NUEVAS ACCIONES DE P53:
HOMEOSTASIS METABÓLICA Y EFECTO OREXIGÉNICO DE
GHRELIN
DOUGLAS ALFREDO VELASQUEZ RAIMUNDO
MEMORIA pa a op a al g ado de Doc o
Uni e sidad de San iago de Compos ela, 2012
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
D . Ca los Diéguez González, ca ed á ico de Fisiología de la Uni e sidad de
San iago de Compos ela
D . Rubén Noguei as Pozo, In es igado “Ramón y cajal”, depa amen o de
Fisiología, Uni e sidad de San iago de Compos ela
Ce i ican que:
La p esen e Tesis Doc o al i ulada “Nue as acciones de p53: Homeos asis
me abólica y e ec o o exigénico de gh elin”, elabo ada po Douglas Al edo
Velásquez Raimundo, ha sido ealizada bajo nues a di ección en los
Labo a o ios de Neu ociencia “Ramón Domínguez” del Depa amen o de
Fisiología de la Uni e sidad de San iago de Compos ela, es imando que se
encuen a concluida y en condiciones de se p esen ada pa a op a al g ado de
Doc o .
Y pa a que cons e i mamos la p esen e au o ización en San iago de
Compos ela, Mayo de 2012
Fdo.: Ca los Diéguez González Fdo.: Rubén Noguei as
Pozo
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA
INDICE
INDICE
INTRODUCCION ............................................................................... 3
I. Obesidad ................................................................................. 3
II. Hipo álamo .............................................................................. 5
Núcleo A cua o ..................................................................... 5
Núcleo pa a en icula ......................................................... 6
Núcleo en omedial hipo alámico ....................................... 7
Núcleo do somedial hipo alámico ........................................ 8
Á ea hipo alámica la e al ...................................................... 8
III. Pép idos hipo alámicos y pe i é icos que es imulan la inges a 9
Neu opép ido Y .................................................................. 10
Pép ido elacionado a agou i ............................................... 12
Ho mona concen ado a de melanina ................................. 15
Gh elin ................................................................................ 17
IV. Pép idos hipo alámicos y pe i é icos que inhiben la inges a. 27
T ansc ip o egulado po cocaína y an e aminas ................ 27
Melanoco inas ................................................................... 28
Lep ina ................................................................................ 31
Colecis ocinina ................................................................... 37

INDICE
Polipép ido YY/ polipép ido P ............................................ 39
V. Señales in acelula es
AMPK ................................................................................. 43
Si uinas .............................................................................. 49
P53 ...................................................................................... 55
OBJETIVOS ...................................................................................... 67
MATERIALES Y METODOS .......................................................... 71
I. Animales de expe imen ación ............................................... 73
II. Técnicas expe imen ales ....................................................... 76
III. Me odología Expe imen al .................................................... 77
IV. P o ocolo expe imen al ......................................................... 79
V. Me odología analí ica ............................................................ 81
RESULTADOS ................................................................................ 103
E ec o de la die a es ánda en a ones p53 knockou .................. 105
E ec o de la die a al a en g asas en a ones p53 knockou .......... 110
E ec o del es ado nu icional sob e ni eles de SIRT y p53 en
hipo álamo de a as Sp ague-Dawley .......................................... 129
E ec os de gh elin sob e inges a y ni eles de p o eína en
hipo álamo de a as Sp ague-Dawley .......................................... 131
E ec o del bloqueo a macológico de SIRT1 sob e la acción
o exigenica de gh elin ................................................................. 133
INDICE
E ec o del bloqueo de SIRT1 sob e la acción de gh elin en el
me abolismo de ácidos g asos a ni el del hipo álamo. ............... 135
E ec o del bloqueo de SIRT1 sob e la acción de gh elin en la
exp esión de ac o es de ansc ipción y neu opép idos
mediado es de la inges a. ............................................................ 136
E ec os de gh elin sob e la inges a y el me abolismo de ácidos
g asos en a ones p53 KO .......................................................... 138
E ec o de la adminis ación de Res e a ol sob e la inges a y
el me abolismo de ácidos g asos a ni el del hipo álamo de
a ones p53 ko. ............................................................................ 141
E ec os de la adminis ación de AICAR sob e la inges a y el
me abolismo de ácidos g asos en a ones p53 ko ..................... 144
DISCUSION .................................................................................... 147
CONCLUSIONES ........................................................................... 163
BIBLIOGRAFIA ............................................................................. 167
ACC: ace il-CoA ca boxilasa
ACTH: ho mona ad enoco ico opina
AgRP: p o eína elacionada con agou i
AICAR: 5-aminoimidazol 4
ca boxamida ibosido
AMPK: adenosin mono os a o
ac i ado po kinasa
ARC: núcleo a cua o hipo alámico
ARNm: ácido ibonucleico mensaje o
ATM: A axia Telangiec asia Mu a ed
BAT: ejido adiposo ma ón
BHE: ba e a hema oence álica
CART: ánsc i o egulado po
an e amina y cocaína
CCK: colecis ocinina
CPT-1: ca ni ina-palmi oil ans e asa
CRH: ho mona libe ado a de
co ico opina.
DMH: núcleo do somedial
hipo alámico
FAS: ácido g aso sin asa
FFA: ácidos g asos lib es
GABA: ácido gammaaminobu í ico
GH: ho mona del c ecimien o
GHRH: ho mona libe ado a de la
ho mona de c ecimien o
GHS: sec e agogos de GH
GHS-R: ecep o de sec e agogos de
GH (GHS-R1a y GHS-R1b)
GLP-1: pép ido ipo glucagon
GLP1R: ecep o de GLP-1
GLUT: anspo ado de glucosa
GOAT: gh elin O-acil ans e asa
GTT: es de ole ancia a glucosa
HFD: die a al a en g asa
i.c. .: in ace eb o en icula
IMC: índice de masa co po al
ITT: es de ole ancia a insulina
JAK2: Kinasa Janus 2
LHA: hipo álamo la e al
LKBI: li e kinase B1
LMW: bajo peso molecula
LPL: lipop o ein lipasa
MBOAT: acyl ans e asas unidas
amemb ana
MCD: malonyl-CoA deca boxilasa
MCH: ho mona concen ado a de
melanina
MCR: ecep o de melanoco inas
(MCR-3, MCR -4)
MDM2: (Mu ine Doble Minu e 2
MMC: complejo mayo de mig ación
mTOR: “mammalian a ge o
apamycin”
NAc: núcleo acumbens
NF-kB: ac o nuclea kappa-be a
NPY: neu opép ido y
NTS: núcleo del ac o soli a io
OB: lep ina
Ob: obesos
TABLA DE ABREVIATURAS
INTRODUCCION
6
núcleo pa a en icula (PVN) donde las ho monas ano exigénicas, ho mona
libe ado a de i o opina (TRH) y ho mona libe ado a de co ico opina
(CRH) y oxi ocina son sec e adas, y o a pa e de las neu onas del ARC se
p oyec an al á ea hipo alámica la e al (LHA) y á ea pe i o nical (PFA)
donde las o exinas y la ho mona concen ado a de melanina (MCH) son
p oducidas. Cuando las señales de adiposidad (insulina y lep ina) alcanzan al
ARC, los pép idos ano exigénicos son libe ados y ac i an a ci cui os
ca abólicos. Al con a io la ac i ación de ías anabólicas lle a a la
libe ación de pép idos o exigénicos y ocu e cuando las señales de
adiposidad que llegan al ce eb o son bajas, indicando la necesidad de
es ablece los almacenamien os de ene gía. Todas es as ca ac e ís icas le
pe mi en al ARC in eg a señales ho monales pa a la homeos asis
ene gé ica.
Núcleo pa a en icula (PVN)
Se encuen a adyacen e a la pa e supe io del e ce en ículo en el
hipo álamo an e io . El PVN es el p incipal si io de libe ación de CRH y
TRH. Nume osas ías neu onales implicadas en el balance ene gé ico
con e gen en el PVN, incluyendo p oyecciones de neu onas NPY del ARC,
o exinas, de i ados del pép ido POMC y el pép ido es imulan e del ape i o
galanina. Todo es o, hace que el PVN desempeñe un papel impo an e en la
in eg ación de señales nu icionales con la glándula i oides y el eje
hipo álamo-hipó isis-ad enal (Nea y e al., 2004).
El PVN es muy sensible a la adminis ación de pép idos implicados en la
inges a como colecis ocinina (CCK), NPY ó gh elin. Es os pép idos pueden
ac ua median e la p o eína kinasa sensible a AMP (AMPK). Es as
p oyecciones desde o os núcleos, así como la de los pép idos pe i é icos,

INTRODUCCION
7
pueden egula la ac i idad de las neu onas TRH y las que exp esan CRH, y
és as a su ez ac úan sob e las células hipo isa ias p oduc o as de TSH,
indicando así que el PVN in eg a señales nu icionales con el eje hipo isa io
y i oideo.
Núcleo en omedial hipo alámico (VMH)
Es ampliamen e conocido como el cen o de la saciedad. Ha sido
iden i icado como un si io diana de la lep ina, la cual ac úa en el hipo álamo
inhibiendo la inges a de alimen os, es imulando el gas o ene gé ico y po lo
an o causando la pé dida de peso. Las lesiones en es e núcleo p oducen
hipe agia y obesidad.
El VMH puede aumen a di ec amen e la ac i idad de las neu onas POMC
median e mic oci cui os, es imulando su ac i idad excep o en es ado de
ayuno en el que disminuye, además de p oyec a hacia o os núcleos
hipo alámicos y al onco ce eb al. Po su pa e el ARC ambién egula la
ac i idad del VMH donde se encuen an ecep o es ipo 4 de las
melanoco inas (MCR4), y ecep o es pa a el neu opép ido Y ipo Y1R, Y2R
e Y5R, sugi iendo que an o POMC como NPY emi en p oyecciones al
VMH. La impo ancia del VMH en la egulación de la homeos asis
ene gé ica ha sido demos ada po es udios en los que se demues a la
exis encia de ecep o es de lep ina (ObRb) y ac i ación neu onal inducida
po lep ina: inyecciones selec i as de lep ina en el VMH educen la inges a y
el peso co po al en a as (I ani BG, 2008).
INTRODUCCION
8
Núcleo do somedial hipo alámico (DMH)
Es e núcleo iene ex ensas conexiones con o os núcleos hipo alámicos
mediales y la e ales y si e como in eg ado y p ocesado de in o mación de
esos núcleos. El núcleo DMH es á elacionado con la modulación de la
sec eción de glucoco icoides, empe a u a co po al, sueño- igilia, i mo
ci cadiano y ac i idad locomo o a (Elmquis JK, 1998; Gooley JJ, 2006).
Á ea hipo alámica la e al (LHA)
Es el clásico cen o del hamb e, con iene neu onas sensibles a la glucosa que
son es imuladas po la hipoglicemia y es c ucial en media la ma cada
hipe agia inducida po la disminución de la glucemia (Be na dis and
Bellinge , 1996).
En él se sin e izan dos ipos de pép idos: hipoc e inas (o exinas) y MCH. Se
ca ac e izan po emi i p oyecciones a un amplio núme o de zonas del SNC
(có ex, álamo o sis ema límbico) pa icipando en nume osas unciones ales
como ap endizaje, memo ia, emoción, y espues as mo o as en unción del
es ado ene gé ico ya que es án eguladas po nume osas ho monas, en e
ellas, gh elin y lep ina.
INTRODUCCION
9
Fig 1: ep esen ación esquemá ica del hipo álamo, su ubicación en el ce eb o y sus p incipales núcleos:
Núcleo a cua o (ARC), núcleo pa a en icula (PVN), Núcleo en omedial (VMN), A ea hipo alámica
la e al (LHA), Núcleo Do somedial (DMN), A ea pe i o nical (PFA).
10
III.-PÉPTIDOS HIPOTALÁMICOS Y PERIFÉRICOS QUE ESTIMULAN
LA INGESTA (o exigénicos)
Neu opép ido Y
El Neu opép ido Y (NPY), aislado en 1982, con iene 36 esiduos de
aminoácidos, incluyendo un esiduo de i osina en cada ex emo, es uno de
los más abundan es pép idos del hipo álamo y uno de los más po en es
ac o es o exigénicos, ha sido uncionalmen e implicado en el
compo amien o alimen icio, egulación ca dio ascula , con ol del eje
neu oendoc ino y e ención de la memo ia. El ARC es el si io de mayo
exp esión pa a NPY den o de las neu onas del hipo álamo que se p oyec an
al PVH, DMH, á ea la e al del hipo álamo y á ea pe i o nical y o os si ios
hipo alámicos.
Cinco ecep o es de NPY han sido iden i icados Y1, Y2, Y4, Y5, Y6, los
cuales median sus acciones en el hipo álamo. El ecep o Y5 ha sido
implicado como un impo an e ecep o que media los e ec os de la inges a
de NPY. El Y5 se exp esa ela i amen e en g andes ni eles en el LHA,
ce cano al si io donde NPY ac úa po en emen e pa a es imula la inges a.
Una de las p incipales unciones que se le han a ibuido a las neu onas de
NPY del ARC, es el es au a el balance ene gé ico no mal y las ese as de
g asa co po al bajo condiciones de dé ici ene gé ico. Al con a io, la
obesidad inducida po sob ealimen ación olun a ia, no es acompañada po
inc emen os en la ac i idad de las neu onas de NPY en el ARC (Widdowson
e al., 1997).
Las neu onas que sin e izan NPY en el ARC son al amen e sensibles al
es ado de de iciencia de ene gía y al as demandas me abólicas. Su exp esión
es es imulada po la dep i ación de comida, así como es ados de
INTRODUCCION
INTRODUCCION
11
inc emen os de eje cicios, ío y emba azo. Se ha is o una ele ada
exp esión de NPY du an e la adminis ación de es e oides como la
co icos e ona, la cual se libe a en es ados de balance ene gé ico nega i o.
Simila men e a la co icos e ona, gh elin, el ligando endógeno del ecep o
de sec e agagos de la ho mona de c ecimien o (GHSR), es un indicado de
insu iciencia ene gé ica que a ec a a la exp esión de NPY. Una demos ación
de la elación en e gh elin y NPY es que es a ho mona es imula la inges a
de alimen os más ma cadamen e cuando es inyec ada di ec amen e al ARC e
induce la exp esión de c-Fos (un ma cado de ac i ación neu onal)
p edominan emen e en neu onas NPY del ARC, donde el ARNm de GHSR
es exp esado (Guan XM e al, 1997). También se ha demos ado una
elación en e NPY e insulina y lep ina, ya que ambas educen la exp esión
génica de NPY (Abe M. e al, 1991). Es e e ec o pa ece es a mediado po
ecep o es de lep ina e insulina en las neu onas de NPY. Además de es as
elaciones, hay e idencias de que cie os nu ien es pueden a ec a la
exp esión de pép idos in oluc ados en la conduc a alimen icia. Es as
e idencias sugie en que NPY se encuen a es echamen e elacionado con la
glucosa y su me abolismo, así como los ca bohid a os de la die a
(Jean enaud B, 2001; Sho -Posne G, 1991). Es a elación en e NPY y
ca bohid a os sugie e que es e pép ido puede es a elacionado con señales
que e lejan una de iciencia de la disponibilidad de glucosa, su
almacenamien o o u ilización. Es a a i mación es apoyada po e idencias
que demues an que los ni eles de ARNm de NPY en el ARC son
signi ica i amen e ele ados después del bloqueo a macológico de la
u ilización de glucosa con 2-desoxy-D-glucosa. (2-DG) (Akabayashi A, e al
1993; Se gee VG, e al, 200).
La exp esión de NPY es ma cadamen e a ec ada po la adminis ación aguda
de glucosa, mos ando una elación in e sa con los ni eles ci culan es.

INTRODUCCION
12
Den o de los p ime os 30-60 minu os después de la inyección de glucosa,
NPY es inicialmen e sup imido en elación a los ni eles ascenden es de
glucosa, después de 90 minu os, es e e ec o es e e ido, lle ando a la
es imulación de NPY según como lo ni eles de glucosa se ace can a su línea
basal. Un mecanismo que puede media es os cambios, es la glucocinasa, un
senso de la u ilización de glucosa, que se exp esa en neu onas NPY del
ARC (Lynch RM, 2000). También se ha is o que la adminis ación de NPY
p oduce un inc emen o en el cocien e espi a o io, lo cual e leja una
educida u ilización de las g asas a a o de los ca bohid a os,
inc emen ando así la acumulación de g asa co po al (Menendez JA, 1990).
En conclusión se puede a i ma que las neu onas de NPY en el ARC es án
es imuladas bajo condiciones de balance ene gé ico nega i o, como ocu e
después de la dep i ación de alimen os, en una die a baja en calo ías, an es
del inicio del ciclo no mal de alimen ación o en animales des e ados con
poca g asa co po al. La unción de NPY endógeno du an e la escasez de
alimen os o en es ado de bajo almacenamien o de ca bohid a os es p omo e
la inges a de alimen os, educi la oxidación de g asas a a o de los
ca bohid a os o es imula la lipogénesis de no o.
Pép ido elacionado a Agou i (AgRP)
El AgRP es un pép ido de 132 esiduos de aminoácidos, iene una al a
homología al p oduc o del gen del colo agou i en a ones (una molécula de
señal pa ac ina p oducida no malmen e en la piel que inhibe el e ec o de la
ho mona α es imulan e de los melanoci os, sob e los ecep o es MC-1
(Leibel e al., 1997). AgRP es exp esado p ima iamen e en el ARC, en
neu onas que ambién p oducen NPY. El AgRP sup ime la ac i idad basal
del MCR-4 ( ecep o ipo 4 de melanoco inas). Es udios
INTRODUCCION
13
inmunohis oquímicos mues an que los cue pos celula es de AgRP se
encuen an limi ados al ARC, ib as de AgRP se p oyec an a di e sas á eas
del ce eb o y múl iples á eas den o del hipo álamo, incluyendo al PVN y
á ea la e al y pe i o nical del hipo álamo (Haskell-Lue ano e al., 1999).
O os es udios demues an una elación uncional es echa en e los ci cui os
neu onales de AgRP y NPY (Mizumo TM, 1999). Se ha demos ado que
es ados de balance ene gé ico nega i o o inc emen o en la demanda de
ene gía, como dep i ación de comida o du an e la lac ancia, los cuales
educen los ni eles de lep ina e insulina e inc emen an los ni eles de gh elin
y de cos icos e ona, es imulan AgRP jun o con NPY (Chen P., e al., 1999).
Al igual que NPY, AgRP es sup imido bajo condiciones de balance
ene gé ico posi i o, cuando la lep ina y los ni eles de insulina se encuen an
ele ados y los ni eles de gh elin se encuen an disminuidos. La exp esión de
AgRP es al a en a as con die as bajas en calo ías compa adas con die as
icas en g asas. Al igual que NPY, AgRP se inc emen a en condiciones
donde la u ilización de glucosa es educida, como la inyección de 2-DG
(Se geye V, 2000). Es o es apoyado po es udios en los cuales los ni eles
endógenos de AgRP son sup imidos po una única inyección de glucosa,
mien as es e e ec o es e e ido cuando los ni eles de glucosa caen a sus
lími es basales. Al igual que NPY, la adminis ación cen al de AgRP iene
un po en e e ec o es imula o io de la inges a de alimen os. Es e e ec o
es imula o io de AgRP du a has a 6 días, un e ec o más du ade o que el
obse ado con NPY (Hagan MM, 2000). La adminis ación c ónica de
AgRP, al igual que NPY, ambién inc emen a la inges a de comida dia ia y
disminuye el consumo de oxigeno y la capacidad del ejido adiposo ma ón
pa a consumi ene gía, lle ando a un inc emen o de la ganancia de g asa
co po al y los ni eles de lep ina (Small CJ, 2001). Tan o AgRP como NPY,
median los e ec os de gh elin. Los a ones con sob eexp esión de Ag p
INTRODUCCION
14
ienen un eno ipo simila al de NPY, ya que mues an hipe agia y obesidad,
inc emen o de la longi ud co po al, hipe insulinemia, hipe plasia de los
islo es panc eá icos e hipe glicemia de inicio a dío (G aham M, 1997). Sin
emba go los a ones con de iciencia de Ag p, son no mo ágicos y mues an
un peso y composición co po al no mal bajo una alimen ación ad libi um
(Qian S, 2002). O os es udios demues an un an agonismo en e los
sis emas de AgRP/NPY y el sis ema de melanoco inas (pép idos
ano exigénicos) en con ola la inges a y el peso co po al. Es udios
elec o isiológicos sugie en que las neu onas AgRP in e ac úan con las
neu onas de POMC en el ARC a a és del GABA (ácido gamma
animobu í ico, neu o ansmiso inhibi o io) (Cowley MA, 2001). Los axones
de neu onas AgRP/NPY colocalizan con p oyecciones de GABA hacia
células POMC en el ARC e inhiben su ac i idad neu al, apoyando la idea de
que AgRP/NPY p oducen e ec os anabólicos sup imiendo el sis ema de las
melanoco inas (POMC). Po o a pa e se ha is o que la lep ina inhibe la
ac i ación de las neu onas AgRP/NPY y educe la libe ación de GABA
hacia las neu onas POMC (Cowley MA, 2001). Con a iamen e gh elin
es imula las neu onas AgRP/NPY, induciendo un inc emen o de la
libe ación de GABA e inhibiendo las neu onas POMC (Cowley MA, 2003).
En conclusión se puede a i ma que el uncionamien o de AgRP en el ARC
es simila a NPY en elación a su modo de ac i ación po condiciones de
de iciencia ene gé ica. Es e pe il endoc ino es e iden e en suje os al inicio
de una ase ac i a, pos e io a una dep i ación de alimen os, en es ado de
baja consumo de glucosa o en die as bajas en calo ías, bajo esas condiciones
AgRP es imula la inges a, educe la u ilización de lípidos a a o de los
ca bohid a os, y p omue e la sín esis de lípidos.
INTRODUCCION
15
Ho mona concen ado a de melanina (MCH)
Es un neu opép ido o exigénico cíclico de 19 aminoácidos. Se de i a de su
p ecu so p ep o-MCH, del cual se de i an ambién o os pép idos con
unciones oda ía desconocidas (Liebe man e al., 2006). Los cue pos
celula es de las neu onas que con ienen MCH se encuen an p incipalmen e
en hipo álamo la e al y en la zona ince a que como hemos desc i o son
cen os egulado es de la alimen ación. Mien as MCH es simila a NPY y
AgRP en se es imulado po la dep i ación de alimen os e inhibido po
lep ina, di ie e en los an e io es en que no es a ec ado po la adminis ación
de gh elin o insulina. También se ha is o que la exp esión de MCH
pe manece inal e ada en a as obesas inducidas po die a compa adas con
a as delgadas. Es e pép ido ac úa especí icamen e a a és del ecep o ipo
1 (MCHR1) el cual es un ecep o con sie e dominios ansmemb anal
asociado a p o eínas G. EL ecep o MCHR1 se exp esa ampliamen e en el
ARC, LHA y en VMH, y ambién en á eas ex a hipo alámicas (He ieu GJ,
2000; Sai o Y, 1999). La exp esión de MCH es es imulada po el ayuno. El
papel de MCH en el con ol de la inges a y homeos asis ene gé ica es
apoyado po hallazgos de la adminis ación cen al de es e pép ido que
po encian la inges a (Kawano H, e al., 2002). Aunque es e e ec o inducido
po MCH es ela i amen e co o y de pequeña du ación compa ado con el de
NPY. Exis e e idencia de que MCH puede ene un mayo e ec o en
p ocesos me abólicos que pueden con ibui a la ganancia de peso (Qu D, e
al., 1996). Es o ue demos ado po el bloqueo de la exp esión de MCH en
a as expues as al io, en las cuales se io un e ec o débil sob e la inges a,
pe o causó una pé dida de peso co po al jun o con un inc emen o de la
exp esión de la p o eína desacoplan e ipo 1 (UCP1) (Pe ei a-da-sil a M,
2003).
INTRODUCCION
22
La exp esión de AGRP/NPY en el ARC es esencial pa a el con ol de la
alimen ación y el peso co po al y di e sos es udios han demos ado que la
ac i ación de las neu onas NPY y AGRP en el hipo álamo medio basal
media los e ec os de gh elin en el balance ene gé ico (G opp E., 2005;
Luque S. e al., 2005).
Pe i é icamen e se c ee que la acción adipogénica de gh elin puede se
di ec a y puede es a mediada po la egulación de PPAR-γ, aunque o os
es udios demues an que gh elin media la adiposidad pe i é ica a a és de
los ecep o es de melanoco inas en el hipo álamo y el sis ema ne ioso
simpá ico e e en e, e ec o que es independien e de la inges a (Ba azzoni R.,
2005).
O o aspec o impo an e en el mecanismo de acción de gh elin es su sis ema
de señalización in acelula y den o de es e el calcio desempeña un papel
impo an e en el modo de señalización u ilizado po los ecep o es GSHR-
1a. El gh elin inc emen a los ni eles de calcio a a és de la adenila o ciclasa
cinasa A y es capaz de desencadena la libe ación de GH a a és de la
p o eína cinasa os olipasa C ( e igu a 5) (Kohno D, 2003; Chen C, 1996).
Se conoce ambién que gh elin inc emen a la inges a de alimen os en
elación al ayuno a a és de la ac i ación de la p o eína cinasa ac i ada po
AMP (AMPK) y ace il-CoA ca boxilasa (ACC) y la inhibición de la sin asa
de ácidos g asos (FAS) en el VMN. También exis en da os que espaldan
que el me abolismo de ácidos g asos, la ac i ación de AMPK y especies de
oxigeno eac i as, pueden media las acciones de gh elin en el núcleo ARC y
VMN (López M, 2008; And ews Z. B., 2008).

INTRODUCCION
23
Fig. 5: Mecanismo de acción de gh elin, a a és de ecep o es GHS-1ª en el hipo álamo e
hipó isis. Gh elin inc emen a el ion calcio in acelula a a és de la ía de la p o eína cinasa
adenila o ciclasa (AC-PKA) en las células que exp esan NPY en el núcleo a cua o o a a és
de la os olipasa C (PLC-PKC). AMPK jun o con ac il-CoA ca boxilasa (ACC) y la acido
g aso sin asa (FAS) ambién median el inc emen o de la inges a de alimen os mediado po
gh elin du an e un ayuno.
Gh elin-Balance ene gé ico y gh elin
Exis en muchas e idencias que demues an que el gh elin es impo an e en la
egulación del ape i o y del balance ene gé ico a co o y la go plazo. Exis e
un aumen o p epandial de gh elin y una caída pos p andial en el plasma
apoyando la hipó esis que gh elin ac úa como un iniciado del consumo de
comidas en humanos ( e igu a 6) (Cummings DE, 2004; Callahan HS,
2004, McCowen KC, 2002).
Gh elin se desc ibe ambién como la con apa e de la insulina y la lep ina.
Gh elin ambién educe la sec eción de insulina es imulada po la glucosa,
po lo an o gh elin inc emen a los ni eles sanguíneos de glucosa y al e a la
ole ancia de glucosa. También se ha demos ado que gh elin inc emen a los
ni eles de ARNm de la p o eína 1 de unión al elemen o egula o io de
INTRODUCCION
24
es e oles (SREBP1) así como p o eínas elacionada con el almacenamien o
de g asa, incluyendo a ACC, FAS y lipop o eina lipasa (LPL) lle ando a la
es imulación de la acumulación de lípidos in aci oplasmá icos,
disminuyendo así el uso de g asa como combus ible me abólico y
a o eciendo un inc emen o de la adiposidad y del peso co po al. Gh elin
induce la obesidad abdominal, independien emen e de su ac i idad
o exigénica cen al (Thompson NM, 2004; Zhang W, 2004).
Fig. 6: Rep esen ación de los ni eles plasmá icos de gh elin du an e un pe íodo de 24 ho as,
se obse an picos de gh elin p e ios a las comidas y disminuyen pos e io a es os.
De es a o ma los ni eles de gh elin se co elacionan in e samen e con el
IMC. Po lo an o los ni eles de gh elin es án educidos en aquellos suje os
que son obesos compa ados a los suje os no males (Tschöp e al., 2001;
Williams e al., 2006). Los ni eles de gh elin se co elacionan nega i amen e
con ac o es que aumen an la obesidad, po cen aje de g asa, insulina y
ni eles de lep ina. En adición, la pé dida de peso se encuen a asociada con
un inc emen o de los ni eles plasmá icos de gh elin (Cummings DE, 2002;
Pu nell JQ, 2007; B oglio F, 2001).
INTRODUCCION
25
Gh elin y o as en e medades
La caquexia se de ine como la pé dida de peso no in encional en la cual se
pie den masa mag a y g asa. La desnu ición en es e escena io es a menudo
muy di ícil de a a y se asocia con un empeo amien o del as o no
subyacen e. Los ni eles plasmá icos de gh elin se han encon ado ele ados
en los indi iduos con meno IMC en compa ación con aquellos con IMC
no mal o supe io (Huang e al, 2007). Algunos es udios de pacien es con
insu iciencia ca díaca conges i a (ICC), la en e medad pulmona obs uc i a
(EPOC) y el cánce no han demos ado una di e encia signi ica i a en las
concen aciones de gh elin en e indi iduos sanos y pacien es cuando se
compa a el IMC (Nagaya e al, 2001; Madeddu C, 2009). A di e encia de la
caquexia po cánce , la caquexia asociada con la insu iciencia enal c ónica
(IRC) se asocia únicamen e con el aumen o en los ni eles o ales de gh elin
(acil-g elin no se inc emen an) (Yoshimo o e al., 2002). Has a aho a, los
in en os de a amien o de la caquexia po cánce con el gh elin han
eque ido dosis sup a- isiológicas de gh elin, pe o han demos ado e ec os
posi i os casi uni e salmen e en el ape i o. Es o sugie e que el e ec o del
gh elin en los cen os es imulan es del ape i o no es á sa u ado en el ma co
de la caquexia po cánce (DeBoe , 2008). En esumen, los sínd omes de
caquexia ienen ni eles ele ados de des-acil gh elin basal. No se sabe si
es os ni eles ele ados de des-acil gh elin son la causa de los sín omas o una
espues a isiológica a la caquexia. La mayo ía de los es ados de la
en e medad que esul an en la caquexia ambién demues an una ele ación
de la gh elin acilo que se puede espe a después de la pé dida de la masa
co po al. Los p ime os es udios con agonis as del GHS-R son p ome edo es
pa a el a amien o de los sínd omes de caquexia (Ga cia and Pol ino, 2007).
26
Gh elin y Sínd ome de P ade -Willis
El sínd ome de P ade -Willi (SPW) es un sínd ome de obesidad gené ica
ca ac e izada po la de iciencia de GH. Los niños con SPW p esen an un
aumen o ápido de peso en la in ancia, jun o con un ape i o o az. O os
desó denes clínicos asociados al SPW incluyen el hipogonadismo, el con ol
abe an e de la empe a u a co po al y al e aciones del sueño. Aunque la
dis unción hipo alámica se piensa que es la base pa a muchas de las
ca ac e ís icas del SPW, los mecanismos subyacen es siguen siendo
desconocidos.
Los ni eles ele ados de gh elin o al se demos a on po p ime a ez en e
los adul os con SPW. Pos e io men e se demos ó que los niños con SPW en
compa ación con los con oles de peso iguales que ienen de 3 a 4 eces
ni eles de gh elin más al os (Haqq, 2003). También se ha demos ado que
du an e el ayuno los ni eles de gh elin ue on signi ica i amen e mayo es en
el g upo de SPW en compa ación con los g upos con ol con obesidad
mó bida (niños con mu aciones en los genes indi iduales MC4R y los
indi iduos con de iciencia de lep ina). Los es udios an e io es y o os que
eplican es os hallazgos demues an que la hipe agia que se obse a en el
SPW puede se secunda ia debido a los ele ados ni eles de gh elin.
INTRODUCCION
INTRODUCCION
27
IV.-PÉPTIDOS HIPOTALÁMICOS Y PERIFÉRICOS QUE INHIBEN LA
INGESTA (ANOREXIGÉNICOS)
T ansc ip o egulado po cocaína y an e aminas (CART)
CART se iden i icó en un p incipio po PCR como un nue o ARNm
esul an e pos e io a la adminis ación de es imulan es psico ópicos
(Douglass J, 1995). El p oduc o p o eico del ARNm iene una secuencia
líde y a ios pa es de aminoácidos básicos. El pép ido madu o con iene
a ios si ios de unión, con lo que CART puede se p ocesado
pos ansc ipcionalmen e en agmen os co os y la gos. Ambas o mas se
encuen an en a as pe o solo las o mas de pép idos co os son encon adas
en humanos (Douglass J, 1995). Los pép idos CART es án localizados en
di e en es á eas especí icas del hipo álamo, incluyendo el PVN, DMH, PFN,
LHA, ARC, así como en hipó isis y glándula ad enal, sugi iendo un eje
hipo álamo-hipó isis-glándula ad enal. Las neu onas CART es án asociadas
con la ecompensa, p ocesamien o senso ial, es és, egulación endóc ina y
alimen ación (Koylu EO, 1997).
Las a as a/ a y los a ones ob/ob ienen ni eles educidos del ARNm de
CART. (La sen e al., 2000). El ayuno a enúa la exp esión del ARNm de
CART en el hipo álamo, demos ando que la egulación del ARNm de
CART se encuen a elacionada a la disponibilidad de alimen os y al es ado
ho monal pe i é ico. La exp esión de CART en el ARC y PVN es es imulada
en a as some idas a die as al as en g asas compa adas con a as con die as
bajas en g asas, es os cambios posiblemen e se deban en pa e al aumen o de
lep ina as las die as al as en g asas, ya que los ni eles de CART se
co elacionan a los de lep ina (Elias CF, 1998).
La adminis ación aguda cen al del pép ido CART disminuye de una o ma
dosis-dependien e a la inges a de alimen os en a ones y educe la inges a

INTRODUCCION
28
es imulada po NPY (Lambe PD, 1998). La adminis ación c ónica cen al
de es e pép ido disminuye la inges a de alimen os y causa una pé dida de
peso en a as delgadas y obesas a/ a. Además an icue pos con a CART
causan un inc emen o en la inges a noc u na. O os e ec os inducidos po
CART incluyen un e ec o inhibi o io de la sec eción y aciamien o gás ico,
inc emen o de los ni eles ci culan es de ácidos g asos lib e y es imulación
de UCP1, 2 y 3 en el ejido adiposo ma ón, ejido adiposo blanco y músculo
lo que sugie e un e ec o en la e mogénesis (Kong WM, 2003).
Exis en e idencias que espaldan una elación en e CART y o os pép idos
hipo alámicos in oluc ados en la homeos asis ene gé ica. En el ARC, odas
las neu onas de CART exp esan POMC, es ableciendo una elación en e
CART y el sis ema de las melanoco inas en la es imulación de la
e mogénesis y gas o ene gé ico y en la mediación de acciones inhibi o ias
sob e la inges a (Elias CF, 1998). O os es udios demues an la coexis encia
de CART jun o con MCH en el hipo álamo la e al y á ea pe i o nical
(B obe ge , 1999). Al igual que las melanoco inas, CART es es imulado en
condiciones de balance ene gé ico posi i o, en asociación con un aumen o de
lep ina, es ingiendo la inges a de alimen os y ac i ando al sis ema ne ioso
simpá ico, p e iniendo la ganancia de peso co po al.
Melanoco inas
Las melanoco inas son pép idos bioac i os de i ados del p ecu so p o-
opiomelanoco ina (POMC) que es un p ecu so de 267 esiduos de
aminoácidos, el cual es sin e izado en el ARC así como en la hipó isis
an e io , aunque ambién se localiza en el sis ema inmune (B obe ge , 1998).
El p oceso pos ansc ipcional de POMC p oduce un núme o de pép idos con
ac i idades biológicas dis in as. En la adenohipó isis, su p ocesamien o
INTRODUCCION
29
p oduce ho mona libe ado a de la ad enoco ico opina (ACTH), en el ARC,
ACTH es seguidamen e p ocesado a α-MSH, mien as la β-lipop o eina da á
a β-endo ina (B obe ge , 1998). Las acciones biológicas de las
melanoco inas es án mediadas po in e acciones con al menos cinco
ecep o es asociados a p o eínas G, siendo MCR-3 y MCR-4
p edominan emen e los que ienen una mayo ele ancia en cuan o a las
acciones me abólicas, MCR-3 se encuen a localizado en el hipo álamo,
especialmen e en el ARC incluyendo en las neu onas POMC y en el sis ema
límbico. MCR-4 es á más ampliamen e dis ibuido a a és del odo el
ce eb o y es al amen e exp esado en di e en es á eas hipo alámicas ales
como el ARC, PVN y PFLH (Liu H, 2003; Moun joy KG, 1994).
O as e idencias elacionan a las melanoco inas con lep ina, señalando que
la lep ina inc emen a los ni eles de POMC pa a eje ce sus acciones sob e el
balance ene gé ico (Cheung CC, 1997).
El pe il de exp esión del ARNm de POMC mues a un i mo ci cadiano,
con ni eles bajos que se alcanzan en el inicio del ciclo de la alimen ación
cuando los ni eles de lep ina son bajos y picos más al os al inal del ciclo.
La elación en e lep ina y las neu onas de POMC, se ha demos ado po el
hecho que las neu onas de POMC exp esan ecep o pa a la lep ina y que
es a ho mona es imula la exp esión de POMC (Elias CF, 1999). Además se
ha is o que a ones ob/ob mues an una educción subs ancial de POMC en
el ARC, hecho que es e e ido po la adminis ación de lep ina. La obesidad
acompañada con al os ni eles de lep ina se asocia con un inc emen o en los
ni eles de ARNm de POMC. Mien as los es ados de dep i ación de
alimen os y lac ancia, que ienen bajos ni eles de lep ina se asocian con
educción de la exp esión del gen de POMC (To i C, 2002).
La lep ina es imula la sec eción de α-MSH en el hipo álamo e induce una
despola ización de las neu onas de POMC de una mane a elacionada a las
INTRODUCCION
30
concen aciones de la misma. Es o p obablemen e es e mediado po canales
ca iónicos no especí icos, así como po la educción en la ecuencia del
e ec o inhibi o io de las neu onas NPY/GABA. La neu onas POMC
hipo alámicas ambién exp esan ecep o es pa a insulina, y la insulina al
igual que la lep ina, es imula la exp esión del ARNm de POMC (Beno i C,
2002). Con a iamen e a es os pép idos, gh elin inhibe las neu onas POMC,
posiblemen e es imulando las neu onas NPY/GABA que aumen an su e ec o
inhibi o io hacia las neu onas POMC (Cowley MA, 2003). La exp esión de
POMC en el ARC no es a ec ada po el consumo de die as al as en g asas.
La adminis ación cen al de α-MSH o un análogo de es e, p oducen una
ue e sup esión de la inges a de alimen os en a ones obesos (Pie oz DD,
2002). La adminis ación c ónica de α-MSH induce una disminución
ansi o ia de la inges a pe o con una educción man enida del peso co po al
y la con inua in usión de α-MSH disminuye la masa g asa in a-abdominal y
mejo a la acción de la insulina sob e la cap ación de glucosa (Obici S, 2001).
La inhibición de MCR-4 p oduce hipe agia, inc emen ando la g asa
co po al e hipe insulinemia. Es os da os sugie en que las acciones de α-MSH
a a és del MC4-R a o ecen el aumen o de la ac i idad del sis ema
ne ioso simpá ico, y si a es o se le ag ega una educción de la inges a de
alimen os, p oduce una disminución del peso co po al (G aham M, 1997;
Ollmann MM, 1997).
Po o a pa e se ha is o que las mu aciones de MCR-4 en humanos se
encuen an ligadas a obesidad mó bida (Fa ooqui JZ, 1993). Además la
es imulación de MC4-R po las melanoco inas ep oduce impo an es
ca ac e ís icas de la caquexia (disminución de la inges a de alimen os y del
peso co po al e inc emen o de la asa me abólica) (Ma sh DJ, 1999).
INTRODUCCION
31
LEPTINA
Ca ac e ís icas gene ales
P e io al descub imien o de la lep ina, expe imen os de pa abiosis con
a ones gené icamen e obesos (ob) y diabé icos (db) ealizados po Coleman
e al, p edecían la exis encia de un ac o ci culan e capaz de ansmi i
in o mación desde la pe i e ia al ce eb o indicando la exis encia de al a
can idad de ese a ene gé ica (Coleman DL, 1973; Coleman DL, 1979).
Es o se con i ma ía en 1994 cuando F iedman e al iden i ica on el gen ob,
que codi icaba una ho mona que se exp esaba especialmen e en el ejido
adiposo, y la denomina on lep ina (del g iego lep os, que signi ica delgado),
y en los años pos e io es con la iden i icación de su ecep o (Lepdb, Lep a)
(Ta aglia LA, e al 1995; Chen H, 1996).
La lep ina es un pép ido de 16 KDa y cons a de 167 aa. (Figu a 7). Es una
ho mona sec e ada po el ejido adiposo blanco en p opo ción a la can idad
o al de masa g asa, el amaño de los adipoci os y su con enido en
iglicé idos; así aumen a en suje os obesos y cae con la pé dida de peso. Se
exp esa ambién, aunque a ni eles mucho meno es en: BAT ( ejido adiposo
ma ón), es ómago, in es ino, epi elio de glándula mama ia, placen a,
músculo esquelé ico. Ci cula en sang e y c uza la ba e a hema oence álica
(BHE) median e un mecanismo sa u able dependien e de ecep o (Ahima e
al., 2000).
INTRODUCCION
38
Los ecep o es CCK-A exp esados en neu onas agales a e en es son
pa icula men e impo an es dianas pa a CCK pa a p oduci las sensaciones
de saciedad, así como media los e ec os de la inhibición del aciamien o
gás ico y es imulación de la sec eción de enzimas panc eá icas (Dock ay
GJ, 1978).
Los an agonis as pa a el ecep o de CCK-A, inc emen an la inges a de
calo ías y educen la sensación de saciedad, sugi iendo el impo an e papel
que desempeña CCK en la egulación del ape i o (Beglinge C, 2001). La
CCK es un modulado del ape i o a co o plazo, su ida media es de 1-2
minu os, y no es e ec i o en educi la can idad de comida si el pép ido es
adminis ado más de 15 minu os an es de las comidas (Gibbs J, 1973). Se ha
is o que la adminis ación c ónica de CCK esul a en la pé dida de peso,
e ec o que puede explica se po la acción conjun o de CCK con lep ina
(Ma son CA, 2000). O os es udios demues an que la adminis ación
c ónica de an icue pos con a CCK o an agonis as de CCK-A esul a en la
ganancia de peso en modelos animales pe o sin inc emen o signi ica i o de
la inges a de alimen os. En a ones knock-ou pa a el ecep o de CCK-A se
desa olla hipe agia y obesidad (McLaughlin CL, 1985; Mee eis-Schwanke
K, 1998). Con odos las e idencias an e io es sob e CCK en elación a su
papel en la inges a de alimen os, su uso pod ía pensa se como una buena
e apia an i-obesidad, pe o da os en animales han demos ado que la
adminis ación p ep andial epe ida de CCK educe la inges a de alimen os
pe o inc emen a la ecuencia de comidas sin esul ados en el peso co po al,
con i mando que la adminis ación con inua de CCK es ine ec i a después
de las p ime as 24 ho as.

INTRODUCCION
39
Polipép ido YY y polipép ido P
Es os polipép idos (PYY, PP) jun o con NPY, son miemb os de una amilia
de pép idos PP plegados y son ac o es ci culan es pun uales de la saciedad.
Todos ellos ienes 36 esiduos de aminoácidos, con ienen esiduos de
i osina, y equie en amidación en el ca boxilo e minal pa a su acción
biológica. Sus e ec os son eje cidos a a és de la amilia de ecep o es Y
que son ecep o es asociados a p o eínas G, cua o de ellos han sido
iden i icados Y1, Y2, Y4 y Y5, los cuales son exp esado en el hipo álamo
(La hmma D, 1996). Y1 y Y5 se expusie on como ecep o es pa a las
acciones o exigénicas de NPY, y el Y2 es exp esado en las neu onas de
NPY, pe o media las acciones de PYY, mien as que el Y4 media las
acciones de PP. El PYY es sec e ado po las células L en e o endóc inas.
Es as células se encuen an a a és de odo el ac o gas oin es inal, pe o
pa icula men e en la po ción dis al. El pa ón de sec eción de PYY es, al
con a io del de gh elin, libe ado a la ci culación después de las comidas y
sup imido po el ayuno. Además de los e ec os de PYY sob e la inges a,
ambién se ha comp obado que inc emen a la abso ción de luidos y
elec oli os del íleon pos e io a una comida e inhibe las sec eciones
gás icas y panc eá icas, con acción de la esícula bilia y aciamien o
gás ico (Ad ian TE, 1985).
En humanos la in usión in a enosa de PYY3-36 educe el ape i o y la inges a
de alimen os ce ca de un e cio y al con a io de lep ina, los ni eles
ci culan es de PYY no se encuen an ele ados en obesos, y los suje os
obesos e ienen comple amen e la sensibilidad a PYY3-36 y se ha epo ado
que es os suje os iene ni eles bajos de PYY en ayuno y pos p andialmen e
(Ba e ham, 2002; Chelikan PK, 2006).
INTRODUCCION
40
Aunque se conoce que la adminis ación pe i é ica de PYY inhibe la inges a
de alimen os, se ha is o que la adminis ación in ace eb o en icula de
PYY3-36 es imula la inges a de comida, p obablemen e a a és de los
ecep o ipo Y1 y Y5 en el núcleo pa a en icula , que son neu onas diana
de segundo o den pa a las neu onas o exigénicas NPY del ARC (W en AM
and Bloom SR, 2007).
Aunque o o es udios demues an una acción ano exigénica de los ni eles
ci culan es de PYY3-36 en el núcleo a cua o. c- os es obse ado en el núcleo
a cua o en espues a a la pe i é ica adminis ación de PYY3-36 y ambién en
la inyección di ec a en el ARC. Es a acción se c ee que es a a és de los
ecep o es Y2 en las neu onas o exigénicas NPY. O os da os espaldan
es os esul ados mos ando inhibición de la inges a al u iliza agonis a de los
ecep o es Y2, mien as la acción e PYY son ausen es en a ones Y2 knock-
ou . Po lo an o PYY educe la exp esión de NPY en el núcleo a cua o,
desinhibiendo a las neu onas POMC. Aunque la desinhibición neu al de
POMC no pa ece se necesa ia pa a la acción de PYY, dados los e ec os
obse ados en a ones knock-ou pa a melanoco inas (Ba e ham RL, 2002;
Abbo CR, 2005).
Al igual que PYY, el pép ido PP es libe ado en espues a a las comidas, en
p opo ción a la ca ga caló ica, e inhibe el ape i o. El PP es p oducido en el
pánc eas endóc ino y exoc ino, colon y ec o. Las ho monas panc eá icas y
gas oin es inales pueden egula los ni eles de PP. Gh elin es imula
ápidamen e la libe ación de PP, mien as soma os a ina educen sus ni eles,
PP se une con mayo a inidad a los ecep o es ipo Y4 (T acks NS, 1980).
La adminis ación pe i é ica de PP a ni eles isiológicos ha mos ado una
educción en la inges a de alimen os, en asociación con una educción del
aciamien o gás ico y la exp esión de gh elin e inc emen o del ono agal.
INTRODUCCION
41
PP ambién inc emen a el consumo de oxigeno y la ac i idad simpá ica, lo
que sugie e un aumen o del gas o ene gé ico (Asakawa A, 2003).
En humanos la in usión de PP educe la inges a de alimen os sin al e a el
aciamien o gás ico. Apa e de los e ec os agudos del PP sob e el ape i o y
la inges a de alimen os, se ha obse ado que el PP modula el balance
ene gé ico a la go plazo (Ueno N, 1999). Ra ones con sob eexp esión de PP
iene un eno ipo delgado con educción de la inges a de alimen os. Los
ni eles del PP se han encon ado aumen ados en indi iduos de ano exia
ne iosa, y exis en abajos que mues as ni eles sup imidos del PP en
suje os obesos, aunque los e ec os del PP sob e el ape i o y peso co po al en
suje os obesos humanos, son desconocidos. Al igual que PYY, la
adminis ación cen al de PP, aumen a la inges a de alimen os en a as (Cla k
JT e al, 1984)
.
42
Fig. 10: Diag ama esquemá ico esumen del hipo álamo; el núcleo a cua o con iene neu onas
que son capaces de es imula o inhibi la inges a de alimen os; Y1 y Y2, sub ipos de
ecep o es de NPY; MC4R, ecep o ipo 4 de melanoco inas; HGSR, ecep o de
sec e agogos de ho mona del c ecimien o; LEPR, ecep o de lep ina; INSR, ecep o de
insulina
INTRODUCCION
INTRODUCCION
43
V.-SEÑALES INTRACELULARES
AMPK
Las células no males gene almen e man ienen una amplia elación en e
ATP y ADP, ípicamen e de 10:1, es o signi ica que exis e un
almacenamien o de ene gía que puede u iliza se pa a p ocesos que equie en
de su icien e ene gía. La mayo ía de las células man iene su elación ATP:
ADP den o de lími es es echos, lo que indica que el g ado de sín esis de
ATP exac amen e coincide con el g ado de consumo de ATP, en nues as
células, es o se log a g acias a so is icados sis emas que man ienen es e
balance y la p o eína cinasa ac i ada po AMP (AMPK) juega un papel
impo an e en es e p oceso. AMPK son complejos he e o imé icos
consis en es en una subunidad α ca alí ica y subunidades β y γ, egulado as,
cada una de las cuales es codi ica po dos o es genes dis in os (α1, α2, β1,
β2, γ1, γ2, γ3). La egión C- e minal de la subunidad α son eque idas pa a
o ma un complejo con la subunidad β y γ (Pang T e al, 2007; Chen L e al,
2009) (Figu a 11).
Fig. 11: Es uc u a de AMPK; los complejos de AMPK son he e o íme os compues os po
subunidades α, β- y γ en una elación 1:1:1. El dominio del ca boxilo e minal de la subunidad
β (β-CTD) o ma el núcleo del complejo, uniéndose a α-CTD y al amino e minal de la
subunidad γ (an es CBS1). AID: dominio au o inhibi o io; CBM, modulo de unión a
ca bohid a os

INTRODUCCION
44
AMPK es ac i ada po 5’-AMP de es o mas dis in as, siendo odas ellas
an agonizadas po al as concen aciones de ATP. Cuando AMP se une, causa
una ac i ación alos é ica de AMPK y hace que és a úl ima sea un mejo
sus a o pa a o as kinasas egulado as, den o de és as, se ha iden i icado
ecien emen e a LKB1 (li e kinase B1) la cual ac i a a AMPK po
os o ilación de la subunidad α en esiduos de eonina especí icos (Th 172)
y es a os o ilación causa la ac i ación de o as p o eínas kinasas en una
mayo can idad (Hawley e al, 1996). LKB1 o ma un complejo con dos
subunidades acceso ias: STRAD y MO25. Es as es subunidades son
eque idas pa a su comple a ac i idad. Se ha demos ado que los a ones
LKB1-knockou mue en du an e el desa ollo emb iona io, demos ando el
papel impo an e que desempeña LKB1 en la ac i ación de AMPK. La
es imulación po AMP solo es obse ada si se encuen a p esen e el
complejo αβγ in ac o, y no cuando el dominio cinasa es aislado. Es
impo an e des aca que el esiduo de eonina de AMPK es conse ado en
odas las a ian es de AMPK en odos los euca io as y la mu ación de es e
esiduo en le adu as causa una pé dida o al de su unción in i o. En
adición a es o la unión de AMP a AMPK inhibe la des os o ilación de la
eonina 172 po p o eínas os a asas (Hawley e al, 2003).
O a ía al e na i a pa a la ac i ación de AMPK, in oluc a a CaMKKβ, la
cual desencadena la ac i ación de AMPK en espues a al inc emen o de Ca++
sin necesa iamen e eque i cambios en los ni eles de AMP o ADP (Foga y
S, 2010).
AMPK es ac i ada po muchas señales de es és que disminuyen el ATP
celula , ales como el en enenamien o me abólico, es és oxida i o, hipoxia
o dep i ación de nu ien es. Es os se pueden conside a como si uaciones de
es és pa ológico que in e ie en con la p oducción de ATP. AMPK puede
INTRODUCCION
45
se ac i ado po es és isiológico causado po la ac i idad del músculo
esquelé ico, ejido que consume g andes can idades de ATP. Aun más, se ha
demos ado que la elación en e el eje cicio y AMPK es esponsable del
e ec o bené ico de ealiza eje cicio egula men e, p e iniendo la obesidad y
o as en e medades. Po o a pa e, se ha comp obado que AMPK media la
es imulación que ealiza lep ina sob e la oxidación de ácidos g asos en el
músculo esquelé ico. La ac i ación de AMPK en el músculo ambién
inc emen a la cap ación de glucosa y la biogénesis mi ocond ial, y es o
sugie e que lep ina pod ía po lo an o, inc emen al el gas o ene gé ico
es imulando la oxidación de glucosa así como de los ácidos g asos en el
músculo. Los ni eles de lep ina, pueden hace que los adipoci os pasen de la
sín esis de g asas a la oxidación de ácidos g asos, y es o se encuen a
asociado con la ac i ación de AMPK en es as células sugi iendo que AMPK
es imula la combus ión de g asas cuando su almacenamien o es excesi o
(Minokoshi Y, e al, 2004; Yang Y, e al., 2011).
En o os es udios se han es ablecidos elaciones en e AMPK y la inges a de
alimen os en mamí e os, AMPK es inhibida en oedo es con al os ni eles de
glucosa, lep ina e insulina, odos los cuales ep imen la inges a de alimen os,
mien as al con a io de lo an e io , AMPK es ac i ada po gh elin, la única
ho mona o exigénica de nues o o ganismo y que es imula la inges a de
alimen os (Ande son e al, 2004). Es os cambios en AMPK pa ecen
desencadena cambios subsequen es en la inges a, hecho comp obado po la
inyección di ec a en el hipo álamo de un ac i ado de AMPK, el 5-
aminoimidazol 4 ca boxamida ibosido (AICAR), p oduciendo un aumen o
de la inges a. O o da o in e esan e es el hecho de que la lep ina inhibe a
AMPK en el hipo álamo pe o ac i a a es e mismo en el músculo esquelé ico.
Se ha de e minado ambién que el sis ema de AMPK se encuen a
INTRODUCCION
46
in oluc ado en la inges a de alimen os en espues a a los ni eles bajos de
glucosa en mamí e os (Me ill G, 1997).
En gene al, la ac i ación de AMPK egula ías biosin é icas como la sín esis
de ácidos g asos y coles e ol, pe o cambia a ías ca abólicas que gene an
ATP, como son la oxidación de ácidos g asos (β-oxidación), cap ación de
glucosa y glucólisis. Es o lo log a no solo con la acción di ec a sob e la
os o ilación, sino ambién a a és de la es imulación de la exp esión
génica, como la es imulación de los anspo ado es de glucosa GLUT4 y
genes mi ocond iales en el músculo esquelé ico y disminuyendo la exp esión
de genes que codi ican enzimas de la sín esis de ácidos g asos y
gluconeogénesis en el hígado. AMPK egula posi i amen e la exp esión de
PGC1 α, el cual es á in oluc ado en el con ol de la exp esión de genes
mi ocond iales en el músculo, pe o egula nega i amen e los ac o es de
ansc ipción SREBP-1c y HNF4α, los cuales se encuen an in oluc ados en
la exp esión de genes elacionados a la lipogénesis, cap ación de glucosa y
glucolisis en hígado (Li Y, e al, 2011). También AMPK os o ila al ubicuo
co-ac i ado p300 en si ios especí icos, educiendo su capacidad pa a uni se
a ecep o es ho monales nuclea es ales como PPAR-γ (pe oxisome
p oli e a o -ac i a ed ecep o -γ) (Na ka VA, e al, 2008). Di e en es
es udios demues an que AMPK inhibe la ía de mTOR a a és de la
os o ilación de TSC2 ( ube ous scle osis complex 2) TSC1 y TSC2 o man
un complejo que egulan nega i amen e el c ecimien o celula y ac úa a un
ni el supe io de TOR causando su inhibición. AMPK os o ila a TSC2 en
dos si ios, y es o p oduce la inhibición de mTOR (Ji C, e al, 2010;
Alexande A, e al, 2010).
En hígado la ac i ación de MAPK disminuye la exp esión de enzimas de la
gluconeogénesis como la os oenolpi u a o caboxicinasa y la glucosa 6
INTRODUCCION
47
os a asa. O a clase de enzimas que son eguladas nega i amen e en el
hígado son las in oluc adas en la sín esis de ácidos g asos, como FAS y
ACC1, es o asegu a que la sín esis de ácidos g asos se encuen e inac i a
(Me ill G, 1997).
AMPK y la egulación del ape i o
En mamí e os AMPK puede in lui en el me abolismo y en el balance
ene gé ico, pa icula men e a a és de sus acciones sob e á eas c í icas del
hipo álamo in oluc adas en la inges a de alimen os ( e igu a 12) (Cla e
M, e al, 2007). Como se sabe el p incipal cen o del con ol del ape i o es el
ARC. Ensayos de kinasas en egiones hipo alámicas de a ones mues an que
las ho monas que inhiben la inges a, como la lep ina, inhiben la iso o ma α2
de AMPK, mien as aquellas que p omue en la inges a, como gh elin o los
cannabinoides, ac i an a AMPK. La inyección di ec a hacia el hipo álamo de
ac i ado es a macológicos de AMPK p omue e la inges a de alimen os.
Usando agen es a macológicos, se demos ó que gh elin ac i a a AMPK a
a és de la ía CaMKKβ en las neu onas p e sináp icas a a és del GHSR-
1a. Consis en e con es o, a ones de icien es de CaMKKβ mos a on una
educción de la exp esión de NPY/AgRP pe o no de POMC y su inges a en
espues a a la adminis ación de gh elin (Yang Y, e al, 2011; Cla e M, e al,
2007).
AMPK pa ece ene ac i idad en el VMH con olando el balance ene gé ico
o al. Hay e idencias que in oluc an a AMPK en la de ección de ni eles
sanguíneos bajos de glucosa p omo iendo la libe ación de ho monas
con a egulado as (ad enalina y glucagon) que es imulan la libe ación de
glucosa po el hígado. Las ho monas i oideas ambién inhiben a AMPK en
es a egión, inc emen ando la ac i idad de los ne ios simpá icos, lo cual
INTRODUCCION
54
SIRT1, e inc emen o de los ansc ip os de UCP2 en células SIRT1 ko (Yang
T, 2006).
SIRT1 y sis ema ne ioso cen al
A ni el del hipo álamo, el ARNm de SIRT1, ue encon ado
p e e encialmen e en el ARC, VMH, DMH, PVH, sup a óp ico y el núcleo
sup aquiásmá ico. Aunque en ni eles bajos el ARNm de SIRT1 ue ambién
exp esado en el hipo álamo la e al. El ARNm de SIRT1 ue exp esado en
ocho de nue e neu onas POMC del ARC (Ramado i G, 2008). A ni el del
hipo álamo, SIRT1 es c ucial pa a las espues as en con a de die as que
inducen a la obesidad y al desa ollo de Diabe es melli us ipo 2 (Coppa i R,
2012). Ho a h e al., demos a on que la ac i ación de SIRT1 en neu onas
NPY/AgRP es de e minan e pa a su exci abilidad, lo cual es impo an e pa a
cambios ap opiados en p ocesos endoc inos que son necesa ios pa a la
adap ación a un balance ene gé ico nega i o (Diano S, 2010). La inhibición
a macológica de las melanoco inas, e ie e el e ec o ano exigénico de la
inhibición hipo alámica de SIRT1, sugi iendo que SIRT1 egula inges a a
a és de la señalización de las melanoco inas. SIRT1 desace ila a FoxO1,
egulando de es a mane a el sis ema de las melanoco inas (Caki I, e al.,
2009).

INTRODUCCION
55
P53
An eceden es
En 1979 se desc ibía una p o eína que o maba un complejo con la
oncop o eína del i us SV40, el g an an ígeno T (Lane and ca w o d 1979).
Como an ígeno T se había iden i icado la oncop o eina i al SV40 eque ida
pa a la iniciación y man enimien o de la ans o mación celula . También
p53 ue de ec ado como un an ígeno umo al, p oduciendo an icue pos en
umo es de células de a ón. En células SV40 ans o madas, el an ígeno T
egulaba los ni eles de la p o eína p53 en una célula de al o ma que se
pos uló que p53 pod ía se un p oduc o oncogénico ligado al p oceso de la
ans o mación i al. Es os es udios señala on que las unciones de la
p o eína p53 es aban ín imamen e in oluc adas en la eplicación i al y la
umo ogénesis de pequeños ADN i ales (Linze , e al, 1979).
En la década de los ‘80 se aisla on a ios clones de ADNc de p53 y se
demos ó que muchos de es os ADNc pod ían ans o ma células en
combinación con el oncogén Ras. Po lo an o p53 se es ableció como un
oncogén. Pe o pos e io men e se descub ió que cada uno de esos clones
ADNc con enía una mu ación y que los clones sin esas mu aciones p e enían
la ans o mación de las células po los oncogenes (Eliyahu e al. 1984;
Pa ada e al.1984; Eliyahu e al. 1985).
Ag egado a lo an e io , ambién se encon a on mu aciones en ambos alelos
de p53 en umo es de a ones, en líneas celula es en cul i os y lo más
impo an e, en cánce de colon en humanos. Con es as obse aciones se
clasi ica on a las p o eínas p53 de ipo sal aje, como genes sup eso es de
umo es.
INTRODUCCION
56
Es as ideas ue on con i madas po cua o obse aciones:
1.-Los pacien es humanos que he eda on un alelo mu an e del gen, con el
sínd ome de Li-F aumenni, desa olla on cánce a lo la go de su ida con un
100% de pene ancia Algunos de es os indi iduos desa olla on a ios
umo es independien es
2.-Los a ones que enían pé dida de la unción ó mu aciones en el gen p53
( a ones knock-ou ) desa olla on umo es a una edad muy jo en.
3.-Has a el 50% de odos los cánce es humanos, se mos a on que con enían
mu aciones en ambos alelos del gen p53 (Oli ie e al 2010; Robles y Ha is
2010).
4.-La exp esión abe an e de la p o eína p53 se encon ó en muchos ipos de
umo es (Ba ek e al. 1990).
Es as obse aciones deja on cla o que la p o eína p53 juega un papel
esencial en la p e ención de cánce es en humanos y animales.
Después de su descub imien o en 1979, la p o eína sup eso a de umo es p53
se ha con e ido en una pied a angula en la comp ensión de la biología
molecula del cánce . p53 ganó la a ención a inales de 1980, cuando se hizo
e iden e que el TP53, el gen que codi ica la p o eína p53, se encon ó
mu ado o al e ado, en una g an p opo ción de los cánce es humanos,
independien emen e de su ipo his ológico. La p o eína p53 es sob e odo un
sup eso de la p oli e ación celula inadecuada, impidiendo la eplicación del
ADN en condiciones que ponen en pelig o la in eg idad gené ica y la
eliminación de las células que c ecen inadecuadamen e. Es e e ec o sup eso
se p oduce a a és de la inducción de la apop osis (po ejemplo, en las
células p ogeni o as expues os a daños en el ADN), senescencia ó de ención
INTRODUCCION
57
ansi o ia del ciclo celula (en muchas células expues as a bajos ni eles de
daño geno óxico) (Bake SJ, 1989; Nig o JM, 1989).
La p o eína p53 se une a secuencias especí icas de ADN o elemen os de
espues a (ER) y ac úa como un ac o de ansc ipción aumen ando la asa
de ansc ipción de de e minados genes que con ienen es os ER. El gen p53
egula los genes de p21 y Cdc25c los que pueden inicia una de ención del
ciclo celula . La p o eína p53 egula BAX, PUMA, NOXA, Apa -1 y o os
genes que pueden conduci a la apop osis de las células. p53 puede ambién
inicia un p og ama de senescencia celula que conduce a un es ado e minal
pa a la eplicación de las células (Yonish-Rouach e al., 1991). Es os
esul ados del p og ama ansc ipcional de p53 conducen a la sup esión de
umo es. Los ni eles de p o eína p53 y su ac i idad se egulan y son
inducibles po un núme o de señales de es eses di e sos. La p ime a señal
que se mues a como un modulado de la ac i idad de p53 es el daño del
ADN. Si las cadenas sencillas o dobles del ADN son dañadas, la p o eína
kinasa ATM (A axia Telangiec asia Mu a ed) puede ac i a p53 como un
ac o de ansc ipción e icien e, que a su ez ansc ibe los genes que
conducen a la de ención del ciclo celula , la apop osis o la senescencia
(Kas an e al., 1991). La espues a celula pa a la ac i ación de p53 es
de e minada en g an pa e, po la ac i ación di e enciada de genes dianas de
p53. Es a espues a se puede p oduci bajo condiciones de mode ado o
empo al es és, induciendo la de ención del ciclo celula dependien e de p53
o la epa ación del ADN an es que las células ing esen de nue o a un es ado
de p oli e ación no mal una ez que el es és haya desapa ecido. Po o a
pa e la espues a de p53 an e un es és g a e o pe manen e, es la inducción
pe manen e de la inhibición de la p oli e ación celula , a a és de apop osis
o senescencia (Bensaad e al, 2005)
INTRODUCCION
58
Regulación de ac i idad de p53
La can idad de p o eína p53 en las células es de e minada p incipalmen e po
la elocidad a la que se deg ada, en luga de la elocidad a la que se
p oduce. El p oduc o de deg adación se ealiza a a és de un p oceso
conocido como p o eólisis mediada po ubiqui ina. A a és de una se ie de
pasos, a ias copias de un pequeño pép ido (ubiqui ina) es án unidas a la
p o eína a se deg adada (en es e caso p53).
Es a cadena de ubiqui ina ac úa como una "bande a", pe mi iendo que p53
pueda se de ec ada po la maquina ia de p o eína-deg adan e (K use JP and
Gu W, 2009). La p o eína MDM2 (Mu ine Doble Minu e 2) es una de las
enzimas implicadas en el e ique ado de p53 con ubiqui ina. Es e p oceso, es
un p oceso de e oalimen ación.
La p o eína p53 se une a la egión egulado a del gen MDM2 y es imula la
ansc ipción de es e gen en ARN mensaje o, que luego se aduce en
p o eína (Figu a 14). Es a p o eína MDM2 se une a p53 y es imula la
inco po ación de g upos de la ubiqui ina al ca boxilo e minal de la p o eína
p53, que a con inuación es deg adado. Es o educe la concen ación de p53 y
educe la ansc ipción del gen de MDM2, ce ando el bucle de
e oalimen ación y pe mi iendo que los ni eles de p53 aumen en de nue o
(I o A., e al., 2001).
INTRODUCCION
59
Fig. 14: Modelo clásico de ac i ación de p53, en el cual se mues a su unión a MDM2 ( o ma
inac i a), an e un es és. Señales como la os o ilación po AMPK, pueden es abiliza lo y de
es a o ma sepa a se de MDM2 ( o ma ac i a) pa a uni se al ADN y ac i a a sus genes diana
Los mayo es ni eles de p53 po sí solos no son su icien es pa a que se
con ie a en un ac i ado ansc ipcional. Es o equie e cambios
con o macionales en la p o eína, como esul ado de modi icaciones ales
como la adición o eliminación de g upos os a os, ace ilos, glucosilos,
ibosa, ubiqui ina o sumoilación ((K use JP and Gu W, 2009) ( e igu a 15).
El ex emo ca boxilo de la p o eína p53 no malmen e se dobla hacia a ás e
inhibe la unión al dominio del ADN si uado en la pa e cen al de la p o eína
p53. La ace ilación de es os de lisina o os o ilación de los esiduos de
se ina ce ca del ex emo ca boxilo de la p o eína p53 puede mejo a la unión
de p53 al ADN, p esumiblemen e al in e e i con es e plegamien o. La
os o ilación del ex emo amino e minal de p53 no a ec a a sus capacidades
de unión al ADN, pe o a ec a a su a inidad po la deg adación de MDM2.
O os cambios en la p o eína p53 y MDM2 ambién son impo an es pa a
p53. Cuando una p o eína p omue e la sín esis de su p opio egulado
nega i o, los ni eles de las dos p o eínas en una célula se espe a ían que
oscilen. Es o se ha obse ado pa a p53 y MDM2. Del mismo modo,
cualquie pe u bación de p53 o MDM2 puede ene e ec os d amá icos en la

INTRODUCCION
60
o a, así como sob e el compo amien o de las células y de los o ganismos.
Es o se demues a po el hecho de que los a ones gené icamen e
modi icados ca en es de MDM2 y p53 pueden sob e i i has a la edad
adul a, mien as que los a ones que ca ecen solo de MDM2 mue en como
emb iones, p esumiblemen e a causa de la ele ada ac i idad de p53 (Rubbi
and Milne , 2003).
Fig. 15: Si ios de os o ilación, ace ilación y ubiqui inización de p53. Donde P: os o ilación;
Ac, ace ilación; Ub, ubiqui imización.
P53 y Me abolismo
Di e sos es udios han señalado cambios d amá icos en los p ocesos
ca abólicos y anabólicos en las células malignas de di e sos umo es. Como
ejemplo, la cap ación de glucosa que e a mucho mayo en los umo es que
en la mayo ía de ejidos no males (Wa bu g O., 1956). Recien es hallazgos
indican que p53 desempeña un papel impo an e en la glucólisis y la
os o ilación oxida i a. El me abolismo de la glucosa es el mayo e en o en
el desa ollo y el man enimien o de una a iedad de cance es humanos,
como ue desc i o en 1956 po O o Wa bu g. La asa o g ado de
INTRODUCCION
61
e men ación lác ica anae óbica en células cance ígenas es
signi ica i amen e mayo que en las células no males. Po ejemplo la
dep i ación de oxigeno en egiones del umo lle a al cambio a la glucólisis
más que a la os o ilación oxida i a, pa a man ene el c ecimien o umo al
(Bensaad K, 2006).
Las ías me abólicas en las células no males es án es echamen e eguladas
pa a pe mi i el c ecimien o celula o la supe i encia, dependiendo de las
condiciones. La disponibilidad de nu ien es acili a la sín esis de p o eínas,
lípidos y ácidos nucleicos pa a el c ecimien o y p oli e ación celula ,
mien as que la ca encia de nu ien es p o oca una se ie de espues as pa a
es ingi la p oli e ación celula , maximiza la p oducción de ene gía y
ayuda a la supe i encia celula . Den o de es os ac o es impo an es en
es as espues as se encuen a mTOR, que p omue e la sín esis de p o eínas y
sup ime la inducción de au o agia. mTOR es egulado po Ak (p o ein
cinasa B) y la p o eína cinasa ac i ada po AMP (AMPK) , el cual se
conside a como un senso de nu ien es espondiendo a un inc emen o de la
elación AMP/ATP bajo condiciones de baja ene gía pa a ep imi a mTOR
(Feng Z., 2005) ( e igu a 16).
La ac i ación de p53 po el es és me abólico es egulada po la os o ilación
dependien e po AMPK e in luenciada po mTOR. La ía de mTOR juega
un papel c í ico en la egulación de la p oli e ación celula y me abolismo
celula . mTOR o ma dos complejos en las células, mTORC1 y mTORC2.
El es és me abólico ac i a a AMPK, el cual en cambio os o ila y ac i a a la
p o eína TSC2 ( ube ous scle osis complex 2). TSC2 eje ce ac i idad de
GTPasa pa a egula nega i amen e a la p o eína de unión al GTP, Rheb,
que es la p o eína que ac i a a mTORC1, el cual a su ez puede di ec amen e
o indi ec amen e des os o ila a p53 en la se ina 15 en espues a a la escasez
de nu ien es (Feng Z, e al, 2006).
INTRODUCCION
62
Fig. 16: Ac i ación de p53 po la ca encia de nu ien es a a és de la ac i ación de AMPK e
inac i ación de Ak . P53 induce a genes que ac i an a AMPK y es e a su ez ac i a a p53,
os o ilándolo, y AMPK ac i a a TSC1 y TSC2. Que p oducen la inhibición de mTOR. LKB1
ambién ac i a a AMPK.
p53 induce la exp esión de un núme o de genes diana de la ía mTOR y
IGF-1/AKT, incluyendo IGF-BP3, PTEN, TSC2, AMPK b1, Ses inas 1 y 2.
Todos los p oduc os de es os genes egulan nega i amen e la ía IGF-1/Ak
y mTOR en espues a a señales del es és. Se ha demos ado que AMPK
puede se os o ilado y ac i ado po la unión a las ses ina 1 y 2, que son
genes dianas de p53. P53 induce la exp esión de las ses inas 1 y 2, las
cuales in e ac úan con las subunidades α de AMPK esul ando en la
os o ilación de AMPK en la eonina 172, lo que esul a en la ac i ación de
AMPK y TSC2 y la inhibición de la ía de mTOR (Budano AV, 2008;
Feng Z, 2007).
Po o a pa e, en la mayo ía de células no males, la ía de los ácidos
ica boxilícos conduce a la gene ación de ATP en la p esencia de O2
( os o ilación oxida i a, 36 ATP po moléculas de glucosa) pe o en
condiciones en donde exis e una limi ación de O2 o donde el ATP se necesi a
ápidamen e, la glucólisis se con ie e en la ía me abólica p e e encial pa a
INTRODUCCION
63
ob ene ene gía, debido a que p oduce ATP a una mayo p opo ción que la
os o ilación oxida i a (aunque p oduce 2 ATP po molécula de glucosa)
(P ei e T., 2001).
Den o de los umo es exis e con ecuencia una disminución del iego
sanguíneo, y po an o las células cance ígenas some idas a un medio de
hipoxia, u ilizan p e e encialmen e la glucólisis. También se conoce que
den o de las células umo ales exis e un inc emen o de los eque imien os
de ene gía, debido a la al a p oli e ación celula , po lo que ambién
necesi an mac omoléculas pa a man ene el c ecimien o umo al, así como
pa a sob e i i en condiciones de es és oxida i o e hipoxia. Se ha
obse ado ambién un aumen o del uso de la glu amina en las células
cance ígenas p o eyendo un impo an e mecanismo anaple ó ico pa a el
ciclo de los ácidos ica boxílicos (Suzuki S., 2010). Todos es os cambios en
las ías me abólicas du an e la ans o mación maligna celula , no son
p oduc o de alguna de iciencia de las mismas, sino una adap ación o
habilidad asociadas a la ans o mación oncogénica pa a p omo e el
suminis o de ene gía a a és de la glucólisis.
Como se ha mencionado an e io men e, la educción de nu ien es o los
bajos ni eles ene gé icos ac i an a AMPK, y se inhibe la ía Ak -mTOR, lo
que conduce a la ac i ación de p53. Po una pa e Ak ac i a a MDM2, un
egulado nega i o de p53, y p53 puede ac i a a PTEN, el cual es un
conocido egulado nega i o de Ak . AMPK puede ac i a a p53
di ec amen e, inc emen ando su ansc ipción ó es abilizando a p53 a a és
de la os o ilación. El ADP y ATP ambién modulan la capacidad de p53
pa a su unión con el ADN, siendo el ADP un p omo o de su unión y el ATP
un inhibido de la in e acción de p53 con el ADN (Feng Z., 2007). Al inal
odos es os p ocesos son un mecanismo po el cual un descenso de la ene gía
se in e p e a como una señal pa a la inducción y ac i ación de p53. Al

MATERIALES Y METODOS
71
MATERIALES Y METODOS
MATERIALES Y METODOS
73
I.-ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN
Pa a ealiza es os expe imen os se u ilizan a as macho Sp ague-Dawley (8
semanas de edad, 200-250 g .; animala io gene al, Uni e sidad de San iago de
Compos ela) y a ones con base gené ica mix a C57BL/6J y 129/s
homocigo os wild ype (w ) y Knockou pa a el gen p53 (ko p53). Los a ones
wild ype (w ) y knockou (ko) se o iginan de apa ejamien os en e a ones
he e ocigo os pa a el gen p53 y solo las camadas de a ones wild ype y knockou
se u ilizan en los expe imen os. En odos los casos se a a de a as macho y
a ones machos y hemb as adul os.
Los animales some idos a ci ugía pe manecen en el animala io du an e 5-6 días
an es de se u ilizados pa a que se adap en a las condiciones de empe a u a y
luz. Es as condiciones se man ienen cons an es a 22-24ºC e iluminación
con olada en ciclos al e nos de 12/12 ho as luz/oscu idad. Las a as y a ones
se alimen an con pienso come cial y agua ad libi um. En el caso de los a ones
alimen ados con die a al a en g asa (High Fa Die HFD) es os pe manecen
como mínimo 12 semanas con es a die a después de se des e ados.
En aquellos casos que es necesa io ealiza una ci ugía en a as, se adminis a
ia in ape i oneal una mezcla de ke amina (100 mg/kg de peso
co po al)/xilazina (15 mg/kg de peso co po al) conside ándose és a una dosis
adecuada pa a consegui una anes esia de g ado II-III du an e pe íodos de una o
dos ho as, siendo la mo alidad muy baja. Los a ones se anes esian con una
inyección in ape i oneal, usando como anes ésico el T ib omoe anol (480
mg/kg, Sigma Ald ich, S Louis, MO).
MATERIALES Y METODOS
74
Los animales se a an y se sac i ican a las 17 semanas de edad, y en el caso de
los a ones de icien es pa a el gen p53, an es de cualquie signo de mo bilidad o
desa ollo de umo es. Todos los p o ocolos de manipulación animal se han
ealizado cumpliendo las No mas de Cuidado de Animales de Labo a o io y Ley
In e nacional de Expe imen ación Animal.
SOLUCION ANESTESICA
I.-KETAMINA: 42.5 % ke ola , pa ke-Da ius, Mo is Plañis N. J. USA,
50mg/ml
II.-XILAZINA 20% Rompun, Baye Le e kusen, Alemania. 2 mg/ml
III.-Solución Salina Fisiológica (SSN)
FORMULA DE DIETAS UTILIZADAS
Fó mula de Die as u ilizadas, Resea ch die s, Inc. 20 Jules lane, New
B unswick, NJ, USA.:
High Fa Die s: p o eínas (20 kcal%), ca bohid a os (35 kcal%), g asas (45
kcal%).
S anda d Die s (die a con ol): p o eínas (20 kcal%), ca bohid a os (70 kcal%),
g asas (10 kcal%).
MATERIALES Y METODOS
75
Ing edien es
HFD
gm.
HFD
kcal
STD
gm.
STD
kcal
Caseína
200 800 200 800
L-cis eina 3 12 3 12
Almidón de maíz 72.8 291 315 1260
Mal odex ina 10 100 400 35 140
Suc osa 172.8 691 350 1400
Celulosa 50 0 50 0
Acei e de soja 25 225 25 225
Man eca de ce do 177.5 1598 20 180
Mezcla de
mine ales S10026
10 0 10 0
Fos a o dicálcico 13 0 13 0
Ca bona o cálcico 5.5 0 5.5 0
Ci a o po ásico 16.5 0 16.5 0
Mezcla de
i aminas V10001
10 40 10 40
Bi a a o de
colina
2 0 2 0

MATERIALES Y METODOS
76
II.-TÈCNICAS EXPERIMENTALES
CANULACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR ( I.C.V.)
Es a ope ación se ealiza ap oximadamen e 4 días an es del expe imen o. El
obje i o de la implan ación de es as cánulas es accede al en ículo la e al. Se
u ilizan cánulas de polie ileno (PE-20, PE-50, Clay Adams, Bec on-Dickionson,
New Je sey USA) de calib e ino (1.09 mm. de diáme o ex e no y 0.38 de
diáme o in e no) en uno de los ex emos de la cánula se pone un ope y se co a
en bisel a unos ¾ mm de dis ancia, siendo es a pa e la que se in oduce en el
ce eb o y la que pe mi e el acceso al en ículo la e al. El ex emo opues o de la
cánula se sella has a el día del expe imen o. Una ez anes esiados los animales,
(con las dosis desc i as p e iamen e), se ealiza un co e en la piel de la cabeza a
la al u a de la en e y has a la pa e pos e io de los ojos, dejando al descubie o
el ejido subcu áneo, el cual debe se e i ado con la ayuda de un bis u í has a
deja a la is a el c áneo. Se localiza el b egma, que sepa a los huesos on ales
de los occipi ales y se u iliza como pun o de e e encia pa a ealiza un o i icio
(1.2 mm mediola e al y 1 mm pos e io ) a a és del cual se in oduce la cánula.
Pos e io men e se añade cianoac ila o pa a que la cánula quede pe ec amen e
ija y se sella oda la zona abie a.
Pa a comp oba que la cánula ha quedado en posición co ec a se inyec a
p o amina 2 %, disuel o en agua con ace a o sódico, lo cual cla amen e iñe el
en ículo la e al, demos ando así que la cánula ha sido colocada
co ec amen e.
MATERIALES Y METODOS
77
III.-METODOLOGIA EXPERIMENTAL
Es ado nu icional
E ec o del es ado nu icional
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8 a as con alimen o ad libi um
8 a as en ayuno du an e 48 ho as
8 a as en ayuno du an e 48 ho as y ealimen adas du an e 24 ho as
E ec o de la alimen ación con die a al a en g asas (HFD)
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8-12 a ones w alimen ados con die a al a en g asas
8-12 a ones p53 ko alimen ados con die a al a en g asas
T a amien os in ace eb o en icula es (i.c. .)
E ec o de gh elin sob e la inges a y ganancia de peso
Adminis ación i.c. . de ghelin
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8 a as con ol (5 ul solución salina no mal, SSN)
8 a as a adas con gh elin (5 ug/5 ul)
Gh elin (gh elin human i uo oace a e; e : H4864; Bachem)
E ec o del inhibido de SIRT1 sob e la acción de gh elin
Adminis ación i.c. . de EX527 y gh elin
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8 a as con ol (5 ul DMSO + 5 ul SSN)
8 a as a adas con gh elin (5ug/5 ul SSN)
MATERIALES Y METODOS
78
8 a as a adas con EX527 (10 ug/5 ul DMSO)
8 a as a adas con EX527 (10 ug/5 ul ) + gh elin (5ug/5 ul)
Gh elin (gh elin human i uo oace a e; e : H4864; Bachem)
EX527 (6-Chlo o-2,3,4,9- e ahyd o-1H-ca bazole-1-ca boxamide, 10
mg,
TOCRIS bioscience)
El mismo p ocedimien o se u ilizó pa a la adminis ación de Si inol 10 µg i.c. .
(Toc is Bioscience, USA)
E ec o de la adminis ación de Res e a ol sob e la inges a
Adminis ación de es e a ol (10 ug/2 ul) i.c. .
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8 a ones w con ol (2 ul DMSO)
8 a ones w Res e a ol (2 ul Res e a ol )
8 a ones p53 ko con ol (2 ul DMSO)
8 a ones p53 ko Res e a ol (2 ul)
Res e a ol (Toc is Bioscience, USA, 1418)
E ec o de la adminis ación de AICAR
Adminis ación de AICAR (3 ug/5 uL) i.c. .
Se es ablecie on los siguien es g upos expe imen ales:
8-12 a ones C5/BL6 p53 ko (2 ul SSN)
8-12 a ones C5/BL6 p53 ko AICAR (3 ug/5 uL; Sigma-Ald ich, A9978)
MATERIALES Y METODOS
79
IV.-PROTOCOLO EXPERIMENTAL
GASTO ENERGETICO, ACTIVIDAD LOCOMOTORA, COCIENTE
RESPIRATORIO
Se analizó el gas o ene gé ico, cocien e espi a o io RQ y ac i idad locomo o a
usando un sis ema calo imé ico de 12 cajas (PhenoMas e , Sophis ica ed Li e
Science Resea ch Ins umen a ion, TSE sys em, Ge many). Los a ones ue on
colocados en cajas indi iduales du an e 48 ho as pa a su adap ación,
pos e io men e se colocan en el sis ema du an e 48 ho as, du an e los que se
ecolec an los da os y pos e io men e se analizan. Se u iliza on 12 indi iduos
po g upo.
TEST DE TOLERANCIA A LA INSULINA
El es es ealizado en a ones adul os con más de 12 semanas de edad, se ealiza
po la mañana en a ones en ayuno noc u no, se inyec a la insulina (0.75 U/kg)
disuel a en SSN de mane a in ape i oneal. P e io a la inyección de insulina, se
ecolec a sang e de la ena de la cola, pa a medi los ni eles de glucosa basal,
luego se inyec a la insulina in ape i oneal y se mide la glucosa a los 15, 30, 60
90, 120 minu os, median e un glucóme o.
Ma e ial
- Glucóme o y i as de glucosa
- Je ingas 1 ml x 27s ga.
- Insulin Human, ecombinan 50 MG (Sigma Ald ich, S . Louis, USA)
MATERIALES Y METODOS
86
RT-PCR:
EXTRACCION DE ARN TOTAL
a) Ex acción de ARN de los ejidos
Las mues as congeladas se homogenizan mecánicamen e (Poly on) después de
añadi le una can idad de e minada de T izol (In i ogen): 400 μl en el caso del
hígado, y 500 μl en el caso de la g asa.
Después de la homogeneización las mues a se dejan eposa a Tª ambien e
du an e unos 5 minu os
b) Aislamien o de ARN
A con inuación se añade 1 ml de clo o o mo y se agi a ue emen e du an e
a ios segundos, y luego se dejan eposa du an e unos minu os. T anscu ido
ese iempo se cen i uga 15 minu os a 12000 pm a 4ºC obse ando ya
cla amen e las 2 ases: una ase acuosa (donde se halla el ARN) y una ase
enólica (que con iene las p o eínas y los lípidos), en e ambas se encuen a la
in e ase (donde es á el ADN). Se e i a la ase acuosa con cuidado pasándola a
o o ubo de polip opileno au ocla ado y se desp ecia la ase enólica. De esa
mane a sepa amos el ARN del es o de los componen es celula es.
c) P ecipi ación de ARN
Una ez sepa ado el RNA, se le añade 1 ml de isop opanol, se agi a y se deja a -
20ºC du an e unos 10 minu os, consiguiendo así que el ARN p ecipi e.
T anscu ido es e iempo se cen i uga 10 minu os a 12000 pm a 4ºC pa a
concen a el ARN al ondo.

MATERIALES Y METODOS
87
d) La ado
Una ez eliminado el sob enadan e se añade 1 ml de e anol al 70% en H2O
DEPC, y as una agi ación co a se cen i uga du an e unos 5 minu os a 12000
pm y 4ºC.
Pa a elimina la mayo can idad de e anol posible, se uel e a cen i uga 1
minu o a 13500 pm y 4ºC, y pos e io men e se e i a el sob enadan e con una
pipe a. Finalmen e se esuspende en H2O DEPC calen ándolo a 60 ºC du an e
15 minu os.
Cuan i icación
La concen ación de ARN de la mues a se de e mina en un espec o o óme o
ajus ado a 2 longi udes de onda: 260 y 280 nm. La abso ción a 260 nm
p opo ciona la can idad de ácidos nucleícos y a 280 nm la can idad de p o eína.
El g ado de pu eza de la mues a se de e mina es udiando el cocien e 260/280,
conside ándose acep able la oscilación en e 1.8 y 2.
**TRIZOL® Reagen (In i ogen)
**Clo o o mo
**Isop opanol
**E anol 70%
**H2O DEPC: agua bides ilada con die ilpi oca bona o al 0.1%. T as una noche
a Tª ambien e se au ocla a.
MATERIALES Y METODOS
88
RETROTRANSCRIPCIÓN (RT)
La eacción de e o ansc ipción se lle a a cabo en un olumen o al de 30 μl,
con las siguien es p opo ciones:
-Volumen de mues a necesa io pa a ob ene : 500 ng de (g asa) ó 100 ng
(hígado) de ARN o al
-6 μl de ampón de e e so ansc ipción (5X i s s and bu e ; In i ogen) (250
nM T is-HCl, pH 8.3, 375nM KCl, 15mM MgCl2, 50nM DDT)
-1.5 μl ClMg2 de 50 mM (In i ogen)
-6 μl de mezcla de dNTPs (dTTp, dCTp, dGTp, dATp, con una concen ación
de 10 mM de cada uno
-0.17 μl de cebado es (Random p ime s, In i ogen)
-0.25 μl inhibido de RNasa(RNaseOUT®, 40 U/ μl In i ogen)
-2 μl de m-MLV e e so ansc ip asa (200 U/ μl, In i ogen)
-Volumen co espondien e de H2O MQ pa a ob ene el olumen inal de 30 μl
También se ealiza una RT (30 μl de mezcla de eacción excep o mMLV, cuyo
olumen e a sus i uido po H2O MQ)
Una ez p epa adas las mezclas de eacción, se incuban en un e mociclado ,
que ealiza los siguien es pasos: 50 minu os a 37ºC, 15 minu os a 42ºC, 5
minu os a 95ºC, y inalmen e las mues as se man enían a 4ºC.
PCR Tiempo Real (TAQMAN)
Se usa como sis ema de de ección las Sondas Taqman (Sondas especí icas
ma cadas con luo oc omos: donado y acep o ). Es á basado en la ans e encia
de ene gía luo escen e median e esonancia (FRET) en e las dos moléculas.
MATERIALES Y METODOS
89
El luo oc omo u ilizado pa a la ealización de la PCR ha sido TAMRA que
posee un máximo de abso ción de 560nm y un máximo de emisión de 580nm.
Los p ime s usados ue on diseñados según la base de da os BLAST. La mezcla
de eacción de PCR cuyo olumen inal e a de 12 μl es aba cons i uida po :
-2.92 μl H2O-MQ
-0.36 μl Oligonucleó ido sen ido (10 μM)
-0.36 μl Oligonucleó ido an isen ido (10 μM)
-0.36 μl Sonda (5 μM)
-6 μl Taqman Uni e sal PCR mas e mix; (Applied Biosys ems)
-2 μl Mues a (RT)
Además de las mues as, se añade un con ol nega i o (-RT), un blanco y 6
mues as pa a la ealización de una cu a pa ón an o pa a el gen p oblema
como pa a el housekeping o gen cons i u i o, odo ello po duplicado.
**Cu a pa ón: cons a de 6 pun os ealizados po dilución se iada (1:4) a pa i
de un olumen o al de 30-40 μl esul an e de la mezcla de dis in as mues as de
RT (2 μl de dis in os p oduc os de RT, pe o siemp e del mismo a amien o o
ejido).
Las condiciones de ampli icación ue on de:
1) 50ºC du an e 2 minu os
2) 95ºC du an e 10 minu os,
3) 95 º du an e 15 segundos y 60ºC du an e 1 minu o. Núme o de ciclos: 40
Pa a lle a a cabo la eacción de PCR se u iliza 7300 Real Time PCR Sys em
(Applied Biosys ems) median e el p og ama in o má ico 7300 Sys em
So wa e® (Applied Biosys ems). El análisis de los da os se ealiza en base a un
MATERIALES Y METODOS
90
gen de e e encia, en es e caso el 18S, en conc e o calculando la di e encia en e
e iciencias de ambos genes:
Re e encia y p oblema.
mRNA Secuencia
SondaFAM-5’-ACCTTTGAAGATTTCGTCAGGATCTTTGATGA-3’-
TAMRA
ACCα Pime o wa d 5´-TGGGCGGGATGGTCTCTTT -3´
P ime e e se 5’-AGTCGCAGAAGCAGCCCATT-3’
Sonda FAM-5’-CTGCCCAGGACAGGAACCG-3’-TAMRA
FAS Pime o wa d 5’-GACATTTCATCAGGCCACC-3
P ime e e se 5’-CCTCTAGCAGCCGCACCTC-3’
Sonda FAM-5’-CCTGCCGGAGGTCGCCACAAATA-3’-TAMRA
LPL Pime o wa d 5’-CTGAAAGTGAGAACATTCCCTTCA-3’
P ime e e se 5’-CCGTGTAAATCAAGAAGGAGTAGGTT-3’
SondaFAM-5’-TCACCTTGAGAGAAGAATTAGCACGCACGG-3’-TAMRA
SCD-1 Pime o wa d 5’-TGCCAGAGGGAATAGGGAAA-3’
P ime e e se 5’-CTCTCCCATCCTTACTTACAAACCA-3’
Sonda FAM-5´-TGGTCAAGGAGCTGCAGAAGGAGTTTCCT -3´-TAMRA
MCD Pime o wa d 5´-CGGCACCTTCCTCATAAAGC -3´
P ime e e se 5´-TGGAAAAGGCCCCCAGAT -3´
CPTM Come cial
Sonda FAM-5´-CGCTGTTGTCGGCTTATTGTATCCCTTGT -3´-TAMRA
INSIG Pime o wa d 5´-TGCTGTGGCACGGCAG -3´
P ime e e se 5´-CTCCCAGGTGACTGTCA -3´
Sonda FAM-5’-CCCTGGCCTATTTGATGCC-3’-TAMRA
SREBP 1-c Pime o wa d 5’-CTCATCAACAACCAAGACAG-3’
MATERIALES Y METODOS
91
P ime e e se 5’-CCTGTCTCACCCCCAGCAT-3’
Sonda FAM-5’-GACGGCAAGTCTGGTGCCAGCA-3’-TAMRA
18S Pime o wa d 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’
P ime e e se 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’

MATERIALES Y METODOS
92
HIBRIDACIÓN IN SITU
La exp esión génica de los neu opép idos hipo alámicos AgRP, NPY así
como el ac o de asc ipción Bsx, se es udió po hib idación in si u.
Dado que los pép idos es udiados se exp esan en más de un núcleo
hipo alámico, es a écnica nos ha pe mi ido delimi a , ana ómicamen e
los posibles cambios de exp esión del ARNm.
Pa a lle a a cabo es e es udio se u iliza on como sondas
oligonucleó idos monoca ena ios an isen ido, ma cadas en 3’ con [α-35S]
dNTP, odas ellas diseñadas en nues o labo a o io. (Tabla 3)
a) Ob ención de los co es
Los ce eb os de a a que se almacenan a -80ºC has a su
u ilización, se co an en un c ios a o (HM50E®, Mic om) en
secciones de 16µm de espeso . Los co es se mon an en
po aobje os ecubie os de polilisina (PolysineTM; VWR)
Los po aobje os con las secciones de in e és son elegidos en
unción de los c i e ios es e eo áxicos del “A las de ce eb o de
a a” de Paxinos & Wa son. Así pa a el es udio de AgRP, NPY y
Bsx, los co es debían inclui el núcleo a cua o hipo alámico.
Ma caje de la sonda
La eacción de ma caje iene luga en un olumen inal de 20µl.
El o den de los eac i os es el que sigue:
MATERIALES Y METODOS
93
• 10,5µl H2O DEPC
• 2 µl de 10X NE Bu e 4 (1X NEBu e 4 con iene:
50mM ace a o po ásico, 20mM T is-ace a o, 10mM
ace a o magnésico, 1mM DTT; pH 7.9) (BioLabs®)
• 2 µl de Oligonucleó idos (100 ng; la concen ación de
abajo inal es 50ng/ µl)
• 2 µl de solución 10X de CoCl2 (2.5mM) (BioLabs®)
• 1.5 µl de la enzima Te minal T ans e asa (Td )
suminis ada en 60mM KPO4 (pH 7.2), 150 mM KCl,
1mM 2-me cap oe anol, 0.5% T i on X-100 y 50%
glice ol. (BioLabs®)
• 2 µl dNTP-S35 (Pe kinElme ®)
La incubación se lle a a cabo en un baño a 37ºC du an e 120-150
minu os. Una ez concluida la eacción, es necesa io sepa a los
oligonucleó idos ma cados de los dNTP-S35 no unidos. La
sepa ación iene luga po c oma og a ía de exclusión. Se u ilizan
columnas de c oma og a ía come ciales con Sephadex G-50
(Illus a™ NICK Columns. GE Heal hca e). El ampón que se
u iliza pa a elui la columna es TE (10mM T is-HCl / 0.1mM
EDTA; pH 8). P ime amen e se la an las columnas con dicho
ampón, pa a a con inuación elui dos acciones en 400µl de TE.
La úl ima de las acciones se co esponde con el oligonucleó ido
ma cado. Finalmen e p ocedemos a de e mina el núme o de
cuen as adiac i as en un con ado ß (WinSpec al 1414®,
MATERIALES Y METODOS
94
Wallac), diluyendo pa a ello 4µl del oligo ma cado en 4ml de
líquido de cen elleo.
b) P epa ación del ejido
Los co es son secados ápidamen e con el obje o de elimina los
posibles es os de hielo seco, y a con inuación se ijan en
pa a o maldehido al 4% en ampón os a o 0.2M, du an e 30
minu os a empe a u a ambien e. Pa a elimina los es os de
pa a o maldehido se hacen dos la ados ápidos con PBS 1X.
Pos e io men e, se p ocede a la deshid a ación de los co es
median e la ados sucesi os en di e en es concen aciones de
e anol (Guinama) (70, 80, 90, 95 y 100%, 5 minu os cada uno, a
excepción del la ado en e anol absolu o, que ue de 10 minu os).
Po úl imo se dejan seca los co es al ai e lib e.
c) Hib idación
Sob e cada po a se aplican 200 µl de la solución de Hib idación,
con 0.5x106 o 1x106 cpm según el oligonucleó ido ma cado que
es u iésemos empleando en cada caso (Tabla 4). Dicha solución,
es á cons i uida además de los oligos ma cados po Bu e de
Hib idación y DTT 1M.
El Bu e de Hib idación con iene H2O DEPC, SSC 4X (a pa i
de SSC20X: 3M NaCl; 300mM Ci a o Sódico T ibásico
Hid a ado; Sigma), 10% Dex an sul a o (Sigma), disolución
Denha ’s 1X (albúmina de sue o bo ino-BSA, 1% Ficoll, 1%
MATERIALES Y METODOS
95
Poli inilpi olidona-PVP; Sigma), ADN de espe ma de Salmón
(Sigma), 50% o mamida desionizada (Sigma).
Los po aobje os con la sonda se hib ida on oda la noche a 37 ºC
en a mós e a húmeda.
d) La ados
• Eliminamos el exceso de sonda y a con inuación
ealizamos 5-6 la ados ápidos en SSC 1X
• Pos e io men e la amos 4 eces con SSC 1X a 42ºC o
55ºC du an e 30 minu os cada la ado. (Tabla 4)
• Un la ado de 1 ho a a empe a u a ambien e en SSC 1X
• La ado ápido con H2O milliQ au ocla ada
• P ecipi amos las sales con un la ado ápido en e anol 70%
con 300mM NH4AC
• La amos con e anol absolu o y dejamos seca los co es
e) Exposición y e elado
Una ez secos los po as, se exponen a una película de
au o adiog a ía (Kodak Biomax MR Film) en condiciones de o al
oscu idad (Hype casse e™ Ame sham Biosciencies). En cada
película son expues as secciones ep esen an es de cada g upo
expe imen al. Los iempos de exposición son dis in os según el
oligonucleó ido es udiado. (Tabla 4). T anscu ido el iempo de
exposición las placas son e eladas en condiciones de oscu idad
du an e 2.5 minu os y pos e io men e ijadas du an e 5 minu os.
MATERIALES Y METODOS
102
Análisis es adís ico
Los esul ados en odos los casos se p esen an como la Media ± SEM (S anda d
E o o he Mean) de al menos 6-8 indi iduos po cada g upo expe imen al.
Los da os se analizan median e ANOVA, seguido de un es pos hoc de Tukey-
K ame siemp e que las a iables cumpliesen los equisi os de no malidad ( es
de Kolmogo o -Smi no ). Cuando las a iables no cumplen alguna de las
condiciones se u iliza el es no pa amé ico de compa ación múl iple de
K us all-Wallis. Pa a análisis pa ciales en e dos g upos expe imen ales se
emplea el es -s uden siemp e que sea posible, y en su de ec o el es no
pa amé ico Mann-Whi ney. Los análisis es adís icos se ealizan u ilizando el
p og ama in o má ico G aphPad Ins an 3.05. En odos los casos, se conside a
una di e encia es adís icamen e signi ica i a a pa i de la p obabilidad p<0.05.

RESULTADOS
RESULTADOS
105
RESULTADOS
Es bien conocido el papel que el gen sup eso de umo es p53 desempeña como
egulado de los cambios celula es du an e el desa ollo y p og esión de
umo es. Sin emba go p53 posee ambién la capacidad de media cambios
me abólicos en las células a a és de la egulación del me abolismo ene gé ico
y el es és oxida i o.
Con la elación que se es ableció años a ás de p53 y la glicólisis, es a á ea ha
ganado in e és cien í ico y ecien es es udios han demos ado la capacidad de
p53 de egula la exp esión de di e en es enzimas in oluc adas en la glucolisis
así como en la os o ilación oxida i a (Kondoh H, 2005; Schwa zenbe g-Ba -
Yoseph F., 2004; Bensaad K, 2006).
La die a es ánda no modi ica las ca ac e ís icas eno ípicas de los a ones
p53 ko en elación a sus con oles.
En un expe imen o inicial pa imos de camadas de a ones machos homocigo os
wild ype (w ) y p53 knockou (p53 ko) los cuales ue on alimen ados con una
die a es ánda (4 kcal% g asas, Die a AO4/AO4C/RO4, Scien i ic Animal ood
& Enginee ing, SAFE, F ancia) du an e 12 semanas pos e io a su des e e. Los
animales se es abula on en cajas indi iduales con agua y comida ab libi um y se
moni o izó el peso e inges a semanales du an e las 12 semanas.
RESULTADOS
106
Peso co po al (g )
0
5
10
15
20
25
30
w p53 ko
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
w p53 ko
Fig. 1: Peso (A) e inges a dia ia (B) de a ones wild ype y p53 knockou , alimen ados
con die a es ánda (STD) ad libi um du an e 12 semanas pos e io a su des e e.
(n=12/g upo).
Como podemos obse a , nues os esul ados demues an que no exis en
di e encias es adís icas signi ica i as en cuan o a peso (Figu a 1A) e inges a
(Figu a 1B) en los a ones p53 ko compa ados con los a ones w , alimen ados
ad libi um con un die a es ánda du an e 12 semanas pos e io a su des e e.
La die a es ánda no al e a la composición co po al, ni el gas o ene gé ico en
los a ones p53 ko.
Nues o siguien e expe imen o ue e alua la posible ganancia ne a de masa
g asa y no g asa en e es os dos g upos expe imen ales, a a és de esonancia
magné ica nuclea (RMN, Whole Body Composi ion Analyze
EchoMRI,Gene al Elec ic Equipmen s, Hous on,USA). Luego alo amos el
gas o ene gé ico y la ac i idad locomo o a, po calo ime ía indi ec a, a a és
de un sis ema calo imé ico de 12 cajas (PhenoMas e , Sophis ica ed Li e
Science Resea ch Ins umen a ion, TSE sys em, Ge many). Los a ones ue on
pues os p e iamen e en cajas de adap ación du an e 48 ho as con agua y die a
Inges a de alimen os (g )
A B
w STD
p53ko STD
RESULTADOS
107
0
5
10
15
20
25
w p53 ko
0
200
400
600
800
w p53 ko
0
5
10
15
20
25
w p53 ko
es ánda ad libi um, luego se es abula on en 12 cajas indi iduales en el sis ema
de calo ime ía du an e 48 ho as ( e ma e iales y mé odos)
Pa imos de los g upos an e io es:
12 a ones machos wild ype (con oles)
12 a ones machos knockou p53
Fig. 2: E ec o de la die a es ánda sob e la ganancia de masa g asa (A) y no g asa (B)
gas o ene gé ico (C) y ac i idad locomo o a (D) en a ones w y p53 ko. El gas o
ene gé ico y la ac i idad locomo o a ue on moni o izados du an e 48 ho as du an e la
ase diu na (ba as blancas) y ase oscu a (ba as g ises). (n=12/g upo).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
w p53 ko
Masa g asa (g )
Masa mag a (g )
Gas o ene gé ico
(kcal/kg/ 48 h s.)
Ac i idad locomo o a o al
48 ho as
A B
C D
w STD
ko STD

RESULTADOS
108
w p53 ko
0
20
40
60
80
100
120
En es os esul ados obse amos que la adminis ación de una die a es ánda
du an e 12 semanas, pos e io a su des e e no p oduce di e encias es adís icas
signi ica i as en los a ones p53 ko compa ados con los w , en elación a la
ganancia ne a de masa g asa, (Figu a 2A) ampoco encon amos di e encias
signi ica i as en la masa mag a (Figu a 2B) en e ambos g upos.
En elación al gas o ene gé ico, pudimos obse a que ambos g upos, w y p53
ko, man ienen el mismo gas o ene gé ico con la misma ac i idad locomo o a,
an o en la ase de luz como en la oscu a. (Figu a 2C y 2D). Es os esul ados
nos sugie en que la ausencia del gen p53, con una inges a de una die a es ánda ,
no es un ac o de e minan e en pa áme os que in luyen en el peso como son la
inges a y el gas o ene gé ico.
La die a es ánda no modi ica el pe il glicémico de los a ones p53 ko
Como ya es sabido, muchos de los cambios en el me abolismo se e lejan en
al e aciones de los ni eles ci culan es de glucosa, en la ole ancia a la glucosa ó
en la sensibilidad a la insulina, po lo que en un úl imo expe imen o con es e
ipo de die a, e aluamos los ni eles de glucosa basal, el es de ole ancia a la
glucosa y el es de ole ancia a la insulina.
Glucosa basal (mg/dl)
A w STD
ko STD
RESULTADOS
109
0 15 30 60 120 (min)
0
50
100
150
200
250
300
350
P53 KO
P53 WT
0
20
40
60
80
100
120
0 15 30 60 120 (min)
P53 KO
P53 WT
Fig. 3: ni eles glucosa en ayuno (A), es de ole ancia a la glucosa (B), es de
ole ancia a la insulina (C) en a ones w y p53 ko, alimen ados con una die a es ánda
du an e 12 semanas pos e io a su des e e. (n=12/g upo).
Obse amos que los a ones p53 ko ienen los mismos ni eles de glucosa en
ayuno que los a ones w . (Figu a 1A). Además, al some e los al es de
ole ancia de glucosa, no se encon a on di e encias signi ica i as en e ambos
g upos. (Figu a 2B). En el es de ole ancia a la insulina ampoco se obse a on
di e encia es adís icas signi ica i as. (Figu a 2C). Es os esul ados indican que
an o el me abolismo de la glucosa como la sensibilidad a la insulina no es aban
al e ados en los a ones p53 ko alimen ados con una die a es ánda .
Ni eles de Glucosa (mg)
Ni eles de Glucosa (mg)
B C
GTT ITT
110
E ec o de la die a al a en g asas (HFD) en a ones p53 knockou
Aunque la gené ica juega un papel impo an e en la homeos asis ene gé ica,
exis en o os ac o es ex e nos o medioambien ales como los di e en es ipos de
die a que de e minan en un g an po cen aje la génesis de la obesidad. Di e sos
es udios epidemiológicos han demos ado la asociación en e obesidad y el ipo
de die a, especialmen e la die a al a en g asas (Jéquie E., 2002; Hill JO, e al,
2000) que conduce al aumen o de la mo bilidad, aumen ando la ecuencia de
en e medades como la diabe es melli us, hipe ensión, en e medades
ca dio ascula es, cánce y o as.
Los a ones some idos a una die a al a en g asa son un modelo ap opiado y muy
común pa a el es udio de mecanismos implicados en el desa ollo de la
obesidad. En el p esen e abajo some imos a a ones homocigo os wild ype y
p53 knockou , a die as al as en g asas (HFD 45 kcal% g asas) du an e 12
semanas pa a induci les obesidad, con el obje i o de obse a los cambios en el
peso co po al, composición co po al, pe il lipídico y cambios en los ejidos
me abólicamen e ep esen a i os en ausencia del gen p53.
111
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (semanas)
***
P53 KO
P53 WT
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
w p53 ko
*
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
w p53 ko
Los a ones de icien es del gen p53 ganan menos peso que los w cuando se
alimen an con una die a al a en g asas.
Fig. 4: Ganancia de Peso co po al (A y B) e inges a dia ia (C) en a ones machos w y
p53 ko alimen ados con die a HFD du an e 12 semanas pos e io a su des e e.
(n=12/g upo). *P<0.05 en elación a sus con oles.
A
B C
w HFD
p53 ko HFD
Ganancia de peso co po al (g .)
Inges a de alimen os 24h (g .)
Ganancia de peso co po al (g .)
RESULTADOS
118
Fig. 8: Tempe a u a co po al basal (A), es de ole ancia al io a 4ºC, du an e 5 ho as
(B), o og a ías de BAT in e escapula (c uces) con cáma a é mica en un ango de
empe a u a de 27-41 ºC en a ones w y p53 ko HFD. (n=12/g upo). P<0.05, **P<0.01
en elación a sus con oles.
Los a ones p53 knockou mos a on un descenso signi ica i o de su
empe a u a co po al, du an e las 5 ho as a 4ºC, en elación a sus con oles
(Figu as 8A, 8B). Es os esul ados ue on co obo ados con o og a ías é micas
de BAT in i o (Figu a 8C), en las cuales obse amos di e encias cla as en la
empe a u a del BAT en e w y p53 ko, obse ando una meno empe a u a en
el BAT de los a ones p53 ko.
B C
w HFD
w HFD
w HFD
P
53 ko HFD
p53 ko HFD
P
53 ko HFD

RESULTADOS
119
20
40
60
80
100
120
140
*
p
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
220
*
*
*
Eec o de la die a al a en g asas sob e el ejido adiposo blanco en a ones p53
ko
Como sabemos, una de las p incipales unciones del ejido adiposo blanco es la
de almacena ene gía en o ma de iacilglicé idos y libe a es os compues os
como ácidos g asos lib es a los di e en es ejidos du an e si uaciones de s ess o
ayuno. En nues os esul ados pudimos obse a que los a ones p53 ko, a pesa
de es a ingi iendo una die a al a en g asa, ienen can idad de masa g asa meno
que los a ones w , po lo que e aluamos los ni eles de a ias enzimas
in oluc adas en el me abolismo de los lípidos, an o a ni el de ARNm como de
p o eínas.
A B
w HFD
p53 ko HFD
ACCα
FAS
CPT1
p
AMP
K
AMPKα1 AMPKα2
Ni eles de p o eína WAT
Ni eles de p o eínas WAT
FAS
CPT1
ACC
pAMPK
AMPKα1
AMPKα2
Β-ac ina
w p53 ko
RESULTADOS
120
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
p
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4*
Exp esión ARNm
INSIG2
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
*
Fig. 9: Ni eles de p o eína (A y B) y de ARNm (C, D, E) en el ejido adiposo blanco en
a ones w y p53 ko alimen ados con die a al a en g asas du an e 12 semanas.
(n=12/g upo). *P<0.05 en elación a sus con oles.
Encon amos que la exp esión génica de UCP1, FAS, PGC1α y CIDEA no
mos ó cambio alguno en e ambos g upos (Figu as 9C, 9D), a excepción del
ecep o β-ad ené gico ipo 1, del cual encon amos una mayo exp esión génica
signi ica i a en los a ones p53 ko en elación a sus con oles, sugi iendo un
mayo ono simpá ico a ni el del ejido adiposo blanco (WAT). A ni el de
Β-AR1
C
D
w HFD
p53 ko HFD
PGC1 β-AR2 β-AR3
UCP1
CIDEA ATGL
TLR4
FASSREBP1 ATGL HSL MGL
Exp esión ARNm (unidades a bi a ias) Exp esión de ARNm
E
RESULTADOS
121
20
40
60
80
100
120
140
***
*
**
pAMPK AMPKα1 AMPKα2 pACC ACC FAS CPT1
p o eína, encon amos ni eles disminuidos de pAMPK y ni eles ele ados
signi ica i amen e de ACCα, CPT1 y FAS (Figu as 9A, 9D). Po lo an o, es os
esul ados en su conjun o nos es aban indicando que, en cie a o ma, an o la
oxidación como la sín esis de lípidos se encuen an ac i adas. Dado que los
a ones p53 ko, ganan menos masa g asa, es os da os sugie en que el
me abolismo basal es á inc emen ando en los a ones p53 ko en compa ación
con los w .
E ec o de la die a al a en g asas sob e el me abolismo hepá ico en a ones p53
ko
O o ó gano impo an e en la cap ación y libe ación de lípidos es el hígado. Es e
ó gano es ambién uno de los más a ec ados du an e la inges a de die as al as en
g asas, ya que p o ocan es ea osis hepá ica (Dhibi e al, 2011). Po lo an o,
e aluamos los ni eles de las enzimas in oluc adas en el me abolismo de lípidos
an o a ni el de ARNm como de p o eína en el hígado.
A w HFD
p53 ko HFD
Ni eles de
p
o eínas
FAS
pACC
pAMPK
AMPKα
AMPKα2
β-ac ina
ACC
w p53 ko
RESULTADOS
122
0
50
100
150
200
*
50
100
150
200
250
300
350
*
ACCα FAS PGC1α INSIG2
0
0.5
1
1.5
2
**
LPL
Fig. 10: Ni eles de p o eínas (A) y de ARNm (B, C, D) a ni el hepá ico en a ones w y
p53 ko, alimen ados con die a al a en g asas du an e 12 semanas. (n=12/g upo).
*P<0.05, **P<0.01 en elación a sus con oles.
B
Ni eles de ARNm
Ni eles de ARNm Ni eles de ARNm
C D
LDLR MTTP SCARB1
RESULTADOS
123
Como obse amos en nues os esul ados, los ni eles de p o eína de pAMPK,
ACCα y FAS se encon a on disminuidos (Figu a 10A), mien as que a ni el de
exp esión génica no encon amos di e encias signi ica i as en ACCα, FAS,
PGC1 (Figu as 10C, 10D, 10E) en e ambos g upos.
Sin emba go, la exp esión de Sca b1 (in oluc ada en la ecap ación de
lipop o eínas de al a densidad, HDL) y la exp esión génica de LPL (Figu a 10C,
10D), in oluc ado en la hid ólisis y cap ación de TAG ci culan es, se encon ó
signi ica i amen e aumen ada en los a ones p53 ko. Es o nos es aba indicando
que los TAG p o enien es de los quilomic ones y los ácidos g asos lib es (FFA
unidos a albúmina) p o enien es del ejido adiposo blanco, es aban siendo
cap ados y almacenados a ni el hepá ico en una mayo p opo ción en los
a ones p53 ko que sus con oles.
Es os da os molecula es implican que debe ía exis i una mayo can idad de
g asas almacenadas a ni el hepá ico, lo que p oduci ía una mayo es ea osis
hepá ica en los a ones ca en es del gen p53. Po lo que en nues o siguien e
expe imen o analizamos his ológicamen e los hígados de los a ones w y p53
ko, po medio de inciones de hema oxilina-eosina y OIL RED, y e aluamos el
pe il lipídico en ambos g upos de a ones.

RESULTADOS
124
Fig. 11: (Panel A y C) Aspec o his ológico de co es de hígado de a ones w HFD,
donde se ap ecia ena cen al (VC) y sinusoides (S) embebidos en ejido conec i o,
con inción de hema oxilina-eosina y Oil ed (pun os ojos), espec i amen e./(Panel B y
D) Se e a acumulación mac o y mic o esicula de lípidos ( lechas neg as) y hepa oci os
en balón en co es his ológicos de hígados de a ones p53 ko HFD, con inciones de
hema oxilina-eosina y oil ed (pun os ojos) en hígado en a ones p53 ko HFD.
A B
C D
VC
S
p53 ko HFD Wild ype HFD
Wild ype HFD p53 ko HFD
50 µm 50 µm
50 µm 50 µm
RESULTADOS
125
0
2
4
6
8
10
12
NEFAs (µg/mg hígado)
*
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
TG (µg/mg hígado)
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Coles e ol (µg/mg hígado)
Fig. 12: Ni eles de ácidos g asos no es e e icados NEFAs (A), TAG (B) y coles e ol
o al(C), en hígado de a ones w y p53 ko alimen ados con HFD. (n=12/g upo).
*P<0.05, en elación a sus con oles.
Como podemos obse a , en los co es his ológicos de hígado de los a ones
p53 ko, exis e una in il ación de lípidos an o mac o como mic o esicula a
ni el del hepa oci o (Figu a 11, panel B y D) hallazgos que son bien conocidos
y ca ac e ís icos de una es ea osis hepá ica p oducida po la inges a al a en
g asas (Dhibi e al, 2011; Angulo, 2002). Es a in il ación de lípidos en el
hígado de los a ones p53 ko es mayo que en los hígados de los a ones w .
En adición a es os esul ados, encon amos los ni eles hepá icos de ácidos
g asos no es e e icados (NEFAS) disminuidos y la can idad de TG en hígado
aumen ados en los a ones p53 ko (Figu a 12A, 12B), lo que jun o a los
w HFD
p53 ko HFD
A B C
*
RESULTADOS
126
0
25
50
75
100
125
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2 **
hallazgos his ológicos hepá icos y a la mayo exp esión génica de LPL en es os
a ones p53 ko HFD, nos sugie e una mayo cap ación y almacenamien o de
g asa en el hígado.
E ec o de la die a al a en g asas sob e el pe il glicémico y lipídico en a ones
p53 ko.
A con inuación e aluamos el e ec o que iene la die a HFD sob e los ni eles de
lípidos y glucosa en sang e, debido a que exis e una elación di ec a en e la
inges a excesi a de g asas, obesidad y esis encia a insulina que p oduce
al e aciones en el me abolismo de los lípidos y la glucosa. Con es e in,
ealizamos el es de ole ancia a la glucosa e insulina, como se ha desc i o
an e io men e ( e ma e iales y mé odos) y medimos los ni eles ci culan es de
TAG, NEFAS y coles e ol.
w HFD
p53 ko HFD
A
Ni eles de glucosa (mg/dl)
B
Ni eles de Insulina (ng/ml)
RESULTADOS
127
0
0
25
50
75
100
125
*
*
0
0
50
100
150
200
250
300
350
400
P53 KO
P53 WT
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
**
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0
20
40
60
80
100
120
140
**
1
5
30 60 90 120 15 30 60 90 120
Fig. 13: Glucosa Basal en ayuno (A), Ni eles de insulina (B) es de ole ancia a la
glucosa (C), es de ole ancia a la insulina (D), NEFAS (E), TAG (F), ni eles de
coles e ol (G) en a ones w y p53 ko HFD. (n= 12/g upo). *P<0.05, **P<0.01 en
elación a sus con oles.
Ni eles de glucosa (mg/dl)
Ni eles de FFA (mg/dl)
C
(min)
GTT ITT
D
E F G
Ni eles de glucosa (mg/dl)
Ni eles de TAG (mg/dl)
Ni eles de coles e ol (mg/dl)
(min)
RESULTADOS
134
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
***
En un segundo expe imen o adminis amos a ni el cen al i.c. .: gh elin, EX527
y EX527 p e io a la adminis ación de gh elin.
Fig.18: E ec o del bloqueo a macológico de SIRT1 sob e la inges a después de 2 ho as
(B) y 6 ho as (C) pos e io a la adminis ación de EX527 (10 ug) y gh elin (5 ug) i.c. .
en a as macho Sp ague-Dawley. (n=8/g upo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001
en elación a sus con oles.
En es e expe imen o comp obamos que gh elin aumen ó la inges a después de
las 2 y 6 ho as de su adminis ación i.c. ., como e a de espe a . Sin emba go,
cuando el inhibido de SIRT1, EX527, se adminis ó 20 minu os p e io a
gh elin, la acción o exigénica de gh elin ue bloqueada no ablemen e después
de 6 ho as (Figu a 18A, 18B). Es os esul ados demues an que la acción
o exigénica de gh elin depende pa cialmen e de SIRT1.
0
2
4
6
8
10
12
****
***
A B
ehículo + ehículo
ehículo + gh elin
Ex527 + gh elin
Ex527 + ehículo
Inges a acumulada 2h (g )
Inges a acumulada 6h (g )

RESULTADOS
135
0
20
40
60
80
100
120
140
160
0
50
100
150
200
250
300
350
**
*
**
E ec o del bloqueo de SIRT1 sob e la acción de gh elin en el me abolismo de
ácidos g asos a ni el del hipo álamo.
Gh elin aumen a la inges a de alimen os a a és de sus e ec os sob e la
ac i ación de la p o eína kinasa dependien e de AMP, AMPK y sob e el
me abolismo de ácidos g asos a ni el del hipo álamo (López M, 2010). En
nues o siguien e expe imen o e aluamos los ni eles de las p incipales enzimas
in oluc adas en el me abolismo lipídico a ni el del hipo álamo en las a as
a adas con EX527 y gh elin después de 6 ho as.
Fig. 19: E ec o del a amien o agudo con EX527 (10 µg) y gh elin (5 µg) i.c. ., a las 6
ho as, sob e los ni eles de p o eínas in oluc adas en el me abolismo de lípidos en
hipo álamo de a as macho Sp ague-Dawley. El análisis de p o eínas se ealizo a a és
de Wes e n Blo ing, (n= 8/g upo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01 en elación a sus
con oles.
Vehículo Gh elin Ex527 Ex+Gh el
pACC
pAMPK
ACCα
FAS
AMPK α1
AMPKα2
β-ac in
pAMPK AMPKα2 pACC ACC FAS
AMPKα1
ehículo + ehículo
ehículo + gh elin
Ex527 + gh elin
Ex527 + ehículo
Ni eles de
p
o eína
(
% con ol
)
RESULTADOS
136
En es os esul ados, como e a espe ado, después de las 6 ho as de la
adminis ación i.c. . de gh elin, los ni eles de pAMPK hipo alámicos se
inc emen a on signi ica i amen e, mien as que los ni eles de ACC
disminuye on (Figu a 19). Es os e ec os ue on bloqueados cuando el EX527 se
adminis ó p e iamen e a gh elin, sugi iendo que el e ec o de gh elin sob e
AMPK, es aba mediado po SIRT1 y es ableciendo una nue a elación en e
gh elin-SIRT1 y AMPK.
E ec o del bloqueo de SIRT1 sob e la acción de gh elin en la exp esión de
ac o es de ansc ipción y neu opép idos mediado es de la inges a.
Sabemos que gh elin, a ni el del hipo álamo ac i a a AMPK, causando
impo an es cambios en la espi ación mi ocond ial y al e ando la exp esión de
ac o es de ansc ipción como Bsx, Fo khead box O (FoxO1) y pCREB y que
es o conduce a la ac i ación de neu opép idos como AgRP/NPY (Noguei as R,
2010). Po lo an o, e aluamos es os ac o es de ansc ipción y neu opép idos
en los g upos expe imen ales desc i os an e io men e (Con oles, Gh elin,
EX527, EX527+ Gh elin).
Fig. 20: Ni eles de p o eína FoxO1 y pCREB en hipo álamo as la adminis ación de
EX527 y gh elin i.c. . después de 6 ho as en a as macho Sp ague-Dawley, el análisis
se hizo a a és de wes e n Blo ing. (n= 8/g upo). Siendo: *p<0.05 en elación a sus
con oles.
0
50
100
150
200
250
300
350
**
A
FOXO1 pCREB
pCREB
FOXO1
β-ac in
Vehículo Gh elin Ex527 Ex + Gh e
Ni eles de
p
o eína
(
% con ol
)
ehículo + ehículo
ehículo + gh elin
Ex527 + gh elin
Ex527 + ehículo
RESULTADOS
137
Fig. 21: E ec o de la adminis ación de EX527 (10 ug) y gh elin (5 ug) i.c. . después de
6 ho as, sob e la exp esión del ARNm de Bsx, NPY y AgRP en el núcleo a cua o (A,
B, C, D) de a as macho Sp ague-Dawley. El análisis se hizo po medio de la écnica de
hib idación in si u (n=8/g upo): *p<0.05, **p<0.01 en elación a sus con oles.
En es os esul ados obse amos que la exp esión, inducida po gh elin sob e los
ac o es de ansc ipción FoxO1, pCREB y Bsx, además de los neu opép idos
NPY y AgRP a ni el del núcleo a cua o, disminuyó cuando adminis amos
EX527 p e iamen e a gh elin (Figu a 20 y 21). Es os esul ados en su conjun o,
eh + eh eh + gh el Ex527 + eh Ex527 + gh el
NPY
AgRP
Bsx
NPY exp esión ARNm ARC
(unidades a bi a ias)
0
20
40
60
80
100
120
140
160 ** *
Bsx exp esión ARNm ARC
(unidades a bi a ias)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
*
AgRP exp esión ARNm ARC
(unidades a bi a ias)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
** *
C
B
A
D
ehículo + ehículo
ehículo + gh elin
Ex527 + gh elin
Ex527 + ehículo
RESULTADOS
138
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8 ** *
demues an que las acciones o exigénicas de gh elin se encuen an mediadas en
pa e po SIRT1 y que la ac i ación de la ac i idad hipo alámica de SIRT1 es un
e en o an e io a las al e aciones p o ocadas po gh elin sob e AMPK,
me abolismo lipídico, ac o es de ansc ipción y neu opép idos.
En nues o siguien e expe imen o u ilizamos o o inhibido especí ico de la
ac i idad de SIRT1, el Si inol. Ob u imos simila es esul ados a aquellos
obse ados con EX527, sob e la inges a. (Figu a 22)
Fig. 22: E ec os de la inyección i.c. . de gh elin (5 ug), si inol (10 ug), y gh elin +
si inol sob e la inges a de alimen os después de 6h. (n=8/g upo). *p<0.05, **p<0.01 en
elación a sus con oles.
E ec os de gh elin sob e la inges a y el me abolismo de ácidos g asos en
a ones p53 KO
Como hemos comp obado, ace il-p53 es uno de los sus a os de SIRT1 y la
inhibición de es e úl imo disminuye la acción o exigénica de gh elin. Según
li e a u a ecien e p53 se encuen a elacionado con el me abolismo y
homeos asis ene gé ica (Vousden KH, 2009) y nues os esul ados iniciales
demues an una di e encia an o a ni el isula como me abólica en e los
Inges a acumulada 6h (g .)
Vehículo + ehículo
Vehículo +
g
h elin
Si inol + ehículo
Si inol +
g
h elin
RESULTADOS
139
a ones w y p53 ko. Dada oda esa elación, noso os nos plan eamos si p53
pod ía se un mediado de los e ec os de gh elin dependien es de SIRT1, pa a lo
cual en nues o siguien e expe imen o u ilizamos a ones w y p53 ko a los
cuales les adminis amos gh elin i.c. .
Fig. 23: E ec o de la adminis ación gh elin (5 ug) i.c. . sob e la inges a acumulada
después de 2 ho as (A) y 6 ho as (B) en a ones w y p53 ko machos (n=8/g upo)
Siendo: *p<0.05 en elación a sus con oles.
En es os esul ados obse amos que la adminis ación cen al de gh elin
aumen ó la inges a en a ones w signi ica i amen e, pe o no sucedió lo mismo
con el g upo de los a ones p53 ko a ados con gh elin i.c. . después de 2 ni 6
ho as (Figu a 23). Es os esul ados indicaban que la p esencia del gen sup eso
de umo es p53 e a necesa io pa a la acción o exigénica de gh elin. Po lo an o
en un segundo expe imen o e aluamos los ni eles hipo alámicos de las
p incipales enzimas in oluc adas en el me abolismo de lípidos, las cuales son
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
w p53 ko
*
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
w p53 ko
A B
Vehículo
Gh elin (5 ug) 6h
Vehículo
Gh elin (5 ug) 2h
Inges a 6 ho as (g .)
Inges a 2 ho as (g .)

RESULTADOS
140
a ec adas po la ía gh elin-SIRT1. Pa a es e expe imen o pa imos de los
mismo g upos de a ones w y p53 ko u ilizados an e io men e.
Fig. 24: E ec o del a amien o con gh elin (5 ug) i.c. . después de las 6 ho as, sob e
los ni eles de enzimas in oluc adas en el me abolismo de lípidos (A y B) en
hipo álamo de a ones w y p53 ko. El análisis de p o eínas se ealizó a a és de wes e n
Blo ing, (n= 8/g upo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01 en elación a sus con oles.
0
20
40
60
80
100
120
140
w ko
pAMPK
w ko
AMPKα1
w ko
AMPKα2pACC
w ko
FAS
w ko
0
50
100
150
200
ACC
w ko
*
*
**
**
A
Vehículo
Gh elin (5 µg) 6h
Ni eles de p o eína (% con ol)
pACC
pAMPK
ACCα
FAS
AMPK α1
AMPK α2
β-ac in
Vehículo gh elin ehículo gh elin
w p53 ko
RESULTADOS
141
En es os esul ados obse amos que los ni eles hipo alámicos de pAMPK
aumen a on en los a ones w debido al es imulo de gh elin, pe o es e mismo
e ec o no se pudo obse a en los a ones p53 ko (Figu a 24). Es e esul ado
sugie e que el gen sup eso de umo es p53 es un mediado esencial de las
acciones de gh elin sob e AMPK.
Po lo an o con es os esul ados podemos a i ma que p53 es un mediado a
a és de SIRT1, de las acciones o exigénicas de gh elin.
E ec o de la adminis ación de Res e a ol sob e la inges a y el me abolismo de
ácidos g asos a ni el del hipo álamo de a ones p53 ko.
Di e sos abajos cien í icos han demos ado que el Res e a ol, un poli enol
que se encuen a en u as y o os alimen os, ac i a a SIRT1 (Sinclai e al, 2003)
y es imula a AMPK. (Yi CO, 2011; Pa el MI, 2011; Ving deux V, 2010). Po lo
an o, e aluamos la hipó esis de que el Res e a ol pod ía a ec a la inges a de
alimen os a a és de sus e ec os sob e el me abolismo de lípidos a ni el del
hipo álamo.
Pa imos de un p ime expe imen o en el cual adminis amos cen almen e
Res e a ol a di e en es dosis (1 ug, 10 ug, 20 ug) a 1 ho a y 2 ho as a a ones
swiss. En nues os esul ados pudimos obse a que la inyección cen al de
Res e a ol, inc emen a la inges a en a ones de mane a dosis dependien e (1
µg, 10 µg, 20 µg) después de 1 y 2 ho as. (Figu a 25).
RESULTADOS
142
Fig. 25: E ec o de la adminis ación i.c. . de Res e a ol dosis- espues a (1, 10 y 20 ug)
sob e la inges a después de 1ho a (A) y 2 ho as (B), en a ones swiss. (n=8/g upo).
Siendo: p*<0.05, **p<0.01 en elación a sus con oles.
Con los esul ados an e io es, y dado que obse amos una espues a dosis-
dependien e de Res e a ol sob e la inges a, en un segundo expe imen o
e aluamos las enzimas in oluc adas en el me abolismo de lípidos a ni el del
hipo álamo as la adminis ación cen al de Res e a ol (20 µg) después de 1
ho a.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
ehiculo 1 µg 10 µg 20 µg
es e a ol
**
**
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
ehiculo 1 µg 10 µg 20 µg
es e a ol
***
Vehículo
Res e a ol
A B
Inges a a 1 h (g .)
Inges a a 2 h (g .)
RESULTADOS
143
Fig.26: E ec o del a amien o agudo con Res e a ol 20 ug i.c. ., después de 1 ho a,
sob e los ni eles de p o eínas in oluc adas en el me abolismo de lípidos en hipo álamo
de a ones macho. El análisis de p o eínas se ealizó a a és de wes e n Blo ing.
(n=8/g upo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001en elación a sus con oles.
En nues os esul ados obse amos que pos e io a 1 ho a de la adminis ación
cen al de Res e a ol 20 µg, lo ni eles de p o eína de pAMPK y pACC, se
inc emen a on a ni el del hipo álamo (Figu a 26). En nues o siguien e
expe imen o in es igamos si p53 pod ía se un mediado impo an e de las
acciones de Res e a ol. Con es e in a amos con Res e a ol i.c. . a a ones
w y p53 ko, siguiendo el p o ocolo desc i o an e io men e. La adminis ación
cen al de Res e a ol aumen ó la inges a de alimen os después de una ho a,
Veh Res
pACC
pAMPK
β-ac in
ACC
AMPK α1
AMPK α2
FAS
0
20
40
60
80
100
120
140
160
pAMPK AMPKα1ACC 0
50
100
150
200
250
pACC
Ni eles p o eína (% con ol)
***
**
**
FASAMPKα2
Vehículo
Res e a ol 20 ug (1 ho a)