Contribución al desarrollo de métodos de diagnóstico de cepas aflatoxigénicas en alimentos y piensos

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y PIENSOS TERNURA ROSA ROJAS DURÁN 2005 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE VETERINARIA CAMPUS LUGO DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA ÁREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y PIENSOS Memoria que presenta: Ternura Rosa Rojas Durán Para optar al grado de Doctor. Lugo, Abril de 2005 DÑA. PILAR BERMEJO BARRERA, CATEDRÁTICA DE UNIVERSIDAD Y DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA INFORMA: que DÑA TERNURA ROSA ROJAS DURÁN ha realizado en este departamento, bajo la dirección del Dr.D. Alberto Cepeda Sáez, Dña. Cristina Fente Sampayo y D. Emiliano Quinto Fernández, el trabajo titulado: “CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y PIENSOS”, que presenta para optar al grado de Doctor. Y para que así conste donde proceda, firma la presente en Santiago de Compostela, Febrero de 2005. Fdo: Prof. Dr. Dña.Pilar Bermejo Barrera D. ALBERTO CEPEDA SÁEZ, CATEDRÁTICO DE UNIVERSIDAD, DÑA. CRISTINA FENTE SAMPAYO, PROFESORA TITULAR DE UNIVERSIDAD, AMBOS DEL DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA, NUTICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA Y D. EMILIANO QUINTO FERNÁNDEZ, TITULAR DE UNIVERSIDAD NUMERARIO DEL DEPARTAMENTO DE CIENCIA ANIMAL Y DE LOS ALIMENTOS, AREA DE NUTRICIÓN Y BROMATOLOGÍA DE LA UNIVERSIDAD AUTÓNOMA DE BARCELONA. AUTORIZAN a DÑA. TERNURA ROSA ROJAS DURÁN, a la presentación del trabajo titulado: “CONTRIBUCIÓN AL DESARROLLO DE MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS EN ALIMENTOS Y PIENSOS”, realizado bajo su dirección en la Facultad de Veterinaria de Lugo de la Universidad de Santiago de Compostela. Y para que así conste donde proceda, firman la presente en Lugo, Noviembre de 2004. Fdo: Prof. Dr. D. Alberto Cepeda Sáez Fdo: Prof. Dr. Dña. Cristina Fente Sampayo Fdo: Prof. Dr. D. Emiliano Quinto Fernández Fdo: Dña. Ternura Rosa Rojas Durán AGRADECIMIENTOS Quiero comenzar expresando mi gratitud a mis directores de tesis: al Dr. Alberto Cepeda Sáez, por haberme brindado la oportunidad de realizar la tesis doctoral en el grupo de investigación que dirige, al Dr. Emiliano Quinto Fernández por haberme tendido una mano y encauzar mi destino y a la Dra. Cristina Fente Sampayo por su labor de dirección. Al Dr. Carlos Franco por compartir sus conocimientos y la Dra. Beatriz Vázquez por su valiosa orientación en todo momento. Al Profesor Alfredo Sanz Medel por abrirme las puertas del Grupo de Espectrometría Analítica. Al Dr. Wei Jin y al Dr. José Manuel Costa por ampliar mis fronteras. A los compañeros del Laboratorio de Higiene Inspección y Control de los Alimentos: Fabiao, José Manuel y Alicia, con quienes compartí las vicisitudes de la investigación y también muchas risas, en especial a María y a Enka con quienes compartí amistad y trabajo. A l@s amig@s que encontré fuera del trabajo: Yolanda, Ana, Maite, Noemí, Juan Ramón, Oscar, Alberto, Diana, Marta, Cristina, Jorge, David, Roberto y Gema, por la empatía y los buenos momentos vividos. A Kenny y Dipu por cuidar tanto de mi, a su manera. A Bernardo y Miguel Angel, por esas llamadas en el momento preciso. A mi gente de Bolivia: a la Dra. Adela Panozo por iniciarme en la investigación, a Iván por sembrar en mi la inquietud de cruzar el charco, a Mauricio, Luis y Erika, amigos “a control remoto”, por transmitirme el mismo cariño durante estos años, a pesar de la distancia. A mi familia que está desperdigada por el mundo, a Jose Manuel, Karla y Monica que me acompañan con el corazón. A Maxi y a Susi por su apoyo incondicional y por brindarme el calor de una familia. Y finalmente, al Gobierno de España que mediante la AGENCIA ESPAÑOLA DE COOPERACIÓN INTERNACIONAL me ha otorgado la beca para realizar mis estudios de Doctorado. A Israel el mago que consigue imposibles A mi madre por impulsarme a luchar por mis sueños RESUMEN Los organismos del género Aspergillus pertenecen al grupo de los hongos filamentosos o mohos. Son cosmopolitas, se aíslan comúnmente de suelo, de vegetales y del interior de las viviendas y son contaminantes comunes en productos alimenticios. Los individuos de la especie Aspergillus flavus (muchas cepas de A. flavus Link ex Fries), Aspergillus parasiticus Speare (la mayoría de las cepas) y otra especie descrita recientemente, Aspergillus nomius, son los únicos que poseen la habilidad de producir aflatoxinas. Todos estos hongos han sido clasificados en la sección Flavi del género Aspergillus. Debido a su carácter ubicuista, los organismos de esta sección Flavi, no solo actúan como agentes deteriorantes de los productos que contaminan, sino que también, bajo condiciones propicias de sustrato, humedad y temperatura que se dan durante el almacenamiento, algunas cepas son capaces de producir aflatoxinas. Se ha demostrado que estas sustancias resultan hepatotóxicas, cancerígenas y mutagénicas por ingestión crónica Estos efectos han sido estudiados en mayor medida para la aflatoxina B1. Además del interés sanitario de las aflatoxinas, se debe considerar el interés económico que ocasiona la presencia de aflatoxinas en alimentos, las pérdidas económicas son difíciles de evaluar debido a que son muchos los factores a tener en cuenta al realizar la valoración. Con el fin de minimizar el impacto económico, se invierten grandes sumas de dinero en el desarrollo e implementación de métodos de prevención y control de la presencia de mohos y aflatoxinas en las materias primas y en los productos alimenticios. La metodología usada comúnmente para el screening de cepas aflatoxigénicas consiste en cultivar las cepas en un medio líquido o sólido y la posterior extracción y análisis de la presencia de aflatoxinas mediante técnicas cromatográficas. El agar de sacarosa y extracto de levadura (YES) y medios naturales de trigo, arroz o cacahuetes se utilizan para este propósito. Analizar grandes cantidades de muestras de la manera antes descrita resulta largo y tedioso. Por esta razón se han desarrollado numerosos métodos rápidos de screening para la determinación de la producción de aflatoxinas mediante observación de fluorescencia en los medios donde se cultivan cepas aisladas. Dichos métodos utilizan medios de cultivo que contienen aditivos para incrementar la producción de aflatoxinas y conseguir la determinación de un área fluorescente azul brillante o verde-azulada alrededor de las colonias durante su examen bajo luz ultravioleta. Los medios actualmente utilizados con este fin son: un medio complejo que contiene sacarosa, diferentes sales y cacahuetes libres de aflatoxinas, un medio Czapeck modificado que contiene licor de maíz, denominado medio APA, medios que contienen coco denominados agar de coco (CAM), medio de extracto de coco (CEA) y medio de crema de coco (CCA), el medio sintético líquido de Mateles y Adye y un medio que incluye gel de sílice y ácido tartárico. Las ciclodextrinas son moléculas formadas por acción de la enzima ciclodextrin-transglicolasa sobre los dextranos. La propiedad más característica de estos oligómeros es su notable capacidad de formar complejos de inclusión con una amplia variedad de moléculas en su cavidad interna. La fluorescencia natural de las aflatoxinas se deriva de su estructura pentaheterocíclica oxigenada. Resultados experimentales han revelado que la β-ciclodextrina y sus metil derivados poseen excelentes cavidades para exaltar la respuesta fluorescente de las aflatoxinas por medio de la formación de complejos de inclusión. En el presente trabajo el aumento en la respuesta fluorescente de las aflatoxinas por adición de ciclodextrinas a medios de cultivo fue estudiado utilizando cepas representativas de Aspergillus flavus productoras y no productoras de aflatoxinas. Se exponen los resultados obtenidos por la optimización de condiciones de incubación a tres temperaturas con tres diferentes ciclodextrinas adicionadas en dos diferentes concentraciones a la formulación de 12 medios de cultivo, de los cuales 9 son medios de cultivo utilizados comúnmente para recuento y aislamiento de mohos contaminantes de alimentos, un medio de cultivo es utilizado para la producción de micotoxinas y dos medios son utilizados en la guía de Raper y Fennell (1965) para la identificación y clasificación de hongos. También se optimizaron los mismos parámetros utilizando medios de cultivo base a los cuales se añadieron las tres ciclodextrinas en dos concentraciones, en combinación con desoxicolato de sodio y otras tres sales biliares adicionadas en diferentes concentraciones. Paralelamente, la eficacia de los métodos desarrollados fue comprobada por comparación con otras metodologías de screening utilizadas actualmente. Seguidamente se estudiaron las interferencias que pudieran ser producidas por microorganismos pertenecientes a 24 diferentes especies del género Aspergillus spp. que fueran cultivados en los medios de cultivo desarrollados. Se llevó a cabo un estudio de aplicación de un nuevo medio de cultivo adicionado con ciclodextrinas y desoxicolato de sodio para el recuento de mohos y levaduras y simultánea identificación de las cepas productoras de aflatoxinas mediante el análisis de la micoflora presente en distintos alimentos comercializados en España para consumo humano y animal. Las cepas aflatoxigénicas son capaces de emitir fosforescencia a temperatura ambiente (RTP) cuando son cultivadas en medios de cultivo que contienen ciclodextrinas y sales biliares. Con el fin de profundizar en el estudio de la fosforescencia “in vivo”, se realizaron ensayos de RTP “in vitro”, dirigidos a confirmar la relación entre la fosforescencia de cultivos fúngicos y la producción de aflatoxinas, además de explorar la posibilidad de desarrollar una metodología analítica para detección y cuantificación de aflatoxinas basada en RTP. 3.2.5.1. Método de vapores amoniacales ...................................102 3.2.5.2. Método cromatográfico...................................................102 3.2.6. Método para el muestreo y recuento de hongos y levaduras totales en productos alimenticios y piensos.........102 3.2.7. Método para el aislamiento de colonias fúngicas.................103 3.2.8. Métodos de identificación de colonias fúngicas...................103 3.2.9. Métodos para la identificación de cepas aflatoxigénicas en productos alimenticios y piensos..................................104 3.2.9.1. En medio de cultivo con ciclodextrina y desoxicolato de sodio (MACD).......................................104 3.2.9.2. A partir de los medios de cultivo MA y SAB...................104 3.2.10. Métodos de extracción y purificación de aflatoxinas .........105 3.2.10.1. Extracción y purificación de aflatoxinas de medios de cultivo ........................................................105 3.2.10.2. Extracción y purificación de aflatoxinas de especias, piensos y materias primas por diálisis difásica........................................................................105 3.2.10.3. Extracción de aflatoxina B1 para su determinación por el método ELISA...................................................107 3.2.11. Método cromatográfico RP-HPLC con detección fluorescente para confirmación de la producción de aflatoxinas..........................................................................108 3.2.12. Metodología para la obtención de fosforescencia a temperatura ambiente de aflatoxina B1 “in vitro”...............108 3.2.12.1. Instrumentación............................................................108 3.2.12.2. Métodos para obtención de RTP en disolución (F-RTP) ..........................................................................109 3.2.12.2.1. Fosforescencia inducida por átomo pesado (HAI-RTP) ...............................................109 3.2.12.2.2. Fosforescencia en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP) .........................................110 3.2.12.2.3. Fosforescencia en medio micelar (MS-RTP) .........111 3.2.12.2.4. Fosforescencia en disolución de ciclodextrina con desoxicolato de sodio ..................112 3.2.12.3. Métodos para obtención de fosforescencia a temperatura ambiente en soporte sólido (SSRTP) ..............................................................................113 3.2.12.3.1. Ensayos en papel de filtro ......................................113 3.2.12.3.2. Ensayos con resinas de intercambio iónico y gel de sílice..............................................................115 3.2.12.3.2.1. Empaquetado de la celda de flujo ...................116 3.2.12.3.3. Ensayos en soporte Sol-Gel...................................118 3.2.12.4. Desarrollo de un sensor óptico en un sistema de inyección de flujo FIA................................................121 3.2.13. Método y Software Estadísticos.........................................122 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN.............................................................124 4.1. ESTUDIO DE LA ADICIÓN DE CICLODEXTRINAS EN MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL RECUENTO DE HONGOS CONTAMINANTES DE ALIMENTOS Y PARA LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS...................................................................125 4.1.1. Efecto de la adición de ciclodextrinas a los medios de cultivo....................................................................................127 4.1.2. Efecto del tipo de ciclodextrina.............................................131 4.1.3. Efecto de la concentración de ciclodextrina.........................132 4.1.4. Efecto de la composición de los medios de cultivo..............134 4.1.5. Efecto de la temperatura de incubación...............................135 4.1.6. Efecto del tiempo de incubación ..........................................136 4.1.7. Correlación entre la fluorescencia y la producción de aflatoxinas.............................................................................137 4.2. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS EN MEDIOS AÑADIDOS CON CICLODEXTRINAS, DEBIDAS A LA PRODUCCIÓN DE DIVERSOS METABOLITOS POR CEPAS DEL GÉNERO ASPERGILLUS SPP., EN EL DIAGNÓSTICO DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS......................................................141 4.2.1. Efecto de la adición de ciclodextrinas ..................................142 4.2.2. Efecto de la concentración de ciclodextrinas.......................143 4.2.3. Efecto de la composición del medio.....................................144 4.2.4. Correlación entre la fluorescencia y la producción de aflatoxinas........................................................................148 4.3. ESTUDIO DE LA ADICIÓN DE CICLODEXTRINAS Y DESOXICOLATO DE SODIO EN MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA EL RECUENTO DE HONGOS CONTAMINANTES DE ALIMENTOS Y PARA LA IDENTIFICACIÓN RÁPIDA DE CEPAS AFLATOXIGÉNICAS...................................................................149 4.3.1. Efecto de la adición de desoxicolato de sodio al medio de cultivo con ciclodextrinas de concentración 0,3%......................................................................................150 4.3.2. Efecto de la adición de ciclodextrina....................................155 4.3.3. Efecto del tipo de ciclodextrina.............................................156 4.3.4. Efecto de la concentración de ciclodextrina.........................157 4.3.5. Efecto de la temperatura de incubación...............................159 4.3.6. Efecto del tiempo de incubación ..........................................161 4.3.7. Efecto de la composición de los medios de cultivo..............162 4.3.8. Efecto de la adición de otras sales biliares ..........................163 4.3.9. Correlación entre la formación del anillo beige en los medios MACD, SABCD, PDACD y YCSD y la producción de aflatoxinas.....................................................167 4.4. ESTUDIO DE INTERFERENCIAS EN EL DIAGNÓSTICO DE CEPAS FLATOXIGÉNICAS, DEBIDAS A LA PRODUCCIÓN DE DIVERSOS METABOLITOS POR CEPAS DEL GÉNERO ASPERGILLUS SPP. EN MEDIOS AÑADIDOS CON CICLODEXTRINAS Y DESOXICOLATO DE SODIO...................................................................................170 4.4.1. Efecto de la adición de ciclodextrinas ..................................170 4.4.2. Efecto de la composición del medio.....................................170 4.4.3. Efecto del uso de desoxicolato de sodio como aditivo de los medios añadidos con 0,3% ciclodextrina...........173 4.4.4. Correlación entre la fluorescencia y la producción de aflatoxinas........................................................................178 4.5. OBSERVACIÓN DE RTP EN MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS ...................................................................................179 4.5.1 Análisis del precipitado blanco..............................................180 4.6. EMPLEO DEL NUEVO MEDIO DE CULTIVO MACD: RECUENTO TOTAL DE MOHOS Y LEVADURAS ....................182 4.6.1. Preparación del medio de cultivo MACD..............................183 4.6.2. Recuento de mohos y levaduras en distintos alimentos comercializados en Galicia................................................184 4.6.2.1. Recuentos de mohos y levaduras en el medio MACD.............................................................................185 4.6.2.2. Comparación de los recuentos de mohos, levaduras y totales, obtenidos con el nuevo medio de cultivo y otros medios de cultivo utilizados tradicionalmente con este fin.....................................................................188 4.6.2.2.1. Comparación de los resultados obtenidos utilizando el nuevo medio MACD y el medio de cultivo agar Sabouraud dextrosa (SAB) .................188 4.6.2.2.2. Comparación de los resultados obtenidos con los medios de cultivo MACD y agar extracto de malta (MA) .........................................................192 4.6.2.2.3. Comparación de los resultados obtenidos entre los medios de cultivo usados habitualmente agar Sabouraud dextrosa (SAB) y el medio de cultivo extracto de malta (MA) ...........................................196 4.6.2.3. Análisis de los distintos géneros fúngicos aislados de las muestras de alimentos.................................................204 4.6.2.3.1. Géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos utilizando medio MACD...........................204 4.6.2.3.2. Géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos utilizando medio SAB..............................207 4.6.2.3.3. Géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos utilizando medio de cultivo MA................209 4.6.2.3.4. Comparativa entre los distintos medios de cultivo MACD, SAB y MA de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos y piensos.....................................................................211 4.6.2.3.5. Géneros fúngicos aislados según los distintos tipos de alimentos....................................................214 4.6.2.4. Capacidad aflatoxigénica de las cepas de Aspergillus flavus...........................................................................222 4.6.3. Recuento total de mohos y levaduras en muestras de alimentos concentrados y materias primas para alimentación animal .............................................................226 4.6.3.1. Recuento total de mohos y levaduras en muestras de alimentos concentrados para ganado vacuno ..............226 4.6.3.2. Recuento total de mohos y levaduras en muestras de materias primas para piensos de ganado vacuno ....230 4.6.3.3. Comparación entre los resultados obtenidos utilizando el nuevo medio MACDy el medio SAB..........235 4.6.3.3.1. Comparación de los recuentos en muestras de alimentos concentrados para ganado vacuno.........235 4.6.3.3.2. Comparación de los recuentos en muestras de materias primas .......................................................239 4.6.3.4. Análisis de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos concentrados .......................244 4.6.3.4.1. Géneros fúngicos aislados en el medio de cultivo MACD ...........................................................244 4.6.3.4.2. Géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos concentrados utilizando SAB ..................246 4.6.3.5. Comparativa entre los medios de cultivo SAB y MACD de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de alimentos concentrados .......................247 4.6.3.6. Análisis de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas....................................251 4.6.3.6.1. Géneros fúngicos aislados en el medio de cultivo MACD ...........................................................251 4.6.3.6.2. Géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas utilizando SAB...............................253 4.6.3.6.3. Comparativa entre los medios de cultivo SAB y MACD de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas...............255 4.6.3.7. Perfil aflatoxigénico de las muestras analizadas ...........258 4.6.3.7.1. Puesta a punto de los métodos analíticos utilizados para la determinación de la presencia de micotoxinas.........................................................260 4.6.3.7.2. Presencia de aflatoxinas y mohos aflatoxigénicos..260 4.6.3.7.2.1. En muestras de piensos ....................................261 4.6.3.7.2.2. En muestras de materias primas.......................264 4.7. OBTENCIÓN DE RTP DE AFLATOXINA B1 “in vitro” .................264 4.7.1. Obtención de RTP en disolución (F-RTP) ...........................264 4.7.1.1. Fosforescencia inducida por átomo pesado (HAI-RTP) ......................................................................267 4.7.1.2. Fosforescencia en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP) ......................................................................268 4.7.1.3. Fosforescencia en medio micelar (MS-RTP) ................268 4.7.1.4. Fosforescencia en disolución de ciclodextrina con desoxicolato de sodio..............................................268 4.7.2. Obtención de fosforescencia a temperatura ambiente en soporte sólido (SS-RTP) ..............................................269 4.7.2.1 Ensayos en papel filtro (Ensayo 10) ..............................269 4.7.2.2. Ensayos con resinas de intercambio iónico y gel de sílice ..........................................................................274 4.7.2.3. Ensayos en soporte Sol-Gel (Ensayo 14) .....................287 4.7.3. Desarrollo de un sensor óptico en un sistema de inyección de flujo FIA............................................................288 5. CONCLUSIONES.................................................................................291 6. BIBLIOGRAFÍA ....................................................................................293 APÉNDICE II. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Estructuras del género Aspergillus spp. ......................................5 Figura 2. Esquema de la síntesis de la aflatoxina B1 ................................15 Figura 3. Estructura de las principales aflatoxinas.....................................17 Figura 4. Diagrama de Jablonskii. .............................................................50 Figura 5. Estructura de las ciclodextrinas ..................................................55 Figura 6. Esquema del procedimiento seguido para llevar a cabo la extracción por diálisis difásica .................................................106 Figura 7. Empaquetado “en seco” de la celda de flujo ............................117 Figura 8. Diagrama de un sistema FIA diseñado para la detección RTP continua de AFB1.............................................................122 Figura 9. Examen bajo luz UV de: a) colonia aflatoxigénica de A. parasiticus NRRL 2999 y b) colonia no aflatoxigénica de A. flavus NRRL 6538 observadas al tercer día de incubación a 28°C en el medio PDA adicionado con 0,3% CAVASOL® (PDACYD)..................................................128 Figura 10. a) Observación de la pigmentación amarilla al reverso de la colonia aflatoxigénica de A. parasiticus NRRL 2999. b) Pigmentación ausente al reverso de la colonia no aflatoxigénica de A. flavus NRRL 6538. Ambas cepas fueron cultivadas durante 5 días en el medio PDACYD a 28°C .........................................................................................128 Figura 11. a) Cromatograma típico de una mezcla patrón de aflatoxinas inyectada al sistema desarrollado por Cepeda y col. (1996). b) Cromatograma del extracto clorofórmico de un cultivo de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 en el medio PDA suplementado con 0,3% de CAVASOL®, cultivada a 28ºC durante10 días. c) Cromatograma del extracto clorofórmico de un cultivo de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 en el medio TSA suplementado con 0,3% de CAVASOL® en las mismas condiciones. ................................138 Figura 12. Observación del viraje a color rosa por exposición a vapores de NH3 del reverso de a) la colonia aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 y b) viraje de color ausente al reverso de la colonia no aflatoxigénica de A. flavus NRRL 6538, ambas cepas fueron cultivadas a 28°C en el medio PDACYD durante 5 días. .........................139 Figura 13. Observación de colonias de Aspergillus bajo luz UV: a) la imagen brillante corresponde a la fluorescencia de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 bajo luz UV, al quinto día de incubación a 28ºC, comparada con b) un cultivo de la cepa de A. ochraceus NRRL 2917, la cual no exhibe fluorescencia. Ambas cepas fueron cultivadas durante 5 días en agar extracto de malta MA suplementado con 2% CAVASOL®..........................................143 Figura 14. Fluorescencia de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 (al centro de la placa Petri) al tercer día de incubación. Las colonias de A. níger, E. herbariorum, A. terreus, A. sclerotiorum, A. chraceous, A. clavatus y A. oryzae (en sentido de las manecillas del reloj) no exhiben fluorescencia. Las cepas fueron cultivadas a 28ºC en medio SAB suplementado con CAVASOL® 0,3%. ........................................................................................145 Figura 15. a) Observación directa de un anillo beige alrededor de la colonia aflatoxigénica de A. parasiticus NRRL 2999, el cual no es observable alrededor de las colonias no aflatoxigénicas de la cepa A. flavus NRRL 6538 al tercer día de incubación a 28ºC en medio Sabouraud-dextrosa suplementado con 0.3% CAVASOL® y 0.6% NaDC. b) Observación de la mismaplaca bajo luz UV: el anillo muestra fluorescencia que no se observa alrededor de las colonias no productoras de aflatoxinas..............................154 Figura 16. a) Observación directa de cultivos de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 (derecha) y de la cepano aflatoxigénica A. flavus NRRL 6835 (izquierda) cultivadas en medio MACD al quinto día de incubación a 28ºC. b) Observación de las mismas placas después de excitar a 365 nm con una lámpara UV. La RTP emitida por la cepa aflatoxigénica (que no emite la cepa no aflatoxigénica) fue captada durante 2,5 segundos de exposición con una cámara fotográfica digital. ......................................................................................155 Figura 17. Observación de la pigmentación amarilla al reverso de la coloniaaflatoxigénica de A. parasiticus NRRL 2999 ausente al reverso de las colonias de la cepa no aflatoxigénica A. flavus NRRL 6538, cultivadas en el medio MACD al quinto día de incubación a 28°C....................156 Figura 18. Observación directa de las placas de cultivo de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 al tercer día de incubación a 28ºC en medio de cultivo SAB, suplementado con CAVASOL® y a) 0,6% ácido cólico o b) 0,6% NaDC. ........................................................................165 Figura 19. a) Cromatograma típico de una solución de mezcla patrón de aflatoxinas inyectada al sistema desarrollado por Cepeda y col., (1996). b) Cromatograma del extracto clorofórmico de un cultivo de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 en el medio YSCD durante10 días a 28ºC. .............................................................................168 Figura 20. a) Observación directa de un anillo beige alrededor de la colonia aflatoxigénica de A. parasiticus NRRL 2999, la cual no es observable alrededor de las colonias no aflatoxigénicas de A. ochraceus NRRL 5220 al tercer día Tabla 13. Respuesta fluorescente y presencia del halo beige alrededor de las colonias de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 después de 5 días de incubación a 28 ºC en los 12 medios de cultivo suplementados con 0.3% CD y 0.6%NaDC, y su correlación con el método cromatográfico. ........................................................................153 Tabla 14. Comparación del efecto de la concentración y del tipo de CD, al quinto día de incubación a 28ºC de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 en diez medios de cultivo suplementados con 3 ciclodextrinas en 2 concentraciones y 0,6% NaDC................................................158 Tabla 15. Comparación del diámetro en centímetros de anillo beige alrededor de las colonias de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 cultivada en los medios MACD y YSCD a las tres temperaturas de incubación. .........160 Tabla 16. Evolución de la RTP “in vivo” de 5 epas aflatoxigénicas y 1 cepa no aflatoxigénica del grupo Aspergillus flavus cultivadas en medio YSCD a 28ºC..........................................162 Tabla 17. Fluorescencia, emisión RTP y presencia del anillo beige alrededor de las colonias de la cepa aflatoxigénica A. parasiticus NRRL 2999 al tercer día de incubación a 28ºC en medios de cultivo suplementados con CAVASOL® y NaDC o las tres sales biliares alternativas ensayadas................................................................................166 Tabla 18. pH y actividad de agua de los 4 medios de cultivo suplementados con 0,3% CAVSOL® y 0,6% desoxicolato de sodio y el medio para mohos xerófilos. .........172 Tabla 19. Presencia del halo beige, respuesta fluorescente y emisión RTP y al quinto día de incubación a 28ºC de 5 cepas aflatoxigénicas y 4 cepas no aflatoxigénicas del grupo Aspergillus sección Flavi, 6 cepas de Aspergillus niger group y de otras 17 cepas de Aspergillus spp. cultivadas en los 4 medios decultivo adicionados con 0,3% CAVASOL® y 0,6% NaDC y su correlación con el método cromatográfico. ...........................................................176 Tabla 20. Recuentos de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ............................................186 Tabla 21. Recuentos de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ............................................190 Tabla 22. Recuentos mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ..................................................................190 Tabla 23. Recuentos totales (log ufc/g) de mohos y levaduras, en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB al quinto día de incubación a 28ºC. .............................190 Tabla 24. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................193 Tabla 25. Recuento de mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................194 Tabla 26. Recuentos totales (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ..................................................................194 Tabla 27. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos étnicos, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................197 Tabla 28. Recuento de mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos étnicos, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................198 niger group y de otras 17 cepas de Aspergillus spp. cultivadas en los 4 medios decultivo adicionados con 0,3% CAVASOL® y 0,6% NaDC y su correlación con el método cromatográfico. ...........................................................176 Tabla 20. Recuentos de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ............................................186 Tabla 21. Recuentos de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ............................................190 Tabla 22. Recuentos mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. ..................................................................190 Tabla 23. Recuentos totales (log ufc/g) de mohos y levaduras, en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y SAB al quinto día de incubación a 28ºC. .............................190 Tabla 24. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................193 Tabla 25. Recuento de mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................194 Tabla 26. Recuentos totales (log ufc/g), en muestras de alimentos, en los medios de cultivo MACD y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ..................................................................194 Tabla 27. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos étnicos, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................197 Tabla 28. Recuento de mohos (log ufc/g), en muestras de alimentos étnicos, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC..............................................198 Tabla 39. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de especias, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. .......................................................202 Tabla 40. Recuento de mohos (log ufc/g), en muestras de especias, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. .......................................................202 Tabla 41. Recuentos totales (log ufc/g), en muestras de especias, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ..................................................................202 Tabla 42. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos variados, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ........................................203 Tabla 43. Recuento de levaduras (log ufc/g), en muestras de alimentos variados, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ........................................203 Tabla 44. Recuentos totales (log ufc/g) de mohos y levaduras, en muestras de alimentos variados, en los medios de cultivo SAB y MA, al quinto día de incubación a 28ºC. ..........203 Tabla 45. Frecuencia de la presencia (%) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de alimentos cultivadas en el medio MACD. .................................................................206 Tabla 46. Frecuencia de la presencia (tanto por 100) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de alimentos cultivadas en el medio SAB. ...................................208 Tabla 47. Frecuencia de la presencia (tanto por 100) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de alimentos cultivadas en el medio MA. .....................................210 Tabla 48. Frecuencia de aparición de los géneros en los tres medios de cultivo. ...................................................................212 Tabla 49. Tanto por cien alcanzado por cada género en los tres medios, en el total de los alimentos. .......................................212 Tabla 50. Géneros fúngicos encontrados en alimentos étnicos en los tres medios empleados. ....................................................216 Tabla 51. Géneros fúngicos encontrados en frutos secos en los tres medios empleados. ..........................................................217 Tabla 52. Géneros fúngicos encontrados en frutos desecados en los tres medios empleados. ....................................................218 Tabla 53. Géneros fúngicos encontrados en especias en los tres medios empleados. .................................................................219 Tabla 54. Géneros fúngicos encontrados en muestras de té en cada uno de los tres medios empleados. ...............................220 Tabla 55. Géneros fúngicos encontrados en alimentos variados en los tres medios empleados. ....................................................221 Tabla 56. Capacidad aflatoxigénica de las cepas de Aspergillus flavus aislados de los 3 medios de cultivo. .............................223 Tabla 57. Porcentajes de cepas aflatoxigénicas presentes en los alimentos en los medios de cultivo empleados. .....................224 APÉNDICE IV. SÍMBOLOS Y ABREVIATURAS EMPLEADOS EN EL TEXTO %: Tanto por ciento λem: Longitud de onda de emisión λex: Longitud de onda de excitación ACN: Acetonitrilo AF: Aflatoxina Afs: Aflatoxinas AFB1: Aflatoxina B1 AFB2: Aflatoxina B2 AFG1: Aflatoxina G1 AFG2: Aflatoxina G2 AOAC: American Organization of Analytical Chemists APA: Agar para la producción de aflatoxinas aw: Actividad de agua c.m.c.: Concentración micelar crítica c.m.c: Concentración micelar crítica CAM: Agar de coco CAVASOL®: Nombre comercial del derivado metilado de la β-ciclodextrina (βW7M1.8-cyd) CD: Ciclodextrina CDs: Ciclodextrinas CD-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente en presencia de ciclodextrinas cm: Centímetro CYP: Citocromo P450 CZA: Agar Czapek CH: Cáncer hepático DCPA: Agar dicloran cloranfenicol peptona DG18: Agar dicloran glicerol al 18% DNA: ácido desoxiribonucleico DRBC: Agar dicloran rosa de bengala cloranfenicol ELISA: Enzime linked immunosorbent assay F: Fluorescencia FIA: Análisis por inyección de flujo g: Gramo HAI-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente inducida por átomo pesado HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución HPTLC: Cromatografía en capa fina de alta resolución IARC: International Agency for Research of Cancer IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry Kg: Kilogramo l: Litro LC/MS: Cromatografía líquida/espectrometría de masas LD: Límite de detección LD50: Dosis letal media LHICA: Laboratorio de higiene, inspección y control de alimentos log: Logaritmo M: Molar mM: mili molar MA: Agar extracto de malta MACD: Agar malta suplementado con CD y desoxicolato de sodio Max: Valor máximo de una lista de valores Med: Media aritmética de una lista de valores Min: Valor mínimo de una lista de valores ml: Mililitro mm: Milímetro MS/MS: Espectrometría de masas en tándem MS: Espectrofotometría de masas ms: Milisegundo MS-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente en medio micelar MTMOS: Metiltrimetoxisilano MY40G: Agar extracto de malta y glucosa al 40% MYSA: Agar malta, levadura y sacarosa N: Normal n: Número de muestras NaDC: Desoxicolato de sodio nm: Nanómetro NP-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución en fase normal NP-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente en medio no protegido NRRL: Northern Regional Research Laboratory ns: Nanosegundo ºC: Grado centígrado OGY: Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura OMS: Organización mundial de la salud PAH: Hidrocarburos aromáticos policíclicos PBPB: Bromuro perbromuro de piridinio PDA: Agar patata dextrosa PDACD: Agar patata dextrosa suplementado con CD y desoxicolato de sodio pH: Logaritmo de la concentración de hidrogeniones ppb: Partes por billón (µg/kg oµg/l) ppm: Partes por millón (mg/kg) RNA: Acido ribonucleico RP-HPLC: Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa RSD: Desviación estándar relativa RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente SAB: Agar Sabouraud dextrosa SABCD: Agar Sabouraud dextrosa suplementado con CD y desoxicolato de sodio SD: Desviación estándar SDS: Dodecilsulfato sódico SIDA: Síndrome de inmunodeficiencia adquirido SPE: Extracción en fase sólida spp.: Especie S-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente sensibilizada SS-RTP: Fosforescencia a temperatura ambiente sobre soportes sólidos td : Tiempo de demora TFA: Acido trifluoroacético tg : Ventana temporal de media THF: Tetrahidrofurano TLC: Cromatografía en capa fina TMOS: Tetrametoxisilano TSA: Agar triptona soja con polisorbato 80 y lecitina ufc/g: Unidades formadoras de colonias por gramo UV: Ultravioleta WHO: World Health Oganization YCYD: Agar extracto de levadura-sacarosa suplementado con CD YES: Agar extracto de levadurasacarosa YGC: Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol YSCD: Agar extracto de levadura-sacarosa suplementado con CD y desoxicolato de sodio µg: Microgramo µl: Microlitro µm: Micrometro 1. INTRODUCCIÓN Introducción 8 fúngica de sistemas de extracción de aire, donde se observó una alta efectividad de la luz UV para reducir la cantidad de esporas contaminantes en el aire (Levetin y col., 2001). 1.1.4. Significado de la contaminación fúngica de los alimentos El significado de la contaminación fúngica de los alimentos deriva no sólo del potencial de los hongos para deteriorarlos, sino también del potencial de muchos de ellos para producir una gran variedad de micotoxinas a las que el hombre presenta susceptibilidad. Además, la mayoría de los hongos son capaces de provocar infecciones y reacciones alérgicas en personas hipersensibles a los antígenos fúngicos. Hoy en día, la presencia/ausencia de hongos en los alimentos se considera como un índice de las condiciones higiénicas de la materia prima y de las condiciones de manipulación durante la elaboración de productos alimenticios. La contaminación fúngica de los alimentos puede considerarse desde un doble aspecto (Berenguer, 2000): 1. Actuación sobre los alimentos (bioconversión): -Defectos de aspecto. El crecimiento de los hongos sobre los alimentos produce olores indeseables, cambios en la textura por proteolisis y manchas coloreadas tanto en superficie como en el interior, lo que conlleva a una mala presencia que se traduce en la pérdida de categoría e incluso en el rechazo total del producto. -Modificaciones químicas -Reducción del valor nutricional -Cambios de carácter organoléptico -Dificultades de conservación Introducción 9 2. Actuación sobre el hombre y los animales: -Patógena (micosis): el hongo penetra en el tejido y se desarrolla en el interior, suele afectar a mucosas y piel, pero en individuos imnumocomprometidos, puede llegar a atravesar la barrera hematoencefálica, e invadir el tejido nervioso. -Inmunológica (alergias): producidas por la contaminación ambiental y también por micotoxinas y hongos presentes en los alimentos -Tóxica (micotoxicosis): el hongo crece sobre el alimento y elabora las toxinas que producen la intoxicación. Según la toxina que las producen se denominan: aflatoxicosis, islandicosis, fusariosis, clavatoxicosis. 1.1.5. Presencia natural de hongos y micotoxinas en alimentos Los hongos son contaminantes comunes en productos alimenticios, dada su capacidad ubicuista y su gran resistencia, además la mayoría de los alimentos constituyen excelentes medios para la sustentación y reproducción de gran número de especies fúngicas. La invasión fúngica de alimentos puede ocurrir en cualquier etapa de la cadena de producción alimenticia: de la siembra a la cosecha, durante el transporte y almacenamiento (Frisvad y Samson, 1992), durante la preparación de los mismos en restaurantes y hogares e incluso en el momento de ser consumidos. El crecimiento de un determinado tipo de hongo en un alimento depende de varios factores, como son: pH, humedad, temperatura, características del sustrato (elementos nutritivos, estructuras biológicas), condiciones de procesado y almacenamiento, etc. Así, se encuentra que sobre un mismo sustrato aparecen géneros de hongos diferentes a lo largo de su vida (Northolt y Van Egmond, 1982). Introducción 10 Los hongos productores de micotoxinas son abundantes en la naturaleza y las condiciones favorables para que estos microorganismos las sinteticen, pueden ser conseguidas fácilmente, por esta razón, se ha llegado a la conclusión de que muy pocas sustancias comestibles pueden ser consideradas seguras de no sufrir contaminación por micotoxinas. El problema de la contaminación fúngica más que la presencia del propio hongo, lo constituye la aparición de micotoxinas y la mayoría de las especies que las producen no presentan dificultades para desarrollarse en hojas, tallos, cereales, semillas, carne, grasas, productos lácteos, etc. (Betina, 1984; Jarvis y Williams, 1987; Bartine y Tantaoui-Elaraki, 1997; Eltem, 1996). La existencia de hongos en un alimento no indica necesariamente una contaminación con micotoxinas pero si es un factor de riesgo importante para que éstas se produzcan. Del mismo modo, puede detectarse una micotoxina sin la presencia del hongo productor, ya que este pudo haber sido inactivado por diversos tratamientos (pasterización, esterilización, etc.), procesos químicos o alteración de factores ambientales, mientras que las micotoxinas permanecen en el sustrato. 1.1.5.1. Presencia natural de Aspergillus y aflatoxinas en alimentos El género Aspergillus flavus es uno de los más comúnmente encontrados como contaminante de numerosos productos alimenticios para consumo humano y animal. Su presencia ha sido informada en análisis microbiológicos de una amplia variedad de productos como por ejemplo: nueces y semillas oleaginosas de Tailandia, especias y hierbas, productos étnicos de la India y de Turquía, arroz, integral y pelado, entero y molido, de granos pequeños, lenteja, de semillas de amaranto, sorgo, de semillas para ensilaje, de harina Introducción 11 de trigo, maíz en grano, harina de maíz y sus derivados, de leche en polvo, entera y desnatada, de productos lácteos, de pasas de dátil, de ciruela y de uva, de las canales de carne de vaca, de corchos naturales, de semillas de calabaza, de piensos para mascotas, de avellanas, de productos de cacahuete y de coco. Debido a su carácter ubicuista, los organismos de la especie A. flavus no solo actúan como agentes deteriorantes de los productos que contaminan, sino que también, bajo condiciones propicias de sustrato, humedad y temperatura que se dan durante el almacenamiento, algunas cepas son capaces de producir aflatoxinas; se ha demostrado que estas sustancias resultan hepatotóxicas, cancerígenas y mutagénicas por ingestión crónica (Wild y Turner, 2002). La tabla 1 muestra una serie de alimentos en los que las aflatoxinas han sido encontradas naturalmente. Introducción 12 Tabla 1. Presencia natural de aflatoxinas en diversos alimentos. Alimento Referencias Aceite de oliva Alimentos thailandeses (oleaginosas,habas,nueces) Daradimos y col., 2000 Pitt, Hocking, y col ,1994 Almendras Schade y col.,1981; Tutelyan, 1989; Ahmed y Robinson, 1998; Schatzki y Ong, 2000 Arroz y derivados Manabe y col., 1978; Soares y col., 1989; Midio y col., 2001 Cacahuetes y derivados Francis y col., 1982; Dorner y Cole, 1988; Tutelyan, 1989 Patey y Sharman, 1990; Azer y Cooper, 1991; Roch y col., 1992; Wood, 1992; Niedwetzki y Lach, 1994; Taguchi y col. 1995; Shatzki, 1998; Ali y col., 1999; Neal y col., 2001 Carne Ismail y Zaky, 1999 Cebada Tutelyan y col., 1989 Cerveza Scott y Lawrence, 1997 Nakajima y col., 1999 Derivados de soja Kim y col., 2001 Especias y hierbas Awe y Schranz, 1981; Garner y col., 1993; El-Kady y col., 1995; Reif y Metzger, 1995; Fufa y Urga, 1996; MacDonald y Castle, 1996; Martins y col., 2001 Harina de trigo Cutuli de Simón y col., 1983; Tutelyan, 1989; Abouzied y col., 1991; Midio y col., 2001 Higos Sharman y col., 1991 Huevos Stoloff y Truckses, 1978; Micco y col., 1987 Judías Lentejas sudanesas Wei y col. 1980; Tutelyan, 1989; Tseng y col., 1995; Midio y col., 2001 El-Nagerabi y Elshafie, 2000 Maíz y derivados Cohen y Lapointe, 1981; Howell y Taylor, 1981; Hutchins y Hagler, 1983; Heathcote, 1984; Francis y Col., 1988; Shah y Hamid, 1989; Tutelyan y col., 1989; Wilson y Romer, 1991; Baldissera y col., 1992; Joshua, 1993; Torres Espinosa y col., 1995; Resnik y col., 1996; Yoshizawa y col., 1996; Scudamore y col., 1997; Ali y col., 1998; Gloria y col., 1998; Otta y col., 1998; Ali y col., 1999; Furlong y col., 1999; Janardhana y col., 1999; Kpodo y col., 2000; Midio y col., 2001 Nueces y derivados Shah y Hamid, 1989; Azer y Cooper, 1991; Wood, 1992; Trucksess y col.,1994; Furiani y col., 1996; Ramesh y col., 1996; Ahmed y col., 1998 Piensos y/o materias primas Abdelhamid, 1990; Banerjee y Shetty, 1992; Valdman y col., 1992; Wood, 1992; Price y col., 1993; El-Maraghy y col., 1996; Phillips y col., 1996; Dalcero y col., 1997; Scudamore y col., 1998; Scudamore y Patel, 2000 Pistachos Niedwetzki y Lach, 1994; Mahoney y Rodriguez, 1996; Ahmed y Robinson, 1998; Schatzki, 1998; Candlish y col., 2001 Sorgo Da Silva y col., 2000 Introducción 13 1.1.6. Micotoxinas: Concepto y origen El término micotoxina proviene de las palabras griegas "mykes" que significa hongo y "toxicum" que significa veneno (Goldblat, 1972) y designa ciertos metabolitos secundarios tóxicos producidos por hongos que pueden producir acciones adversas en los organismos vivos, especialmente en animales y humanos. El metabolismo secundario de los hongos comprende esencialmente procesos de síntesis cuyos productos no desempeñan un papel demasiado evidente en la función del microorganismo. Comparativamente a otros organismos, este metabolismo secundario está increíblemente desarrollado entre los hongos microscópicos, dando lugar a una enorme diversidad de moléculas (micotoxinas, antibióticos, giberelinas y alcaloides). Dichos metabolitos, con características muy particulares, se agrupan por su similitud química, ya que en general se derivan de una misma red metabólica o por la naturaleza de su actividad, y se producen o no, dependiendo en gran medida de las condiciones del entorno en que se encuentre en ese momento el organismo. Bérdy (1974) propuso una clasificación química de los antibióticos en la que se incluía a las micotoxinas, entre otras razones, porque son también metabolitos secundarios y presentan actividad antibiótica. La mayor parte de estos metabolitos secundarios se originan en la ruta policetónica. Así, a partir de una cadena general policetónica (del tipo RCO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-SCoA), se derivan la mayoría de las micotoxinas con inclusiones finales de antraquinonas, compuestos heterocíclicos y lactonas macrocíclicas (Turner, 1976). Los enzimas implicados en el metabolismo secundario, al contrario de los del primario, son muy poco específicos, lo que permite una mayor “plasticidad” en lo que se refiere a la regulación de estas rutas. La activación metabólica de las micotoxinas depende en algunos casos de una actividad enzimática que los transforme en derivados activos, como por ejemplo la aflatoxina B1 (Swenson, 1977; Essigmann, 1977; Garner y Martin, 1979) y la ocratoxina A (Hennig y Introducción 14 col., 1991; Zepnik y col., 2001), pero hay otros ejemplos como la PR-toxina, patulina, citrinina, tricotecenos y zearalenona que son toxinas directamente activas (Moulé, 1981). Las micotoxinas afectan a órganos concretos, tienen un alto efecto específico en un órgano dado, la mayoría provocan lesiones graves en un sólo tejido y efectos secundarios en otros. El hígado normalmente es el órgano barrera y diana de las micotoxinas, debido a que el paso siguiente después de la digestión, consiste en el transporte por medio de la circulación enterohepática, de todos los componentes ingeridos, para su metabolización y detoxificación en el hígado. Es difícil establecer la etiología y las enfermedades crónicas de una ingestión prolongada de alimentos con ciertos niveles de micotoxinas, ya que los riesgos para la salud humana están sujetos a varios factores: • Tipo de micotoxina, biodisponibilidad, toxicidad y concentración de la misma en el alimento. • Sinergismos entre las micotoxinas presentes. • Cantidad del alimento consumido y continuidad o intermitencia en la ingestión. • Peso del individuo, estado fisiológico y edad del mismo. Introducción 15 1.1.7. Aflatoxinas Los individuos de las especies Aspergillus flavus (muchas cepas de A. flavus Link ex Fries), Aspergillus parasiticus Speare (la mayoría de las cepas) y otra especie descrita recientemente Aspergillus nomius (Kurtzman y col., 1987; Bennet, 1988; Egel, 1994), pero esta última es mucho menos corriente, son los únicos que poseen la habilidad de producir aflatoxinas (AF). Todos estos hongos han sido clasificados en la sección Flavi del género Aspergillus. Figura 2. Esquema de la síntesis de la aflatoxina B1 ( Trail y col., 1995 Yu y col., 1995). La palabra aflatoxina está formada de acuerdo a: la primera letra “A” por el género Aspergillus, las siguientes 3 letras “FLA” por la especie flavus y la palabra toxina, que significa veneno (CFAST -Council for Agricultural Science and Technology, 1979). Introducción 16 Se han identificado al menos 20 aflatoxinas relacionadas estructuralmente entre sí, siendo las principales las B1, B2, G1, G2, M1 y M2. De éstas, las aflatoxinas B1 y G1 se encuentran con mayor frecuencia, la aflatoxina B1 posee la acción más tóxica y más carcinogénica entre todas. Las letras B y G, hacen referencia a los colores fluorescentes observados bajo luz ultravioleta (Blue y Green) y la letra M, a que fue aislada en leche (Milk) de animales; los números 1 y 2 indican el orden de elución de estos compuestos en la mayoría de los sistemas de análisis cromatográficos (Heathcote, 1984). Introducción 17 Figura 3. Estructura de las principales aflatoxinas La fluorescencia natural de las aflatoxinas es debida a su estructura pentaheterocíclica oxigenada (derivados difuranocumarínicos). La parte más reactiva de dicha estructura es el anillo lactónico. Por otro lado, la existencia del núcleo bifurano les confiere una gran rigidez, lo que favorece su interacción con algunos componentes celulares (Palmgren y Hayes, 1987). Introducción 24 ensayos “in vivo”. En años posteriores se registró la muerte de 13 niños chinos como consecuencia de la ingestión de pastas alimenticias (noodles) contaminadas con aflatoxinas. La presencia de estas micotoxinas se confirmó “post-mortem” en muestras de tejidos de los pacientes (Lye y col., 1995). La enfermedad conocida como “cirrosis de la niñez India” se debe en parte a un envenenamiento aflatóxico (Bhandari y Bhandari, 1980; Dhatt y col., 1982; Bhandari y Sharda, 1984). El "síndrome de Reye” ha sido relacionado con la toxicidad de las aflatoxinas (Ryan y col., 1979; Nelson y col., 1980); en Tailandia, donde el “síndrome de Reye” es endémico, las aflatoxinas B1, G1 y B2 han sido detectadas mediante cromatografía en tejido hepático (Smith y col., 1995). La presencia de los metabolitos P1 y Q1 en el hígado ha sido relacionada con cáncer (Qian y col., 1994). 1.1.7.3. Impacto económico La evaluación de las pérdidas económicas derivadas de la presencia de aflatoxinas en alimentos es compleja, debido a que son muchos los factores a tener en cuenta al realizar la valoración (Burdaspal, 1984; Vasanthi y Bhat, 1998). Por una parte, la detección de materias primas o alimentos contaminados puede ocasionar, desde la pérdida absoluta del producto o cultivo, hasta la pérdida de mercados o la disminución de ingresos por la venta de estos productos a menor precio (Burdaspal, 1984; Palmgren y Hayes, 1987; Moss, 1991). Se debe tener en cuenta que la trascendencia de estos hechos en algunos países productores es notablemente elevada, sobre todo si se considera que muchos de estos países están en vías de desarrollo y una de sus mayores fuentes de ingresos es la exportación de materias primas para la elaboración de alimentos. En la mayoría de los casos, los países afectados presentan una climatología favorable para la producción de aflatoxinas y sus sistemas de almacenamiento y procesado no son los más adecuados (Burdaspal, 1984, Moss, 1991). En consecuencia, las cosechas libres de aflatoxina pueden albergar A. flavus, los cuales no son detectados por las pruebas para Introducción 25 aflatoxinas. El hongo puede desarrollarse y comenzar a producir aflatoxinas después de que se haya comprobado la ausencia de las micotoxinas, especialmente en las condiciones húmedas y calientes de zonas tropicales, bajo las cuales se almacenan muchos productos que son exportados hacia Europa. Esto puede dañar la economía de venta de cosechas en estas regiones tropicales, debido a que los agricultores se ven obligados a vender su producción tan pronto como se comprueba que sus cosechas están libres de aflatoxinas, en lugar de almacenarlas hasta poder exigir un mejor precio (Horne y col., 1995). Existen pocas alternativas cuando se detecta la presencia de aflatoxinas en partidas agrícolas en concentraciones superiores a las establecidas por la legislación o por diferentes organismos (Burdaspal, 1984; Moss, 1991). Una de ellas es la destrucción total del producto contaminado. En otros casos (en semillas o forrajes fundamentalmente), es posible el tratamiento con agentes detoxificantes como el peróxido de hidrógeno (Applebaum y Mart, 1982), aldehídos (Codifer y col., 1976; Heimbecher y col., 1988), procedimientos de amoniación (Gardner, 1971; Park y col., 1988; Frayssinet y Lafarge-Frayssinet, 1990; Hammond, 1991) y uso de sales del ácido propiónico (Moreno-Martínez y col., 2001). De estas técnicas, la más recomendable por sus efectos decontaminantes y viabilidad económica es el empleo de amoniaco (Coker y col., 1985; Samarajeewa y col., 1990; Park, 1993). Los productos tratados de esta forma, reducen significativamente sus niveles de contaminación, siendo seguros para la alimentación de animales (Norred y Morrisey, 1983; Hoogenboom y col., 2001; Neal y col., 2001). No obstante, la detoxificación no es rentable en la mayoría de los casos por encarecer el producto y además, estos sistemas no se utilizan para el tratamiento de los alimentos destinados al consumo humano porque pueden producir alteraciones en la calidad organoléptica de los mismos y porque no existen estudios determinantes sobre la posible toxicidad de los derivados formados por amoniación en el hombre. Introducción 26 Otro aspecto económico importante a considerar, son los gastos derivados del uso de procedimientos de vigilancia y control para la detección de aflatoxinas en alimentos, así como de la investigación sobre sus efectos tóxicos y el desarrollo de métodos de análisis (Lynne y col., 1995; Criseo y col., 2001). También es necesario considerar las pérdidas económicas derivadas del consumo de piensos contaminados con aflatoxinas, por los animales domésticos y de granja (Keyl y Booth, 1971; Tung y col., 1975; Guthrie, 1979; Bodine y Mertens, 1983). Este tipo de pérdidas son muy altas cuando se produce la muerte de un elevado número de animales. No obstante, dado que los casos de intoxicaciones masivas no son muy frecuentes en la actualidad, hay que tener en consideración el efecto del consumo reiterado de pequeñas dosis de aflatoxinas por los animales (Burdaspal, 1984; Hussein y Brasel, 2001). Esto se traduce en una mayor suceptibilidad frente a procesos infecciosos y parasitarios, retraso en el crecimiento y una disminución general de la productividad de los animales (Garaleviciene y col., 2001; Ortatatli y col., 2002). Debido a que todas estas consecuencias son difíciles de valorar, el impacto real en términos económicos a nivel mundial, no ha podido ser evaluado correctamente (Panangala y col., 1986; Harvey y col., 1989; Vasanthi y Bhat, 1998). En conclusión, las aflatoxinas son metabolitos muy carcinógenos y tóxicos, que afectan a cosechas, animales y seres humanos en todo el mundo. Se asocian a varias enfermedades tales como aflatoxicosis y síndrome de Reye que pueden causar una serie de síntomas en seres humanos y animales incluyendo la muerte. Este podría ser el porqué las aflatoxinas son las micotoxinas más conocidas y estudiadas con mayor intensidad en el mundo entero. La tabla 2 proporciona una lista de alimentos en los cuales ha sido demostrada la presencia de aflatoxinas en el periodo 1991– 2004. Introducción 27 Tabla 2. Informes recientes de presencia de aflatoxinas en alimentos. Incidencia Rango Producto País Año (%) (µg /kg) Grano de sojaa Argentina 1991 10 1–36 Almendrasa USA 1993 1 2–372 Castañasa USA 1993 17 2–619 Higos secosa Austria 1993 13 2–350 Nuez moscadaa Japón 1993 43 0,2–16,6 Pimientosa Pakistán 1995 66 1–79,9 Maízb Bangladesh 1995 67 33 Hierbas, especiasc UK 1996 24 1–51 Cacahuetesa India 1996 45 5–833 Maíza Argentina 1996 20 5–560 Pistachosa Holanda 1996 59 2–165 Trigoa Uruguay 1996 20 2–20 Cacahuetesd Cuba 1996 40 1–50 Maíza India 1997 47 5–666 Arroza Ecuador 1997 9 6,8–40 Cacahuetese Brasil 1998 51 43–1099 Maízf Brasil 1998 38 0,2–129 Especiasg Suecia 1998 90 0,1–62 Pimientosh Turkía 1998 40 >= 20 Pimientosi India 1999 59 30–969 Harinasj Brasil 2001 9 2,8–1323 Incaparinak Guatemala 2002 100 3–244 Crema de avellanasl Turkía 2003 95 1–13 Pimentónm Turkía 2004 11 1,1–97,5 aPittet (1998); b Dawlatana (2002); c MacDonald y Castle (1996); d Escobar y Regueiro (2002); eFreitas y Brigido (1998); f Vargas y col., (2001); g Olsen y col., (1998); h Omurtag y col., (1998); i Reddy y col., (2001); j Midio y col., (2001); k Trucksess y col., (2002); l Aycicek y col., (2005); m Erdogan (2004). Introducción 28 1.1.8. Procedimientos para reducir la presencia de aflatoxinas Existen métodos físicos y químicos propuestos para reducir la presencia de aflatoxinas en alimentos, y también para reducir la cantidad de hongos contaminantes que las producen. En la tabla 3 están esquematizados los tratamientos más comúnmente utilizados para reducir la presencia de aflatoxinas. Diversos compuestos químicos han sido probados por su habilidad de degradar e inactivar aflatoxinas, pero la mayoría no son prácticos o son potencialmente dañinos, debido a la formación de residuos tóxicos o la perturbación del contenido nutricional y las propiedades organolépticas del producto, es así que el tratamiento químico detoxificante, es empleado únicamente para alimentos destinados a consumo animal. No se puede afirmar que exista un tratamiento verdaderamente eficaz para la eliminación de las aflatoxinas, por ello deben aplicarse sistemas de prevención y control. Introducción 29 Tabla 3. Tratamientos utilizados para reducir la presencia de aflatoxinas en alimentos. Métodos físicos de eliminación Limpieza y separación Molienda húmeda Molienda en seco Irradiación Métodos físicos de detoxificación Desactivación térmica Irradiación Adsorción Bentonita, HSCAS Degradación química NH3 Bisulfito sódico en autoclave Nixtamalización Sales del ácido propiónico Métodos físicos de eliminación Limpieza y separación Molienda húmeda Molienda en seco Irradiación Métodos físicos de detoxificación Desactivación térmica Irradiación Adsorción Bentonita, HSCAS Degradación química NH3 Bisulfito sódico en autoclave Nixtamalización Sales del ácido propiónico Introducción 30 1.1.9. Legislación para el control de aflatoxinas en alimentos destinados a consumo humano y animal El Código Alimentario Español, en su capítulo segundo, apartado 1.02.11., considera alimento contaminado todo aquel que contenga gérmenes patógenos, sustancias químicas o radiactivas, toxinas o parásitos capaces de producir o transmitir enfermedades al hombre o a los animales. Partiendo de esta premisa, los alimentos que contienen micotoxinas deberían clasificarse como alimentos contaminados, no obstante, considerando que la posibilidad de encontrar alimentos con ausencia total de contaminantes es una utopía, distintos países han fijado límites máximos para diversos contaminantes en alimentos entre los que se incluyen las micotoxinas. Resulta extremadamente difícil estimar con exactitud la exposición a aflatoxinas, debido a la ínfima cantidad presente en los alimentos y las variaciones de ingesta diarias y estacionales (Chen y Chen, 2002). En la Unión Europea han sido implementados niveles máximos de contaminación por aflatoxinas mediante el Reglamento 2174/2003/CE, por el que se fija el contenido máximo de determinados contaminantes en los productos alimenticios. Introducción 31 Tabla 4. Extracto del Reglamento 2174/2003/CE. Producto Contenido máximo de aflatoxinas en µg/kg (ppb) B1 B1 + B2 + G1 + G2 2.1.1. Cacahuetes, frutos de cáscara* y frutos secos 2.1.1.1. Cacahuetes, frutos de cáscara y frutos secos y productos derivados de su transformación, destinados al consumo humano directo o como ingrediente de los productos alimenticios 2 4 2.1.1.2. Cacahuetes destinados a ser sometidos a un proceso de selección, u otro tratamiento físico, antes del consumo humano directo o como ingrediente de productos alimenticios 8 15 2.1.1.3. Frutos de cáscara y frutos secos destinados a ser sometidos a un proceso de selección, u otro tratamiento físico, antes del consumo humano directo o de su uso como ingredientes de productos alimenticios 5 10 Introducción 32 2.1.2. Cereales (incluído el trigo sarraceno, Fagopyrum sp.) 2.1.2.1. Cereales (incluido el alforfón, Fagopyrum sp.) y productos derivados de su transformación, destinados al consumo humano directo o como ingrediente de los productos alimenticios 2 4 2.1.2.2. Cereales (incluido el alforfón, Fagopyrum sp.) destinados a ser sometidos a un proceso de selección, u otro tratamiento físico, antes del consumo humano directo o como ingrediente de productos alimenticios 2 4 *Sólo la parte comestible. Introducción 33 La Directiva 1999/29/CE, establece contenidos máximos para las sustancias y productos indeseables en la alimentación animal; basándose en esta directiva, el Real Decreto 747/2001, de 29 de Junio, publicado en el BOE No. 156 del 30 de junio de 2001, establece las sustancias y productos indeseables en la alimentación animal (entre las que se incluyen la aflatoxina B1 y cornezuelo del centeno) y sus límites máximos (tabla 5). Tabla 5. Extracto del R.D. 747/2001, de 29 de Junio. Anexo I Sustancias, productos Alimentos para animales Contenido máximo en mg/kg (ppm) en alimentos para animales, referido a una humedad del 12% -Materias primas para la alimentación animal* 0,05 B.PRODUCTOS (Aflatoxina B1) -Piensos completos para bovinos, ovinos y caprinos (excepto ganado lechero terneros, corderos y cabritos) 0,005 0,01 -Piensos completos para cerdos y aves (excepto animales jóvenes) 0,02 -Otros piensos completos 0,01 -Piensos complementarios para bovinos, ovinos y 0,05 Introducción 40 1.1.11.1. Medios de cultivo para la producción de aflatoxinas El hecho de que no todas las cepas del género A. flavus sean capaces de producir aflatoxinas ha alentado el desarrollo de métodos de screening de las mismas para conocer su capacidad aflatoxigénica. La rutina general para un estudio rápido de detección de posibles cepas fúngicas aflatoxigénicas, consiste en inocular una suspensión de esporas del hongo en el medio de cultivo elegido, conveniente para la producción de aflatoxinas, líquido o sólido. El medio YES y medios naturales conteniendo trigo, arroz o cacahuetes humedecidos (Davis y col., 1966; Abou-Gabal, 1981; Moreno, 1989) han sido utilizados con este propósito. Después del periodo de incubación se extraen las toxinas del medio por simple mezcla y agitación con un disolvente adecuado como el cloroformo. El extracto se filtra, se concentra y se redisuelve en el disolvente adecuado para su posterior análisis. La técnica rápida más comúnmente usada suele ser la cromatografía en capa fina TLC, en la que se detecta la presencia de aflatoxinas mediante el uso de patrones externos (de Iongh, 1965; Dickes, 1966; Betina, 1984; El-Banna y col., 1987). 1.1.11.2. Medios rápidos de diagnóstico para la detección de cepas aflatoxigénicas Examinar un gran número de cepas aisladas de una variedad de sustratos con el procedimiento antes descrito es largo y tedioso. Por esta razón, se han desarrollado numerosos métodos rápidos de screening para la determinación de la producción de aflatoxinas mediante observación de fluorescencia en los medios donde se cultivan cepas aisladas. Dichos métodos utilizan medios de cultivo más o menos complicados que contienen aditivos para incrementar la producción de aflatoxinas y conseguir la determinación de un área fluorescente azul brillante o verde-azulada alrededor de las colonias durante su examen bajo luz ultravioleta. Entre estos métodos se incluyen un medio líquido sintético (Mateles y Adye, 1964, 1965), Introducción 41 medios de cultivo complejos conteniendo sacarosa, diferentes sales y cacahuetes libres de aflatoxinas (Codner, 1963; De Vogel y col., 1965; Diener, 1967; Delucca, 1977), un medio consistente en una base de glucosa, sales y gel de sílice suplementado con ácido tartárico (Torrey y Marth, 1976), el agar de extracto de levadura suplementado con glucosa –GY- (Filtenborg y Frisvad, 1980), o un medio Czapek-Dox como base, sobre la cual se añadió licor de maíz (APA) con el mismo fin (Schröeder, 1966; Hara y col., 1974). También fueron utilizados diversos medios con coco como sustrato o suplementados con este: Arseculeratne y col. (1969) elaboraron un medio de diagnóstico sobre la base del Czapek-Dox, al que adicionaron un 10% de coco fresco, en el que las cepas productoras de aflatoxinas mostraban fluorescencia azul muy intensa. Lin y Dianese (1976) y Davis y col. (1987) utilizaron el medio agar de coco –CAMpara la detección rápida de cepas aflatoxigénicas. La producción de aflatoxinas en este medio estaba asociada a una pigmentación amarillo-anaranjada del reverso de las colonias muy evidente a simple vista. Otros medios que utilizan coco son agar extracto de coco -CEA- (Lemke y col., 1988, 1989) y agar crema de coco –CCA- (Dyer y McCammon, 1994) con el cual los autores añaden la posibilidad de diferenciar entre las cepas aflatoxigénicas de A. flavus que presentaban un anillo fluorescente alrededor, a diferencia de las cepas de A. parasiticus, que presentaban fluorescencia por encima de la colonia. 1.1.11.3. Otros métodos para diagnóstico de cepas aflatoxigénicas Según los resultados observados por Saito y Machida (1999), el reverso de las colonias aflatoxigénicas de A. flavus y A. parasiticus se vuelve de color rosa cuando sus cultivos son expuestos a vapores de amoniaco. El cambio de color fue observado en colonias cultivadas en medios comúnmente utilizados para la producción de aflatoxinas como PDA, medio a base de coco y medio YES. Es un método de diagnóstico de la producción de Introducción 42 aflatoxinas, a través de reacciones coloreadas, para identificar cepas aflatoxigénicas de Aspergillus sección Flavi. 1.1.11.4. Métodos cromatográficos 1.1.11.4.1. Tratamientos previos El análisis cromatográfico de las micotoxinas está precedido por una secuencia de operaciones generales amplias y complejas que incluyen el muestreo, preparación de la muestra, extracción, purificación y concentración del extracto obtenido antes de los pasos de separación, cuantificación y confirmación. Los resultados de la identificación y cuantificación posterior, estarán determinados por la eficacia obtenida en estas operaciones generales (Jarvis y col., 1982). Los niveles de contaminación en alimentos se encuentran típicamente en el rango mg/kg-µg/kg, por lo que es muy importante una extracción eficiente de la toxina con la menor cantidad de sustancias interferentes como sea posible. Debido a que las micotoxinas se producen en una amplia variedad de productos, su extracción depende tanto de las propiedades fisicoquímicas de los productos contaminados como de las propiedades de las toxinas (Ikins, 1991). Los solventes típicos de extracción son el cloroformo, etil acetato, metanol, acetona, acetonitrilo, agua, y combinaciones de alguno o varios de los solventes orgánicos con el agua. Algunas veces, solventes completamente apolares, como el hexano, se incluyen en la extracción cuando la muestra tiene un alto contenido en grasas para separarlas de las micotoxinas. La mayoría de las veces, suelen extraerse al mismo tiempo que la micotoxina de interés, cierto número de sustancias que pueden interferir en la determinación y cuantificación de la toxina. Es por ello que, a menudo, es necesario purificar el extracto para eliminar dichas sustancias. En ciertos casos la purificación puede ser muy simple, requiriendo sólo la filtración del extracto. Esto es frecuente cuando el paso cuantitativo es muy específico, Introducción 43 como en un ensayo por inmunoafinidad (p. ej. ELISA). En otros casos, la purificación deberá ser más rigurosa, requiriendo distintas operaciones, como partición líquido-líquido; centrifugación, precipitación, cromatografía en columna, etc. o combinaciones de las mismas. La purificación en columnas tiene un uso muy extendido en el análisis de las micotoxinas. Desde que Eppley desarrolló en 1968 las columnas de purificación de sílica gel, una gran variedad de columnas de extracción han sido desarrolladas para este propósito. Otro tipo de columnas de extracción son las columnas multifuncionales Mycosep, que al contrario del resto, permiten el paso de las micotoxinas, reteniendo las sustancias interferentes (Wilson y Romer, 1991) y las columnas de inmunoafinidad rellenas con anticuerpos mono o policlonales, que juntas, suponen la herramienta más moderna para la purificación del extracto en el análisis de las micotoxinas (Fremy y col., 1989; Patey y col., 1990; Sharman y col., 1991; Farjam y col. 1992). La diálisis difásica permite una extracción selectiva y eficiente de analitos de bajo peso molecular a partir de una amplia variedad de matrices, utilizando disoluciones acuosas u orgánicas sin necesidad de llevar a cabo la posterior purificación, ya que ambos pasos se llevan a cabo simultáneamente. La diálisis difásica ha sido desarrollada para satisfacer la necesidad de metodologías más eficientes para la determinación de las micotoxinas. Esta aplicación es posible debido a que la mayoría de estos compuestos son altamente solubles en disolventes orgánicos y poseen bajo peso molecular, las dos propiedades en que se basa la técnica (Domínguez y col., 1994). Hasta la fecha, la principal aplicación de la diálisis difásica en el análisis de metabolitos fúngicos han sido determinación de aflatoxinas a partir de leche y derivados (Díaz y col., 1993, 1995) y patulina en zumo de manzana (Prieta y col., 1994), lo que demuestra su versatilidad. La diálisis difásica puede tener muchas aplicaciones analíticas, siendo un avance novedoso y valioso para la determinación de contaminantes en alimentos. Introducción 44 El paso final en muchos protocolos de purificación, es la concentración del extracto conteniendo la micotoxina, que suele hacerse en un rotavapor o mediante evaporación en corriente de nitrógeno. Una vez concentrado, el extracto está listo para ser redisuelto en solventes compatibles con las toxinas y que sean adecuados al sistema elegido para su análisis cromatográfico (Dorner, 1996). 1.1.11.4.2. Aplicación de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)/detección fluorescente para el análisis de aflatoxinas Las primeras cuantificaciones de aflatoxinas fueron hechas por Cromatografía en capa fina (TLC) y esta técnica aún es muy popular actualmente. Sin embargo, la HPLC (principalmente por fase reversa) y el método inmunoenzimático ELISA son los métodos de cuantificación predominantes en las publicaciones sobre el tema en los últimos años (Dorner, 1996), mientras que la Cromatografía líquida/Espectrometría de masas (LC/MS) y la espectrometría de masas en tandem (MS/MS) se aplican como técnicas confirmatorias (Gilbert y Vargas, 2003). La tendencia actual es el uso de HPLC con detección fluorescente para el análisis de las micotoxinas, ya que este método permite analizar sustancias termolábiles, no volátiles, iónicas o polares y proporciona alto poder de resolución entre sustancias químicamente similares; la rapidez, sensibilidad, precisión, repetibilidad y la gran gama de posibilidades que ofrece, la capacitan para el análisis de sustancias de carácter muy diverso. La principal ventaja sobre otros métodos parece ser el potencial para su automatización. Aunque la separación de las aflatoxinas por HPLC es relativamente simple, en los primeros ensayos utilizando HPLC de fase normal (NP-HPLC) y detección UV, los límites de detección alcanzados fueron insuficientes. Debido a las propiedades fluorescentes de las aflatoxinas, se demostró que Introducción 45 los sistemas de HPLC con detección fluorescente eran más sensibles para su determinación (Panalaks y Scott, 1977; Takahashi, 1977). Un problema existente era que la fluorescencia de las AFB1 y AFB2 disminuía en los disolventes usados en la NP-HPLC. Esto hacía necesario el uso simultáneo de dos detectores: uno UV para la AFB1 y AFB2 y otro de fluorescencia para AFG1 y AFG2 (Pons y Franz, 1977). En 1978, Manabe y col. lograron sensibilizar la detección fluorescente de las aflatoxinas B1 y B2 con la adición de un ácido orgánico a la fase móvil. Este método, modificado, ha sido utilizado para la determinación de aflatoxinas en diversos productos agrícolas (Howell y Taylor, 1981) y piensos (Goto y col., 1979). Basándose en el hecho de que la fluorescencia de las aflatoxinas B1 y B2 es mayor en sólidos de adsorción, Panalaks y Scott en 1977 y Zimmerli también en 1977, desarrollaron una técnica en la que la célula de flujo del detector fluorescente se rellenaba con micropartículas de gel de sílice donde las aflatoxinas eran adsorbidas de forma reversible en una reacción post-columna. Varios autores utilizaron este método para la determinación de aflatoxinas en diversos productos agrícolas (Awe y Schranz 1981; Francis y col., 1982; Tutelyan y col., 1989). En general, los sistemas de HPLC de fase reversa (RP-HPLC) se han ido imponiendo sobre los de fase normal. Dado que en los disolventes acuosos la fluorescencia de la AFB1 y AFG1 disminuye (Holcomb y col.,1992; Kok, 1994), se han desarrollado numerosos métodos con el fin de aumentar la fluorescencia de las aflatoxinas para una mejor determinación y cuantificación. Entre ellos podemos mencionar diferentes tipos de derivatizaciones, incluido el uso de ácidos fuertes como el ácido trifluoroacético (TFA) y oxidantes como la cloramina (Lázaro y col., 1988), el iodo y el bromo. Takahashi (1977) alcanzó un límite de detección de 0,02 µg/l para las 4 aflatoxinas extraídas de muestras de vino, mediante una derivatización Introducción 46 precolumna con TFA. En 1978, Beebe adaptó este método para su aplicación en diferentes alimentos (cacahuetes, mantequilla de cacahuete, maíz y nueces), incluyendo una extracción con n-hexano al mismo tiempo que la derivatización con el TFA para liberar las aflatoxinas de los residuos grasos de los extractos. Esta derivatización ha sido utilizada para determinar aflatoxinas en diversos alimentos, como pistachos (Haghighi y col., 1981), almendras (Schade y col., 1981), maíz (Cohen y Lapointe, 1981; Hutchins y Hagler, 1983; Wilson y Romer, 1991; Torres Espinosa y col., 1995; Yoshizawa y col., 1996; Ali y col., 1998, 1999) y cacahuetes y derivados (Tarter y col., 1984; Roch y col., 1992; Ali y col., 1999) y leche humana (Saad y col., 1995). Su mayor desventaja radica en la baja estabilidad de los derivados B2a y G2a en metanol (Beebe, 1978), lo que puede evitarse en parte, suprimiendo el uso de este disolvente en la fase móvil (Holcomb y col., 1992). En 1980, Davis y Diener describieron que al tratar previamente las aflatoxinas B1 y G1 con iodo, los derivados obtenidos eran más fluorescentes. Sin embargo, también se formaban numerosos productos secundarios, por lo que esta técnica sólo fue utilizada como prueba de confirmación. Posteriormente se han desarrollado diferentes métodos de derivatización post-columna. Así, Thorpe y col. (1982) utilizaron un mezclador en forma de T para introducir el iodo post-columna en la fase móvil. Sheperd y Gilbert (1984) determinaron las condiciones óptimas necesarias para la determinación de un estándar de aflatoxina B1 mediante HPLC con iodo postcolumna. El sistema de HPLC con derivatización con iodo post-columna ha sido utilizado para la determinación de las aflatoxinas en maíz (Thiel y col., 1986; Groopman y Donahue, 1988; Scudamore y col., 1998a; Kpodo y col., 2000), cacahuetes y derivados (Shepperd y Gilbert, 1984; Thiel y col., 1986; Jansen y col., 1987; Dorner y Cole, 1988; Groopman y Donahue, 1988; Gilbert y col., 1991; Patey y col., 1990; Niedwetzki y Lach, 1994), nueces y frutos secos (Shepperd y Gilbert, 1984; Sharman y col., 1991; Niedwetzki y Lach, 1994), dátiles (Ahmed y Robinson, 1998), leche (Groopman y Donahue, Introducción 47 1988), piensos (Tuinstra y Haasnoot, 1983; Traag y col., 1987; Sharman y col., 1991; Van Egmond y col., 1988, 1991) y salvado de arroz (Scudamore y col., 1998b). Este sistema ha sido adoptado como método oficial de análisis de aflatoxinas por la AOAC-IUPAC (AOAC, 1991). Uno de los principales inconvenientes del uso de halógenos es el deterioro del equipo debido al uso de disoluciones saturadas de iodo. En 1987, Jansen y col. desarrollaron una manera alternativa de utilizar el iodo, usando una pequeña columna empaquetada con iodo sólido como reactivo en fase sólida (Jansen y col., 1987). Kok y col. (1986) propusieron un nuevo método para la determinación de aflatoxinas en piensos y cacahuetes, utilizando bromo como derivatizante en una reacción post-columna. Estos autores utilizaron un sistema de generación electroquímica de bromo (Célula-KOBRA®). Dorner y col. (1993) estudiaron la presencia de aflatoxinas en cacahuetes utilizando esta metodología. En 1993, Garner y col. desarrollaron un método para la determinación de éstas micotoxinas en especies, el cual incluía un nuevo método de derivatización post-columna utilizando bromuro perbromuro de piridinio (PBPB). Una alternativa para evitar los inconvenientes de la halogenación, permitiendo al mismo tiempo un aumento de la respuesta fluorescente de las aflatoxinas B1 y G1, es el uso de ciclodextrinas. Introducción 48 1.2. PRINCIPIOS BÁSICOS DE LA LUMINISCENCIA: FLUORESCENCIA Y FOSFORESCENCIA Desde hace siglos es bien conocido el hecho de que determinados compuestos emiten una radiación visible cuando son expuestos a los rayos solares. Los fenómenos luminiscentes tales como la ”aurora boreal”, la fosforescencia del mar, la luminiscencia de animales marinos, de insectos, de la madera, etc., han fascinado al hombre desde la antigüedad, quedando reflejado en los primitivos trabajos científicos. Aristóteles (384-322 a. C.) parece ser uno de los primeros en reconocer la “luz fría” en pescados muertos, hongos y en la secreción luminosa de algunos peces. Un sistema que absorbe energía puede remitirla parcialmente en forma de radiación luminosa. Sin embargo, es preciso diferenciar claramente entre el proceso que tiene lugar procedente de luz térmica y de fuentes de luz luminiscentes. Así, cuando un cuerpo emite luz exclusivamente por una elevación de su temperatura el fenómeno se denomina “incandescencia”. Todos los demás fenómenos en que se emite luz, es decir hay una radiación emitida por átomos o moléculas como consecuencia de la transición radiacional desde un estado excitado a otro de menor energía, se denominan genéricamente “luminiscencia” (Hurtubise, 1990; Vo-Dinh, 1984; Schulman, 1977; Winefirdner y col., 1972). Evidentemente en este caso la temperatura de la especie no se altera. Por otra parte, el proceso luminiscente precisa de un intervalo de tiempo al menos del orden de 10-10 segundos para transformar la energía absorbida en emisión de luz. En este hecho radica la principal diferencia entre la luminiscencia y otros fenómenos ópticos que no cumplen las leyes del equilibrio térmico y cuya duración es menor, como la dispersión Rayleigh y el efecto Raman. En función del tipo de excitación que produce la luminiscencia se le asignan diversos nombres. Así por ejemplo tenemos: Introducción 49 Quimioluminiscencia: es aquella luminiscencia en la que la energía es originada por reacciones químicas. Bioluminiscencia: Es una quimioluminscencia que ocurre en organismos vivos. Triboluminiscencia: obtenida por ruptura, roce, etc. de ciertos materiales. Catodoluminiscencia o electroluminiscencia: debida a la excitación por electrones. Ocurre cuando se producen descargas eléctricas en gases enrarecidos. Anodoluminiscencia: se da en ánodos y es debida a la acción de cationes sobre la sustancia que forma el ánodo. Radioluminiscencia: producida por materiales radiactivos. Sonoluminiscencia: algunos líquidos orgánicos poseen luminiscencia cuando son excitados por ultrasonidos. Fotoluminiscencia: es una emisión lumínica subsiguiente a la absorción de luz por ciertas moléculas en la que la energía activadora es de origen electromagnético (rayos ultravioleta, rayos X o rayos catódicos). En 1935, Jablonskii, tras estudiar la luminiscencia de diversos colorantes, propuso el conocido diagrama de “niveles electrónicos de energía” de los estados singlete y triplete para explicar los procesos de excitación y de emisión de luminiscencia. El diagrama propuesto fue la base de la interpretación teórica de todos los fenómenos luminiscentes. Introducción 56 1.2.2. Fosforescencia aplicada al control de los alimentos Desde que Roth, en 1967, sugirió el uso de la fosforimetría a temperatura ambiente (RTP) para la detección de algunos compuestos orgánicos depositados sobre celulosa, han aparecido en la bibliografía decenas de aplicaciones para esta técnica en el campo del control medioambiental y del control de los alimentos. Sin embargo, hasta la fecha no ha sido descrito en la literatura ningún método fosforimétrico para la detección y cuantificación de aflatoxinas o para la identificación de hongos aflatoxigénicos. Actualmente es bien sabido que para obtener RTP analíticamente útil han de cumplirse varios requisitos importantes (Hurtubise, 1990; Vo-Dinh, 1984; Schulman, 1977): Es necesario asegurar un elevado grado de rigidez en el entorno del fosforóforo que asegure la protección del triplete excitado, mediante el empleo de temperaturas muy bajas (nitrógeno líquido 77ºC), protegiéndolo en disolución con el uso de medios organizados o inmovilizándolo sobre soportes sólidos. Favorecer la población del estado triplete excitado, a través del empleo de átomos o estructuras pesadas, bien intramoleculares (sustituyentes como –I, -Br, etc.) o extramoleculares (Tl+, Ag+, I-, Br-CH2-CHBr, etc), los cuales elevan la constante de velocidad radiacional de la fosforescencia al favorecer el cruce intersistemas. El oxígeno en estado fundamental está en estado triplete y es por ello un desactivante del triplete excitado del analito luminiscente. Por consiguiente, y teniendo en cuenta su elevada solubilidad en medios acuosos, es preciso asegurar su total eliminación. El uso de la desoxigenación química con sulfito de sodio, en lugar de burbujear una Introducción 57 corriente de gases inertes como el Ar o N2 por la disolución, es una innovación introducida por el grupo de investigación del Prof. Alfredo Sanz Medel (Díaz García y col., 1986) que ha permitido facilitar la determinación de diversas especies, dando resultados satisfactorios al ser implementada en sistemas de inyección de flujo (FIA). Se ha visto que para algunos compuestos es posible obtener señal fosforescente en disolución utilizando simplemente disoluciones acuosas de los analitos en presencia de una fuente externa de átomo pesado y sulfito de sodio como agente desoxigenante. Esta metodología fue introducida por el grupo del Prof. Alberto Fernández (Segura Carretero y col., 1988) se denomina fosforescencia a temperatura ambiente inducida por átomo pesado (HAI-RTP), aunque otros autores (Li y col., 1998), la denominan fosforescencia a temperatura ambiente en medios no protegidos (NP-RTP). Aplicando esta metodología, en el año 2003 Wen-qing Long publicó un método de determinación de triptófano. Las intensidades de fosforescencia en fase líquida son generalmente muy bajas para ser utilizadas en trabajos analíticos. Entre 1981 y 1983, Donkerbroek y col., demostraron el potencial analítico de la fosforescencia sensibilizada en solución a temperatura ambiente (S-RTP) producida por un proceso de transferencia de energía triplete-triplete desde el analito de interés, que actúa como donador, a un aceptor, generalmente biacetilo o 1,4dibromonaftaleno. A través de ese mecanismo ciertos compuestos presentan señales de fosforescencia suficientemente elevadas para ser utilizadas con fines analíticos. En 1985 Baumann y col. se basaron en el principio de S-RTP para la detección de biacetilo en cromatografía líquida, demostrando su aplicabilidad en muestras de cerveza. El mismo año, Shatirishvili y col. describieron un método de determinación de sulfito en vino Napareuli, mediante cromatografía de intercambio iónico donde formaba un complejo con biacetilo, cuya fosforescencia era medida. Introducción 58 En 1989, Cepeda Sáez y col. describieron un método de detección de biacetilo en mantequilla y margarina. Inicialmente el compuesto era aislado por destilación y posteriormente su fosforescencia nativa era sensibilizada con una furocumarina. A excepción de la fosforescencia a temperatura ambiente sensibilizada y la fosforescencia a temperatura ambiente inducida por átomo pesado, todos los métodos propuestos para la obtención de señales fosforescentes en disolución hasta finales de los 90 suponen el uso de algún tipo de organización a nivel microscópico. En los últimos años, la utilización de los llamados “medios organizados” o “medios ordenados” se ha convertido en una valiosa herramienta analítica, debido a su capacidad de organizar las especies químicas a nivel molecular. Estos “anfitriones” moleculares son estructuras químicas microscópicas que, en ciertas condiciones, se aproximan a las características de disoluciones fluidas homogéneas. La primera observación de RTP mediante la estabilización con medios microscópicamente organizados fue realizada empleando dodecilsulfato sódico (SDS) en presencia de talio como átomo pesado (Kalyanasundaram y col., 1977). En 1982 Turro y col. habían observado asociaciones de tipo anfitrión– invitado cuando detergentes catiónicos fosforescentes se incluyen en βy γCD, mientras que tales asociaciones no se ponen de manifiesto con α-CD. Desde entonces se estudian diferentes métodos para estabilizar el estado triplete en disolución y a temperatura ambiente. Entre los sistemas organizados podemos considerar los sistemas micelares y aquellos que están basados en la formación de complejos de inclusión. Entre estos últimos, las ciclodextrinas son, con notable diferencia, el medio más utilizado para estabilizar la RTP. En este caso, existe una relación “anfitrión-invitado” entre la ciclodextrina y el analito, y al igual que ocurre Introducción 59 con la fluorescencia, cuando se opera en condiciones adecuadas, estas disoluciones acuosas de ciclodextrinas producen un aumento de la señal de fosforescencia, dando lugar a la llamada fosforescencia e temperatura ambiente en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP). Por otra parte, es posible obtener señales fosforescentes a temperatura ambiente en disolución acuosa para un amplio número de compuestos, mediante la utilización de otro tipo de medio organizado, aumentando la viscosidad del microentorno que rodea a los fosforóforos basándose en interacciones a nivel molecular. Para la obtención de señal fosforescente a temperatura ambiente en disolución hay que tener en cuenta que los procesos de atenuación o desactivación (“quenching”) son directamente proporcionales a la temperatura e inversamente proporcionales a la viscosidad. La fosforescencia a temperatura ambiente en medios micelares (MSRTP), se basa en la utilización de agentes surfactantes, que al rodear a un analito mejoran su solubilidad en el medio y ofrecen una protección especial de los estados excitados (singlete y triplete) de la molécula huésped frente a procesos de desactivación no radiante. La principal característica de los agentes tensoactivos es su capacidad de autoasociación, tanto en disolución acuosa como en medios apolares, dando lugar a grandes agregados de dimensiones coloidales y estructura definida. El tipo de agregado que se forma depende tanto de la estructura del tensoactivo como del medio dispersante. La formación de dichos agregados ocurre al superarse una determinada concentración del tensoactivo en la disolución. Esta se denomina concentración micelar crítica (c.m.c.), por debajo de la cual el tensoactivo se encuentra en forma de monómeros. En la bibliografía existen estudios publicados que aplican la MS-RTP para determinación de pesticidas, como por ejemplo Segura Carretero y col. Introducción 60 (1998), que analizaron enlatados de piña enriquecidos con ácido naftilacético, o Murillo Pulgarín y col., que en 2002 determinaron napronamida en sedimentos, pimientos y tomates y en 2003 determinaron ácido naftil-acético en fórmulas insecticidas, sedimentos y frutas. El uso analítico de la fosforescencia de compuestos adsorbidos en sustratos sólidos constituye el área de aplicación de la fosforimetría sobre soportes sólidos (SS-RTP). Ciertos compuestos polares o iónicos presentan fosforescencia cuando están adsorbidos sobre soportes como celulosa, gel de sílice, polímeros, acetato sódico, ciclodextrinas o papel de filtro. Sólo ciertos materiales sólidos son adecuados para obtener RTP a partir de compuestos orgánicos adsorbidos, de entre los cuales el papel de filtro es el más ampliamente usado. Schulman y Parker (1977) estudiaron el efecto de la humedad, oxígeno y naturaleza de la interacción soporte/analito en varios soportes sólidos, especialmente en papel de filtro. Schulman y Walling (1972; 1973) sugieren que la adsorción de compuestos potencialmente fosforescentes en el soporte sólido inhibe la desactivación colisional del estado triplete y disminuye la atenuación por oxígeno si la muestra se seca totalmente. Schulman y Parker en 1977, propusieron que el enlace de hidrógeno de las moléculas orgánicas iónicas con los grupos hidroxilo de la superficie sólida es el mecanismo primario para inducir la rigidez necesaria en la promoción de RTP. Otro aspecto experimental estudiado (Niday y Seybold, 1978) en la emisión RTP es el efecto de la adición de varios compuestos como sales, NaF, NH4Cl, AcNa, glicina, etc., sobre el soporte sólido. Los resultados obtenidos demuestran que la eficacia del proceso RTP mejora en general y los tiempos de vida del estado excitado aumentan. La interpretación de este efecto está basada en que el empaquetamiento superficial de la matriz sólida Introducción 61 con sales y otros compuestos inhibe los movimientos internos del analito como consecuencia del relleno de los canales e intersticios de la matriz, lo cual reduce la permeabilidad del oxígeno protegiendo las moléculas fosforescentes de la atenuación (Fernández y Schulman, 2001). El disolvente utilizado para depositar el analito sobre el substrato sólido puede ser muy importante para obtener buenas emisiones RTP. Además de la solubilidad del analito hay que tener en cuenta la posibilidad de que tengan lugar interacciones del disolvente con la matriz sólida. Tras la adsorción del analito sobre la superficie sólida es necesario secar la muestra exhaustivamente antes de la etapa de medida, pues la humedad es uno de los factores determinantes en la disminución de la señal RTP. El proceso de secado debe ser rápido, no contaminante y evitar pérdidas de la muestra por volatilización. Capitán Vallvey y col. han trabajado en la determinación de pesticidas por SS-RTP utilizando papel de filtro como sustrato: analizaron agua y patatas, judías y lechuga para determinar morestan en 1998 y tiabendazol en 1999; en 1998 determinaron carbaril agua, patatas y vegetales; determinaron o-fenilfenol en agua y vegetales en 2003. El año 2001 propusieron un sensor fosofrimétrico desechable para determinar morestan en aguas. Este dispositivo consiste en un soporte sólido de polyester con una zona sensora que tiene tributilfosfato adherido. El año 2003 diseñaron un sensor análogo para determinar un antibiótico: el ácido oxolínico de leche de vaca u orina humana. Por otra parte, en el año 2002, Dong y col. aplicando la RTP mediante adsorción en papel de filtro, encontraron que el té verde posee un mayor contenido de compuestos polifenólicos que el té negro. Dentro de la metodología de SS-RTP, se puede inducir fosforescencia de los compuestos inmovilizándolos sobre la superficie porosa Introducción 62 de partículas adsorbentes como el gel de sílice y las resinas de intercambio iónico. En la literatura existen metodologías para la determinación de benzo[a]pyreno en agua (Fernández Sánchez y col., 2004) mediante inmovilización sobre amberlita y posterior detección fluorescente, sin embargo, no se han encontrado trabajos relacionados con la inmovilización en resinas y detección fosforescente de PAHs u otros contaminantes en alimentos. Las resinas de intercambio iónico se han utilizado en el campo de la fosforescencia para el desarrollo de sensores de humedad (Costa Fernández y Sanz Medel, 2000) o detección de metales pesados en agua como el plomo (San Vicente de la Riva y col., 1999) o el mercurio (San Vicente de la Riva y col., 2002). En los últimos años el desarrollo de la tecnología sol-gel ha permitido la preparación a temperatura ambiente de matrices inorgánicas que han demostrado tener unas excepcionales características como soportes sólidos para inmovilizar moléculas luminiscentes. La tecnología sol-gel permite preparar, a temperatura ambiente, matrices inorgánicas altamente porosas con idéntica composición que los vidrios y materiales cerámicos, mediante polimerizaciones y coagulaciones de hidróxidos, alcóxidos o ésteres de metal, evitando los procesos de degradación y fusión tradicionales que tienen lugar en la síntesis de materiales a elevadas temperaturas. La formación de matrices inorgánicas mediante la tecnología sol-gel tiene lugar a través de la hidrólisis (en presencia de agua y de un catalizador ácido o básico) y condensación por formación de enlaces siloxano de distintos precursores (generalmente ortosilicatos tetrasustituidos) para producir una suspensión coloidal (sol). La mayor parte de las técnicas sol-gel emplean tetraalcoxisilanos de bajo peso molecular como precursores, principalmente tetrametoxisilano Introducción 63 (TMOS) o tetraetoxisilano (TEOS), aunque también es posible utilizar silicato sódico. Las reacciones químicas vienen dadas por: Si-OR + H2OSi-OH + ROH ( Hidrólisis ) Si-OR + HO-Si Si-O-Si + ROH ( Condensación) Si-OR + H2OSi-OH + ROH ( Hidrólisis ) Si-OR + HO-Si Si-O-Si + ROH ( Condensación) Posteriormente tiene lugar una aglomeración de los monómeros coloidales formados con un aumento de la viscosidad del sol y originándose una estructura porosa denominada gel. Las propiedades del gel continúan cambiando mientras queden disolventes y agua en la estructura debido a reacciones de policondensación. Tras una etapa de secado que conlleva un encogimiento y una posible fragmentación del gel, se obtiene finalmente un xerogel poroso (gel seco). Durante la última etapa de formación del gel, el agua y los disolventes orgánicos empleados se evaporan de las cavidades del vidrio de forma que el volumen de la matriz sólida se reduce en un factor de 2-10. En esta etapa los disolventes contenidos en los poros de mayor diámetro se evaporan mucho más rápido que los de los poros de menor diámetro, los cuales permanecen húmedos y se forman unos gradientes de presión crecientes que pueden provocar la ruptura del vidrio monolítico. El catalizador empleado en la etapa de hidrólisis controla igualmente la superficie específica y distribución de los poros del xerogel final. Generalmente una catálisis básica genera sol-geles más porosos, mientras que la catálisis ácida da lugar a geles altamente ramificados y de alta densidad, con elevada área superficial. Las matrices preparadas según la tecnología sol-gel proporcionan una serie de ventajas frente a los soportes sólidos tradicionalmente empleados en el desarrollo de superficies activas para sensores ópticos. Así, proporcionan un entorno de elevada rigidez para las moléculas inmobilizadas Introducción 64 (por lo que se favorece su desactivación en forma de emisión luminiscente), la probabilidad de lixiviado de la molécula huésped es muy baja y finalmente, son soportes químicamente inertes, con una baja fluorescencia intrínseca y elevada transparencia óptica. En la literatura existen algunos trabajos relacionados con la inmovilización en soportes de tipo sol-gel y posterior detección fosforescente de compuestos aromáticos tóxicos como la benzofenona (Bagnich, 1996; Matsui y col., 1999) y el benzaldehido (Bagnich y col., 1995; Bagnich, 1998). 1.2.3. Sensores ópticos en sistemas de análisis de flujo De acuerdo con la IUPAC, un sensor químico sería “un sistema que transforma información química en una señal analítica útil. Esta información química puede ser originada por una reacción química del analito o por una propiedad física del sistema investigado, los sensores químicos contienen dos unidades funcionales básicas: un receptor y un transductor. Algunos sensores pueden incluir un separador, como por ejemplo una membrana”. En base a la naturaleza de la señal física que se genera y mide, dentro de la clasificación de los sensores químicos, un sensor óptico es aquel que mide cambios en alguna propiedad óptica del sistema (absorbancia, reflectancia, luminiscencia). La primera definición de “optosensor” apareció en los años 80, en un trabajo de Ruzicka y Hansen. Según estos autores, el concepto de “optosensor” nace de integrar un sensor óptico en sistemas típicos de análisis por inyección de flujo (FIA). La integración de las técnicas de fotoluminiscencia en fases sólidas con las de inyección de flujo ha sido realmente un “casamiento” fructífero que ofrece importantes ventajas de gran interés analítico tales como: automatización, facilidad para renovar reactivos en la superficie sensora, posibilidad de integrar en el sistema de flujo Introducción 65 pretratamientos en línea de la muestra, empleo de reacciones no reversibles en la fase activa, etc. (Sanz Medel, 1993). Un sistema analítico convencional de flujo continuo (Valcárcel y Luque de Castro, 1988) comprende tres etapas: la transferencia de masa (analito) entre dos fases, la reacción (bio) química de reconocimiento y la detección continua en una celda de flujo convencional. Estas etapas pueden tener lugar en una misma zona o en zonas diferentes de modo secuencial. El dispositivo que realice simultáneamente la detección con la reacción y la separación de la celda de medida puede considerarse formalmente como un “sensor” pues reúne sus características principales (responde directa, reversible, continua y rápidamente a variaciones en la concentración del analito de interés) y se denomina “optosensor”. Material y Métodos 72 -Microscopio óptico, modelo CH-2 (OLYMPUS) -Molinillo para café, eléctrico (MOULINEX) -pH-metro, pH 526 (WTV) -Ultrasonidos uci-200 (JKM) -Medidor de actividad de agua (AquaLab Serie3TE, DECAGON) -Luminómetro Perkin Elmer LS50B. 3.1.2. Diluyentes Disolución salina con polisorbato 80 Composición: Cloruro sódico (PANREAC) 0,90 g Polisorbato 80 (Tween® 80) 0,1 g Agua destilada 100,0 ml Preparación: Se pesan los componentes, se mezclan y se esterilizan a 121ºC durante 15 minutos. Material y Métodos 73 3.1.3. Colorantes Azul de metileno Composición: Azul de metileno (MERCK) 1,0 g Agua destilada 100,0 ml Preparación: Se pesa el colorante, se disuelve en unas gotas de alcohol, posteriormente se añade el agua, en pequeños volúmenes, hasta la completa disolución del colorante. 3.1.4. Medios de cultivo 3.1.4.1. Medios de cultivo para el recuento de mohos y levaduras -Agar Czapek (CZA) Composición: Sacarosa 30,0 g Nitrato sódico 2,0 g Fosfato dipotásico 1,0 g Sulfato magnésico 0,5 g Cloruro potásico 0,5 g Sulfato ferroso 0,01 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Material y Métodos 74 Preparación: Se utilizó el agar comercial Czapek de PANREAC que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se disuelven 49 g en un litro de agua destilada y se esteriliza 20 minutos a 115ºC. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar diclorán cloranfenicol peptona (DCPA) Composición: Peptona (PANREAC) 15,0 g Agar (PANREAC) 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se preparó la fórmula propuesta por Andrews y Pitt (1986), los componentes se pesan, se disuelven en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta 50ºC y se añade 2 mg de diclorán y 200 mg de cloranfenicol, se agita y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar diclorán glicerol al 18% (DG18) Composición: Peptona 5,0 g Dextrosa 10,0 g Fosfato monopotásico 1,0 g Diclorán 0,002 g Sulfato de magnesio 0,5 g Cloranfenicol 0,1 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Material y Métodos 75 Preparación: Se utilizó el agar comercial de MERCK que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se añaden 31,6 gramos en 1 litro de agua destilada. Se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC. Se enfría hasta 50ºC aproximadamente, se agita bien antes de distribuir asépticamente en placas estériles. -Agar dicloran rosa de bengala cloranfenicol (DRBC) Composición: Peptona 5,0 g Dextrosa 10,0 g Fosfato monopotásico 1,0 g Sulfato de magnesio 1,0 g Diclorán 0,002 g Rosa de Bengala 0,025 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se utilizó el agar comercial de MERCK, que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se disuelven 31,6 gramos en 1 litro de agua destilada calentando hasta su total disolución y se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente, se agita y distribuye asépticamente en placas estériles. Material y Métodos 76 -Agar malta al 2% (MA) Composición: Extracto de malta (SCHARLAU) 20,0 g Glucosa (PANREAC) 20,0 g Peptona (DIFCO) 1,0 g Agar (PANREAC) 25,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se preparó la fórmula de Blakeslee (Samson y col., 2000). Los componentes se pesan, se disuelven en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente, se agita y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar malta, levadura y sacarosa (MYSA) Composición: Extracto de malta 15,0 g Triptona 2,0 g Sacarosa 30,0 g Extracto de levadura 5,0 g Nitrato de sodio 0,5 g Agar 20,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se preparó la fórmula propuesta por Skaar y Stenwig (1996). Los componentes se pesan, se disuelven en un litro de agua destilada, se ajusta el pH a 6,8 con NaOH 1N y se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC. Luego de esterilizar, se añade 0,5% Cloranfenicol y 0,5% Clortetraciclina, se mezcla Material y Métodos 77 por agitación. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente, y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar oxitetraciclina glucosa extracto de levadura (OGYE) Composición: Glucosa 10,0 g Extracto de levadura 5,0 g Agar 20,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se utilizó el agar comercial de MERCK, que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se disuelven en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Luego de esterilizar se añade 0,01% oxitetraciclina en disolución alcohólica. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente, se agita y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar patata dextrosa (PDA) Composición: Extracto de patata 4,0 g Glucosa 20,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se utilizaron dos marcas comerciales PANREAC y SCHARLAU que contienen todos los ingredientes. Ambas marcas comerciales indican que para rehidratar el medio se disuelven 39 gramos en 1 litro de agua destilada y se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC. Luego de agitar se enfría hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. Material y Métodos 78 -Agar Sabouraud dextrosa (SAB) Composición: Peptona 10,0 g Glucosa 40,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se utilizó el agar Sabouraud de dos marcas comerciales PANREAC y MERCK, que contienen todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, ambas marcas comerciales indican que 65 gramos deben ser disueltos en un litro de agua destilada, se esteriliza durante 10 minutos a 118ºC. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar triptona soja con polisorbato 80 y lecitina (TSA) Composición: Triptona 15,0 g Peptona de soja 5,0 g Lactosa 10,0 ml Cloruro de sodio 5,0 g Polisorbato 80 5,0 g Lecitina 0,7 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Material y Métodos 79 Preparación: Se utilizó el agar comercial de MERCK, que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se mezclan 45,7 gramos con 1 litro de agua destilada y se esteriliza durante 15 minutos a 121ºC. Se enfría hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar extracto de levadura con sacarosa (YES) Composición: Extracto de levadura (DIFCO) 20,0 g Sacarosa 150,0 g Agar (PANREAC) 20,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se preparó la fórmula propuesta por Samson y col. (2000). Se pesan los componentes, se disuelven en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. -Agar extracto de levadura glucosa cloranfenicol (YGC) Composición: Extracto de levadura 5,0 g Glucosa 20,0 g Agar 15,0 g Agua destilada 1000,0 ml Material y Métodos 80 Preparación: Se utilizó el agar comercial MERCK que contiene todos los ingredientes. Para rehidratar el medio, se disuelven 38 gr en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Luego de esterilizar se añade 0,01% cloranfenicol, se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles 3.1.4.2. Medios de cultivo para crecimiento de especies xerófilas -Agar extracto de malta glucosa al 40% (MY40G) Composición: Extracto de malta 20,0 g Extracto de levadura (DIFCO) 20,0 g Glucosa 150,0 g Agar (PANREAC) 20,0 g Agua destilada 1000,0 ml Preparación: Se preparó la fórmula propuesta por Samson y col. (2000). Se pesan los componentes, se disuelven en un litro de agua destilada y se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. Material y Métodos 81 3.1.4.3. Medios de cultivo para la producción de aflatoxinas - Agar para la producción de aflatoxinas (APA) Composición: Sacarosa 24,0 g Fosfato amónico (NH4)H2PO4 (MERCK) 8,0 g Fosfato bipotásico (K2HPO4) (MERCK) 0,8 g Sulfato magnésico (MgSO4.7H2O) (MERCK) 0,82 g Cloruro potásico (KCl) (MERCK) 0,4 g Sulfato ferroso (FeSO4.7H2O) (MERCK) 0,0008 g Cloruro de mercurio (HgCl2) (MERCK) 0,112 g Licor de maíz (corn steep liquor) (SIGMA) 0,4 g Agar (PANREAC) 16,0 g Agua destilada 800,0 ml Preparación: Se preparó según la fórmula propuesta por Hara y col. (1974). Se pesan los componentes, se disuelven en 800 ml de agua destilada, se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Se deja enfriar hasta 50ºC aproximadamente y se distribuye asépticamente en placas estériles. Material y Métodos 88 3.1.9. Material para el análisis inmunoenzimático (ELISA) de aflatoxinas Material y aparatos - Espectrofotómetro SLT Spectra (ATOM) - Filtros de papel Whatman #4 (MILLIPORE) - Impresora LX-400 (EPSON) - Kit comercial aflatoxin B1 Transia Plate (DIFFCHAMB) Reactivos -Agua de calidad ultrapura Milli-Q (MILLIPORE) -Metanol, grado HPLC (MERCK) Patrones Diferentes concentraciones de disolución de aflatoxina B1: 0 ppb, 0,5 ppb, 1,5 ppb, 4,5 ppb, 13 ppb, 40,5 ppb, suministradas con el kit. Material y Métodos 89 3.1.10. Cepas fúngicas Fueron utilizadas 32 cepas, pertenecientes a 24 especies diferentes del género Aspergillus. Para los primeros estudios, se emplearon dos cepas representativas: una cepa aflatoxigénica de A. parasiticus, Speare (NRRL 2999), una cepa no aflatoxigénica de A. flavus, Link: Fries (NRRL 6538). Para los estudios de especificidad se aumentaron 2 cepas no aflatoxigénicas y 2 cepas aflatoxigénicas de Aspergillus sección Flavi, junto con 18 cepas Aspergillus spp. y 5 cepas de Ascomicetos (Eurotiun y Emericella), todas obtenidas de la Colección Española de Cultivos Tipo (Burjasot, Valencia). Adicionalmente, fueron utilizadas 2 cepas aflatoxigénicas y 1 cepa no aflatoxigénica de Aspergillus sección Flavi, pertenecientes a la colección de cultivos del Laboratorio de Higiene e Inspección de los Alimentos. Las cepas fueron elegidas en base a su habilidad de producir diversos metabolitos. En la tabla 7 se enumeran todas las cepas y los metabolitos secundarios que producen, además de su respuesta a las pruebas de aflatoxigenicidad. Material y Métodos 90 Tabla 7. Cepas de Aspergillus spp. utilizadas para los estudios, producción de aflatoxina y otros metabolitos secundarios Resp Resp Especie Cepa APA HPLCa Metabolitos A. aculeatus CECT 2968 - - A. awamori NRRL 3112 - - A. carbonarius NRRL 368 - - A. clavatus CECT 2673 - - A. flavus NRRL A-3537 - - blasticidina S A. flavus NRRL 6541 - - aflavarina, aflavininas A. flavus NRRL 6538 - - A. flavus NRRL 6540 + + aflatoxina B1, B2 A. flavus group LHICA 1316 + + aflatoxina B1, B2 A. flavus group LHICA 876 + + aflatoxina B1, B2 A. flavus group LHICA 893 - - A. fumigatus NRRL 1979 - - fumigacina, gliotoxina A. hennebergii NRRL 2801 - - A. niger NRRL 566 - - A. niger CECT 2915 - - A. ochraceus CECT 2917 - - ácido L-malico A. ochraceus NRRL 5220 - - ácido penicílico A. oryzae NRRL 1988 - - A. parasiticus NRRL 2999 + + aflatoxina B1, B2, G1, G2 A. parasiticus NRRL 3145 + + aflatoxina B1, B2, G1, G2 A. penicillioides CECT 2074 - - A. restrictus NRRL 4155 - - A. sclerotiorum CECT 2546 - - A. terreus CECT 2748 - - A. terreus NRRL 571 - - A. versicolor NRRL 573 - - Esterigmatocistina A. wentii NRRL 376 - - ácido gluconico, manitol, glicerol Em. corrugata CECT 2830 - - Em. nidulans CECT 2833 - - Eurot. herbariorum CECT 2922 - - auroglaucina, flavoglaucina Eurot. halophilicum CECT 2072 - - Eurot. tonophilum NRRL A-11464 - - Material y Métodos 91 3.1.11. Material para la obtención de fosforescencia a temperatura ambiente de aflatoxina B1 “in vitro” Material -Argon (AIR LIQUID) -Bomba peristáltica (SCHARLAU SCIENCE) -Celda de flujo de cuarzo (HELLMA) -Cubeta de fluorescencia de cuarzo (HELLMA) -Desecador -Mortero -Papel de filtro (WHATMAN) -Placa filtrante -Tamices (paso de malla 80 y 160 um) -Tuberías de bombeo (ELKAY) -Tuberías de teflón (SCHARLAB) -Viales topacio de 15-30 ml Disolventes -Acetonitrilo, grado HPLC (MERCK) -Agua de calidad ultrapura Milli-Q (MILLIPORE) -Etanol, grado HPLC (MERCK) -Metanol, grado HPLC (MERCK) Material y Métodos 92 Aditivos β-ciclodextrina (Roquette, Francia) Nº CAS: 7585-39-9 CAVASOL® W7 M (WACKER, Alemania) Nº CAS: 12446-36-6 Ciclohexano C6H12 Nº CAS: 110-82-7 Desoxicolato de sodio (SIGMA) Nº CAS: 302-95-4 Átomos pesados Acetato de cadmio C4H6CdO4 Nº CAS: 5743-04-4 Acetato de zinc (C4O2)2Zn Nº CAS: 557-34-6 Bromobenceno C6H5Br fenil-bromuro, bromobenzol Nº CAS: 108-86-1 Bromoetanol C2H5Br Nº CAS: 540-51-2 Carbonato de litio Li2CO3 Nº CAS: 554-13-2 Cloruro de aluminio Cl3Al Nº CAS: 7429-90-5 Material y Métodos 93 Cloruro de mercurio HgCl Nº CAS: 7487-94-7 Cloruro de terbio Cl3Tb Nº CAS: 10042-88-3 Cloruro de zinc ZnCl2 Nº CAS: 7648-85-7 Patrón de nitrato de europio Eu(NO3)3 1000 ppm en HNO 3 al 1% Nº CAS: 7440-53-1 Fluoruro de litio LiF Nº CAS: 7789-24-4 Patrón de nitrato de magnesio MgNO3 1000 ppm en HNO 3 al 1% Nº CAS: 13446-18-9 Oxalato de zinc (C2O4)2Zn Nº CAS: 4255-07-6 Yoduro de potasio KI Nº CAS: 7681-11-0 Desoxigenante Sulfito de sodio (Na2SO3) Nº CAS: 7631-90-5 Material y Métodos 94 Patrón Aflatoxina B1 Nº CAS: 1162-65-8 Preparación del patrón Se preparó una disolución madre de aflatoxina B1 disolviendo 1mg en 300 µl de acetonitrilo, se conservó a -18ºC durante 1 mes. Las disoluciones patrón de trabajo, se prepararon diariamente a partir de la disolución madre diluyéndolas con acetonitrilo, conservadas a -4ºC en viales topacio con tapón de rosca. Partículas adsorbentes y resinas de intercambio iónico Amberlita® IRC-50S Nº CAS: 81133-22-4 Amberlita® IRC-718 Nº CAS: 79620-28-3 Amberlita® XAD-2 Nº CAS: 9060-05-3 Amberlita® XAD-7 Nº CAS: 37380-43-1 Dowex® 1x2-100-200 Nº CAS: 60267-37-0 Dowex® 50Wx2-200 Nº CAS: 12617-37-2 Dowex® 50Wx4-200R Nº CAS: 12640-54-9 Material y Métodos 95 Dowex® 50Wx8-200 Nº CAS: 11119-57-8 Gel de sílice 70-140 µm, poro 25Å Nº CAS: 112926-00-8 Precursores de sol-gel TMOS Metil trimetilsilil éter Nº CAS: 1825-61-2 MTMOS Trimetoximetilsilano Nº CAS: 1185-55-3 Material y Métodos 96 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Precauciones durante el manejo de las micotoxinas y residuos peligrosos Debido a la toxicidad de las aflatoxinas y al riesgo de contaminación que implica su empleo en el laboratorio, es obligatorio tomar una serie de precauciones durante la manipulación de estas sustancias. Estas medidas de seguridad fueron establecidas desde los inicios del estudio de las aflatoxinas en los años sesenta (Fischbach y Campbell, 1965; Stoloff y Trager, 1965; Ciegler y Lillehoj, 1968) y son aplicadas actualmente en los laboratorios dedicados a su investigación (Trucksess y John, 1992). Durante la realización de este trabajo, todos los procedimientos que implicaban el manejo de las micotoxinas, por ejemplo, la preparación de las soluciones de trabajo, la contaminación de las matrices o el manejo de los extractos, se llevaron a cabo en una campana de extracción de gases y empleando guantes de látex. El material de vidrio que estuvo en contacto con las micotoxinas, era sumergido en una solución de lejía al 10% durante al menos una hora antes del lavado. Los viales utilizados para contener las soluciones patrón de aflatoxinas, se detoxificaron manteniéndolos sumergidos en lejía sin diluir (Yang, 1972; Natarajan y col., 1975). Todas las sustancias y solventes utilizados durante los ensayos analíticos, al igual que los residuos sólidos originados durante los ensayos microbiológicos fueron tratados como residuos peligrosos, siguiendo las definiciones de la Directiva 78/319/EEC. 3.2.2. Preparación de los inóculos Las 32 cepas fúngicas liofilizadas fueron cultivadas en medio de reanimación durante el tiempo recomendado por el proveedor (CECT). Material y Métodos 97 Transcurrido este tiempo, las cepas fueron cultivadas para producir esporas, de acuerdo a las mejores condiciones consultadas en la bibliografía (Samson y col., 2000) para cada microorganismo. Se preparó una suspensión de esporas, depositando asépticamente el agar cubierto de esporas en una bolsa de Masticator® y añadiendo 10 ml de solución salina estéril de Tween 80® . Seguidamente la bolsa se agitó cuidadosamente, permitiendo que se desprenda solamente la superficie de las colonias y a continuación se fraccionó la suspensión en tubos eppendorf estériles (0,5 ml), cada uno de los cuales estaba destinado para un solo uso. Se conservaron los tubos con esta suspensión stock a 4ºC durante un periodo máximo de 3 meses. 3.2.3. Métodos para la confirmación de la producción de aflatoxinas por parte de las cepas utilizadas 3.2.3.1. Método microbiológico Para determinar la capacidad de producir aflatoxinas por parte de las 32 cepas de Aspergillus spp., utilizadas, estas se sembraron en los medios APA, CAM y YES y se incubaron a 28ºC durante 10 días. Las colonias sembradas en los medios APA y CAM fueron observadas bajo luz UV, cada día, durante diez días, para observar la presencia o ausencia de fluorescencia verde-azulada en las zonas del agar que rodeaban a las colonias como indicativo de la producción de aflatoxinas. 3.2.3.2. Método cromatográfico Las colonias cultivadas en medio YES de la forma descrita en el apartado anterior, fueron extraídas con cloroformo, al séptimo y décimo día Material y Métodos 104 3.2.9. Métodos para la identificación de cepas aflatoxigénicas en los medios de cultivo estudiados 3.2.9.1. En medio de cultivo con ciclodextrina y desoxicolato de sodio (MACD) Las placas sembradas en el medio de cultivo MACD fueron examinadas al quinto día de incubación. La reacción entre las aflatoxinas, la ciclodextrina y el desoxicolato de sodio hace que alrededor de la colonia se forme un halo beige y si se examina bajo luz UV (365 nm) las zonas del agar que rodean a las colonias emiten fluorescencia verde-azulada. Las colonias de Aspergillus spp. que presentaban esta característica fueron consideradas positivas. 3.2.9.2. A partir de los medios de cultivo MA y SAB Al quinto día de incubación y una vez identificada una colonia del género Aspergillus por sus características morfológicas mediante análisis microscópico, se aisló en los medios APA, YES y MACD para conocer su capacidad aflatoxigénica y se incubó a 28ºC durante 3-10 días. Las colonias sembradas en el medio MACD fueron examinadas bajo luz UV, al segundo y tercer día de incubación, mientras que las colonias sembradas en el medio APA fueron analizadas de la manera descrita en el apartado 3.2.3.. Las colonias sembradas en el medio YES fueron extraídas con cloroformo de la manera descrita el apartado 3.2.10.1., al séptimo y décimo día de incubación, para la confirmación cromatográfica de la presencia de aflatoxinas mediante RP-HPLC/fluorescencia en el sistema descrito en el apartado 3.2.11.. Material y Métodos 105 3.2.10. Métodos de extracción y purificación de aflatoxinas 3.2.10.1. Extracción y purificación de aflatoxinas de medios de cultivo Se procedió a la extracción de las aflatoxinas utilizando el procedimiento descrito por Fente y col. (2001), el cual consiste en depositar el contenido de las placas cultivadas en una bolsa de Masticator® protegida por otras dos a la que se añaden 20 ml (10 ml x 2) de cloroformo. Posteriormente, la mezcla agar-cloroformo se homogeneiza en el Masticator® durante 4 minutos, después de los cuales, la fase clorofórmica se filtra en papel Whatman No. 3 sobre sulfato de sodio anhidro. Los extractos se concentran en un evaporador, a una temperatura máxima de 40ºC y se conservan, en congelación, en viales topacio con tapón de rosca para su análisis posterior, en los casos en que no fuera posible realizar la determinación cromatográfica el mismo día de la extracción. Los extractos provenientes de los medios de cultivo con ciclodextrinas no necesitaron purificación previa a la determinación cromatográfica adecuada, en cambio los extractos de medios que contenían desoxicolato de sodio en su composición, precisaron una filtración antes de ser inyectados al sistema RP-HPLC que se describe en el apartado 3.2.11.. 3.2.10.2. Extracción y purificación de aflatoxinas de especias, piensos y materias primas por diálisis difásica Las aflatoxinas fueron extraídas y purificadas de las muestras de piensos y materias primas con una adaptación del método descrito por Jaimez (2001). Para la extracción se pesaron 25 gramos de cada muestra, previamente triturada y homogenizada, en un matraz balón topacio, de fondo plano. Se agregaron 100 ml de metanol-agua (85+15) y se agitó Material y Métodos 106 manualmente hasta que no se observaron grumos. Se colocó una membrana de diálisis llena con 20 mililitros de cloroformo, de la manera indicada en la figura 6 y los matraces se agitaron 1 hora en un agitador-incubador orbital a 25ºC. Al cabo de este tiempo se recuperó la fracción clorofórmica en un tubo color topacio y se evaporó a sequedad en corriente de nitrógeno. Cloroformo Se llena la cápsula fabricada a partir de membrana dializante con cloroformo Al mismo tiempo se prepara un matraz erlenmeyer con el pienso y MeOH:H2O (85:15) A.- B.- Pienso Se introduce en el matraz la cápsula conteniendo el cloroformo El matraz con la cápsula se coloca en el agitador y se somete a agitación durante el tiempo, temperatura y r.p.m. pertinentes D.- Se vierte la fase orgánica en un tubo de ensayo El extracto orgánico se evapora a sequedad Fase orgánica Cloroformo Se llena la cápsula fabricada a partir de membrana dializante con cloroformo Al mismo tiempo se prepara un matraz erlenmeyer con el pienso y MeOH:H2O (85:15) A.- B.- Pienso Se introduce en el matraz la cápsula conteniendo el cloroformo El matraz con la cápsula se coloca en el agitador y se somete a agitación durante el tiempo, temperatura y r.p.m. pertinentes D.- Se vierte la fase orgánica en un tubo de ensayo El extracto orgánico se evapora a sequedad Fase orgánica Figura 6. Esquema del procedimiento seguido para llevar a cabo la extracción por diálisis difásica. Material y Métodos 107 En el caso de que los pigmentos presentes en las muestras atravesaban la membrana de diálisis, el extracto se redisolvió en 3 ml de diclorometano para su posterior purificación. La purificación se llevó a cabo según del método descrito por Jaimez (2001): utilizando cartuchos Sep-Pak C18 (WATERS), los cuales se colocaron en un sistema de vacío múltiple manifold (WATERS), a 1 atmósfera de presión y se acondicionaron con 3 ml de hexano seguidos de 3 ml de diclorometano. Una vez acondicionados los cartuchos, se agregaron los extractos redisueltos en diclorometano. Los matraces que contenían los extractos se lavaron con dos porciones de 2 ml de diclorometano, y ambas porciones se agregaron al cartucho. Para el lavado de los cartuchos, se utilizaron 3 ml de hexano seguidos de 3 ml de dietil éter y 3 ml de diclorometano. Las aflatoxinas se eluyeron con 3 porciones de 3 ml de cloroformo-acetona (9+1). Los eluatos se evaporaron a sequedad en corriente de nitrógeno, a una temperatura máxima de 40ºC. Una vez purificados, los extractos fueron inyectados al sistema RPHPLC que se describe en el apartado 3.2.11.. 3.2.10.3. Extracción de aflatoxina B1 para su determinación por el método ELISA La extracción de la aflatoxina B1 se llevó a cabo siguiendo el protocolo del kit comercial utilizado para su determinación: en una bolsa de Masticator®, se pesaron 2 gramos de la muestra previamente triturada y homogenizada con un molinillo de café, y se le agregaron 10 ml de una mezcla metanol-agua (70+30) a temperatura ambiente. La suspensión anterior se homogenizó durante 3 minutos en un agitador y posteriormente se filtró con filtros Whatman No.1. El filtrado se recolectó en viales plásticos y se mantuvo refrigerado y a resguardado de la luz hasta su utilización para el análisis inmunoenzimático. Material y Métodos 108 3.2.11. Método cromatográfico RP-HPLC con detección fluorescente para confirmación de la producción de aflatoxinas Los extractos fueron redisueltos en 200 µl de fase móvil y volúmenes de 50 µl fueron inyectados al sistema RP-HPLC-detección fluorescente propuesto por Cepeda y col., (1996) con ligeras modificaciones: la fase móvil consistió en una mezcla de metanol-agua (50:50, v/v), previamente filtrada y desgasificada, a un flujo de 0,5 ml/min, el detector de fluorescencia fue ajustado a una λex = 365 nm y una λem = 415 nm. El orden de elución de las aflatoxinas utilizando este sistema fue AFG2-AFG1-AFB2-AFB1. 3.2.12. Metodología para la obtención de fosforescencia a temperatura ambiente de aflatoxina B 1 “in vitro” 3.2.12.1. Instrumentación Las medidas de fosforescencia fueron llevadas a cabo empleando un luminómetro Perkin Elmer LS50B provisto de una lámpara pulsada de Xe como fuente de excitación, el cual posee como interfase un PC dotado del software WINLAB. Para la realización de medidas fosforescentes es necesario seleccionar un tiempo de demora (td, transcurrido desde el apagado de la lámpara hasta el comienzo de la adquisición de la señal) suficientemente elevado (mínimo de 0,04 ms) para asegurar que tanto las posibles emisiones fluorescentes de la muestra como la luz de la fuente de excitación y haces de luz dispersa no lleguen al detector. Por otro lado, es necesario seleccionar una ventana temporal de medida (tg) de modo que se asegure la adquisición de la emisión fosforescente durante todo su decaimiento. Material y Métodos 109 3.2.12.2. Métodos para obtención de RTP en disolución (F-RTP) 3.2.12.2.1. Fosforescencia inducida por átomo pesado (HAI-RTP) Preparación de disoluciones: - Aflatoxina B1 0,01M disuelta en acetonitrilo - Disolución acuosa de KI concentración 4M - Disolución acuosa de Na2SO3 concentración 0,25M - Bromobenceno en presentación original (conc. 9,5M) - Bromoetanol en presentación original (conc. 13,44M) Ensayo 1: Utilizando las disoluciones indicadas arriba, se prepararon 18 disoluciones acuosas en matraces aforados de 5 ml conteniendo concentraciones variables de AFB1 (10-4 y 10-7 M), KI (1, 1,5 y 2 M) como fuente externa de átomo pesado y Na2SO3 (5, 25 y 50 mM) añadido en último lugar como agente desoxigenante. Las disoluciones fueron agitadas y al cabo de 5 minutos de reposo se trasvasaron 3,5 ml de cada mezcla a la cubeta de medida, que debía permanecer tapada para evitar la entrada de oxígeno durante las medidas. Ensayo 2: Siguiendo la metodología del ensayo descrito anteriormente se sustituyó el KI por otras fuentes de átomo pesado añadidas en las siguientes concentraciones: terbio (1 mM y 2,5 mM), bromoetanol 0,2 M y bromobenceno 0,15 M. Material y Métodos 110 3.2.12.2.2. Fosforescencia en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP) Preparación de disoluciones: - Aflatoxina B1 disuelta en acetonitrilo conc. 0,01M - Disolución acuosa de KI concentración 4M - Disolución acuosa de Na2SO3 concentración 0,25M - Disolución acuosa de ciclodextrina CAVASOL® conc. 0,24M - Disolución acuosa de β -ciclodextrina concentración 0,24M - Bromoetanol en presentación original (conc. 13,44M) - Ciclohexano en presentación original (líquido) Ensayo 3: Utilizando los reactivos indicados arriba, se prepararon 8 disoluciones acuosas en matraces aforados de 5 ml conteniendo concentraciones variables de AFB1 (10-4 y 10-7 M) y β-ciclodextrina o βhidroximetil-ciclodextrina (CAVASOL®) (3 y 6 mM), así como bromoetanol 0,2 M como fuente de átomo pesado. En primer lugar se mezcló la AFB1 con una de las ciclodextrinas y la mezcla resultante se dejó reposar protegida de la luz durante una noche, para favorecer la formación del complejo de inclusión AFCD. Al cabo de este tiempo se añadió el bromoetanol y las mezclas se enrasaron con agua. Tras agitar y después de 5 minutos de reposo 3,5 ml de cada mezcla fueron trasvasados a la cubeta de medida, que permaneció tapada mientras se obtuvieron los espectros de emisión. Material y Métodos 111 Ensayo 4: El bromoetanol fue sustituido por KI (1, 1,5 y 2 M) como fuente de externa de átomo pesado y se realizó la desoxigenación química con Na2SO3, que fue añadido siempre en último lugar, en cantidad suficiente para obtener concentraciones finales de 5, 25 y 50 mM. Ensayo 5: Paralelamente a los ensayos 3 y 4, se realizaron medidas de fosforescencia añadiendo 3 µl de ciclohexano a las mezclas finales una vez depositadas en la cubeta de medida. 3.2.12.2.3. Fosforescencia en medio micelar (MS-RTP) Preparación de disoluciones: - Aflatoxina B1 disuelta en acetonitrilo conc. 0,01M - Cavasol CD solución acuosa de concentración 0,25M - NaDC solución acuosa de concentración 0,1M - Disolución acuosa de KI concentración 4M - Disolución acuosa de Na2SO3 concentración 0,25M Ensayo 6: Utilizando los reactivos indicados arriba, se prepararon 18 disoluciones acuosas en matraces aforados de 5 ml, conteniendo concentraciones variables de AFB1 (10-4 y 10-7 M), KI (1, 1,5 y 2 M), desoxicolato de sodio 6 mM (concentración mayor a la cmc = 4 mM) y Na2SO3 (5, 25 y 50 mM), añadido siempre en último lugar. Tras agitar y después de 5 minutos de reposo, 3,5 ml de cada mezcla fueron trasvasados a la cubeta de medida, que permaneció tapada mientras se obtuvieron los espectros de emisión. Material y Métodos 112 3.2.12.2.4. Fosforescencia en disolución de ciclodextrina con desoxicolato de sodio Preparación de disoluciones: - Aflatoxina B1 disuelta en acetonitrilo conc. 0,01M - Cavasol CD solución acuosa de concentración 0,25M - NaDC solución acuosa de concentración 0,1M - Disolución acuosa de KI concentración 4M - Disolución acuosa de Na2SO3 concentración 0,25M - Bromoetanol en presentación original (conc. 13,44M) Ensayo 7: Utilizando las disoluciones indicadas arriba, se prepararon 6 disoluciones acuosas en matraces aforados de 5 ml, conteniendo concentraciones variables de AFB1 (10-4 y 10-7M), CAVASOL® 0,3% (0,0023 M), NaDC 0,6% (0,015 M) y Na2SO3 (5, 25 y 50 mM), añadido siempre en último lugar. Tras agitar y después de 5 minutos de reposo, 3,5 ml de cada mezcla fueron trasvasados a la cubeta de medida, que permaneció tapada mientras se obtuvieron los espectros de emisión. Ensayo 8: Alternativamente, se realizó el mismo ensayo anterior trabajando con desoxicolato de sodio 6 mM (concentración mayor a la c.m.c.) y CAVASOL® 3 y 6 mM. Ensayo 9: Asimismo, se repitieron los ensayos 7 y 8 adicionando fuentes externas de átomo pesado: KI 1 y 2 M y bromoetanol en concentración final 0,2 M. Los espectros de emisión RTP correspondientes a los apartados 3.2.12.2.1 a 3.2.12.2.4 (ensayos 1-9) se obtuvieron variando las condiciones instrumentales dentro de los siguientes rangos: Material y Métodos 113 λex: 350 – 370 nm λem: 400 – 700 nm td = 0,04 – 0,08 ms tg = 1 - 3 ms Rendijas: Exitación: 10 – 20 nm Emisión: 15 – 20 nm 3.2.12.3. Métodos para obtención de fosforescencia a temperatura ambiente en soporte sólido (SS-RTP) 3.2.12.3.1. Ensayos en papel de filtro Preparación de disoluciones: - Aflatoxina B1 disuelta en acetonitrilo conc. 0,01M - Cavasol CD solución etanólica de concentración 0,25M - NaDC solución etanólica de concentración 0,1M - Disoluciones etanólicas de AlCl3, ZnCl2,Mg(NO3)2 (CH3COO)2Cd, y HgCl concentración 0,3 ug/ml - Disoluciones acuosas de AlCl3, ZnCl2,Mg(NO3)2, (CH3COO)2Cd, HgCl, Li2CO3,, Cl3Tb, KI y LiF concentración 0,3 ug/ml - Bromoetanol en presentación original (conc. 13,44M) Ensayo 10: Se cortaron tiras de papel de filtro Watman nº4 del tamaño de un soporte de acrílico diseñado para adaptarse al portacubetas del luminómetro (0,8cm x 1,3cm). Posteriormente las tiras fueron acondicionadas con el fin de eliminar la humedad que pudieran contener, por medio de evaporación, en una estufa a 60 - 80ºC durante una noche. 216 Tabla 50. Géneros fúngicos encontrados en alimentos étnicos en los tres medios empleados. GENERO MP % MP % MP % MP % Penicillium 1 4,35 1 4,35 0 0 0,67 2,90 Aspergillus spp. 11 47,83 10 43,48 2 8,70 7,67 33,33 Aspergillus flavus 12 52,17 11 47,83 4 17,39 9 39,13 Aspergillus niger 28,7000000,672,90 Eurotrium 2 8,70 2 8,70 1 4,35 1,67 7,25 Mucor 00000000 Rizophus 2 8,70 4 17,39 0 0 2,00 8,70 Cladosporium 6 26,09 4 17,39 1 4,35 3,67 15,94 Fusarium 14,3500000,331,45 Alternaria 00000000 Geotrichum 00000000 M icelia sterilia 8 34,78 7 30,43 5 21,74 6,67 28,99 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA 217 Tabla 51. Géneros fúngicos encontrados en frutos secos en los tres medios empleados. GENERO MP%MP%MP%MP% Penicillium 9 69,23 5 38,46 6 46,15 6,67 51,28 Aspergillus spp. 11 84,62 11 84,62 10 76,92 10,67 82,05 Aspergillus flavus 8 61,54 2 15,38 2 15,385 4 30,77 Aspergillus niger 4 30,77 2 15,38 0 0 2 15,38 Eurotrium 1 7,69 0 0 0 0 0,33 2,56 Mucor 0 0 2 15,38 0 0 0,67 5,13 Rizophus 5 38,46 3 23,08 0 0 2,67 20,51 Cladosporium 9 69,23 3 23,08 5 38,46 5,67 43,59 Fusarium 3 23,08 3 23,08 2 15,38 2,67 20,51 Alternaria 0 0 3 23,08 2 15,38 1,67 12,82 Geotrichum 1 7,69 1 7,69 0 0 0,67 5,13 Micelia sterilia 11 84,62 10 76,92 7 53,85 9,33 71,79 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA 218 Tabla 52. Géneros fúngicos encontrados en frutos desecados en los tres medios empleados. GENERO MP % MP % MP % MP % Penicillium 1 10 2 20 1 10 1,33 13,33 Aspergillus spp. 440440770550 Aspergillus flavus 660550110440 Aspergillus niger 2 20 2 20 0 0 1,33 13,33 Eurotrium 00000000 Mucor 22000000,676,67 Rizophus 4 40 2 20 0 0 2 20 Cladosporium 8 80 7 70 1 10 5,33 53,33 Fusarium 3 30 2 20 0 0 1,67 16,67 Alternaria 00000000 Geotrichum 0 0 2 20 0 0 0,67 6,67 M icelia sterilia 7 70 8 80 4 40 6,33 63,33 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA 219 Tabla 53. Géneros fúngicos encontrados en especias en los tres medios empleados. GENERO MP % MP % MP % MP % Penicillium 7 29,17 6 25 7 29,17 6,67 27,78 Aspergillus spp. 10 41,67 10 41,67 10 41,67 10 41,67 Aspergillus flavus 22 91,67 9 37,5 12 50 14,33 59,72 Aspergillus niger 13 54,17 9 37,5 3 12,5 8,33 34,72 Eurotrium 1 4,17 0 0 0 0 0,33 1,39 Mucor 2 8,33 5 20,83 0 0 2,33 9,72 Rizophus 10 41,67 8 33,33 0 0 6 25 Cladosporium 13 54,17 10 41,67 2 8,33 8,33 34,72 Fusarium 4 16,67 1 4,17 1 4,17 2,00 8,33 Alternaria 1 4,17 0 0 0 0 0,33 1,39 Geotrichum 1 4,17 3 12,5 1 4,17 1,67 6,94 M icelia sterilia 12 50 9 37,5 6 25 9,00 37,50 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA 220 Tabla 54. Géneros fúngicos encontrados en muestras de té en cada uno de los tres medios empleados. GENERO MP % MP % MP % MP % Penicillium 4 28,57 3 21,43 4 28,57 3,67 26,19 Aspergillus spp. 11 78,57 10 71,43 9 64,29 10 71,43 Aspergillus flavus 9 64,29 12 85,71 4 28,57 8,33 59,52 Aspergillus niger 11 78,57 8 57,14 1 7,14 6,67 47,62 Eurotrium 0 0 0 0 2 14,29 0,67 4,76 Mucor 6 42,86 2 14,29 0 0 2,67 19,05 Rizophus 7 50 8 57,14 0 0 5 35,71 Cladosporium 5 35,71 2 14,29 0 0 2,33 16,67 Fusarium 00000000 Alternaria 00000000 Geotrichum 00000000 Micelia sterilia 5 35,71 4 28,57 5 35,71 4,67 33,33 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA 221 Tabla 55. Géneros fúngicos encontrados en alimentos variados en los tres medios empleados. GENERO MP % MP % MP % MP % Penicillium 1 12,50 0 0 1 12,50 0,67 8,33 Aspergillus spp. 6 75 5 62,50 6 75 5,67 70,83 Aspergillus flavus 4 50 3 37,50 3 37,50 3,33 41,57 Aspergillus niger 00000000 Eurotrium 1 12,5 1 12,5 0 0 0,67 8,33 Mucor 2 25 1 12,50 0 0 1 12,50 Rizophus 00000000 Cladosporium 4 50 3 37,50 0 0 2,33 29,17 Fusarium 1 12,5 0 0 0 0 0,33 4,17 Alternaria 00000000 Geotrichum 0 0 1 12,5 0 0 0,33 4,17 Micelia sterilia 3 37,50 4 50 1 12,50 2,67 33,33 MP: Muestras positivas a cada género fúngico SAB MA MACD MEDIA Resultados y Discusión 222 4.6.2.4. Capacidad aflatoxigénica de las cepas de Aspergillus flavus La contaminación de los alimentos (tanto para consumo humano como animal) por mohos, siempre es indeseable, ya que la presencia de géneros fúngicos potencialmente toxigénicos, independientemente del nivel, siempre puede causar problemas de toxicidad debidos a la producción de micotoxinas. En este sentido, se ha comprobado que niveles muy bajos de contaminación (10-1) por Aspergillus spp., han sido capaces de producir grandes cantidades de aflatoxinas, si las condiciones ambientales son favorables para ello (Sharma y col., 1980; Karunaratne y Bullerman, 1990). Se realizó la identificación de las cepas aflatoxigénicas de Aspergillus spp. aisladas a partir de las placas sembradas, por dos métodos, uno el método microbiológico descrito en el apartado 3.2.9. y el otro fue el método de extracción descrito en el apartado 3.2.10.1. para la posterior detección cromatográfica en el sistema descrito en el apartado 3.2.11.. En cuanto a los resultados, cabe apuntar que a partir del medio SAB se aisló la mayor cantidad de cepas de Aspergillus flavus, un total de 61, entre las cuales 22 cepas mostraron capacidad aflatoxigénica lo que representa un 36%. En el medio MA, se desarrollaron mejor las cepas con capacidad aflatoxigénica, porque de un total de 42 colonias aisladas de A. flavus resultaron positivas 23, representando un 55%. A partir del medio MACD se obtuvo un porcentaje similiar al medio SAB (38,5%), sin embargo, en este medio, en cuanto a número se aislaron menos cepas de A. flavus, solamente 26, siendo positivas 10. Este resultado ha sido considerado coherente, teniendo en cuenta que en el medio MACD la micoflora no alcanza un desarrollo equiparable a los otros dos medios, debido al NaDC que es un inhibidor de crecimiento. Estos resultados están representados en las tablas 56 y 57. Resultados y Discusión 223 Tabla 56. Capacidad aflatoxigénica de las cepas de Aspergillus flavus aislados de los 3 medios de cultivo. tipo de alimento ALIM. ETNICOS FRUTOS SECOS FRUTOS DESECADOS ESPECIAS TES VARIOS TOTALES 3/3 23/42 4/4 22/61 1/4 1/2 0/1 4/12 3/4 1/3 10/26 3/9 8/12 1/2 5/11 4/22 4/9 4/12 4/8 3/6 3/5 SAB (+)/Totales aisladas (+)/Totales aisladas (+)/Totales aisladas MA MACD La capacidad aflatoxigénica de las colonias de Aspergillus flavus que se desarrollaron en el medio MACD se comprobó directamente en la placa por la presencia de halo beige alrededor de las colonias así como la fluorescencia del mismo como se muestra en la figura 34. Resultados y Discusión 224 Figura 34. a) Examen a simple vista de la placa de siembra de una muestra de orégano en el medio de cultivo MACD, donde existe una colonia aflatoxigénica que presenta un halo beige, el cual no está presente alrededor de las otras colonias. b) Examen de la misma placa con una lámpara de luz UV, se observa que el anillo beige exhibe una fluorescencia que no exhiben las otras colonias. Debido a que los grupos de alimentos no son del mismo tamaño, los resultados de los porcentajes son más representativos para ver cual de ellos contiene mayor numero de cepas con capacidad aflatoxigénica (tabla 57). Tabla 57. Porcentajes de cepas aflatoxigénicas presentes en los alimentos en los medios de cultivo empleados. tipo de alimento ALIM. ETNICOS FRUTOS SECOS FRUTOS DESECADOS ESPECIAS TES VARIOS 44 67 75 100 100 75 50 60 0 18 33 33 33 45 25 50 50 50 SAB% MA% MACD% En los alimentos variados, donde se encuentran los panes, sésamo, arroz y aperitivos a base de galletas y frutos secos, el 100% de la cepas de Resultados y Discusión 225 Aspergillus flavus aisladas de los medios SAB y MA, han mostrado capacidad aflatoxigénica. Se tienen datos anteriores sobre la presencia de aflatoxinas en arroz (Manabe y col., 1978), harinas (Cutuli de Simón, 1983; Tutelyan, 1989; Abouzied, 1991; Midio, 2001) y cacahuetes (Manabe, 1978; Francis, 1982; Dorner, 1988; Tutelyan, 1989; Sharman, 1990; Azer, 1991; Roch, 1992; Wood, 1992; Taguchi, 1995; Shatzki 1998; Ali, 1999; Neal 2001). Corroborando lo dicho sobre los cacahuetes en el grupo de los frutos secos se obtuvo también un alto porcentaje de cepas aflatoxigénicas (un 50% en los tres medios SAB, MA y MACD) y contamos también con publicaciones donde se habla de la aparición de aflatoxinas en almendras (Shade, 1981; Tutelyan, 1989; Ahmed, 1998; Ong, 2000) y nueces (Pitt, 1994). También en los frutos desecados la mayoría de las cepas de A. flavus aisladas resultaron productoras de aflatoxinas, encontrándose incluso, un mayor porcentaje que los frutos secos (60%) cuando fueron cultivadas en el medio MA. El medio de cultivo MACD ha mostrado la misma efectividad que los otros dos medios MA y SAB en el caso de los frutos secos y las especias, en el caso de las infusiones ha funcionado mejor que los medios de uso habitual para la detección de cepas aflatoxigénicas, en donde el 75% de las cepas aisladas han desarrollado esta capacidad. La prueba χ2 para un nivel de confianza del 95% y 5 grados de libertad, demostró que no existen diferencias significativas entre el número de cepas de A. flavus que han resultado aflatoxigénicas aisladas de los medios de cultivo SAB y MA, y al igual que en las pruebas anteriores el nuevo medio no resulta comparable con los medios usados como referencia. 232 Tabla 59. Recuento de mohos, levaduras y recuento total (log ufc/g) en muestras de materias primas en el medio de cultivo MACD al quinto día de incubación a 28ºC. tipo de alimento Min Max Med SD Min Max Med SD Min Max Med SD H.soja (n=3) 3,78 6,52 4,97 1,40 4,62 6,24 5,34 0,82 5,20 6,70 5,73 0,85 Cebada (n=3) 4,56 6,44 5,77 1,05 5,46 6,24 5,91 0,41 0,41 6,24 4,19 3,28 Cebad molid (n=4) 0 5,994,172,804,325,895,270,745,57 6 5,850,19 S. algodón (n=9) 4,06 5,79 4,93 0,70 0 6,37 3,86 2,35 4,15 6,47 5,23 0,77 Maíz grano (n=7) 5,43 6,46 5,94 0,36 0 6,85 3,50 3,32 5,57 6,91 6,23 0,51 Maíz molido (n=6) 0 6,40 4,90 2,55 0 7 5,12 2,67 0 7 3,70 2,47 Mohos Levaduras Total Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar Resultados y Discusión 233 A cuatro (12,25 %) de las 32 muestras de materias primas, no se les detectó la presencia de mohos, mientras que en todas las muestras restantes se detectó la presencia conjunta de mohos y de levaduras. En general, los recuentos totales de las muestras, fueron un reflejo del grado de contaminación por levaduras pues en la mayoría de los casos, los recuentos para levaduras fueron mayores o iguales que los recuentos para mohos. El grado de contaminación fúngica en granos y cereales almacenados y en piensos, puede utilizarse como una medida de la calidad de las condiciones de almacenamiento (temperatura y grado de humedad adecuados, etc.) a las que han estado sometidas. Así, los piensos o granos con bajos recuentos fúngicos (101-103 ufc/g), pueden considerarse de mejor calidad y más seguros, que aquellos con recuentos más altos (106 ufc/g) (Karunaratne y col., 1990). La contaminación de los alimentos (tanto para consumo humano como animal) por mohos, siempre es indeseable, ya que la presencia de géneros fúngicos potencialmente toxigénicos, independientemente del nivel, siempre puede causar problemas de toxicidad debidos a la presencia de micotoxinas. En este sentido, se ha comprobado que niveles muy bajos de contaminación (10-1) por Aspergillus spp., han sido capaces de producir grandes cantidades de aflatoxinas, si las condiciones ambientales son favorables para ello (Sharma y col., 1980; Karunaratne y Bullerman, 1990). Generalmente, la producción de micotoxinas no ocurre sin el crecimiento del moho productor. Por otra parte, la presencia de hongos micotoxigénicos en determinado producto no indica automáticamente la presencia de micotoxinas, especialmente si el crecimiento no ha ocurrido. Sin embargo, las toxinas pueden persistir mucho después de que el crecimiento vegetativo haya ocurrido y los mohos hayan muerto (Bullerman y col., 1984). Resultados y Discusión 234 RECUENTO DE LEVADURAS EN MACD 0 20 40 60 80 100 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc/g % h soja cebada cebada molida s. algodón maiz grano maiz molido Figura 38 RECUENTO DE MOHOS EN MACD 0 20 40 60 80 100 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc % h soja cebada cebada molida s. algodón maiz grano maiz molido Figura 39 Resultados y Discusión 235 RECUENTO TOTAL EN MACD 0 20 40 60 80 100 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc/g % h soja cebada cebada molida s. algodón maiz grano maiz molido Figura 40 4.6.3.3. Comparación entre los resultados obtenidos utilizando el nuevo medio MACD y el medio SAB 4.6.3.3.1. Comparación de los recuentos en muestras de alimentos concentrados para ganado vacuno En las tablas 60, 61 y 62 se muestran los valores de los recuentos de mohos, de levaduras y totales obtenidos para las muestras de piensos y mezclas, cultivadas en los medios MACD y SAB. Al igual que se hizo en el apartado de los alimentos comercializados en Galicia, para determinar si estos resultados diferían significativamente, se analizaron los datos mediante la prueba “t” para datos pareados. En las figuras 41, 42 y 43 se muestran los porcentajes de los recuentos de mohos, levaduras y totales respectivamente, obtenidos en el medio de cultivo SAB, dentro de cada categoría establecida según la Resultados y Discusión 236 cantidad de microorganismos presentes (log ufc/g) en las muestras analizadas. No se observaron diferencias significativas para un intervalo de confianza del 95%, entre los recuentos totales obtenidos con los medios MACD y SAB, por lo que se puede inferir que el medio MACD podría sustituir a un medio de recuento tradicional, para el análisis de muestras de alimentos para animales de granja, con la ventaja de permitir la identificación simultánea de cepas aflatoxigénicas. Tabla 60. Recuento de mohos (log ufc/g) en muestras de alimentos concentrados, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. Recuento de mohos tipo de alimento Min Max Med SD Min Max Med SD Piensos (n=9) 3,30 5,66 4,59 0,75 0 5,71 4,51 1,81 Mezclas (n=12) 4,60 5,95 5,42 0,40 4,95 6,14 5,44 0,32 Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar MACD SA B Tabla 61. Recuento de levaduras (log ufc/g) en muestras de alimentos concentrados en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. Recuento de levaduras tipo de alimento Min Max media SD Min Max media SD Piensos (n=9) 0 6,82 4,55 2,67 0 6,53 3,25 3,10 Mezclas (n=12) 3,78 6,78 5,54 0,84 5 6,48 5,88 0,48 Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar MACD SA B Resultados y Discusión 237 Tabla 62. Recuento total (log ufc/g) de mohos y levaduras en muestras de alimentos concentrados en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. Recuento total tipo de alimento Min Max media SD Min Max media SD Piensos (n=9) 3,30 6,82 5,66 1,07 0 6,54 4,96 2,04 Mezclas (n=12) 5,11 6,79 5,93 0,53 5,55 6,51 6,10 0,30 Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar MACD SA B RECUENTO DE LEVADURAS EN SAB 0 20 40 60 80 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc/g % piensos mezclas Figura 41 Resultados y Discusión 238 RECUENTO DE MOHOS EN SAB 0 20 40 60 80 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc/g % piensos mezclas Figura 42 RECUENTO TOTAL EN SAB 0 20 40 60 80 <2 2-2,9 3-3,9 log ufc/g % piensos mezclas Figura 43 Resultados y Discusión 239 4.6.3.3.2. Comparación de los recuentos en muestras de materias primas En las tablas 63, 64 y 65 se comparan los valores de los recuentos de mohos, de levaduras y totales obtenidos para las muestras de materias primas, cultivadas en los medios MACD y SAB. Para determinar si estos recuentos diferían significativamente entre si, los datos se analizaron mediante la prueba “t” para datos pareados. No se observaron diferencias significativas para un nivel de significación de 0,05 (intervalo de confianza de 95%) entre los resultados de recuentos obtenidos con los dos medios de cultivo. En las figuras (44, 45 y 46) se muestran los porcentajes de los recuentos de mohos, levaduras y totales, en el medio de cultivo SAB, dentro de cada categoría establecida según la cantidad de microorganismos presentes (log ufc/g) en las muestras analizadas. 240 Tabla 63. Recuento de levaduras (log ufc/g) en muestras de materias primas en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. Recuento de levaduras tipo de alimento Min Max Med SD Min Max Med SD H.soja (n=3) 4,62 6,24 5,34 0,82 0 5,24 3,39 2,9407 Cebada (n=3) 5,46 6,24 5,91 0,41 0 6,28 3,92 3,4205 Cebada molid (n=4) 4,32 5,89 5,27 0,74 0 5,32 3,85 2,57 S. algodón (n=9) 0 6,373,862,354,816,315,480,55 Maíz grano (n=7) 0 6,85 3,50 3,32 0 6,95 4,47 3,15 Maíz molido (n=6) 0 7 5,12 2,67 3 7,29 5,77 1,54 MACD SA B Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar 241 Tabla 64. Recuento de mohos (log ufc/g) en muestras de materias primas, en los medios de cultivo MACD y SAB, al quinto día de incubación a 28ºC. Recuento de mohos tipo de alimento Min Max Med SD Min Max Med SD H. soja (n=3) 3,78 6,52 4,97 1,40 4,40 5,76 5,05 0,69 Cebada (n=3) 4,56 6,44 5,77 1,05 3,85 6,98 5,58 1,60 Cebada molid (n=4) 0 5,99 4,17 2,80 4,60 5,58 5,18 0,46 S. algodón (n=9) 4,06 5,79 4,93 0,70 0 5,30 1,64 2,48 Maíz grano (n=7) 5,43 6,46 5,94 0,36 5,46 6,60 6,20 0,40 Maíz molido (n=6) 0 6,40 4,90 2,55 4,08 6,70 5,87 0,93 MACD SA B Min: Mínimo Max: Máximo Med: Media SD: Desviación estándar Resultados y Discusión 248 Tabla 69. Tanto por cien alcanzado por cada género en los dos medios y teniendo en cuenta el total de los alimentos. GENEROS MACD% SAB% Penicillium 66,67 71,43 Aspergillus spp. 66,67 57,14 Aspergillus flavus 38,10 38,10 Eurotrium 9,52 42,86 Cladosporium 28,57 23,81 Fusarium 38,10 66,67 Comparación de géneros aislados en los dos medios de cultivo 0 20 40 60 80 Penicillium Aspergillus spp. Aspergillus flavus Eurotrium Cladosporium Fusarium Especie Porcentaje (%) MACD% SAB% Figura 47. Tanto por cien alcanzado por cada género en los tres medios y teniendo en cuenta el total de los alimentos concentrados. Resultados y Discusión 249 La prueba χ2 con α= 0,05 y 4 grados de libertad, demuestra que no existen diferencias significativas entre los géneros aislados de ambos medios de cultivo. Comparando estos resultados, hay que señalar como única diferencia, que Mucor spp. fue el único género que no fue aislado en el medio MACD y si fue aislado en el medio SAB, lo cual hace la relación de géneros entre los dos medios de cultivo comparable, ya que Mucor spp. no es un género de importancia epidemiológica ni económica. 250 Tabla 70. Frecuencia de la presencia (tanto por cien) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de alimentos concentrados en los medios MACD y SAB. PIENSOS (n =9) MEZCLAS (n=12) TOTAL (n=21) MP % MP % MP % GENEROS MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B MACD/SA B Penicillium 5/6 55/67 9/9 75/75 14/15 67/71 Aspergillus spp. 7/3 78/33 7/9 58,3/75 14/12 67/57 Aspergillus flavus 2/2 22/22 6/6 50/50 8/8 38/38 Aspergillus niger 0/1 0/11 1/2 8/17 1/3 5/14 Eurotrium 0/3 0/33 2/6 17/50 2/9 9/43 Mucor 0/2 0/22 0/6 0/50 0/8 0/38 Rizophus 1/1 11/11 0/0 0/0 1/1 5/5 Cladosporium 3/3 33/33 3/2 25/17 6/5 29/24 Fusarium 2/4 22/44 6/10 50/83 8/14 38/67 Micelia sterilia 0/3 0/33 1/2 8/17 1/5 5/24 MP: Muestras positivas a cada género fúngico Resultados y Discusión 251 4.6.3.6. Análisis de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas 4.6.3.6.1. Géneros fúngicos aislados en el medio de cultivo MACD Se realizó el aislamiento y al identificación de los géneros fúngicos encontrados en los cultivos de las muestras según la metodología descrita en los apartados 3.2.7. y 3.2.8. respectivamente. A partir del medio MACD se aislaron 6 géneros fúngicos en las distintas muestras de alimentos: Penicillium spp., Aspergillus spp., Eurotium spp., Cladosporium spp., Fusarium spp. y Micelia sterilia. En el presente estudio, el género Penicillium spp., fue aislado con la misma frecuencia que Aspergillus spp. (50%). Se contaron por separado A. flavus (31,3%) y Eurotrium (15,6%). Coinicidiendo con los resultados obtenidos por otros autores, el género Aspergillus es uno de los que se han encontrado más frecuentemente, durante el estudio de la micoflora en muestras de maíz (Viñas y col., 1984; Adebajo y col., 1994; Castro y col., 1995; El-Maghraby y col., 1995; Pozzi y col., 1995; Ono y col., 1999, 2002; Almeida y col., 2000, 2002, Pacin y col., 2003), soja (Roy y col., 2001) y semillas de algodón (Mazen y col., 1990; Klich, 1998). Los porcentajes de frecuencia de los demás géneros fueron: Cladosporium spp. (16%), Fusarium spp. (25%) y Micelia sterilia (6%). Todos los géneros aislados en el análisis de las muestras estudiadas, han sido mencionados en estudios hechos por otros autores. En la tabla 71 se muestra la frecuencia de la presencia (porcentaje) de los géneros fúngicos aislados de las muestras de materias primas analizadas. 252 Tabla 71. Frecuencia de la presencia (tanto por cien) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de materias primas cultivadas en el medio MACD. HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32) GENEROS MP%MP%MP%MP%MP%MP%MP% Penicillium 3 100 2 66,67 3 75 3 33,33 5 71,43 4 66,67 16 50 Aspergillus spp. 2 66,67 2 66,67 3 75 7 77,78 2 28,57 1 16,67 16 50 Aspergillus flavus 1 33,33 1 33,33 2 50 5 55,56 0 0 1 16,67 10 31,25 Aspergillus niger 1 33,33 0 0 1 25 0 0 0 0 0 0 2 6,25 Eurotrium 1 33,33 2 66,67 0 0 1 11,11 1 14,29 0 0 5 15,63 Mucor 00000000000000 Rizophus 00000000000000 Cladosporium 0 0 1 33,33 1 25 1 11,11 2 28,57 2 33,33 5 15,63 Fusarium 0 0 133,330 0 444,44342,86466,678 25 Micelia sterilia 0 0 0 0 1 25 1 11,11 0 0 1 16,67 2 6,25 MP: Muestras positivas a cada género fúngico Resultados y Discusión 253 4.6.3.6.2. Géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas utilizando SAB En el medio SAB se encontraron y aislaron 7 géneros fúngicos en las distintas muestras de alimentos: Penicillium spp., Aspergillus spp., Mucor spp., Rizophus spp., Cladosporium spp., Fusarium spp. y Micelia sterilia. El género más abundante fue Aspergillus spp. (56%), seguido del género Penicillium spp. (47%). Los porcentajes de los demás géneros fue: Fusarium spp. (37%), Mucor spp. (38%), Cladosporium spp. (19%), Micelia sterilia (12%) y Rizophus spp. (6%). Los datos referentes a la frecuencia de los géneros fúngicos aislados del medio SAB se muestran en la tabla 72. 254 Tabla 72. Frecuencia de la presencia (tanto por cien) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de materias primas cultivadas en el medio SAB. HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32) GENEROS MP%MP%MP%MP%MP%MP%MP% Penicillium 2 66,67 2 66,67 4 100 3 33,33 4 57,14 2 33,33 15 46,88 Aspergillus spp. 3 100 2 66,67 2 50 8 88,89 3 42,86 2 33,33 18 56,25 Aspergillus flavus 1 33,33 2 66,67 2 50 8 88,88 1 14,29 0 0 14 43,75 Aspergillus niger 133,3300125666,670000825 Eurotrium 1 33,33 3 100 1 25 7 77,78 1 14,29 0 0 13 40,63 Mucor 1 33,33 0 0 1 25 5 55,56 1 14,29 1 16,67 8 25 Rizophus 000000222,22000026,25 Cladosporium 0 0 1 33,33 1 25 1 11,11 3 42,86 1 16,67 6 18,75 Fusarium 0 0 1 33,33 0 0 6 66,67 5 71,43 2 33,33 12 37,5 Micelia sterilia 1 33,33 1 33,33 0 0 2 22,22 0 0 1 16,67 4 12,5 MP: Muestras positivas a cada género fúngico Resultados y Discusión 255 4.6.3.6.3. Comparativa entre los medios de cultivo SAB y MACD de los distintos géneros fúngicos aislados en muestras de materias primas Para el análisis estadístico de la frecuencia de géneros fúngicos se tomaron los datos referentes a cada género y en cada medio, considerando todos los tipos de materias primas como un único grupo. Sobre estos datos, y por considerar que son más representativos que si tomamos los grupos de alimentos por separado, se ha realizado la prueba χ2 (Chi cuadrado), que comprueba si la frecuencia de aparición de los géneros es comparable en los dos medios. Eliminando los géneros que representan un porcentaje menor del 5%, los cuales fueron Mucor y Rizophus. Analizando estos resultados estadísticamente, mediante la prueba χ2 encontramos que para un nivel de significación de 0,05 y 5 grados de libertad, no existen diferencias significativas entre las frecuencias de aislamiento de los distintos géneros fúngicos aislados de las muestras de materias primas, en los medios de cultivo MACD y SAB. Tabla 73. Número de muestras en las que ha aparecido cada género en el total de los alimentos concentrados y sobre la que se han realizado el análisis estadístico. GENEROS SAB MA Penicillium 15 16 Aspergillus spp 18 16 Aspergillus flavus 14 10 Eurotrium 13 5 Cladosporium 65 Fusarium 12 8 Resultados y Discusión 256 Tabla 74. Tanto por cien alcanzado por cada género en los dos medios y teniendo en cuenta el total de los alimentos. GENEROS SAB % MACD% Penicillium 46,88 50 Aspergillus spp. 56,25 50 Aspergillus flavus 43,75 31,25 Aspergillus niger 25 6,25 Eurotrium 40,63 15,63 Cladosporium 18,75 15,63 Fusarium 37,5 25 Micelia sterilia 12,50 6,25 Comparación de géneros aislados en los dos medios de cultivo 0 20 40 60 Penicillium Aspergillus spp. Aspergillus flavus Aspergillus niger Eurotrium Cladosporium Fusarium Micelia sterilia Especie Porcentaje (%) SAB % MACD% Figura 48. Tanto por cien alcanzado por cada género en los dos medios y teniendo en cuenta el total de las materias primas analizadas. 257 Tabla 75. Frecuencia de la presencia (tanto por cien) de los distintos géneros fúngicos aislados de muestras de materias primas en los medios MACD y SAB. HARINA CEBADA SEMILLA MAIZ MAIZ SOJA (n =3) CEBADA (n=3) MOLIDA (n=4) ALGODÓN (n=9) GRANO (n=7) MOLIDO (n=6) TOTAL (n=32) MP % MP % MP % MP % MP % MP % MP % GENEROS MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB MACD/SAB Penicillium 3/2 100/67 2/2 67/67 3/4 75/100 3/3 33/33 5/4 71/57 4/2 67/33 16/15 50/47 Aspergillus spp. 2/3 67/100 2/2 67/67 3/2 75/100 7/8 78/89 2/3 29/43 1/2 17/33 16/18 50/56 Aspergillus flavus 1/1 33/33 1/2 33/67 2/2 50/50 5/8 56/89 0/1 0/14 1/0 17/0 10/14 31/44 Aspergillus niger 1/1 33/33 0/0 0/0 1/1 25/25 0/6 0/67 0/0 0/0 0/0 0/0 2/8 6/25 Eurotrium 1/1 33/33 2/3 67/100 0/1 0/25 1/7 11/78 1/1 14/14 0/0 0/0 5/13 16/41 Mucor 0/1 0/33 0/0 0/0 0/1 0/25 0/5 0/56 0/1 0/14 0/0 0/0 0/0 0/0 Rizophus 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/2 0/22 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 0/0 Cladosporium 0/0 0/0 1/1 33/33 1/1 25/25 1/1 11/11 2/3 29/43 2/1 33/17 5/6 16/19 Fusarium 0/0 0/0 1/1 33/33 0/0 25/25 4/6 44/67 3/5 43/71 4/2 67/33 8/12 25/38 Micelia sterilia 0/1 0/33 0/1 0/33 1/0 25/0 1/2 11/22 0/0 0/0 1/1 17/17 2/4 6/13 MP: Muestras positivas a cada género fúngico Resultados y Discusión 264 4.7. OBTENCIÓN DE RTP DE AFLATOXINA B1“in vitro” A raíz de las observaciones relatadas en el apartado 4.5., se realizaron ensayos en base a las diferentes metodologías de inducción de RTP que han sido descritas en la literatura. Los ensayos detallados a continuación estuvieron dirigidos a reproducir el mismo fenómeno mediante la inducción de RTP de aflatoxinas “in vitro”. Tanto los ensayos en discontinuo (para reproducir las condiciones de la placa de medio de cultivo) como en flujo se realizaron con la finalidad de encontrar un método aplicable a la determinación de aflatoxinas en alimentos mediante una técnica fosforimétrica. La aflatoxina B1 fue elegida para los ensayos de obtención de (RTP), debido a que se conoce que su emisión fluorescente aumenta hasta 27 veces por interacción con las ciclodextrinas (Cepeda y col., 1996). Al mismo tiempo se conce que las ciclodextrinas se utilizan para inducir fosforescencia de una variedad de compuestos. 4.7.1. Obtención de RTP en disolución (F-RTP) 4.7.1.1. Fosforescencia inducida por átomo pesado (HAI-RTP) Siguiendo los procedimientos descritos en el apartado 3.2.12.2.1. fueron probadas diferentes combinaciones de aflatoxina B1 con los aditivos, así como diferentes condiciones instrumentales. Las medidas fueron comparadas con espectros obtenidos a partir de disoluciones “blanco” preparadas de la misma manera, conteniendo todos los reactivos, excepto la AFB1. Al no obtenerse señal analítica útil con el yoduro de potasio (ENSAYO 1), fueron probados otros compuestos como fuente externa de Resultados y Discusión 265 átomo pesado (ENSAYO 2): bromobenceno, bromoetanol y terbio, siguiendo el mismo procedimiento y añadiendo los compuestos en cantidad suficiente para trabajar con las concentraciones finales indicadas en los respectivos ensayos. No se obtuvo señal utilizando IK, bromobenceno ni bromoetanol. Sin embargo, los espectros de fosforescencia de la mezcla con terbio muestran dos picos a 500 y 550 nm, los cuales son menores en el caso de la emisión del blanco y no se observan en el espectro de fluorescencia, como se muestra en la figura 49. Estas señales, en contra de lo esperado, no fueron desactivadas por el oxígeno presente en la disolución. 460 480 500 520 540 560 580 600 10 20 30 40 50 60 70 80 O(nm) INT AFB1+Tb+3 Blanco 460 480 500 520 540 560 580 600 10 20 30 40 50 60 70 80 O(nm) INT AFB1+Tb+3 Blanco AFB1+Tb+3 Blanco Figura 49. Espectro de fosforescencia de aflatoxina B1 en disolución con Tb+3 frente a una preparación blanco. Resultados y Discusión 266 En ciertos complejos de metales de transición, sobre todo los de lantánidos y actínidos, los electrones desapareados están en su mayor parte aislados del ligando. Se ha observado en la literatura que las emisiones luminiscentes resultantes son lineares y aparecen a longitudes de onda del rojo para el Eu(III) y en el verde para complejos de Tb(III), las cuales se pueden observar en disolución. Existe una gran controversia relacionada con este tipo de emisiones observadas en complejos de lantánidos. Si bien no suele aplicárseles el término “fosforescencia” para definirlas, pues de forma general no se generan desde estados excitados triplete, parece claro que no se trata de emisiones fluorescentes, por sus largos tiempos de vida y longitudes de onda de emisión. Por ello, se les suele denominar, de forma muy genérica, emisiones “luminiscentes” (Fernández y Schulman, 2001). El hecho de que no se haya observado "quenching”, por acción del oxígeno, de las señales obtenidas en el ensayo realizado con Tb+3 como átomo pesado, apoyan la hipótesis de que las emisiones “luminiscentes” observadas puedan efectivamente no estarse produciendo desde un estado excitado triplete del complejo AFB1-Tb+3. Este suceso puede ser debido a la diferente estructura de niveles atómicos de los lantánidos, comparada con la de otros átomos pesados pertenecientes al grupo de los elementos de transición. En la literatura existen estudios sobre el uso de quelatos de lantánidos para análisis de iones y biomoléculas. Los autores habían sintetizado compuestos que contienen un grupo cumarínico como fluoróforo que sensibiliza la emisión del lantánido (Crossley y col., 1994; Heyduk y col., 1997; Katerinopoulos, 2000). Las aflatoxinas poseen este grupo cumarínico en su estructura, lo cual explicaría el resultado obtenido, en el presente trabajo. Vázquez y col., (1996) utlilizaron el Tb+3 para desarrollar un método de cuantificación simultánea de otras dos micotoxinas: citrinina y patulina. El método consiste en una extracción previa de las muestras de diferentes tipos Resultados y Discusión 267 de quesos seguida de la separación en columna cromatográfica y la posterior la reacción post columna con solución de Tb+3 en medio básico. Empleando una fuente pulsada, los autores lograron mejorar la especificidad con respecto a la detección fluorescente. El tipo y concentración de la sal del átomo pesado es una variable experimental fundamental en la puesta a punto de métodos analíticos basados en esta metodología. En diferentes trabajos publicados se estudiaron diversas sales de átomos pesados para inducir fosforescencia en disolución en ausencia de medios organizados. Existen varios halogenuros alcalinos aparte del KI (NaCl, NaBr, NaI, KCl, KBr, RbCl y CsCl) y diferentes sales solubles que contienen átomos de elevado número atómico (KIO3, Ca(NO3)2, Cr(NO3)3, RbNO3, InCl3, La(NO3)3, CeCl3, AgNO3, PB(NO3)2 y Tl(NO3). Todos estos compuestos pueden ser probados en un futuro con la finalidad de inducir fosforescencia de las aflatoxinas. 4.7.1.2. Fosforescencia en presencia de ciclodextrinas (CD-RTP) Siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.2.12.2.2. fueron probadas diferentes combinaciones del analito y los dos tipos de ciclodextrinas, así como diferentes condiciones instrumentales. Las medidas fueron comparadas con espectros obtenidos a partir de disoluciones “blanco” preparadas de la misma manera, conteniendo todos los reactivos excepto la aflatoxina B1. Al no obtenerse señal analítica útil con el bromoetanol, (ENSAYO 3), el yoduro de potasio fue añadido como fuente externa de átomo pesado (ENSAYO 4) y también se utilizó ciclohexano en presencia de ȕ-CD (ENSAYO 5), basándonos en el trabajo de Wei Jin y col., (1994), quienes Resultados y Discusión 275 Alternativamente, también se ensayó bromoetanol como fuente externa de átomo pesado. Siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.2.12.3.2., la AFB1 y las sales (ENSAYO 11) y los otros aditivos (ENSAYO 12), fueron añadidos sobre las resinas acondicionadas y se dejaron fijar sobre la superficie de las partículas durante una noche. Tras dejar evaporar el disolvente, el paso siguiente consistió en empaquetar las preparaciones en la celda de medida, lo cual inicialmente se realizaba arrastrando las resinas dentro de la celda por succión con agua destilada, con ayuda de una jeringa y una punta de pipeta como embudo, como muestra la figura 54. Pero, al no obtener señal fosforescente ni fluorescente, se dedujo que esta manera de empaquetar la celda de flujo producía la lixiviación del analito, que tiene mayor afinidad por el agua que por los soportes sólidos. Por esta razón, se decidió empaquetar la celda de flujo “en seco”, de la manera descrita en el apartado 3.2.12.3.2.1.. Figura 54. Empaquetado de la celda de flujo por arrastre con agua. Resultados y Discusión 268 encontraron que pequeñas adiciones de ciclohexano, en presencia de Eciclodextrinas, aumentan la rigidez del medio mediante la formación de microcristales. No se obtuvo señal RTP de la aflatoxina B1 mediante el uso de estas metodologías, probablemente debido a que no se cumplió otro requisito para obtener emisión de RTP inducida por CD: que la cavidad hidrofóbica de la CD debe permitir una interacción suficiente entre el analito y el compuesto que posee el átomo pesado, para producir una población efectiva de los estados tripletes del analito. Además de esto, luminóforo y átomo pesado necesitan estar al mismo tiempo, muy próximos, dentro de la cavidad de la CD (Muñoz de la Peña y col., 2001). 4.7.1.3. Fosforescencia en medio micelar (MS-RTP) Se realizaron pruebas basadas en el trabajo de Li y col., (2003), para inducir RTP de la aflatoxina B1 utilizando desoxicolato de sodio como agente surfactante (ENSAYO 6), añadido a la disolución en concentración mayor a la c.m.c. (> 4 mM) y otros aditivos de la manera descrita en el apartado 3.2.12.2.3.. No se obtuvo resultado aplicando esta metodología de inducción de fosforescencia, quizás porque la viscosidad obtenida con el NaDC no fue suficiente para inducir la RTP de nuestro analito en particular. En el futuro se podrían probar otros tensoactivos como el SDS para conseguir inducir la RTP de la AFB1 en este tipo de medios. 4.7.1.4. Fosforescencia en disolución de ciclodextrina con desoxicolato de sodio Se realizaron pruebas de inducción de fosforescencia a temperatura ambiente de la aflatoxina B1 en una mezcla de CAVASOL® 0,3% (equivalente a 0,0023 M) y desoxicolato de sodio 0,6% (equivalente a 0,015 M) (ENSAYO Resultados y Discusión 269 7). Estas concentraciones fueron ensayadas ya que son a las que se observa la fosforescencia “in vivo” en presencia de estos compuestos. Alternativamente, también se probó la inducción de fosforescencia a temperatura ambiente de la aflatoxina B1 con una combinación de los dos medios organizados (micelar y con CD) descritos en los apartados 4.7.1.2.y 4.7.1.3. (ENSAYO 8). Con el fin de evitar la atenuación de la fosforescencia, en estos ensayos se utilizó el agente desoxigenante y por otra parte se probó la adición de bromoetanol como fuente externa de átomo pesado, ya que el KI precipita en presencia de desoxicolato de sodio (ENSAYO 9). No se obtuvo resultado aplicando estas metodologías de inducción de fosforescencia de la aflatoxina B1. 4.7.2. Obtención de fosforescencia a temperatura ambiente en soporte sólido (SS-RTP) 4.7.2.1 Ensayos en papel filtro (Ensayo 10) Siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.2.12.3.1., la AFB1 fue inmovilizada en papel de filtro y se añadieron diferentes iones para lograr el efecto externo de átomo pesado (I-, Cd+2, Al+3, Li+, Zn+2, Mg+2, Tl+, Hg+2) así como bromoetanol, que fueron elegidos en función de la literatura consultada. También se emplearon CAVASOL® y NaDC como aditivos para la inducción de RTP. Los resultados más relevantes obtenidos aplicando este procedimiento de inducción de RTP son los siguientes: Resultados y Discusión 270 - No se obtuvo señal fosforescente de la AFB1 en combinación con disoluciones acuosas o etanólicas de I-, Tl+, Al+3 y Zn+2. - No se obtuvieron resultados por adición de ciclodextrinas o desoxicolato de sodio a las preparaciones. A diferencia del método usado por Vo Dinh (1987), en el cual se realizaba un pretratamiento de las tiras con CD antes de añadir el reactivo. En nuestros caso agregado directamente al soporte una mezcla de AFB1 con CD y NaDC. Este debería ser en principio un procedimiento más adecuado, pues aseguramos que el complejo de inclusión ya se ha formado en la mezcla inicial y no esperamos a que suceda sobre el papel de filtro. El resultado obtenido por inmovilización de la aflatoxina B1 en presencia de CD y NaDC en principio debía haber reproducido la observación mencionada en el apartado 4.5.1., sin embargo no se obtuvieron espectros de emisión fosforescente por este procedimiento, probablemente debido a que la concentración de AFB1 utilizada en el ensayo “in vitro” fue mucho menor de la que estaba presente en el precipitado blanco. En el caso de las disoluciones acuosas de los metales: no se obtuvo señal fosforescente de la AFB1 inmovilizada en combinación con disoluciones de Li+ ni de Mg+2 (figura 50). Resultados y Discusión 271 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 λ(nm) INT Blanco Li+yMg +2. 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 λ(nm) INT 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 λ(nm) INT Blanco Li+yMg +2. Figura 50. Los espectros de intensidad inferior al blanco pertenecen a preparaciones de AFB1 con Li+ y Mg+2. Se obtuvieron espectros de emisión a partir de la preparación de AFB1 en combinación con la disolución de Hg+2 (figura 51). Sin embargo, como puede observarse en dicha figura, la intensidad de emisión disminuía rápidamente con el tiempo, lo cual parece indicar que el complejo Hg+2-AFB1 es altamente inestable. Resultados y Discusión 272 400 450 500 550 600 650 700 10 20 30 40 49 λ(nm) INT tiempo=0 seg tiempo=2 min tiempo=60 seg 400 450 500 550 600 650 700 10 20 30 40 49 λ(nm) INT 400 450 500 550 600 650 700 10 20 30 40 49 λ(nm) INT tiempo=0 seg tiempo=2 min tiempo=60 seg Figura 51. Espectros de emisión de fosforescencia de una misma preparación de AFB1 inmovilizada en papel filtro con disolución acuosa de mercurio. La señal disminuye rápidamente en el tiempo. No obstante, sí se obtuvo señal fosforescente a partir de la combinación de AFB1 con una disolución de Cd+2 (figura 52). 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 29 λ(nm) INT AFB 1 +Cd +2 Blanco 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 29 λ(nm) INT 400 450 500 550 600 650 700 0 5 10 15 20 25 29 λ(nm) INT AFB 1 +Cd +2 Blanco Figura 52. Comparación de espectros de fosforescencia de la AFB1 con disolución acuosa de Cd+2 frente al blanco. Resultados y Discusión 279 Comparando los espectros RTP entre disoluciones acuosas de Cd+2, se observó la presencia de dos picos a 500 y 555 nm en el espectro de emisión de RTP de la preparación que contenía CD, los cuales no aparecieron en los espectros de las preparaciones que carecían de ella (figura 59). Por otro lado, ambas señales se desactivan al inyectar aire a través de la resina (figura 60). 400 440 480 520 560 600 5 10 15 20 25 30 λ(nm) INT AFB 1 +Cd +2 +CD AFB 1 +Cd +2 400 440 480 520 560 600 5 10 15 20 25 30 λ(nm) INT 400 440 480 520 560 600 5 10 15 20 25 30 λ(nm) INT AFB 1 +Cd +2 +CD AFB 1 +Cd +2 Figura 59. Comparación entre espectros de RTP de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice con disoluciones acuosas de Cd+2 con y sin CAVASOL®. Resultados y Discusión 280 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 λ(nm) INT AFB1+Cd+2+CD AFB1+Cd+2+CD+ O2 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 λ(nm) INT AFB1+Cd+2+CD AFB1+Cd+2+CD+ O2 Figura 60. Espectros de RTP de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice preparada con disolución acuosa de Cd+2 con CAVASOL®. Los dos picos desaparecen del espectro de fosforescencia cuando se inyecta oxígeno. Los resultados obtenidos empleando aluminio como fuente externa de átomo pesado se ilustran en la figura 61. Como puede observarse, se obtuvo señal fosforescente de la AFB1 fijada sobre gel de sílice con la disolución etanólica de Al+3. Sin embargo, empleando además CAVASOL® no se observó emisión fosforescente por parte de la aflatoxina. Resultados y Discusión 281 400 450 500 550 600 650 700 3 4 5 6 7 8 9 INT λ(nm) AFB1+Al+3+CD AFB1+Al+3 Blanco 400 450 500 550 600 650 700 3 4 5 6 7 8 9 INT λ(nm) AFB1+Al+3+CD AFB1+Al+3 Blanco Figura 61. Comparación entre espectros de emisión de RTP de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice con disolución etanólica de Al+3. El espectro de la preparación con CD tiene una intensidad prácticamente igual a la señal del blanco. Los resultados obtenidos empleando zinc como fuente externa de átomo pesado se ilustran en las figuras 62 y 63. Se obtuvo una señal fosforescente muy débil de la AFB1 fijada sobre gel de sílice con la disolución acuosa de acetato de zinc (figura 62). Lo mismo sucedió al emplear una disolución etanólica de oxalato de zinc (figura 63). Sin embargo, en el espectro de emisión de RTP de la preparación con disolución acuosa de oxalato de zinc se observó nuevamente la presencia de dos picos a 500 y 555 nm (figura 63). Resultados y Discusión 282 400 440 480 520 560 600 640 680 5 6 7 8 9 10 11 12 λ(nm) INT AFB 1 +(CH 3 COO) 2 Zn Blanco 400 440 480 520 560 600 640 680 5 6 7 8 9 10 11 12 λ(nm) INT 400 440 480 520 560 600 640 680 5 6 7 8 9 10 11 12 λ(nm) INT AFB 1 +(CH 3 COO) 2 Zn Blanco Figura 62. Espectro de emisión fosforescente de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice preparada con disolución acuosa de acetato de zinc, frente al blanco. Blanco AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en H 2 O 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 35 λ(nm) INT AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en etOH Blanco AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en H 2 O 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 35 λ(nm) INT AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en etOH AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en H 2 O 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 35 λ(nm) INT 460 480 500 520 540 560 580 600 5 10 15 20 25 30 35 λ(nm) INT AFB 1 +(C 4 0 2 ) 2 Zn en etOH Figura 63. Comparación entre espectros de emisión de RTP de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice con disoluciones etanólica y acuosa de (C402)2Zn, frente al blanco. Resultados y Discusión 283 Los resultados obtenidos por la adición de cloruro de terbio a las preparaciones de AFB1 fijada sobre gel de sílice están ilustrados en la figura 64. Los espectros de RTP presentan dos picos a 490 y 555 nm. Al obtener espectros a partir de distintas concentraciones de AFB1 inmovilizada, se observó que la intensidad de la emisión varía en función de la cantidad de analito. De nuevo, al inyectar oxígeno al sistema no se observó un descenso en la intensidad de los dos picos de emisión luminiscente. 450 500 550 600 650 700 750 800 50 100 150 200 250 300 350 400 λ(nm) INT 450 500 550 600 650 700 750 800 50 100 150 200 250 300 350 400 λ(nm) INT Figura 64. Espectros de emisión RTP de AFB1 10-4M y 10-6M fijada sobre gel de sílice preparada con disolución acuosa de Tb+3. Los resultados obtenidos por la adición de bromoetanol a las preparaciones de AFB1 fijada sobre gel de sílice están ilustrados en la figuras 65 y 66. Una vez que se obtuvo señal fosforescente se procedió a optimizar el tiempo de demora (figura 65), seleccionándose td=0,04ms como el parámetro óptimo. Paralelamente se estudió la adición de CD a las preparaciones (figura 66), encontrándose de nuevo que dicha adición inhibe la emisión fosforescente de la aflatoxina. Podríamos justificar este hecho, Resultados y Discusión 284 suponiendo que la inclusión de la AFB1 dentro de la CD impide que exista la proximidad necesaria entre ella y el bromoetanol para generar el efecto de átomo pesado que favorezca el cruce intersistemas para dar lugar a una emisión fosforescente. 400 450 500 550 600 650 8 10 12 14 16 18 20 22 λ(nm) INT t d =0,04 ms t d =0,08 ms t d =0,1 ms t d =0,2 ms 400 450 500 550 600 650 8 10 12 14 16 18 20 22 λ(nm) INT 400 450 500 550 600 650 8 10 12 14 16 18 20 22 λ(nm) INT t d =0,04 ms t d =0,08 ms t d =0,1 ms t d =0,2 ms Figura 65. Comparación de espectros de fosforescencia de AFB1 10-5M con bromoetanol inmovilizada en gel de sílice a diferentes td: 0,04-0,08-0,1-0,2 ms, en intensidad decreciente. El espectro más bajo se obtuvo con la misma muestra en un flujo de aire. Resultados y Discusión 285 AFB 1 +brOH+CD 400 440 480 520 560 600 640 10 30 50 70 λ(nm) INT AFB 1 +brOH Blanco AFB 1 +brOH+CD 400 440 480 520 560 600 640 10 30 50 70 λ(nm) INT AFB 1 +brOH Blanco 400 440 480 520 560 600 640 10 30 50 70 λ(nm) INT 400 440 480 520 560 600 640 10 30 50 70 λ(nm) INT AFB 1 +brOH Blanco Figura 66. Comparación entre espectros de emisión RTP de AFB1 10-5M fijada sobre gel de sílice con bromoetanol. Con y sin CAVASOL®, frente al blanco. ENSAYO 13: Con el fin de reproducir los resultados obtenidos con la solución estándar de aflatoxina B1, los cultivos de una cepa productora y otra cepa no productora de aflatoxinas en medio YSCD a 28ºC fueron incubados durante 3 días y extraídos con cloroformo e inmovilizados sobre resinas adsorbentes de la manera descrita para los ensayos anteriores. Al mismo tiempo, se obtuvieron los espectros de emisión RTP de un patrón de aflatoxina B1 y de una preparación blanco con el fin de hacer la comparación. Los resultados obtenidos demuestran que el extracto del cultivo de la cepa aflatoxigénica NRRL 2999 emite fosforescencia, al contrario que el extracto del cultivo de la cepa no aflatoxigénica NRRL 6538 (figura 67). 286 Figura 67. Comparación entre espectros de emisión RTP de a) solución patrón de aflatoxina B1 frente a una preparación blanco y b) extractos clorofórmicos de cultivos de A. parasiticus aflatoxigénico NRRL 2999 y A. flavus no aflatoxigénico NRRL 6538 todos inmovilizados sobre resina DOWEX® (td: 0,04 ms y tG: 4 ms). Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 20 30 40 50 Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 500 600 Wavelength (nm) 500 600 10 40 50 Wavelength (nm) 400 Blanco AFB1 a) Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 20 30 40 50 Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 500 600 Wavelength (nm) 500 600 10 40 50 Wavelength (nm) 400 Blanco AFB1 Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 20 30 40 50 Wavelength (nm) Intensity (a.u.) 500 600 Wavelength (nm) 500 600 10 40 50 Wavelength (nm) 400 Blanco AFB1 a) 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT Cepa aflatoxigénica Cepa no aflatoxigénica b) 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT Cepa aflatoxigénica Cepa no aflatoxigénica 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT 450 500 550 5 10 15 450 500 550 λ(nm) INT Cepa aflatoxigénica Cepa no aflatoxigénica b) Resultados y Discusión 287 Con respecto a la correlación entre los espectros RTP obtenidos del patrón de AFB1 y el extracto del cultivo de la cepa aflatoxigénica, cabe destacar que esta última produce las cuatro aflatoxinas B1, B2, G1 y G2 (figura 18b). Las emisiones RTP de las 4 aflatoxinas están muy cercanas entre si probablemente debido a que poseen estructuras moleculares análogas. Por lo tanto, el espectro resultante de una mezcla de las cuatro aflatoxinas resulta similar pero no igual a aquel obtenido solamente con la aflatoxina B1. 4.7.2.3. Ensayos en soporte Sol-Gel (Ensayo 14) Se empleó la tecnología sol-gel con el propósito de inducir RTP de la aflatoxina B1, para lo cual se prepararon diferentes combinaciones con el fin de optimizar la composición de un xerogel que ofreciera resultados satisfactorios (tabla 8). Se ensayaron 3 concentraciones distintas de AFB1 (10-5M, 10-7M, 10-9M) en disolución acuosa con y sin CAVASOL® 0,01 M inmovilizada en 72 preparados diferentes de soporte sólido sol-gel, combinando tetrametoxisilano y metiltrimetoxisilano como precursores, siguiendo el procedimiento descrito en el apartado 3.2.12.3.3.. Se utilizaron viales ámbar y los geles fueron almacenados para su evaporación a temperatura ambiente, al abrigo de la luz debido a que el analito es termosensible y también fotosensible. Los xerogeles obtenidos fueron reducidos a un tamaño de partícula adecuado por medio de molienda y posteriormente fueron empaquetados en la celda de flujo, como ilustra la figura 7. Para realizar las medidas se conectó la celda de flujo a una corriente de Ar con el fin de desplazar el oxígeno y evitar la atenuación de la emisión fosforescente (“quenching”). No se obtuvo señal, debido probablemente a que las concentraciones ensayadas fueron muy bajas (o altas –si es que se produjo autoabsorción-), a pesar de utilizar ciclodextrina, que fue mezclada en un paso previo con la AFB1, para asegurar la formación del complejo de inclusión. Resultados y Discusión 288 4.7.3. Desarrollo de un sensor óptico en un sistema de inyección de flujo FIA Una vez obtenida la señal fosforescente por adsorción de la aflatoxina B1 sobre gel de sílice, se pasó a acoplar un sistema de análisis de flujo a la celda para poder detectar y, eventualmente, cuantificar la aflatoxina B1 de forma continua en un sistema dinámico que implica el establecimiento de un flujo que transporte la muestra y permitiera obtener un perfil señal-tiempo. Lázaro y col., (1988) realizaron análisis de alimentos por medio de un sistema HPLC acoplado a FIA con el cual se llevaba a cabo la derivatización post columna de aflatoxinas, para su posterior detección fluorescente. Peña y col., (2002) diseñaron un sistema FIA, para realizar la derivatización de las aflatoxinas, el cual permitía el screening de muestras de piensos que tuvieran un contenido de aflatoxinas mayor al permitido por ley, mediante detección fluorescente. En base a una publicación de Wei Jin y col. (2001), en el presente trabajo se diseñó un sistema FIA, el cual constó de una celda de flujo empaquetada con gel de sílice, a través de la cual, con ayuda de una bomba peristáltica, se hizo circular la disolución “carrier” que contenía Na2SO3 como agente desoxigenante. Por medio de una válvula se inyectó al sistema un volumen de 2 ml de diluciones acuosas de aflatoxina B1 (10–4Ma 10 –9 M) a las cuales se añadió bromoetanol o KI como fuentes externas de átomo pesado y también CAVASOL® con el propósito de aumentar la señal de RTP, además de Na2SO3con le fin de eliminar todo el oxígeno presente. Las mediciones de fosforescencia de la aflatoxina B1 con esta metodología fueron infructuosas, por esta razón se conectó el sistema FIA a un detector de fluorescencia con el fin de monitorizar la emisión fluorescente en el tiempo donde se observó que existía una rápida lixiviación del analito a causa del flujo. Bibliografía 294 9º SIMPOSIO INTERNATIONAL SOBRE CICLODEXTRINAS. (1998). 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