piramidales de la región CA3 y el neuropilo del estrato lacunoso-molecular de CA1 de hipocampo, y el giro dentado (Fig.29 J,K,L). En cerebelo, no se observaron cambios en la expresión de KGA. Las diferencias observadas en la intensidad del marcaje fueron graduales desde animales WT a KOLPA1, lo que podría implicar una reducción proporcional en los niveles de la isoforma KGA cuando los niveles del receptor LPA1 disminuyen. Asimismo, se detectó un cambio en el marcaje perivascular en los animales con menor expresión de LPA1, especialmente en KOLPA1 (Fig.29 M,N,Ñ). La disminución en los niveles de expresión de KGA, la isoenzima GA más abundante en tejido cerebral (Blanco et al., 2012; Martín-Rufián et al., 2012), fue completamente inesperada y no puede explicarse en base a resultados previos que Resultados y Discusión 101 han demostrado alteraciones en el cerebro de estos animales KOLPA1. Así, por ejemplo, se ha publicado previamente que los animales KOLPA1 presentan una reducción de neuronas corticales, pero dicho descenso sólo ocurre en las capas I/III, V y VI de la corteza cerebral (Estivill-Torrús et al., 2008), por lo que resulta insuficiente para justificar la reducción detectada de la proteína KGA en corteza y resto de regiones, particularmente hipocampo. De forma análoga, se ha descrito una menor neurogénesis en el giro dentado de los ratones KOLPA1 (Matas-Rico et al., 2008), que podría contribuir parcialmente al déficit de KGA en esta subregión cerebral, pero que, sin duda, no explica el silenciamiento de la expresión de KGA en otras regiones hipocampales. Resultados y Discusión 102 Fig 29. Localización inmunohistoquímica de KGA en animales WT, heterocigotos (HT) y KOLPA1. Se puede observar una reducción progresiva en el marcaje de KGA de animales WT a KOLPA1, con un fenotipo intermedio en los HT. (A-C) Panorámica de la corteza (Cx) y estriado (Str), las flechas indican vasos sanguíneos inmunorreactivos para KGA. (D-F) Detalle del cambio progresivo en el marcaje perivascular de la corteza insular. (G-I) Panorámica del hipocampo, las flechas indican los cambios en el marcaje de CA1 y CA3. (J-L) Disminución en el marcaje del slm y Resultados y Discusión 103 DG en HT y KOLPA1 y en neuronas de CA3. (M-Ñ) En áreas subtalámicas, cerca del III ventrículo se observa un cambio en el marcaje perivascular en animales KOLPA1. En cerebelo no se observaron diferencias (no se muestran resultados de esta región). Cx, corteza; Str, estriado; VS, vaso sanguíneo; CA1, CA3 subcampos hipocampales; sp estrato piramidal; slm, estrato lacunosomolecular; DG, giro dentado; m, capa molecular; 3V, tercer ventrículo. Barras de escala: A-C, 1 mm; D-F, 100 µm; detalle D, 25 µm; detalle E, 40 µm; J-L, 500 µm; M-Ñ 200 µm. En contraposición con KGA, los patrones de inmunomarcaje frente a las isoformas GLS2 fueron esencialmente idénticos para los tres genotipos de animales estudiados (Fig. 30). No se detectaron cambios aparentes en la expresión de GLS2 en las diferentes regiones cerebrales analizadas por inmunohistoquímica, tales como corteza, estriado (Fig. 20 A-C), hipocampo (Fig. 30 D-F) o cerebelo (Fig. 30 G-I). La inmunotinción GLS2 reveló un patrón distintivo con relación a KGA, mostrando un marcaje característico mayoritariamente nuclear, de acuerdo con resultados previos de inmunolocalización de GLS2 en cerebro de mamíferos (Olalla et al., 2002; Cardona et al., 2015). Resultados y Discusión 110 Figura 34. Tinción de Golgi-Cox de las dendritas basales de neuronas piramidales de CA1 en animales WT(A-D) y KOLPA1 (E-H). (A) Panorámica de neurona piramidal de animal WT, y (B) detalle de la dendrita indicada. (C y D) Dendritas secundarias de animales WT. (E) Panorámica de neurona piramidal de animal KOLPA1, los detalles se muestran en las figuras F y G. (H) Espinas dendríticas de un animal KOLPA1. Las espinas dendríticas de los animales KOLPA1 tienen una morfología más alargada y delgada en comparación con los WT. Barra de escala: Panorámias (A y E) 10 μm; B-D y F-H 5 μm. Se realizaron diferentes medidas, entre ellas la densidad de espinas dendríticas, que se valoró como el número de espinas por cada 10 μm de longitud, en dendritas secundarias y terciarias. Aunque no se observaron diferencias significativas en este parámetro, ni en el ancho de la dendrita de animales WT y KOLPA1 (p valor=0.097 y 0.086 respectivamente, t-test), sí se observaron alteraciones morfológicas en las espinas dendríticas. Posteriormente, se llevo a cabo un análisis morfométrico que reveló la presencia de un mayor número de espinas alargadas, delgadas y de recorrido más Resultados y Discusión 111 tortuoso (giros y dobleces) en los animales KOLPA1 (Fig. 34, E-H) en comparación con los WT (Fig. 34, A-D), características de estadios inmaduros (Ebrahimi & Okabe, 2014). Se cuantificaron el número de espinas por subtipo (champiñón, delgadas, cortas y filopodia) y genotipo, observándose una mayor frecuencia de las tipo filopodia en ratones KOLPA1 (***p=0.004, t-test) en detrimento de las tipo champiñón y cortas (Fig. 35). Además, la longitud de las espinas dendríticas reveló diferencias significativas (***p=0.0004, Mann-Whitney), con un aumento en el subtipo delgada en los ratones KOLPA1 (*p=0.0104, Mann-Whitney) (Fig. 35). Otro de los parámetros que también se alteró fue el diámetro de la cabeza de la espina dendrítica, concretamente en las espinas tipo champiñón con un menor tamaño en los KOLPA1 (***p< 0.0001, Mann-Whitney). Figura 35. Diferencias en las longitudes de las espinas dendríticas y en la distribución morfológica de éstas en animales WT y KOLPA1. Se observaron diferencias significativas en la longitud de las espinas dendríticas entre animales WT (1.4±0.9) y KOLPA1 (1.9±1.1), y una mayor frecuencia de espinas tipo filopodia en los KOLPA1 en detrimento de las espinas tipo champiñón y cortas. En promedio, más de 60 espinas de cada genotipo fueron analizadas (***p<0.0004). Por último, en este análisis por tinción de Golgi-Cox, comparamos las longitudes de los distintos subtipos de espinas entre genotipos (Tabla 3). Se encontraron diferencias significativas para las espinas delgadas al comparar los animales WT vs KOLPA1 (*p=0.0104, Mann-Whitney). Resultados y Discusión 112 Tabla 3. Análisis de las longitudes de los subtipos de espinas dendríticas en la región CA1 hipocampal de animales WT y KOLPA1. Los datos representan la media de los rangos de longitudes±SEM. Se indica el número espinas dendríticas analizado para cada genotipo(n=123 WT; n=104 KOLPA1) (*p=0.0104, Mann-Whitney). Subtipo de espina dendrítica WT (n=123) KOLPA1 (n=104) Champiñón 0.8-2 ±0.3 0.78-2±0.28 Delgada* 0.86-2.76±0.44 1.24-3.6±0.5 Corta 0.3-0.9±0.1 0.4-0.9±0.1 Filopodia 1.13-5.5±1.4 1.22-5.3±1.16 Estos resultados sugieren que la formación y/o maduración de las espinas dendríticas de las neuronas piramidales de hipocampo está desregulada en el modelo KOLPA1. Está bien documentado el papel modulador de LPA en la formación de sinapsis a través de la modulación de la dinámica estructural de las espinas dendríticas. Por ejemplo, en cultivos de neuronas de hipocampo el receptor LPA1 se localiza de manera punteada en las espinas dendríticas y su sobreexpresión conlleva un incremento de la densidad y tamaño de las espinas (Pilpel & Segal, 2006). Nuestra hipótesis, a tenor de los resultados aquí descritos, en la región CA1 del hipocampo es que los animales KOLPA1 poseen cambios morfológicos en las espinas de sus principales sinapsis excitatorias. Los resultados de la tinción de Golgi-Cox muestran unas espinas dendríticas hipocampales con un marcado fenotipo inmaduro en el genotipo KOLPA1. 6. Análisis de la expresión de marcadores proteicos de espinas dendríticas Para identificar la base molecular que subyace al cambio morfológicoestructural de las espinas dendríticas, investigamos si existían alteraciones en los perfiles de expresión proteica de marcadores dendríticos conocidos y de proteínas bien caracterizadas por su papel en la formación y modulación de las sinapsis establecidas entre espinas. Se examinaron diferentes marcadores como la proteína de la densidad postsináptica 95 (PSD-95) (marcador post-sináptico) y una proteína de vesículas, sinaptofisina (Syn; marcador presináptico). El análisis mediante Resultados y Discusión 113 inmunotransferencias Western de ambas proteínas no demostró ninguna variación significativa en sus niveles de expresión entre animales WT y KOLPA1 (Fig. 36 y 37). Figura 36. Análisis de la expresión de marcadores de espinas dendríticas por inmunotransferencias Western. Se llevó a cabo un análisis cuantitativo por densitometría de PSD-95 (105 kDa) y Syn (42 kDa), empleando como control de carga GAPDH. WT KOLPA1 WT KOLPA1 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 Corteza Hipocampo PSD95/GAPDH WT KOLPA1 WT KOLPA1 0.0 0.5 1.0 1.5 Corteza Hipocampo Syn/GAPDH Figura 37. Expresión de PSD-95 y Syn en corteza e hipocampo de animales WT y KOLPA1. A pesar de los cambios observados en la morfología de las espinas dendríticas, con un fenotipo más inmaduro en los KOLPA1, no hay diferencias significativas en los marcadores proteicos analizados entre WT y KOLPA1. 7. El silenciamiento génico de LPA1 reduce la expresión y actividad gelatinasa MMP-9, pero no la MMP-2 Las metaloproteinasas de matriz han atraído recientemente mucha atención como importantes moduladores de la morfología de las espinas dendríticas, junto con otras proteínas constitutivas que se conoce participan en la formación de las sinapsis. Dado el importante papel que ejerce la metaloproteinasa de matriz 9 (MMP-9) en la potenciación a largo plazo, favoreciendo el alargamiento y contacto Resultados y Discusión 114 de las espinas dendríticas (Michaluk et al., 2011; Dziembowska & Wlodarczyk, 2012) (véase Fig. 38), se analizó la actividad de las metaloproteinasas MMP-2 y MMP-9 en corteza e hipocampo, con la finalidad de ver si los ratones KOLPA1 presentaban alguna alteración como base molecular de sus problemas cognitivos y de memoria. Con esta finalidad, se analizó medio hemisferio de ambos genotipos (WT n=8 y KOLPA1 n=11) mediante zimografía en gelatina, observándose diferencias en los niveles de actividad proteolítica de MMP-9 en ambas regiones cerebrales (con una disminución significativa en los animales KOLPA1, ***p< 0.0001), mientras que los niveles de MMP-2 permanecían estables (Fig. 39). Figura 38. Modo de actuación de MMP-9. Tras un estímulo, MMP-9 se libera al medio extracelular donde se activa y ejerce su acción a través de integrinas-β1 promoviendo cambios en el citoesqueleto, que conllevan a la elongación de las espinas dendríticas y reorganización de los receptores NMDA (Michaluk et al., 2011). Esta activación es breve, y rápidamente se inactiva por el inhibidor tisular de metaloproteinasas 1 (TIMP-1), lo que permite la maduración de las espinas y la formación de sinapsis activas (Wang et al., 2008; Dziembowska et al., 2013; Stawarski et al., 2014). Durante la maduración de las espinas se establecen morfologías asociadas con una mayor estabilidad, y mayor densidad postsináptica, como las espinas tipo champiñón (Hotulainen & Hoogenraad, 2010). Imagen tomada de Dziembowska et al., 2013. Resultados y Discusión 115 WT KOLPA1 WT KOLPA1 0 50 100 150 Corteza Hipocampo Actividad proteolítica MMP-2 (% vs WT) Figura 39. Zimograma de MMP-2 y MMP-9 en corteza e hipocampo de animales WT y KOLPA1. Se analizó medio hemisferio de animales WT (n= 8) y KOLPA1 (n=11) para estudiar la actividad de MMP-9 y MMP-2. Se observaron diferencias significativas en la actividad proteolítica de MMP-9 en ambas regiones cerebrales, con un descenso en la actividad de los KOLPA1 (***p<0.0001), mientras que no se observaron cambios en la actividad de MMP-2. Para comprobar si la reducida actividad MMP-9 observada en los animales KOLPA1 se debía a una disminución de la expresión proteica, realizamos inmunotransferencias Western para evaluar los niveles de MMP-9 (tanto el zimógeno, 92 kDa, como la proteína activa, 82 kDa) en corteza cerebral e hipocampo. Los resultados obtenidos (Fig. 40) mostraron una disminución en la expresión de MMP-9 activa en los animales KOLPA1 comparado con los WT (*p<0.05), mientras que no se observó variación en los niveles del zimógeno. Resultados y Discusión 116 Figura 40. Inmunotransferencia Western de pro-MMP9 y MMP-9 en corteza cerebral e hipocampo de animales WT (n=4) y KOLPA1 (n=5). Se realizó un análisis cuantitativo de MMP9 pro-activa (92 kDa) y activa (82 kDa) mediante densitometría usando β-actina como control de carga. Los animales KOLPA1 mostraron una reducción en los niveles de MMP-9 activa (*p<0.05). Por último, se evaluó la actividad proteolítica del activador tisular de plasminógeno (tPA), encargado de catalizar el paso de plasminógeno a plasmina, donde la última actúa como potente activador de las MMPs (Van Wart & BirkedalHansel, 1990). Aunque el sistema tPA/plasmina ha sido implicado en numerosos aspectos de la función cerebral, incluyendo la remodelación de las dendritas en hipocampo (Pawlak et al., 2015) y corteza visual (Mataga et al., 2014) de ratón, además de participar en la activación proteolítica de MMP-9 desde su forma zimógena (Wang et al., 2008), no se observaron diferencias significativas en su actividad entre animales KOLPA1 y WT ni en corteza ni en hipocampo (Fig. 41). Resultados y Discusión 117 Figura 41. Zimograma de tPA en corteza e hipocampo de animales WT (n=4) y KOLPA1 (n=6). El análisis por densitometría de la actividad tPA no reveló diferencias entre animales KOLPA1 y WT. Los resultados obtenidos apuntan a una participación significativa de la señalización LPA en la activación de MMP-9. Se ha descrito una relación entre LPA y MMP-9 en células de carcinoma hepatocelular, donde el LPA extracelular sintetizado por ATX, a través de su unión al receptor LPA1, es capaz de activar diferentes cascadas que llevan a la inducción de la expresión de MMP-9, entre las que destacan la vía PI3K/Akt y PKC/MPAK (Park et al., 2010). Estos antecedentes concuerdan con nuestros resultados en ratones deficientes para el receptor LPA1 que experimentan una disminución en la actividad MMP-9. Sin embargo, los niveles de zimógeno no varían, disminuyendo exclusivamente los de MMP-9 activa, lo que podría implicar la actuación de terceros en esta vía. La plasmina es un inductor natural poco eficiente de MMP-9, pero puede activar a otras MMPs, como MMP-3, que ejerce una potente acción catalítica sobre pro-MMP9 (RamosDeSimone et al., 1999). Así pues, podemos hipotetizar un posible papel de LPA1 sobre la activación de MMP-9, que a su vez actuaría en la potenciación a largo plazo y en la adquisición de aprendizaje espacial, función en la que también se ha visto implicada MMP-3 (Meighan et al., 2006). Resultados y Discusión 118 Por otra parte, la implicación de MMP-9 (Rivera et al., 2010; Michaluk et al., 2011), y otras proteasas extracelulares como tPA (Mataga et al., 2004), en la remodelación de sinapsis, plasticidad sináptica y procesos cognitivos está ampliamente documentada. En neuronas, MMP-9 está localizada en los dominios postsinápticos de las sinapsis excitatorias; su inhibición se ha relacionado con déficits de memoria en paradigmas de aprendizaje comportamental (Nagy et al., 2007). Y, por supuesto, como ya se ha mencionado, MMP-9 es un regulador clave de la morfología de las espinas dendríticas (Michaluk et al., 2011; Dziembowska & Wlodarczyk, 2012). Los resultados mostrados aquí sobre MMP-9 sugieren que la reducción de su actividad en ratones KOLPA1 podría deberse, al menos parcialmente, a una disminución de la forma activa provocada por mecanismos postraduccionales (disminución de su procesamiento proteolítico a forma activa o directa modificación de algún residuo sobre la proteína madura). La reducción de la actividad MMP-9 podría explicar cambios a corto plazo de la plasticidad sináptica (con repercusión sobre las propiedades cognitivas y de memoria), debido a la ausencia de un adecuado proceso de remodelado de las espinas dendríticas en las neuronas hipocampales, y como parte del fenotipo neurofisiológico mostrado por los animales KOLPA1. No obstante, MMP-9 ejerce una función dual en la morfología de las espinas: mientras que niveles locales basales de actividad MMP-9 promueven el alargamiento de las espinas y la potenciación sináptica concomitante (Wang et al. 2008), un exceso de actividad MMP-9, como las que acontecen en situaciones patológicas como el infarto o la epilepsia, provoca la transformación de las espinas dendríticas desde el tipo champiñón hasta protrusiones tipo-filopodio (fenotipo inmaduro) (Bilousova et al., 2009); de hecho, la inhibición de este incremento no transitorio de actividad MMP9 provocó la remodelación de las espinas dendríticas hacia el fenotipo maduro tipo champiñón (Bilousova et al., 2009). De esta forma, nuestros resultados indican que una actividad MMP-9 reducida podría surgir como un efecto cadena-debajo de la ausencia de señalización Rho/ROCK inducida por LPA1, ruta que se conoce produce la activación de enzimas proteolíticas como MMP-9 (Yu et al., 2014). Como una consecuencia, la falta de plasticidad sináptica, provocada por la remodelación de las espinas hipocampales ejercida por MMP-9, podría explicar los déficits Resultados y Discusión 119 cognitivos y de memoria mostrados por los animales KOLPA1. Sin embargo, otros autores han encontrado que la morfología de las espinas dendríticas se afecta por LPA1 pero de manera independiente de sus tres principales cascadas de señalización, sugiriendo alternativamente que este efecto fue debido a interacciones con otras proteínas (el receptor LPA1 tiene un módulo de reconocimiento de proteínas PDZ en su región C-terminal) (Pilpel & Segal, 2006). 8. Función de las isoenzimas GA en el desarrollo y la diferenciación neuronal Por último, aunque se desconoce el mecanismo postranscripcional por el que LPA1 lleva al silenciamiento de KGA en cerebro, la disminución de esta isoforma puede originar alteraciones en el desarrollo de las neuronas corticales e hipocampales que, seguidamente, pueden contribuir a notables déficits en el crecimiento de neuritas, axones y en la maduración de espinas dendríticas. De hecho, KGA se ha asociado a diferenciación neuronal y proliferación de células neuronales. Ambas isoformas GLS (KGA y GAC) aumentan durante la neurogénesis de células progenitoras neurales humanas (NPCs), y su patrón de expresión correlaciona positivamente con el marcador neuronal MAP-2 (proteína asociada al microtúbulo-2) (Wang et al., 2014). Hay que destacar que estudios realizados con cultivos de NPCs humanas mediante silenciamiento génico de GLS con siRNA, sugieren un papel crítico de las isoformas GLS en la proliferación y supervivencia de NPCs (Wang et al., 2014). Más aún, la inhibición de la actividad GA en cultivos de neuronas corticales embrionarias de ratón provocó inhibición de la neurogénesis (Velletri et al., 2013), mientras que los niveles de mRNA y proteína KGA aumentaron de forma notable cuando células granulares del cerebelo se diferencian en cultivo (Thomas et al., 1989). Este último estudio también demostró una sobre-expresión de KGA, en paralelo con la liberación de Glu dependiente de Ca2+ y la formación de neuritas, vesículas sinápticas y sinapsis (Thomas et al., 1989). En los últimos años, se ha puesto de manifiesto la implicación de KGA en la reprogramación metabólica subyacente a la diferenciación neuronal. Así, durante la diferenciación ex vivo de neuronas corticales primarias, el ciclo Glu/Gln aumentó Anexo I 127 1. Medios de cultivo para bacterias Medio LB (Luria-Bertani) Extracto de levadura 5 g Bactotriptona 10 g NaCl 10 g El pH se ajustó a 7.4 y el volumen a 1 litro. A continuación se esterilizó en autoclave. LB-Agar Extracto de levadura 2.5 g Bactotriptona 5 g NaCl 5 g Agar 7.5 g El pH se ajustó a 7.4 y el volumen a 500 ml. Se esterilizó en autoclave. Se dejó enfriar hasta aproximadamente 50ºC y se añadió la ampicilina a una concentración de 50μg/ml. 2. Medios y soluciones para el cultivo de células de mamífero Medio EF Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 4500 mg/l glucosa, glutaMAX, y 110 mg/L piruvato sódico) FBS 10% (v/v) Penicilina/Estreptomicina 1 mM Glutamina 2 mM Aminoácidos no esenciales 1 mM Medio ES Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; 4500 mg/l glucosa, glutaMAX, y 110 mg/L piruvato sódico) FBS 15% (v/v) Penicilina/Estreptomicina 1 mM Glutamina 2 mM Aminoácidos no esenciales 1 mM Anexo I 128 β-mercaptoetanol 1 mM Factor inhibidor de leucemia (LIF) 1000 U/ml PBS 10x NaH2PO4.H2O 2.28 g KCl 4.6 g Na2HPO4.2H2O 16.6 g NaCl 87.7 g El pH se ajustó a 7.4 y el volumen a 1 litro. Se esterilizó en autoclave. 3. Soluciones para DNA TAE 50x Tris Base 242 g Ácido acético glacial 57.1 ml EDTA 0.5 M 100 ml Se utilizó EDTA 0.5M (pH 8) previamente esterilizado en autoclave. Se ajustó el volumen a 1 litro. TBE 10x Tris Base 121.1 g Ácido bórico 52.3 ml EDTA 0.5 M 20 ml Se utilizó EDTA 0.5M (pH8) previamente esterilizado en autoclave. Se ajustó el volumen a 1 litro. TE Tris 1M 2.5 ml EDTA 0.5 M 0.5 ml Se utilizó EDTA 0.5M (pH8) y Tris 1 M (pH 8) previamente esterilizados en autoclave. El volumen se ajustó a 250 ml. STES (Tampón de extracción de DNA) TrisHCl (pH 8) 50mM NaCl 20 mM EDTA 1 mM Anexo I 129 SDS 0.1 % Denhardt’s 50x Polivinilpirrolidona 1% (p/v) Ficoll 1% (p/v) BSA 1% (p/v) Se esterilizan con autoclave los dos primeros en un pequeño volumen y luego se añade la disolución de albúmina esterilizada por filtración hasta completar 500 ml. Se hacen alícuotas que se mantienen hasta su utilización a -20ºC. 4. Soluciones para RNA MOPS 10x MOPS 0.2 mM NaC2H3O2 80 mM EDTA 10 mM Para la preparación de geles desnaturalizantes se utilizó agarosa al 1.5% (p/v) en 40.66 ml de agua. Cuando la temperatura descendió se añadieron 5 ml de tampón MOPS 10x, 3.34 ml de formaldehido 37% (p/v) y RedSafe 1x. El tampón de muestra se preparó mezclando 720 μL de formamida, 160 μL de formaldehído 37% y 180 μL de MOPS 10x. Una vez se prepararon las muestras, la mezcla se desnaturalizó 15 min a 62ºC y se enfrió 1 min en hielo. 5. Soluciones para proteínas Tampón de carga de proteínas 6x Glicerol 36% (v/v) Azul de bromofenol 0.012% (p/v) β-mercaptoetanol 5% (v/v) SDS 10% (p/v) Tris-HCl (pH 6.8) 350 mM Tampón electrolito 10x Glicina 0.19 M Tris 0.025 M SDS 0.1% (p/v) Anexo I 130 Tampón de transferencia Glicina 190 mM Tris 25 mM Metanol 20% (p/v) TBS 10x NaCl 90 g Tris 121 g El pH se ajustó a 7.5 y el volumen a 1 litro. TTBS 1x TBS 1x Tween 0.1% Anexo II 131 Validación del vector de transgénesis In2Fw: Se une al intrón 2 y en sentido 5’→3’ permite secuenciar hasta el intrón 3. Permite identificar la diana de EcoRV del fragmento de restricción de 1.2 kb. Los resultados obtenidos coinciden con la secuencia teórica tanto para la diana de la enzima de restricción, como para el fragmento secuenciado. Figura 1. Resultado de la secuenciación del vector de transgénesis con el cebador In2Fw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Anexo II 132 In5Fw: Este cebador se une al intrón 5 y permite secuenciar hasta el intrón 7. Figura 2. Resultado de la secuenciación del vector de transgénesis con el cebador In5Fw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. LacZFW: Se comprueba mediante análisis de secuencia la presencia del fragmento de 2.5 kb, ausente en la digestión con la enzima de restricción SacI. Para ello se diseña un cebador, LacZzFw, que permitirá confirmar la integridad del vector de transgénesis. Anexo II 133 Figura 3. Resultado de la secuenciación del vector de transgénesis con el cebador LazZFw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Genotipado de las células ES murinas mutantes resistentes a G418 Int1Fw y Lar3Rv: Los cebadores secuencian la región específica de la cassette transgénica. El Int1Fw reconoce al intrón 1, mientras que Lar3Rv es homólogo a la secuencia En2SA del vector. En esta secuenciación se identifican el intrón 1, la región FRT (azul) y el En2SA (rojo). Los zona de reconocimiento de los cebadores aparece subrayada. tccacctgagtgaggtagacatcctatatctttattccatagataagtaatattaagtgggcttcctaaaggcgcataacgataccacgatatc aacaagtttgtacaaaaaagcaggctggcgccggaaccgaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcgaaccc tttcccacaccaccctccacacttgccccaaacactgccaactatgtaggaggaaggggttgggactaacagaagaacccgttg Figura 4. Resultado de la secuenciación de las ES resistentes a G418 con el cebador Int1Fw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Figura 5. Resultado de la secuenciación de las ES resistentes a G418 con el cebador LaR3Rv. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Anexo II 134 NeoFw: Permite secuenciar la región correspondiente al gen neor del vector de transgénesis. Figura 6. Resultado de la secuenciación de las ES resistentes a G418 con el cebador NeoFw. En la primera línea aparece los resultados de la secuenciación y en la segunda la secuencia teórica del vector. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Ex7Fw e In7Rv: Los cebadores secuencian la zona flanqueante al sitio loxP del brazo corto de homología. A continuación se indica la zona amplificada, donde en rosa se muestra parte del exón 7 y en rojo el loxP. Subrayado aparece la zona de unión de los cebadores. ggaattccccataaccccatggtcaatgctggtgccattgtggtcagctccctgatcaaggtcagtgcatttctaaccttctgaaaggtaattt ctcaactccccttatccctacatccccatatctgttcagttctccaggcagatagggcagggggtgggggggttcctgagtcatttgagaatt aataagaggcatggaaaaaatgcatcaggaagtcctgtgagatggcgcaacgcaattaatgataacttcgtatagcatacattatacgaa gttatggtctgagctcgccatcagttcaagagccaaatgccaagggcagggggaggacaacaccatcaggc Figura 7. Resultado de la secuenciación de las ES resistentes a G418 con el cebador Ex7Fw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Anexo II 135 Figura 8. Resultado de la secuenciación de las ES resistentes a G418 con el cebador In7Fw. En la primera línea aparece la secuencia teórica esperada y en la segunda los resultados de la secuenciación. Por último, en tercera posición, la secuencia consenso. Secuenciación del fragmento correspondiente al alelo tm1c Int1Fw e Int1Rv: Los cebadores (subrayados) secuencian la región donde ha actuado la recombinasa FLP. Se confirma la secuencia única FRT que resulta tras la acción de la recombinasa (azul) y el sitio loxP (rojo). tccacctgagtgaggtagacatcctatatctttattccatagataagtaatattaagtgggcttcctaaaggcgcataacgataccacgata tcaacaagtttgtacaaaaaagcaggctggcgccggaaccgaagttcctattccgaagttcctattctctagaaagtataggaacttcgtc gagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgtcgagatatctagacccagctttcttgtacaaagtggttgatatctctatagtcg cagtaggcggttagtttctaactcactgcagacgcagaatgtgggaacagtcagacggatgctgtgtttccatctcgtccccatcctcacg ggaaacacaaagacacacaccattgctggatgcactctgtttccagtgtttgccggacatcagtacgtgcaatgatttaggaggtggctcg aaataaaggactgaaaagttcagagttccttttaaaagagactagagagtcagattggcaacctctcgcactggggtggaagttaggatc acagaacctgccagatggt Figura 9. Resultado de la secuenciación del fragmento tm1c amplificado con los cebadores Int1Fw e Int1Rv. En la primera línea aparece el resultado de la secuenciación y en la segunda la secuencia teórica esperada. En tercera posición, la secuencia consenso.