UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE VETERINARIA
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y
BROMATOLOGÍA
CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS
DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS
EN ALIMENTOS Y PIENSOS
TERNURA ROSA ROJAS DURÁN
2005
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE VETERINARIA
CAMPUS LUGO
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y
BROMATOLOGÍA
ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA
CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS
DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS
EN ALIMENTOS Y PIENSOS
Memo ia que p esen a:
Te nu a Rosa Rojas Du án
Pa a op a al g ado de Doc o .
Lugo, Ab il de 2005
DÑA. PILAR BERMEJO BARRERA, CATEDRÁTICA DE UNIVERSIDAD Y
DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTICIÓN
Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE
COMPOSTELA
INFORMA: que DÑA TERNURA ROSA ROJAS DURÁN ha ealizado en es e
depa amen o, bajo la di ección del D .D. Albe o Cepeda Sáez, Dña. C is ina
Fen e Sampayo y D. Emiliano Quin o Fe nández, el abajo i ulado:
“CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE
CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y PIENSOS”, que p esen a
pa a op a al g ado de Doc o .
Y pa a que así cons e donde p oceda, i ma la p esen e en San iago de
Compos ela, Feb e o de 2005.
Fdo: P o . D . Dña.Pila Be mejo Ba e a
D. ALBERTO CEPEDA SÁEZ, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD, DÑA.
CRISTINA FENTE SAMPAYO, PROFESORA TITULAR DE UNIVERSIDAD,
AMBOS DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTICIÓN Y
BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE
COMPOSTELA Y D. EMILIANO QUINTO FERNÁNDEZ, TITULAR DE
UNIVERSIDAD NUMERARIO DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIA ANIMAL
Y DE LOS ALIMENTOS, AREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA.
AUTORIZAN a DÑA. TERNURA ROSA ROJAS DURÁN, a la p esen ación
del abajo i ulado: “CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE
DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y
PIENSOS”, ealizado bajo su di ección en la Facul ad de Ve e ina ia de Lugo
de la Uni e sidad de San iago de Compos ela.
Y pa a que así cons e donde p oceda, i man la p esen e en Lugo,
No iemb e de 2004.
Fdo: P o . D . D. Albe o Cepeda Sáez
Fdo: P o . D . Dña. C is ina Fen e Sampayo
Fdo: P o . D . D. Emiliano Quin o Fe nández
Fdo: Dña. Te nu a Rosa Rojas Du án
AGRADECIMIENTOS
Quie o comenza exp esando mi g a i ud a mis di ec o es de esis: al D . Albe o
Cepeda Sáez, po habe me b indado la opo unidad de ealiza la esis doc o al en el
g upo de in es igación que di ige, al D . Emiliano Quin o Fe nández po habe me
endido una mano y encauza mi des ino y a la D a. C is ina Fen e Sampayo po su
labo de di ección.
Al D . Ca los F anco po compa i sus conocimien os y la D a. Bea iz Vázquez po su
aliosa o ien ación en odo momen o.
Al P o eso Al edo Sanz Medel po ab i me las pue as del G upo de Espec ome ía
Analí ica.
Al D . Wei Jin y al D . José Manuel Cos a po amplia mis on e as.
A los compañe os del Labo a o io de Higiene Inspección y Con ol de los Alimen os:
Fabiao, José Manuel y Alicia, con quienes compa í las icisi udes de la in es igación
y ambién muchas isas, en especial a Ma ía y a Enka con quienes compa í amis ad y
abajo.
A l@s amig@s que encon é ue a del abajo: Yolanda, Ana, Mai e, Noemí, Juan
Ramón, Osca , Albe o, Diana, Ma a, C is ina, Jo ge, Da id, Robe o y Gema, po la
empa ía y los buenos momen os i idos.
A Kenny y Dipu po cuida an o de mi, a su mane a. A Be na do y Miguel Angel, po
esas llamadas en el momen o p eciso.
A mi gen e de Boli ia: a la D a. Adela Panozo po inicia me en la in es igación, a I án
po semb a en mi la inquie ud de c uza el cha co, a Mau icio, Luis y E ika, amigos “a
con ol emo o”, po ansmi i me el mismo ca iño du an e es os años, a pesa de la
dis ancia.
A mi amilia que es á despe digada po el mundo, a Jose Manuel, Ka la y Monica que
me acompañan con el co azón.
A Maxi y a Susi po su apoyo incondicional y po b inda me el calo de una amilia.
Y inalmen e, al Gobie no de España que median e la AGENCIA ESPAÑOLA DE
COOPERACIÓN INTERNACIONAL me ha o o gado la beca pa a ealiza mis es udios
de Doc o ado.

A Is ael
el mago que consigue imposibles
A mi mad e
po impulsa me a lucha po mis sueños
RESUMEN
Los o ganismos del géne o Aspe gillus pe enecen al g upo de los
hongos ilamen osos o mohos. Son cosmopoli as, se aíslan comúnmen e de
suelo, de ege ales y del in e io de las i iendas y son con aminan es
comunes en p oduc os alimen icios.
Los indi iduos de la especie Aspe gillus la us (muchas cepas de A.
la us Link ex F ies), Aspe gillus pa asi icus Spea e (la mayo ía de las cepas)
y o a especie desc i a ecien emen e, Aspe gillus nomius, son los únicos que
poseen la habilidad de p oduci a la oxinas. Todos es os hongos han sido
clasi icados en la sección Fla i del géne o Aspe gillus.
Debido a su ca ác e ubicuis a, los o ganismos de es a sección Fla i,
no solo ac úan como agen es de e io an es de los p oduc os que con aminan,
sino que ambién, bajo condiciones p opicias de sus a o, humedad y
empe a u a que se dan du an e el almacenamien o, algunas cepas son
capaces de p oduci a la oxinas. Se ha demos ado que es as sus ancias
esul an hepa o óxicas, cance ígenas y mu agénicas po inges ión c ónica
Es os e ec os han sido es udiados en mayo medida pa a la a la oxina B1.
Además del in e és sani a io de las a la oxinas, se debe conside a el
in e és económico que ocasiona la p esencia de a la oxinas en alimen os, las
pé didas económicas son di íciles de e alua debido a que son muchos los
ac o es a ene en cuen a al ealiza la alo ación. Con el in de minimiza el
impac o económico, se in ie en g andes sumas de dine o en el desa ollo e
implemen ación de mé odos de p e ención y con ol de la p esencia de
mohos y a la oxinas en las ma e ias p imas y en los p oduc os alimen icios.
La me odología usada comúnmen e pa a el sc eening de cepas
a la oxigénicas consis e en cul i a las cepas en un medio líquido o sólido y la
pos e io ex acción y análisis de la p esencia de a la oxinas median e
écnicas c oma og á icas. El aga de saca osa y ex ac o de le adu a (YES) y
medios na u ales de igo, a oz o cacahue es se u ilizan pa a es e p opósi o.
Analiza g andes can idades de mues as de la mane a an es
desc i a esul a la go y edioso. Po es a azón se han desa ollado
nume osos mé odos ápidos de sc eening pa a la de e minación de la
p oducción de a la oxinas median e obse ación de luo escencia en los
medios donde se cul i an cepas aisladas.
Dichos mé odos u ilizan medios de cul i o que con ienen adi i os
pa a inc emen a la p oducción de a la oxinas y consegui la de e minación
de un á ea luo escen e azul b illan e o e de-azulada al ededo de las
colonias du an e su examen bajo luz ul a iole a.
Los medios ac ualmen e u ilizados con es e in son: un medio
complejo que con iene saca osa, di e en es sales y cacahue es lib es de
a la oxinas, un medio Czapeck modi icado que con iene lico de maíz,
denominado medio APA, medios que con ienen coco denominados aga de
coco (CAM), medio de ex ac o de coco (CEA) y medio de c ema de coco
(CCA), el medio sin é ico líquido de Ma eles y Adye y un medio que incluye
gel de sílice y ácido a á ico.
Las ciclodex inas son moléculas o madas po acción de la enzima
ciclodex in- ansglicolasa sob e los dex anos. La p opiedad más
ca ac e ís ica de es os oligóme os es su no able capacidad de o ma
complejos de inclusión con una amplia a iedad de moléculas en su ca idad
in e na.
La luo escencia na u al de las a la oxinas se de i a de su es uc u a
pen ahe e ocíclica oxigenada. Resul ados expe imen ales han e elado que
la β-ciclodex ina y sus me il de i ados poseen excelen es ca idades pa a
exal a la espues a luo escen e de las a la oxinas po medio de la o mación
de complejos de inclusión.
En el p esen e abajo el aumen o en la espues a luo escen e de las
a la oxinas po adición de ciclodex inas a medios de cul i o ue es udiado
u ilizando cepas ep esen a i as de Aspe gillus la us p oduc o as y no
p oduc o as de a la oxinas. Se exponen los esul ados ob enidos po la
op imización de condiciones de incubación a es empe a u as con es
di e en es ciclodex inas adicionadas en dos di e en es concen aciones a la
o mulación de 12 medios de cul i o, de los cuales 9 son medios de cul i o
u ilizados comúnmen e pa a ecuen o y aislamien o de mohos con aminan es
de alimen os, un medio de cul i o es u ilizado pa a la p oducción de
mico oxinas y dos medios son u ilizados en la guía de Rape y Fennell (1965)
pa a la iden i icación y clasi icación de hongos.
También se op imiza on los mismos pa áme os u ilizando medios de
cul i o base a los cuales se añadie on las es ciclodex inas en dos
concen aciones, en combinación con desoxicola o de sodio y o as es sales
bilia es adicionadas en di e en es concen aciones.
Pa alelamen e, la e icacia de los mé odos desa ollados ue
comp obada po compa ación con o as me odologías de sc eening u ilizadas
ac ualmen e.
Seguidamen e se es udia on las in e e encias que pudie an se
p oducidas po mic oo ganismos pe enecien es a 24 di e en es especies del
géne o Aspe gillus spp. que ue an cul i ados en los medios de cul i o
desa ollados.
Se lle ó a cabo un es udio de aplicación de un nue o medio de
cul i o adicionado con ciclodex inas y desoxicola o de sodio pa a el ecuen o
de mohos y le adu as y simul ánea iden i icación de las cepas p oduc o as de
a la oxinas median e el análisis de la mico lo a p esen e en dis in os
alimen os come cializados en España pa a consumo humano y animal.
Las cepas a la oxigénicas son capaces de emi i os o escencia a
empe a u a ambien e (RTP) cuando son cul i adas en medios de cul i o que
con ienen ciclodex inas y sales bilia es.
Con el in de p o undiza en el es udio de la os o escencia “in i o”,
se ealiza on ensayos de RTP “in i o”, di igidos a con i ma la elación en e
la os o escencia de cul i os úngicos y la p oducción de a la oxinas, además
de explo a la posibilidad de desa olla una me odología analí ica pa a
de ección y cuan i icación de a la oxinas basada en RTP.
3.2.5.1. Mé odo de apo es amoniacales ...................................102
3.2.5.2. Mé odo c oma og á ico...................................................102
3.2.6. Mé odo pa a el mues eo y ecuen o de hongos y
le adu as o ales en p oduc os alimen icios y piensos.........102
3.2.7. Mé odo pa a el aislamien o de colonias úngicas.................103
3.2.8. Mé odos de iden i icación de colonias úngicas...................103
3.2.9. Mé odos pa a la iden i icación de cepas a la oxigénicas
en p oduc os alimen icios y piensos..................................104
3.2.9.1. En medio de cul i o con ciclodex ina y
desoxicola o de sodio (MACD).......................................104
3.2.9.2. A pa i de los medios de cul i o MA y SAB...................104
3.2.10. Mé odos de ex acción y pu i icación de a la oxinas .........105
3.2.10.1. Ex acción y pu i icación de a la oxinas de
medios de cul i o ........................................................105
3.2.10.2. Ex acción y pu i icación de a la oxinas de
especias, piensos y ma e ias p imas po diálisis
di ásica........................................................................105
3.2.10.3. Ex acción de a la oxina B1 pa a su de e minación
po el mé odo ELISA...................................................107
3.2.11. Mé odo c oma og á ico RP-HPLC con de ección
luo escen e pa a con i mación de la p oducción de
a la oxinas..........................................................................108
3.2.12. Me odología pa a la ob ención de os o escencia a
empe a u a ambien e de a la oxina B1 “in i o”...............108
3.2.12.1. Ins umen ación............................................................108
3.2.12.2. Mé odos pa a ob ención de RTP en disolución
(F-RTP) ..........................................................................109
3.2.12.2.1. Fos o escencia inducida po á omo
pesado (HAI-RTP) ...............................................109
3.2.12.2.2. Fos o escencia en p esencia de
ciclodex inas (CD-RTP) .........................................110
3.2.12.2.3. Fos o escencia en medio micela (MS-RTP) .........111

3.2.12.2.4. Fos o escencia en disolución de
ciclodex ina con desoxicola o de sodio ..................112
3.2.12.3. Mé odos pa a ob ención de os o escencia a
empe a u a ambien e en sopo e sólido (SS-
RTP) ..............................................................................113
3.2.12.3.1. Ensayos en papel de il o ......................................113
3.2.12.3.2. Ensayos con esinas de in e cambio iónico y
gel de sílice..............................................................115
3.2.12.3.2.1. Empaque ado de la celda de lujo ...................116
3.2.12.3.3. Ensayos en sopo e Sol-Gel...................................118
3.2.12.4. Desa ollo de un senso óp ico en un sis ema
de inyección de lujo FIA................................................121
3.2.13. Mé odo y So wa e Es adís icos.........................................122
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.............................................................124
4.1. ESTUDIO DE LA ADICIÓN DE CICLODEXTRINAS EN
MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL RECUENTO
DE HONGOS CONTAMINANTES DE ALIMENTOS Y PARA
LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE CEPAS
AFLATOXIGÉNICAS...................................................................125
4.1.1. E ec o de la adición de ciclodex inas a los medios de
cul i o....................................................................................127
4.1.2. E ec o del ipo de ciclodex ina.............................................131
4.1.3. E ec o de la concen ación de ciclodex ina.........................132
4.1.4. E ec o de la composición de los medios de cul i o..............134
4.1.5. E ec o de la empe a u a de incubación...............................135
4.1.6. E ec o del iempo de incubación ..........................................136
4.1.7. Co elación en e la luo escencia y la p oducción de
a la oxinas.............................................................................137
4.2. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS EN MEDIOS AÑADIDOS
CON CICLODEXTRINAS, DEBIDAS A LA PRODUCCIÓN
DE DIVERSOS METABOLITOS POR CEPAS DEL
GÉNERO ASPERGILLUS SPP., EN EL DIAGNÓSTICO DE
CEPAS AFLATOXIGÉNICAS......................................................141
4.2.1. E ec o de la adición de ciclodex inas ..................................142
4.2.2. E ec o de la concen ación de ciclodex inas.......................143
4.2.3. E ec o de la composición del medio.....................................144
4.2.4. Co elación en e la luo escencia y la p oducción
de a la oxinas........................................................................148
4.3. ESTUDIO DE LA ADICIÓN DE CICLODEXTRINAS Y
DESOXICOLATO DE SODIO EN MEDIOS DE CULTIVO
UTILIZADOS PARA EL RECUENTO DE HONGOS
CONTAMINANTES DE ALIMENTOS Y PARA LA
IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE CEPAS
AFLATOXIGÉNICAS...................................................................149
4.3.1. E ec o de la adición de desoxicola o de sodio al
medio de cul i o con ciclodex inas de concen ación
0,3%......................................................................................150
4.3.2. E ec o de la adición de ciclodex ina....................................155
4.3.3. E ec o del ipo de ciclodex ina.............................................156
4.3.4. E ec o de la concen ación de ciclodex ina.........................157
4.3.5. E ec o de la empe a u a de incubación...............................159
4.3.6. E ec o del iempo de incubación ..........................................161
4.3.7. E ec o de la composición de los medios de cul i o..............162
4.3.8. E ec o de la adición de o as sales bilia es ..........................163
4.3.9. Co elación en e la o mación del anillo beige en los
medios MACD, SABCD, PDACD y YCSD y la
p oducción de a la oxinas.....................................................167
4.4. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS EN EL DIAGNÓSTICO
DE CEPAS FLATOXIGÉNICAS, DEBIDAS A LA
PRODUCCIÓN DE DIVERSOS METABOLITOS POR
CEPAS DEL GÉNERO ASPERGILLUS SPP. EN MEDIOS
AÑADIDOS CON CICLODEXTRINAS Y DESOXICOLATO
DE SODIO...................................................................................170
4.4.1. E ec o de la adición de ciclodex inas ..................................170
4.4.2. E ec o de la composición del medio.....................................170
4.4.3. E ec o del uso de desoxicola o de sodio como
adi i o de los medios añadidos con 0,3% ciclodex ina...........173
4.4.4. Co elación en e la luo escencia y la p oducción
de a la oxinas........................................................................178
4.5. OBSERVACIÓN DE RTP EN MEDIOS DE CULTIVO
LÍQUIDOS ...................................................................................179
4.5.1 Análisis del p ecipi ado blanco..............................................180
4.6. EMPLEO DEL NUEVO MEDIO DE CULTIVO MACD:
RECUENTO TOTAL DE MOHOS Y LEVADURAS ....................182
4.6.1. P epa ación del medio de cul i o MACD..............................183
4.6.2. Recuen o de mohos y le adu as en dis in os alimen os
come cializados en Galicia................................................184
4.6.2.1. Recuen os de mohos y le adu as en el medio
MACD.............................................................................185
4.6.2.2. Compa ación de los ecuen os de mohos, le adu as y
o ales, ob enidos con el nue o medio de cul i o y
o os medios de cul i o u ilizados adicionalmen e
con es e in.....................................................................188
4.6.2.2.1. Compa ación de los esul ados ob enidos
u ilizando el nue o medio MACD y el medio de
cul i o aga Sabou aud dex osa (SAB) .................188
4.6.2.2.2. Compa ación de los esul ados ob enidos con
los medios de cul i o MACD y aga ex ac o
de mal a (MA) .........................................................192
4.6.2.2.3. Compa ación de los esul ados ob enidos en e
los medios de cul i o usados habi ualmen e aga
Sabou aud dex osa (SAB) y el medio de cul i o
ex ac o de mal a (MA) ...........................................196
4.6.2.3. Análisis de los dis in os géne os úngicos aislados de
las mues as de alimen os.................................................204
4.6.2.3.1. Géne os úngicos aislados en mues as de
alimen os u ilizando medio MACD...........................204
4.6.2.3.2. Géne os úngicos aislados en mues as de
alimen os u ilizando medio SAB..............................207
4.6.2.3.3. Géne os úngicos aislados en mues as de
alimen os u ilizando medio de cul i o MA................209
4.6.2.3.4. Compa a i a en e los dis in os medios de cul i o
MACD, SAB y MA de los dis in os géne os
úngicos aislados en mues as de alimen os y
piensos.....................................................................211
4.6.2.3.5. Géne os úngicos aislados según los dis in os
ipos de alimen os....................................................214
4.6.2.4. Capacidad a la oxigénica de las cepas de Aspe gillus
la us...........................................................................222
4.6.3. Recuen o o al de mohos y le adu as en mues as de
alimen os concen ados y ma e ias p imas pa a
alimen ación animal .............................................................226
4.6.3.1. Recuen o o al de mohos y le adu as en mues as de
alimen os concen ados pa a ganado acuno ..............226
4.6.3.2. Recuen o o al de mohos y le adu as en mues as
de ma e ias p imas pa a piensos de ganado acuno ....230
4.6.3.3. Compa ación en e los esul ados ob enidos
u ilizando el nue o medio MACDy el medio SAB..........235
4.6.3.3.1. Compa ación de los ecuen os en mues as de
alimen os concen ados pa a ganado acuno.........235
4.6.3.3.2. Compa ación de los ecuen os en mues as de
ma e ias p imas .......................................................239
4.6.3.4. Análisis de los dis in os géne os úngicos aislados
en mues as de alimen os concen ados .......................244
4.6.3.4.1. Géne os úngicos aislados en el medio de
cul i o MACD ...........................................................244
4.6.3.4.2. Géne os úngicos aislados en mues as de
alimen os concen ados u ilizando SAB ..................246
4.6.3.5. Compa a i a en e los medios de cul i o SAB y
MACD de los dis in os géne os úngicos aislados
en mues as de alimen os concen ados .......................247
4.6.3.6. Análisis de los dis in os géne os úngicos aislados
en mues as de ma e ias p imas....................................251
4.6.3.6.1. Géne os úngicos aislados en el medio de
cul i o MACD ...........................................................251
4.6.3.6.2. Géne os úngicos aislados en mues as de
ma e ias p imas u ilizando SAB...............................253
4.6.3.6.3. Compa a i a en e los medios de cul i o SAB y
MACD de los dis in os géne os úngicos
aislados en mues as de ma e ias p imas...............255
4.6.3.7. Pe il a la oxigénico de las mues as analizadas ...........258
4.6.3.7.1. Pues a a pun o de los mé odos analí icos
u ilizados pa a la de e minación de la p esencia
de mico oxinas.........................................................260
4.6.3.7.2. P esencia de a la oxinas y mohos a la oxigénicos..260
4.6.3.7.2.1. En mues as de piensos ....................................261
4.6.3.7.2.2. En mues as de ma e ias p imas.......................264
4.7. OBTENCIÓN DE RTP DE AFLATOXINA B1 “in i o” .................264
4.7.1. Ob ención de RTP en disolución (F-RTP) ...........................264
4.7.1.1. Fos o escencia inducida po á omo pesado
(HAI-RTP) ......................................................................267
4.7.1.2. Fos o escencia en p esencia de ciclodex inas
(CD-RTP) ......................................................................268
4.7.1.3. Fos o escencia en medio micela (MS-RTP) ................268
4.7.1.4. Fos o escencia en disolución de ciclodex ina
con desoxicola o de sodio..............................................268
4.7.2. Ob ención de os o escencia a empe a u a ambien e
en sopo e sólido (SS-RTP) ..............................................269

4.7.2.1 Ensayos en papel il o (Ensayo 10) ..............................269
4.7.2.2. Ensayos con esinas de in e cambio iónico y gel
de sílice ..........................................................................274
4.7.2.3. Ensayos en sopo e Sol-Gel (Ensayo 14) .....................287
4.7.3. Desa ollo de un senso óp ico en un sis ema de
inyección de lujo FIA............................................................288
5. CONCLUSIONES.................................................................................291
6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................293
APÉNDICE II. ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Es uc u as del géne o Aspe gillus spp. ......................................5
Figu a 2. Esquema de la sín esis de la a la oxina B1 ................................15
Figu a 3. Es uc u a de las p incipales a la oxinas.....................................17
Figu a 4. Diag ama de Jablonskii. .............................................................50
Figu a 5. Es uc u a de las ciclodex inas ..................................................55
Figu a 6. Esquema del p ocedimien o seguido pa a lle a a cabo la
ex acción po diálisis di ásica .................................................106
Figu a 7. Empaque ado “en seco” de la celda de lujo ............................117
Figu a 8. Diag ama de un sis ema FIA diseñado pa a la de ección
RTP con inua de AFB1.............................................................122
Figu a 9. Examen bajo luz UV de: a) colonia a la oxigénica de A.
pa asi icus NRRL 2999 y b) colonia no a la oxigénica de
A. la us NRRL 6538 obse adas al e ce día de
incubación a 28°C en el medio PDA adicionado con
0,3% CAVASOL® (PDACYD)..................................................128
Figu a 10. a) Obse ación de la pigmen ación ama illa al e e so
de la colonia a la oxigénica de A. pa asi icus NRRL
2999. b) Pigmen ación ausen e al e e so de la colonia
no a la oxigénica de A. la us NRRL 6538. Ambas cepas
ue on cul i adas du an e 5 días en el medio PDACYD a
28°C .........................................................................................128
Figu a 11. a) C oma og ama ípico de una mezcla pa ón de
a la oxinas inyec ada al sis ema desa ollado po
Cepeda y col. (1996). b) C oma og ama del ex ac o
clo o ó mico de un cul i o de la cepa a la oxigénica A.
pa asi icus NRRL 2999 en el medio PDA suplemen ado
con 0,3% de CAVASOL®, cul i ada a 28ºC du an e10
días. c) C oma og ama del ex ac o clo o ó mico de un
cul i o de la cepa a la oxigénica A. pa asi icus NRRL
2999 en el medio TSA suplemen ado con 0,3% de
CAVASOL® en las mismas condiciones. ................................138
Figu a 12. Obse ación del i aje a colo osa po exposición a
apo es de NH3 del e e so de a) la colonia
a la oxigénica A. pa asi icus NRRL 2999 y b) i aje de
colo ausen e al e e so de la colonia no a la oxigénica
de A. la us NRRL 6538, ambas cepas ue on cul i adas
a 28°C en el medio PDACYD du an e 5 días. .........................139
Figu a 13. Obse ación de colonias de Aspe gillus bajo luz UV: a)
la imagen b illan e co esponde a la luo escencia de la
cepa a la oxigénica A. pa asi icus NRRL 2999 bajo luz
UV, al quin o día de incubación a 28ºC, compa ada con
b) un cul i o de la cepa de A. och aceus NRRL 2917, la
cual no exhibe luo escencia. Ambas cepas ue on
cul i adas du an e 5 días en aga ex ac o de mal a MA
suplemen ado con 2% CAVASOL®..........................................143
Figu a 14. Fluo escencia de la cepa a la oxigénica A. pa asi icus
NRRL 2999 (al cen o de la placa Pe i) al e ce día de
incubación. Las colonias de A. níge , E. he ba io um, A.
e eus, A. scle o io um, A. ch aceous, A. cla a us y A.
o yzae (en sen ido de las manecillas del eloj) no
exhiben luo escencia. Las cepas ue on cul i adas a
28ºC en medio SAB suplemen ado con CAVASOL®
0,3%. ........................................................................................145
Figu a 15. a) Obse ación di ec a de un anillo beige al ededo de
la colonia a la oxigénica de A. pa asi icus NRRL 2999, el
cual no es obse able al ededo de las colonias no
a la oxigénicas de la cepa A. la us NRRL 6538 al e ce
día de incubación a 28ºC en medio Sabou aud-dex osa
suplemen ado con 0.3% CAVASOL® y 0.6% NaDC. b)
Obse ación de la mismaplaca bajo luz UV: el anillo
mues a luo escencia que no se obse a al ededo de
las colonias no p oduc o as de a la oxinas..............................154
Figu a 16. a) Obse ación di ec a de cul i os de la cepa
a la oxigénica A. pa asi icus NRRL 2999 (de echa) y de
la cepano a la oxigénica A. la us NRRL 6835
(izquie da) cul i adas en medio MACD al quin o día de
incubación a 28ºC. b) Obse ación de las mismas
placas después de exci a a 365 nm con una lámpa a
UV. La RTP emi ida po la cepa a la oxigénica (que no
emi e la cepa no a la oxigénica) ue cap ada du an e 2,5
segundos de exposición con una cáma a o og á ica
digi al. ......................................................................................155
Figu a 17. Obse ación de la pigmen ación ama illa al e e so de
la coloniaa la oxigénica de A. pa asi icus NRRL 2999
ausen e al e e so de las colonias de la cepa no
a la oxigénica A. la us NRRL 6538, cul i adas en el
medio MACD al quin o día de incubación a 28°C....................156
Figu a 18. Obse ación di ec a de las placas de cul i o de la cepa
a la oxigénica A. pa asi icus NRRL 2999 al e ce día de
incubación a 28ºC en medio de cul i o SAB,
suplemen ado con CAVASOL® y a) 0,6% ácido cólico o
b) 0,6% NaDC. ........................................................................165
Figu a 19. a) C oma og ama ípico de una solución de mezcla
pa ón de a la oxinas inyec ada al sis ema desa ollado
po Cepeda y col., (1996). b) C oma og ama del ex ac o
clo o ó mico de un cul i o de la cepa a la oxigénica A.
pa asi icus NRRL 2999 en el medio YSCD du an e10
días a 28ºC. .............................................................................168
Figu a 20. a) Obse ación di ec a de un anillo beige al ededo de
la colonia a la oxigénica de A. pa asi icus NRRL 2999, la
cual no es obse able al ededo de las colonias no
a la oxigénicas de A. och aceus NRRL 5220 al e ce día
Tabla 13. Respues a luo escen e y p esencia del halo beige
al ededo de las colonias de la cepa a la oxigénica A.
pa asi icus NRRL 2999 después de 5 días de incubación
a 28 ºC en los 12 medios de cul i o suplemen ados con
0.3% CD y 0.6%NaDC, y su co elación con el mé odo
c oma og á ico. ........................................................................153
Tabla 14. Compa ación del e ec o de la concen ación y del ipo de
CD, al quin o día de incubación a 28ºC de la cepa
a la oxigénica A. pa asi icus NRRL 2999 en diez medios
de cul i o suplemen ados con 3 ciclodex inas en 2
concen aciones y 0,6% NaDC................................................158
Tabla 15. Compa ación del diáme o en cen íme os de anillo
beige al ededo de las colonias de la cepa a la oxigénica
A. pa asi icus NRRL 2999 cul i ada en los medios
MACD y YSCD a las es empe a u as de incubación. .........160
Tabla 16. E olución de la RTP “in i o” de 5 epas a la oxigénicas y
1 cepa no a la oxigénica del g upo Aspe gillus la us
cul i adas en medio YSCD a 28ºC..........................................162
Tabla 17. Fluo escencia, emisión RTP y p esencia del anillo beige
al ededo de las colonias de la cepa a la oxigénica A.
pa asi icus NRRL 2999 al e ce día de incubación a
28ºC en medios de cul i o suplemen ados con
CAVASOL® y NaDC o las es sales bilia es al e na i as
ensayadas................................................................................166
Tabla 18. pH y ac i idad de agua de los 4 medios de cul i o
suplemen ados con 0,3% CAVSOL® y 0,6%
desoxicola o de sodio y el medio pa a mohos xe ó ilos. .........172
Tabla 19. P esencia del halo beige, espues a luo escen e y
emisión RTP y al quin o día de incubación a 28ºC de 5
cepas a la oxigénicas y 4 cepas no a la oxigénicas del
g upo Aspe gillus sección Fla i, 6 cepas de Aspe gillus
nige g oup y de o as 17 cepas de Aspe gillus spp.

cul i adas en los 4 medios decul i o adicionados con
0,3% CAVASOL® y 0,6% NaDC y su co elación con el
mé odo c oma og á ico. ...........................................................176
Tabla 20. Recuen os de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y SAB, al
quin o día de incubación a 28ºC. ............................................186
Tabla 21. Recuen os de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y SAB, al
quin o día de incubación a 28ºC. ............................................190
Tabla 22. Recuen os mohos (log u c/g), en mues as de alimen os,
en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de
incubación a 28ºC. ..................................................................190
Tabla 23. Recuen os o ales (log u c/g) de mohos y le adu as, en
mues as de alimen os, en los medios de cul i o MACD
y SAB al quin o día de incubación a 28ºC. .............................190
Tabla 24. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................193
Tabla 25. Recuen o de mohos (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................194
Tabla 26. Recuen os o ales (log u c/g), en mues as de alimen os,
en los medios de cul i o MACD y MA, al quin o día de
incubación a 28ºC. ..................................................................194
Tabla 27. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os é nicos, en los medios de cul i o SAB y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................197
Tabla 28. Recuen o de mohos (log u c/g), en mues as de
alimen os é nicos, en los medios de cul i o SAB y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................198
nige g oup y de o as 17 cepas de Aspe gillus spp.
cul i adas en los 4 medios decul i o adicionados con
0,3% CAVASOL® y 0,6% NaDC y su co elación con el
mé odo c oma og á ico. ...........................................................176
Tabla 20. Recuen os de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y SAB, al
quin o día de incubación a 28ºC. ............................................186
Tabla 21. Recuen os de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y SAB, al
quin o día de incubación a 28ºC. ............................................190
Tabla 22. Recuen os mohos (log u c/g), en mues as de alimen os,
en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de
incubación a 28ºC. ..................................................................190
Tabla 23. Recuen os o ales (log u c/g) de mohos y le adu as, en
mues as de alimen os, en los medios de cul i o MACD
y SAB al quin o día de incubación a 28ºC. .............................190
Tabla 24. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................193
Tabla 25. Recuen o de mohos (log u c/g), en mues as de
alimen os, en los medios de cul i o MACD y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................194
Tabla 26. Recuen os o ales (log u c/g), en mues as de alimen os,
en los medios de cul i o MACD y MA, al quin o día de
incubación a 28ºC. ..................................................................194
Tabla 27. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os é nicos, en los medios de cul i o SAB y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................197
Tabla 28. Recuen o de mohos (log u c/g), en mues as de
alimen os é nicos, en los medios de cul i o SAB y MA, al
quin o día de incubación a 28ºC..............................................198
Tabla 39. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
especias, en los medios de cul i o SAB y MA, al quin o
día de incubación a 28ºC. .......................................................202
Tabla 40. Recuen o de mohos (log u c/g), en mues as de
especias, en los medios de cul i o SAB y MA, al quin o
día de incubación a 28ºC. .......................................................202
Tabla 41. Recuen os o ales (log u c/g), en mues as de especias,
en los medios de cul i o SAB y MA, al quin o día de
incubación a 28ºC. ..................................................................202
Tabla 42. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os a iados, en los medios de cul i o SAB y MA,
al quin o día de incubación a 28ºC. ........................................203
Tabla 43. Recuen o de le adu as (log u c/g), en mues as de
alimen os a iados, en los medios de cul i o SAB y MA,
al quin o día de incubación a 28ºC. ........................................203
Tabla 44. Recuen os o ales (log u c/g) de mohos y le adu as, en
mues as de alimen os a iados, en los medios de
cul i o SAB y MA, al quin o día de incubación a 28ºC. ..........203
Tabla 45. F ecuencia de la p esencia (%) de los dis in os géne os
úngicos aislados de mues as de alimen os cul i adas
en el medio MACD. .................................................................206
Tabla 46. F ecuencia de la p esencia ( an o po 100) de los
dis in os géne os úngicos aislados de mues as de
alimen os cul i adas en el medio SAB. ...................................208
Tabla 47. F ecuencia de la p esencia ( an o po 100) de los
dis in os géne os úngicos aislados de mues as de
alimen os cul i adas en el medio MA. .....................................210
Tabla 48. F ecuencia de apa ición de los géne os en los es
medios de cul i o. ...................................................................212
Tabla 49. Tan o po cien alcanzado po cada géne o en los es
medios, en el o al de los alimen os. .......................................212
Tabla 50. Géne os úngicos encon ados en alimen os é nicos en
los es medios empleados. ....................................................216
Tabla 51. Géne os úngicos encon ados en u os secos en los
es medios empleados. ..........................................................217
Tabla 52. Géne os úngicos encon ados en u os desecados en
los es medios empleados. ....................................................218
Tabla 53. Géne os úngicos encon ados en especias en los es
medios empleados. .................................................................219
Tabla 54. Géne os úngicos encon ados en mues as de é en
cada uno de los es medios empleados. ...............................220
Tabla 55. Géne os úngicos encon ados en alimen os a iados en
los es medios empleados. ....................................................221
Tabla 56. Capacidad a la oxigénica de las cepas de Aspe gillus
la us aislados de los 3 medios de cul i o. .............................223
Tabla 57. Po cen ajes de cepas a la oxigénicas p esen es en los
alimen os en los medios de cul i o empleados. .....................224
APÉNDICE IV. SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS
EMPLEADOS EN EL TEXTO
%: Tan o po cien o
λem: Longi ud de onda de emisión
λex: Longi ud de onda de exci ación
ACN: Ace oni ilo
AF: A la oxina
A s: A la oxinas
AFB1: A la oxina B1
AFB2: A la oxina B2
AFG1: A la oxina G1
AFG2: A la oxina G2
AOAC: Ame ican O ganiza ion o Analy ical Chemis s
APA: Aga pa a la p oducción de a la oxinas
aw: Ac i idad de agua
c.m.c.: Concen ación micela c í ica
c.m.c: Concen ación micela c í ica
CAM: Aga de coco
CAVASOL®: Nomb e come cial del de i ado me ilado de la
β-ciclodex ina (βW7M1.8-cyd)
CD: Ciclodex ina
CDs: Ciclodex inas
CD-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e en p esencia de
ciclodex inas
cm: Cen íme o
CYP: Ci oc omo P450
CZA: Aga Czapek
CH: Cánce hepá ico
DCPA: Aga diclo an clo an enicol pep ona
DG18: Aga diclo an glice ol al 18%
DNA: ácido desoxi ibonucleico

DRBC: Aga diclo an osa de bengala clo an enicol
ELISA: Enzime linked immunoso ben assay
F: Fluo escencia
FIA: Análisis po inyección de lujo
g: G amo
HAI-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e inducida po á omo
pesado
HPLC: C oma og a ía líquida de al a esolución
HPTLC: C oma og a ía en capa ina de al a esolución
IARC: In e na ional Agency o Resea ch o Cance
IUPAC: In e na ional Union o Pu e and Applied Chemis y
Kg: Kilog amo
l: Li o
LC/MS: C oma og a ía líquida/espec ome ía de masas
LD: Lími e de de ección
LD50: Dosis le al media
LHICA: Labo a o io de higiene, inspección y con ol de alimen os
log: Loga i mo
M: Mola
mM: mili mola
MA: Aga ex ac o de mal a
MACD: Aga mal a suplemen ado con CD y desoxicola o de sodio
Max: Valo máximo de una lis a de alo es
Med: Media a i mé ica de una lis a de alo es
Min: Valo mínimo de una lis a de alo es
ml: Milili o
mm: Milíme o
MS/MS: Espec ome ía de masas en ándem
MS: Espec o o ome ía de masas
ms: Milisegundo
MS-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e en medio micela
MTMOS: Me il ime oxisilano
MY40G: Aga ex ac o de mal a y glucosa al 40%
MYSA: Aga mal a, le adu a y saca osa
N: No mal
n: Núme o de mues as
NaDC: Desoxicola o de sodio
nm: Nanóme o
NP-HPLC: C oma og a ía líquida de al a esolución en ase no mal
NP-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e en medio no p o egido
NRRL: No he n Regional Resea ch Labo a o y
ns: Nanosegundo
ºC: G ado cen íg ado
OGY: Aga oxi e aciclina glucosa ex ac o de le adu a
OMS: O ganización mundial de la salud
PAH: Hid oca bu os a omá icos policíclicos
PBPB: B omu o pe b omu o de pi idinio
PDA: Aga pa a a dex osa
PDACD: Aga pa a a dex osa suplemen ado con CD y desoxicola o de sodio
pH: Loga i mo de la concen ación de hid ogeniones
ppb: Pa es po billón (µg/kg oµg/l)
ppm: Pa es po millón (mg/kg)
RNA: Acido ibonucleico
RP-HPLC: C oma og a ía líquida de al a esolución en ase e e sa
RSD: Des iación es ánda ela i a
RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e
SAB: Aga Sabou aud dex osa
SABCD: Aga Sabou aud dex osa suplemen ado con CD y desoxicola o de
sodio
SD: Des iación es ánda
SDS: Dodecilsul a o sódico
SIDA: Sínd ome de inmunode iciencia adqui ido
SPE: Ex acción en ase sólida
spp.: Especie
S-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e sensibilizada
SS-RTP: Fos o escencia a empe a u a ambien e sob e sopo es sólidos
d : Tiempo de demo a
TFA: Acido i luo oacé ico
g : Ven ana empo al de media
THF: Te ahid o u ano
TLC: C oma og a ía en capa ina
TMOS: Te ame oxisilano
TSA: Aga ip ona soja con poliso ba o 80 y leci ina
u c/g: Unidades o mado as de colonias po g amo
UV: Ul a iole a
WHO: Wo ld Heal h Oganiza ion
YCYD: Aga ex ac o de le adu a-saca osa suplemen ado con CD
YES: Aga ex ac o de le adu a- saca osa
YGC: Aga ex ac o de le adu a glucosa clo an enicol
YSCD: Aga ex ac o de le adu a-saca osa suplemen ado con CD y
desoxicola o de sodio
µg: Mic og amo
µl: Mic oli o
µm: Mic ome o
1. INTRODUCCIÓN
In oducción
8
úngica de sis emas de ex acción de ai e, donde se obse ó una al a
e ec i idad de la luz UV pa a educi la can idad de espo as con aminan es en
el ai e (Le e in y col., 2001).
1.1.4. Signi icado de la con aminación úngica de los alimen os
El signi icado de la con aminación úngica de los alimen os de i a no
sólo del po encial de los hongos pa a de e io a los, sino ambién del po encial
de muchos de ellos pa a p oduci una g an a iedad de mico oxinas a las que
el homb e p esen a suscep ibilidad. Además, la mayo ía de los hongos son
capaces de p o oca in ecciones y eacciones alé gicas en pe sonas
hipe sensibles a los an ígenos úngicos. Hoy en día, la p esencia/ausencia de
hongos en los alimen os se conside a como un índice de las condiciones
higiénicas de la ma e ia p ima y de las condiciones de manipulación du an e
la elabo ación de p oduc os alimen icios.
La con aminación úngica de los alimen os puede conside a se desde
un doble aspec o (Be engue , 2000):
1. Ac uación sob e los alimen os (biocon e sión):
-De ec os de aspec o. El c ecimien o de los hongos sob e los
alimen os p oduce olo es indeseables, cambios en la ex u a po p o eolisis y
manchas colo eadas an o en supe icie como en el in e io , lo que conlle a a
una mala p esencia que se aduce en la pé dida de ca ego ía e incluso en el
echazo o al del p oduc o.
-Modi icaciones químicas
-Reducción del alo nu icional
-Cambios de ca ác e o ganolép ico
-Di icul ades de conse ación

In oducción
9
2. Ac uación sob e el homb e y los animales:
-Pa ógena (micosis): el hongo pene a en el ejido y se desa olla en
el in e io , suele a ec a a mucosas y piel, pe o en indi iduos
imnumocomp ome idos, puede llega a a a esa la ba e a hema o-
ence álica, e in adi el ejido ne ioso.
-Inmunológica (ale gias): p oducidas po la con aminación ambien al
y ambién po mico oxinas y hongos p esen es en los alimen os
-Tóxica (mico oxicosis): el hongo c ece sob e el alimen o y elabo a
las oxinas que p oducen la in oxicación. Según la oxina que las p oducen se
denominan: a la oxicosis, islandicosis, usa iosis, cla a oxicosis.
1.1.5. P esencia na u al de hongos y mico oxinas en alimen os
Los hongos son con aminan es comunes en p oduc os alimen icios,
dada su capacidad ubicuis a y su g an esis encia, además la mayo ía de los
alimen os cons i uyen excelen es medios pa a la sus en ación y ep oducción
de g an núme o de especies úngicas.
La in asión úngica de alimen os puede ocu i en cualquie e apa de
la cadena de p oducción alimen icia: de la siemb a a la cosecha, du an e el
anspo e y almacenamien o (F is ad y Samson, 1992), du an e la
p epa ación de los mismos en es au an es y hoga es e incluso en el
momen o de se consumidos.
El c ecimien o de un de e minado ipo de hongo en un alimen o
depende de a ios ac o es, como son: pH, humedad, empe a u a,
ca ac e ís icas del sus a o (elemen os nu i i os, es uc u as biológicas),
condiciones de p ocesado y almacenamien o, e c. Así, se encuen a que
sob e un mismo sus a o apa ecen géne os de hongos di e en es a lo la go
de su ida (No hol y Van Egmond, 1982).
In oducción
10
Los hongos p oduc o es de mico oxinas son abundan es en la
na u aleza y las condiciones a o ables pa a que es os mic oo ganismos las
sin e icen, pueden se conseguidas ácilmen e, po es a azón, se ha llegado
a la conclusión de que muy pocas sus ancias comes ibles pueden se
conside adas segu as de no su i con aminación po mico oxinas.
El p oblema de la con aminación úngica más que la p esencia del
p opio hongo, lo cons i uye la apa ición de mico oxinas y la mayo ía de las
especies que las p oducen no p esen an di icul ades pa a desa olla se en
hojas, allos, ce eales, semillas, ca ne, g asas, p oduc os lác eos, e c.
(Be ina, 1984; Ja is y Williams, 1987; Ba ine y Tan aoui-Ela aki, 1997;
El em, 1996).
La exis encia de hongos en un alimen o no indica necesa iamen e
una con aminación con mico oxinas pe o si es un ac o de iesgo impo an e
pa a que és as se p oduzcan. Del mismo modo, puede de ec a se una
mico oxina sin la p esencia del hongo p oduc o , ya que es e pudo habe sido
inac i ado po di e sos a amien os (pas e ización, es e ilización, e c.),
p ocesos químicos o al e ación de ac o es ambien ales, mien as que las
mico oxinas pe manecen en el sus a o.
1.1.5.1. P esencia na u al de Aspe gillus y a la oxinas en
alimen os
El géne o Aspe gillus la us es uno de los más comúnmen e
encon ados como con aminan e de nume osos p oduc os alimen icios pa a
consumo humano y animal.
Su p esencia ha sido in o mada en análisis mic obiológicos de una
amplia a iedad de p oduc os como po ejemplo: nueces y semillas
oleaginosas de Tailandia, especias y hie bas, p oduc os é nicos de la India y
de Tu quía, a oz, in eg al y pelado, en e o y molido, de g anos pequeños,
len eja, de semillas de ama an o, so go, de semillas pa a ensilaje, de ha ina
In oducción
11
de igo, maíz en g ano, ha ina de maíz y sus de i ados, de leche en pol o,
en e a y desna ada, de p oduc os lác eos, de pasas de dá il, de ci uela y de
u a, de las canales de ca ne de aca, de co chos na u ales, de semillas de
calabaza, de piensos pa a masco as, de a ellanas, de p oduc os de
cacahue e y de coco.
Debido a su ca ác e ubicuis a, los o ganismos de la especie A. la us
no solo ac úan como agen es de e io an es de los p oduc os que con aminan,
sino que ambién, bajo condiciones p opicias de sus a o, humedad y
empe a u a que se dan du an e el almacenamien o, algunas cepas son
capaces de p oduci a la oxinas; se ha demos ado que es as sus ancias
esul an hepa o óxicas, cance ígenas y mu agénicas po inges ión c ónica
(Wild y Tu ne , 2002). La abla 1 mues a una se ie de alimen os en los que
las a la oxinas han sido encon adas na u almen e.
In oducción
12
Tabla 1. P esencia na u al de a la oxinas en di e sos alimen os.
Alimen o Re e encias
Acei e de oli a
Alimen os hailandeses
(oleaginosas,habas,nueces)
Da adimos y col., 2000
Pi , Hocking, y col ,1994
Almend as Schade y col.,1981; Tu elyan, 1989; Ahmed y Robinson, 1998;
Scha zki y Ong, 2000
A oz y de i ados Manabe y col., 1978; Soa es y col., 1989; Midio y col., 2001
Cacahue es y de i ados
F ancis y col., 1982; Do ne y Cole, 1988; Tu elyan, 1989 Pa ey
y Sha man, 1990; Aze y Coope , 1991; Roch y col., 1992;
Wood, 1992; Niedwe zki y Lach, 1994; Taguchi y col. 1995;
Sha zki, 1998; Ali y col., 1999; Neal y col., 2001
Ca ne Ismail y Zaky, 1999
Cebada Tu elyan y col., 1989
Ce eza Sco y Law ence, 1997 Nakajima y col., 1999
De i ados de soja Kim y col., 2001
Especias y hie bas
Awe y Sch anz, 1981; Ga ne y col., 1993; El-Kady y col., 1995;
Rei y Me zge , 1995; Fu a y U ga, 1996; MacDonald y Cas le,
1996; Ma ins y col., 2001
Ha ina de igo Cu uli de Simón y col., 1983; Tu elyan, 1989; Abouzied y col.,
1991; Midio y col., 2001
Higos Sha man y col., 1991
Hue os S olo y T uckses, 1978; Micco y col., 1987
Judías
Len ejas sudanesas
Wei y col. 1980; Tu elyan, 1989; Tseng y col., 1995; Midio y
col., 2001
El-Nage abi y Elsha ie, 2000
Maíz y de i ados
Cohen y Lapoin e, 1981; Howell y Taylo , 1981; Hu chins y
Hagle , 1983; Hea hco e, 1984; F ancis y Col., 1988; Shah y
Hamid, 1989; Tu elyan y col., 1989; Wilson y Rome , 1991;
Baldisse a y col., 1992; Joshua, 1993; To es Espinosa y col.,
1995; Resnik y col., 1996; Yoshizawa y col., 1996; Scudamo e
y col., 1997; Ali y col., 1998; Glo ia y col., 1998; O a y col.,
1998; Ali y col., 1999; Fu long y col., 1999; Jana dhana y col.,
1999; Kpodo y col., 2000; Midio y col., 2001
Nueces y de i ados
Shah y Hamid, 1989; Aze y Coope , 1991; Wood, 1992;
T ucksess y col.,1994; Fu iani y col., 1996; Ramesh y col.,
1996; Ahmed y col., 1998
Piensos y/o ma e ias
p imas
Abdelhamid, 1990; Bane jee y She y, 1992; Valdman y col.,
1992; Wood, 1992; P ice y col., 1993; El-Ma aghy y col., 1996;
Phillips y col., 1996; Dalce o y col., 1997; Scudamo e y col.,
1998; Scudamo e y Pa el, 2000
Pis achos Niedwe zki y Lach, 1994; Mahoney y Rod iguez, 1996; Ahmed
y Robinson, 1998; Scha zki, 1998; Candlish y col., 2001
So go Da Sil a y col., 2000
In oducción
13
1.1.6. Mico oxinas: Concep o y o igen
El é mino mico oxina p o iene de las palab as g iegas "mykes" que
signi ica hongo y " oxicum" que signi ica eneno (Goldbla , 1972) y designa
cie os me aboli os secunda ios óxicos p oducidos po hongos que pueden
p oduci acciones ad e sas en los o ganismos i os, especialmen e en
animales y humanos.
El me abolismo secunda io de los hongos comp ende esencialmen e
p ocesos de sín esis cuyos p oduc os no desempeñan un papel demasiado
e iden e en la unción del mic oo ganismo. Compa a i amen e a o os
o ganismos, es e me abolismo secunda io es á inc eíblemen e desa ollado
en e los hongos mic oscópicos, dando luga a una eno me di e sidad de
moléculas (mico oxinas, an ibió icos, gibe elinas y alcaloides). Dichos
me aboli os, con ca ac e ís icas muy pa icula es, se ag upan po su simili ud
química, ya que en gene al se de i an de una misma ed me abólica o po la
na u aleza de su ac i idad, y se p oducen o no, dependiendo en g an medida
de las condiciones del en o no en que se encuen e en ese momen o el
o ganismo. Bé dy (1974) p opuso una clasi icación química de los an ibió icos
en la que se incluía a las mico oxinas, en e o as azones, po que son
ambién me aboli os secunda ios y p esen an ac i idad an ibió ica.
La mayo pa e de es os me aboli os secunda ios se o iginan en la
u a police ónica. Así, a pa i de una cadena gene al police ónica (del ipo R-
CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-SCoA), se de i an la mayo ía de las
mico oxinas con inclusiones inales de an aquinonas, compues os
he e ocíclicos y lac onas mac ocíclicas (Tu ne , 1976). Los enzimas
implicados en el me abolismo secunda io, al con a io de los del p ima io, son
muy poco especí icos, lo que pe mi e una mayo “plas icidad” en lo que se
e ie e a la egulación de es as u as. La ac i ación me abólica de las
mico oxinas depende en algunos casos de una ac i idad enzimá ica que los
ans o me en de i ados ac i os, como po ejemplo la a la oxina B1 (Swenson,
1977; Essigmann, 1977; Ga ne y Ma in, 1979) y la oc a oxina A (Hennig y

In oducción
14
col., 1991; Zepnik y col., 2001), pe o hay o os ejemplos como la PR- oxina,
pa ulina, ci inina, ico ecenos y zea alenona que son oxinas di ec amen e
ac i as (Moulé, 1981).
Las mico oxinas a ec an a ó ganos conc e os, ienen un al o e ec o
especí ico en un ó gano dado, la mayo ía p o ocan lesiones g a es en un
sólo ejido y e ec os secunda ios en o os. El hígado no malmen e es el
ó gano ba e a y diana de las mico oxinas, debido a que el paso siguien e
después de la diges ión, consis e en el anspo e po medio de la ci culación
en e ohepá ica, de odos los componen es inge idos, pa a su me abolización
y de oxi icación en el hígado.
Es di ícil es ablece la e iología y las en e medades c ónicas de una
inges ión p olongada de alimen os con cie os ni eles de mico oxinas, ya que
los iesgos pa a la salud humana es án suje os a a ios ac o es:
• Tipo de mico oxina, biodisponibilidad, oxicidad y concen ación
de la misma en el alimen o.
• Sine gismos en e las mico oxinas p esen es.
• Can idad del alimen o consumido y con inuidad o in e mi encia en
la inges ión.
• Peso del indi iduo, es ado isiológico y edad del mismo.
In oducción
15
1.1.7. A la oxinas
Los indi iduos de las especies Aspe gillus la us (muchas cepas de
A. la us Link ex F ies), Aspe gillus pa asi icus Spea e (la mayo ía de las
cepas) y o a especie desc i a ecien emen e Aspe gillus nomius (Ku zman y
col., 1987; Benne , 1988; Egel, 1994), pe o es a úl ima es mucho menos
co ien e, son los únicos que poseen la habilidad de p oduci a la oxinas (AF).
Todos es os hongos han sido clasi icados en la sección Fla i del géne o
Aspe gillus.
Figu a 2. Esquema de la sín esis de la a la oxina B1 ( T ail y col., 1995 Yu y
col., 1995).
La palab a a la oxina es á o mada de acue do a: la p ime a le a “A”
po el géne o Aspe gillus, las siguien es 3 le as “FLA” po la especie la us y
la palab a oxina, que signi ica eneno (CFAST -Council o Ag icul u al
Science and Technology, 1979).
In oducción
16
Se han iden i icado al menos 20 a la oxinas elacionadas
es uc u almen e en e sí, siendo las p incipales las B1, B2, G1, G2, M1 y M2.
De és as, las a la oxinas B1 y G1 se encuen an con mayo ecuencia, la
a la oxina B1 posee la acción más óxica y más ca cinogénica en e odas.
Las le as B y G, hacen e e encia a los colo es luo escen es obse ados
bajo luz ul a iole a (Blue y G een) y la le a M, a que ue aislada en leche
(Milk) de animales; los núme os 1 y 2 indican el o den de elución de es os
compues os en la mayo ía de los sis emas de análisis c oma og á icos
(Hea hco e, 1984).
In oducción
17
Figu a 3. Es uc u a de las p incipales a la oxinas
La luo escencia na u al de las a la oxinas es debida a su es uc u a
pen ahe e ocíclica oxigenada (de i ados di u anocuma ínicos). La pa e más
eac i a de dicha es uc u a es el anillo lac ónico. Po o o lado, la exis encia
del núcleo bi u ano les con ie e una g an igidez, lo que a o ece su
in e acción con algunos componen es celula es (Palmg en y Hayes, 1987).
In oducción
24
ensayos “in i o”. En años pos e io es se egis ó la mue e de 13 niños
chinos como consecuencia de la inges ión de pas as alimen icias (noodles)
con aminadas con a la oxinas. La p esencia de es as mico oxinas se con i mó
“pos -mo em” en mues as de ejidos de los pacien es (Lye y col., 1995). La
en e medad conocida como “ci osis de la niñez India” se debe en pa e a un
en enenamien o a la óxico (Bhanda i y Bhanda i, 1980; Dha y col., 1982;
Bhanda i y Sha da, 1984). El "sínd ome de Reye” ha sido elacionado con la
oxicidad de las a la oxinas (Ryan y col., 1979; Nelson y col., 1980); en
Tailandia, donde el “sínd ome de Reye” es endémico, las a la oxinas B1, G1 y
B2 han sido de ec adas median e c oma og a ía en ejido hepá ico (Smi h y
col., 1995). La p esencia de los me aboli os P1 y Q1 en el hígado ha sido
elacionada con cánce (Qian y col., 1994).
1.1.7.3. Impac o económico
La e aluación de las pé didas económicas de i adas de la p esencia
de a la oxinas en alimen os es compleja, debido a que son muchos los
ac o es a ene en cuen a al ealiza la alo ación (Bu daspal, 1984; Vasan hi
y Bha , 1998). Po una pa e, la de ección de ma e ias p imas o alimen os
con aminados puede ocasiona , desde la pé dida absolu a del p oduc o o
cul i o, has a la pé dida de me cados o la disminución de ing esos po la
en a de es os p oduc os a meno p ecio (Bu daspal, 1984; Palmg en y
Hayes, 1987; Moss, 1991). Se debe ene en cuen a que la ascendencia de
es os hechos en algunos países p oduc o es es no ablemen e ele ada, sob e
odo si se conside a que muchos de es os países es án en ías de desa ollo
y una de sus mayo es uen es de ing esos es la expo ación de ma e ias
p imas pa a la elabo ación de alimen os.
En la mayo ía de los casos, los países a ec ados p esen an una
clima ología a o able pa a la p oducción de a la oxinas y sus sis emas de
almacenamien o y p ocesado no son los más adecuados (Bu daspal, 1984,
Moss, 1991). En consecuencia, las cosechas lib es de a la oxina pueden
albe ga A. la us, los cuales no son de ec ados po las p uebas pa a

In oducción
25
a la oxinas. El hongo puede desa olla se y comenza a p oduci a la oxinas
después de que se haya comp obado la ausencia de las mico oxinas,
especialmen e en las condiciones húmedas y calien es de zonas opicales,
bajo las cuales se almacenan muchos p oduc os que son expo ados hacia
Eu opa. Es o puede daña la economía de en a de cosechas en es as
egiones opicales, debido a que los ag icul o es se en obligados a ende
su p oducción an p on o como se comp ueba que sus cosechas es án lib es
de a la oxinas, en luga de almacena las has a pode exigi un mejo p ecio
(Ho ne y col., 1995).
Exis en pocas al e na i as cuando se de ec a la p esencia de
a la oxinas en pa idas ag ícolas en concen aciones supe io es a las
es ablecidas po la legislación o po di e en es o ganismos (Bu daspal, 1984;
Moss, 1991). Una de ellas es la des ucción o al del p oduc o con aminado.
En o os casos (en semillas o o ajes undamen almen e), es posible el
a amien o con agen es de oxi ican es como el pe óxido de hid ógeno
(Applebaum y Ma , 1982), aldehídos (Codi e y col., 1976; Heimbeche y col.,
1988), p ocedimien os de amoniación (Ga dne , 1971; Pa k y col., 1988;
F ayssine y La a ge-F ayssine , 1990; Hammond, 1991) y uso de sales del
ácido p opiónico (Mo eno-Ma ínez y col., 2001). De es as écnicas, la más
ecomendable po sus e ec os decon aminan es y iabilidad económica es el
empleo de amoniaco (Coke y col., 1985; Sama ajeewa y col., 1990; Pa k,
1993). Los p oduc os a ados de es a o ma, educen signi ica i amen e sus
ni eles de con aminación, siendo segu os pa a la alimen ación de animales
(No ed y Mo isey, 1983; Hoogenboom y col., 2001; Neal y col., 2001). No
obs an e, la de oxi icación no es en able en la mayo ía de los casos po
enca ece el p oduc o y además, es os sis emas no se u ilizan pa a el
a amien o de los alimen os des inados al consumo humano po que pueden
p oduci al e aciones en la calidad o ganolép ica de los mismos y po que no
exis en es udios de e minan es sob e la posible oxicidad de los de i ados
o mados po amoniación en el homb e.
In oducción
26
O o aspec o económico impo an e a conside a , son los gas os
de i ados del uso de p ocedimien os de igilancia y con ol pa a la de ección
de a la oxinas en alimen os, así como de la in es igación sob e sus e ec os
óxicos y el desa ollo de mé odos de análisis (Lynne y col., 1995; C iseo y
col., 2001). También es necesa io conside a las pé didas económicas
de i adas del consumo de piensos con aminados con a la oxinas, po los
animales domés icos y de g anja (Keyl y Boo h, 1971; Tung y col., 1975;
Gu h ie, 1979; Bodine y Me ens, 1983). Es e ipo de pé didas son muy al as
cuando se p oduce la mue e de un ele ado núme o de animales. No
obs an e, dado que los casos de in oxicaciones masi as no son muy
ecuen es en la ac ualidad, hay que ene en conside ación el e ec o del
consumo ei e ado de pequeñas dosis de a la oxinas po los animales
(Bu daspal, 1984; Hussein y B asel, 2001). Es o se aduce en una mayo
sucep ibilidad en e a p ocesos in ecciosos y pa asi a ios, e aso en el
c ecimien o y una disminución gene al de la p oduc i idad de los animales
(Ga ale iciene y col., 2001; O a a li y col., 2002). Debido a que odas es as
consecuencias son di íciles de alo a , el impac o eal en é minos
económicos a ni el mundial, no ha podido se e aluado co ec amen e
(Panangala y col., 1986; Ha ey y col., 1989; Vasan hi y Bha , 1998).
En conclusión, las a la oxinas son me aboli os muy ca cinógenos y
óxicos, que a ec an a cosechas, animales y se es humanos en odo el
mundo. Se asocian a a ias en e medades ales como a la oxicosis y
sínd ome de Reye que pueden causa una se ie de sín omas en se es
humanos y animales incluyendo la mue e. Es e pod ía se el po qué las
a la oxinas son las mico oxinas más conocidas y es udiadas con mayo
in ensidad en el mundo en e o. La abla 2 p opo ciona una lis a de alimen os
en los cuales ha sido demos ada la p esencia de a la oxinas en el pe iodo
1991– 2004.
In oducción
27
Tabla 2. In o mes ecien es de p esencia de a la oxinas en alimen os.
Incidencia Rango
P oduc o País Año (%) (µg /kg)
G ano de sojaa A gen ina 1991 10 1–36
Almend asa USA 1993 1 2–372
Cas añasa USA 1993 17 2–619
Higos secosa Aus ia 1993 13 2–350
Nuez moscadaa Japón 1993 43 0,2–16,6
Pimien osa Pakis án 1995 66 1–79,9
Maízb Bangladesh 1995 67 33
Hie bas, especiasc UK 1996 24 1–51
Cacahue esa India 1996 45 5–833
Maíza A gen ina 1996 20 5–560
Pis achosa Holanda 1996 59 2–165
T igoa U uguay 1996 20 2–20
Cacahue esd Cuba 1996 40 1–50
Maíza India 1997 47 5–666
A oza Ecuado 1997 9 6,8–40
Cacahue ese B asil 1998 51 43–1099
Maíz B asil 1998 38 0,2–129
Especiasg Suecia 1998 90 0,1–62
Pimien osh Tu kía 1998 40 >= 20
Pimien osi India 1999 59 30–969
Ha inasj B asil 2001 9 2,8–1323
Incapa inak Gua emala 2002 100 3–244
C ema de a ellanasl Tu kía 2003 95 1–13
Pimen ónm Tu kía 2004 11 1,1–97,5
aPi e (1998); b Dawla ana (2002); c MacDonald y Cas le (1996); d Escoba y Reguei o
(2002); eF ei as y B igido (1998); Va gas y col., (2001); g Olsen y col., (1998); h
Omu ag y col., (1998); i Reddy y col., (2001); j Midio y col., (2001); k T ucksess y col.,
(2002); l Aycicek y col., (2005); m E dogan (2004).
In oducción
28
1.1.8. P ocedimien os pa a educi la p esencia de a la oxinas
Exis en mé odos ísicos y químicos p opues os pa a educi la
p esencia de a la oxinas en alimen os, y ambién pa a educi la can idad de
hongos con aminan es que las p oducen. En la abla 3 es án esquema izados
los a amien os más comúnmen e u ilizados pa a educi la p esencia de
a la oxinas.
Di e sos compues os químicos han sido p obados po su habilidad
de deg ada e inac i a a la oxinas, pe o la mayo ía no son p ác icos o son
po encialmen e dañinos, debido a la o mación de esiduos óxicos o la
pe u bación del con enido nu icional y las p opiedades o ganolép icas del
p oduc o, es así que el a amien o químico de oxi ican e, es empleado
únicamen e pa a alimen os des inados a consumo animal.
No se puede a i ma que exis a un a amien o e dade amen e e icaz
pa a la eliminación de las a la oxinas, po ello deben aplica se sis emas de
p e ención y con ol.
In oducción
29
Tabla 3. T a amien os u ilizados pa a educi la p esencia de a la oxinas en alimen os.
Mé odos ísicos de
eliminación
Limpieza y sepa ación
Molienda húmeda
Molienda en seco
I adiación
Mé odos ísicos de
de oxi icación
Desac i ación é mica
I adiación
Adso ción Ben oni a, HSCAS
Deg adación química
NH3
Bisul i o sódico en au ocla e
Nix amalización
Sales del ácido p opiónico
Mé odos ísicos de
eliminación
Limpieza y sepa ación
Molienda húmeda
Molienda en seco
I adiación
Mé odos ísicos de
de oxi icación
Desac i ación é mica
I adiación
Adso ción Ben oni a, HSCAS
Deg adación química
NH3
Bisul i o sódico en au ocla e
Nix amalización
Sales del ácido p opiónico

In oducción
30
1.1.9. Legislación pa a el con ol de a la oxinas en alimen os
des inados a consumo humano y animal
El Código Alimen a io Español, en su capí ulo segundo, apa ado
1.02.11., conside a alimen o con aminado odo aquel que con enga gé menes
pa ógenos, sus ancias químicas o adiac i as, oxinas o pa ási os capaces de
p oduci o ansmi i en e medades al homb e o a los animales.
Pa iendo de es a p emisa, los alimen os que con ienen mico oxinas
debe ían clasi ica se como alimen os con aminados, no obs an e,
conside ando que la posibilidad de encon a alimen os con ausencia o al de
con aminan es es una u opía, dis in os países han ijado lími es máximos
pa a di e sos con aminan es en alimen os en e los que se incluyen las
mico oxinas.
Resul a ex emadamen e di ícil es ima con exac i ud la exposición a
a la oxinas, debido a la ín ima can idad p esen e en los alimen os y las
a iaciones de inges a dia ias y es acionales (Chen y Chen, 2002).
En la Unión Eu opea han sido implemen ados ni eles máximos de
con aminación po a la oxinas median e el Reglamen o 2174/2003/CE, po el
que se ija el con enido máximo de de e minados con aminan es en los
p oduc os alimen icios.
In oducción
31
Tabla 4. Ex ac o del Reglamen o 2174/2003/CE.
P oduc o
Con enido máximo de
a la oxinas en µg/kg (ppb)
B1 B1 + B2 + G1
+ G2
2.1.1. Cacahue es, u os de
cásca a* y u os secos
2.1.1.1. Cacahue es, u os de
cásca a y u os secos y p oduc os
de i ados de su ans o mación,
des inados al consumo humano di ec o o
como ing edien e de los p oduc os
alimen icios
2
4
2.1.1.2. Cacahue es des inados a
se some idos a un p oceso de selección,
u o o a amien o ísico, an es del
consumo humano di ec o o como
ing edien e de p oduc os alimen icios
8
15
2.1.1.3. F u os de cásca a y
u os secos des inados a se some idos
a un p oceso de selección, u o o
a amien o ísico, an es del consumo
humano di ec o o de su uso como
ing edien es de p oduc os alimen icios
5
10
In oducción
32
2.1.2. Ce eales (incluído el igo
sa aceno, Fagopy um sp.)
2.1.2.1. Ce eales (incluido el
al o ón, Fagopy um sp.) y p oduc os
de i ados de su ans o mación,
des inados al consumo humano di ec o o
como ing edien e de los p oduc os
alimen icios
2
4
2.1.2.2. Ce eales (incluido el
al o ón, Fagopy um sp.) des inados a
se some idos a un p oceso de selección,
u o o a amien o ísico, an es del
consumo humano di ec o o como
ing edien e de p oduc os alimen icios
2
4
*Sólo la pa e comes ible.
In oducción
33
La Di ec i a 1999/29/CE, es ablece con enidos máximos pa a las
sus ancias y p oduc os indeseables en la alimen ación animal; basándose en
es a di ec i a, el Real Dec e o 747/2001, de 29 de Junio, publicado en el BOE
No. 156 del 30 de junio de 2001, es ablece las sus ancias y p oduc os
indeseables en la alimen ación animal (en e las que se incluyen la a la oxina
B1 y co nezuelo del cen eno) y sus lími es máximos ( abla 5).
Tabla 5. Ex ac o del R.D. 747/2001, de 29 de Junio.
Anexo I
Sus ancias,
p oduc os Alimen os pa a animales
Con enido máximo en
mg/kg (ppm) en alimen os
pa a animales, e e ido a
una humedad del 12%
-Ma e ias p imas pa a la
alimen ación animal* 0,05
B.PRODUCTOS
(A la oxina B1) -Piensos comple os pa a
bo inos, o inos y cap inos
(excep o ganado leche o
e ne os, co de os y cab i os)
0,005
0,01
-Piensos comple os pa a
ce dos y a es (excep o
animales jó enes)
0,02
-O os piensos comple os 0,01
-Piensos complemen a ios
pa a bo inos, o inos y
0,05
In oducción
40
1.1.11.1. Medios de cul i o pa a la p oducción de a la oxinas
El hecho de que no odas las cepas del géne o A. la us sean
capaces de p oduci a la oxinas ha alen ado el desa ollo de mé odos de
sc eening de las mismas pa a conoce su capacidad a la oxigénica.
La u ina gene al pa a un es udio ápido de de ección de posibles
cepas úngicas a la oxigénicas, consis e en inocula una suspensión de
espo as del hongo en el medio de cul i o elegido, con enien e pa a la
p oducción de a la oxinas, líquido o sólido. El medio YES y medios na u ales
con eniendo igo, a oz o cacahue es humedecidos (Da is y col., 1966;
Abou-Gabal, 1981; Mo eno, 1989) han sido u ilizados con es e p opósi o.
Después del pe iodo de incubación se ex aen las oxinas del medio po
simple mezcla y agi ación con un disol en e adecuado como el clo o o mo. El
ex ac o se il a, se concen a y se edisuel e en el disol en e adecuado pa a
su pos e io análisis. La écnica ápida más comúnmen e usada suele se la
c oma og a ía en capa ina TLC, en la que se de ec a la p esencia de
a la oxinas median e el uso de pa ones ex e nos (de Iongh, 1965; Dickes,
1966; Be ina, 1984; El-Banna y col., 1987).
1.1.11.2. Medios ápidos de diagnós ico pa a la de ección de
cepas a la oxigénicas
Examina un g an núme o de cepas aisladas de una a iedad de
sus a os con el p ocedimien o an es desc i o es la go y edioso. Po es a
azón, se han desa ollado nume osos mé odos ápidos de sc eening pa a la
de e minación de la p oducción de a la oxinas median e obse ación de
luo escencia en los medios donde se cul i an cepas aisladas. Dichos
mé odos u ilizan medios de cul i o más o menos complicados que con ienen
adi i os pa a inc emen a la p oducción de a la oxinas y consegui la
de e minación de un á ea luo escen e azul b illan e o e de-azulada
al ededo de las colonias du an e su examen bajo luz ul a iole a. En e es os
mé odos se incluyen un medio líquido sin é ico (Ma eles y Adye, 1964, 1965),

In oducción
41
medios de cul i o complejos con eniendo saca osa, di e en es sales y
cacahue es lib es de a la oxinas (Codne , 1963; De Vogel y col., 1965;
Diene , 1967; Delucca, 1977), un medio consis en e en una base de glucosa,
sales y gel de sílice suplemen ado con ácido a á ico (To ey y Ma h, 1976),
el aga de ex ac o de le adu a suplemen ado con glucosa –GY- (Fil enbo g y
F is ad, 1980), o un medio Czapek-Dox como base, sob e la cual se añadió
lico de maíz (APA) con el mismo in (Sch öede , 1966; Ha a y col., 1974).
También ue on u ilizados di e sos medios con coco como sus a o o
suplemen ados con es e: A secule a ne y col. (1969) elabo a on un medio de
diagnós ico sob e la base del Czapek-Dox, al que adiciona on un 10% de
coco esco, en el que las cepas p oduc o as de a la oxinas mos aban
luo escencia azul muy in ensa. Lin y Dianese (1976) y Da is y col. (1987)
u iliza on el medio aga de coco –CAM- pa a la de ección ápida de cepas
a la oxigénicas. La p oducción de a la oxinas en es e medio es aba asociada
a una pigmen ación ama illo-ana anjada del e e so de las colonias muy
e iden e a simple is a. O os medios que u ilizan coco son aga ex ac o de
coco -CEA- (Lemke y col., 1988, 1989) y aga c ema de coco –CCA- (Dye y
McCammon, 1994) con el cual los au o es añaden la posibilidad de
di e encia en e las cepas a la oxigénicas de A. la us que p esen aban un
anillo luo escen e al ededo , a di e encia de las cepas de A. pa asi icus, que
p esen aban luo escencia po encima de la colonia.
1.1.11.3. O os mé odos pa a diagnós ico de cepas
a la oxigénicas
Según los esul ados obse ados po Sai o y Machida (1999), el
e e so de las colonias a la oxigénicas de A. la us y A. pa asi icus se uel e
de colo osa cuando sus cul i os son expues os a apo es de amoniaco. El
cambio de colo ue obse ado en colonias cul i adas en medios
comúnmen e u ilizados pa a la p oducción de a la oxinas como PDA, medio a
base de coco y medio YES. Es un mé odo de diagnós ico de la p oducción de
In oducción
42
a la oxinas, a a és de eacciones colo eadas, pa a iden i ica cepas
a la oxigénicas de Aspe gillus sección Fla i.
1.1.11.4. Mé odos c oma og á icos
1.1.11.4.1. T a amien os p e ios
El análisis c oma og á ico de las mico oxinas es á p ecedido po una
secuencia de ope aciones gene ales amplias y complejas que incluyen el
mues eo, p epa ación de la mues a, ex acción, pu i icación y concen ación
del ex ac o ob enido an es de los pasos de sepa ación, cuan i icación y
con i mación. Los esul ados de la iden i icación y cuan i icación pos e io ,
es a án de e minados po la e icacia ob enida en es as ope aciones
gene ales (Ja is y col., 1982).
Los ni eles de con aminación en alimen os se encuen an
ípicamen e en el ango mg/kg-µg/kg, po lo que es muy impo an e una
ex acción e icien e de la oxina con la meno can idad de sus ancias
in e e en es como sea posible. Debido a que las mico oxinas se p oducen en
una amplia a iedad de p oduc os, su ex acción depende an o de las
p opiedades isicoquímicas de los p oduc os con aminados como de las
p opiedades de las oxinas (Ikins, 1991). Los sol en es ípicos de ex acción
son el clo o o mo, e il ace a o, me anol, ace ona, ace oni ilo, agua, y
combinaciones de alguno o a ios de los sol en es o gánicos con el agua.
Algunas eces, sol en es comple amen e apola es, como el hexano, se
incluyen en la ex acción cuando la mues a iene un al o con enido en g asas
pa a sepa a las de las mico oxinas.
La mayo ía de las eces, suelen ex ae se al mismo iempo que la
mico oxina de in e és, cie o núme o de sus ancias que pueden in e e i en la
de e minación y cuan i icación de la oxina. Es po ello que, a menudo, es
necesa io pu i ica el ex ac o pa a elimina dichas sus ancias. En cie os
casos la pu i icación puede se muy simple, equi iendo sólo la il ación del
ex ac o. Es o es ecuen e cuando el paso cuan i a i o es muy especí ico,
In oducción
43
como en un ensayo po inmunoa inidad (p. ej. ELISA). En o os casos, la
pu i icación debe á se más igu osa, equi iendo dis in as ope aciones, como
pa ición líquido-líquido; cen i ugación, p ecipi ación, c oma og a ía en
columna, e c. o combinaciones de las mismas. La pu i icación en columnas
iene un uso muy ex endido en el análisis de las mico oxinas. Desde que
Eppley desa olló en 1968 las columnas de pu i icación de sílica gel, una g an
a iedad de columnas de ex acción han sido desa olladas pa a es e
p opósi o. O o ipo de columnas de ex acción son las columnas
mul i uncionales Mycosep, que al con a io del es o, pe mi en el paso de las
mico oxinas, e eniendo las sus ancias in e e en es (Wilson y Rome , 1991) y
las columnas de inmunoa inidad ellenas con an icue pos mono o
policlonales, que jun as, suponen la he amien a más mode na pa a la
pu i icación del ex ac o en el análisis de las mico oxinas (F emy y col., 1989;
Pa ey y col., 1990; Sha man y col., 1991; Fa jam y col. 1992).
La diálisis di ásica pe mi e una ex acción selec i a y e icien e de
anali os de bajo peso molecula a pa i de una amplia a iedad de ma ices,
u ilizando disoluciones acuosas u o gánicas sin necesidad de lle a a cabo la
pos e io pu i icación, ya que ambos pasos se lle an a cabo
simul áneamen e.
La diálisis di ásica ha sido desa ollada pa a sa is ace la necesidad
de me odologías más e icien es pa a la de e minación de las mico oxinas.
Es a aplicación es posible debido a que la mayo ía de es os compues os son
al amen e solubles en disol en es o gánicos y poseen bajo peso molecula ,
las dos p opiedades en que se basa la écnica (Domínguez y col., 1994).
Has a la echa, la p incipal aplicación de la diálisis di ásica en el
análisis de me aboli os úngicos han sido de e minación de a la oxinas a pa i
de leche y de i ados (Díaz y col., 1993, 1995) y pa ulina en zumo de
manzana (P ie a y col., 1994), lo que demues a su e sa ilidad. La diálisis
di ásica puede ene muchas aplicaciones analí icas, siendo un a ance
no edoso y alioso pa a la de e minación de con aminan es en alimen os.
In oducción
44
El paso inal en muchos p o ocolos de pu i icación, es la
concen ación del ex ac o con eniendo la mico oxina, que suele hace se en
un o a apo o median e e apo ación en co ien e de ni ógeno. Una ez
concen ado, el ex ac o es á lis o pa a se edisuel o en sol en es
compa ibles con las oxinas y que sean adecuados al sis ema elegido pa a su
análisis c oma og á ico (Do ne , 1996).
1.1.11.4.2. Aplicación de la c oma og a ía líquida de al a
esolución (HPLC)/de ección luo escen e pa a el análisis de a la oxinas
Las p ime as cuan i icaciones de a la oxinas ue on hechas po
C oma og a ía en capa ina (TLC) y es a écnica aún es muy popula
ac ualmen e. Sin emba go, la HPLC (p incipalmen e po ase e e sa) y el
mé odo inmunoenzimá ico ELISA son los mé odos de cuan i icación
p edominan es en las publicaciones sob e el ema en los úl imos años
(Do ne , 1996), mien as que la C oma og a ía líquida/Espec ome ía de
masas (LC/MS) y la espec ome ía de masas en andem (MS/MS) se aplican
como écnicas con i ma o ias (Gilbe y Va gas, 2003).
La endencia ac ual es el uso de HPLC con de ección luo escen e
pa a el análisis de las mico oxinas, ya que es e mé odo pe mi e analiza
sus ancias e molábiles, no olá iles, iónicas o pola es y p opo ciona al o
pode de esolución en e sus ancias químicamen e simila es; la apidez,
sensibilidad, p ecisión, epe ibilidad y la g an gama de posibilidades que
o ece, la capaci an pa a el análisis de sus ancias de ca ác e muy di e so.
La p incipal en aja sob e o os mé odos pa ece se el po encial pa a su
au oma ización.
Aunque la sepa ación de las a la oxinas po HPLC es ela i amen e
simple, en los p ime os ensayos u ilizando HPLC de ase no mal (NP-HPLC)
y de ección UV, los lími es de de ección alcanzados ue on insu icien es.
Debido a las p opiedades luo escen es de las a la oxinas, se demos ó que
In oducción
45
los sis emas de HPLC con de ección luo escen e e an más sensibles pa a su
de e minación (Panalaks y Sco , 1977; Takahashi, 1977). Un p oblema
exis en e e a que la luo escencia de las AFB1 y AFB2 disminuía en los
disol en es usados en la NP-HPLC. Es o hacía necesa io el uso simul áneo
de dos de ec o es: uno UV pa a la AFB1 y AFB2 y o o de luo escencia pa a
AFG1 y AFG2 (Pons y F anz, 1977).
En 1978, Manabe y col. log a on sensibiliza la de ección luo escen e
de las a la oxinas B1 y B2 con la adición de un ácido o gánico a la ase mó il.
Es e mé odo, modi icado, ha sido u ilizado pa a la de e minación de
a la oxinas en di e sos p oduc os ag ícolas (Howell y Taylo , 1981) y piensos
(Go o y col., 1979). Basándose en el hecho de que la luo escencia de las
a la oxinas B1 y B2 es mayo en sólidos de adso ción, Panalaks y Sco en
1977 y Zimme li ambién en 1977, desa olla on una écnica en la que la
célula de lujo del de ec o luo escen e se ellenaba con mic opa ículas de
gel de sílice donde las a la oxinas e an adso bidas de o ma e e sible en una
eacción pos -columna. Va ios au o es u iliza on es e mé odo pa a la
de e minación de a la oxinas en di e sos p oduc os ag ícolas (Awe y Sch anz
1981; F ancis y col., 1982; Tu elyan y col., 1989).
En gene al, los sis emas de HPLC de ase e e sa (RP-HPLC) se han
ido imponiendo sob e los de ase no mal. Dado que en los disol en es
acuosos la luo escencia de la AFB1 y AFG1 disminuye (Holcomb y col.,1992;
Kok, 1994), se han desa ollado nume osos mé odos con el in de aumen a
la luo escencia de las a la oxinas pa a una mejo de e minación y
cuan i icación. En e ellos podemos menciona di e en es ipos de
de i a izaciones, incluido el uso de ácidos ue es como el ácido
i luo oacé ico (TFA) y oxidan es como la clo amina (Láza o y col., 1988), el
iodo y el b omo.
Takahashi (1977) alcanzó un lími e de de ección de 0,02 µg/l pa a las
4 a la oxinas ex aídas de mues as de ino, median e una de i a ización

In oducción
46
p ecolumna con TFA. En 1978, Beebe adap ó es e mé odo pa a su aplicación
en di e en es alimen os (cacahue es, man equilla de cacahue e, maíz y
nueces), incluyendo una ex acción con n-hexano al mismo iempo que la
de i a ización con el TFA pa a libe a las a la oxinas de los esiduos g asos
de los ex ac os. Es a de i a ización ha sido u ilizada pa a de e mina
a la oxinas en di e sos alimen os, como pis achos (Haghighi y col., 1981),
almend as (Schade y col., 1981), maíz (Cohen y Lapoin e, 1981; Hu chins y
Hagle , 1983; Wilson y Rome , 1991; To es Espinosa y col., 1995;
Yoshizawa y col., 1996; Ali y col., 1998, 1999) y cacahue es y de i ados
(Ta e y col., 1984; Roch y col., 1992; Ali y col., 1999) y leche humana (Saad
y col., 1995). Su mayo des en aja adica en la baja es abilidad de los
de i ados B2a y G2a en me anol (Beebe, 1978), lo que puede e i a se en
pa e, sup imiendo el uso de es e disol en e en la ase mó il (Holcomb y col.,
1992).
En 1980, Da is y Diene desc ibie on que al a a p e iamen e las
a la oxinas B1 y G1 con iodo, los de i ados ob enidos e an más luo escen es.
Sin emba go, ambién se o maban nume osos p oduc os secunda ios, po lo
que es a écnica sólo ue u ilizada como p ueba de con i mación.
Pos e io men e se han desa ollado di e en es mé odos de de i a ización
pos -columna. Así, Tho pe y col. (1982) u iliza on un mezclado en o ma de T
pa a in oduci el iodo pos -columna en la ase mó il. Shepe d y Gilbe
(1984) de e mina on las condiciones óp imas necesa ias pa a la
de e minación de un es ánda de a la oxina B1 median e HPLC con iodo pos -
columna. El sis ema de HPLC con de i a ización con iodo pos -columna ha
sido u ilizado pa a la de e minación de las a la oxinas en maíz (Thiel y col.,
1986; G oopman y Donahue, 1988; Scudamo e y col., 1998a; Kpodo y col.,
2000), cacahue es y de i ados (Sheppe d y Gilbe , 1984; Thiel y col., 1986;
Jansen y col., 1987; Do ne y Cole, 1988; G oopman y Donahue, 1988;
Gilbe y col., 1991; Pa ey y col., 1990; Niedwe zki y Lach, 1994), nueces y
u os secos (Sheppe d y Gilbe , 1984; Sha man y col., 1991; Niedwe zki y
Lach, 1994), dá iles (Ahmed y Robinson, 1998), leche (G oopman y Donahue,
In oducción
47
1988), piensos (Tuins a y Haasnoo , 1983; T aag y col., 1987; Sha man y
col., 1991; Van Egmond y col., 1988, 1991) y sal ado de a oz (Scudamo e y
col., 1998b). Es e sis ema ha sido adop ado como mé odo o icial de análisis
de a la oxinas po la AOAC-IUPAC (AOAC, 1991).
Uno de los p incipales incon enien es del uso de halógenos es el
de e io o del equipo debido al uso de disoluciones sa u adas de iodo. En
1987, Jansen y col. desa olla on una mane a al e na i a de u iliza el iodo,
usando una pequeña columna empaque ada con iodo sólido como eac i o
en ase sólida (Jansen y col., 1987).
Kok y col. (1986) p opusie on un nue o mé odo pa a la de e minación
de a la oxinas en piensos y cacahue es, u ilizando b omo como de i a izan e
en una eacción pos -columna. Es os au o es u iliza on un sis ema de
gene ación elec oquímica de b omo (Célula-KOBRA®). Do ne y col. (1993)
es udia on la p esencia de a la oxinas en cacahue es u ilizando es a
me odología. En 1993, Ga ne y col. desa olla on un mé odo pa a la
de e minación de és as mico oxinas en especies, el cual incluía un nue o
mé odo de de i a ización pos -columna u ilizando b omu o pe b omu o de
pi idinio (PBPB).
Una al e na i a pa a e i a los incon enien es de la halogenación,
pe mi iendo al mismo iempo un aumen o de la espues a luo escen e de las
a la oxinas B1 y G1, es el uso de ciclodex inas.
In oducción
48
1.2. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA LUMINISCENCIA:
FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA
Desde hace siglos es bien conocido el hecho de que de e minados
compues os emi en una adiación isible cuando son expues os a los ayos
sola es. Los enómenos luminiscen es ales como la ”au o a bo eal”, la
os o escencia del ma , la luminiscencia de animales ma inos, de insec os, de
la made a, e c., han ascinado al homb e desde la an igüedad, quedando
e lejado en los p imi i os abajos cien í icos. A is ó eles (384-322 a. C.)
pa ece se uno de los p ime os en econoce la “luz ía” en pescados
mue os, hongos y en la sec eción luminosa de algunos peces.
Un sis ema que abso be ene gía puede emi i la pa cialmen e en
o ma de adiación luminosa. Sin emba go, es p eciso di e encia cla amen e
en e el p oceso que iene luga p oceden e de luz é mica y de uen es de luz
luminiscen es. Así, cuando un cue po emi e luz exclusi amen e po una
ele ación de su empe a u a el enómeno se denomina “incandescencia”.
Todos los demás enómenos en que se emi e luz, es deci hay una adiación
emi ida po á omos o moléculas como consecuencia de la ansición
adiacional desde un es ado exci ado a o o de meno ene gía, se denominan
gené icamen e “luminiscencia” (Hu ubise, 1990; Vo-Dinh, 1984; Schulman,
1977; Wine i dne y col., 1972). E iden emen e en es e caso la empe a u a
de la especie no se al e a. Po o a pa e, el p oceso luminiscen e p ecisa de
un in e alo de iempo al menos del o den de 10-10 segundos pa a
ans o ma la ene gía abso bida en emisión de luz. En es e hecho adica la
p incipal di e encia en e la luminiscencia y o os enómenos óp icos que no
cumplen las leyes del equilib io é mico y cuya du ación es meno , como la
dispe sión Rayleigh y el e ec o Raman.
En unción del ipo de exci ación que p oduce la luminiscencia se le
asignan di e sos nomb es. Así po ejemplo enemos:
In oducción
49
Quimioluminiscencia: es aquella luminiscencia en la que la ene gía es
o iginada po eacciones químicas.
Bioluminiscencia: Es una quimioluminscencia que ocu e en
o ganismos i os.
T iboluminiscencia: ob enida po up u a, oce, e c. de cie os
ma e iales.
Ca odoluminiscencia o elec oluminiscencia: debida a la exci ación
po elec ones. Ocu e cuando se p oducen desca gas eléc icas en gases
en a ecidos.
Anodoluminiscencia: se da en ánodos y es debida a la acción de
ca iones sob e la sus ancia que o ma el ánodo.
Radioluminiscencia: p oducida po ma e iales adiac i os.
Sonoluminiscencia: algunos líquidos o gánicos poseen luminiscencia
cuando son exci ados po ul asonidos.
Fo oluminiscencia: es una emisión lumínica subsiguien e a la
abso ción de luz po cie as moléculas en la que la ene gía ac i ado a es de
o igen elec omagné ico ( ayos ul a iole a, ayos X o ayos ca ódicos).
En 1935, Jablonskii, as es udia la luminiscencia de di e sos
colo an es, p opuso el conocido diag ama de “ni eles elec ónicos de
ene gía” de los es ados single e y iple e pa a explica los p ocesos de
exci ación y de emisión de luminiscencia. El diag ama p opues o ue la base
de la in e p e ación eó ica de odos los enómenos luminiscen es.
In oducción
56
1.2.2. Fos o escencia aplicada al con ol de los alimen os
Desde que Ro h, en 1967, sugi ió el uso de la os o ime ía a
empe a u a ambien e (RTP) pa a la de ección de algunos compues os
o gánicos deposi ados sob e celulosa, han apa ecido en la bibliog a ía
decenas de aplicaciones pa a es a écnica en el campo del con ol
medioambien al y del con ol de los alimen os.
Sin emba go, has a la echa no ha sido desc i o en la li e a u a ningún
mé odo os o imé ico pa a la de ección y cuan i icación de a la oxinas o pa a
la iden i icación de hongos a la oxigénicos.
Ac ualmen e es bien sabido que pa a ob ene RTP analí icamen e ú il
han de cumpli se a ios equisi os impo an es (Hu ubise, 1990; Vo-Dinh,
1984; Schulman, 1977):
Es necesa io asegu a un ele ado g ado de igidez en el en o no del
os o ó o o que asegu e la p o ección del iple e exci ado, median e el
empleo de empe a u as muy bajas (ni ógeno líquido 77ºC), p o egiéndolo en
disolución con el uso de medios o ganizados o inmo ilizándolo sob e
sopo es sólidos.
Fa o ece la población del es ado iple e exci ado, a a és del
empleo de á omos o es uc u as pesadas, bien in amolecula es
(sus i uyen es como –I, -B , e c.) o ex amolecula es (Tl+, Ag+, I-, B -CH2-CH-
B , e c), los cuales ele an la cons an e de elocidad adiacional de la
os o escencia al a o ece el c uce in e sis emas.
El oxígeno en es ado undamen al es á en es ado iple e y es po ello
un desac i an e del iple e exci ado del anali o luminiscen e. Po
consiguien e, y eniendo en cuen a su ele ada solubilidad en medios
acuosos, es p eciso asegu a su o al eliminación. El uso de la
desoxigenación química con sul i o de sodio, en luga de bu bujea una

In oducción
57
co ien e de gases ine es como el A o N2 po la disolución, es una
inno ación in oducida po el g upo de in es igación del P o . Al edo Sanz
Medel (Díaz Ga cía y col., 1986) que ha pe mi ido acili a la de e minación de
di e sas especies, dando esul ados sa is ac o ios al se implemen ada en
sis emas de inyección de lujo (FIA).
Se ha is o que pa a algunos compues os es posible ob ene señal
os o escen e en disolución u ilizando simplemen e disoluciones acuosas de
los anali os en p esencia de una uen e ex e na de á omo pesado y sul i o de
sodio como agen e desoxigenan e. Es a me odología ue in oducida po el
g upo del P o . Albe o Fe nández (Segu a Ca e e o y col., 1988) se
denomina os o escencia a empe a u a ambien e inducida po á omo pesado
(HAI-RTP), aunque o os au o es (Li y col., 1998), la denominan
os o escencia a empe a u a ambien e en medios no p o egidos (NP-RTP).
Aplicando es a me odología, en el año 2003 Wen-qing Long publicó un
mé odo de de e minación de ip ó ano.
Las in ensidades de os o escencia en ase líquida son gene almen e
muy bajas pa a se u ilizadas en abajos analí icos. En e 1981 y 1983,
Donke b oek y col., demos a on el po encial analí ico de la os o escencia
sensibilizada en solución a empe a u a ambien e (S-RTP) p oducida po un
p oceso de ans e encia de ene gía iple e- iple e desde el anali o de
in e és, que ac úa como donado , a un acep o , gene almen e biace ilo o 1,4-
dib omona aleno. A a és de ese mecanismo cie os compues os p esen an
señales de os o escencia su icien emen e ele adas pa a se u ilizadas con
ines analí icos.
En 1985 Baumann y col. se basa on en el p incipio de S-RTP pa a la
de ección de biace ilo en c oma og a ía líquida, demos ando su aplicabilidad
en mues as de ce eza. El mismo año, Sha i ish ili y col. desc ibie on un
mé odo de de e minación de sul i o en ino Napa euli, median e
c oma og a ía de in e cambio iónico donde o maba un complejo con
biace ilo, cuya os o escencia e a medida.
In oducción
58
En 1989, Cepeda Sáez y col. desc ibie on un mé odo de de ección de
biace ilo en man equilla y ma ga ina. Inicialmen e el compues o e a aislado
po des ilación y pos e io men e su os o escencia na i a e a sensibilizada
con una u ocuma ina.
A excepción de la os o escencia a empe a u a ambien e
sensibilizada y la os o escencia a empe a u a ambien e inducida po á omo
pesado, odos los mé odos p opues os pa a la ob ención de señales
os o escen es en disolución has a inales de los 90 suponen el uso de algún
ipo de o ganización a ni el mic oscópico.
En los úl imos años, la u ilización de los llamados “medios
o ganizados” o “medios o denados” se ha con e ido en una aliosa
he amien a analí ica, debido a su capacidad de o ganiza las especies
químicas a ni el molecula . Es os “an i iones” molecula es son es uc u as
químicas mic oscópicas que, en cie as condiciones, se ap oximan a las
ca ac e ís icas de disoluciones luidas homogéneas.
La p ime a obse ación de RTP median e la es abilización con
medios mic oscópicamen e o ganizados ue ealizada empleando
dodecilsul a o sódico (SDS) en p esencia de alio como á omo pesado
(Kalyanasunda am y col., 1977).
En 1982 Tu o y col. habían obse ado asociaciones de ipo an i ión–
in i ado cuando de e gen es ca iónicos os o escen es se incluyen en β- y γ-
CD, mien as que ales asociaciones no se ponen de mani ies o con α-CD.
Desde en onces se es udian di e en es mé odos pa a es abiliza el es ado
iple e en disolución y a empe a u a ambien e.
En e los sis emas o ganizados podemos conside a los sis emas
micela es y aquellos que es án basados en la o mación de complejos de
inclusión. En e es os úl imos, las ciclodex inas son, con no able di e encia,
el medio más u ilizado pa a es abiliza la RTP. En es e caso, exis e una
elación “an i ión-in i ado” en e la ciclodex ina y el anali o, y al igual que ocu e
In oducción
59
con la luo escencia, cuando se ope a en condiciones adecuadas, es as
disoluciones acuosas de ciclodex inas p oducen un aumen o de la señal de
os o escencia, dando luga a la llamada os o escencia e empe a u a
ambien e en p esencia de ciclodex inas (CD-RTP).
Po o a pa e, es posible ob ene señales os o escen es a
empe a u a ambien e en disolución acuosa pa a un amplio núme o de
compues os, median e la u ilización de o o ipo de medio o ganizado,
aumen ando la iscosidad del mic oen o no que odea a los os o ó o os
basándose en in e acciones a ni el molecula .
Pa a la ob ención de señal os o escen e a empe a u a ambien e en
disolución hay que ene en cuen a que los p ocesos de a enuación o
desac i ación (“quenching”) son di ec amen e p opo cionales a la
empe a u a e in e samen e p opo cionales a la iscosidad.
La os o escencia a empe a u a ambien e en medios micela es (MS-
RTP), se basa en la u ilización de agen es su ac an es, que al odea a un
anali o mejo an su solubilidad en el medio y o ecen una p o ección especial
de los es ados exci ados (single e y iple e) de la molécula huésped en e a
p ocesos de desac i ación no adian e.
La p incipal ca ac e ís ica de los agen es ensoac i os es su
capacidad de au oasociación, an o en disolución acuosa como en medios
apola es, dando luga a g andes ag egados de dimensiones coloidales y
es uc u a de inida. El ipo de ag egado que se o ma depende an o de la
es uc u a del ensoac i o como del medio dispe san e. La o mación de
dichos ag egados ocu e al supe a se una de e minada concen ación del
ensoac i o en la disolución. Es a se denomina concen ación micela c í ica
(c.m.c.), po debajo de la cual el ensoac i o se encuen a en o ma de
monóme os.
En la bibliog a ía exis en es udios publicados que aplican la MS-RTP
pa a de e minación de pes icidas, como po ejemplo Segu a Ca e e o y col.
In oducción
60
(1998), que analiza on enla ados de piña en iquecidos con ácido na il-
acé ico, o Mu illo Pulga ín y col., que en 2002 de e mina on nap onamida en
sedimen os, pimien os y oma es y en 2003 de e mina on ácido na il-acé ico
en ó mulas insec icidas, sedimen os y u as.
El uso analí ico de la os o escencia de compues os adso bidos en
sus a os sólidos cons i uye el á ea de aplicación de la os o ime ía sob e
sopo es sólidos (SS-RTP).
Cie os compues os pola es o iónicos p esen an os o escencia
cuando es án adso bidos sob e sopo es como celulosa, gel de sílice,
políme os, ace a o sódico, ciclodex inas o papel de il o. Sólo cie os
ma e iales sólidos son adecuados pa a ob ene RTP a pa i de compues os
o gánicos adso bidos, de en e los cuales el papel de il o es el más
ampliamen e usado.
Schulman y Pa ke (1977) es udia on el e ec o de la humedad,
oxígeno y na u aleza de la in e acción sopo e/anali o en a ios sopo es
sólidos, especialmen e en papel de il o. Schulman y Walling (1972; 1973)
sugie en que la adso ción de compues os po encialmen e os o escen es en
el sopo e sólido inhibe la desac i ación colisional del es ado iple e y
disminuye la a enuación po oxígeno si la mues a se seca o almen e.
Schulman y Pa ke en 1977, p opusie on que el enlace de hid ógeno de las
moléculas o gánicas iónicas con los g upos hid oxilo de la supe icie sólida es
el mecanismo p ima io pa a induci la igidez necesa ia en la p omoción de
RTP.
O o aspec o expe imen al es udiado (Niday y Seybold, 1978) en la
emisión RTP es el e ec o de la adición de a ios compues os como sales,
NaF, NH4Cl, AcNa, glicina, e c., sob e el sopo e sólido. Los esul ados
ob enidos demues an que la e icacia del p oceso RTP mejo a en gene al y
los iempos de ida del es ado exci ado aumen an. La in e p e ación de es e
e ec o es á basada en que el empaque amien o supe icial de la ma iz sólida
In oducción
61
con sales y o os compues os inhibe los mo imien os in e nos del anali o
como consecuencia del elleno de los canales e in e s icios de la ma iz, lo
cual educe la pe meabilidad del oxígeno p o egiendo las moléculas
os o escen es de la a enuación (Fe nández y Schulman, 2001).
El disol en e u ilizado pa a deposi a el anali o sob e el subs a o
sólido puede se muy impo an e pa a ob ene buenas emisiones RTP.
Además de la solubilidad del anali o hay que ene en cuen a la posibilidad de
que engan luga in e acciones del disol en e con la ma iz sólida.
T as la adso ción del anali o sob e la supe icie sólida es necesa io
seca la mues a exhaus i amen e an es de la e apa de medida, pues la
humedad es uno de los ac o es de e minan es en la disminución de la señal
RTP. El p oceso de secado debe se ápido, no con aminan e y e i a
pé didas de la mues a po ola ilización.
Capi án Vall ey y col. han abajado en la de e minación de
pes icidas po SS-RTP u ilizando papel de il o como sus a o: analiza on
agua y pa a as, judías y lechuga pa a de e mina mo es an en 1998 y
iabendazol en 1999; en 1998 de e mina on ca ba il agua, pa a as y
ege ales; de e mina on o- enil enol en agua y ege ales en 2003. El año
2001 p opusie on un senso oso imé ico desechable pa a de e mina
mo es an en aguas. Es e disposi i o consis e en un sopo e sólido de
polyes e con una zona senso a que iene ibu il os a o adhe ido. El año 2003
diseña on un senso análogo pa a de e mina un an ibió ico: el ácido
oxolínico de leche de aca u o ina humana.
Po o a pa e, en el año 2002, Dong y col. aplicando la RTP
median e adso ción en papel de il o, encon a on que el é e de posee un
mayo con enido de compues os poli enólicos que el é neg o.
Den o de la me odología de SS-RTP, se puede induci
os o escencia de los compues os inmo ilizándolos sob e la supe icie po osa

In oducción
62
de pa ículas adso ben es como el gel de sílice y las esinas de in e cambio
iónico.
En la li e a u a exis en me odologías pa a la de e minación de
benzo[a]py eno en agua (Fe nández Sánchez y col., 2004) median e
inmo ilización sob e ambe li a y pos e io de ección luo escen e, sin
emba go, no se han encon ado abajos elacionados con la inmo ilización
en esinas y de ección os o escen e de PAHs u o os con aminan es en
alimen os.
Las esinas de in e cambio iónico se han u ilizado en el campo de la
os o escencia pa a el desa ollo de senso es de humedad (Cos a Fe nández
y Sanz Medel, 2000) o de ección de me ales pesados en agua como el plomo
(San Vicen e de la Ri a y col., 1999) o el me cu io (San Vicen e de la Ri a y
col., 2002).
En los úl imos años el desa ollo de la ecnología sol-gel ha
pe mi ido la p epa ación a empe a u a ambien e de ma ices ino gánicas que
han demos ado ene unas excepcionales ca ac e ís icas como sopo es
sólidos pa a inmo iliza moléculas luminiscen es. La ecnología sol-gel
pe mi e p epa a , a empe a u a ambien e, ma ices ino gánicas al amen e
po osas con idén ica composición que los id ios y ma e iales ce ámicos,
median e polime izaciones y coagulaciones de hid óxidos, alcóxidos o
és e es de me al, e i ando los p ocesos de deg adación y usión adicionales
que ienen luga en la sín esis de ma e iales a ele adas empe a u as.
La o mación de ma ices ino gánicas median e la ecnología sol-gel
iene luga a a és de la hid ólisis (en p esencia de agua y de un ca alizado
ácido o básico) y condensación po o mación de enlaces siloxano de
dis in os p ecu so es (gene almen e o osilica os e asus i uidos) pa a
p oduci una suspensión coloidal (sol).
La mayo pa e de las écnicas sol-gel emplean e aalcoxisilanos de
bajo peso molecula como p ecu so es, p incipalmen e e ame oxisilano
In oducción
63
(TMOS) o e ae oxisilano (TEOS), aunque ambién es posible u iliza silica o
sódico. Las eacciones químicas ienen dadas po :
Si-OR + H2OSi-OH + ROH (
Hid ólisis
)
Si-OR + HO-Si Si-O-Si + ROH (
Condensación)
Si-OR + H2OSi-OH + ROH (
Hid ólisis
)
Si-OR + HO-Si Si-O-Si + ROH (
Condensación)
Pos e io men e iene luga una aglome ación de los monóme os
coloidales o mados con un aumen o de la iscosidad del sol y o iginándose
una es uc u a po osa denominada gel. Las p opiedades del gel con inúan
cambiando mien as queden disol en es y agua en la es uc u a debido a
eacciones de policondensación. T as una e apa de secado que conlle a un
encogimien o y una posible agmen ación del gel, se ob iene inalmen e un
xe ogel po oso (gel seco).
Du an e la úl ima e apa de o mación del gel, el agua y los
disol en es o gánicos empleados se e apo an de las ca idades del id io de
o ma que el olumen de la ma iz sólida se educe en un ac o de 2-10. En
es a e apa los disol en es con enidos en los po os de mayo diáme o se
e apo an mucho más ápido que los de los po os de meno diáme o, los
cuales pe manecen húmedos y se o man unos g adien es de p esión
c ecien es que pueden p o oca la up u a del id io monolí ico.
El ca alizado empleado en la e apa de hid ólisis con ola igualmen e
la supe icie especí ica y dis ibución de los po os del xe ogel inal.
Gene almen e una ca álisis básica gene a sol-geles más po osos, mien as
que la ca álisis ácida da luga a geles al amen e ami icados y de al a
densidad, con ele ada á ea supe icial.
Las ma ices p epa adas según la ecnología sol-gel p opo cionan
una se ie de en ajas en e a los sopo es sólidos adicionalmen e
empleados en el desa ollo de supe icies ac i as pa a senso es óp icos. Así,
p opo cionan un en o no de ele ada igidez pa a las moléculas inmobilizadas
In oducción
64
(po lo que se a o ece su desac i ación en o ma de emisión luminiscen e),
la p obabilidad de lixi iado de la molécula huésped es muy baja y inalmen e,
son sopo es químicamen e ine es, con una baja luo escencia in ínseca y
ele ada anspa encia óp ica.
En la li e a u a exis en algunos abajos elacionados con la
inmo ilización en sopo es de ipo sol-gel y pos e io de ección os o escen e
de compues os a omá icos óxicos como la benzo enona (Bagnich, 1996;
Ma sui y col., 1999) y el benzaldehido (Bagnich y col., 1995; Bagnich, 1998).
1.2.3. Senso es óp icos en sis emas de análisis de lujo
De acue do con la IUPAC, un senso químico se ía “un sis ema que
ans o ma in o mación química en una señal analí ica ú il. Es a in o mación
química puede se o iginada po una eacción química del anali o o po una
p opiedad ísica del sis ema in es igado, los senso es químicos con ienen
dos unidades uncionales básicas: un ecep o y un ansduc o . Algunos
senso es pueden inclui un sepa ado , como po ejemplo una memb ana”.
En base a la na u aleza de la señal ísica que se gene a y mide,
den o de la clasi icación de los senso es químicos, un senso óp ico es aquel
que mide cambios en alguna p opiedad óp ica del sis ema (abso bancia,
e lec ancia, luminiscencia).
La p ime a de inición de “op osenso ” apa eció en los años 80, en un
abajo de Ruzicka y Hansen. Según es os au o es, el concep o de
“op osenso ” nace de in eg a un senso óp ico en sis emas ípicos de análisis
po inyección de lujo (FIA). La in eg ación de las écnicas de
o oluminiscencia en ases sólidas con las de inyección de lujo ha sido
ealmen e un “casamien o” uc í e o que o ece impo an es en ajas de g an
in e és analí ico ales como: au oma ización, acilidad pa a eno a eac i os
en la supe icie senso a, posibilidad de in eg a en el sis ema de lujo
In oducción
65
p e a amien os en línea de la mues a, empleo de eacciones no e e sibles
en la ase ac i a, e c. (Sanz Medel, 1993).
Un sis ema analí ico con encional de lujo con inuo (Valcá cel y
Luque de Cas o, 1988) comp ende es e apas: la ans e encia de masa
(anali o) en e dos ases, la eacción (bio) química de econocimien o y la
de ección con inua en una celda de lujo con encional. Es as e apas pueden
ene luga en una misma zona o en zonas di e en es de modo secuencial. El
disposi i o que ealice simul áneamen e la de ección con la eacción y la
sepa ación de la celda de medida puede conside a se o malmen e como un
“senso ” pues eúne sus ca ac e ís icas p incipales ( esponde di ec a,
e e sible, con inua y ápidamen e a a iaciones en la concen ación del
anali o de in e és) y se denomina “op osenso ”.
Ma e ial y Mé odos
72
-Mic oscopio óp ico, modelo CH-2 (OLYMPUS)
-Molinillo pa a ca é, eléc ico (MOULINEX)
-pH-me o, pH 526 (WTV)
-Ul asonidos uci-200 (JKM)
-Medido de ac i idad de agua (AquaLab Se ie3TE,
DECAGON)
-Luminóme o Pe kin Elme LS50B.
3.1.2. Diluyen es
Disolución salina con poliso ba o 80
Composición:
Clo u o sódico (PANREAC) 0,90 g
Poliso ba o 80 (Tween® 80) 0,1 g
Agua des ilada 100,0 ml
P epa ación:
Se pesan los componen es, se mezclan y se es e ilizan a 121ºC
du an e 15 minu os.

Ma e ial y Mé odos
73
3.1.3. Colo an es
Azul de me ileno
Composición:
Azul de me ileno (MERCK) 1,0 g
Agua des ilada 100,0 ml
P epa ación:
Se pesa el colo an e, se disuel e en unas go as de alcohol,
pos e io men e se añade el agua, en pequeños olúmenes, has a la comple a
disolución del colo an e.
3.1.4. Medios de cul i o
3.1.4.1. Medios de cul i o pa a el ecuen o de mohos y le adu as
-Aga Czapek (CZA)
Composición:
Saca osa 30,0 g
Ni a o sódico 2,0 g
Fos a o dipo ásico 1,0 g
Sul a o magnésico 0,5 g
Clo u o po ásico 0,5 g
Sul a o e oso 0,01 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
Ma e ial y Mé odos
74
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial Czapek de PANREAC que con iene odos
los ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se disuel en 49 g en un li o de
agua des ilada y se es e iliza 20 minu os a 115ºC. Se deja en ia has a 50ºC
ap oximadamen e y se dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
-Aga diclo án clo an enicol pep ona (DCPA)
Composición:
Pep ona (PANREAC) 15,0 g
Aga (PANREAC) 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó la ó mula p opues a po And ews y Pi (1986), los
componen es se pesan, se disuel en en un li o de agua des ilada y se
es e iliza a 121ºC du an e 15 minu os. Se deja en ia has a 50ºC y se añade
2 mg de diclo án y 200 mg de clo an enicol, se agi a y se dis ibuye
asép icamen e en placas es é iles.
-Aga diclo án glice ol al 18% (DG18)
Composición:
Pep ona 5,0 g
Dex osa 10,0 g
Fos a o monopo ásico 1,0 g
Diclo án 0,002 g
Sul a o de magnesio 0,5 g
Clo an enicol 0,1 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
Ma e ial y Mé odos
75
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial de MERCK que con iene odos los
ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se añaden 31,6 g amos en 1 li o de
agua des ilada. Se es e iliza du an e 15 minu os a 121ºC. Se en ía has a
50ºC ap oximadamen e, se agi a bien an es de dis ibui asép icamen e en
placas es é iles.
-Aga diclo an osa de bengala clo an enicol (DRBC)
Composición:
Pep ona 5,0 g
Dex osa 10,0 g
Fos a o monopo ásico 1,0 g
Sul a o de magnesio 1,0 g
Diclo án 0,002 g
Rosa de Bengala 0,025 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial de MERCK, que con iene odos los
ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se disuel en 31,6 g amos en 1 li o de
agua des ilada calen ando has a su o al disolución y se es e iliza du an e 15
minu os a 121ºC. Se deja en ia has a 50ºC ap oximadamen e, se agi a y
dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
Ma e ial y Mé odos
76
-Aga mal a al 2% (MA)
Composición:
Ex ac o de mal a (SCHARLAU) 20,0 g
Glucosa (PANREAC) 20,0 g
Pep ona (DIFCO) 1,0 g
Aga (PANREAC) 25,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó la ó mula de Blakeslee (Samson y col., 2000). Los
componen es se pesan, se disuel en en un li o de agua des ilada y se
es e iliza a 121ºC du an e 15 minu os. Se deja en ia has a 50ºC
ap oximadamen e, se agi a y se dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
-Aga mal a, le adu a y saca osa (MYSA)
Composición:
Ex ac o de mal a 15,0 g
T ip ona 2,0 g
Saca osa 30,0 g
Ex ac o de le adu a 5,0 g
Ni a o de sodio 0,5 g
Aga 20,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó la ó mula p opues a po Skaa y S enwig (1996). Los
componen es se pesan, se disuel en en un li o de agua des ilada, se ajus a
el pH a 6,8 con NaOH 1N y se es e iliza du an e 15 minu os a 121ºC. Luego
de es e iliza , se añade 0,5% Clo an enicol y 0,5% Clo e aciclina, se mezcla
Ma e ial y Mé odos
77
po agi ación. Se deja en ia has a 50ºC ap oximadamen e, y se dis ibuye
asép icamen e en placas es é iles.
-Aga oxi e aciclina glucosa ex ac o de le adu a (OGYE)
Composición:
Glucosa 10,0 g
Ex ac o de le adu a 5,0 g
Aga 20,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial de MERCK, que con iene odos los
ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se disuel en en un li o de agua
des ilada y se es e iliza a 121ºC du an e 15 minu os. Luego de es e iliza se
añade 0,01% oxi e aciclina en disolución alcohólica. Se deja en ia has a
50ºC ap oximadamen e, se agi a y se dis ibuye asép icamen e en placas
es é iles.
-Aga pa a a dex osa (PDA)
Composición:
Ex ac o de pa a a 4,0 g
Glucosa 20,0 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se u iliza on dos ma cas come ciales PANREAC y SCHARLAU que
con ienen odos los ing edien es. Ambas ma cas come ciales indican que
pa a ehid a a el medio se disuel en 39 g amos en 1 li o de agua des ilada y
se es e iliza du an e 15 minu os a 121ºC. Luego de agi a se en ía has a
50ºC ap oximadamen e y se dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.

Ma e ial y Mé odos
78
-Aga Sabou aud dex osa (SAB)
Composición:
Pep ona 10,0 g
Glucosa 40,0 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se u ilizó el aga Sabou aud de dos ma cas come ciales PANREAC y
MERCK, que con ienen odos los ing edien es. Pa a ehid a a el medio,
ambas ma cas come ciales indican que 65 g amos deben se disuel os en un
li o de agua des ilada, se es e iliza du an e 10 minu os a 118ºC. Se deja
en ia has a 50ºC ap oximadamen e y se dis ibuye asép icamen e en placas
es é iles.
-Aga ip ona soja con poliso ba o 80 y leci ina (TSA)
Composición:
T ip ona 15,0 g
Pep ona de soja 5,0 g
Lac osa 10,0 ml
Clo u o de sodio 5,0 g
Poliso ba o 80 5,0 g
Leci ina 0,7 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
Ma e ial y Mé odos
79
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial de MERCK, que con iene odos los
ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se mezclan 45,7 g amos con 1 li o de
agua des ilada y se es e iliza du an e 15 minu os a 121ºC. Se en ía has a
50ºC ap oximadamen e y se dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
-Aga ex ac o de le adu a con saca osa (YES)
Composición:
Ex ac o de le adu a (DIFCO) 20,0 g
Saca osa 150,0 g
Aga (PANREAC) 20,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó la ó mula p opues a po Samson y col. (2000). Se pesan
los componen es, se disuel en en un li o de agua des ilada y se es e iliza a
121ºC du an e 15 minu os. Se deja en ia has a 50ºC ap oximadamen e y se
dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
-Aga ex ac o de le adu a glucosa clo an enicol (YGC)
Composición:
Ex ac o de le adu a 5,0 g
Glucosa 20,0 g
Aga 15,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
Ma e ial y Mé odos
80
P epa ación:
Se u ilizó el aga come cial MERCK que con iene odos los
ing edien es. Pa a ehid a a el medio, se disuel en 38 g en un li o de agua
des ilada y se es e iliza a 121ºC du an e 15 minu os. Luego de es e iliza se
añade 0,01% clo an enicol, se deja en ia has a 50ºC ap oximadamen e y se
dis ibuye asép icamen e en placas es é iles
3.1.4.2. Medios de cul i o pa a c ecimien o de especies xe ó ilas
-Aga ex ac o de mal a glucosa al 40% (MY40G)
Composición:
Ex ac o de mal a 20,0 g
Ex ac o de le adu a (DIFCO) 20,0 g
Glucosa 150,0 g
Aga (PANREAC) 20,0 g
Agua des ilada 1000,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó la ó mula p opues a po Samson y col. (2000). Se pesan
los componen es, se disuel en en un li o de agua des ilada y se es e iliza a
121ºC du an e 15 minu os. Se deja en ia has a 50ºC ap oximadamen e y se
dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
Ma e ial y Mé odos
81
3.1.4.3. Medios de cul i o pa a la p oducción de a la oxinas
- Aga pa a la p oducción de a la oxinas (APA)
Composición:
Saca osa 24,0 g
Fos a o amónico (NH4)H2PO4 (MERCK) 8,0 g
Fos a o bipo ásico (K2HPO4) (MERCK) 0,8 g
Sul a o magnésico (MgSO4.7H2O) (MERCK) 0,82 g
Clo u o po ásico (KCl) (MERCK) 0,4 g
Sul a o e oso (FeSO4.7H2O) (MERCK) 0,0008 g
Clo u o de me cu io (HgCl2) (MERCK) 0,112 g
Lico de maíz (co n s eep liquo ) (SIGMA) 0,4 g
Aga (PANREAC) 16,0 g
Agua des ilada 800,0 ml
P epa ación:
Se p epa ó según la ó mula p opues a po Ha a y col. (1974). Se
pesan los componen es, se disuel en en 800 ml de agua des ilada, se
es e iliza a 121ºC du an e 15 minu os. Se deja en ia has a 50ºC
ap oximadamen e y se dis ibuye asép icamen e en placas es é iles.
Ma e ial y Mé odos
88
3.1.9. Ma e ial pa a el análisis inmunoenzimá ico (ELISA) de
a la oxinas
Ma e ial y apa a os
- Espec o o óme o SLT Spec a (ATOM)
- Fil os de papel Wha man #4 (MILLIPORE)
- Imp eso a LX-400 (EPSON)
- Ki come cial a la oxin B1 T ansia Pla e (DIFFCHAMB)
Reac i os
-Agua de calidad ul apu a Milli-Q (MILLIPORE)
-Me anol, g ado HPLC (MERCK)
Pa ones
Di e en es concen aciones de disolución de a la oxina B1: 0 ppb, 0,5
ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13 ppb, 40,5 ppb, suminis adas con el ki .

Ma e ial y Mé odos
89
3.1.10. Cepas úngicas
Fue on u ilizadas 32 cepas, pe enecien es a 24 especies di e en es
del géne o Aspe gillus.
Pa a los p ime os es udios, se emplea on dos cepas ep esen a i as:
una cepa a la oxigénica de A. pa asi icus, Spea e (NRRL 2999), una cepa no
a la oxigénica de A. la us, Link: F ies (NRRL 6538).
Pa a los es udios de especi icidad se aumen a on 2 cepas
no a la oxigénicas y 2 cepas a la oxigénicas de Aspe gillus sección Fla i, jun o
con 18 cepas Aspe gillus spp. y 5 cepas de Ascomice os (Eu o iun y
Eme icella), odas ob enidas de la Colección Española de Cul i os Tipo
(Bu jaso , Valencia).
Adicionalmen e, ue on u ilizadas 2 cepas a la oxigénicas y 1 cepa no
a la oxigénica de Aspe gillus sección Fla i, pe enecien es a la colección de
cul i os del Labo a o io de Higiene e Inspección de los Alimen os.
Las cepas ue on elegidas en base a su habilidad de p oduci
di e sos me aboli os.
En la abla 7 se enume an odas las cepas y los me aboli os
secunda ios que p oducen, además de su espues a a las p uebas de
a la oxigenicidad.
Ma e ial y Mé odos
90
Tabla 7. Cepas de Aspe gillus spp. u ilizadas pa a los es udios, p oducción
de a la oxina y o os me aboli os secunda ios
Resp Resp
Especie Cepa APA HPLCa Me aboli os
A. aculea us CECT 2968 - -
A. awamo i NRRL 3112 - -
A. ca bona ius NRRL 368 - -
A. cla a us CECT 2673 - -
A. la us NRRL A-3537 - - blas icidina S
A. la us NRRL 6541 - - a la a ina, a la ininas
A. la us NRRL 6538 - -
A. la us NRRL 6540 + + a la oxina B1, B2
A. la us g oup LHICA 1316 + + a la oxina B1, B2
A. la us g oup LHICA 876 + + a la oxina B1, B2
A. la us g oup LHICA 893 - -
A. umiga us NRRL 1979 - - umigacina, glio oxina
A. hennebe gii NRRL 2801 - -
A. nige NRRL 566 - -
A. nige CECT 2915 - -
A. och aceus CECT 2917 - - ácido L-malico
A. och aceus NRRL 5220 - - ácido penicílico
A. o yzae NRRL 1988 - -
A. pa asi icus NRRL 2999 + + a la oxina B1, B2, G1, G2
A. pa asi icus NRRL 3145 + + a la oxina B1, B2, G1, G2
A. penicillioides CECT 2074 - -
A. es ic us NRRL 4155 - -
A. scle o io um CECT 2546 - -
A. e eus CECT 2748 - -
A. e eus NRRL 571 - -
A. e sicolo NRRL 573 - - Es e igma ocis ina
A. wen ii NRRL 376 - - ácido gluconico, mani ol, glice ol
Em. co uga a CECT 2830 - -
Em. nidulans CECT 2833 - -
Eu o . he ba io um CECT 2922 - - au oglaucina, la oglaucina
Eu o . halophilicum CECT 2072 - -
Eu o . onophilum NRRL A-11464 - -
Ma e ial y Mé odos
91
3.1.11. Ma e ial pa a la ob ención de os o escencia a
empe a u a ambien e de a la oxina B1 “in i o”
Ma e ial
-A gon (AIR LIQUID)
-Bomba pe is ál ica (SCHARLAU SCIENCE)
-Celda de lujo de cua zo (HELLMA)
-Cube a de luo escencia de cua zo (HELLMA)
-Desecado
-Mo e o
-Papel de il o (WHATMAN)
-Placa il an e
-Tamices (paso de malla 80 y 160 um)
-Tube ías de bombeo (ELKAY)
-Tube ías de e lón (SCHARLAB)
-Viales opacio de 15-30 ml
Disol en es
-Ace oni ilo, g ado HPLC (MERCK)
-Agua de calidad ul apu a Milli-Q (MILLIPORE)
-E anol, g ado HPLC (MERCK)
-Me anol, g ado HPLC (MERCK)
Ma e ial y Mé odos
92
Adi i os
β-ciclodex ina (Roque e, F ancia)
Nº CAS: 7585-39-9
CAVASOL® W7 M (WACKER, Alemania)
Nº CAS: 12446-36-6
Ciclohexano C6H12
Nº CAS: 110-82-7
Desoxicola o de sodio (SIGMA)
Nº CAS: 302-95-4
Á omos pesados
Ace a o de cadmio C4H6CdO4
Nº CAS: 5743-04-4
Ace a o de zinc (C4O2)2Zn
Nº CAS: 557-34-6
B omobenceno C6H5B
enil-b omu o, b omobenzol
Nº CAS: 108-86-1
B omoe anol C2H5B
Nº CAS: 540-51-2
Ca bona o de li io Li2CO3
Nº CAS: 554-13-2
Clo u o de aluminio Cl3Al
Nº CAS: 7429-90-5
Ma e ial y Mé odos
93
Clo u o de me cu io HgCl
Nº CAS: 7487-94-7
Clo u o de e bio Cl3Tb
Nº CAS: 10042-88-3
Clo u o de zinc ZnCl2
Nº CAS: 7648-85-7
Pa ón de ni a o de eu opio Eu(NO3)3
1000 ppm en HNO
3 al 1%
Nº CAS: 7440-53-1
Fluo u o de li io LiF
Nº CAS: 7789-24-4
Pa ón de ni a o de magnesio MgNO3
1000 ppm en HNO
3 al 1%
Nº CAS: 13446-18-9
Oxala o de zinc (C2O4)2Zn
Nº CAS: 4255-07-6
Yodu o de po asio KI
Nº CAS: 7681-11-0
Desoxigenan e
Sul i o de sodio (Na2SO3)
Nº CAS: 7631-90-5

Ma e ial y Mé odos
94
Pa ón
A la oxina B1
Nº CAS: 1162-65-8
P epa ación del pa ón
Se p epa ó una disolución mad e de a la oxina B1 disol iendo 1mg en
300 µl de ace oni ilo, se conse ó a -18ºC du an e 1 mes. Las disoluciones
pa ón de abajo, se p epa a on dia iamen e a pa i de la disolución mad e
diluyéndolas con ace oni ilo, conse adas a -4ºC en iales opacio con apón
de osca.
Pa ículas adso ben es y esinas de in e cambio iónico
Ambe li a® IRC-50S
Nº CAS: 81133-22-4
Ambe li a® IRC-718
Nº CAS: 79620-28-3
Ambe li a® XAD-2
Nº CAS: 9060-05-3
Ambe li a® XAD-7
Nº CAS: 37380-43-1
Dowex® 1x2-100-200
Nº CAS: 60267-37-0
Dowex® 50Wx2-200
Nº CAS: 12617-37-2
Dowex® 50Wx4-200R
Nº CAS: 12640-54-9
Ma e ial y Mé odos
95
Dowex® 50Wx8-200
Nº CAS: 11119-57-8
Gel de sílice
70-140 µm, po o 25Å
Nº CAS: 112926-00-8
P ecu so es de sol-gel
TMOS Me il ime ilsilil é e
Nº CAS: 1825-61-2
MTMOS T ime oxime ilsilano
Nº CAS: 1185-55-3
Ma e ial y Mé odos
96
3.2. MÉTODOS
3.2.1. P ecauciones du an e el manejo de las mico oxinas
y esiduos pelig osos
Debido a la oxicidad de las a la oxinas y al iesgo de con aminación
que implica su empleo en el labo a o io, es obliga o io oma una se ie de
p ecauciones du an e la manipulación de es as sus ancias. Es as medidas de
segu idad ue on es ablecidas desde los inicios del es udio de las a la oxinas
en los años sesen a (Fischbach y Campbell, 1965; S olo y T age , 1965;
Ciegle y Lillehoj, 1968) y son aplicadas ac ualmen e en los labo a o ios
dedicados a su in es igación (T ucksess y John, 1992).
Du an e la ealización de es e abajo, odos los p ocedimien os que
implicaban el manejo de las mico oxinas, po ejemplo, la p epa ación de las
soluciones de abajo, la con aminación de las ma ices o el manejo de los
ex ac os, se lle a on a cabo en una campana de ex acción de gases y
empleando guan es de lá ex. El ma e ial de id io que es u o en con ac o con
las mico oxinas, e a sume gido en una solución de lejía al 10% du an e al
menos una ho a an es del la ado. Los iales u ilizados pa a con ene las
soluciones pa ón de a la oxinas, se de oxi ica on man eniéndolos
sume gidos en lejía sin dilui (Yang, 1972; Na a ajan y col., 1975).
Todas las sus ancias y sol en es u ilizados du an e los ensayos
analí icos, al igual que los esiduos sólidos o iginados du an e los ensayos
mic obiológicos ue on a ados como esiduos pelig osos, siguiendo las
de iniciones de la Di ec i a 78/319/EEC.
3.2.2. P epa ación de los inóculos
Las 32 cepas úngicas lio ilizadas ue on cul i adas en medio de
eanimación du an e el iempo ecomendado po el p o eedo (CECT).
Ma e ial y Mé odos
97
T anscu ido es e iempo, las cepas ue on cul i adas pa a p oduci espo as,
de acue do a las mejo es condiciones consul adas en la bibliog a ía (Samson
y col., 2000) pa a cada mic oo ganismo.
Se p epa ó una suspensión de espo as, deposi ando asép icamen e
el aga cubie o de espo as en una bolsa de Mas ica o ® y añadiendo 10 ml
de solución salina es é il de Tween 80®
. Seguidamen e la bolsa se agi ó
cuidadosamen e, pe mi iendo que se desp enda solamen e la supe icie de
las colonias y a con inuación se accionó la suspensión en ubos eppendo
es é iles (0,5 ml), cada uno de los cuales es aba des inado pa a un solo uso.
Se conse a on los ubos con es a suspensión s ock a 4ºC du an e un
pe iodo máximo de 3 meses.
3.2.3. Mé odos pa a la con i mación de la p oducción de
a la oxinas po pa e de las cepas u ilizadas
3.2.3.1. Mé odo mic obiológico
Pa a de e mina la capacidad de p oduci a la oxinas po pa e de las
32 cepas de Aspe gillus spp., u ilizadas, es as se semb a on en los medios
APA, CAM y YES y se incuba on a 28ºC du an e 10 días.
Las colonias semb adas en los medios APA y CAM ue on
obse adas bajo luz UV, cada día, du an e diez días, pa a obse a la
p esencia o ausencia de luo escencia e de-azulada en las zonas del aga
que odeaban a las colonias como indica i o de la p oducción de a la oxinas.
3.2.3.2. Mé odo c oma og á ico
Las colonias cul i adas en medio YES de la o ma desc i a en el
apa ado an e io , ue on ex aídas con clo o o mo, al sép imo y décimo día
Ma e ial y Mé odos
104
3.2.9. Mé odos pa a la iden i icación de cepas
a la oxigénicas en los medios de cul i o es udiados
3.2.9.1. En medio de cul i o con ciclodex ina y
desoxicola o de sodio (MACD)
Las placas semb adas en el medio de cul i o MACD ue on
examinadas al quin o día de incubación. La eacción en e las a la oxinas, la
ciclodex ina y el desoxicola o de sodio hace que al ededo de la colonia se
o me un halo beige y si se examina bajo luz UV (365 nm) las zonas del aga
que odean a las colonias emi en luo escencia e de-azulada. Las colonias
de Aspe gillus spp. que p esen aban es a ca ac e ís ica ue on conside adas
posi i as.
3.2.9.2. A pa i de los medios de cul i o MA y SAB
Al quin o día de incubación y una ez iden i icada una colonia del
géne o Aspe gillus po sus ca ac e ís icas mo ológicas median e análisis
mic oscópico, se aisló en los medios APA, YES y MACD pa a conoce su
capacidad a la oxigénica y se incubó a 28ºC du an e 3-10 días. Las colonias
semb adas en el medio MACD ue on examinadas bajo luz UV, al segundo y
e ce día de incubación, mien as que las colonias semb adas en el medio
APA ue on analizadas de la mane a desc i a en el apa ado 3.2.3.. Las
colonias semb adas en el medio YES ue on ex aídas con clo o o mo de la
mane a desc i a el apa ado 3.2.10.1., al sép imo y décimo día de
incubación, pa a la con i mación c oma og á ica de la p esencia de
a la oxinas median e RP-HPLC/ luo escencia en el sis ema desc i o en el
apa ado 3.2.11..

Ma e ial y Mé odos
105
3.2.10. Mé odos de ex acción y pu i icación de a la oxinas
3.2.10.1. Ex acción y pu i icación de a la oxinas de
medios de cul i o
Se p ocedió a la ex acción de las a la oxinas u ilizando el
p ocedimien o desc i o po Fen e y col. (2001), el cual consis e en deposi a
el con enido de las placas cul i adas en una bolsa de Mas ica o ® p o egida
po o as dos a la que se añaden 20 ml (10 ml x 2) de clo o o mo.
Pos e io men e, la mezcla aga -clo o o mo se homogeneiza en el Mas ica o ®
du an e 4 minu os, después de los cuales, la ase clo o ó mica se il a en
papel Wha man No. 3 sob e sul a o de sodio anhid o. Los ex ac os se
concen an en un e apo ado , a una empe a u a máxima de 40ºC y se
conse an, en congelación, en iales opacio con apón de osca pa a su
análisis pos e io , en los casos en que no ue a posible ealiza la
de e minación c oma og á ica el mismo día de la ex acción.
Los ex ac os p o enien es de los medios de cul i o con
ciclodex inas no necesi a on pu i icación p e ia a la de e minación
c oma og á ica adecuada, en cambio los ex ac os de medios que con enían
desoxicola o de sodio en su composición, p ecisa on una il ación an es de
se inyec ados al sis ema RP-HPLC que se desc ibe en el apa ado 3.2.11..
3.2.10.2. Ex acción y pu i icación de a la oxinas de
especias, piensos y ma e ias p imas po diálisis di ásica
Las a la oxinas ue on ex aídas y pu i icadas de las mues as de
piensos y ma e ias p imas con una adap ación del mé odo desc i o po
Jaimez (2001). Pa a la ex acción se pesa on 25 g amos de cada mues a,
p e iamen e i u ada y homogenizada, en un ma az balón opacio, de ondo
plano. Se ag ega on 100 ml de me anol-agua (85+15) y se agi ó
Ma e ial y Mé odos
106
manualmen e has a que no se obse a on g umos. Se colocó una memb ana
de diálisis llena con 20 milili os de clo o o mo, de la mane a indicada en la
igu a 6 y los ma aces se agi a on 1 ho a en un agi ado -incubado o bi al a
25ºC. Al cabo de es e iempo se ecupe ó la acción clo o ó mica en un ubo
colo opacio y se e apo ó a sequedad en co ien e de ni ógeno.
Clo o o mo
Se llena la cápsula
ab icada a pa i de
memb ana dializan e
con clo o o mo
Al mismo iempo se
p epa a un ma az
e lenmeye con el
pienso y MeOH:H2O
(85:15)
A.-
B.-
Pienso
Se in oduce en el ma az
la cápsula con eniendo el
clo o o mo
El ma az con la cápsula
se coloca en el agi ado y
se some e a agi ación
du an e el iempo,
empe a u a y .p.m.
pe inen es
D.-
Se ie e la ase
o gánica en un ubo de
ensayo
El ex ac o o gánico se
e apo a a sequedad
Fase o gánica
Clo o o mo
Se llena la cápsula
ab icada a pa i de
memb ana dializan e
con clo o o mo
Al mismo iempo se
p epa a un ma az
e lenmeye con el
pienso y MeOH:H2O
(85:15)
A.-
B.-
Pienso
Se in oduce en el ma az
la cápsula con eniendo el
clo o o mo
El ma az con la cápsula
se coloca en el agi ado y
se some e a agi ación
du an e el iempo,
empe a u a y .p.m.
pe inen es
D.-
Se ie e la ase
o gánica en un ubo de
ensayo
El ex ac o o gánico se
e apo a a sequedad
Fase o gánica
Figu a 6. Esquema del p ocedimien o seguido pa a lle a a cabo la ex acción po
diálisis di ásica.
Ma e ial y Mé odos
107
En el caso de que los pigmen os p esen es en las mues as
a a esaban la memb ana de diálisis, el ex ac o se edisol ió en 3 ml de
diclo ome ano pa a su pos e io pu i icación.
La pu i icación se lle ó a cabo según del mé odo desc i o po Jaimez
(2001): u ilizando ca uchos Sep-Pak C18 (WATERS), los cuales se coloca on
en un sis ema de acío múl iple mani old (WATERS), a 1 a mós e a de
p esión y se acondiciona on con 3 ml de hexano seguidos de 3 ml de
diclo ome ano. Una ez acondicionados los ca uchos, se ag ega on los
ex ac os edisuel os en diclo ome ano. Los ma aces que con enían los
ex ac os se la a on con dos po ciones de 2 ml de diclo ome ano, y ambas
po ciones se ag ega on al ca ucho. Pa a el la ado de los ca uchos, se
u iliza on 3 ml de hexano seguidos de 3 ml de die il é e y 3 ml de
diclo ome ano. Las a la oxinas se eluye on con 3 po ciones de 3 ml de
clo o o mo-ace ona (9+1). Los elua os se e apo a on a sequedad en
co ien e de ni ógeno, a una empe a u a máxima de 40ºC.
Una ez pu i icados, los ex ac os ue on inyec ados al sis ema RP-
HPLC que se desc ibe en el apa ado 3.2.11..
3.2.10.3. Ex acción de a la oxina B1 pa a su de e minación
po el mé odo ELISA
La ex acción de la a la oxina B1 se lle ó a cabo siguiendo el
p o ocolo del ki come cial u ilizado pa a su de e minación: en una bolsa de
Mas ica o ®, se pesa on 2 g amos de la mues a p e iamen e i u ada y
homogenizada con un molinillo de ca é, y se le ag ega on 10 ml de una
mezcla me anol-agua (70+30) a empe a u a ambien e. La suspensión
an e io se homogenizó du an e 3 minu os en un agi ado y pos e io men e se
il ó con il os Wha man No.1. El il ado se ecolec ó en iales plás icos y se
man u o e ige ado y a esgua dado de la luz has a su u ilización pa a el
análisis inmunoenzimá ico.
Ma e ial y Mé odos
108
3.2.11. Mé odo c oma og á ico RP-HPLC con de ección
luo escen e pa a con i mación de la p oducción de a la oxinas
Los ex ac os ue on edisuel os en 200 µl de ase mó il y olúmenes de
50 µl ue on inyec ados al sis ema RP-HPLC-de ección luo escen e p opues o
po Cepeda y col., (1996) con lige as modi icaciones: la ase mó il consis ió
en una mezcla de me anol-agua (50:50, / ), p e iamen e il ada y
desgasi icada, a un lujo de 0,5 ml/min, el de ec o de luo escencia ue
ajus ado a una λex = 365 nm y una λem = 415 nm. El o den de elución de las
a la oxinas u ilizando es e sis ema ue AFG2-AFG1-AFB2-AFB1.
3.2.12. Me odología pa a la ob ención de os o escencia a
empe a u a ambien e de a la oxina B 1 “in i o”
3.2.12.1. Ins umen ación
Las medidas de os o escencia ue on lle adas a cabo empleando un
luminóme o Pe kin Elme LS50B p o is o de una lámpa a pulsada de Xe
como uen e de exci ación, el cual posee como in e ase un PC do ado del
so wa e WINLAB.
Pa a la ealización de medidas os o escen es es necesa io
selecciona un iempo de demo a ( d, anscu ido desde el apagado de la
lámpa a has a el comienzo de la adquisición de la señal) su icien emen e
ele ado (mínimo de 0,04 ms) pa a asegu a que an o las posibles emisiones
luo escen es de la mues a como la luz de la uen e de exci ación y haces de
luz dispe sa no lleguen al de ec o . Po o o lado, es necesa io selecciona
una en ana empo al de medida ( g) de modo que se asegu e la adquisición
de la emisión os o escen e du an e odo su decaimien o.
Ma e ial y Mé odos
109
3.2.12.2. Mé odos pa a ob ención de RTP en disolución
(F-RTP)
3.2.12.2.1. Fos o escencia inducida po á omo pesado
(HAI-RTP)
P epa ación de disoluciones:
- A la oxina B1 0,01M disuel a en ace oni ilo
- Disolución acuosa de KI concen ación 4M
- Disolución acuosa de Na2SO3 concen ación 0,25M
- B omobenceno en p esen ación o iginal (conc. 9,5M)
- B omoe anol en p esen ación o iginal (conc. 13,44M)
Ensayo 1: U ilizando las disoluciones indicadas a iba, se p epa a on
18 disoluciones acuosas en ma aces a o ados de 5 ml con eniendo
concen aciones a iables de AFB1 (10-4 y 10-7 M), KI (1, 1,5 y 2 M) como
uen e ex e na de á omo pesado y Na2SO3 (5, 25 y 50 mM) añadido en úl imo
luga como agen e desoxigenan e. Las disoluciones ue on agi adas y al cabo
de 5 minu os de eposo se as asa on 3,5 ml de cada mezcla a la cube a de
medida, que debía pe manece apada pa a e i a la en ada de oxígeno
du an e las medidas.
Ensayo 2: Siguiendo la me odología del ensayo desc i o
an e io men e se sus i uyó el KI po o as uen es de á omo pesado añadidas
en las siguien es concen aciones: e bio (1 mM y 2,5 mM), b omoe anol 0,2
M y b omobenceno 0,15 M.

Ma e ial y Mé odos
110
3.2.12.2.2. Fos o escencia en p esencia de ciclodex inas
(CD-RTP)
P epa ación de disoluciones:
- A la oxina B1 disuel a en ace oni ilo conc. 0,01M
- Disolución acuosa de KI concen ación 4M
- Disolución acuosa de Na2SO3 concen ación 0,25M
- Disolución acuosa de ciclodex ina CAVASOL® conc. 0,24M
- Disolución acuosa de
β
-ciclodex ina concen ación 0,24M
- B omoe anol en p esen ación o iginal (conc. 13,44M)
- Ciclohexano en p esen ación o iginal (líquido)
Ensayo 3: U ilizando los eac i os indicados a iba, se p epa a on 8
disoluciones acuosas en ma aces a o ados de 5 ml con eniendo
concen aciones a iables de AFB1 (10-4 y 10-7 M) y β-ciclodex ina o β-
hid oxime il-ciclodex ina (CAVASOL®) (3 y 6 mM), así como b omoe anol 0,2
M como uen e de á omo pesado. En p ime luga se mezcló la AFB1 con una
de las ciclodex inas y la mezcla esul an e se dejó eposa p o egida de la luz
du an e una noche, pa a a o ece la o mación del complejo de inclusión AF-
CD. Al cabo de es e iempo se añadió el b omoe anol y las mezclas se
en asa on con agua. T as agi a y después de 5 minu os de eposo 3,5 ml de
cada mezcla ue on as asados a la cube a de medida, que pe maneció
apada mien as se ob u ie on los espec os de emisión.
Ma e ial y Mé odos
111
Ensayo 4: El b omoe anol ue sus i uido po KI (1, 1,5 y 2 M) como
uen e de ex e na de á omo pesado y se ealizó la desoxigenación química
con Na2SO3, que ue añadido siemp e en úl imo luga , en can idad su icien e
pa a ob ene concen aciones inales de 5, 25 y 50 mM.
Ensayo 5: Pa alelamen e a los ensayos 3 y 4, se ealiza on medidas
de os o escencia añadiendo 3 µl de ciclohexano a las mezclas inales una
ez deposi adas en la cube a de medida.
3.2.12.2.3. Fos o escencia en medio micela (MS-RTP)
P epa ación de disoluciones:
- A la oxina B1 disuel a en ace oni ilo conc. 0,01M
- Ca asol CD solución acuosa de concen ación 0,25M
- NaDC solución acuosa de concen ación 0,1M
- Disolución acuosa de KI concen ación 4M
- Disolución acuosa de Na2SO3 concen ación 0,25M
Ensayo 6: U ilizando los eac i os indicados a iba, se p epa a on 18
disoluciones acuosas en ma aces a o ados de 5 ml, con eniendo
concen aciones a iables de AFB1 (10-4 y 10-7 M), KI (1, 1,5 y 2 M),
desoxicola o de sodio 6 mM (concen ación mayo a la cmc = 4 mM) y
Na2SO3 (5, 25 y 50 mM), añadido siemp e en úl imo luga . T as agi a y
después de 5 minu os de eposo, 3,5 ml de cada mezcla ue on as asados
a la cube a de medida, que pe maneció apada mien as se ob u ie on los
espec os de emisión.
Ma e ial y Mé odos
112
3.2.12.2.4. Fos o escencia en disolución de ciclodex ina
con desoxicola o de sodio
P epa ación de disoluciones:
- A la oxina B1 disuel a en ace oni ilo conc. 0,01M
- Ca asol CD solución acuosa de concen ación 0,25M
- NaDC solución acuosa de concen ación 0,1M
- Disolución acuosa de KI concen ación 4M
- Disolución acuosa de Na2SO3 concen ación 0,25M
- B omoe anol en p esen ación o iginal (conc. 13,44M)
Ensayo 7: U ilizando las disoluciones indicadas a iba, se p epa a on
6 disoluciones acuosas en ma aces a o ados de 5 ml, con eniendo
concen aciones a iables de AFB1 (10-4 y 10-7M), CAVASOL® 0,3% (0,0023
M), NaDC 0,6% (0,015 M) y Na2SO3 (5, 25 y 50 mM), añadido siemp e en
úl imo luga . T as agi a y después de 5 minu os de eposo, 3,5 ml de cada
mezcla ue on as asados a la cube a de medida, que pe maneció apada
mien as se ob u ie on los espec os de emisión.
Ensayo 8: Al e na i amen e, se ealizó el mismo ensayo an e io
abajando con desoxicola o de sodio 6 mM (concen ación mayo a la c.m.c.)
y CAVASOL® 3 y 6 mM.
Ensayo 9: Asimismo, se epi ie on los ensayos 7 y 8 adicionando
uen es ex e nas de á omo pesado: KI 1 y 2 M y b omoe anol en
concen ación inal 0,2 M.
Los espec os de emisión RTP co espondien es a los apa ados
3.2.12.2.1 a 3.2.12.2.4 (ensayos 1-9) se ob u ie on a iando las condiciones
ins umen ales den o de los siguien es angos:
Ma e ial y Mé odos
113
λex: 350 – 370 nm
λem: 400 – 700 nm
d = 0,04 – 0,08 ms
g = 1 - 3 ms
Rendijas:
Exi ación: 10 – 20 nm
Emisión: 15 – 20 nm
3.2.12.3. Mé odos pa a ob ención de os o escencia a
empe a u a ambien e en sopo e sólido (SS-RTP)
3.2.12.3.1. Ensayos en papel de il o
P epa ación de disoluciones:
- A la oxina B1 disuel a en ace oni ilo conc. 0,01M
- Ca asol CD solución e anólica de concen ación 0,25M
- NaDC solución e anólica de concen ación 0,1M
- Disoluciones e anólicas de AlCl3, ZnCl2,Mg(NO3)2
(CH3COO)2Cd, y HgCl concen ación 0,3 ug/ml
- Disoluciones acuosas de AlCl3, ZnCl2,Mg(NO3)2,
(CH3COO)2Cd, HgCl, Li2CO3,, Cl3Tb, KI y LiF
concen ación 0,3 ug/ml
- B omoe anol en p esen ación o iginal (conc. 13,44M)
Ensayo 10: Se co a on i as de papel de il o Wa man nº4 del
amaño de un sopo e de ac ílico diseñado pa a adap a se al po acube as
del luminóme o (0,8cm x 1,3cm). Pos e io men e las i as ue on
acondicionadas con el in de elimina la humedad que pudie an con ene , po
medio de e apo ación, en una es u a a 60 - 80ºC du an e una noche.
216
Tabla 50. Géne os úngicos encon ados en alimen os é nicos en los es medios empleados.
GENERO MP % MP % MP % MP %
Penicillium 1 4,35 1 4,35 0 0 0,67 2,90
Aspe gillus spp. 11 47,83 10 43,48 2 8,70 7,67 33,33
Aspe gillus la us 12 52,17 11 47,83 4 17,39 9 39,13
Aspe gillus nige 28,7000000,672,90
Eu o ium 2 8,70 2 8,70 1 4,35 1,67 7,25
Muco 00000000
Rizophus 2 8,70 4 17,39 0 0 2,00 8,70
Cladospo ium 6 26,09 4 17,39 1 4,35 3,67 15,94
Fusa ium 14,3500000,331,45
Al e na ia 00000000
Geo ichum 00000000
M icelia s e ilia 8 34,78 7 30,43 5 21,74 6,67 28,99
MP:
Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA

217
Tabla 51. Géne os úngicos encon ados en u os secos en los es medios empleados.
GENERO MP%MP%MP%MP%
Penicillium 9 69,23 5 38,46 6 46,15 6,67 51,28
Aspe gillus spp. 11 84,62 11 84,62 10 76,92 10,67 82,05
Aspe gillus la us 8 61,54 2 15,38 2 15,385 4 30,77
Aspe gillus nige 4 30,77 2 15,38 0 0 2 15,38
Eu o ium 1 7,69 0 0 0 0 0,33 2,56
Muco 0 0 2 15,38 0 0 0,67 5,13
Rizophus 5 38,46 3 23,08 0 0 2,67 20,51
Cladospo ium 9 69,23 3 23,08 5 38,46 5,67 43,59
Fusa ium 3 23,08 3 23,08 2 15,38 2,67 20,51
Al e na ia 0 0 3 23,08 2 15,38 1,67 12,82
Geo ichum 1 7,69 1 7,69 0 0 0,67 5,13
Micelia s e ilia 11 84,62 10 76,92 7 53,85 9,33 71,79
MP:
Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA
218
Tabla 52. Géne os úngicos encon ados en u os desecados en los es medios empleados.
GENERO MP % MP % MP % MP %
Penicillium 1 10 2 20 1 10 1,33 13,33
Aspe gillus spp. 440440770550
Aspe gillus la us 660550110440
Aspe gillus nige 2 20 2 20 0 0 1,33 13,33
Eu o ium 00000000
Muco 22000000,676,67
Rizophus 4 40 2 20 0 0 2 20
Cladospo ium 8 80 7 70 1 10 5,33 53,33
Fusa ium 3 30 2 20 0 0 1,67 16,67
Al e na ia 00000000
Geo ichum 0 0 2 20 0 0 0,67 6,67
M icelia s e ilia 7 70 8 80 4 40 6,33 63,33
MP:
Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA
219
Tabla 53. Géne os úngicos encon ados en especias en los es medios empleados.
GENERO MP % MP % MP % MP %
Penicillium 7 29,17 6 25 7 29,17 6,67 27,78
Aspe gillus spp. 10 41,67 10 41,67 10 41,67 10 41,67
Aspe gillus la us 22 91,67 9 37,5 12 50 14,33 59,72
Aspe gillus nige 13 54,17 9 37,5 3 12,5 8,33 34,72
Eu o ium 1 4,17 0 0 0 0 0,33 1,39
Muco 2 8,33 5 20,83 0 0 2,33 9,72
Rizophus 10 41,67 8 33,33 0 0 6 25
Cladospo ium 13 54,17 10 41,67 2 8,33 8,33 34,72
Fusa ium 4 16,67 1 4,17 1 4,17 2,00 8,33
Al e na ia 1 4,17 0 0 0 0 0,33 1,39
Geo ichum 1 4,17 3 12,5 1 4,17 1,67 6,94
M icelia s e ilia 12 50 9 37,5 6 25 9,00 37,50
MP:
Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA
220
Tabla 54. Géne os úngicos encon ados en mues as de é en cada uno de los es medios empleados.
GENERO MP % MP % MP % MP %
Penicillium 4 28,57 3 21,43 4 28,57 3,67 26,19
Aspe gillus spp. 11 78,57 10 71,43 9 64,29 10 71,43
Aspe gillus la us 9 64,29 12 85,71 4 28,57 8,33 59,52
Aspe gillus nige 11 78,57 8 57,14 1 7,14 6,67 47,62
Eu o ium 0 0 0 0 2 14,29 0,67 4,76
Muco 6 42,86 2 14,29 0 0 2,67 19,05
Rizophus 7 50 8 57,14 0 0 5 35,71
Cladospo ium 5 35,71 2 14,29 0 0 2,33 16,67
Fusa ium 00000000
Al e na ia 00000000
Geo ichum 00000000
Micelia s e ilia 5 35,71 4 28,57 5 35,71 4,67 33,33
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA
221
Tabla 55. Géne os úngicos encon ados en alimen os a iados en los es medios empleados.
GENERO MP % MP % MP % MP %
Penicillium 1 12,50 0 0 1 12,50 0,67 8,33
Aspe gillus spp. 6 75 5 62,50 6 75 5,67 70,83
Aspe gillus la us 4 50 3 37,50 3 37,50 3,33 41,57
Aspe gillus nige 00000000
Eu o ium 1 12,5 1 12,5 0 0 0,67 8,33
Muco 2 25 1 12,50 0 0 1 12,50
Rizophus 00000000
Cladospo ium 4 50 3 37,50 0 0 2,33 29,17
Fusa ium 1 12,5 0 0 0 0 0,33 4,17
Al e na ia 00000000
Geo ichum 0 0 1 12,5 0 0 0,33 4,17
Micelia s e ilia 3 37,50 4 50 1 12,50 2,67 33,33
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
SAB MA MACD MEDIA

Resul ados y Discusión
222
4.6.2.4. Capacidad a la oxigénica de las cepas de Aspe gillus
la us
La con aminación de los alimen os ( an o pa a consumo humano
como animal) po mohos, siemp e es indeseable, ya que la p esencia de
géne os úngicos po encialmen e oxigénicos, independien emen e del ni el,
siemp e puede causa p oblemas de oxicidad debidos a la p oducción de
mico oxinas. En es e sen ido, se ha comp obado que ni eles muy bajos de
con aminación (10-1) po Aspe gillus spp., han sido capaces de p oduci
g andes can idades de a la oxinas, si las condiciones ambien ales son
a o ables pa a ello (Sha ma y col., 1980; Ka una a ne y Bulle man, 1990).
Se ealizó la iden i icación de las cepas a la oxigénicas de Aspe gillus
spp. aisladas a pa i de las placas semb adas, po dos mé odos, uno el
mé odo mic obiológico desc i o en el apa ado 3.2.9. y el o o ue el mé odo
de ex acción desc i o en el apa ado 3.2.10.1. pa a la pos e io de ección
c oma og á ica en el sis ema desc i o en el apa ado 3.2.11..
En cuan o a los esul ados, cabe apun a que a pa i del medio SAB
se aisló la mayo can idad de cepas de Aspe gillus la us, un o al de 61,
en e las cuales 22 cepas mos a on capacidad a la oxigénica lo que
ep esen a un 36%. En el medio MA, se desa olla on mejo las cepas con
capacidad a la oxigénica, po que de un o al de 42 colonias aisladas de A.
la us esul a on posi i as 23, ep esen ando un 55%. A pa i del medio MACD
se ob u o un po cen aje similia al medio SAB (38,5%), sin emba go, en es e medio,
en cuan o a núme o se aisla on menos cepas de A. la us, solamen e 26,
siendo posi i as 10. Es e esul ado ha sido conside ado cohe en e, eniendo en
cuen a que en el medio MACD la mico lo a no alcanza un desa ollo
equipa able a los o os dos medios, debido al NaDC que es un inhibido de
c ecimien o.
Es os esul ados es án ep esen ados en las ablas 56 y 57.
Resul ados y Discusión
223
Tabla 56. Capacidad a la oxigénica de las cepas de Aspe gillus la us
aislados de los 3 medios de cul i o.
ipo de
alimen o
ALIM. ETNICOS
FRUTOS SECOS
FRUTOS DESECADOS
ESPECIAS
TES
VARIOS
TOTALES
3/3
23/42
4/4
22/61
1/4
1/2
0/1
4/12
3/4
1/3
10/26
3/9
8/12
1/2
5/11
4/22
4/9
4/12
4/8
3/6 3/5
SAB
(+)/To ales aisladas (+)/To ales aisladas (+)/To ales aisladas
MA MACD
La capacidad a la oxigénica de las colonias de Aspe gillus la us que
se desa olla on en el medio MACD se comp obó di ec amen e en la placa
po la p esencia de halo beige al ededo de las colonias así como la
luo escencia del mismo como se mues a en la igu a 34.
Resul ados y Discusión
224
Figu a 34. a) Examen a simple is a de la placa de siemb a de una mues a de
o égano en el medio de cul i o MACD, donde exis e una colonia a la oxigénica que
p esen a un halo beige, el cual no es á p esen e al ededo de las o as colonias. b)
Examen de la misma placa con una lámpa a de luz UV, se obse a que el anillo beige
exhibe una luo escencia que no exhiben las o as colonias.
Debido a que los g upos de alimen os no son del mismo amaño, los
esul ados de los po cen ajes son más ep esen a i os pa a e cual de ellos
con iene mayo nume o de cepas con capacidad a la oxigénica ( abla 57).
Tabla 57. Po cen ajes de cepas a la oxigénicas p esen es en los alimen os
en los medios de cul i o empleados.
ipo de
alimen o
ALIM. ETNICOS
FRUTOS SECOS
FRUTOS DESECADOS
ESPECIAS
TES
VARIOS
44 67 75
100 100 75
50 60 0
18 33 33
33 45 25
50 50 50
SAB% MA% MACD%
En los alimen os a iados, donde se encuen an los panes, sésamo,
a oz y ape i i os a base de galle as y u os secos, el 100% de la cepas de
Resul ados y Discusión
225
Aspe gillus la us aisladas de los medios SAB y MA, han mos ado capacidad
a la oxigénica. Se ienen da os an e io es sob e la p esencia de a la oxinas
en a oz (Manabe y col., 1978), ha inas (Cu uli de Simón, 1983; Tu elyan,
1989; Abouzied, 1991; Midio, 2001) y cacahue es (Manabe, 1978; F ancis,
1982; Do ne , 1988; Tu elyan, 1989; Sha man, 1990; Aze , 1991; Roch, 1992;
Wood, 1992; Taguchi, 1995; Sha zki 1998; Ali, 1999; Neal 2001).
Co obo ando lo dicho sob e los cacahue es en el g upo de los u os secos
se ob u o ambién un al o po cen aje de cepas a la oxigénicas (un 50% en los
es medios SAB, MA y MACD) y con amos ambién con publicaciones donde
se habla de la apa ición de a la oxinas en almend as (Shade, 1981; Tu elyan,
1989; Ahmed, 1998; Ong, 2000) y nueces (Pi , 1994).
También en los u os desecados la mayo ía de las cepas de A.
la us aisladas esul a on p oduc o as de a la oxinas, encon ándose incluso,
un mayo po cen aje que los u os secos (60%) cuando ue on cul i adas en
el medio MA. El medio de cul i o MACD ha mos ado la misma e ec i idad
que los o os dos medios MA y SAB en el caso de los u os secos y las
especias, en el caso de las in usiones ha uncionado mejo que los medios de
uso habi ual pa a la de ección de cepas a la oxigénicas, en donde el 75% de
las cepas aisladas han desa ollado es a capacidad.
La p ueba χ2 pa a un ni el de con ianza del 95% y 5 g ados de
libe ad, demos ó que no exis en di e encias signi ica i as en e el núme o de
cepas de A. la us que han esul ado a la oxigénicas aisladas de los medios
de cul i o SAB y MA, y al igual que en las p uebas an e io es el nue o medio
no esul a compa able con los medios usados como e e encia.
232
Tabla 59. Recuen o de mohos, le adu as y ecuen o o al (log u c/g) en mues as de ma e ias p imas en el medio de cul i o MACD
al quin o día de incubación a 28ºC.
ipo de
alimen o Min Max Med SD Min Max Med SD Min Max Med SD
H.soja (n=3) 3,78 6,52 4,97 1,40 4,62 6,24 5,34 0,82 5,20 6,70 5,73 0,85
Cebada (n=3) 4,56 6,44 5,77 1,05 5,46 6,24 5,91 0,41 0,41 6,24 4,19 3,28
Cebad molid (n=4) 0 5,994,172,804,325,895,270,745,57 6 5,850,19
S. algodón (n=9) 4,06 5,79 4,93 0,70 0 6,37 3,86 2,35 4,15 6,47 5,23 0,77
Maíz g ano (n=7) 5,43 6,46 5,94 0,36 0 6,85 3,50 3,32 5,57 6,91 6,23 0,51
Maíz molido (n=6) 0 6,40 4,90 2,55 0 7 5,12 2,67 0 7 3,70 2,47
Mohos Le adu as To al
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda

Resul ados y Discusión
233
A cua o (12,25 %) de las 32 mues as de ma e ias p imas, no se les
de ec ó la p esencia de mohos, mien as que en odas las mues as es an es
se de ec ó la p esencia conjun a de mohos y de le adu as. En gene al, los
ecuen os o ales de las mues as, ue on un e lejo del g ado de
con aminación po le adu as pues en la mayo ía de los casos, los ecuen os
pa a le adu as ue on mayo es o iguales que los ecuen os pa a mohos.
El g ado de con aminación úngica en g anos y ce eales
almacenados y en piensos, puede u iliza se como una medida de la calidad
de las condiciones de almacenamien o ( empe a u a y g ado de humedad
adecuados, e c.) a las que han es ado some idas. Así, los piensos o g anos
con bajos ecuen os úngicos (101-103 u c/g), pueden conside a se de mejo
calidad y más segu os, que aquellos con ecuen os más al os (106 u c/g)
(Ka una a ne y col., 1990).
La con aminación de los alimen os ( an o pa a consumo humano
como animal) po mohos, siemp e es indeseable, ya que la p esencia de
géne os úngicos po encialmen e oxigénicos, independien emen e del ni el,
siemp e puede causa p oblemas de oxicidad debidos a la p esencia de
mico oxinas. En es e sen ido, se ha comp obado que ni eles muy bajos de
con aminación (10-1) po Aspe gillus spp., han sido capaces de p oduci
g andes can idades de a la oxinas, si las condiciones ambien ales son
a o ables pa a ello (Sha ma y col., 1980; Ka una a ne y Bulle man, 1990).
Gene almen e, la p oducción de mico oxinas no ocu e sin el
c ecimien o del moho p oduc o . Po o a pa e, la p esencia de hongos
mico oxigénicos en de e minado p oduc o no indica au omá icamen e la
p esencia de mico oxinas, especialmen e si el c ecimien o no ha ocu ido. Sin
emba go, las oxinas pueden pe sis i mucho después de que el c ecimien o
ege a i o haya ocu ido y los mohos hayan mue o (Bulle man y col., 1984).
Resul ados y Discusión
234
RECUENTO DE LEVADURAS EN MACD
0
20
40
60
80
100
<2 2-2,9 3-3,9
log u c/g
%
h soja cebada cebada molida s. algodón maiz g ano maiz molido
Figu a 38
RECUENTO DE MOHOS EN MACD
0
20
40
60
80
100
<2 2-2,9 3-3,9
log u c
%
h soja cebada cebada molida s. algodón maiz g ano maiz molido
Figu a 39
Resul ados y Discusión
235
RECUENTO TOTAL EN MACD
0
20
40
60
80
100
<2 2-2,9 3-3,9
log u c/g
%
h soja
cebada
cebada molida
s. algodón
maiz g ano
maiz molido
Figu a 40
4.6.3.3. Compa ación en e los esul ados ob enidos u ilizando el
nue o medio MACD y el medio SAB
4.6.3.3.1. Compa ación de los ecuen os en mues as de
alimen os concen ados pa a ganado acuno
En las ablas 60, 61 y 62 se mues an los alo es de los ecuen os de
mohos, de le adu as y o ales ob enidos pa a las mues as de piensos y
mezclas, cul i adas en los medios MACD y SAB. Al igual que se hizo en el
apa ado de los alimen os come cializados en Galicia, pa a de e mina si
es os esul ados di e ían signi ica i amen e, se analiza on los da os median e
la p ueba “ ” pa a da os pa eados.
En las igu as 41, 42 y 43 se mues an los po cen ajes de los
ecuen os de mohos, le adu as y o ales espec i amen e, ob enidos en el
medio de cul i o SAB, den o de cada ca ego ía es ablecida según la
Resul ados y Discusión
236
can idad de mic oo ganismos p esen es (log u c/g) en las mues as
analizadas.
No se obse a on di e encias signi ica i as pa a un in e alo de
con ianza del 95%, en e los ecuen os o ales ob enidos con los medios
MACD y SAB, po lo que se puede in e i que el medio MACD pod ía sus i ui
a un medio de ecuen o adicional, pa a el análisis de mues as de alimen os
pa a animales de g anja, con la en aja de pe mi i la iden i icación
simul ánea de cepas a la oxigénicas.
Tabla 60. Recuen o de mohos (log u c/g) en mues as de alimen os
concen ados, en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de incubación a
28ºC.
Recuen o de mohos
ipo de
alimen o Min Max Med SD Min Max Med SD
Piensos (n=9) 3,30 5,66 4,59 0,75 0 5,71 4,51 1,81
Mezclas (n=12) 4,60 5,95 5,42 0,40 4,95 6,14 5,44 0,32
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda
MACD SA B
Tabla 61. Recuen o de le adu as (log u c/g) en mues as de alimen os
concen ados en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de incubación a
28ºC.
Recuen o de le adu as
ipo de
alimen o Min Max media SD Min Max media SD
Piensos (n=9) 0 6,82 4,55 2,67 0 6,53 3,25 3,10
Mezclas (n=12) 3,78 6,78 5,54 0,84 5 6,48 5,88 0,48
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda
MACD SA B
Resul ados y Discusión
237
Tabla 62. Recuen o o al (log u c/g) de mohos y le adu as en mues as de
alimen os concen ados en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de
incubación a 28ºC.
Recuen o o al
ipo de
alimen o Min Max media SD Min Max media SD
Piensos (n=9) 3,30 6,82 5,66 1,07 0 6,54 4,96 2,04
Mezclas (n=12) 5,11 6,79 5,93 0,53 5,55 6,51 6,10 0,30
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda
MACD SA B
RECUENTO DE LEVADURAS EN SAB
0
20
40
60
80
<2 2-2,9 3-3,9
log u c/g
%
piensos mezclas
Figu a 41

Resul ados y Discusión
238
RECUENTO DE MOHOS EN SAB
0
20
40
60
80
<2 2-2,9 3-3,9
log u c/g
%
piensos mezclas
Figu a 42
RECUENTO TOTAL EN SAB
0
20
40
60
80
<2 2-2,9 3-3,9
log u c/g
%
piensos mezclas
Figu a 43
Resul ados y Discusión
239
4.6.3.3.2. Compa ación de los ecuen os en mues as de
ma e ias p imas
En las ablas 63, 64 y 65 se compa an los alo es de los ecuen os
de mohos, de le adu as y o ales ob enidos pa a las mues as de ma e ias
p imas, cul i adas en los medios MACD y SAB. Pa a de e mina si es os
ecuen os di e ían signi ica i amen e en e si, los da os se analiza on
median e la p ueba “ ” pa a da os pa eados. No se obse a on di e encias
signi ica i as pa a un ni el de signi icación de 0,05 (in e alo de con ianza de
95%) en e los esul ados de ecuen os ob enidos con los dos medios de
cul i o.
En las igu as (44, 45 y 46) se mues an los po cen ajes de los
ecuen os de mohos, le adu as y o ales, en el medio de cul i o SAB, den o
de cada ca ego ía es ablecida según la can idad de mic oo ganismos
p esen es (log u c/g) en las mues as analizadas.
240
Tabla 63. Recuen o de le adu as (log u c/g) en mues as de ma e ias p imas en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día
de incubación a 28ºC.
Recuen o de le adu as
ipo de
alimen o Min Max Med SD Min Max Med SD
H.soja (n=3) 4,62 6,24 5,34 0,82 0 5,24 3,39 2,9407
Cebada (n=3) 5,46 6,24 5,91 0,41 0 6,28 3,92 3,4205
Cebada molid (n=4) 4,32 5,89 5,27 0,74 0 5,32 3,85 2,57
S. algodón (n=9) 0 6,373,862,354,816,315,480,55
Maíz g ano (n=7) 0 6,85 3,50 3,32 0 6,95 4,47 3,15
Maíz molido (n=6) 0 7 5,12 2,67 3 7,29 5,77 1,54
MACD SA B
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda
241
Tabla 64. Recuen o de mohos (log u c/g) en mues as de ma e ias p imas, en los medios de cul i o MACD y SAB, al quin o día de
incubación a 28ºC.
Recuen o de mohos
ipo de
alimen o Min Max Med SD Min Max Med SD
H. soja (n=3) 3,78 6,52 4,97 1,40 4,40 5,76 5,05 0,69
Cebada (n=3) 4,56 6,44 5,77 1,05 3,85 6,98 5,58 1,60
Cebada molid (n=4) 0 5,99 4,17 2,80 4,60 5,58 5,18 0,46
S. algodón (n=9) 4,06 5,79 4,93 0,70 0 5,30 1,64 2,48
Maíz g ano (n=7) 5,43 6,46 5,94 0,36 5,46 6,60 6,20 0,40
Maíz molido (n=6) 0 6,40 4,90 2,55 4,08 6,70 5,87 0,93
MACD SA B
Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Des iación es ánda
Resul ados y Discusión
248
Tabla 69. Tan o po cien alcanzado po cada géne o en los dos medios y
eniendo en cuen a el o al de los alimen os.
GENEROS MACD% SAB%
Penicillium 66,67 71,43
Aspe gillus spp. 66,67 57,14
Aspe gillus la us 38,10 38,10
Eu o ium 9,52 42,86
Cladospo ium 28,57 23,81
Fusa ium 38,10 66,67
Compa ación de géne os aislados en los dos
medios de cul i o
0
20
40
60
80
Penicillium
Aspe gillus spp.
Aspe gillus la us
Eu o ium
Cladospo ium
Fusa ium
Especie
Po cen aje (%)
MACD%
SAB%
Figu a 47. Tan o po cien alcanzado po cada géne o en los es medios y eniendo
en cuen a el o al de los alimen os concen ados.

Resul ados y Discusión
249
La p ueba χ2 con α= 0,05 y 4 g ados de libe ad, demues a que no
exis en di e encias signi ica i as en e los géne os aislados de ambos medios
de cul i o. Compa ando es os esul ados, hay que señala como única
di e encia, que Muco spp. ue el único géne o que no ue aislado en el medio
MACD y si ue aislado en el medio SAB, lo cual hace la elación de géne os
en e los dos medios de cul i o compa able, ya que Muco spp. no es un
géne o de impo ancia epidemiológica ni económica.
250
Tabla 70. F ecuencia de la p esencia ( an o po cien) de los dis in os géne os úngicos aislados de mues as de alimen os
concen ados en los medios MACD y SAB.
PIENSOS (n =9) MEZCLAS (n=12) TOTAL (n=21)
MP % MP % MP %
GENEROS MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B
Penicillium 5/6 55/67 9/9 75/75 14/15 67/71
Aspe gillus spp. 7/3 78/33 7/9 58,3/75 14/12 67/57
Aspe gillus la us 2/2 22/22 6/6 50/50 8/8 38/38
Aspe gillus nige 0/1 0/11 1/2 8/17 1/3 5/14
Eu o ium 0/3 0/33 2/6 17/50 2/9 9/43
Muco 0/2 0/22 0/6 0/50 0/8 0/38
Rizophus 1/1 11/11 0/0 0/0 1/1 5/5
Cladospo ium 3/3 33/33 3/2 25/17 6/5 29/24
Fusa ium 2/4 22/44 6/10 50/83 8/14 38/67
Micelia s e ilia 0/3 0/33 1/2 8/17 1/5 5/24
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
Resul ados y Discusión
251
4.6.3.6. Análisis de los dis in os géne os úngicos aislados en
mues as de ma e ias p imas
4.6.3.6.1. Géne os úngicos aislados en el medio de cul i o
MACD
Se ealizó el aislamien o y al iden i icación de los géne os úngicos
encon ados en los cul i os de las mues as según la me odología desc i a en
los apa ados 3.2.7. y 3.2.8. espec i amen e.
A pa i del medio MACD se aisla on 6 géne os úngicos en las
dis in as mues as de alimen os: Penicillium spp., Aspe gillus spp., Eu o ium
spp., Cladospo ium spp., Fusa ium spp. y Micelia s e ilia.
En el p esen e es udio, el géne o Penicillium spp., ue aislado con la
misma ecuencia que Aspe gillus spp. (50%). Se con a on po sepa ado A. la us
(31,3%) y Eu o ium (15,6%). Coinicidiendo con los esul ados ob enidos po
o os au o es, el géne o Aspe gillus es uno de los que se han encon ado
más ecuen emen e, du an e el es udio de la mico lo a en mues as de maíz
(Viñas y col., 1984; Adebajo y col., 1994; Cas o y col., 1995; El-Magh aby y
col., 1995; Pozzi y col., 1995; Ono y col., 1999, 2002; Almeida y col., 2000,
2002, Pacin y col., 2003), soja (Roy y col., 2001) y semillas de algodón
(Mazen y col., 1990; Klich, 1998).
Los po cen ajes de ecuencia de los demás géne os ue on:
Cladospo ium spp. (16%), Fusa ium spp. (25%) y Micelia s e ilia (6%).
Todos los géne os aislados en el análisis de las mues as es udiadas,
han sido mencionados en es udios hechos po o os au o es.
En la abla 71 se mues a la ecuencia de la p esencia (po cen aje)
de los géne os úngicos aislados de las mues as de ma e ias p imas
analizadas.
252
Tabla 71. F ecuencia de la p esencia ( an o po cien) de los dis in os géne os úngicos aislados de mues as de ma e ias p imas
cul i adas en el medio MACD.
HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ
SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32)
GENEROS MP%MP%MP%MP%MP%MP%MP%
Penicillium 3 100 2 66,67 3 75 3 33,33 5 71,43 4 66,67 16 50
Aspe gillus spp. 2 66,67 2 66,67 3 75 7 77,78 2 28,57 1 16,67 16 50
Aspe gillus la us 1 33,33 1 33,33 2 50 5 55,56 0 0 1 16,67 10 31,25
Aspe gillus nige 1 33,33 0 0 1 25 0 0 0 0 0 0 2 6,25
Eu o ium 1 33,33 2 66,67 0 0 1 11,11 1 14,29 0 0 5 15,63
Muco 00000000000000
Rizophus 00000000000000
Cladospo ium 0 0 1 33,33 1 25 1 11,11 2 28,57 2 33,33 5 15,63
Fusa ium 0 0 133,330 0 444,44342,86466,678 25
Micelia s e ilia 0 0 0 0 1 25 1 11,11 0 0 1 16,67 2 6,25
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
Resul ados y Discusión
253
4.6.3.6.2. Géne os úngicos aislados en mues as de ma e ias
p imas u ilizando SAB
En el medio SAB se encon a on y aisla on 7 géne os úngicos en las
dis in as mues as de alimen os: Penicillium spp., Aspe gillus spp., Muco
spp., Rizophus spp., Cladospo ium spp., Fusa ium spp. y Micelia s e ilia.
El géne o más abundan e ue Aspe gillus spp. (56%), seguido del
géne o Penicillium spp. (47%).
Los po cen ajes de los demás géne os ue: Fusa ium spp. (37%),
Muco spp. (38%), Cladospo ium spp. (19%), Micelia s e ilia (12%) y
Rizophus spp. (6%).
Los da os e e en es a la ecuencia de los géne os úngicos aislados
del medio SAB se mues an en la abla 72.

254
Tabla 72. F ecuencia de la p esencia ( an o po cien) de los dis in os géne os úngicos aislados de mues as de ma e ias p imas
cul i adas en el medio SAB.
HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ
SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32)
GENEROS MP%MP%MP%MP%MP%MP%MP%
Penicillium 2 66,67 2 66,67 4 100 3 33,33 4 57,14 2 33,33 15 46,88
Aspe gillus spp. 3 100 2 66,67 2 50 8 88,89 3 42,86 2 33,33 18 56,25
Aspe gillus la us 1 33,33 2 66,67 2 50 8 88,88 1 14,29 0 0 14 43,75
Aspe gillus nige 133,3300125666,670000825
Eu o ium 1 33,33 3 100 1 25 7 77,78 1 14,29 0 0 13 40,63
Muco 1 33,33 0 0 1 25 5 55,56 1 14,29 1 16,67 8 25
Rizophus 000000222,22000026,25
Cladospo ium 0 0 1 33,33 1 25 1 11,11 3 42,86 1 16,67 6 18,75
Fusa ium 0 0 1 33,33 0 0 6 66,67 5 71,43 2 33,33 12 37,5
Micelia s e ilia 1 33,33 1 33,33 0 0 2 22,22 0 0 1 16,67 4 12,5
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
Resul ados y Discusión
255
4.6.3.6.3. Compa a i a en e los medios de cul i o SAB y MACD
de los dis in os géne os úngicos aislados en mues as de ma e ias
p imas
Pa a el análisis es adís ico de la ecuencia de géne os úngicos se
oma on los da os e e en es a cada géne o y en cada medio, conside ando
odos los ipos de ma e ias p imas como un único g upo. Sob e es os da os, y
po conside a que son más ep esen a i os que si omamos los g upos de
alimen os po sepa ado, se ha ealizado la p ueba χ2 (Chi cuad ado), que
comp ueba si la ecuencia de apa ición de los géne os es compa able en los
dos medios. Eliminando los géne os que ep esen an un po cen aje meno
del 5%, los cuales ue on Muco y Rizophus.
Analizando es os esul ados es adís icamen e, median e la p ueba χ2
encon amos que pa a un ni el de signi icación de 0,05 y 5 g ados de
libe ad, no exis en di e encias signi ica i as en e las ecuencias de
aislamien o de los dis in os géne os úngicos aislados de las mues as de
ma e ias p imas, en los medios de cul i o MACD y SAB.
Tabla 73. Núme o de mues as en las que ha apa ecido cada géne o en el
o al de los alimen os concen ados y sob e la que se han ealizado el análisis
es adís ico.
GENEROS SAB MA
Penicillium 15 16
Aspe gillus spp 18 16
Aspe gillus la us 14 10
Eu o ium 13 5
Cladospo ium 65
Fusa ium 12 8
Resul ados y Discusión
256
Tabla 74. Tan o po cien alcanzado po cada géne o en los dos medios y
eniendo en cuen a el o al de los alimen os.
GENEROS SAB % MACD%
Penicillium 46,88 50
Aspe gillus spp. 56,25 50
Aspe gillus la us 43,75 31,25
Aspe gillus nige 25 6,25
Eu o ium 40,63 15,63
Cladospo ium 18,75 15,63
Fusa ium 37,5 25
Micelia s e ilia 12,50 6,25
Compa ación de géne os aislados en los dos medios
de cul i o
0
20
40
60
Penicillium
Aspe gillus spp.
Aspe gillus la us
Aspe gillus nige
Eu o ium
Cladospo ium
Fusa ium
Micelia s e ilia
Especie
Po cen aje (%)
SAB %
MACD%
Figu a 48. Tan o po cien alcanzado po cada géne o en los dos medios y eniendo en
cuen a el o al de las ma e ias p imas analizadas.
257
Tabla 75. F ecuencia de la p esencia ( an o po cien) de los dis in os géne os úngicos aislados de mues as de ma e ias p imas
en los medios MACD y SAB.
HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ
SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32)
MP % MP % MP % MP % MP % MP % MP %
GENEROS MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB
Penicillium 3/2 100/67 2/2 67/67 3/4 75/100 3/3 33/33 5/4 71/57 4/2 67/33 16/15 50/47
Aspe gillus spp. 2/3 67/100 2/2 67/67 3/2 75/100 7/8 78/89 2/3 29/43 1/2 17/33 16/18 50/56
Aspe gillus la us 1/1 33/33 1/2 33/67 2/2 50/50 5/8 56/89 0/1 0/14 1/0 17/0 10/14 31/44
Aspe gillus nige 1/1 33/33 0/0 0/0 1/1 25/25 0/6 0/67 0/0 0/0 0/0 0/0 2/8 6/25
Eu o ium 1/1 33/33 2/3 67/100 0/1 0/25 1/7 11/78 1/1 14/14 0/0 0/0 5/13 16/41
Muco 0/1 0/33 0/0 0/0 0/1 0/25 0/5 0/56 0/1 0/14 0/0 0/0 0/0 0/0
Rizophus 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/2 0/22 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0
Cladospo ium 0/0 0/0 1/1 33/33 1/1 25/25 1/1 11/11 2/3 29/43 2/1 33/17 5/6 16/19
Fusa ium 0/0 0/0 1/1 33/33 0/0 25/25 4/6 44/67 3/5 43/71 4/2 67/33 8/12 25/38
Micelia s e ilia 0/1 0/33 0/1 0/33 1/0 25/0 1/2 11/22 0/0 0/0 1/1 17/17 2/4 6/13
MP: Mues as posi i as a cada géne o úngico
Resul ados y Discusión
264
4.7. OBTENCIÓN DE RTP DE AFLATOXINA B1“in i o”
A aíz de las obse aciones ela adas en el apa ado 4.5., se
ealiza on ensayos en base a las di e en es me odologías de inducción de
RTP que han sido desc i as en la li e a u a. Los ensayos de allados a
con inuación es u ie on di igidos a ep oduci el mismo enómeno median e la
inducción de RTP de a la oxinas “in i o”. Tan o los ensayos en discon inuo
(pa a ep oduci las condiciones de la placa de medio de cul i o) como en
lujo se ealiza on con la inalidad de encon a un mé odo aplicable a la
de e minación de a la oxinas en alimen os median e una écnica
os o imé ica.
La a la oxina B1 ue elegida pa a los ensayos de ob ención de (RTP),
debido a que se conoce que su emisión luo escen e aumen a has a 27
eces po in e acción con las ciclodex inas (Cepeda y col., 1996). Al
mismo iempo se conce que las ciclodex inas se u ilizan pa a induci
os o escencia de una a iedad de compues os.
4.7.1. Ob ención de RTP en disolución (F-RTP)
4.7.1.1. Fos o escencia inducida po á omo pesado
(HAI-RTP)
Siguiendo los p ocedimien os desc i os en el apa ado 3.2.12.2.1.
ue on p obadas di e en es combinaciones de a la oxina B1 con los adi i os,
así como di e en es condiciones ins umen ales. Las medidas ue on
compa adas con espec os ob enidos a pa i de disoluciones “blanco”
p epa adas de la misma mane a, con eniendo odos los eac i os, excep o la
AFB1.
Al no ob ene se señal analí ica ú il con el yodu o de po asio
(ENSAYO 1), ue on p obados o os compues os como uen e ex e na de

Resul ados y Discusión
265
á omo pesado (ENSAYO 2): b omobenceno, b omoe anol y e bio, siguiendo
el mismo p ocedimien o y añadiendo los compues os en can idad su icien e
pa a abaja con las concen aciones inales indicadas en los espec i os
ensayos.
No se ob u o señal u ilizando IK, b omobenceno ni b omoe anol. Sin
emba go, los espec os de os o escencia de la mezcla con e bio mues an
dos picos a 500 y 550 nm, los cuales son meno es en el caso de la emisión
del blanco y no se obse an en el espec o de luo escencia, como se
mues a en la igu a 49. Es as señales, en con a de lo espe ado, no ue on
desac i adas po el oxígeno p esen e en la disolución.
460 480 500 520 540 560 580 600
10
20
30
40
50
60
70
80
O(nm)
INT
AFB1+Tb+3
Blanco
460 480 500 520 540 560 580 600
10
20
30
40
50
60
70
80
O(nm)
INT
AFB1+Tb+3
Blanco
AFB1+Tb+3
Blanco
Figu a 49. Espec o de os o escencia de a la oxina B1 en disolución con
Tb+3 en e a una p epa ación blanco.
Resul ados y Discusión
266
En cie os complejos de me ales de ansición, sob e odo los de
lan ánidos y ac ínidos, los elec ones desapa eados es án en su mayo pa e
aislados del ligando. Se ha obse ado en la li e a u a que las emisiones
luminiscen es esul an es son linea es y apa ecen a longi udes de onda del
ojo pa a el Eu(III) y en el e de pa a complejos de Tb(III), las cuales se
pueden obse a en disolución. Exis e una g an con o e sia elacionada con
es e ipo de emisiones obse adas en complejos de lan ánidos. Si bien no
suele aplicá seles el é mino “ os o escencia” pa a de ini las, pues de o ma
gene al no se gene an desde es ados exci ados iple e, pa ece cla o que no
se a a de emisiones luo escen es, po sus la gos iempos de ida y
longi udes de onda de emisión. Po ello, se les suele denomina , de o ma
muy gené ica, emisiones “luminiscen es” (Fe nández y Schulman, 2001).
El hecho de que no se haya obse ado "quenching”, po acción del
oxígeno, de las señales ob enidas en el ensayo ealizado con Tb+3 como
á omo pesado, apoyan la hipó esis de que las emisiones “luminiscen es”
obse adas puedan e ec i amen e no es a se p oduciendo desde un es ado
exci ado iple e del complejo AFB1-Tb+3. Es e suceso puede se debido a la
di e en e es uc u a de ni eles a ómicos de los lan ánidos, compa ada con la
de o os á omos pesados pe enecien es al g upo de los elemen os de
ansición.
En la li e a u a exis en es udios sob e el uso de quela os de
lan ánidos pa a análisis de iones y biomoléculas. Los au o es habían
sin e izado compues os que con ienen un g upo cuma ínico como luo ó o o
que sensibiliza la emisión del lan ánido (C ossley y col., 1994; Heyduk y col.,
1997; Ka e inopoulos, 2000). Las a la oxinas poseen es e g upo cuma ínico
en su es uc u a, lo cual explica ía el esul ado ob enido, en el p esen e
abajo.
Vázquez y col., (1996) u liliza on el Tb+3 pa a desa olla un mé odo
de cuan i icación simul ánea de o as dos mico oxinas: ci inina y pa ulina. El
mé odo consis e en una ex acción p e ia de las mues as de di e en es ipos
Resul ados y Discusión
267
de quesos seguida de la sepa ación en columna c oma og á ica y la pos e io
la eacción pos columna con solución de Tb+3 en medio básico. Empleando
una uen e pulsada, los au o es log a on mejo a la especi icidad con
espec o a la de ección luo escen e.
El ipo y concen ación de la sal del á omo pesado es una a iable
expe imen al undamen al en la pues a a pun o de mé odos analí icos
basados en es a me odología.
En di e en es abajos publicados se es udia on di e sas sales de
á omos pesados pa a induci os o escencia en disolución en ausencia de
medios o ganizados. Exis en a ios halogenu os alcalinos apa e del KI
(NaCl, NaB , NaI, KCl, KB , RbCl y CsCl) y di e en es sales solubles que
con ienen á omos de ele ado núme o a ómico (KIO3, Ca(NO3)2, C (NO3)3,
RbNO3, InCl3, La(NO3)3, CeCl3, AgNO3, PB(NO3)2 y Tl(NO3). Todos es os
compues os pueden se p obados en un u u o con la inalidad de induci
os o escencia de las a la oxinas.
4.7.1.2. Fos o escencia en p esencia de ciclodex inas
(CD-RTP)
Siguiendo el p ocedimien o desc i o en el apa ado 3.2.12.2.2. ue on
p obadas di e en es combinaciones del anali o y los dos ipos de
ciclodex inas, así como di e en es condiciones ins umen ales. Las medidas
ue on compa adas con espec os ob enidos a pa i de disoluciones “blanco”
p epa adas de la misma mane a, con eniendo odos los eac i os excep o la
a la oxina B1.
Al no ob ene se señal analí ica ú il con el b omoe anol, (ENSAYO 3),
el yodu o de po asio ue añadido como uen e ex e na de á omo pesado
(ENSAYO 4) y ambién se u ilizó ciclohexano en p esencia de ȕ-CD
(ENSAYO 5), basándonos en el abajo de Wei Jin y col., (1994), quienes
Resul ados y Discusión
275
Al e na i amen e, ambién se ensayó b omoe anol como uen e ex e na de
á omo pesado.
Siguiendo el p ocedimien o desc i o en el apa ado 3.2.12.3.2., la
AFB1 y las sales (ENSAYO 11) y los o os adi i os (ENSAYO 12), ue on
añadidos sob e las esinas acondicionadas y se deja on ija sob e la
supe icie de las pa ículas du an e una noche. T as deja e apo a el
disol en e, el paso siguien e consis ió en empaque a las p epa aciones en la
celda de medida, lo cual inicialmen e se ealizaba a as ando las esinas
den o de la celda po succión con agua des ilada, con ayuda de una je inga y
una pun a de pipe a como embudo, como mues a la igu a 54. Pe o, al no
ob ene señal os o escen e ni luo escen e, se dedujo que es a mane a de
empaque a la celda de lujo p oducía la lixi iación del anali o, que iene
mayo a inidad po el agua que po los sopo es sólidos. Po es a azón, se
decidió empaque a la celda de lujo “en seco”, de la mane a desc i a en el
apa ado 3.2.12.3.2.1..
Figu a 54. Empaque ado de la celda de lujo po a as e con agua.
Resul ados y Discusión
268
encon a on que pequeñas adiciones de ciclohexano, en p esencia de E-
ciclodex inas, aumen an la igidez del medio median e la o mación de
mic oc is ales.
No se ob u o señal RTP de la a la oxina B1 median e el uso de es as
me odologías, p obablemen e debido a que no se cumplió o o equisi o pa a
ob ene emisión de RTP inducida po CD: que la ca idad hid o óbica de la CD
debe pe mi i una in e acción su icien e en e el anali o y el compues o que
posee el á omo pesado, pa a p oduci una población e ec i a de los es ados
iple es del anali o. Además de es o, luminó o o y á omo pesado necesi an
es a al mismo iempo, muy p óximos, den o de la ca idad de la CD (Muñoz
de la Peña y col., 2001).
4.7.1.3. Fos o escencia en medio micela (MS-RTP)
Se ealiza on p uebas basadas en el abajo de Li y col., (2003), pa a
induci RTP de la a la oxina B1 u ilizando desoxicola o de sodio como agen e
su ac an e (ENSAYO 6), añadido a la disolución en concen ación mayo a la
c.m.c. (> 4 mM) y o os adi i os de la mane a desc i a en el apa ado
3.2.12.2.3.. No se ob u o esul ado aplicando es a me odología de inducción
de os o escencia, quizás po que la iscosidad ob enida con el NaDC no ue
su icien e pa a induci la RTP de nues o anali o en pa icula . En el u u o se
pod ían p oba o os ensoac i os como el SDS pa a consegui induci la RTP
de la AFB1 en es e ipo de medios.
4.7.1.4. Fos o escencia en disolución de ciclodex ina con
desoxicola o de sodio
Se ealiza on p uebas de inducción de os o escencia a empe a u a
ambien e de la a la oxina B1 en una mezcla de CAVASOL® 0,3% (equi alen e
a 0,0023 M) y desoxicola o de sodio 0,6% (equi alen e a 0,015 M) (ENSAYO

Resul ados y Discusión
269
7). Es as concen aciones ue on ensayadas ya que son a las que se obse a
la os o escencia “in i o” en p esencia de es os compues os.
Al e na i amen e, ambién se p obó la inducción de os o escencia a
empe a u a ambien e de la a la oxina B1 con una combinación de los dos
medios o ganizados (micela y con CD) desc i os en los apa ados 4.7.1.2.y
4.7.1.3. (ENSAYO 8).
Con el in de e i a la a enuación de la os o escencia, en es os
ensayos se u ilizó el agen e desoxigenan e y po o a pa e se p obó la
adición de b omoe anol como uen e ex e na de á omo pesado, ya que el KI
p ecipi a en p esencia de desoxicola o de sodio (ENSAYO 9).
No se ob u o esul ado aplicando es as me odologías de inducción
de os o escencia de la a la oxina B1.
4.7.2. Ob ención de os o escencia a empe a u a ambien e en
sopo e sólido (SS-RTP)
4.7.2.1 Ensayos en papel il o (Ensayo 10)
Siguiendo el p ocedimien o desc i o en el apa ado 3.2.12.3.1., la
AFB1 ue inmo ilizada en papel de il o y se añadie on di e en es iones pa a
log a el e ec o ex e no de á omo pesado (I-, Cd+2, Al+3, Li+, Zn+2, Mg+2, Tl+,
Hg+2) así como b omoe anol, que ue on elegidos en unción de la li e a u a
consul ada. También se emplea on CAVASOL® y NaDC como adi i os pa a la
inducción de RTP.
Los esul ados más ele an es ob enidos aplicando es e
p ocedimien o de inducción de RTP son los siguien es:
Resul ados y Discusión
270
- No se ob u o señal os o escen e de la AFB1 en combinación
con disoluciones acuosas o e anólicas de I-, Tl+, Al+3 y Zn+2.
- No se ob u ie on esul ados po adición de ciclodex inas o
desoxicola o de sodio a las p epa aciones. A di e encia del
mé odo usado po Vo Dinh (1987), en el cual se ealizaba un
p e a amien o de las i as con CD an es de añadi el
eac i o. En nues os caso ag egado di ec amen e al sopo e
una mezcla de AFB1 con CD y NaDC. Es e debe ía se en
p incipio un p ocedimien o más adecuado, pues asegu amos
que el complejo de inclusión ya se ha o mado en la mezcla
inicial y no espe amos a que suceda sob e el papel de
il o.
El esul ado ob enido po inmo ilización de la a la oxina B1 en
p esencia de CD y NaDC en p incipio debía habe ep oducido la obse ación
mencionada en el apa ado 4.5.1., sin emba go no se ob u ie on espec os
de emisión os o escen e po es e p ocedimien o, p obablemen e debido a
que la concen ación de AFB1 u ilizada en el ensayo “in i o” ue mucho
meno de la que es aba p esen e en el p ecipi ado blanco.
En el caso de las disoluciones acuosas de los me ales: no se ob u o
señal os o escen e de la AFB1 inmo ilizada en combinación con disoluciones
de Li+ ni de Mg+2 ( igu a 50).
Resul ados y Discusión
271
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
λ(nm)
INT
Blanco
Li+yMg
+2.
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
λ(nm)
INT
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
λ(nm)
INT
Blanco
Li+yMg
+2.
Figu a 50. Los espec os de in ensidad in e io al blanco pe enecen a
p epa aciones de AFB1 con Li+ y Mg+2.
Se ob u ie on espec os de emisión a pa i de la p epa ación de
AFB1 en combinación con la disolución de Hg+2 ( igu a 51). Sin emba go,
como puede obse a se en dicha igu a, la in ensidad de emisión disminuía
ápidamen e con el iempo, lo cual pa ece indica que el complejo Hg+2-AFB1
es al amen e ines able.
Resul ados y Discusión
272
400 450 500 550 600 650 700
10
20
30
40
49
λ(nm)
INT
iempo=0 seg
iempo=2 min
iempo=60 seg
400 450 500 550 600 650 700
10
20
30
40
49
λ(nm)
INT
400 450 500 550 600 650 700
10
20
30
40
49
λ(nm)
INT
iempo=0 seg
iempo=2 min
iempo=60 seg
Figu a 51. Espec os de emisión de os o escencia de una misma
p epa ación de AFB1 inmo ilizada en papel il o con disolución acuosa de
me cu io. La señal disminuye ápidamen e en el iempo.
No obs an e, sí se ob u o señal os o escen e a pa i de la
combinación de AFB1 con una disolución de Cd+2 ( igu a 52).
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
29
λ(nm)
INT
AFB
1
+Cd
+2
Blanco
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
29
λ(nm)
INT
400 450 500 550 600 650 700
0
5
10
15
20
25
29
λ(nm)
INT
AFB
1
+Cd
+2
Blanco
Figu a 52. Compa ación de espec os de os o escencia de la AFB1 con
disolución acuosa de Cd+2 en e al blanco.
Resul ados y Discusión
279
Compa ando los espec os RTP en e disoluciones acuosas de Cd+2,
se obse ó la p esencia de dos picos a 500 y 555 nm en el espec o de
emisión de RTP de la p epa ación que con enía CD, los cuales no
apa ecie on en los espec os de las p epa aciones que ca ecían de ella
( igu a 59). Po o o lado, ambas señales se desac i an al inyec a ai e a
a és de la esina ( igu a 60).
400 440 480 520 560 600
5
10
15
20
25
30
λ(nm)
INT
AFB
1
+Cd
+2
+CD
AFB
1
+Cd
+2
400 440 480 520 560 600
5
10
15
20
25
30
λ(nm)
INT
400 440 480 520 560 600
5
10
15
20
25
30
λ(nm)
INT
AFB
1
+Cd
+2
+CD
AFB
1
+Cd
+2
Figu a 59. Compa ación en e espec os de RTP de AFB1 10-5M ijada sob e
gel de sílice con disoluciones acuosas de Cd+2 con y sin CAVASOL®.

Resul ados y Discusión
280
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
λ(nm)
INT
AFB1+Cd+2+CD
AFB1+Cd+2+CD+ O2
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
λ(nm)
INT
AFB1+Cd+2+CD
AFB1+Cd+2+CD+ O2
Figu a 60. Espec os de RTP de AFB1 10-5M ijada sob e gel de sílice
p epa ada con disolución acuosa de Cd+2 con CAVASOL®. Los dos picos
desapa ecen del espec o de os o escencia cuando se inyec a oxígeno.
Los esul ados ob enidos empleando aluminio como uen e ex e na
de á omo pesado se ilus an en la igu a 61. Como puede obse a se, se
ob u o señal os o escen e de la AFB1 ijada sob e gel de sílice con la
disolución e anólica de Al+3. Sin emba go, empleando además CAVASOL® no
se obse ó emisión os o escen e po pa e de la a la oxina.
Resul ados y Discusión
281
400 450 500 550 600 650 700
3
4
5
6
7
8
9
INT
λ(nm)
AFB1+Al+3+CD
AFB1+Al+3
Blanco
400 450 500 550 600 650 700
3
4
5
6
7
8
9
INT
λ(nm)
AFB1+Al+3+CD
AFB1+Al+3
Blanco
Figu a 61. Compa ación en e espec os de emisión de RTP de AFB1 10-5M
ijada sob e gel de sílice con disolución e anólica de Al+3. El espec o de la
p epa ación con CD iene una in ensidad p ác icamen e igual a la señal del
blanco.
Los esul ados ob enidos empleando zinc como uen e ex e na de
á omo pesado se ilus an en las igu as 62 y 63. Se ob u o una señal
os o escen e muy débil de la AFB1 ijada sob e gel de sílice con la disolución
acuosa de ace a o de zinc ( igu a 62). Lo mismo sucedió al emplea una
disolución e anólica de oxala o de zinc ( igu a 63). Sin emba go, en el
espec o de emisión de RTP de la p epa ación con disolución acuosa de
oxala o de zinc se obse ó nue amen e la p esencia de dos picos a 500 y
555 nm ( igu a 63).
Resul ados y Discusión
282
400 440 480 520 560 600 640 680
5
6
7
8
9
10
11
12
λ(nm)
INT
AFB
1
+(CH
3
COO)
2
Zn
Blanco
400 440 480 520 560 600 640 680
5
6
7
8
9
10
11
12
λ(nm)
INT
400 440 480 520 560 600 640 680
5
6
7
8
9
10
11
12
λ(nm)
INT
AFB
1
+(CH
3
COO)
2
Zn
Blanco
Figu a 62. Espec o de emisión os o escen e de AFB1 10-5M ijada sob e
gel de sílice p epa ada con disolución acuosa de ace a o de zinc, en e al
blanco.
Blanco
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn
en H
2
O
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
35
λ(nm)
INT
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn en e OH
Blanco
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn
en H
2
O
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
35
λ(nm)
INT
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn en e OH
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn
en H
2
O
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
35
λ(nm)
INT
460 480 500 520 540 560 580 600
5
10
15
20
25
30
35
λ(nm)
INT
AFB
1
+(C
4
0
2
)
2
Zn en e OH
Figu a 63. Compa ación en e espec os de emisión de RTP de AFB1 10-5M
ijada sob e gel de sílice con disoluciones e anólica y acuosa de (C402)2Zn,
en e al blanco.
Resul ados y Discusión
283
Los esul ados ob enidos po la adición de clo u o de e bio a las
p epa aciones de AFB1 ijada sob e gel de sílice es án ilus ados en la igu a
64. Los espec os de RTP p esen an dos picos a 490 y 555 nm. Al ob ene
espec os a pa i de dis in as concen aciones de AFB1 inmo ilizada, se
obse ó que la in ensidad de la emisión a ía en unción de la can idad de
anali o. De nue o, al inyec a oxígeno al sis ema no se obse ó un descenso
en la in ensidad de los dos picos de emisión luminiscen e.
450 500 550 600 650 700 750 800
50
100
150
200
250
300
350
400
λ(nm)
INT
450 500 550 600 650 700 750 800
50
100
150
200
250
300
350
400
λ(nm)
INT
Figu a 64. Espec os de emisión RTP de AFB1 10-4M y 10-6M ijada sob e
gel de sílice p epa ada con disolución acuosa de Tb+3.
Los esul ados ob enidos po la adición de b omoe anol a las
p epa aciones de AFB1 ijada sob e gel de sílice es án ilus ados en la igu as
65 y 66. Una ez que se ob u o señal os o escen e se p ocedió a op imiza
el iempo de demo a ( igu a 65), seleccionándose d=0,04ms como el
pa áme o óp imo. Pa alelamen e se es udió la adición de CD a las
p epa aciones ( igu a 66), encon ándose de nue o que dicha adición inhibe
la emisión os o escen e de la a la oxina. Pod íamos jus i ica es e hecho,
Resul ados y Discusión
284
suponiendo que la inclusión de la AFB1 den o de la CD impide que exis a la
p oximidad necesa ia en e ella y el b omoe anol pa a gene a el e ec o de
á omo pesado que a o ezca el c uce in e sis emas pa a da luga a una
emisión os o escen e.
400 450 500 550 600 650
8
10
12
14
16
18
20
22
λ(nm)
INT
d
=0,04 ms
d
=0,08 ms
d
=0,1 ms
d
=0,2 ms
400 450 500 550 600 650
8
10
12
14
16
18
20
22
λ(nm)
INT
400 450 500 550 600 650
8
10
12
14
16
18
20
22
λ(nm)
INT
d
=0,04 ms
d
=0,08 ms
d
=0,1 ms
d
=0,2 ms
Figu a 65. Compa ación de espec os de os o escencia de AFB1 10-5M con
b omoe anol inmo ilizada en gel de sílice a di e en es d: 0,04-0,08-0,1-0,2
ms, en in ensidad dec ecien e. El espec o más bajo se ob u o con la misma
mues a en un lujo de ai e.

Resul ados y Discusión
285
AFB
1
+b OH+CD
400 440 480 520 560 600 640
10
30
50
70
λ(nm)
INT
AFB
1
+b OH
Blanco
AFB
1
+b OH+CD
400 440 480 520 560 600 640
10
30
50
70
λ(nm)
INT
AFB
1
+b OH
Blanco
400 440 480 520 560 600 640
10
30
50
70
λ(nm)
INT
400 440 480 520 560 600 640
10
30
50
70
λ(nm)
INT
AFB
1
+b OH
Blanco
Figu a 66. Compa ación en e espec os de emisión RTP de AFB1 10-5M
ijada sob e gel de sílice con b omoe anol. Con y sin CAVASOL®, en e al
blanco.
ENSAYO 13: Con el in de ep oduci los esul ados ob enidos con la
solución es ánda de a la oxina B1, los cul i os de una cepa p oduc o a y o a
cepa no p oduc o a de a la oxinas en medio YSCD a 28ºC ue on incubados
du an e 3 días y ex aídos con clo o o mo e inmo ilizados sob e esinas
adso ben es de la mane a desc i a pa a los ensayos an e io es. Al mismo
iempo, se ob u ie on los espec os de emisión RTP de un pa ón de
a la oxina B1 y de una p epa ación blanco con el in de hace la compa ación.
Los esul ados ob enidos demues an que el ex ac o del cul i o de la cepa
a la oxigénica NRRL 2999 emi e os o escencia, al con a io que el ex ac o
del cul i o de la cepa no a la oxigénica NRRL 6538 ( igu a 67).
286
Figu a 67. Compa ación en e espec os de emisión RTP de a) solución pa ón de a la oxina B1 en e a una p epa ación blanco y
b) ex ac os clo o ó micos de cul i os de A. pa asi icus a la oxigénico NRRL 2999 y A. la us no a la oxigénico NRRL 6538 odos
inmo ilizados sob e esina DOWEX® ( d: 0,04 ms y G: 4 ms).
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
20
30
40
50
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
500 600
Wa eleng h (nm)
500 600
10
40
50
Wa eleng h (nm)
400
Blanco
AFB1
a)
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
20
30
40
50
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
500 600
Wa eleng h (nm)
500 600
10
40
50
Wa eleng h (nm)
400
Blanco
AFB1
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
20
30
40
50
Wa eleng h (nm)
In ensi y (a.u.)
500 600
Wa eleng h (nm)
500 600
10
40
50
Wa eleng h (nm)
400
Blanco
AFB1
a)
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
Cepa a la oxigénica
Cepa no a la oxigénica
b)
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
Cepa a la oxigénica
Cepa no a la oxigénica
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
450 500 550
5
10
15
450 500 550
λ(nm)
INT
Cepa a la oxigénica
Cepa no a la oxigénica
b)
Resul ados y Discusión
287
Con espec o a la co elación en e los espec os RTP ob enidos del
pa ón de AFB1 y el ex ac o del cul i o de la cepa a la oxigénica, cabe
des aca que es a úl ima p oduce las cua o a la oxinas B1, B2, G1 y G2 ( igu a
18b). Las emisiones RTP de las 4 a la oxinas es án muy ce canas en e si
p obablemen e debido a que poseen es uc u as molecula es análogas. Po
lo an o, el espec o esul an e de una mezcla de las cua o a la oxinas esul a
simila pe o no igual a aquel ob enido solamen e con la a la oxina B1.
4.7.2.3. Ensayos en sopo e Sol-Gel (Ensayo 14)
Se empleó la ecnología sol-gel con el p opósi o de induci RTP de la
a la oxina B1, pa a lo cual se p epa a on di e en es combinaciones con el in
de op imiza la composición de un xe ogel que o ecie a esul ados
sa is ac o ios ( abla 8). Se ensaya on 3 concen aciones dis in as de AFB1
(10-5M, 10-7M, 10-9M) en disolución acuosa con y sin CAVASOL® 0,01 M
inmo ilizada en 72 p epa ados di e en es de sopo e sólido sol-gel,
combinando e ame oxisilano y me il ime oxisilano como p ecu so es,
siguiendo el p ocedimien o desc i o en el apa ado 3.2.12.3.3.. Se u iliza on
iales ámba y los geles ue on almacenados pa a su e apo ación a
empe a u a ambien e, al ab igo de la luz debido a que el anali o es
e mosensible y ambién o osensible.
Los xe ogeles ob enidos ue on educidos a un amaño de pa ícula
adecuado po medio de molienda y pos e io men e ue on empaque ados en
la celda de lujo, como ilus a la igu a 7.
Pa a ealiza las medidas se conec ó la celda de lujo a una co ien e
de A con el in de desplaza el oxígeno y e i a la a enuación de la emisión
os o escen e (“quenching”). No se ob u o señal, debido p obablemen e a
que las concen aciones ensayadas ue on muy bajas (o al as –si es que se
p odujo au oabso ción-), a pesa de u iliza ciclodex ina, que ue mezclada
en un paso p e io con la AFB1, pa a asegu a la o mación del complejo de
inclusión.
Resul ados y Discusión
288
4.7.3. Desa ollo de un senso óp ico en un sis ema de inyección
de lujo FIA
Una ez ob enida la señal os o escen e po adso ción de la
a la oxina B1 sob e gel de sílice, se pasó a acopla un sis ema de análisis de
lujo a la celda pa a pode de ec a y, e en ualmen e, cuan i ica la a la oxina
B1 de o ma con inua en un sis ema dinámico que implica el es ablecimien o
de un lujo que anspo e la mues a y pe mi ie a ob ene un pe il señal- iempo.
Láza o y col., (1988) ealiza on análisis de alimen os po medio de un
sis ema HPLC acoplado a FIA con el cual se lle aba a cabo la de i a ización
pos columna de a la oxinas, pa a su pos e io de ección luo escen e. Peña y
col., (2002) diseña on un sis ema FIA, pa a ealiza la de i a ización de las
a la oxinas, el cual pe mi ía el sc eening de mues as de piensos que u ie an
un con enido de a la oxinas mayo al pe mi ido po ley, median e de ección
luo escen e.
En base a una publicación de Wei Jin y col. (2001), en el p esen e abajo
se diseñó un sis ema FIA, el cual cons ó de una celda de lujo empaque ada
con gel de sílice, a a és de la cual, con ayuda de una bomba pe is ál ica,
se hizo ci cula la disolución “ca ie ” que con enía Na2SO3 como agen e
desoxigenan e. Po medio de una ál ula se inyec ó al sis ema un olumen
de 2 ml de diluciones acuosas de a la oxina B1 (10–4Ma 10
–9 M) a las cuales
se añadió b omoe anol o KI como uen es ex e nas de á omo pesado y
ambién CAVASOL® con el p opósi o de aumen a la señal de RTP, además
de Na2SO3con le in de elimina odo el oxígeno p esen e.
Las mediciones de os o escencia de la a la oxina B1 con es a
me odología ue on in uc uosas, po es a azón se conec ó el sis ema FIA a
un de ec o de luo escencia con el in de moni o iza la emisión luo escen e
en el iempo donde se obse ó que exis ía una ápida lixi iación del anali o a
causa del lujo.
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