T abajo de Fin de G ado
RAQUEL MARÍA SUÁREZ LÓPEZ
Tu o izado po Ma ía Te esa Acos a Almeida y Ana Salas Pé ez
G ado en Biología. Junio 2020
E ec o de Gani elix en cul i os o gano ípicos de
miomas u e inos en p esencia de ho monas
o á icas
E ec o Gani elix on o gano ypic cul u es o
u e ine leiomyoma unde he in luence o
o a ian s e oids
ÍNDICE
Resumen ................................................................................................. 1
Abs ac .................................................................................................. 1
In oducción ............................................................................................ 3
E iología y desa ollo de los leiomiomas u e inos ........................................................ 3
T a amien os exis en es ............................................................................................... 6
Cul i os o gano ípicos pa a el es udio de leiomiomas u e inos .................................. 7
Hipó esis ................................................................................................. 8
Obje i os ................................................................................................. 9
Ma e iales y mé odos.............................................................................. 9
Ob ención de las mues as biológicas .......................................................................... 9
Cul i o o gano ípico y ensayo del á maco ................................................................ 10
Tinción his ológica ...................................................................................................... 12
Ex acción de ARN y p o eínas .................................................................................... 12
Limpieza del ARN con DNasa y cuan i icación del ARN .............................................. 14
Cuan i icación de p o eínas ........................................................................................ 14
PCR cuan i a i a (qPCR) y Wes e n Blo ..................................................................... 15
Resul ados ............................................................................................ 18
Tinción his ológica ...................................................................................................... 18
Cuan i icación de ARN y p o eínas ............................................................................. 20
Discusión ............................................................................................... 24
Conclusiones ......................................................................................... 27
Conclusions ........................................................................................... 27
Ag adecimien os ................................................................................... 28
Bibliog a ía ............................................................................................ 28
1
Resumen
Los leiomiomas u e inos son los umo es benignos más ecuen es del apa a o
ep oduc o emenino que a ec an a un g an po cen aje de muje es en edad
ep oduc i a. En ocasiones, es a pa ología p o oca la apa ición de sín omas que
educen la calidad de ida de las pacien es, po lo que es necesa io la aplicación de
a amien os que pe mi a ex i pa o educi el amaño de los miomas. La adminis ación
de an agonis as de GnRH cons i uye una de las e apias a macológicas más u ilizadas
pa a la educción de es os umo es, aunque su aplicación a ni el sis émico p o oca
e ec os secunda ios no deseados que limi an la du ación del a amien o.
Recien emen e, se ha demos ado que la aplicación de an agonis as de GnRH
di ec amen e sob e cul i os adicionales de leiomioma inhibe su c ecimien o y es imula
el p oceso apop ó ico, lo cual se debe a la capacidad de es os medicamen os de
in e ac ua de mane a compe i i a con los ecep o es de GnRH p esen es en es os
ejidos. En es e es udio, in es igamos el e ec o de Gani elix, un an agonis a de GnRH,
sob e la p oli e ación y apop osis en cul i os o gano ípicos de leiomioma bajo la
in luencia de las ho monas o á icas en condiciones isiológicas simila es a las p esen es
du an e la ase p oli e a i a y la ase sec e o a del ciclo o ula o io.
Palab as cla e: ib oma, leiomioma, cul i o o gano ípico, es ógeno, p oges e ona,
análogo de GnRH, Gani elix, apop osis.
Abs ac
U e ine leiomyomas a e he mos equen benign umo s o he emale ep oduc i e
sys em, a ec ing a la ge p opo ion o women in ep oduc i e age. Occasionally, his
pa hology causes se e e symp oms ha nega i ely a ec s he quali y o li e o pa ien s.
The e o e, he apies aimed a educing umo size o su gical emo al o umo a e
needed. GnRH an agonis s a e widely used as a non-in asi e ea men o educe he
size o myomas, al hough hey cause undesi able seconda y e ec s ha limi s hei
sys emic use o a sho pe iod o ime. Recen s udies demons a ed ha GnRH
an agonis s inhibi g ow h and igge s apop osis in leiomyoma cells unde cul u e
2
h ough compe i i e binding o GnRH ecep o s exp essed in umo issues. In his s udy,
we ied o assess he e ec o Gani elix, a GnRH an agonis , on cell p oli e a ion and
apop osis using o gano ypic cul u es o u e ine leiomyoma unde he in luence o
o a ian s e oids, simula ing he physiological condi ions o he p oli e a i e and he
sec e o y phases o he mens ual cycle.
Keywo ds: ib oid, leiomyoma, o gano ypic cul u e, es ogen, p oges e one, GnRH
analogue, Gani elix, apop osis.
3
In oducción
Los leiomiomas u e inos, ambién denominados ib omas u e inos, son los umo es
benignos más ecuen es en muje es en edad ep oduc i a, con una incidencia del 40%
en muje es caucásicas y del 60% en muje es de aza neg a en o no a los 35 años, que
se ele a al 70% y más del 80% espec i amen e a los 50 años (Pa one e al., 2018). A
menudo, la p esencia de es os umo es pasa inad e ida po la ausencia de sín omas,
que se mani ies an en el 15-30% de las muje es con leiomiomas y a ec an a la calidad de
ida de es as (Se da & Bulun, 2013).
En e la sin oma ología asociada a es a pa ología se incluye dolo en el á ea lumba ,
a iga, dolo abdominal, sang ado excesi o du an e la mens uación y di icul ades
du an e la concepción y el emba azo (Ne i e al., 2019). La se e idad de es os sín omas
depende del núme o, amaño y localización de los umo es, que al e an la ana omía y
uncionalidad de los ejidos del ú e o (Zepi idis e al., 2016; Sohn e al., 2018). Po
ejemplo, los ib omas submucosos, que c ecen hacia la ca idad u e ina, suelen es a
asociados a sang ado mens ual abundan e y anemia, así como p oblemas de
implan ación del emb ión y complicaciones del emba azo y el pa o; mien as que los
miomas subse osos, que se desa ollan hacia la ca idad pe i oneal, pueden p o oca
sín omas de ipo comp ensi o solo si alcanzan cie o amaño, como moles ias
abdominales, disu ia y es eñimien o. Po o o lado, los ib omas in amu ales, que se
desa ollan en el miome io, ambién a ec an a la capacidad ep oduc i a (Elda -Ge a
e al., 1998; Se da & Bulun, 2013; Ali & Al-Hendy, 2017; Ne i e al., 2019). Además, la
apa ición de es os sín omas no solo es debido a la masa y amaño de los leiomiomas,
sino ambién a la p oducción de moléculas de señalización que al e an la ac i idad de
los ejidos adyacen es al umo (Zepi idis e al., 2016).
E iología y desa ollo de los leiomiomas u e inos
Los leiomiomas u e inos ienen un o igen monoclonal a pa i de células mad e
somá icas del miome io. Aunque oda ía no se han es ablecido con exac i ud aquellos
mecanismos que p o ocan la ans o mación de células no males en células iniciado as
de leiomiomas, pa ece que son a ios los ac o es implicados en el o igen y expansión
de es os umo es, ales como al e aciones gené icas, epigené icas e in luencia de

4
ho monas sexuales y ac o es de c ecimien o (Islam e al., 2013). Con espec o al
desa ollo de los leiomiomas, se ha obse ado que es os umo es son especialmen e
sensibles a la p esencia de ho monas o á icas, que es imulan la p oli e ación de las
células de mioma y una p oducción excesi a de ma iz ex acelula (ECM po sus siglas
en inglés), lo cual concue da con el hecho de que es os umo es apa ecen solamen e
después de la mena quia y expe imen an una eg esión después de la menopausia
(Se da & Bulun, 2013).
A ni el his ológico, los leiomiomas des acan po la p esencia de un exceso de ma iz
ex acelula de ca ác e ib oso deso ganizado, azón po la cual es os umo es ambién
eciben el nomb e de ib omas. En compa ación con los ejidos no a ec ados del
miome io, se ha comp obado que en los leiomiomas exis e sob eexp esión de genes
que codi ican di e sos componen es de la ma iz ex acelula , ales como colágeno,
ib onec inas, lamininas, p o eoglucanos, in eg inas y p o easas in oluc adas en la
emodelación de la ma iz ex acelula (Islam e al., 2018). Además, se ha obse ado que
los leiomiomas p esen an una disposición y o ien ación ano mal de las ib as de
colágeno con espec o al miome io. Es a excesi a acumulación de ma iz ex acelula ,
apa e de p o oca la apa ición de los sín omas asociados a la al e ación ana ómica del
ú e o, ambién ac úa como ese o io de ac o es de c ecimien o que, al libe a se
du an e los p ocesos de emodelado de la ma iz ex acelula , ac i an di e sas ías de
ansducción que conducen, en úl ima ins ancia, al desa ollo y expansión del umo
(Koohes ani e al., 2013; Islam e al., 2018).
Como ya se mencionó an e io men e, los leiomiomas u e inos dependen de las
ho monas o á icas, es ógeno y p oges e ona, pa a su desa ollo y man enimien o. En
las células de leiomioma, se ha comp obado que exis e una sob eexp esión de los
ecep o es de es ógeno (ERα y ERβ) en compa ación con el miome io sano, lo cual
jus i ica su mayo sensibilidad a la p esencia de es a ho mona en el medio. Asimismo,
ambién se ha obse ado que es os umo es p esen an mayo es can idades de
a oma asa, una enzima cla e en el p oceso de con e sión de and ógenos en es adiol
(E2), de mane a que los leiomiomas son capaces de p oduci su icien e es ógeno pa a
man ene su c ecimien o. La acción del es ógeno incluye la ac i ación de la exp esión
5
de di e sos genes implicados en la pa ogénesis de los leiomiomas, ales como ac o es
de c ecimien o, colágenos y ecep o es de es ógeno y p oges e ona (Bo ahay e al.,
2015; Mo a ek e al., 2015; Salas e al., 2020). Po o o lado, ambién se ha obse ado
que exis e una mayo can idad de ecep o es de p oges e ona en las células de
leiomioma con espec o al miome io no a ec ado (Tsigkou e al., 2015). La
p oges e ona es esponsable del desa ollo del umo , ya que es imula la p oli e ación
celula y la acumulación de ma iz ex acelula al modula la exp esión de di e sos
ac o es de c ecimien o, como EGF y PCNA, y moléculas implicadas en inhibi el p oceso
de apop osis (Bo ahay e al., 2015; Pa el e al., 2016).
O a ca ac e ís ica llama i a de los leiomiomas u e inos es la p esencia de al e aciones
gené icas que pod ían con ibui a la iniciación y desa ollo de es os. Las anomalías
gené icas más ecuen es se co esponden con mu aciones en el gen MED12 y
aslocaciones o sob eexp esión del gen HMGA2. Se ha obse ado que en e el 50 y el
85% de los umo es p esen an mu aciones en MED12, la mayo ía de ellas si uadas en el
exón 2 (Galindo e al., 2018; Mello e al., 2018). MED12 (Media o complex subuni 12,
po sus siglas en inglés) es un componen e del Complejo Mediado , que in e ac úa con
la ARN polime asa II y egula el inicio de la ansc ipción, el c ecimien o celula y la
di e enciación, po lo que la p esencia de mu aciones en es e gen pod ía es a
elacionada con al al e ación del desa ollo y de los pa ones de exp esión de las células
que dan luga a los leiomiomas (Mello e al., 2018).
Po o o lado, HMGA2 (high-mobili y g oup AT-hook 2, po sus siglas en inglés) es un
ac o de ansc ipción que induce cambios con o macionales en la es uc u a de la
c oma ina, lo cual a ec a a los p ocesos de c ecimien o, di e enciación, apop osis y
ans o mación celula (Galindo e al., 2018). En o no al 40-50% de los leiomiomas
u e inos p esen an anomalías ci ogené icas de ec ables, de las cuales un 20%
co esponden a eo denaciones c omosómicas que se p oducen co ien e a iba del
p omo o del gen HMGA2, p o ocando una sob eexp esión de es e en los umo es que
p esen an es a anomalía. Sin emba go, ambién se ha obse ado una mayo exp esión
de es e gen con espec o al miome io sano en leiomiomas en los que es a al e ación se
encon aba ausen e, po lo que se ha plan eado la exis encia de o os mecanismos
6
egulado es de la exp esión de es e gen, como la ac uación de mic oARNs (Mello e al.,
2018). Des aca ambién el hecho de que ambas al e aciones gené icas, la mu ación en
MED12 y la eo denación c omosómica en HMGA2, son mu uamen e excluyen es
(Mäkinen e al., 2017). Sin emba go, a la luz de ecien es es udios se ha obse ado la
p esencia de mu aciones en MED12 y sob eexp esión de HMGA2 de mane a simul ánea
en un mismo umo (Galindo e al., 2018; Mello e al., 2018).
T a amien os exis en es
Has a la echa, el a amien o de ini i o pa a la eliminación de los leiomiomas u e inos
es la his e ec omía, pe o es a no esul a una opción deseable pa a las muje es que
desean ene hijos. Po ello, ha sido necesa io busca a amien os al e na i os, ya sea
mé odos conse a i os como la miomec omía o écnicas menos in asi as, como la
embolización de a e ias u e inas y la aplicación de ul asonidos de al a in ensidad, las
cuales, sin emba go, no es án exen as de iesgo y no ga an izan que no se p oduzca un
eb o e del umo (Ne i e al., 2019). Po o o lado, la adminis ación de á macos
cons i uye una opción p e e ible pa a aquellas muje es que desean e i a los p ocesos
de ci ugía y man ene su capacidad ep oduc i a. El obje i o de es os medicamen os es
educi la in luencia de las ho monas o á icas sob e los leiomiomas y, de es a mane a,
inhibi el c ecimien o y expansión del umo . No obs an e, po el momen o el empleo
de es os á macos suele limi a se a un co o pe íodo de iempo debido a los e ec os
secunda ios que p o ocan, y no malmen e se ece an como e apia p eope a o ia pa a
educi el amaño de los umo es y mejo a los sín omas asociados a es a pa ología.
Además, as la suspensión del a amien o, los leiomiomas ecupe an en poco iempo
su amaño inicial (Ali & Al-Hendy, 2017). Algunos de los medicamen os más u ilizados
son los modulado es selec i os del ecep o de p oges e ona, los análogos de GnRH y
los inhibido es de a oma asa.
Los agonis as de GnRH ue on los p ime os á macos que se u iliza on pa a el
a amien o de los leiomiomas u e inos. Su adminis ación a ni el sis émico p o oca una
es imulación inicial de las células gonado ópicas de la hipó isis, que pos e io men e
concluye con la inhibición del eje hipo isa io-gonadal. De es a mane a, se educe la
can idad de ho monas o á icas ci culan es, lo cual pe mi e que se eduzca el amaño de
7
los umo es y el ali io de los sín omas asociados. Sin emba go, es a educción d ás ica
del ni el de es ógenos induce una se ie de e ec os secunda ios ca ac e ís icos de la
menopausia, desde so ocos y sequedad aginal has a consecuencias más g a es, como
desmine alización y pé dida de densidad ósea, po lo que la du ación de es os
a amien os es limi ada. Po o o lado, los an agonis as de GnRH ac úan median e
inhibición compe i i a de los ecep o es de GnRH hipo isa ios, po lo que se consigue
una inhibición inmedia a del eje hipo isa io-gonadal, al con a io que en el caso de los
agonis as de GnRH, lo cual pe mi e una meno du ación del a amien o en compa ación
con es os úl imos (Pa sanezhad e al., 2012).
Desde hace años se sabe de la p esencia de ecep o es de GnRH en ejidos no
hipo isa ios, incluidos los leiomiomas u e inos (Pa ke e al., 2007). Es o implica que las
células en los que es os ecep o es es án p esen es son capaces de esponde a la acción
de GnRH y sus análogos. De hecho, se ha comp obado que la aplicación local de análogos
de GnRH sob e cul i os de leiomiomas u e inos p o oca una inhibición de la
p oli e ación en las células que con o man es os umo es y un mayo ni el de apop osis,
además de inhibi la exp esión de genes que codi ican componen es de la ma iz
ex acelula , la cual es un elemen o cla e en la o mación de es os umo es (Chen e al.,
2005; B i en e al., 2012; Malik e al., 2016). Po an o, el desa ollo de sis emas e icaces
y segu os pa a aplica es os á macos a ni el local en el p opio umo cons i uye una
opción in e esan e, ya que de es a mane a se consegui ía a a los leiomiomas e i ando
los e ec os secunda ios que p o oca su aplicación sis émica.
Cul i os o gano ípicos pa a el es udio de leiomiomas u e inos
El desa ollo de modelos en los que se pueda es udia la isiología de los leiomiomas
u e inos, así como su espues a an e dis in os ac o es, ales como la aplicación
ho monas o á icas y á macos, esul a esencial pa a la comp ensión de los mecanismos
median e los cuales se o iginan y expanden, así como pa a la ealización de ensayos
p eclínicos con a amien os po encialmen e e icaces y segu os pa a su adminis ación
a muje es con es e ipo de umo es. En es e sen ido, los p ime os modelos u ilizados
pa a el es udio de los leiomiomas u e inos es aban basados en animales, como la a a
EKER o los xeno ansplan es, que ienen el incon enien e de no ep esen a de mane a
14
Limpieza del ARN con DNasa y cuan i icación del ARN
Con el obje i o de elimina de la mues a ob enida de ARN cualquie es o de ADN que
hubie a podido queda , se a ó con DNasa I lib e de RNasa (P omega). Pa a ello, se
ealizó una mezcla de 10 µL ampón 10X, 1 µL de RNasin (40 u/µL), 10 µL de DNasa (1
u/µL) y 54 µL de Agua-DEPC po cada mues a de 25 µL de ARN, con lo que al inal
esul aba un olumen de 100 µl po ubo de eacción. A con inuación, se incuba on los
ubos en un e mociclado de p e-PCR modelo Mul iGene II (Labne ) a 37 °C du an e 30
minu os. Pos e io men e, se añadió a cada uno de los ubos 100 µL de una mezcla de
enol/clo o o mo en p opo ción 3:1, se mezcló median e ó ex y se cen i ugó du an e
5 minu os a 18.000 pm a 4 °C. Después, se ecogió el sob enadan e y se le añadió 10 µL
de ace a o sódico (3 M, pH 5.2) y 300 µL de e anol absolu o y se dejó p ecipi a oda la
noche a -80 °C.
Al día siguien e, se cen i uga on los ubos a 18.000 g y 4 °C du an e 15 minu os, as lo
cual se desechó el sob enadan e y se la ó el pelle con e anol al 80%. Después de ol e
a cen i uga a 18.000 g du an e 5 minu os, se eliminó el sob enadan e y se dejó seca
el pelle pa a, a con inuación, esuspende lo en 25 µL de Agua-DEPC. Finalmen e, se
ealizó la cuan i icación a pa i del alo de abso bancia del ARN median e un
espec o o óme o NanoD op ND-1000 (The mo Fishe Scien i ic).
Cuan i icación de p o eínas
Pa a ealiza la cuan i icación de las p o eínas ex aídas, se u ilizó el ki de ensayo de
p o eínas Pie ce Mic o BCA (The mo Fishe Scien i ic). P e iamen e, se diluye on las
mues as de p o eínas 200 eces y se elabo ó una cu a pa ón con un g adien e de
concen aciones de BSA de en e 0,5 y 200 µg/mL. El eac i o de abajo (WR) se p epa ó
con 25 pa es de eac i o MA (ca bona o sódico, bica bona o sódico y a a o de sodio
en 0,2 N de NaOH), 24 pa es de eac i o MB (solución al 4% ácido bicinconínico en agua)
y 1 pa e de eac i o MC (solución de sul a o cúp ico al 4% en agua pen ahid a ado). Las
mues as se coloca on en una placa de 96 pocillos, en la cual se añadie on p ime o 150
µL del eac i o de abajo a cada pocillo y, seguidamen e, 150 µL de cada mues a.
Pos e io men e, se incubó la placa a 37 °C du an e dos ho as, as lo cual se midió la

15
abso bancia de las mues as a 562 nm en el lec o de placas EnSpi e Mul imode Pla e
Reade (Pe kinElme ).
PCR cuan i a i a (qPCR) y Wes e n Blo
Po cues ión de iempo, no ue posible ealiza la cuan i icación de la exp esión génica
median e PCR cuan i a i a y Wes e n Blo al y como se enía planeado, po lo que a
con inuación se de alla án b e emen e los ma cado es que se p e endían analiza pa a
cada uno de los mé odos.
Po un lado, median e la écnica de Wes e n Blo se p e endía analiza el ni el de
exp esión génica de los ma cado es ecogidos en la Tabla 1, los cuales p esen an
elación con el p oceso de p oli e ación y apop osis. Se indica, además, los an icue pos
p ima ios y secunda ios que se u iliza ían pa a de ec a cada una de es as p o eínas.
Tabla 1. Ma cado es que se p e endían es udia median e el ensayo de Wes e n Blo en las mues as
ex aídas, jun o con los an icue pos des inados a su de ección, la casa come cial que los suminis a y el
amaño espe ado de las p o eínas de ec adas. En el caso de la enzima poli-(ADP- ibosa) polime asa
(PARP), el an icue po aplicado de ec a an o la p o eína ín eg a como PARP o a (clea ed). La be a ac ina
se u iliza como p o eína con ol pa a no maliza los alo es de los o os ma cado es.
Po o o lado, se hab ía ealizado la e o ansc ipción del ARN ex aído y pu i icado
pa a, pos e io men e, some e el ADNc ob enido a un p oceso de PCR cuan i a i a con
el obje i o de de e mina el ni el de exp esión génica de los ma cado es ecogidos en
la Tabla 2, los cuales se co esponden con genes que codi ican componen es de la ma iz
Ma cado
An icue po
p ima io (1)
An icue po
secunda io (2)
Casa come cial
Tamaño
espe ado (kDa)
Bcl-2
Mouse IgG1
An i-mouse IgGk-HRP
San a C uz
Bio echnology (1 y 2)
26
PCNA
Mouse IgG2a
An i-mouse IgGk-HRP
San a C uz
Bio echnology (1 y 2)
35
Caspasa-3
Rabbi IgG
Goa an i- abbi IgG
Abcam (1) y Be hyl (2)
17
PARP
Rabbi IgG
Goa an i- abbi IgG
The moFishe (1) y
Be hyl (2)
135
85 (clea ed)
Be a ac ina
(con ol)
Mouse IgG1
An i-mouse IgGk-HRP
San a C uz
Bio echnology (1 y 2)
43
16
ex acelula , ma cado es de apop osis y el gen d i e HMGA2. En es e úl imo caso, se
p e endía compa a el ni el de exp esión de es e gen en los miomas con espec o a su
miome io pa eado. Con espec o al gen d i e MED12, se deseaba comp oba ,
median e ampli icación y secuenciación del ADN ex aído a T0, si exis ía mu ación de
es e gen en los miomas es udiados y, de se así, si se encon aba en un es ado de
homocigosis o de he e ocigosis, en cuyo caso la ampli icación del ADNc ob enido
pe mi i ía sabe cuál de los alelos se es aba exp esando.
Además, en la abla se incluyen los dos genes de exp esión cons i u i a o housekeeping
PUM1 (Pumilio homolog 1, po sus siglas en inglés) y GNB2L1 (Guanine nucleo ide-
binding p o ein subuni be a-2-like-1, po sus siglas en inglés) que se hab ían u ilizado
pa a no maliza los alo es de exp esión génica de los genes diana, pues o que
p esen an una exp esión es able independien emen e del a amien o aplicado (Cañe e
e al., 2013; Almeida e al., 2014).
17
Gen
Fo wa d (5’ → 3’)
Re e se (5’ → 3’)
Longi ud del
amplicón (pb)
Ma iz ex acelula
COL1A1
GAGGGCCAAGACGAAGACATC
CAGATCACGTCATCGCACAAC
140
FN1
GAGAATAAGCTGTACCATCGCAA
CGACCACATAGGAAGTCCCAG
200
DPT
TGACAGACAATGGAACTACGC
TGCTGTAGCGACAACAGTAAAA
203
VCAN
GAAGGCTTGTTTGGACGTTGG
ACGGAATCCATAAGTCCTGACTC
193
Apop osis
APAF1
AGGCTAAAGACCGTCTCCGC
GCTTTCAACACCCAAGAGTCCC
94
BAX
TGGGCTGGACATTGGACTTCC
CCGCCACAAAGATGGTCACG
175
BBC3 (PUMA)
AGCCAAACGTGACCACTAGC
CACGGGCAGAGCACAGGATT
179
BCL2L1 (BCL-XL)
TTGGATCCAGGAGAACGGCG
TGAAGCGTTCCTGGCCCTTT
92
BIRC5 (SURVIVIN)
GGACCACCGCATCTCTACATTCA
AGTCTGGCTCGTTCTCAGTGG
116
CASP1
TATGCCTGTTCCTGTGATGTGG
CTCTTTCAGTGGTGGGCATCTG
97
CASP3
ACCAAAGATCATACATGGAAGCG
CCCTGAGGTTTGCTGCATCG
176
CASP8
GCCTGAGAGAGCGATGTCCT
TGAGGCATCTGTTTCCCCATGT
112
FAS
ACACTGTGACCCTTGCACCA
AGAAGACAAAGCCACCCCAAGT
117
FASLG
TCCGAGAGTCTACCAGCCAGAT
CCAGAGGCATGGACCTTGAGT
141
TNFRSF10A/DR4
ATCGGCTCAGGTTGTGGAGG
CACCTGTCAAATCTGCCGGC
187
TNFRSF10B/DR5
TCACAGTTGCAGCCGTAGTCT
AGCTTCTGTCCACACGCTCA
132
TNFSF10 (TRAIL)
CCCTGCTGGCAAGTCAAGTG
TTGCTTCTTCCTCTGGTCCCA
176
Genes d i e s y housekeeping
HMGA2
AGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCA
CAACTGCTGCTGAGGTAGAAATCG
196
MED12-TUR-F y 3R
TTCTAACGTGCCCCCTTGTT
GTTGGAACTGATCTTGGCAGG
352
MED12 In 1F/In 2R
GCCCTTTCACCTTGTTCCTT
TGTCCCTATAAGTCTTCCCAACC
291
PUM1
GACGCTATGGTGGACTACTTCT
TGGAACGCACCTGATGTTCTG
142
GNB2L1
GAGTGTGGCCTTCTCCTCTG
GCTTGCAGTTAGCCAGGTTC
224
Tabla 2. Ma cado es que se p e endían analiza median e qPCR. Se incluye la secuencia de los cebado es
o wa d y e e se u ilizados pa a ampli ica cada uno de es os genes, así como la longi ud del amplicón
ob enido. Los genes housekeeping PUM1 y GNB2L1 se u iliza on pa a no maliza los alo es de qPCR. Todos
los ma cado es se ampli ica on a pa i de ADNc a excepción de MED12 In 1F/In 2R, que se ampli icó a pa i
de ADN.
18
Resul ados
Tinción his ológica
Median e el análisis his ológico de las secciones de mioma, ue posible es udia la
e olución de los ejidos a lo la go del iempo y bajo cada uno de los a amien os
aplicados. En la Figu a 2, puede obse a se la compa ación de una sección de mioma
co espondien e a T0 con espec o a los con oles nega i os (OH) de los iempos 6 y 9.
En ellos puede obse a se la mo ología ípica de es os ejidos, es deci , la p esencia de
células de núcleos usi o mes y una abundan e can idad de ma iz ex acelula , aunque
a medida que a anza el iempo de cul i o se ap ecia una pé dida g adual de la es uc u a
del mioma así como del núme o y mo ología de las células con espec o al mioma
inicial.
Figu a 2. Mic o o og a ías a 20x de secciones del mioma L17 eñidas con hema oxilina-e i osina
co espondien es a T0 y a los con oles nega i os de los iempos 6 y 9. Los núcleos celula es apa ecen
eñidos de iole a (señalados con lechas) y el ci oplasma y la ma iz celula de osado.
En las mues as a adas con á macos, independien emen e de si se les aplicó o no
a amien o ho monal, pudo obse a se la p esencia de núcleos con acumulación de
eosina y picnosis ca ac e ís icas del p oceso apop ó ico, en el que se p oduce una
condensación de la c oma ina nuclea , al y como se señala en la Figu a 3. Además, al
analiza las secciones que ecibie on solamen e a amien o ho monal, sin adición de
á maco, se puede ap ecia que la es uc u a isula y la mo ología celula ípica de
es os ejidos se man iene de mane a más du ade a en las mues as que ue on a adas
con es ógeno y p oges e ona, en compa ación con las que ue on a adas
exclusi amen e con es ógenos, en las cuales llama la a ención la p esencia de algunos
núcleos picnó icos.
19
Figu a 3. Mic o o og a ías a 20X de las mues as del mioma L17 de cada uno de los a amien os con
á maco y ho monas de T6 y T9. En las secciones a las que se les aplicó el á maco, las lechas señalan los
núcleos en los que se ap ecia una acumulación de eosina (colo ojizo). E = E2, P = P4, F = á maco
(Gani elix).

20
Cuan i icación de ARN y p o eínas
A con inuación, se ecogen las ablas de da os e e en es a la ex acción y cuan i icación
del ARN y las p o eínas ob enidas. En el caso de las mues as co espondien es a T0, se
incluyen ambién los alo es cuan i icados pa a las secciones de miome io pa eado de
cada uno de los miomas, an o pa a el ARN (Tabla 1) como pa a las p o eínas (Tabla 5).
Cabe des aca que el p o ocolo empleado ha sido op imizado de mane a que sea posible
ex ae ADN, ARN y p o eínas a pa i de una misma mues a con la su icien e calidad y
can idad de odos ellos.
En p ime luga , con espec o a los alo es de ARN cuan i icados, llama la a ención las
concen aciones ela i amen e ele adas que pudie on ob ene se a pa i de mues as
an pequeñas, así como su g ado de pu eza, que se es ablece median e los a ios
A260/A280 y A260/A230 de e minados po el espec o o óme o. El p ime a io
pe mi e comp oba si la mues a se encuen a con aminada po p o eínas, las cuales
p esen an un pico de abso bancia a 280 nm, mien as que el segundo pa áme o
pe mi e es ablece si es án p esen es con aminan es que abso ben a 230 nm, como
sales cao ópicas y enoles u ilizados du an e el p oceso de ex acción. En el caso de la
elación A260/A280, la ob ención de alo es ce canos a 2 indica que la mues a de ARN
p esen a un adecuado ni el de pu eza, mien as que el alo de A260/A230 ob enido
debe encon a se en e 1,5 y 2,2. En las Tablas 1-4, se obse a que la mayo ía de las
mues as p esen an unos a ios que se adecúan a las condiciones desc i as, po lo que
se puede a i ma que la pu eza del ARN ex aído median e es e p o ocolo es bas an e
buena.
Tabla 3. Da os de la cuan i icación de ARN en las mues as co espondien es al T0 de cada mues a de
mioma y miome io, ob enidas median e espec o o óme o NanoD op ND-1000. Se incluye la
concen ación de ARN en ng/µL y los a ios de pu eza de las mues as cuan i icadas.
Concen ación (ng/µL)
A260/A280
A260/A230
L16T0
293,64
2,02
1,93
M16T0
406,38
2,12
2,13
L17T0
588,25
2,03
2,04
M17T0
399,79
2,07
2,01
L18T0
457,56
2,08
2,02
M18T0
783,49
2,14
2,09
21
Tabla 4. Da os de la cuan i icación de ARN co espondien es a las mues as de L16 a T6 y T9 pa a cada
uno de los a amien os. Pa a T9 solo se incluye una éplica de cada a amien o, ya que la placa en que
se encon aban las o as dos se con aminó con un hongo y u o que se desechada. Se ecoge la
concen ación en ng/µL y los a ios de pu eza.
Tabla 5. Da os de la cuan i icación de ARN co espondien es a las mues as del mioma L17 a T6 y T9 pa a
cada uno de los a amien os. Se ecoge la concen ación en ng/µL y los a ios de pu eza.
T6
T9
Concen ación
A260/A280
A260/A230
Concen ación
A260/A280
A260/A230
OH
239,93
2,07
2,03
186,3
2,05
1,92
101,07
1,99
2,02
369,28
2,09
1,98
264,13
2,04
1,89
419,89
2,08
1,94
F
307,77
2,06
2,01
278,03
2,1
1,91
250,59
2,03
2,05
198,06
2,05
2,03
152,93
2
1,85
131,97
2,04
1,82
E
211,55
2,03
2,14
179,43
2,06
1,99
200,68
1,97
1,97
371,93
2,04
1,98
243,58
2,01
2,06
302,69
2,09
2,06
EF
338,32
2,09
2,11
118,41
2,05
1,92
247,63
2
1,93
290,82
2,08
1,94
245,37
2,05
2,12
309,88
2,05
1,98
EP
307,94
2,05
1,94
139,78
2,02
1,83
348,05
2,02
1,97
254,78
2,02
1,86
247,59
2,01
1,82
203,46
2,05
1,99
EPF
172,55
2,01
1,86
317,28
2,08
1,86
195,84
2
2,03
187,83
2,05
1,87
144,45
1,97
1,68
195,98
2
1,8
T6
T9
Concen ación
A260/A280
A260/A230
Concen ación
A260/A280
A260/A230
OH
253,88
2,05
1,92
540,83
1,76
2,02
296,55
2,03
1,95
-
-
-
289,01
2,01
1,86
-
-
-
F
390,56
1,85
1,98
382,1
1,9
2,08
122,09
1,94
1,67
-
-
-
275,69
1,82
2
-
-
-
E
259,98
1,99
2,03
148,92
1,96
1,86
110,61
1,9
1,95
-
-
-
413,62
1,89
2,12
-
-
-
EF
352,79
1,85
2,11
585,73
1,95
1,96
140,67
1,9
1,71
-
-
-
195,51
1,99
1,92
-
-
-
EP
303,65
1,99
1,93
378,32
1,99
1,89
241,47
1,99
1,86
-
-
-
261,38
2,01
1,79
-
-
-
EPF
504,62
2,06
1,85
202,7
1,95
1,78
166,22
1,92
1,57
-
-
-
398,2
2,01
1,83
-
-
-
22
En cuan o a las p o eínas, se adjun an las ablas de alo es exp esados como
concen ación de p o eínas (µg/µL) en las mues as analizadas, an o de los miomas y
miome ios a T0 (Tabla 5) como de las mues as de T6 y T9 some idas a los dis in os
a amien os (Tabla 6). Cabe des aca que el ki Mic o BCA empleado pa a ealiza la
cuan i icación es bas an e sensible a la p esencia de pequeñas can idades de p o eínas
en las mues as, lo cual pe mi e de ec a y de e mina el con enido p o eico de
mues as ela i amen e pequeñas o diluidas. Además, es e ki es compa ible con un
amplio ango de p oduc os p esen es en la mayo ía de las soluciones que se u ilizan pa a
esuspende p o eínas, a di e encia de o os ki s. Asimismo, median e es e mé odo se
ob ienen cu as pa ón con alo es de co elación (R2) ce canos a 1, lo cual nos pe mi e
es ima la concen ación de p o eínas de una mues a en base a su abso bancia a pa i
de la ecuación de la ec a ob enida, siemp e que su alo caiga den o del ango de
concen aciones que se han u ilizado pa a elabo a la cu a pa ón. La Figu a 4 mues a
una de es as g á icas calculadas du an e la cuan i icación de las p o eínas de las dis in as
mues as.
T6
T9
Concen ación
A260/A280
A260/A230
Concen ación
A260/A280
A260/A230
OH
148,73
2,05
2,02
225,45
2,04
2,04
327,09
2,1
2,02
104,08
1,91
2,07
255,7
2,08
2,06
-
-
-
F
311,53
2,12
2,04
163,24
1,99
1,71
401,63
2,1
2
740,1
2,06
2,11
288,91
2,11
2,04
566,74
2,1
2,07
E
358,65
2,1
2,07
26,64
1,56
1,98
520,29
2,08
2,09
411,38
2,07
2,06
326,95
2,09
2
22,4
1,61
2,07
EF
419,73
2,1
2,04
137,99
1,89
2,03
409,87
2,09
2,03
439,83
2,05
2,1
305,61
2,1
2,04
348,47
2,03
2,05
EP
275,97
2,08
2,01
83,76
1,85
2,08
345,78
2,1
2,06
215,76
2,04
2,1
357,56
2,1
2,05
256,78
2,04
2,08
EPF
113,59
2,04
1,97
130,16
1,98
2,04
138,15
2,04
1,83
419,58
2,07
2,09
430,15
2,09
2,02
305,15
2,06
2,04
Tabla 6. Da os de la cuan i icación del ARN de las mues as de L18 a T6 y T9 pa a cada uno de los
a amien os. Se ecoge la concen ación en ng/µL y los a ios de pu eza.
23
Figu a 4. Cu a pa ón elabo ada pa a la cuan i icación de las p o eínas con enidas en las mues as
co espondien es a L18T6 pa a los dis in os a amien os. En la esquina supe io de echa se obse a la
ecuación de la ec a ob enida y el alo de co elación (R2)
Concen ación de
p o eínas (µg/µL)
L16T0
4,19
M16T0
3,64
L17T0
2,53
M17T0
2,42
L18T0
1,96
M18T0
2,70
Tabla 7. Da os de la cuan i icación de p o eínas
co espondien es a las mues as de miomas y
miome ios de T0, exp esados como concen ación
de p o eínas.
30
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