Nuevas acciones de p53: Homeostasis metabólica y efecto orexigénico de ghrelin

NUEVAS ACCIONES DE P53: HOMEOSTASIS METABÓLICA Y EFECTO OREXIGÉNICO DE GHRELIN DOUGLAS ALFREDO VELASQUEZ RAIMUNDO MEMORIA para optar al grado de Doctor Universidad de Santiago de Compostela, 2012 UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA Dr. Carlos Diéguez González, catedrático de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela Dr. Rubén Nogueiras Pozo, Investigador “Ramón y cajal”, departamento de Fisiología, Universidad de Santiago de Compostela Certifican que: La presente Tesis Doctoral titulada “Nuevas acciones de p53: Homeostasis metabólica y efecto orexigénico de ghrelin”, elaborada por Douglas Alfredo Velásquez Raimundo, ha sido realizada bajo nuestra dirección en los Laboratorios de Neurociencia “Ramón Domínguez” del Departamento de Fisiología de la Universidad de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor. Y para que conste firmamos la presente autorización en Santiago de Compostela, Mayo de 2012 Fdo.: Carlos Diéguez González Fdo.: Rubén Nogueiras Pozo UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA FACULTAD DE MEDICINA DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA INDICE INDICE INTRODUCCION ............................................................................... 3 I. Obesidad ................................................................................. 3 II. Hipotálamo .............................................................................. 5 Núcleo Arcuato ..................................................................... 5 Núcleo paraventricular ......................................................... 6 Núcleo ventromedial hipotalámico ....................................... 7 Núcleo dorsomedial hipotalámico ........................................ 8 Área hipotalámica lateral ...................................................... 8 III. Péptidos hipotalámicos y periféricos que estimulan la ingesta 9 Neuropéptido Y .................................................................. 10 Péptido relacionado a agouti ............................................... 12 Hormona concentradora de melanina ................................. 15 Ghrelin ................................................................................ 17 IV. Péptidos hipotalámicos y periféricos que inhiben la ingesta. 27 Transcripto regulado por cocaína y anfetaminas ................ 27 Melanocortinas ................................................................... 28 Leptina ................................................................................ 31 Colecistocinina ................................................................... 37 INDICE Polipéptido YY/ polipéptido P ............................................ 39 V. Señales intracelulares AMPK ................................................................................. 43 Sirtuinas .............................................................................. 49 P53 ...................................................................................... 55 OBJETIVOS ...................................................................................... 67 MATERIALES Y METODOS .......................................................... 71 I. Animales de experimentación ............................................... 73 II. Técnicas experimentales ....................................................... 76 III. Metodología Experimental .................................................... 77 IV. Protocolo experimental ......................................................... 79 V. Metodología analítica ............................................................ 81 RESULTADOS ................................................................................ 103 Efecto de la dieta estándar en ratones p53 knockout .................. 105 Efecto de la dieta alta en grasas en ratones p53 knockout .......... 110 Efecto del estado nutricional sobre niveles de SIRT y p53 en hipotálamo de ratas Sprague-Dawley .......................................... 129 Efectos de ghrelin sobre ingesta y niveles de proteína en hipotálamo de ratas Sprague-Dawley .......................................... 131 Efecto del bloqueo farmacológico de SIRT1 sobre la acción orexigenica de ghrelin ................................................................. 133 INDICE Efecto del bloqueo de SIRT1 sobre la acción de ghrelin en el metabolismo de ácidos grasos a nivel del hipotálamo. ............... 135 Efecto del bloqueo de SIRT1 sobre la acción de ghrelin en la expresión de factores de transcripción y neuropéptidos mediadores de la ingesta. ............................................................ 136 Efectos de ghrelin sobre la ingesta y el metabolismo de ácidos grasos en ratones p53 KO .......................................................... 138 Efecto de la administración de Resveratrol sobre la ingesta y el metabolismo de ácidos grasos a nivel del hipotálamo de ratones p53 ko. ............................................................................ 141 Efectos de la administración de AICAR sobre la ingesta y el metabolismo de ácidos grasos en ratones p53 ko ..................... 144 DISCUSION .................................................................................... 147 CONCLUSIONES ........................................................................... 163 BIBLIOGRAFIA ............................................................................. 167 ACC: acetil-CoA carboxilasa ACTH: hormona adrenocorticotropina AgRP: proteína relacionada con agouti AICAR: 5-aminoimidazol 4 carboxamida ribosido AMPK: adenosin monofosfato activado por kinasa ARC: núcleo arcuato hipotalámico ARNm: ácido ribonucleico mensajero ATM: Ataxia Telangiectasia Mutated BAT: tejido adiposo marrón BHE: barrera hematoencefálica CART: tránscrito regulado por anfetamina y cocaína CCK: colecistocinina CPT-1: carnitina-palmitoil transferasa CRH: hormona liberadora de corticotropina. DMH: núcleo dorsomedial hipotalámico FAS: ácido graso sintasa FFA: ácidos grasos libres GABA: ácido gammaaminobutírico GH: hormona del crecimiento GHRH: hormona liberadora de la hormona de crecimiento GHS: secretagogos de GH GHS-R: receptor de secretagogos de GH (GHS-R1a y GHS-R1b) GLP-1: péptido tipo glucagon GLP1R: receptor de GLP-1 GLUT: transportador de glucosa GOAT: ghrelin O-aciltransferasa GTT: test de tolerancia a glucosa HFD: dieta alta en grasa i.c.v.: intracerebroventricular IMC: índice de masa corporal ITT: test de tolerancia a insulina JAK2: Kinasa Janus 2 LHA: hipotálamo lateral LKBI: liver kinase B1 LMW: bajo peso molecular LPL: lipoprotein lipasa MBOAT: acyltransferasas unidas amembrana MCD: malonyl-CoA decarboxilasa MCH: hormona concentradora de melanina MCR: receptor de melanocortinas (MCR-3, MCR -4) MDM2: (Murine Doble Minute 2 MMC: complejo mayor de migración mTOR: “mammalian target of rapamycin” NAc: núcleo acumbens NF-kB: factor nuclear kappa-beta NPY: neuropéptido y NTS: núcleo del tracto solitario OB: leptina Ob: obesos TABLA DE ABREVIATURAS INTRODUCCION 6 núcleo paraventricular (PVN) donde las hormonas anorexigénicas, hormona liberadora de tirotropina (TRH) y hormona liberadora de corticotropina (CRH) y oxitocina son secretadas, y otra parte de las neuronas del ARC se proyectan al área hipotalámica lateral (LHA) y área perifornical (PFA) donde las orexinas y la hormona concentradora de melanina (MCH) son producidas. Cuando las señales de adiposidad (insulina y leptina) alcanzan al ARC, los péptidos anorexigénicos son liberados y activan a circuitos catabólicos. Al contrario la activación de vías anabólicas lleva a la liberación de péptidos orexigénicos y ocurre cuando las señales de adiposidad que llegan al cerebro son bajas, indicando la necesidad de restablecer los almacenamientos de energía. Todas estas características le permiten al ARC integrar señales hormonales para la homeostasis energética. Núcleo paraventricular (PVN) Se encuentra adyacente a la parte superior del tercer ventrículo en el hipotálamo anterior. El PVN es el principal sitio de liberación de CRH y TRH. Numerosas vías neuronales implicadas en el balance energético convergen en el PVN, incluyendo proyecciones de neuronas NPY del ARC, orexinas, derivados del péptido POMC y el péptido estimulante del apetito galanina. Todo esto, hace que el PVN desempeñe un papel importante en la integración de señales nutricionales con la glándula tiroides y el eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (Neary et al., 2004). El PVN es muy sensible a la administración de péptidos implicados en la ingesta como colecistocinina (CCK), NPY ó ghrelin. Estos péptidos pueden actuar mediante la proteína kinasa sensible a AMP (AMPK). Estas proyecciones desde otros núcleos, así como la de los péptidos periféricos, INTRODUCCION 7 pueden regular la actividad de las neuronas TRH y las que expresan CRH, y éstas a su vez actúan sobre las células hipofisarias productoras de TSH, indicando así que el PVN integra señales nutricionales con el eje hipofisario y tiroideo. Núcleo ventromedial hipotalámico (VMH) Es ampliamente conocido como el centro de la saciedad. Ha sido identificado como un sitio diana de la leptina, la cual actúa en el hipotálamo inhibiendo la ingesta de alimentos, estimulando el gasto energético y por lo tanto causando la pérdida de peso. Las lesiones en este núcleo producen hiperfagia y obesidad. El VMH puede aumentar directamente la actividad de las neuronas POMC mediante microcircuitos, estimulando su actividad excepto en estado de ayuno en el que disminuye, además de proyectar hacia otros núcleos hipotalámicos y al tronco cerebral. Por su parte el ARC también regula la actividad del VMH donde se encuentran receptores tipo 4 de las melanocortinas (MCR4), y receptores para el neuropéptido Y tipo Y1R, Y2R e Y5R, sugiriendo que tanto POMC como NPY emiten proyecciones al VMH. La importancia del VMH en la regulación de la homeostasis energética ha sido demostrada por estudios en los que se demuestra la existencia de receptores de leptina (ObRb) y activación neuronal inducida por leptina: inyecciones selectivas de leptina en el VMH reducen la ingesta y el peso corporal en ratas (Irani BG, 2008). INTRODUCCION 8 Núcleo dorsomedial hipotalámico (DMH) Este núcleo tiene extensas conexiones con otros núcleos hipotalámicos mediales y laterales y sirve como integrador y procesador de información de esos núcleos. El núcleo DMH está relacionado con la modulación de la secreción de glucocorticoides, temperatura corporal, sueño-vigilia, ritmo circadiano y actividad locomotora (Elmquist JK, 1998; Gooley JJ, 2006). Área hipotalámica lateral (LHA) Es el clásico centro del hambre, contiene neuronas sensibles a la glucosa que son estimuladas por la hipoglicemia y es crucial en mediar la marcada hiperfagia inducida por la disminución de la glucemia (Bernardis and Bellinger, 1996). En él se sintetizan dos tipos de péptidos: hipocretinas (orexinas) y MCH. Se caracterizan por emitir proyecciones a un amplio número de zonas del SNC (córtex, tálamo o sistema límbico) participando en numerosas funciones tales como aprendizaje, memoria, emoción, y respuestas motoras en función del estado energético ya que están reguladas por numerosas hormonas, entre ellas, ghrelin y leptina. INTRODUCCION 9 Fig 1: representación esquemática del hipotálamo, su ubicación en el cerebro y sus principales núcleos: Núcleo arcuato (ARC), núcleo paraventricular (PVN), Núcleo ventromedial (VMN), Area hipotalámica lateral (LHA), Núcleo Dorsomedial (DMN), Area perifornical (PFA). 10 III.-PÉPTIDOS HIPOTALÁMICOS Y PERIFÉRICOS QUE ESTIMULAN LA INGESTA (orexigénicos) Neuropéptido Y El Neuropéptido Y (NPY), aislado en 1982, contiene 36 residuos de aminoácidos, incluyendo un residuo de tirosina en cada extremo, es uno de los más abundantes péptidos del hipotálamo y uno de los más potentes factores orexigénicos, ha sido funcionalmente implicado en el comportamiento alimenticio, regulación cardiovascular, control del eje neuroendocrino y retención de la memoria. El ARC es el sitio de mayor expresión para NPY dentro de las neuronas del hipotálamo que se proyectan al PVH, DMH, área lateral del hipotálamo y área perifornical y otros sitios hipotalámicos. Cinco receptores de NPY han sido identificados Y1, Y2, Y4, Y5, Y6, los cuales median sus acciones en el hipotálamo. El receptor Y5 ha sido implicado como un importante receptor que media los efectos de la ingesta de NPY. El Y5 se expresa relativamente en grandes niveles en el LHA, cercano al sitio donde NPY actúa potentemente para estimular la ingesta. Una de las principales funciones que se le han atribuido a las neuronas de NPY del ARC, es el restaurar el balance energético normal y las reservas de grasa corporal bajo condiciones de déficit energético. Al contrario, la obesidad inducida por sobrealimentación voluntaria, no es acompañada por incrementos en la actividad de las neuronas de NPY en el ARC (Widdowson et al., 1997). Las neuronas que sintetizan NPY en el ARC son altamente sensibles al estado de deficiencia de energía y altas demandas metabólicas. Su expresión es estimulada por la deprivación de comida, así como estados de INTRODUCCION INTRODUCCION 11 incrementos de ejercicios, frío y embarazo. Se ha visto una elevada expresión de NPY durante la administración de esteroides como la corticosterona, la cual se libera en estados de balance energético negativo. Similarmente a la corticosterona, ghrelin, el ligando endógeno del receptor de secretagagos de la hormona de crecimiento (GHSR), es un indicador de insuficiencia energética que afecta a la expresión de NPY. Una demostración de la relación entre ghrelin y NPY es que esta hormona estimula la ingesta de alimentos más marcadamente cuando es inyectada directamente al ARC e induce la expresión de c-Fos (un marcador de activación neuronal) predominantemente en neuronas NPY del ARC, donde el ARNm de GHSR es expresado (Guan XM et al, 1997). También se ha demostrado una relación entre NPY e insulina y leptina, ya que ambas reducen la expresión génica de NPY (Abe M. et al, 1991). Este efecto parece estar mediado por receptores de leptina e insulina en las neuronas de NPY. Además de estas relaciones, hay evidencias de que ciertos nutrientes pueden afectar la expresión de péptidos involucrados en la conducta alimenticia. Estas evidencias sugieren que NPY se encuentra estrechamente relacionado con la glucosa y su metabolismo, así como los carbohidratos de la dieta (Jeanrenaud B, 2001; Shor-Posner G, 1991). Esta relación entre NPY y carbohidratos sugiere que este péptido puede estar relacionado con señales que reflejan una deficiencia de la disponibilidad de glucosa, su almacenamiento o utilización. Esta afirmación es apoyada por evidencias que demuestran que los niveles de ARNm de NPY en el ARC son significativamente elevados después del bloqueo farmacológico de la utilización de glucosa con 2-desoxy-D-glucosa. (2-DG) (Akabayashi A, et al 1993; Sergeev VG, et al, 200). La expresión de NPY es marcadamente afectada por la administración aguda de glucosa, mostrando una relación inversa con los niveles circulantes. INTRODUCCION 12 Dentro de los primeros 30-60 minutos después de la inyección de glucosa, NPY es inicialmente suprimido en relación a los niveles ascendentes de glucosa, después de 90 minutos, este efecto es revertido, llevando a la estimulación de NPY según como lo niveles de glucosa se acercan a su línea basal. Un mecanismo que puede mediar estos cambios, es la glucocinasa, un sensor de la utilización de glucosa, que se expresa en neuronas NPY del ARC (Lynch RM, 2000). También se ha visto que la administración de NPY produce un incremento en el cociente respiratorio, lo cual refleja una reducida utilización de las grasas a favor de los carbohidratos, incrementando así la acumulación de grasa corporal (Menendez JA, 1990). En conclusión se puede afirmar que las neuronas de NPY en el ARC están estimuladas bajo condiciones de balance energético negativo, como ocurre después de la deprivación de alimentos, en una dieta baja en calorías, antes del inicio del ciclo normal de alimentación o en animales destetados con poca grasa corporal. La función de NPY endógeno durante la escasez de alimentos o en estado de bajo almacenamiento de carbohidratos es promover la ingesta de alimentos, reducir la oxidación de grasas a favor de los carbohidratos o estimular la lipogénesis de novo. Péptido relacionado a Agouti (AgRP) El AgRP es un péptido de 132 residuos de aminoácidos, tiene una alta homología al producto del gen del color agouti en ratones (una molécula de señal paracrina producida normalmente en la piel que inhibe el efecto de la hormona α estimulante de los melanocitos, sobre los receptores MC-1 (Leibel et al., 1997). AgRP es expresado primariamente en el ARC, en neuronas que también producen NPY. El AgRP suprime la actividad basal del MCR-4 (receptor tipo 4 de melanocortinas). Estudios INTRODUCCION 13 inmunohistoquímicos muestran que los cuerpos celulares de AgRP se encuentran limitados al ARC, fibras de AgRP se proyectan a diversas áreas del cerebro y múltiples áreas dentro del hipotálamo, incluyendo al PVN y área lateral y perifornical del hipotálamo (Haskell-Luevano et al., 1999). Otros estudios demuestran una relación funcional estrecha entre los circuitos neuronales de AgRP y NPY (Mizumo TM, 1999). Se ha demostrado que estados de balance energético negativo o incremento en la demanda de energía, como deprivación de comida o durante la lactancia, los cuales reducen los niveles de leptina e insulina e incrementan los niveles de ghrelin y de costicosterona, estimulan AgRP junto con NPY (Chen P., et al., 1999). Al igual que NPY, AgRP es suprimido bajo condiciones de balance energético positivo, cuando la leptina y los niveles de insulina se encuentran elevados y los niveles de ghrelin se encuentran disminuidos. La expresión de AgRP es alta en ratas con dietas bajas en calorías comparadas con dietas ricas en grasas. Al igual que NPY, AgRP se incrementa en condiciones donde la utilización de glucosa es reducida, como la inyección de 2-DG (Sergeyev V, 2000). Esto es apoyado por estudios en los cuales los niveles endógenos de AgRP son suprimidos por una única inyección de glucosa, mientras este efecto es revertido cuando los niveles de glucosa caen a sus límites basales. Al igual que NPY, la administración central de AgRP tiene un potente efecto estimulatorio de la ingesta de alimentos. Este efecto estimulatorio de AgRP dura hasta 6 días, un efecto más duradero que el observado con NPY (Hagan MM, 2000). La administración crónica de AgRP, al igual que NPY, también incrementa la ingesta de comida diaria y disminuye el consumo de oxigeno y la capacidad del tejido adiposo marrón para consumir energía, llevando a un incremento de la ganancia de grasa corporal y los niveles de leptina (Small CJ, 2001). Tanto AgRP como NPY, median los efectos de ghrelin. Los ratones con sobreexpresión de Agrp INTRODUCCION 14 tienen un fenotipo similar al de NPY, ya que muestran hiperfagia y obesidad, incremento de la longitud corporal, hiperinsulinemia, hiperplasia de los islotes pancreáticos e hiperglicemia de inicio tardío (Graham M, 1997). Sin embargo los ratones con deficiencia de Agrp, son normofágicos y muestran un peso y composición corporal normal bajo una alimentación ad libitum (Qian S, 2002). Otros estudios demuestran un antagonismo entre los sistemas de AgRP/NPY y el sistema de melanocortinas (péptidos anorexigénicos) en controlar la ingesta y el peso corporal. Estudios electrofisiológicos sugieren que las neuronas AgRP interactúan con las neuronas de POMC en el ARC a través del GABA (ácido gamma animobutírico, neurotransmisor inhibitorio) (Cowley MA, 2001). Los axones de neuronas AgRP/NPY colocalizan con proyecciones de GABA hacia células POMC en el ARC e inhiben su actividad neural, apoyando la idea de que AgRP/NPY producen efectos anabólicos suprimiendo el sistema de las melanocortinas (POMC). Por otra parte se ha visto que la leptina inhibe la activación de las neuronas AgRP/NPY y reduce la liberación de GABA hacia las neuronas POMC (Cowley MA, 2001). Contrariamente ghrelin estimula las neuronas AgRP/NPY, induciendo un incremento de la liberación de GABA e inhibiendo las neuronas POMC (Cowley MA, 2003). En conclusión se puede afirmar que el funcionamiento de AgRP en el ARC es similar a NPY en relación a su modo de activación por condiciones de deficiencia energética. Este perfil endocrino es evidente en sujetos al inicio de una fase activa, posterior a una deprivación de alimentos, en estado de baja consumo de glucosa o en dietas bajas en calorías, bajo esas condiciones AgRP estimula la ingesta, reduce la utilización de lípidos a favor de los carbohidratos, y promueve la síntesis de lípidos. INTRODUCCION 15 Hormona concentradora de melanina (MCH) Es un neuropéptido orexigénico cíclico de 19 aminoácidos. Se deriva de su precursor prepro-MCH, del cual se derivan también otros péptidos con funciones todavía desconocidas (Lieberman et al., 2006). Los cuerpos celulares de las neuronas que contienen MCH se encuentran principalmente en hipotálamo lateral y en la zona incerta que como hemos descrito son centros reguladores de la alimentación. Mientras MCH es similar a NPY y AgRP en ser estimulado por la deprivación de alimentos e inhibido por leptina, difiere en los anteriores en que no es afectado por la administración de ghrelin o insulina. También se ha visto que la expresión de MCH permanece inalterada en ratas obesas inducidas por dieta comparadas con ratas delgadas. Este péptido actúa específicamente a través del receptor tipo 1 (MCHR1) el cual es un receptor con siete dominios transmembranal asociado a proteínas G. EL receptor MCHR1 se expresa ampliamente en el ARC, LHA y en VMH, y también en áreas extra hipotalámicas (Hervieu GJ, 2000; Saito Y, 1999). La expresión de MCH es estimulada por el ayuno. El papel de MCH en el control de la ingesta y homeostasis energética es apoyado por hallazgos de la administración central de este péptido que potencian la ingesta (Kawano H, et al., 2002). Aunque este efecto inducido por MCH es relativamente corto y de pequeña duración comparado con el de NPY. Existe evidencia de que MCH puede tener un mayor efecto en procesos metabólicos que pueden contribuir a la ganancia de peso (Qu D, et al., 1996). Esto fue demostrado por el bloqueo de la expresión de MCH en ratas expuestas al frio, en las cuales se vio un efecto débil sobre la ingesta, pero causó una pérdida de peso corporal junto con un incremento de la expresión de la proteína desacoplante tipo 1 (UCP1) (Pereira-da-silva M, 2003). INTRODUCCION 22 La expresión de AGRP/NPY en el ARC es esencial para el control de la alimentación y el peso corporal y diversos estudios han demostrado que la activación de las neuronas NPY y AGRP en el hipotálamo medio basal media los efectos de ghrelin en el balance energético (Gropp E., 2005; Luquet S. et al., 2005). Periféricamente se cree que la acción adipogénica de ghrelin puede ser directa y puede estar mediada por la regulación de PPAR-γ, aunque otros estudios demuestran que ghrelin media la adiposidad periférica a través de los receptores de melanocortinas en el hipotálamo y el sistema nervioso simpático eferente, efecto que es independiente de la ingesta (Barazzoni R., 2005). Otro aspecto importante en el mecanismo de acción de ghrelin es su sistema de señalización intracelular y dentro de este el calcio desempeña un papel importante en el modo de señalización utilizado por los receptores GSHR1a. El ghrelin incrementa los niveles de calcio a través de la adenilato ciclasa cinasa A y es capaz de desencadenar la liberación de GH a través de la proteína cinasa fosfolipasa C (ver figura 5) (Kohno D, 2003; Chen C, 1996). Se conoce también que ghrelin incrementa la ingesta de alimentos en relación al ayuno a través de la activación de la proteína cinasa activada por AMP (AMPK) y acetil-CoA carboxilasa (ACC) y la inhibición de la sintasa de ácidos grasos (FAS) en el VMN. También existen datos que respaldan que el metabolismo de ácidos grasos, la activación de AMPK y especies de oxigeno reactivas, pueden mediar las acciones de ghrelin en el núcleo ARC y VMN (López M, 2008; Andrews Z. B., 2008). INTRODUCCION 23 Fig. 5: Mecanismo de acción de ghrelin, a través de receptores GHS-1ª en el hipotálamo e hipófisis. Ghrelin incrementa el ion calcio intracelular a través de la vía de la proteína cinasa adenilato ciclasa (AC-PKA) en las células que expresan NPY en el núcleo arcuato o a través de la fosfolipasa C (PLC-PKC). AMPK junto con actil-CoA carboxilasa (ACC) y la acido graso sintasa (FAS) también median el incremento de la ingesta de alimentos mediado por ghrelin durante un ayuno. Ghrelin-Balance energético y ghrelin Existen muchas evidencias que demuestran que el ghrelin es importante en la regulación del apetito y del balance energético a corto y largo plazo. Existe un aumento prepandial de ghrelin y una caída postprandial en el plasma apoyando la hipótesis que ghrelin actúa como un iniciador del consumo de comidas en humanos (ver figura 6) (Cummings DE, 2004; Callahan HS, 2004, McCowen KC, 2002). Ghrelin se describe también como la contraparte de la insulina y la leptina. Ghrelin también reduce la secreción de insulina estimulada por la glucosa, por lo tanto ghrelin incrementa los niveles sanguíneos de glucosa y altera la tolerancia de glucosa. También se ha demostrado que ghrelin incrementa los niveles de ARNm de la proteína 1 de unión al elemento regulatorio de INTRODUCCION 24 esteroles (SREBP1) así como proteínas relacionada con el almacenamiento de grasa, incluyendo a ACC, FAS y lipoproteina lipasa (LPL) llevando a la estimulación de la acumulación de lípidos intracitoplasmáticos, disminuyendo así el uso de grasa como combustible metabólico y favoreciendo un incremento de la adiposidad y del peso corporal. Ghrelin induce la obesidad abdominal, independientemente de su actividad orexigénica central (Thompson NM, 2004; Zhang W, 2004). Fig. 6: Representación de los niveles plasmáticos de ghrelin durante un período de 24 horas, se observan picos de ghrelin previos a las comidas y disminuyen posterior a estos. De esta forma los niveles de ghrelin se correlacionan inversamente con el IMC. Por lo tanto los niveles de ghrelin están reducidos en aquellos sujetos que son obesos comparados a los sujetos normales (Tschöp et al., 2001; Williams et al., 2006). Los niveles de ghrelin se correlacionan negativamente con factores que aumentan la obesidad, porcentaje de grasa, insulina y niveles de leptina. En adición, la pérdida de peso se encuentra asociada con un incremento de los niveles plasmáticos de ghrelin (Cummings DE, 2002; Purnell JQ, 2007; Broglio F, 2001). INTRODUCCION 25 Ghrelin y otras enfermedades La caquexia se define como la pérdida de peso no intencional en la cual se pierden masa magra y grasa. La desnutrición en este escenario es a menudo muy difícil de tratar y se asocia con un empeoramiento del trastorno subyacente. Los niveles plasmáticos de ghrelin se han encontrado elevados en los individuos con menor IMC en comparación con aquellos con IMC normal o superior (Huang et al, 2007). Algunos estudios de pacientes con insuficiencia cardíaca congestiva (ICC), la enfermedad pulmonar obstructiva (EPOC) y el cáncer no han demostrado una diferencia significativa en las concentraciones de ghrelin entre individuos sanos y pacientes cuando se compara el IMC (Nagaya et al, 2001; Madeddu C, 2009). A diferencia de la caquexia por cáncer, la caquexia asociada con la insuficiencia renal crónica (IRC) se asocia únicamente con el aumento en los niveles totales de ghrelin (acil-grelin no se incrementan) (Yoshimoto et al., 2002). Hasta ahora, los intentos de tratamiento de la caquexia por cáncer con el ghrelin han requerido dosis supra-fisiológicas de ghrelin, pero han demostrado efectos positivos casi universalmente en el apetito. Esto sugiere que el efecto del ghrelin en los centros estimulantes del apetito no está saturado en el marco de la caquexia por cáncer (DeBoer, 2008). En resumen, los síndromes de caquexia tienen niveles elevados de des-acil ghrelin basal. No se sabe si estos niveles elevados de des-acil ghrelin son la causa de los síntomas o una respuesta fisiológica a la caquexia. La mayoría de los estados de la enfermedad que resultan en la caquexia también demuestran una elevación de la ghrelin acilo que se puede esperar después de la pérdida de la masa corporal. Los primeros estudios con agonistas del GHS-R son prometedores para el tratamiento de los síndromes de caquexia (Garcia and Polvino, 2007). 26 Ghrelin y Síndrome de Prader-Willis El síndrome de Prader-Willi (SPW) es un síndrome de obesidad genética caracterizada por la deficiencia de GH. Los niños con SPW presentan un aumento rápido de peso en la infancia, junto con un apetito voraz. Otros desórdenes clínicos asociados al SPW incluyen el hipogonadismo, el control aberrante de la temperatura corporal y alteraciones del sueño. Aunque la disfunción hipotalámica se piensa que es la base para muchas de las características del SPW, los mecanismos subyacentes siguen siendo desconocidos. Los niveles elevados de ghrelin total se demostraron por primera vez entre los adultos con SPW. Posteriormente se demostró que los niños con SPW en comparación con los controles de peso iguales que tienen de 3 a 4 veces niveles de ghrelin más altos (Haqq, 2003). También se ha demostrado que durante el ayuno los niveles de ghrelin fueron significativamente mayores en el grupo de SPW en comparación con los grupos control con obesidad mórbida (niños con mutaciones en los genes individuales MC4R y los individuos con deficiencia de leptina). Los estudios anteriores y otros que replican estos hallazgos demuestran que la hiperfagia que se observa en el SPW puede ser secundaria debido a los elevados niveles de ghrelin. INTRODUCCION INTRODUCCION 27 IV.-PÉPTIDOS HIPOTALÁMICOS Y PERIFÉRICOS QUE INHIBEN LA INGESTA (ANOREXIGÉNICOS) Transcripto regulado por cocaína y anfetaminas (CART) CART se identificó en un principio por PCR como un nuevo ARNm resultante posterior a la administración de estimulantes psicotrópicos (Douglass J, 1995). El producto proteico del ARNm tiene una secuencia líder y varios pares de aminoácidos básicos. El péptido maduro contiene varios sitios de unión, con lo que CART puede ser procesado postranscripcionalmente en fragmentos cortos y largos. Ambas formas se encuentran en ratas pero solo las formas de péptidos cortos son encontradas en humanos (Douglass J, 1995). Los péptidos CART están localizados en diferentes áreas específicas del hipotálamo, incluyendo el PVN, DMH, PFN, LHA, ARC, así como en hipófisis y glándula adrenal, sugiriendo un eje hipotálamo-hipófisis-glándula adrenal. Las neuronas CART están asociadas con la recompensa, procesamiento sensorial, estrés, regulación endócrina y alimentación (Koylu EO, 1997). Las ratas fa/fa y los ratones ob/ob tienen niveles reducidos del ARNm de CART. (Larsen et al., 2000). El ayuno atenúa la expresión del ARNm de CART en el hipotálamo, demostrando que la regulación del ARNm de CART se encuentra relacionada a la disponibilidad de alimentos y al estado hormonal periférico. La expresión de CART en el ARC y PVN es estimulada en ratas sometidas a dietas altas en grasas comparadas con ratas con dietas bajas en grasas, estos cambios posiblemente se deban en parte al aumento de leptina tras las dietas altas en grasas, ya que los niveles de CART se correlacionan a los de leptina (Elias CF, 1998). La administración aguda central del péptido CART disminuye de una forma dosis-dependiente a la ingesta de alimentos en ratones y reduce la ingesta INTRODUCCION 28 estimulada por NPY (Lambert PD, 1998). La administración crónica central de este péptido disminuye la ingesta de alimentos y causa una pérdida de peso en ratas delgadas y obesas fa/fa. Además anticuerpos contra CART causan un incremento en la ingesta nocturna. Otros efectos inducidos por CART incluyen un efecto inhibitorio de la secreción y vaciamiento gástrico, incremento de los niveles circulantes de ácidos grasos libre y estimulación de UCP1, 2 y 3 en el tejido adiposo marrón, tejido adiposo blanco y músculo lo que sugiere un efecto en la termogénesis (Kong WM, 2003). Existen evidencias que respaldan una relación entre CART y otros péptidos hipotalámicos involucrados en la homeostasis energética. En el ARC, todas las neuronas de CART expresan POMC, estableciendo una relación entre CART y el sistema de las melanocortinas en la estimulación de la termogénesis y gasto energético y en la mediación de acciones inhibitorias sobre la ingesta (Elias CF, 1998). Otros estudios demuestran la coexistencia de CART junto con MCH en el hipotálamo lateral y área perifornical (Broberger, 1999). Al igual que las melanocortinas, CART es estimulado en condiciones de balance energético positivo, en asociación con un aumento de leptina, restringiendo la ingesta de alimentos y activando al sistema nervioso simpático, previniendo la ganancia de peso corporal. Melanocortinas Las melanocortinas son péptidos bioactivos derivados del precursor proopiomelanocortina (POMC) que es un precursor de 267 residuos de aminoácidos, el cual es sintetizado en el ARC así como en la hipófisis anterior, aunque también se localiza en el sistema inmune (Broberger, 1998). El proceso postranscripcional de POMC produce un número de péptidos con actividades biológicas distintas. En la adenohipófisis, su procesamiento INTRODUCCION 29 produce hormona liberadora de la adrenocorticotropina (ACTH), en el ARC, ACTH es seguidamente procesado a α-MSH, mientras la β-lipoproteina dará a β-endorfina (Broberger, 1998). Las acciones biológicas de las melanocortinas están mediadas por interacciones con al menos cinco receptores asociados a proteínas G, siendo MCR-3 y MCR-4 predominantemente los que tienen una mayor relevancia en cuanto a las acciones metabólicas, MCR-3 se encuentra localizado en el hipotálamo, especialmente en el ARC incluyendo en las neuronas POMC y en el sistema límbico. MCR-4 está más ampliamente distribuido a través del todo el cerebro y es altamente expresado en diferentes áreas hipotalámicas tales como el ARC, PVN y PFLH (Liu H, 2003; Mountjoy KG, 1994). Otras evidencias relacionan a las melanocortinas con leptina, señalando que la leptina incrementa los niveles de POMC para ejercer sus acciones sobre el balance energético (Cheung CC, 1997). El perfil de expresión del ARNm de POMC muestra un ritmo circadiano, con niveles bajos que se alcanzan en el inicio del ciclo de la alimentación cuando los niveles de leptina son bajos y picos más altos al final del ciclo. La relación entre leptina y las neuronas de POMC, se ha demostrado por el hecho que las neuronas de POMC expresan receptor para la leptina y que esta hormona estimula la expresión de POMC (Elias CF, 1999). Además se ha visto que ratones ob/ob muestran una reducción substancial de POMC en el ARC, hecho que es revertido por la administración de leptina. La obesidad acompañada con altos niveles de leptina se asocia con un incremento en los niveles de ARNm de POMC. Mientras los estados de deprivación de alimentos y lactancia, que tienen bajos niveles de leptina se asocian con reducción de la expresión del gen de POMC (Torri C, 2002). La leptina estimula la secreción de α-MSH en el hipotálamo e induce una despolarización de las neuronas de POMC de una manera relacionada a las INTRODUCCION 30 concentraciones de la misma. Esto probablemente este mediado por canales catiónicos no específicos, así como por la reducción en la frecuencia del efecto inhibitorio de las neuronas NPY/GABA. La neuronas POMC hipotalámicas también expresan receptores para insulina, y la insulina al igual que la leptina, estimula la expresión del ARNm de POMC (Benoti C, 2002). Contrariamente a estos péptidos, ghrelin inhibe las neuronas POMC, posiblemente estimulando las neuronas NPY/GABA que aumentan su efecto inhibitorio hacia las neuronas POMC (Cowley MA, 2003). La expresión de POMC en el ARC no es afectada por el consumo de dietas altas en grasas. La administración central de α-MSH o un análogo de este, producen una fuerte supresión de la ingesta de alimentos en ratones obesos (Pierroz DD, 2002). La administración crónica de α-MSH induce una disminución transitoria de la ingesta pero con una reducción mantenida del peso corporal y la continua infusión de α-MSH disminuye la masa grasa intra-abdominal y mejora la acción de la insulina sobre la captación de glucosa (Obici S, 2001). La inhibición de MCR-4 produce hiperfagia, incrementando la grasa corporal e hiperinsulinemia. Estos datos sugieren que las acciones de α-MSH a través del MC4-R favorecen el aumento de la actividad del sistema nervioso simpático, y si a esto se le agrega una reducción de la ingesta de alimentos, produce una disminución del peso corporal (Graham M, 1997; Ollmann MM, 1997). Por otra parte se ha visto que las mutaciones de MCR-4 en humanos se encuentran ligadas a obesidad mórbida (Farooqui JZ, 1993). Además la estimulación de MC4-R por las melanocortinas reproduce importantes características de la caquexia (disminución de la ingesta de alimentos y del peso corporal e incremento de la tasa metabólica) (Marsh DJ, 1999). INTRODUCCION 31 LEPTINA Características generales Previo al descubrimiento de la leptina, experimentos de parabiosis con ratones genéticamente obesos (ob) y diabéticos (db) realizados por Coleman et al, predecían la existencia de un factor circulante capaz de transmitir información desde la periferia al cerebro indicando la existencia de alta cantidad de reserva energética (Coleman DL, 1973; Coleman DL, 1979). Esto se confirmaría en 1994 cuando Friedman et al identificaron el gen ob, que codificaba una hormona que se expresaba especialmente en el tejido adiposo, y la denominaron leptina (del griego leptos, que significa delgado), y en los años posteriores con la identificación de su receptor (Lepdb, Lepfa) (Tartaglia LA, et al 1995; Chen H, 1996). La leptina es un péptido de 16 KDa y consta de 167 aa. (Figura 7). Es una hormona secretada por el tejido adiposo blanco en proporción a la cantidad total de masa grasa, el tamaño de los adipocitos y su contenido en triglicéridos; así aumenta en sujetos obesos y cae con la pérdida de peso. Se expresa también, aunque a niveles mucho menores en: BAT (tejido adiposo marrón), estómago, intestino, epitelio de glándula mamaria, placenta, músculo esquelético. Circula en sangre y cruza la barrera hematoencefálica (BHE) mediante un mecanismo saturable dependiente de receptor (Ahima et al., 2000). INTRODUCCION 38 Los receptores CCK-A expresados en neuronas vagales aferentes son particularmente importantes dianas para CCK para producir las sensaciones de saciedad, así como mediar los efectos de la inhibición del vaciamiento gástrico y estimulación de la secreción de enzimas pancreáticas (Dockray GJ, 1978). Los antagonistas para el receptor de CCK-A, incrementan la ingesta de calorías y reducen la sensación de saciedad, sugiriendo el importante papel que desempeña CCK en la regulación del apetito (Beglinger C, 2001). La CCK es un modulador del apetito a corto plazo, su vida media es de 1-2 minutos, y no es efectivo en reducir la cantidad de comida si el péptido es administrado más de 15 minutos antes de las comidas (Gibbs J, 1973). Se ha visto que la administración crónica de CCK resulta en la pérdida de peso, efecto que puede explicarse por la acción conjunto de CCK con leptina (Matson CA, 2000). Otros estudios demuestran que la administración crónica de anticuerpos contra CCK o antagonistas de CCK-A resulta en la ganancia de peso en modelos animales pero sin incremento significativo de la ingesta de alimentos. En ratones knock-out para el receptor de CCK-A se desarrolla hiperfagia y obesidad (McLaughlin CL, 1985; Meereis-Schwanke K, 1998). Con todos las evidencias anteriores sobre CCK en relación a su papel en la ingesta de alimentos, su uso podría pensarse como una buena terapia anti-obesidad, pero datos en animales han demostrado que la administración preprandial repetida de CCK reduce la ingesta de alimentos pero incrementa la frecuencia de comidas sin resultados en el peso corporal, confirmando que la administración continua de CCK es inefectiva después de las primeras 24 horas. INTRODUCCION 39 Polipéptido YY y polipéptido P Estos polipéptidos (PYY, PP) junto con NPY, son miembros de una familia de péptidos PP plegados y son factores circulantes puntuales de la saciedad. Todos ellos tienes 36 residuos de aminoácidos, contienen residuos de tirosina, y requieren amidación en el carboxilo terminal para su acción biológica. Sus efectos son ejercidos a través de la familia de receptores Y que son receptores asociados a proteínas G, cuatro de ellos han sido identificados Y1, Y2, Y4 y Y5, los cuales son expresado en el hipotálamo (Larhmmar D, 1996). Y1 y Y5 se expusieron como receptores para las acciones orexigénicas de NPY, y el Y2 es expresado en las neuronas de NPY, pero media las acciones de PYY, mientras que el Y4 media las acciones de PP. El PYY es secretado por las células L entero endócrinas. Estas células se encuentran a través de todo el tracto gastrointestinal, pero particularmente en la porción distal. El patrón de secreción de PYY es, al contrario del de ghrelin, liberado a la circulación después de las comidas y suprimido por el ayuno. Además de los efectos de PYY sobre la ingesta, también se ha comprobado que incrementa la absorción de fluidos y electrolitos del íleon posterior a una comida e inhibe las secreciones gástricas y pancreáticas, contracción de la vesícula biliar y vaciamiento gástrico (Adrian TE, 1985). En humanos la infusión intravenosa de PYY3-36 reduce el apetito y la ingesta de alimentos cerca de un tercio y al contrario de leptina, los niveles circulantes de PYY no se encuentran elevados en obesos, y los sujetos obesos retienen completamente la sensibilidad a PYY3-36 y se ha reportado que estos sujetos tiene niveles bajos de PYY en ayuno y postprandialmente (Batterham, 2002; Chelikan PK, 2006). INTRODUCCION 40 Aunque se conoce que la administración periférica de PYY inhibe la ingesta de alimentos, se ha visto que la administración intracerebroventricular de PYY3-36 estimula la ingesta de comida, probablemente a través de los receptor tipo Y1 y Y5 en el núcleo paraventricular, que son neuronas diana de segundo orden para las neuronas orexigénicas NPY del ARC (Wren AM and Bloom SR, 2007). Aunque otro estudios demuestran una acción anorexigénica de los niveles circulantes de PYY3-36 en el núcleo arcuato. c-fos es observado en el núcleo arcuato en respuesta a la periférica administración de PYY3-36 y también en la inyección directa en el ARC. Esta acción se cree que es a través de los receptores Y2 en las neuronas orexigénicas NPY. Otros datos respaldan estos resultados mostrando inhibición de la ingesta al utilizar agonista de los receptores Y2, mientras la acción e PYY son ausentes en ratones Y2 knockout. Por lo tanto PYY reduce la expresión de NPY en el núcleo arcuato, desinhibiendo a las neuronas POMC. Aunque la desinhibición neural de POMC no parece ser necesaria para la acción de PYY, dados los efectos observados en ratones knock-out para melanocortinas (Batterham RL, 2002; Abbott CR, 2005). Al igual que PYY, el péptido PP es liberado en respuesta a las comidas, en proporción a la carga calórica, e inhibe el apetito. El PP es producido en el páncreas endócrino y exocrino, colon y recto. Las hormonas pancreáticas y gastrointestinales pueden regular los niveles de PP. Ghrelin estimula rápidamente la liberación de PP, mientras somatostatina reducen sus niveles, PP se une con mayor afinidad a los receptores tipo Y4 (Tracks NS, 1980). La administración periférica de PP a niveles fisiológicos ha mostrado una reducción en la ingesta de alimentos, en asociación con una reducción del vaciamiento gástrico y la expresión de ghrelin e incremento del tono vagal. INTRODUCCION 41 PP también incrementa el consumo de oxigeno y la actividad simpática, lo que sugiere un aumento del gasto energético (Asakawa A, 2003). En humanos la infusión de PP reduce la ingesta de alimentos sin alterar el vaciamiento gástrico. Aparte de los efectos agudos del PP sobre el apetito y la ingesta de alimentos, se ha observado que el PP modula el balance energético a largo plazo (Ueno N, 1999). Ratones con sobreexpresión de PP tiene un fenotipo delgado con reducción de la ingesta de alimentos. Los niveles del PP se han encontrado aumentados en individuos de anorexia nerviosa, y existen trabajos que muestras niveles suprimidos del PP en sujetos obesos, aunque los efectos del PP sobre el apetito y peso corporal en sujetos obesos humanos, son desconocidos. Al igual que PYY, la administración central de PP, aumenta la ingesta de alimentos en ratas (Clark JT et al, 1984) . 42 Fig. 10: Diagrama esquemático resumen del hipotálamo; el núcleo arcuato contiene neuronas que son capaces de estimular o inhibir la ingesta de alimentos; Y1 y Y2, subtipos de receptores de NPY; MC4R, receptor tipo 4 de melanocortinas; HGSR, receptor de secretagogos de hormona del crecimiento; LEPR, receptor de leptina; INSR, receptor de insulina INTRODUCCION INTRODUCCION 43 V.-SEÑALES INTRACELULARES AMPK Las células normales generalmente mantienen una amplia relación entre ATP y ADP, típicamente de 10:1, esto significa que existe un almacenamiento de energía que puede utilizarse para procesos que requieren de suficiente energía. La mayoría de las células mantiene su relación ATP: ADP dentro de límites estrechos, lo que indica que el grado de síntesis de ATP exactamente coincide con el grado de consumo de ATP, en nuestras células, esto se logra gracias a sofisticados sistemas que mantienen este balance y la proteína cinasa activada por AMP (AMPK) juega un papel importante en este proceso. AMPK son complejos heterotriméricos consistentes en una subunidad α catalítica y subunidades β y γ, reguladoras, cada una de las cuales es codifica por dos o tres genes distintos (α1, α2, β1, β2, γ1, γ2, γ3). La región C-terminal de la subunidad α son requeridas para formar un complejo con la subunidad β y γ (Pang T et al, 2007; Chen L et al, 2009) (Figura 11). Fig. 11: Estructura de AMPK; los complejos de AMPK son heterotrímeros compuestos por subunidades α, βy γ en una relación 1:1:1. El dominio del carboxilo terminal de la subunidad β (β-CTD) forma el núcleo del complejo, uniéndose a α-CTD y al amino terminal de la subunidad γ (antes CBS1). AID: dominio auto inhibitorio; CBM, modulo de unión a carbohidratos INTRODUCCION 44 AMPK es activada por 5’-AMP de tres formas distintas, siendo todas ellas antagonizadas por altas concentraciones de ATP. Cuando AMP se une, causa una activación alostérica de AMPK y hace que ésta última sea un mejor sustrato para otras kinasas reguladoras, dentro de éstas, se ha identificado recientemente a LKB1 (liver kinase B1) la cual activa a AMPK por fosforilación de la subunidad α en residuos de treonina específicos (Thr172) y esta fosforilación causa la activación de otras proteínas kinasas en una mayor cantidad (Hawley et al, 1996). LKB1 forma un complejo con dos subunidades accesorias: STRAD y MO25. Estas tres subunidades son requeridas para su completa actividad. Se ha demostrado que los ratones LKB1-knockout mueren durante el desarrollo embrionario, demostrando el papel importante que desempeña LKB1 en la activación de AMPK. La estimulación por AMP solo es observada si se encuentra presente el complejo αβγ intacto, y no cuando el dominio cinasa es aislado. Es importante destacar que el residuo de treonina de AMPK es conservado en todas las variantes de AMPK en todos los eucariotas y la mutación de este residuo en levaduras causa una pérdida total de su función in vivo. En adición a esto la unión de AMP a AMPK inhibe la desfosforilación de la treonina 172 por proteínas fosfatasas (Hawley et al, 2003). Otra vía alternativa para la activación de AMPK, involucra a CaMKKβ, la cual desencadena la activación de AMPK en respuesta al incremento de Ca++ sin necesariamente requerir cambios en los niveles de AMP o ADP (Fogarty S, 2010). AMPK es activada por muchas señales de estrés que disminuyen el ATP celular, tales como el envenenamiento metabólico, estrés oxidativo, hipoxia o deprivación de nutrientes. Estos se pueden considerar como situaciones de estrés patológico que interfieren con la producción de ATP. AMPK puede INTRODUCCION 45 ser activado por estrés fisiológico causado por la actividad del músculo esquelético, tejido que consume grandes cantidades de ATP. Aun más, se ha demostrado que la relación entre el ejercicio y AMPK es responsable del efecto benéfico de realizar ejercicio regularmente, previniendo la obesidad y otras enfermedades. Por otra parte, se ha comprobado que AMPK media la estimulación que realiza leptina sobre la oxidación de ácidos grasos en el músculo esquelético. La activación de AMPK en el músculo también incrementa la captación de glucosa y la biogénesis mitocondrial, y esto sugiere que leptina podría por lo tanto, incremental el gasto energético estimulando la oxidación de glucosa así como de los ácidos grasos en el músculo. Los niveles de leptina, pueden hacer que los adipocitos pasen de la síntesis de grasas a la oxidación de ácidos grasos, y esto se encuentra asociado con la activación de AMPK en estas células sugiriendo que AMPK estimula la combustión de grasas cuando su almacenamiento es excesivo (Minokoshi Y, et al, 2004; Yang Y, et al., 2011). En otros estudios se han establecidos relaciones entre AMPK y la ingesta de alimentos en mamíferos, AMPK es inhibida en roedores con altos niveles de glucosa, leptina e insulina, todos los cuales reprimen la ingesta de alimentos, mientras al contrario de lo anterior, AMPK es activada por ghrelin, la única hormona orexigénica de nuestro organismo y que estimula la ingesta de alimentos (Anderson et al, 2004). Estos cambios en AMPK parecen desencadenar cambios subsequentes en la ingesta, hecho comprobado por la inyección directa en el hipotálamo de un activador de AMPK, el 5aminoimidazol 4 carboxamida ribosido (AICAR), produciendo un aumento de la ingesta. Otro dato interesante es el hecho de que la leptina inhibe a AMPK en el hipotálamo pero activa a este mismo en el músculo esquelético. Se ha determinado también que el sistema de AMPK se encuentra INTRODUCCION 46 involucrado en la ingesta de alimentos en respuesta a los niveles bajos de glucosa en mamíferos (Merrill G, 1997). En general, la activación de AMPK regula vías biosintéticas como la síntesis de ácidos grasos y colesterol, pero cambia a vías catabólicas que generan ATP, como son la oxidación de ácidos grasos (β-oxidación), captación de glucosa y glucólisis. Esto lo logra no solo con la acción directa sobre la fosforilación, sino también a través de la estimulación de la expresión génica, como la estimulación de los transportadores de glucosa GLUT4 y genes mitocondriales en el músculo esquelético y disminuyendo la expresión de genes que codifican enzimas de la síntesis de ácidos grasos y gluconeogénesis en el hígado. AMPK regula positivamente la expresión de PGC1 α, el cual está involucrado en el control de la expresión de genes mitocondriales en el músculo, pero regula negativamente los factores de transcripción SREBP-1c y HNF4α, los cuales se encuentran involucrados en la expresión de genes relacionados a la lipogénesis, captación de glucosa y glucolisis en hígado (Li Y, et al, 2011). También AMPK fosforila al ubicuo co-activador p300 en sitios específicos, reduciendo su capacidad para unirse a receptores hormonales nucleares tales como PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) (Narkar VA, et al, 2008). Diferentes estudios demuestran que AMPK inhibe la vía de mTOR a través de la fosforilación de TSC2 (tuberous sclerosis complex 2) TSC1 y TSC2 forman un complejo que regulan negativamente el crecimiento celular y actúa a un nivel superior de TOR causando su inhibición. AMPK fosforila a TSC2 en dos sitios, y esto produce la inhibición de mTOR (Ji C, et al, 2010; Alexander A, et al, 2010). En hígado la activación de MAPK disminuye la expresión de enzimas de la gluconeogénesis como la fosfoenolpiruvato caboxicinasa y la glucosa 6 INTRODUCCION 47 fosfatasa. Otra clase de enzimas que son reguladas negativamente en el hígado son las involucradas en la síntesis de ácidos grasos, como FAS y ACC1, esto asegura que la síntesis de ácidos grasos se encuentre inactiva (Merrill G, 1997). AMPK y la regulación del apetito En mamíferos AMPK puede influir en el metabolismo y en el balance energético, particularmente a través de sus acciones sobre áreas críticas del hipotálamo involucradas en la ingesta de alimentos (ver figura 12) (Claret M, et al, 2007). Como se sabe el principal centro del control del apetito es el ARC. Ensayos de kinasas en regiones hipotalámicas de ratones muestran que las hormonas que inhiben la ingesta, como la leptina, inhiben la isoforma α2 de AMPK, mientras aquellas que promueven la ingesta, como ghrelin o los cannabinoides, activan a AMPK. La inyección directa hacia el hipotálamo de activadores farmacológicos de AMPK promueve la ingesta de alimentos. Usando agentes farmacológicos, se demostró que ghrelin activa a AMPK a través de la vía CaMKKβ en las neuronas pre sinápticas a través del GHSR1a. Consistente con esto, ratones deficientes de CaMKKβ mostraron una reducción de la expresión de NPY/AgRP pero no de POMC y su ingesta en respuesta a la administración de ghrelin (Yang Y, et al, 2011; Claret M, et al, 2007). AMPK parece tener actividad en el VMH controlando el balance energético total. Hay evidencias que involucran a AMPK en la detección de niveles sanguíneos bajos de glucosa promoviendo la liberación de hormonas contrareguladoras (adrenalina y glucagon) que estimulan la liberación de glucosa por el hígado. Las hormonas tiroideas también inhiben a AMPK en esta región, incrementando la actividad de los nervios simpáticos, lo cual INTRODUCCION 54 SIRT1, e incremento de los transcriptos de UCP2 en células SIRT1 ko (Yang T, 2006). SIRT1 y sistema nervioso central A nivel del hipotálamo, el ARNm de SIRT1, fue encontrado preferencialmente en el ARC, VMH, DMH, PVH, supra óptico y el núcleo supraquiásmático. Aunque en niveles bajos el ARNm de SIRT1 fue también expresado en el hipotálamo lateral. El ARNm de SIRT1 fue expresado en ocho de nueve neuronas POMC del ARC (Ramadori G, 2008). A nivel del hipotálamo, SIRT1 es crucial para las respuestas en contra de dietas que inducen a la obesidad y al desarrollo de Diabetes mellitus tipo 2 (Coppari R, 2012). Horvath et al., demostraron que la activación de SIRT1 en neuronas NPY/AgRP es determinante para su excitabilidad, lo cual es importante para cambios apropiados en procesos endocrinos que son necesarios para la adaptación a un balance energético negativo (Diano S, 2010). La inhibición farmacológica de las melanocortinas, revierte el efecto anorexigénico de la inhibición hipotalámica de SIRT1, sugiriendo que SIRT1 regula ingesta a través de la señalización de las melanocortinas. SIRT1 desacetila a FoxO1, regulando de esta manera el sistema de las melanocortinas (Cakir I, et al., 2009). INTRODUCCION 55 P53 Antecedentes En 1979 se describía una proteína que formaba un complejo con la oncoproteína del virus SV40, el gran antígeno T (Lane and carwford 1979). Como antígeno T se había identificado la oncoproteina viral SV40 requerida para la iniciación y mantenimiento de la transformación celular. También p53 fue detectado como un antígeno tumoral, produciendo anticuerpos en tumores de células de ratón. En células SV40 transformadas, el antígeno T regulaba los niveles de la proteína p53 en una célula de tal forma que se postuló que p53 podría ser un producto oncogénico ligado al proceso de la transformación viral. Estos estudios señalaron que las funciones de la proteína p53 estaban íntimamente involucradas en la replicación viral y la tumorogénesis de pequeños ADN virales (Linzer, et al, 1979). En la década de los ‘80 se aislaron varios clones de ADNc de p53 y se demostró que muchos de estos ADNc podrían transformar células en combinación con el oncogén Ras. Por lo tanto p53 se estableció como un oncogén. Pero posteriormente se descubrió que cada uno de esos clones ADNc contenía una mutación y que los clones sin esas mutaciones prevenían la transformación de las células por los oncogenes (Eliyahu et al. 1984; Parada et al.1984; Eliyahu et al. 1985). Agregado a lo anterior, también se encontraron mutaciones en ambos alelos de p53 en tumores de ratones, en líneas celulares en cultivos y lo más importante, en cáncer de colon en humanos. Con estas observaciones se clasificaron a las proteínas p53 de tipo salvaje, como genes supresores de tumores. INTRODUCCION 56 Estas ideas fueron confirmadas por cuatro observaciones: 1.-Los pacientes humanos que heredaron un alelo mutante del gen, con el síndrome de Li-Fraumenni, desarrollaron cáncer a lo largo de su vida con un 100% de penetrancia Algunos de estos individuos desarrollaron varios tumores independientes 2.-Los ratones que tenían pérdida de la función ó mutaciones en el gen p53 (ratones knock-out) desarrollaron tumores a una edad muy joven. 3.-Hasta el 50% de todos los cánceres humanos, se mostraron que contenían mutaciones en ambos alelos del gen p53 (Olivier et al 2010; Robles y Harris 2010). 4.-La expresión aberrante de la proteína p53 se encontró en muchos tipos de tumores (Bartek et al. 1990). Estas observaciones dejaron claro que la proteína p53 juega un papel esencial en la prevención de cánceres en humanos y animales. Después de su descubrimiento en 1979, la proteína supresora de tumores p53 se ha convertido en una piedra angular en la comprensión de la biología molecular del cáncer. p53 ganó la atención a finales de 1980, cuando se hizo evidente que el TP53, el gen que codifica la proteína p53, se encontró mutado o alterado, en una gran proporción de los cánceres humanos, independientemente de su tipo histológico. La proteína p53 es sobre todo un supresor de la proliferación celular inadecuada, impidiendo la replicación del ADN en condiciones que ponen en peligro la integridad genética y la eliminación de las células que crecen inadecuadamente. Este efecto supresor se produce a través de la inducción de la apoptosis (por ejemplo, en las células progenitoras expuestos a daños en el ADN), senescencia ó detención INTRODUCCION 57 transitoria del ciclo celular (en muchas células expuestas a bajos niveles de daño genotóxico) (Baker SJ, 1989; Nigro JM, 1989). La proteína p53 se une a secuencias específicas de ADN o elementos de respuesta (ER) y actúa como un factor de transcripción aumentando la tasa de transcripción de determinados genes que contienen estos ER. El gen p53 regula los genes de p21 y Cdc25c los que pueden iniciar una detención del ciclo celular. La proteína p53 regula BAX, PUMA, NOXA, Apaf-1 y otros genes que pueden conducir a la apoptosis de las células. p53 puede también iniciar un programa de senescencia celular que conduce a un estado terminal para la replicación de las células (Yonish-Rouach et al., 1991). Estos resultados del programa transcripcional de p53 conducen a la supresión de tumores. Los niveles de proteína p53 y su actividad se regulan y son inducibles por un número de señales de estreses diversos. La primera señal que se muestra como un modulador de la actividad de p53 es el daño del ADN. Si las cadenas sencillas o dobles del ADN son dañadas, la proteína kinasa ATM (Ataxia Telangiectasia Mutated) puede activar p53 como un factor de transcripción eficiente, que a su vez transcribe los genes que conducen a la detención del ciclo celular, la apoptosis o la senescencia (Kastan et al., 1991). La respuesta celular para la activación de p53 es determinada en gran parte, por la activación diferenciada de genes dianas de p53. Esta respuesta se puede producir bajo condiciones de moderado o temporal estrés, induciendo la detención del ciclo celular dependiente de p53 o la reparación del ADN antes que las células ingresen de nuevo a un estado de proliferación normal una vez que el estrés haya desaparecido. Por otra parte la respuesta de p53 ante un estrés grave o permanente, es la inducción permanente de la inhibición de la proliferación celular, a través de apoptosis o senescencia (Bensaad et al, 2005) INTRODUCCION 58 Regulación de actividad de p53 La cantidad de proteína p53 en las células es determinada principalmente por la velocidad a la que se degrada, en lugar de la velocidad a la que se produce. El producto de degradación se realiza a través de un proceso conocido como proteólisis mediada por ubiquitina. A través de una serie de pasos, varias copias de un pequeño péptido (ubiquitina) están unidas a la proteína a ser degradada (en este caso p53). Esta cadena de ubiquitina actúa como una "bandera", permitiendo que p53 pueda ser detectada por la maquinaria de proteína-degradante (Kruse JP and Gu W, 2009). La proteína MDM2 (Murine Doble Minute 2) es una de las enzimas implicadas en el etiquetado de p53 con ubiquitina. Este proceso, es un proceso de retroalimentación. La proteína p53 se une a la región reguladora del gen MDM2 y estimula la transcripción de este gen en ARN mensajero, que luego se traduce en proteína (Figura 14). Esta proteína MDM2 se une a p53 y estimula la incorporación de grupos de la ubiquitina al carboxilo terminal de la proteína p53, que a continuación es degradado. Esto reduce la concentración de p53 y reduce la transcripción del gen de MDM2, cerrando el bucle de retroalimentación y permitiendo que los niveles de p53 aumenten de nuevo (Ito A., et al., 2001). INTRODUCCION 59 Fig. 14: Modelo clásico de activación de p53, en el cual se muestra su unión a MDM2 (forma inactiva), ante un estrés. Señales como la fosforilación por AMPK, pueden estabilizarlo y de esta forma separarse de MDM2 (forma activa) para unirse al ADN y activar a sus genes diana Los mayores niveles de p53 por sí solos no son suficientes para que se convierta en un activador transcripcional. Esto requiere cambios conformacionales en la proteína, como resultado de modificaciones tales como la adición o eliminación de grupos fosfatos, acetilos, glucosilos, ribosa, ubiquitina o sumoilación ((Kruse JP and Gu W, 2009) (ver figura 15). El extremo carboxilo de la proteína p53 normalmente se dobla hacia atrás e inhibe la unión al dominio del ADN situado en la parte central de la proteína p53. La acetilación de restos de lisina o fosforilación de los residuos de serina cerca del extremo carboxilo de la proteína p53 puede mejorar la unión de p53 al ADN, presumiblemente al interferir con este plegamiento. La fosforilación del extremo amino terminal de p53 no afecta a sus capacidades de unión al ADN, pero afecta a su afinidad por la degradación de MDM2. Otros cambios en la proteína p53 y MDM2 también son importantes para p53. Cuando una proteína promueve la síntesis de su propio regulador negativo, los niveles de las dos proteínas en una célula se esperarían que oscilen. Esto se ha observado para p53 y MDM2. Del mismo modo, cualquier perturbación de p53 o MDM2 puede tener efectos dramáticos en la INTRODUCCION 60 otra, así como sobre el comportamiento de las células y de los organismos. Esto se demuestra por el hecho de que los ratones genéticamente modificados carentes de MDM2 y p53 pueden sobrevivir hasta la edad adulta, mientras que los ratones que carecen solo de MDM2 mueren como embriones, presumiblemente a causa de la elevada actividad de p53 (Rubbi and Milner, 2003). Fig. 15: Sitios de fosforilación, acetilación y ubiquitinización de p53. Donde P: fosforilación; Ac, acetilación; Ub, ubiquitimización. P53 y Metabolismo Diversos estudios han señalado cambios dramáticos en los procesos catabólicos y anabólicos en las células malignas de diversos tumores. Como ejemplo, la captación de glucosa que era mucho mayor en los tumores que en la mayoría de tejidos normales (Warburg O., 1956). Recientes hallazgos indican que p53 desempeña un papel importante en la glucólisis y la fosforilación oxidativa. El metabolismo de la glucosa es el mayor evento en el desarrollo y el mantenimiento de una variedad de canceres humanos, como fue descrito en 1956 por Otto Warburg. La tasa o grado de INTRODUCCION 61 fermentación láctica anaeróbica en células cancerígenas es significativamente mayor que en las células normales. Por ejemplo la deprivación de oxigeno en regiones del tumor lleva al cambio a la glucólisis más que a la fosforilación oxidativa, para mantener el crecimiento tumoral (Bensaad K, 2006). Las vías metabólicas en las células normales están estrechamente reguladas para permitir el crecimiento celular o la supervivencia, dependiendo de las condiciones. La disponibilidad de nutrientes facilita la síntesis de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos para el crecimiento y proliferación celular, mientras que la carencia de nutrientes provoca una serie de respuestas para restringir la proliferación celular, maximizar la producción de energía y ayudar a la supervivencia celular. Dentro de estos factores importantes en estas respuestas se encuentra mTOR, que promueve la síntesis de proteínas y suprime la inducción de autofagia. mTOR es regulado por Akt (protein cinasa B) y la proteína cinasa activada por AMP (AMPK) , el cual se considera como un sensor de nutrientes respondiendo a un incremento de la relación AMP/ATP bajo condiciones de baja energía para reprimir a mTOR (Feng Z., 2005) (ver figura 16). La activación de p53 por el estrés metabólico es regulada por la fosforilación dependiente por AMPK e influenciada por mTOR. La vía de mTOR juega un papel crítico en la regulación de la proliferación celular y metabolismo celular. mTOR forma dos complejos en las células, mTORC1 y mTORC2. El estrés metabólico activa a AMPK, el cual en cambio fosforila y activa a la proteína TSC2 (tuberous sclerosis complex 2). TSC2 ejerce actividad de GTPasa para regular negativamente a la proteína de unión al GTP, Rheb, que es la proteína que activa a mTORC1, el cual a su vez puede directamente o indirectamente desfosforilar a p53 en la serina 15 en respuesta a la escasez de nutrientes (Feng Z, et al, 2006). INTRODUCCION 62 Fig. 16: Activación de p53 por la carencia de nutrientes a través de la activación de AMPK e inactivación de Akt. P53 induce a genes que activan a AMPK y este a su vez activa a p53, fosforilándolo, y AMPK activa a TSC1 y TSC2. Que producen la inhibición de mTOR. LKB1 también activa a AMPK. p53 induce la expresión de un número de genes diana de la vía mTOR y IGF-1/AKT, incluyendo IGF-BP3, PTEN, TSC2, AMPK b1, Sestrinas 1 y 2. Todos los productos de estos genes regulan negativamente la vía IGF-1/Akt y mTOR en respuesta a señales del estrés. Se ha demostrado que AMPK puede ser fosforilado y activado por la unión a las sestrina 1 y 2, que son genes dianas de p53. P53 induce la expresión de las sestrinas 1 y 2, las cuales interactúan con las subunidades α de AMPK resultando en la fosforilación de AMPK en la treonina 172, lo que resulta en la activación de AMPK y TSC2 y la inhibición de la vía de mTOR (Budanov AV, 2008; Feng Z, 2007). Por otra parte, en la mayoría de células normales, la vía de los ácidos tricarboxilícos conduce a la generación de ATP en la presencia de O2 (fosforilación oxidativa, 36 ATP por moléculas de glucosa) pero en condiciones en donde existe una limitación de O2 o donde el ATP se necesita rápidamente, la glucólisis se convierte en la vía metabólica preferencial para INTRODUCCION 63 obtener energía, debido a que produce ATP a una mayor proporción que la fosforilación oxidativa (aunque produce 2 ATP por molécula de glucosa) (Pfeiffer T., 2001). Dentro de los tumores existe con frecuencia una disminución del riego sanguíneo, y por tanto las células cancerígenas sometidas a un medio de hipoxia, utilizan preferencialmente la glucólisis. También se conoce que dentro de las células tumorales existe un incremento de los requerimientos de energía, debido a la alta proliferación celular, por lo que también necesitan macromoléculas para mantener el crecimiento tumoral, así como para sobrevivir en condiciones de estrés oxidativo e hipoxia. Se ha observado también un aumento del uso de la glutamina en las células cancerígenas proveyendo un importante mecanismo anaplerótico para el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (Suzuki S., 2010). Todos estos cambios en las vías metabólicas durante la transformación maligna celular, no son producto de alguna deficiencia de las mismas, sino una adaptación o habilidad asociadas a la transformación oncogénica para promover el suministro de energía a través de la glucólisis. Como se ha mencionado anteriormente, la reducción de nutrientes o los bajos niveles energéticos activan a AMPK, y se inhibe la vía Akt-mTOR, lo que conduce a la activación de p53. Por una parte Akt activa a MDM2, un regulador negativo de p53, y p53 puede activar a PTEN, el cual es un conocido regulador negativo de Akt. AMPK puede activar a p53 directamente, incrementando su transcripción ó estabilizando a p53 a través de la fosforilación. El ADP y ATP también modulan la capacidad de p53 para su unión con el ADN, siendo el ADP un promotor de su unión y el ATP un inhibidor de la interacción de p53 con el ADN (Feng Z., 2007). Al final todos estos procesos son un mecanismo por el cual un descenso de la energía se interpreta como una señal para la inducción y activación de p53. Al MATERIALES Y METODOS 71 MATERIALES Y METODOS MATERIALES Y METODOS 73 I.-ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN Para realizar estos experimentos se utilizan ratas macho Sprague-Dawley (8 semanas de edad, 200-250 gr.; animalario general, Universidad de Santiago de Compostela) y ratones con base genética mixta C57BL/6J y 129/sv homocigotos wildtype (wt) y Knockout para el gen p53 (ko p53). Los ratones wildtype (wt) y knockout (ko) se originan de aparejamientos entre ratones heterocigotos para el gen p53 y solo las camadas de ratones wildtype y knockout se utilizan en los experimentos. En todos los casos se trata de ratas macho y ratones machos y hembras adultos. Los animales sometidos a cirugía permanecen en el animalario durante 5-6 días antes de ser utilizados para que se adapten a las condiciones de temperatura y luz. Estas condiciones se mantienen constantes a 22-24ºC e iluminación controlada en ciclos alternos de 12/12 horas luz/oscuridad. Las ratas y ratones se alimentan con pienso comercial y agua ad libitum. En el caso de los ratones alimentados con dieta alta en grasa (High Fat Diet HFD) estos permanecen como mínimo 12 semanas con esta dieta después de ser destetados. En aquellos casos que es necesario realizar una cirugía en ratas, se administra via intraperitoneal una mezcla de ketamina (100 mg/kg de peso corporal)/xilazina (15 mg/kg de peso corporal) considerándose ésta una dosis adecuada para conseguir una anestesia de grado II-III durante períodos de una o dos horas, siendo la mortalidad muy baja. Los ratones se anestesian con una inyección intraperitoneal, usando como anestésico el Tribromoetanol (480 mg/kg, Sigma Aldrich, St Louis, MO). MATERIALES Y METODOS 74 Los animales se tratan y se sacrifican a las 17 semanas de edad, y en el caso de los ratones deficientes para el gen p53, antes de cualquier signo de morbilidad o desarrollo de tumores. Todos los protocolos de manipulación animal se han realizado cumpliendo las Normas de Cuidado de Animales de Laboratorio y Ley Internacional de Experimentación Animal. SOLUCION ANESTESICA I.-KETAMINA: 42.5 % ketolar, parke-Davius, Morris Plañis N. J. USA, 50mg/ml II.-XILAZINA 20% Rompun, Bayer Leverkusen, Alemania. 2 mg/ml III.-Solución Salina Fisiológica (SSN) FORMULA DE DIETAS UTILIZADAS Fórmula de Dietas utilizadas, Research diets, Inc. 20 Jules lane, New Brunswick, NJ, USA.: High Fat Diets: proteínas (20 kcal%), carbohidratos (35 kcal%), grasas (45 kcal%). Standard Diets (dieta control): proteínas (20 kcal%), carbohidratos (70 kcal%), grasas (10 kcal%). MATERIALES Y METODOS 75 Ingredientes HFD gm. HFD kcal STD gm. STD kcal Caseína 200 800 200 800 L-cisteina 3 12 3 12 Almidón de maíz 72.8 291 315 1260 Maltodextrina 10 100 400 35 140 Sucrosa 172.8 691 350 1400 Celulosa 50 0 50 0 Aceite de soja 25 225 25 225 Manteca de cerdo 177.5 1598 20 180 Mezcla de minerales S10026 10 0 10 0 Fosfato dicálcico 13 0 13 0 Carbonato cálcico 5.5 0 5.5 0 Citrato potásico 16.5 0 16.5 0 Mezcla de vitaminas V10001 10 40 10 40 Bitartrato de colina 2 0 2 0 MATERIALES Y METODOS 76 II.-TÈCNICAS EXPERIMENTALES CANULACIÓN INTRACEREBROVENTRICULAR ( I.C.V.) Esta operación se realiza aproximadamente 4 días antes del experimento. El objetivo de la implantación de estas cánulas es acceder al ventrículo lateral. Se utilizan cánulas de polietileno (PE-20, PE-50, Clay Adams, Becton-Dickionson, New Jersey USA) de calibre fino (1.09 mm. de diámetro externo y 0.38 de diámetro interno) en uno de los extremos de la cánula se pone un tope y se corta en bisel a unos ¾ mm de distancia, siendo esta parte la que se introduce en el cerebro y la que permite el acceso al ventrículo lateral. El extremo opuesto de la cánula se sella hasta el día del experimento. Una vez anestesiados los animales, (con las dosis descritas previamente), se realiza un corte en la piel de la cabeza a la altura de la frente y hasta la parte posterior de los ojos, dejando al descubierto el tejido subcutáneo, el cual debe ser retirado con la ayuda de un bisturí hasta dejar a la vista el cráneo. Se localiza el bregma, que separa los huesos frontales de los occipitales y se utiliza como punto de referencia para realizar un orificio (1.2 mm mediolateral y 1 mm posterior) a través del cual se introduce la cánula. Posteriormente se añade cianoacrilato para que la cánula quede perfectamente fija y se sella toda la zona abierta. Para comprobar que la cánula ha quedado en posición correcta se inyecta protamina 2 %, disuelto en agua con acetato sódico, lo cual claramente tiñe el ventrículo lateral, demostrando así que la cánula ha sido colocada correctamente. MATERIALES Y METODOS 77 III.-METODOLOGIA EXPERIMENTAL Estado nutricional Efecto del estado nutricional Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8 ratas con alimento ad libitum 8 ratas en ayuno durante 48 horas 8 ratas en ayuno durante 48 horas y realimentadas durante 24 horas Efecto de la alimentación con dieta alta en grasas (HFD) Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8-12 ratones wt alimentados con dieta alta en grasas 8-12 ratones p53 ko alimentados con dieta alta en grasas Tratamientos intracerebroventriculares (i.c.v.) Efecto de ghrelin sobre la ingesta y ganancia de peso Administración i.c.v. de ghelin Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8 ratas control (5 ul solución salina normal, SSN) 8 ratas tratadas con ghrelin (5 ug/5 ul) Ghrelin (ghrelin human trifuoroacetate; ref: H4864; Bachem) Efecto del inhibidor de SIRT1 sobre la acción de ghrelin Administración i.c.v. de EX527 y ghrelin Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8 ratas control (5 ul DMSO + 5 ul SSN) 8 ratas tratadas con ghrelin (5ug/5 ul SSN) MATERIALES Y METODOS 78 8 ratas tratadas con EX527 (10 ug/5 ul DMSO) 8 ratas tratadas con EX527 (10 ug/5 ul ) + ghrelin (5ug/5 ul) Ghrelin (ghrelin human trifuoroacetate; ref: H4864; Bachem) EX527 (6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-carbazole-1-carboxamide, 10 mg, TOCRIS bioscience) El mismo procedimiento se utilizó para la administración de Sirtinol 10 µg i.c.v. (Tocris Bioscience, USA) Efecto de la administración de Resveratrol sobre la ingesta Administración de resveratrol (10 ug/2 ul) i.c.v. Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8 ratones wt control (2 ul DMSO) 8 ratones wt Resveratrol (2 ul Resveratrol ) 8 ratones p53 ko control (2 ul DMSO) 8 ratones p53 ko Resveratrol (2 ul) Resveratrol (Tocris Bioscience, USA, 1418) Efecto de la administración de AICAR Administración de AICAR (3 ug/5 uL) i.c.v. Se establecieron los siguientes grupos experimentales: 8-12 ratones C5/BL6 p53 ko (2 ul SSN) 8-12 ratones C5/BL6 p53 ko AICAR (3 ug/5 uL; Sigma-Aldrich, A9978) MATERIALES Y METODOS 79 IV.-PROTOCOLO EXPERIMENTAL GASTO ENERGETICO, ACTIVIDAD LOCOMOTORA, COCIENTE RESPIRATORIO Se analizó el gasto energético, cociente respiratorio RQ y actividad locomotora usando un sistema calorimétrico de 12 cajas (PhenoMaster, Sophisticated Life Science Research Instrumentation, TSE system, Germany). Los ratones fueron colocados en cajas individuales durante 48 horas para su adaptación, posteriormente se colocan en el sistema durante 48 horas, durante los que se recolectan los datos y posteriormente se analizan. Se utilizaron 12 individuos por grupo. TEST DE TOLERANCIA A LA INSULINA El test es realizado en ratones adultos con más de 12 semanas de edad, se realiza por la mañana en ratones en ayuno nocturno, se inyecta la insulina (0.75 U/kg) disuelta en SSN de manera intraperitoneal. Previo a la inyección de insulina, se recolecta sangre de la vena de la cola, para medir los niveles de glucosa basal, luego se inyecta la insulina intraperitoneal y se mide la glucosa a los 15, 30, 60 90, 120 minutos, mediante un glucómetro. Material - Glucómetro y tiras de glucosa - Jeringas 1 ml x 27s ga. - Insulin Human, recombinant 50 MG (Sigma Aldrich, St. Louis, USA) MATERIALES Y METODOS 86 RT-PCR: EXTRACCION DE ARN TOTAL a) Extracción de ARN de los tejidos Las muestras congeladas se homogenizan mecánicamente (Polytron) después de añadirle una cantidad determinada de Trizol (Invitrogen): 400 μl en el caso del hígado, y 500 μl en el caso de la grasa. Después de la homogeneización las muestra se dejan reposar a Tª ambiente durante unos 5 minutos b) Aislamiento de ARN A continuación se añade 1 ml de cloroformo y se agita fuertemente durante varios segundos, y luego se dejan reposar durante unos minutos. Transcurrido ese tiempo se centrifuga 15 minutos a 12000 rpm a 4ºC observando ya claramente las 2 fases: una fase acuosa (donde se halla el ARN) y una fase fenólica (que contiene las proteínas y los lípidos), entre ambas se encuentra la interfase (donde está el ADN). Se retira la fase acuosa con cuidado pasándola a otro tubo de polipropileno autoclavado y se desprecia la fase fenólica. De esa manera separamos el ARN del resto de los componentes celulares. c) Precipitación de ARN Una vez separado el RNA, se le añade 1 ml de isopropanol, se agita y se deja a - 20ºC durante unos 10 minutos, consiguiendo así que el ARN precipite. Transcurrido este tiempo se centrifuga 10 minutos a 12000 rpm a 4ºC para concentrar el ARN al fondo. MATERIALES Y METODOS 87 d) Lavado Una vez eliminado el sobrenadante se añade 1 ml de etanol al 70% en H2O DEPC, y tras una agitación corta se centrifuga durante unos 5 minutos a 12000 rpm y 4ºC. Para eliminar la mayor cantidad de etanol posible, se vuelve a centrifugar 1 minuto a 13500 rpm y 4ºC, y posteriormente se retira el sobrenadante con una pipeta. Finalmente se resuspende en H2O DEPC calentándolo a 60 ºC durante 15 minutos. Cuantificación La concentración de ARN de la muestra se determina en un espectofotómetro ajustado a 2 longitudes de onda: 260 y 280 nm. La absorción a 260 nm proporciona la cantidad de ácidos nucleícos y a 280 nm la cantidad de proteína. El grado de pureza de la muestra se determina estudiando el cociente 260/280, considerándose aceptable la oscilación entre 1.8 y 2. **TRIZOL® Reagent (Invitrogen) **Cloroformo **Isopropanol **Etanol 70% **H2O DEPC: agua bidestilada con dietilpirocarbonato al 0.1%. Tras una noche a Tª ambiente se autoclava. MATERIALES Y METODOS 88 RETROTRANSCRIPCIÓN (RT) La reacción de retrotranscripción se lleva a cabo en un volumen total de 30 μl, con las siguientes proporciones: -Volumen de muestra necesario para obtener: 500 ng de (grasa) ó 100 ng (hígado) de ARN total -6 μl de tampón de reversotranscripción (5X first strand buffer; Invitrogen) (250 nM Tris-HCl, pH 8.3, 375nM KCl, 15mM MgCl2, 50nM DDT) -1.5 μl ClMg2 de 50 mM (Invitrogen) -6 μl de mezcla de dNTPs (dTTp, dCTp, dGTp, dATp, con una concentración de 10 mM de cada uno -0.17 μl de cebadores (Random primers, Invitrogen) -0.25 μl inhibidor de RNasa(RNaseOUT®, 40 U/ μl Invitrogen) -2 μl de m-MLV reversotranscriptasa (200 U/ μl, Invitrogen) -Volumen correspondiente de H2O MQ para obtener el volumen final de 30 μl También se realiza una RT (30 μl de mezcla de reacción excepto mMLV, cuyo volumen era sustituido por H2O MQ) Una vez preparadas las mezclas de reacción, se incuban en un termociclador, que realiza los siguientes pasos: 50 minutos a 37ºC, 15 minutos a 42ºC, 5 minutos a 95ºC, y finalmente las muestras se mantenían a 4ºC. PCR Tiempo Real (TAQMAN) Se usa como sistema de detección las Sondas Taqman (Sondas específicas marcadas con fluorocromos: donador y aceptor). Está basado en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. MATERIALES Y METODOS 89 El fluorocromo utilizado para la realización de la PCR ha sido TAMRA que posee un máximo de absorción de 560nm y un máximo de emisión de 580nm. Los primers usados fueron diseñados según la base de datos BLAST. La mezcla de reacción de PCR cuyo volumen final era de 12 μl estaba constituida por: -2.92 μl H2O-MQ -0.36 μl Oligonucleótido sentido (10 μM) -0.36 μl Oligonucleótido antisentido (10 μM) -0.36 μl Sonda (5 μM) -6 μl Taqman Universal PCR master mix; (Applied Biosystems) -2 μl Muestra (RT) Además de las muestras, se añade un control negativo (-RT), un blanco y 6 muestras para la realización de una curva patrón tanto para el gen problema como para el housekeping o gen constitutivo, todo ello por duplicado. **Curva patrón: consta de 6 puntos realizados por dilución seriada (1:4) a partir de un volumen total de 30-40 μl resultante de la mezcla de distintas muestras de RT (2 μl de distintos productos de RT, pero siempre del mismo tratamiento o tejido). Las condiciones de amplificación fueron de: 1) 50ºC durante 2 minutos 2) 95ºC durante 10 minutos, 3) 95 º durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto. Número de ciclos: 40 Para lleva a cabo la reacción de PCR se utiliza 7300 Real Time PCR System (Applied Biosystems) mediante el programa informático 7300 System Software® (Applied Biosystems). El análisis de los datos se realiza en base a un MATERIALES Y METODOS 90 gen de referencia, en este caso el 18S, en concreto calculando la diferencia entre eficiencias de ambos genes: Referencia y problema. mRNA Secuencia SondaFAM-5’-ACCTTTGAAGATTTCGTCAGGATCTTTGATGA-3’- TAMRA ACCα Pimer forward 5´-TGGGCGGGATGGTCTCTTT -3´ Primer reverse 5’-AGTCGCAGAAGCAGCCCATT-3’ Sonda FAM-5’-CTGCCCAGGACAGGAACCG-3’-TAMRA FAS Pimer forward 5’-GACATTTCATCAGGCCACC-3 Primer reverse 5’-CCTCTAGCAGCCGCACCTC-3’ Sonda FAM-5’-CCTGCCGGAGGTCGCCACAAATA-3’-TAMRA LPL Pimer forward 5’-CTGAAAGTGAGAACATTCCCTTCA-3’ Primer reverse 5’-CCGTGTAAATCAAGAAGGAGTAGGTT-3’ SondaFAM-5’-TCACCTTGAGAGAAGAATTAGCACGCACGG-3’-TAMRA SCD-1 Pimer forward 5’-TGCCAGAGGGAATAGGGAAA-3’ Primer reverse 5’-CTCTCCCATCCTTACTTACAAACCA-3’ Sonda FAM-5´-TGGTCAAGGAGCTGCAGAAGGAGTTTCCT -3´-TAMRA MCD Pimer forward 5´-CGGCACCTTCCTCATAAAGC -3´ Primer reverse 5´-TGGAAAAGGCCCCCAGAT -3´ CPTM Comercial Sonda FAM-5´-CGCTGTTGTCGGCTTATTGTATCCCTTGT -3´-TAMRA INSIG Pimer forward 5´-TGCTGTGGCACGGCAG -3´ Primer reverse 5´-CTCCCAGGTGACTGTCA -3´ Sonda FAM-5’-CCCTGGCCTATTTGATGCC-3’-TAMRA SREBP 1-c Pimer forward 5’-CTCATCAACAACCAAGACAG-3’ MATERIALES Y METODOS 91 Primer reverse 5’-CCTGTCTCACCCCCAGCAT-3’ Sonda FAM-5’-GACGGCAAGTCTGGTGCCAGCA-3’-TAMRA 18S Pimer forward 5’-CGGCTACCACATCCAAGGAA-3’ Primer reverse 5’-GCTGGAATTACCGCGGCT-3’ MATERIALES Y METODOS 92 HIBRIDACIÓN IN SITU La expresión génica de los neuropéptidos hipotalámicos AgRP, NPY así como el factor de trascripción Bsx, se estudió por hibridación in situ. Dado que los péptidos estudiados se expresan en más de un núcleo hipotalámico, esta técnica nos ha permitido delimitar, anatómicamente los posibles cambios de expresión del ARNm. Para llevar a cabo este estudio se utilizaron como sondas oligonucleótidos monocatenarios antisentido, marcadas en 3’ con [α-35S] dNTP, todas ellas diseñadas en nuestro laboratorio. (Tabla 3) a) Obtención de los cortes Los cerebros de rata que se almacenan a -80ºC hasta su utilización, se cortan en un criostato (HM50E®, Microm) en secciones de 16µm de espesor. Los cortes se montan en portaobjetos recubiertos de polilisina (PolysineTM; VWR) Los portaobjetos con las secciones de interés son elegidos en función de los criterios estereotáxicos del “Atlas de cerebro de rata” de Paxinos & Watson. Así para el estudio de AgRP, NPY y Bsx, los cortes debían incluir el núcleo arcuato hipotalámico. Marcaje de la sonda La reacción de marcaje tiene lugar en un volumen final de 20µl. El orden de los reactivos es el que sigue: MATERIALES Y METODOS 93 • 10,5µl H2O DEPC • 2 µl de 10X NE Buffer 4 (1X NEBuffer 4 contiene: 50mM acetato potásico, 20mM Tris-acetato, 10mM acetato magnésico, 1mM DTT; pH 7.9) (BioLabs®) • 2 µl de Oligonucleótidos (100 ng; la concentración de trabajo final es 50ng/ µl) • 2 µl de solución 10X de CoCl2 (2.5mM) (BioLabs®) • 1.5 µl de la enzima Terminal Transferasa (Tdt) suministrada en 60mM KPO4 (pH 7.2), 150 mM KCl, 1mM 2-mercaptoetanol, 0.5% Triton X-100 y 50% glicerol. (BioLabs®) • 2 µl dNTP-S35 (PerkinElmer®) La incubación se lleva a cabo en un baño a 37ºC durante 120-150 minutos. Una vez concluida la reacción, es necesario separar los oligonucleótidos marcados de los dNTP-S35 no unidos. La separación tiene lugar por cromatografía de exclusión. Se utilizan columnas de cromatografía comerciales con Sephadex G-50 (Illustra™ NICK Columns. GE Healthcare). El tampón que se utiliza para eluir la columna es TE (10mM Tris-HCl / 0.1mM EDTA; pH 8). Primeramente se lavan las columnas con dicho tampón, para a continuación eluir dos fracciones en 400µl de TE. La última de las fracciones se corresponde con el oligonucleótido marcado. Finalmente procedemos a determinar el número de cuentas radiactivas en un contador ß (WinSpectral 1414®, MATERIALES Y METODOS 94 Wallac), diluyendo para ello 4µl del oligo marcado en 4ml de líquido de centelleo. b) Preparación del tejido Los cortes son secados rápidamente con el objeto de eliminar los posibles restos de hielo seco, y a continuación se fijan en paraformaldehido al 4% en tampón fosfato 0.2M, durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para eliminar los restos de paraformaldehido se hacen dos lavados rápidos con PBS 1X. Posteriormente, se procede a la deshidratación de los cortes mediante lavados sucesivos en diferentes concentraciones de etanol (Guinama) (70, 80, 90, 95 y 100%, 5 minutos cada uno, a excepción del lavado en etanol absoluto, que fue de 10 minutos). Por último se dejan secar los cortes al aire libre. c) Hibridación Sobre cada porta se aplican 200 µl de la solución de Hibridación, con 0.5x106 o 1x106 cpm según el oligonucleótido marcado que estuviésemos empleando en cada caso (Tabla 4). Dicha solución, está constituida además de los oligos marcados por Buffer de Hibridación y DTT 1M. El Buffer de Hibridación contiene H2O DEPC, SSC 4X (a partir de SSC20X: 3M NaCl; 300mM Citrato Sódico Tribásico Hidratado; Sigma), 10% Dextran sulfato (Sigma), disolución Denhart’s 1X (albúmina de suero bovino-BSA, 1% Ficoll, 1% MATERIALES Y METODOS 95 Polivinilpirrolidona-PVP; Sigma), ADN de esperma de Salmón (Sigma), 50% formamida desionizada (Sigma). Los portaobjetos con la sonda se hibridaron toda la noche a 37 ºC en atmósfera húmeda. d) Lavados • Eliminamos el exceso de sonda y a continuación realizamos 5-6 lavados rápidos en SSC 1X • Posteriormente lavamos 4 veces con SSC 1X a 42ºC o 55ºC durante 30 minutos cada lavado. (Tabla 4) • Un lavado de 1 hora a temperatura ambiente en SSC 1X • Lavado rápido con H2O milliQ autoclavada • Precipitamos las sales con un lavado rápido en etanol 70% con 300mM NH4AC • Lavamos con etanol absoluto y dejamos secar los cortes e) Exposición y revelado Una vez secos los portas, se exponen a una película de autorradiografía (Kodak Biomax MR Film) en condiciones de total oscuridad (Hypercassette™ Amersham Biosciencies). En cada película son expuestas secciones representantes de cada grupo experimental. Los tiempos de exposición son distintos según el oligonucleótido estudiado. (Tabla 4). Transcurrido el tiempo de exposición las placas son reveladas en condiciones de oscuridad durante 2.5 minutos y posteriormente fijadas durante 5 minutos. MATERIALES Y METODOS 102 Análisis estadístico Los resultados en todos los casos se presentan como la Media ± SEM (Standard Error of the Mean) de al menos 6-8 individuos por cada grupo experimental. Los datos se analizan mediante ANOVA, seguido de un test post hoc de TukeyKramer siempre que las variables cumpliesen los requisitos de normalidad (test de Kolmogorov-Smirnov). Cuando las variables no cumplen alguna de las condiciones se utiliza el test no paramétrico de comparación múltiple de Krustall-Wallis. Para análisis parciales entre dos grupos experimentales se emplea el test t-student siempre que sea posible, y en su defecto el test no paramétrico Mann-Whitney. Los análisis estadísticos se realizan utilizando el programa informático GraphPad Instant 3.05. En todos los casos, se considera una diferencia estadísticamente significativa a partir de la probabilidad p<0.05. RESULTADOS RESULTADOS 105 RESULTADOS Es bien conocido el papel que el gen supresor de tumores p53 desempeña como regulador de los cambios celulares durante el desarrollo y progresión de tumores. Sin embargo p53 posee también la capacidad de mediar cambios metabólicos en las células a través de la regulación del metabolismo energético y el estrés oxidativo. Con la relación que se estableció años atrás de p53 y la glicólisis, esta área ha ganado interés científico y recientes estudios han demostrado la capacidad de p53 de regular la expresión de diferentes enzimas involucradas en la glucolisis así como en la fosforilación oxidativa (Kondoh H, 2005; Schwartzenberg-BarYoseph F., 2004; Bensaad K, 2006). La dieta estándar no modifica las características fenotípicas de los ratones p53 ko en relación a sus controles. En un experimento inicial partimos de camadas de ratones machos homocigotos wildtype (wt) y p53 knockout (p53 ko) los cuales fueron alimentados con una dieta estándar (4 kcal% grasas, Dieta AO4/AO4C/RO4, Scientific Animal food & Engineering, SAFE, Francia) durante 12 semanas posterior a su destete. Los animales se estabularon en cajas individuales con agua y comida ab libitum y se monitorizó el peso e ingesta semanales durante las 12 semanas. RESULTADOS 106 Peso corporal (gr) 0 5 10 15 20 25 30 wt p53 ko 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 wt p53 ko Fig. 1: Peso (A) e ingesta diaria (B) de ratones wildtype y p53 knockout, alimentados con dieta estándar (STD) ad libitum durante 12 semanas posterior a su destete. (n=12/grupo). Como podemos observar, nuestros resultados demuestran que no existen diferencias estadísticas significativas en cuanto a peso (Figura 1A) e ingesta (Figura 1B) en los ratones p53 ko comparados con los ratones wt, alimentados ad libitum con un dieta estándar durante 12 semanas posterior a su destete. La dieta estándar no altera la composición corporal, ni el gasto energético en los ratones p53 ko. Nuestro siguiente experimento fue evaluar la posible ganancia neta de masa grasa y no grasa entre estos dos grupos experimentales, a través de resonancia magnética nuclear (RMN, Whole Body Composition Analyzer EchoMRI,General Electric Equipments, Houston,USA). Luego valoramos el gasto energético y la actividad locomotora, por calorimetría indirecta, a través de un sistema calorimétrico de 12 cajas (PhenoMaster, Sophisticated Life Science Research Instrumentation, TSE system, Germany). Los ratones fueron puestos previamente en cajas de adaptación durante 48 horas con agua y dieta Ingesta de alimentos (gr) A B wt STD p53ko STD RESULTADOS 107 0 5 10 15 20 25 wt p53 ko 0 200 400 600 800 wt p53 ko 0 5 10 15 20 25 wt p53 ko estándar ad libitum, luego se estabularon en 12 cajas individuales en el sistema de calorimetría durante 48 horas (ver materiales y métodos) Partimos de los grupos anteriores: 12 ratones machos wildtype (controles) 12 ratones machos knockout p53 Fig. 2: Efecto de la dieta estándar sobre la ganancia de masa grasa (A) y no grasa (B) gasto energético (C) y actividad locomotora (D) en ratones wt y p53 ko. El gasto energético y la actividad locomotora fueron monitorizados durante 48 horas durante la fase diurna (barras blancas) y fase oscura (barras grises). (n=12/grupo). 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 wt p53 ko Masa grasa (gr) Masa magra (gr) Gasto energético (kcal/kg/ 48 hrs.) Actividad locomotora total 48 horas A B C D wt STD ko STD RESULTADOS 108 wt p53 ko 0 20 40 60 80 100 120 En estos resultados observamos que la administración de una dieta estándar durante 12 semanas, posterior a su destete no produce diferencias estadísticas significativas en los ratones p53 ko comparados con los wt, en relación a la ganancia neta de masa grasa, (Figura 2A) tampoco encontramos diferencias significativas en la masa magra (Figura 2B) entre ambos grupos. En relación al gasto energético, pudimos observar que ambos grupos, wt y p53 ko, mantienen el mismo gasto energético con la misma actividad locomotora, tanto en la fase de luz como en la oscura. (Figura 2C y 2D). Estos resultados nos sugieren que la ausencia del gen p53, con una ingesta de una dieta estándar, no es un factor determinante en parámetros que influyen en el peso como son la ingesta y el gasto energético. La dieta estándar no modifica el perfil glicémico de los ratones p53 ko Como ya es sabido, muchos de los cambios en el metabolismo se reflejan en alteraciones de los niveles circulantes de glucosa, en la tolerancia a la glucosa ó en la sensibilidad a la insulina, por lo que en un último experimento con este tipo de dieta, evaluamos los niveles de glucosa basal, el test de tolerancia a la glucosa y el test de tolerancia a la insulina. Glucosa basal (mg/dl) A wt STD ko STD RESULTADOS 109 0 15 30 60 120 (min) 0 50 100 150 200 250 300 350 P53 KO P53 WT 0 20 40 60 80 100 120 0 15 30 60 120 (min) P53 KO P53 WT Fig. 3: niveles glucosa en ayuno (A), test de tolerancia a la glucosa (B), test de tolerancia a la insulina (C) en ratones wt y p53 ko, alimentados con una dieta estándar durante 12 semanas posterior a su destete. (n=12/grupo). Observamos que los ratones p53 ko tienen los mismos niveles de glucosa en ayuno que los ratones wt. (Figura 1A). Además, al someterlos al test de tolerancia de glucosa, no se encontraron diferencias significativas entre ambos grupos. (Figura 2B). En el test de tolerancia a la insulina tampoco se observaron diferencia estadísticas significativas. (Figura 2C). Estos resultados indican que tanto el metabolismo de la glucosa como la sensibilidad a la insulina no estaban alterados en los ratones p53 ko alimentados con una dieta estándar. Niveles de Glucosa (mg) Niveles de Glucosa (mg) B C GTT ITT 110 Efecto de la dieta alta en grasas (HFD) en ratones p53 knockout Aunque la genética juega un papel importante en la homeostasis energética, existen otros factores externos o medioambientales como los diferentes tipos de dieta que determinan en un gran porcentaje la génesis de la obesidad. Diversos estudios epidemiológicos han demostrado la asociación entre obesidad y el tipo de dieta, especialmente la dieta alta en grasas (Jéquier E., 2002; Hill JO, et al, 2000) que conduce al aumento de la morbilidad, aumentando la frecuencia de enfermedades como la diabetes mellitus, hipertensión, enfermedades cardiovasculares, cáncer y otras. Los ratones sometidos a una dieta alta en grasa son un modelo apropiado y muy común para el estudio de mecanismos implicados en el desarrollo de la obesidad. En el presente trabajo sometimos a ratones homocigotos wildtype y p53 knockout, a dietas altas en grasas (HFD 45 kcal% grasas) durante 12 semanas para inducirles obesidad, con el objetivo de observar los cambios en el peso corporal, composición corporal, perfil lipídico y cambios en los tejidos metabólicamente representativos en ausencia del gen p53. 111 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 (semanas) *** P53 KO P53 WT 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 wt p53 ko * 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 wt p53 ko Los ratones deficientes del gen p53 ganan menos peso que los wt cuando se alimentan con una dieta alta en grasas. Fig. 4: Ganancia de Peso corporal (A y B) e ingesta diaria (C) en ratones machos wt y p53 ko alimentados con dieta HFD durante 12 semanas posterior a su destete. (n=12/grupo). *P<0.05 en relación a sus controles. A B C wt HFD p53 ko HFD Ganancia de peso corporal (gr.) Ingesta de alimentos 24h (gr.) Ganancia de peso corporal (gr.) RESULTADOS 118 Fig. 8: Temperatura corporal basal (A), test de tolerancia al frio a 4ºC, durante 5 horas (B), fotografías de BAT interescapular (cruces) con cámara térmica en un rango de temperatura de 27-41 ºC en ratones wt y p53 ko HFD. (n=12/grupo). P<0.05, **P<0.01 en relación a sus controles. Los ratones p53 knockout mostraron un descenso significativo de su temperatura corporal, durante las 5 horas a 4ºC, en relación a sus controles (Figuras 8A, 8B). Estos resultados fueron corroborados con fotografías térmicas de BAT in vivo (Figura 8C), en las cuales observamos diferencias claras en la temperatura del BAT entre wt y p53 ko, observando una menor temperatura en el BAT de los ratones p53 ko. B C wt HFD wt HFD wt HFD P 53 ko HFD p53 ko HFD P 53 ko HFD RESULTADOS 119 20 40 60 80 100 120 140 * p 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 * * * Eecto de la dieta alta en grasas sobre el tejido adiposo blanco en ratones p53 ko Como sabemos, una de las principales funciones del tejido adiposo blanco es la de almacenar energía en forma de triacilglicéridos y liberar estos compuestos como ácidos grasos libres a los diferentes tejidos durante situaciones de stress o ayuno. En nuestros resultados pudimos observar que los ratones p53 ko, a pesar de estar ingiriendo una dieta alta en grasa, tienen cantidad de masa grasa menor que los ratones wt, por lo que evaluamos los niveles de varias enzimas involucradas en el metabolismo de los lípidos, tanto a nivel de ARNm como de proteínas. A B wt HFD p53 ko HFD ACCα FAS CPT1 p AMP K AMPKα1 AMPKα2 Niveles de proteína WAT Niveles de proteínas WAT FAS CPT1 ACC pAMPK AMPKα1 AMPKα2 Β-actina wt p53 ko RESULTADOS 120 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 p 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4* Expresión ARNm INSIG2 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 * Fig. 9: Niveles de proteína (A y B) y de ARNm (C, D, E) en el tejido adiposo blanco en ratones wt y p53 ko alimentados con dieta alta en grasas durante 12 semanas. (n=12/grupo). *P<0.05 en relación a sus controles. Encontramos que la expresión génica de UCP1, FAS, PGC1α y CIDEA no mostró cambio alguno entre ambos grupos (Figuras 9C, 9D), a excepción del receptor β-adrenérgico tipo 1, del cual encontramos una mayor expresión génica significativa en los ratones p53 ko en relación a sus controles, sugiriendo un mayor tono simpático a nivel del tejido adiposo blanco (WAT). A nivel de Β-AR1 C D wt HFD p53 ko HFD PGC1 β-AR2 β-AR3 UCP1 CIDEA ATGL TLR4 FASSREBP1 ATGL HSL MGL Expresión ARNm (unidades arbitrarias) Expresión de ARNm E RESULTADOS 121 20 40 60 80 100 120 140 *** * ** pAMPK AMPKα1 AMPKα2 pACC ACC FAS CPT1 proteína, encontramos niveles disminuidos de pAMPK y niveles elevados significativamente de ACCα, CPT1 y FAS (Figuras 9A, 9D). Por lo tanto, estos resultados en su conjunto nos estaban indicando que, en cierta forma, tanto la oxidación como la síntesis de lípidos se encuentran activadas. Dado que los ratones p53 ko, ganan menos masa grasa, estos datos sugieren que el metabolismo basal está incrementando en los ratones p53 ko en comparación con los wt. Efecto de la dieta alta en grasas sobre el metabolismo hepático en ratones p53 ko Otro órgano importante en la captación y liberación de lípidos es el hígado. Este órgano es también uno de los más afectados durante la ingesta de dietas altas en grasas, ya que provocan esteatosis hepática (Dhibi et al, 2011). Por lo tanto, evaluamos los niveles de las enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos tanto a nivel de ARNm como de proteína en el hígado. A wt HFD p53 ko HFD Niveles de p roteínas FAS pACC pAMPK AMPKα AMPKα2 β-actina ACC wt p53 ko RESULTADOS 122 0 50 100 150 200 * 50 100 150 200 250 300 350 * ACCα FAS PGC1α INSIG2 0 0.5 1 1.5 2 ** LPL Fig. 10: Niveles de proteínas (A) y de ARNm (B, C, D) a nivel hepático en ratones wt y p53 ko, alimentados con dieta alta en grasas durante 12 semanas. (n=12/grupo). *P<0.05, **P<0.01 en relación a sus controles. B Niveles de ARNm Niveles de ARNm Niveles de ARNm C D LDLR MTTP SCARB1 RESULTADOS 123 Como observamos en nuestros resultados, los niveles de proteína de pAMPK, ACCα y FAS se encontraron disminuidos (Figura 10A), mientras que a nivel de expresión génica no encontramos diferencias significativas en ACCα, FAS, PGC1 (Figuras 10C, 10D, 10E) entre ambos grupos. Sin embargo, la expresión de Scarb1 (involucrada en la recaptación de lipoproteínas de alta densidad, HDL) y la expresión génica de LPL (Figura 10C, 10D), involucrado en la hidrólisis y captación de TAG circulantes, se encontró significativamente aumentada en los ratones p53 ko. Esto nos estaba indicando que los TAG provenientes de los quilomicrones y los ácidos grasos libres (FFA unidos a albúmina) provenientes del tejido adiposo blanco, estaban siendo captados y almacenados a nivel hepático en una mayor proporción en los ratones p53 ko que sus controles. Estos datos moleculares implican que debería existir una mayor cantidad de grasas almacenadas a nivel hepático, lo que produciría una mayor esteatosis hepática en los ratones carentes del gen p53. Por lo que en nuestro siguiente experimento analizamos histológicamente los hígados de los ratones wt y p53 ko, por medio de tinciones de hematoxilina-eosina y OIL RED, y evaluamos el perfil lipídico en ambos grupos de ratones. RESULTADOS 124 Fig. 11: (Panel A y C) Aspecto histológico de cortes de hígado de ratones wt HFD, donde se aprecia vena central (VC) y sinusoides (S) embebidos en tejido conectivo, con tinción de hematoxilina-eosina y Oil red (puntos rojos), respectivamente./(Panel B y D) Severa acumulación macro y microvesicular de lípidos (flechas negras) y hepatocitos en balón en cortes histológicos de hígados de ratones p53 ko HFD, con tinciones de hematoxilina-eosina y oilred (puntos rojos) en hígado en ratones p53 ko HFD. A B C D VC S p53 ko HFD Wildtype HFD Wildtype HFD p53 ko HFD 50 µm 50 µm 50 µm 50 µm RESULTADOS 125 0 2 4 6 8 10 12 NEFAs (µg/mg hígado) * 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0,09 TG (µg/mg hígado) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Colesterol (µg/mg hígado) Fig. 12: Niveles de ácidos grasos no estereficados NEFAs (A), TAG (B) y colesterol total(C), en hígado de ratones wt y p53 ko alimentados con HFD. (n=12/grupo). *P<0.05, en relación a sus controles. Como podemos observar, en los cortes histológicos de hígado de los ratones p53 ko, existe una infiltración de lípidos tanto macro como microvesicular a nivel del hepatocito (Figura 11, panel B y D) hallazgos que son bien conocidos y característicos de una esteatosis hepática producida por la ingesta alta en grasas (Dhibi et al, 2011; Angulo, 2002). Esta infiltración de lípidos en el hígado de los ratones p53 ko es mayor que en los hígados de los ratones wt. En adición a estos resultados, encontramos los niveles hepáticos de ácidos grasos no estereficados (NEFAS) disminuidos y la cantidad de TG en hígado aumentados en los ratones p53 ko (Figura 12A, 12B), lo que junto a los wt HFD p53 ko HFD A B C * RESULTADOS 126 0 25 50 75 100 125 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 ** hallazgos histológicos hepáticos y a la mayor expresión génica de LPL en estos ratones p53 ko HFD, nos sugiere una mayor captación y almacenamiento de grasa en el hígado. Efecto de la dieta alta en grasas sobre el perfil glicémico y lipídico en ratones p53 ko. A continuación evaluamos el efecto que tiene la dieta HFD sobre los niveles de lípidos y glucosa en sangre, debido a que existe una relación directa entre la ingesta excesiva de grasas, obesidad y resistencia a insulina que produce alteraciones en el metabolismo de los lípidos y la glucosa. Con este fin, realizamos el test de tolerancia a la glucosa e insulina, como se ha descrito anteriormente (ver materiales y métodos) y medimos los niveles circulantes de TAG, NEFAS y colesterol. wt HFD p53 ko HFD A Niveles de glucosa (mg/dl) B Niveles de Insulina (ng/ml) RESULTADOS 127 0 0 25 50 75 100 125 * * 0 0 50 100 150 200 250 300 350 400 P53 KO P53 WT 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 ** 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 0 20 40 60 80 100 120 140 ** 1 5 30 60 90 120 15 30 60 90 120 Fig. 13: Glucosa Basal en ayuno (A), Niveles de insulina (B) test de tolerancia a la glucosa (C), test de tolerancia a la insulina (D), NEFAS (E), TAG (F), niveles de colesterol (G) en ratones wt y p53 ko HFD. (n= 12/grupo). *P<0.05, **P<0.01 en relación a sus controles. Niveles de glucosa (mg/dl) Niveles de FFA (mg/dl) C (min) GTT ITT D E F G Niveles de glucosa (mg/dl) Niveles de TAG (mg/dl) Niveles de colesterol (mg/dl) (min) RESULTADOS 134 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 *** En un segundo experimento administramos a nivel central i.c.v.: ghrelin, EX527 y EX527 previo a la administración de ghrelin. Fig.18: Efecto del bloqueo farmacológico de SIRT1 sobre la ingesta después de 2 horas (B) y 6 horas (C) posterior a la administración de EX527 (10 ug) y ghrelin (5 ug) i.c.v. en ratas macho Sprague-Dawley. (n=8/grupo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 en relación a sus controles. En este experimento comprobamos que ghrelin aumentó la ingesta después de las 2 y 6 horas de su administración i.c.v., como era de esperar. Sin embargo, cuando el inhibidor de SIRT1, EX527, se administró 20 minutos previo a ghrelin, la acción orexigénica de ghrelin fue bloqueada notablemente después de 6 horas (Figura 18A, 18B). Estos resultados demuestran que la acción orexigénica de ghrelin depende parcialmente de SIRT1. 0 2 4 6 8 10 12 **** *** A B vehículo + vehículo vehículo + ghrelin Ex527 + ghrelin Ex527 + vehículo Ingesta acumulada 2h (gr) Ingesta acumulada 6h (gr) RESULTADOS 135 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 50 100 150 200 250 300 350 ** * ** Efecto del bloqueo de SIRT1 sobre la acción de ghrelin en el metabolismo de ácidos grasos a nivel del hipotálamo. Ghrelin aumenta la ingesta de alimentos a través de sus efectos sobre la activación de la proteína kinasa dependiente de AMP, AMPK y sobre el metabolismo de ácidos grasos a nivel del hipotálamo (López M, 2010). En nuestro siguiente experimento evaluamos los niveles de las principales enzimas involucradas en el metabolismo lipídico a nivel del hipotálamo en las ratas tratadas con EX527 y ghrelin después de 6 horas. Fig. 19: Efecto del tratamiento agudo con EX527 (10 µg) y ghrelin (5 µg) i.c.v., a las 6 horas, sobre los niveles de proteínas involucradas en el metabolismo de lípidos en hipotálamo de ratas macho Sprague-Dawley. El análisis de proteínas se realizo a través de Western Blotting, (n= 8/grupo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01 en relación a sus controles. Vehículo Ghrelin Ex527 Ex+Ghrel pACC pAMPK ACCα FAS AMPK α1 AMPKα2 β-actin pAMPK AMPKα2 pACC ACC FAS AMPKα1 vehículo + vehículo vehículo + ghrelin Ex527 + ghrelin Ex527 + vehículo Niveles de p roteína ( % control ) RESULTADOS 136 En estos resultados, como era esperado, después de las 6 horas de la administración i.c.v. de ghrelin, los niveles de pAMPK hipotalámicos se incrementaron significativamente, mientras que los niveles de ACC disminuyeron (Figura 19). Estos efectos fueron bloqueados cuando el EX527 se administró previamente a ghrelin, sugiriendo que el efecto de ghrelin sobre AMPK, estaba mediado por SIRT1 y estableciendo una nueva relación entre ghrelin-SIRT1 y AMPK. Efecto del bloqueo de SIRT1 sobre la acción de ghrelin en la expresión de factores de transcripción y neuropéptidos mediadores de la ingesta. Sabemos que ghrelin, a nivel del hipotálamo activa a AMPK, causando importantes cambios en la respiración mitocondrial y alterando la expresión de factores de transcripción como Bsx, Forkhead box O (FoxO1) y pCREB y que esto conduce a la activación de neuropéptidos como AgRP/NPY (Nogueiras R, 2010). Por lo tanto, evaluamos estos factores de transcripción y neuropéptidos en los grupos experimentales descritos anteriormente (Controles, Ghrelin, EX527, EX527+ Ghrelin). Fig. 20: Niveles de proteína FoxO1 y pCREB en hipotálamo tras la administración de EX527 y ghrelin i.c.v. después de 6 horas en ratas macho Sprague-Dawley, el análisis se hizo a través de western Blotting. (n= 8/grupo). Siendo: *p<0.05 en relación a sus controles. 0 50 100 150 200 250 300 350 ** A FOXO1 pCREB pCREB FOXO1 β-actin Vehículo Ghrelin Ex527 Ex + Ghre Niveles de p roteína ( % control ) vehículo + vehículo vehículo + ghrelin Ex527 + ghrelin Ex527 + vehículo RESULTADOS 137 Fig. 21: Efecto de la administración de EX527 (10 ug) y ghrelin (5 ug) i.c.v. después de 6 horas, sobre la expresión del ARNm de Bsx, NPY y AgRP en el núcleo arcuato (A, B, C, D) de ratas macho Sprague-Dawley. El análisis se hizo por medio de la técnica de hibridación in situ (n=8/grupo): *p<0.05, **p<0.01 en relación a sus controles. En estos resultados observamos que la expresión, inducida por ghrelin sobre los factores de transcripción FoxO1, pCREB y Bsx, además de los neuropéptidos NPY y AgRP a nivel del núcleo arcuato, disminuyó cuando administramos EX527 previamente a ghrelin (Figura 20 y 21). Estos resultados en su conjunto, veh + veh veh + ghrel Ex527 + veh Ex527 + ghrel NPY AgRP Bsx NPY expresión ARNm ARC (unidades arbitrarias) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ** * Bsx expresión ARNm ARC (unidades arbitrarias) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 * AgRP expresión ARNm ARC (unidades arbitrarias) 0 20 40 60 80 100 120 140 160 ** * C B A D vehículo + vehículo vehículo + ghrelin Ex527 + ghrelin Ex527 + vehículo RESULTADOS 138 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 ** * demuestran que las acciones orexigénicas de ghrelin se encuentran mediadas en parte por SIRT1 y que la activación de la actividad hipotalámica de SIRT1 es un evento anterior a las alteraciones provocadas por ghrelin sobre AMPK, metabolismo lipídico, factores de transcripción y neuropéptidos. En nuestro siguiente experimento utilizamos otro inhibidor específico de la actividad de SIRT1, el Sirtinol. Obtuvimos similares resultados a aquellos observados con EX527, sobre la ingesta. (Figura 22) Fig. 22: Efectos de la inyección i.c.v. de ghrelin (5 ug), sirtinol (10 ug), y ghrelin + sirtinol sobre la ingesta de alimentos después de 6h. (n=8/grupo). *p<0.05, **p<0.01 en relación a sus controles. Efectos de ghrelin sobre la ingesta y el metabolismo de ácidos grasos en ratones p53 KO Como hemos comprobado, acetil-p53 es uno de los sustratos de SIRT1 y la inhibición de este último disminuye la acción orexigénica de ghrelin. Según literatura reciente p53 se encuentra relacionado con el metabolismo y homeostasis energética (Vousden KH, 2009) y nuestros resultados iniciales demuestran una diferencia tanto a nivel tisular como metabólica entre los Ingesta acumulada 6h (gr.) Vehículo + vehículo Vehículo + g hrelin Sirtinol + vehículo Sirtinol + g hrelin RESULTADOS 139 ratones wt y p53 ko. Dada toda esa relación, nosotros nos planteamos si p53 podría ser un mediador de los efectos de ghrelin dependientes de SIRT1, para lo cual en nuestro siguiente experimento utilizamos ratones wt y p53 ko a los cuales les administramos ghrelin i.c.v. Fig. 23: Efecto de la administración ghrelin (5 ug) i.c.v. sobre la ingesta acumulada después de 2 horas (A) y 6 horas (B) en ratones wt y p53 ko machos (n=8/grupo) Siendo: *p<0.05 en relación a sus controles. En estos resultados observamos que la administración central de ghrelin aumentó la ingesta en ratones wt significativamente, pero no sucedió lo mismo con el grupo de los ratones p53 ko tratados con ghrelin i.c.v. después de 2 ni 6 horas (Figura 23). Estos resultados indicaban que la presencia del gen supresor de tumores p53 era necesario para la acción orexigénica de ghrelin. Por lo tanto en un segundo experimento evaluamos los niveles hipotalámicos de las principales enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos, las cuales son 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 wt p53 ko * 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 wt p53 ko A B Vehículo Ghrelin (5 ug) 6h Vehículo Ghrelin (5 ug) 2h Ingesta 6 horas (gr.) Ingesta 2 horas (gr.) RESULTADOS 140 afectadas por la vía ghrelin-SIRT1. Para este experimento partimos de los mismo grupos de ratones wt y p53 ko utilizados anteriormente. Fig. 24: Efecto del tratamiento con ghrelin (5 ug) i.c.v. después de las 6 horas, sobre los niveles de enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos (A y B) en hipotálamo de ratones wt y p53 ko. El análisis de proteínas se realizó a través de western Blotting, (n= 8/grupo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01 en relación a sus controles. 0 20 40 60 80 100 120 140 wt ko pAMPK wt ko AMPKα1 wt ko AMPKα2pACC wt ko FAS wt ko 0 50 100 150 200 ACC wt ko * * ** ** A Vehículo Ghrelin (5 µg) 6h Niveles de proteína (% control) pACC pAMPK ACCα FAS AMPK α1 AMPK α2 β-actin Vehículo ghrelin vehículo ghrelin wt p53 ko RESULTADOS 141 En estos resultados observamos que los niveles hipotalámicos de pAMPK aumentaron en los ratones wt debido al estimulo de ghrelin, pero este mismo efecto no se pudo observar en los ratones p53 ko (Figura 24). Este resultado sugiere que el gen supresor de tumores p53 es un mediador esencial de las acciones de ghrelin sobre AMPK. Por lo tanto con estos resultados podemos afirmar que p53 es un mediador a través de SIRT1, de las acciones orexigénicas de ghrelin. Efecto de la administración de Resveratrol sobre la ingesta y el metabolismo de ácidos grasos a nivel del hipotálamo de ratones p53 ko. Diversos trabajos científicos han demostrado que el Resveratrol, un polifenol que se encuentra en uvas y otros alimentos, activa a SIRT1 (Sinclair et al, 2003) y estimula a AMPK. (Yi CO, 2011; Patel MI, 2011; Vingtdeux V, 2010). Por lo tanto, evaluamos la hipótesis de que el Resveratrol podría afectar la ingesta de alimentos a través de sus efectos sobre el metabolismo de lípidos a nivel del hipotálamo. Partimos de un primer experimento en el cual administramos centralmente Resveratrol a diferentes dosis (1 ug, 10 ug, 20 ug) a 1 hora y 2 horas a ratones swiss. En nuestros resultados pudimos observar que la inyección central de Resveratrol, incrementa la ingesta en ratones de manera dosis dependiente (1 µg, 10 µg, 20 µg) después de 1 y 2 horas. (Figura 25). RESULTADOS 142 Fig. 25: Efecto de la administración i.c.v. de Resveratrol dosis-respuesta (1, 10 y 20 ug) sobre la ingesta después de 1hora (A) y 2 horas (B), en ratones swiss. (n=8/grupo). Siendo: p*<0.05, **p<0.01 en relación a sus controles. Con los resultados anteriores, y dado que observamos una respuesta dosisdependiente de Resveratrol sobre la ingesta, en un segundo experimento evaluamos las enzimas involucradas en el metabolismo de lípidos a nivel del hipotálamo tras la administración central de Resveratrol (20 µg) después de 1 hora. 0 0,05 0,1 0,15 0,2 vehiculo 1 µg 10 µg 20 µg resveratrol ** ** 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 vehiculo 1 µg 10 µg 20 µg resveratrol *** Vehículo Resveratrol A B Ingesta a 1 hr (gr.) Ingesta a 2 hr (gr.) RESULTADOS 143 Fig.26: Efecto del tratamiento agudo con Resveratrol 20 ug i.c.v., después de 1 hora, sobre los niveles de proteínas involucradas en el metabolismo de lípidos en hipotálamo de ratones macho. El análisis de proteínas se realizó a través de western Blotting. (n=8/grupo). Siendo: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001en relación a sus controles. En nuestros resultados observamos que posterior a 1 hora de la administración central de Resveratrol 20 µg, lo niveles de proteína de pAMPK y pACC, se incrementaron a nivel del hipotálamo (Figura 26). En nuestro siguiente experimento investigamos si p53 podría ser un mediador importante de las acciones de Resveratrol. Con este fin tratamos con Resveratrol i.c.v. a ratones wt y p53 ko, siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La administración central de Resveratrol aumentó la ingesta de alimentos después de una hora, Veh Resv pACC pAMPK β-actin ACC AMPK α1 AMPK α2 FAS 0 20 40 60 80 100 120 140 160 pAMPK AMPKα1ACC 0 50 100 150 200 250 pACC Niveles proteína (% control) *** ** ** FASAMPKα2 Vehículo Resveratrol 20 ug (1 hora)