Extracción y caracterización analítica de compuestos bioactivos en cultivos biotecnológicos

1
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Cu so académico 2020/2021
FACULTAD DE QUÍMICA
Depa amen o de Química Analí ica, Nu ición y B oma ología
DOBLE GRADO EN QUÍMICA Y EN BIOLOGÍA
TRABAJO DE FIN DE GRADO EN QUÍMICA
EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN ANALÍTICA DE
COMPUESTOS BIOACTIVOS EN CULTIVOS
BIOTECNOLÓGICOS
Diego González Iglesias
Julio, 2021
2
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
Cu so académico 2020/2021
La D a. Ma a Lo es Aguín y la D a. Ca men Ma ía Ga cía Ja es, P o eso as Ca ed á icas
del Depa amen o de Química Analí ica, Nu ición y B oma ología de la Facul ad de
Química de la Uni e sidad de San iago de Compos ela, in o man que el abajo i ulado:
“Ex acción y Ca ac e ización Analí ica de Compues os Bioac i os en
Cul i os Bio ecnológicos”
ue ealizado, bajo su di ección, como T abajo de Fin de G ado po Diego González
Iglesias.
Asdo.: Ma a Lo es Aguín Asdo.: Ca men Ma ía Ga cía Ja es
LORES
AGUIN
MARTA -
35450286H
Fi mado
digi almen e po
LORES AGUIN
MARTA -
35450286H
Fecha: 2021.07.05
13:06:17 +02'00'
Ca men
Ga cía
Ja es
Fi mado
digi almen e po
Ca men Ga cía
Ja es
Fecha: 2021.07.05
13:07:48 +02'00'
3
LISTADO DE ABREVIATURAS
Å
A ms ong (1x10-10 m)
DAD
Diode A ay De ec o (de ec o de ed de
diodos)
e al.
E alii (y o os)
g
G amo
GC
Gas Ch oma og aphy (c oma og a ía de
gases)
h
Ho a
HPLC
High Pe o mance Liquid
Ch oma og aphy (c oma og a ía de
líquidos de al a esolución)
kg
Kilog amo (1x103 g)
L
Li o
lx
Lux
M
Mola (mol/L)
mg
Milig amo (1x10-3 g)
min
Minu o
ml
Milili o (1x10-3 L)
mm
Milíme o (1x10-3 m)
mM
Milimola (1x10-3 M)
MS
Mass Spec ome y (Espec ome ía de
masas)
MSPD
Ma ix solid phase dispe sion (dispe sión
de ma iz en ase sólida)
µg
Mic og amo (1x10-6 g)
µL
Mic oli o (1x10-6 L)
µm
Mic óme o (1x10-6 m)
µV
Mic o ol ios (1x10-6 V)
nm
Nanóme o (1x10-9 m)
ppb
Pa es po billón (µg/L)
ppm
Pa es po millón (mg/L)
$
Dóla ame icano
4
ÍNDICE DE CONTENIDOS
RESUMEN .................................................................................................................. 7
1. Resumen ................................................................................................................ 7
2. Resumo ................................................................................................................. 7
3. Abs ac ................................................................................................................. 8
INTRODUCCIÓN ...................................................................................................... 9
1. Haema ococcus plu ialis ....................................................................................... 9
2. As axan ina.......................................................................................................... 11
3. Ácidos g asos ...................................................................................................... 14
4. Ex acción ........................................................................................................... 14
5. Ca ac e ización de los compues os ....................................................................... 15
5.1. HPLC-DAD .................................................................................................. 15
5.2. GC-MS ......................................................................................................... 16
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS .......................................................................... 17
PARTE EXPERIMENTAL ...................................................................................... 18
1. Ma e iales e ins umen ación ............................................................................... 18
2. Reac i os ............................................................................................................. 19
3. P epa ación de ec as de calib ado y disoluciones pa ón ..................................... 21
4. Mues as .............................................................................................................. 22
5. Ex acción ........................................................................................................... 23
6. Análisis espec o o omé ico ................................................................................ 25
6.1. Medición de ni a os ...................................................................................... 25
6.2. Medición de ca o enoides .............................................................................. 26
7. Análisis c oma og á ico ....................................................................................... 26
7.1. HPLC-DAD .................................................................................................. 26
7.2. GC-MS ......................................................................................................... 27
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ............................................................................... 29
1. Diseño expe imen al biológico............................................................................. 29
2. Compues os bioac i os ........................................................................................ 32
2.1. Análisis de ca o enoides ................................................................................ 33
2.2. Análisis de ácidos g asos ............................................................................... 39
CONCLUSIONES..................................................................................................... 44
1. Conclusiones ....................................................................................................... 44
2. Conclusións ......................................................................................................... 44
3. Conclusions ......................................................................................................... 45
BIBLIOGRAFÍA ...................................................................................................... 46
5
ÍNDICE DE FIGURAS
Figu a 1. Ciclo celula de Haema ococcus plu ialis. Tomado y modi icado de
Domínguez e al., 2006. .............................................................................................. 10
Figu a 2. Cu as de calib ado pa a los ca o enoides es udiados. ................................. 21
Figu a 3. Cu as de calib ado pa a los ácidos g asos es udiados. ................................ 22
Figu a 4. Fo obio eac o de 1 L con ase ege a i a. ................................................. 23
Figu a 5. Esquema de la ex acción ía mini-MSPD................................................... 24
Figu a 6. Espec o o óme o UV-Vis empleado en la medición de ni a o y ca o enoides
o ales. ........................................................................................................................ 25
Figu a 7. E olución de la ase de p oducción de biomasa de Haema ococcus plu ialis a
medida que se consumen los ni a os del medio. .......................................................... 25
Figu a 8. C oma óg a o de líquidos acoplado a de ec o de ed de diodos (HPLC-DAD)
empleado en el análisis de ca o enoides. ...................................................................... 26
Figu a 9. C oma óg a o de gases acoplado a espec óme o de masas (GC-MS)
empleado en el análisis de los ácidos g asos. ............................................................... 27
Figu a 10. Fo obio eac o es de 80 mL el úl imo día del expe imen o. ....................... 30
Figu a 11. Células de Haema ococcus plu ialis el úl imo día del expe imen o bajo
mic oscopio óp ico con un aumen o x1000 (x100 del obje i o y x10 del ocula ). En la
ila supe io , de izquie da a de echa: BI0, BIA y BIC. En la ila in e io , de izquie da a
de echa. ...................................................................................................................... 30
Figu a 12. E olución de los ca o enoides du an e los es úl imos días de la ase de
inducción (µg/mL). ..................................................................................................... 31
Figu a 13. Fases de inducción lle adas a análisis c oma og á ico. De izquie da a
de echa: BIA, BIC y AIC. ........................................................................................... 32
Figu a 14. Concen ación po cen ual ela i a a los p incipales ca o enoides p esen es en
Haema ococcus plu ialis a lo la go de las di e en es ases del p oceso. ....................... 33
Figu a 15. Células de AIC bajo mic oscopio óp ico con aumen o x1000 (x100 de
obje i o y x10 de ocula ). ............................................................................................ 36
Figu a 16. C oma og ama de ca o enoides ob enido pa a un ex ac o de AIC. ............ 36
Figu a 17. C oma og ama de ca o enoides ob enido pa a aplanóspo as ojas en el que
se mues an los és e es de as axan ina. Tomado y modi icado de Hol in e al., 2009. ... 37
Figu a 18. Supe posición de los espec os de abso ción de un ex ac o AIC ( osa) y el
pa ón (azul). A, isóme o de lu eína. B, C y D, és e es de as axan ina. ......................... 38
Figu a 19. C oma og ama de ácidos g asos ob enido pa a un ex ac o de AIC. ........... 39
Figu a 20. A, espec o de masas expe imen al pa a el ácido linoleico ob enido de un
ex ac o AIC. B, espec o de masas eó ico pa a el ácido linoleico............................... 40
Figu a 21. Visión compa ada de la concen ación de ácidos g asos, siendo AG ácidos
g asos y PS peso seco. ................................................................................................. 41

6
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Con enido en peso seco de Haema ococcus plu ialis en su es ado e de y en su
es ado ojo. ................................................................................................................. 12
Tabla 2. Pa ones de ca o enoides empleados. ............................................................ 19
Tabla 3. Pa ones de ácidos g asos empleados. ........................................................... 19
Tabla 4. Disol en es empleados. ................................................................................ 20
Tabla 5. Reac i os empleados. ................................................................................... 20
Tabla 6. Pa áme os u ilizados pa a la ex acción. ...................................................... 23
Tabla 7. E ique as de la ase de inducción. ................................................................. 29
Tabla 8. Concen ación de los p incipales ca o enoides p esen es en las di e en es ases
celula es de Haema ococcus plu ialis (mg/g). ............................................................. 35
Tabla 9. Iden i icación de los p incipales ca o enoides p esen es en un ex ac o AIC. . 37
Tabla 10. Iden i icación de los p incipales ácidos g asos pa a un ex ac o AIC. Valo es
en neg i a indican el ión de cuan i icación. Valo es en e pa én esis indican la abundancia
de cada ión. ................................................................................................................. 41
Tabla 11. Relación as axan ina/ácidos g asos pa a BIC y AIC (mg/mg). ..................... 42
7
RESUMEN
1. Resumen
Es e abajo o ece una isión compa ada del con enido en compues os bioac i os,
p esen es en la mic oalga Haema ococcus plu ialis a lo la go de di e en es ases de su
ciclo celula , desde su es ado ege a i o mó il, has a aplanóspo as cul i adas bajo
di e en es condiciones ambien ales de iluminancia y disponibilidad de CO2. Debido a la
du a pa ed celula de las aplanóspo as, se lle ó a cabo una écnica de ex acción ápida,
sencilla, económicamen e iable y espe uosa con el medio ambien e, que pe mi e una
ácil dis upción de las mues as, la dispe sión de ma iz en ase sólida, MSPD,
ob eniéndose unos ex ac os icos en ca o enoides y ácidos g asos. Median e la
ca ac e ización c oma og á ica de es os compues os se obse a una mayo acumulación
a medida que a anza el pe iodo de enquis amien o, la in ensidad luminosa y la
disponibilidad de CO2, siendo la concen ación de ca o enoides y ácidos g asos máxima
pa a aplanóspo as some idas a al a iluminancia y apo e de CO2 ex e no (8,8 y 14,3 mg/g,
espec i amen e) y mínima pa a la ase ege a i a (3,3 y 1,7 mg/g, espec i amen e).
2. Resumo
Es e aballo o ece unha isión compa ada do con ido en compos os bioac i os,
p esen es na mic oalga Haema ococcus plu ialis ao longo de di e en es ases do seu ciclo
celula , desde o seu es ado exe a i o móbil, a a aplanóspo as cul i adas baixo di e en es
condicións ambien ais de iluminancia e dispoñibilidade de CO2. Debido á du a pa ede
celula das aplanóspo as, le ouse a cabo unha écnica de ex acción ápida, sinxela,
economicamen e iable e espec uosa co medio ambien e, que pe mi e unha ácil
dis upción das mos as, a dispe sión de ma iz en ase sólida, MSPD, ob éndose uns
ex ac os icos en ca o enoides e ácidos g axos. Median e a ca ac e ización
c oma og á ica des es compos os obsé ase unha maio acumulación a medida que
a anza o pe íodo de enquis amien o, a in ensidade luminosa e a dispoñibilidade de CO2,
sendo a concen ación de ca o enoides e ácidos g axos máxima pa a aplanóspo as
some idas a al a iluminancia e achega de CO2 ex e no (8,8 e 14,3 mg/ g, espec i amen e)
e mínima pa a a ase exe a i a (3,3 e 1,7 mg/ g, espec i amen e).
8
3. Abs ac
This wo k p o ides a compa a i e iew o he con en o bioac i e compounds
p esen in he mic oalga Haema ococcus plu ialis h oughou di e en phases o i s cell
cycle, om i s mo ile ege a i e s a e o aplanospo es g own unde di e en
en i onmen al condi ions o illuminance and CO2 a ailabili y. Due o he ha d cell wall
o aplanospo es, a as , simple, economically iable and en i onmen ally iendly
ex ac ion echnique, which allows easy dis up ion o he samples, solid phase ma ix
dispe sion, MSPD, was used o ob ain ex ac s ich in ca o enoids and a y acids.
Ch oma og aphic cha ac e isa ion o hese compounds shows a g ea e accumula ion as
he encys a ion pe iod, ligh in ensi y and CO2 a ailabili y p og ess, wi h he
concen a ion o ca o enoids and a y acids being maximum o aplanospo es subjec ed
o high illuminance and ex e nal CO2 supply (8.8 and 14.3 mg/g, espec i ely) and
minimum o he ege a i e phase (3.3 and 1.7 mg/g, espec i ely).
9
INTRODUCCIÓN
Las mic oalgas son un g upo de di e sos mic oo ganismos que ealizan la
o osín esis oxigénica. Den o de es a clasi icación se encuen an algas mic oscópicas y
bac e ias que ealizan es e p oceso, como las cianobac e ias.
Una de las ca ac e ís icas más esal ables de es os mic oo ganismos es su
capacidad de adap ación al medio donde i en. De es a mane a, pueden c ece en
condiciones de al a y baja luminosidad, alcalinidad, salinidad, oxicidad y empe a u a
(Kobayashi e al., 1993; Tjahjono e al., 1994; Co de o e al., 1996; Sa ada e al., 2002).
Su pequeño amaño y ápida ep oducción, en compa ación con las algas plu icelula es,
pe mi en su cul i o en espacios educidos median e eac o es ubula es o es é icos, y
placas, c eando g anjas de mic oalgas de mode ado amaño con ele ada p oduc i idad
(Ledda e al., 2016).
La mayo ía de es os mic oo ganismos son o oau ó o os, po lo que pueden
emplea la luz sola pa a ob ene ene gía y ija CO2 pa a la biosín esis de moléculas
complejas. Así, es a bioquímica an di e sa, los con ie en en una ma e ia p ima muy
a ac i a pa a cualquie p oceso, siendo u ilizadas en la ac ualidad, p incipalmen e, en la
indus ia cosmé ica, alimen a ia y a macéu ica (Mula czyk e al., 2020). También exis en
mic oalgas he e ó o as que son capaces de asimila moléculas o gánicas, con
aplicaciones muy in e esan es como el a amien o de aguas esiduales (Casagli e al.,
2021).
Una de las especies de algas mic oscópicas más econocidas a ni el mundial es
Haema ococcus plu ialis, po se una de las mejo es uen es na u ales de un ca o enoide
de la amilia de las xan o ilas denominado as axan ina (Amba i e al., 2014).
1. Haema ococcus plu ialis
Haema ococcus plu ialis es un alga e de, unicelula que pe enece a la di isión
Chlo ophy a. Es una mic oalga de agua dulce que p esen a dos lagelos impulso es
del mismo amaño, isocon os, inse ados en la pa e pos e io de la célula,
opis ocon os. P esen a un ciclo celula complejo con dis in as o mas celula es,
cambiando de una a o a en unción de los ac o es del cul i o (Ellio , 1934). Se han
dis inguido es o mas, una e de, o alada y lagelada denominada célula ege a i a;
16
HPLC ha mos ado se una écnica e icien e en la sepa ación de ca o enoides y
és e es de ca o enoides (Winge a h e al., 1996). El acoplamien o HPLC-DAD se ha
aplicado con éxi o en la iden i icación de di e en es ca o enoides p esen es en u as
exó icas (Aze edo-Melei o & Rod iguez-Amaya, 2004); así como en la ca ac e ización
de los ca o enoides y és e es de as axan ina p esen es en aplanóspo as ojas de
Haema ococcus plu ialis (Hol in e al., 2009).
5.2. GC-MS
El acoplamien o de la c oma og a ía de gases a espec ome ía de masas es una
écnica analí ica ampliamen e u ilizada hoy en día g acias a que apo a di e en es en ajas
g acias a la mayo sensibilidad y especi icidad de usa espec ome ía de masas como
de ec o , pe mi iendo iden i ica picos no esuel os y de e mina es uc u as molecula es.
Es e acoplamien o aumen a la con ianza de los esul ados de los análisis cuali a i os y
cuan i a i os.
La c oma og a ía de gases es una écnica analí ica cuyo undamen o se basa en la
dis ibución de los compues os en e una ase es aciona ia sólida o líquida inmo ilizada
sob e la supe icie in e na de la columna c oma og á ica y una ase mó il gaseosa llamada
gas po ado , pa a pe mi i la sepa ación de los componen es de una mezcla.
El espec óme o de masas es á compues o po es elemen os undamen ales: una
uen e de ionización en la que la molécula se ioniza en al o acío o a p esión a mos é ica,
pa a gene a un conjun o de iones, un analizado de masas que ac úa a modo de il o
sepa ando los iones según su elación masa/ca ga (m/z) y un de ec o que es capaz de
iden i ica la p esencia e in ensidad de los iones. Así, se gene a un espec o de masas que
es único y ca ac e ís ico pa a cada molécula. El cuad upolo es uno de los analizado es
más empleados y es á o mado po cua o odillos pa alelos some idos a una co ien e
con inua y a un po encial de adio ecuencia cuya a iación modi ica la ayec o ia de los
iones pe mi iendo su sepa ación.

17
JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS
Es e abajo o ece una isión compa ada del con enido en compues os bioac i os
p esen es en la mic oalga de agua dulce Haema ococcus plu ialis a lo la go de di e en es
ases de su ciclo celula , desde su es ado ege a i o mó il, has a aplanóspo as cul i adas
bajo di e en es condiciones de iluminancia y disponibilidad de CO2.
De es a mane a, esul a in e esan e la ca ac e ización de los ex ac os de las
di e en es ases de Haema ococcus plu ialis y la cuan i icación de su con enido en
ca o enoides y ácidos g asos. Así, los obje i os especí icos que se p oponen son:
 Analiza , iden i ica y cuan i ica los ca o enoides p incipales p esen es en
cul i os de Haema ococcus plu ialis some idos a di e en es condiciones
de cul i o.
 Analiza , iden i ica y cuan i ica los ácidos g asos p incipales p esen es
en cul i os de Haema ococcus plu ialis some idos a di e en es
condiciones de cul i o.
Es o pe mi i á:
 Una mayo comp ensión del papel de la as axan ina du an e el pe iodo de
enquis amien o en Haema ococcus plu ialis.
 Es udia ases celula es de Haema ococcus plu ialis nunca in es igadas.
Pa a lo cual, se p ocede a:
 Emplea una écnica de ex acción den o de la Química Ve de que pe mi a
una ácil dis upción de las mues as, la MSPD.
 Ca ac e iza el con enido en ca o enoides median e el mé odo
c oma og á ico de HPLC-DAD.
 Ca ac e iza el con enido en ácidos g asos median e el mé odo
c oma og á ico de GC-MS.
18
PARTE EXPERIMENTAL
En es e apa ado se de alla án los ma e iales y mé odos empleados en la ob ención
de la mues a y ca ac e ización de es a, así como odo el p oceso desde la ob ención de la
ma e ia p ima has a el almacenamien o de los ex ac os.
1. Ma e iales e ins umen ación
 Mic opipe as de p ecisión de olúmenes en e 20-200 µL, 100-1000 µL y 1000-
5000 µL.
 Pun as de mic opipe as de p ecisión
 Pipe as Pas eu y pe as de succión de goma
 Ca uchos de mini-MSPD de 2,5 mL
 P obe as de 10 mL
 Viales de 1,8 y 5 mL ámba y iales de 10 mL anspa en es.
 Cápsulas y sep a pa a el sellado de los iales
 Encapsulado es y desencapsulado es
 Fil os PTFE 0,22 µm
 Mo e o de id io
 Espá ulas me álicas
 Sopo es y pinzas
 C onóme o
 Papel de aluminio
 Lana de id io
 Balanza analí ica
 Vó ex
 Espec o o óme o Ul a iole a-Visible
19
 C oma óg a o de líquidos con de ec o de diodos
 C oma óg a o de gases con espec óme o de masas
2. Reac i os
 Pa ones
Tabla 2. Pa ones de ca o enoides empleados.
Compues o
Núme o
CAS
Pu eza
% (g/g)
Ma ca
come cial
Es uc u a
As axan ina
472-61-7
98,1%
Biosyn h
Ca bosyn h
β-ca o eno
7235-40-7
99,7%
The moFishe
Can axan ina
514-78-3
95,2 %
D .
Eh ens o e
Lu eína
127-40-2
91,9%
Biopu i y
Zeaxan ina
144-68-3
97,8%
Biopu i y
Tabla 3. Pa ones de ácidos g asos empleados.
Compues o
Núme o
CAS
Pu eza
% (g/g)
Ma ca
come cial
Es uc u a
Ácido
linoleico
60-33-3
99,2%
Sigma-
Ald ich
Ácido
linolénico
463-40-1
98,5%
Sigma-
Ald ich
Ácido
oleico
112-80-1
99,6%
Sigma-
Ald ich
Ácido
palmí ico
57-10-3
99,9%
Fluo ochem
20
 Disol en es
Tabla 4. Disol en es empleados.
Compues o
Núme o
CAS
Pu eza
% (g/g)
Ma ca
come cial
Es uc u a
Ácido ó mico
64-18-6
≥99%
Scha lab
Agua
7732-18-5
≥99%
Scha lab
E anol
64-17-5
≥99%
Scha lab
Me anol
67-56-1
≥99%
Scha lab
Me il e -bu il é e
(MTBE)
1634-04-4
≥99%
Me ck
N,N-
dime il o mamida
(DMF)
68-12-2
≥99%
Pan eac
 Dispe san e: a ena 210-297 µm de amaño de po o (ma ca Sigma-Ald ich)
 Reac i os
Tabla 5. Reac i os empleados.
Reac i o
Núme o
CAS
Pu eza
% (g/g)
Ma ca
come cial
Es uc u a
Bu ilhid oxi olueno
(BHT)
128-37-0
99,9%
The moFishe
Hid óxido de
ime ilsul onio
(TMSH)
17287-03-5
≥99%
Sigma-
Ald ich
21
3. P epa ación de ec as de calib ado y disoluciones pa ón
Pa a elabo a las ec as de calib ado de los ca o enoides se p epa a on los
siguien es ni eles de concen ación: 0,5, 1, 5, 10 y 20 ppm, u ilizando como disol en e
DMF. Se ealizan es inyecciones de cada uno de ellos y se ep esen a la in ensidad
(abso bancia a λ en el ango 440-480 nm) ob enida en e a la concen ación ( igu a 2).
Figu a 2. Cu as de calib ado pa a los ca o enoides es udiados.
Pa a elabo a las ec as de calib ado de los ácidos g asos se p epa a on los
siguien es ni eles de concen ación: 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 y 10000
ppb, u ilizando MTBE como disol en e. Se ealizan dos inyecciones de cada uno de ellos

22
y se ep esen a el á ea de pico ob enida pa a un ión de cuan i icación seleccionado (SIM)
en e a la concen ación ( igu a 3).
Figu a 3. Cu as de calib ado pa a los ácidos g asos es udiados.
4. Mues as
En es e abajo se analiza on cul i os de Haema ococcus plu ialis cepa
CCMP34/7 de la colección del g upo AQUABIOTEC (GI-1209) del Cen o de
In es igaciones Biológicas de la Uni e sidad de San iago de Compos ela (CIBUS) en
di e en es ases de su ciclo celula .
La me odología de cul i o comenzó inoculando la mic oalga en dos
o obio eac o es de 1L con una densidad de 1x105 células/mL en medio óp imo pa a
Haema ococcus (MOH) con una concen ación inicial de ni ógeno de 4 mM. Los
o obio eac o es son bo ellas de id io con un apón que median e capila es in oduce
una co ien e de ai e y de CO2, pa a es a úl ima se ajus ó el lujo pa a man ene un pH
in e io a 7,8 y supe io a 7,0. Se man u o la p oducción de biomasa du an e ocho días
23
has a llega a una densidad de 1x106 células/mL, con ciclos ci cadianos de luz:oscu idad
(12h:12h) (Domínguez e al., 2019).
Figu a 4. Fo obio eac o de 1 L con ase ege a i a.
A con inuación, u o luga la ase de inducción, en la que el cul i o se di idió en
o obio eac o es de 80 mL some idos a di e en es condiciones de ai eación e
iluminación. Al inal de es e diseño biológico, se cen i uga on los cul i os y se eliminó
el agua pa a o ma una pas a que se i á como ma e ia p ima pa a lle a a cabo las
u u as ex acciones. Es as mues as se gua da on en congelado a -20 ºC p o egidas de
la luz pa a e i a la posible deg adación de sus compues os bioac i os.
5. Ex acción
Pa a lle a a cabo la ex acción de los ca o enoides y ácidos g asos de las
di e en es ases celula es de Haema ococcus plu ialis se empleó la me odología mini-
MSPD con je ingas de 2,5 mL, u ilizando los pa áme os óp imos es udiados
an e io men e po el g upo de in es igación pa a la mic oalga lio ilizada. Sin emba go,
es a op imización con emplaba una elación de masa de alga:dispe san e 1:4, pe o se u o
que ecu i a una elación 1:8 po que la mezcla quedaba muy ag egada debido a la
humedad de la pas a en compa ación con el alga lio ilizada. Los pa áme os de la
ex acción se esumen, a con inuación, en la abla 6.
Tabla 6. Pa áme os u ilizados pa a la ex acción.
Mues a
Dispe san e
Eluyen e
Tiempo
0,1 g
0,8 g
5 mL
20 min
Como agen e dispe san e se empleó a ena con amaño de po o 210-297 µm y
como eluyen e e anol g ado alimen a io. El p ocedimien o consis ió en pesa la masa de
24
la mic oalga y de la a ena sob e un mo e o de id io, sob e el que se ealiza la dis upción
du an e 5 minu os, ob eniéndose una mezcla homogénea. El in e io de la je inga se
ellenó con un poco de lana de id io y de a ena del mismo amaño de po o a modo de
il o, sob e la cual se añadió la mezcla dis up ada. A con inuación, se coloca un poco de
lana de id io sob e ella y se compac a pa a e i a caminos de p e e encia del eluyen e.
Finalmen e, se la a el mo e o con el e anol que se emplea á como disol en e y se p ocede
a ealiza la ex acción en oscu idad, con ayuda de una lámpa a oja, pa a e i a la
deg adación de los ca o enoides. Cada una de las ases se ex ae po iplicado. A
con inuación, se mues a un esquema de la écnica de ex acción ( igu a 5).
Figu a 5. Esquema de la ex acción ía mini-MSPD.
Pa a e i a la deg adación de los ex ac os se añaden 0,1 mL de una disolución de
BHT 11 g/mL sob e un olumen de 1 mL de cada ex ac o (Meléndez-Ma ínez e al.,
2006). Es a disolución se p epa a pesando 22 mg de BHT y se disuel en en 2 mL de
e anol g ado alimen a io. Los iales se gua dan en congelado a -20 ºC pa a el pos e io
análisis c oma og á ico.
25
6. Análisis espec o o omé ico
Pa a la medición de la concen ación de ni a o p esen e en el medio du an e la
ase de p oducción de biomasa de Haema ococcus plu ialis, así como pa a la medición
de los ca o enoides o ales du an e el pe iodo de enquis amien o bajo di e en es
condiciones de cul i o, se empleó un espec o o óme o The mo Scien i ic Helios Omega
UV-Vis (ul a iole a- isible). Po lo an o, los análisis mos ados en es e apa ado
u ie on luga an es de la ex acción mini-MSPD.
Figu a 6. Espec o o óme o UV-Vis empleado en la medición de ni a o y ca o enoides o ales.
6.1. Medición de ni a os
El seguimien o de la can idad de ni a os du an e la p oducción de biomasa se
ealizó dia iamen e siguiendo el mé odo espec o o omé ico de Collos e al. (1999) pa a
la longi ud de onda de 220 nm, y se mues a en la igu a 7:
Figu a 7. E olución de la ase de p oducción de biomasa de Haema ococcus plu ialis a medida que se
consumen los ni a os del medio.
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 2 3 4 5 6 7 8
[NO3-] (mM)
Células/mL (10-4)
Tiempo (días)
Biomasa Ni ógeno
32
Pa a lle a a cabo una cuan i icación igu osa de los di e en es ca o enoides
p esen es en los cul i os de Haema ococcus plu ialis se p ecisan écnicas
c oma og á icas. Pa a es e análisis se echaza on las condiciones ca en es de ai eación
(BI0 y AI0) debido a una ele ada mue e celula , y AIA po se la única condición en la
que se o ma on g umos gene ando p oblemas du an e su cul i o, además de
expe imen a ambién mue e celula . Po lo an o, de la ase de inducción solo se
ecogie on BIA, BIC y AIC po se las que de mayo in e és biológico. Pa a acondiciona
las mues as pa a los u u os análisis, se some ie on a cen i ugación y, pos e io men e,
se eliminó la mayo can idad de agua posible ob eniéndose una pas a que se gua dó en
congelado a -20 ºC. A con inuación, se mues an es as es condiciones p e iamen e al
acondicionamien o, obse ándose una cla a di e encia en su colo ( igu a 13).
Figu a 13. Fases de inducción lle adas a análisis c oma og á ico. De izquie da a de echa: BIA, BIC y AIC.
Además, ambién se ecogie on una ase ege a i a mó il (FM) an es de en a en
el pe iodo de enquis amien o, y una ase de palmella en los momen os iniciales de la ase
de inducción (PL) pa a obse a la e olución de la ca o enogénesis y de los ácidos g asos
du an e odo el p oceso de enquis amien o.
2. Compues os bioac i os
En es e apa ado se mues an los esul ados de los ensayos ealizados pa a la
de e minación de los ca o enoides y ácidos g asos p incipales, en los que se emplea on
un HPLC-DAD y un GC-MS, espec i amen e.

33
2.1. Análisis de ca o enoides
Los ca o enoides ep esen an la amilia de compues os bioac i os más es udiada
en Haema ococcus plu ialis. A su ez, los esul ados de los ensayos que abo dan el
análisis de los ac o es modi icado es de la concen ación de es os compues os en la
mic oalga son obje o de discusión. Así pues, en el siguien e esquema ( igu a 14) se
mues a la concen ación po cen ual de los p incipales ca o enoides (as axan ina, lu eína,
zeaxan ina y β-ca o eno) en las di e en es ases del diseño expe imen al.
Figu a 14. Concen ación po cen ual ela i a a los p incipales ca o enoides p esen es en Haema ococcus
plu ialis a lo la go de las di e en es ases del p oceso: ase mó il (FM), palmella (PL), baja in ensidad
lumínica en p esencia de ai e (BIA), baja in ensidad lumínica en p esencia de CO2 (BIC), y al a in ensidad
lumínica en p esencia de CO2 (AIC). Siendo AXT-EST as axan ina es e i icada.
34
En la igu a 14 se ep esen a la e olución de la concen ación po cen ual de los
ca o enoides p incipales desde el es ado ege a i o mó il, seguido po la ase in e media
de palmella, has a llega a las ases de inducción en donde se gene an las aplanóspo as.
La secuencia BIA  BIC  AIC mues a una ap oximación en la ase de inducción desde
BIA, que no es u o some ida a ningún es és que a o ecie a la sín esis de as axan ina;
siguiendo con BIC, some ida a un lujo de CO2 ex e no; has a llega a AIC, cul i ada bajo
un lujo de CO2 ex e no y al a in ensidad lumínica, es deci , bajo las condiciones óp imas
pa a la acumulación de as axan ina.
Así, espec o a las condiciones p e ias al pe iodo de enquis amien o, las ases FM
y PL, que se co esponden con la mic oalga en su es ado ege a i o y en ase de palmella,
espec i amen e, mues an pe iles simila es, ya que en palmella la ase es aciona ia se
encuen a en un es ado incipien e. Den o de los p incipales ca o enoides cuan i icados
en es as ases de la mic oalga esal a la espues a conjun a de los isóme os lu eína-
zeaxan ina. Es a cuan i icación se mues a de o ma conjun a debido a la simila a inidad
po pa e de es os compues os con la ase es aciona ia u ilizada, lo cual hace compleja su
sepa ación c oma og á ica. El β-ca o eno p esen a un pe il simila siendo escasamen e
mayo en el caso de FM. A su ez, en una meno p opo ción se de alla la espues a de un
isóme o de lu eína.
En cuen o a las ases de inducción, se obse a una cla a di e encia. BIA mues a
un pe il semejan e a las ases an e io es, pe o con una mayo p opo ción del apo e
lu eína-zeaxan ina en compa ación con el β-ca o eno. Sin emba go, la mayo di e encia
se e idencia en el comienzo de la sín esis de as axan ina debida al poco CO2 que pudo
cap a del ai e. En BIC se obse a como la p opo ción de lu eína-zeaxan ina a
disminuyendo, y comienza la sín esis y acumulación de as axan ina, sin emba go, no hay
g andes di e encias en e su o ma lib e y es e i icada. Finalmen e, AIC mues a el
aumen o e iden e de la sín esis de as axan ina, p esen ándose mayo i a iamen e en o ma
es e i icada. Al mismo iempo se obse a una disminución disc e a de la espues a
conjun a lu eína-zeaxan ina y β-ca o eno; y ambién la apa ición de la can axan ina, no
de ec ada en ninguna de las o as condiciones.
35
Tabla 8. Concen ación de los p incipales ca o enoides p esen es en las di e en es ases celula es de
Haema ococcus plu ialis (mg/g).
Compues o
FM
PL
BIA
BIC
AIC
I-Lu eína
0,15
0,26
0,35
0,41
0,29
Lu -Zea
1,90
2,17
2,20
2,46
1,95
B-ca o eno
1,25
1,27
0,79
2,08
2,19
As axan ina
n.d
n.d
0,01
0,07
0,31
Ax -Es
n.d
n.d
n.d
0,17
3,93
Can axan ina
n.d
n.d
n.d
n.d
0,13
TOTAL
3,30
3,70
3,34
5,19
8,79
En la abla 8 se obse a cómo a anza el p oceso de ca o enogénesis a medida que
Haema ococcus plu ialis en a en la ase es aciona ia, siendo cada ez mayo la
concen ación de ca o enoides has a llega al óp imo de sín esis y acumulación de
as axan ina, excep o pa a la ase BIA. Pa a es a condición hay una meno concen ación
o al de ca o enoides debido, p incipalmen e, a un p oceso de mue e celula ocu ido po
el aumen o del pH, ya que no es u o some ido a una co ien e de CO2 ex e na que pudie a
egula lo, ele ándose has a alo es de 9. Sin emba go, pa a el es o de las condiciones,
con pH con olado en el ango 7,0-7,8, se obse a cla amen e como la concen ación o al
de ca o enoides se inc emen a has a llega a un alo máximo en AIC.
En los p ocesos donde se induce la sín esis de as axan ina en Haema ococcus
plu ialis, las concen aciones de β-ca o eno mues an alo es mínimos (Shah e al.,
2016). Es o esul a con adic o io con lo aquí p esen ado en AIC. Es a di e encia puede
se debida a que la ase de inducción se de u o an es de que la mic oalga pudie a acumula
el máximo de as axan ina, quedando las células ojas odeadas de una co ona e de
( igu a 15), sugi iéndose que es e β-ca o eno acaba ía con i iéndose en as axan ina a
a és de una de e minada u a sin é ica. Los e ec os de de ene la ase de inducción
p ema u amen e ambién se pueden e e lejados en la can idad po cen ual de
as axan ina es e i icada espec o a la o al (lib e y es e i icada), que es del 92,6%, en e
al 95% que se puede encon a en la bibliog a ía (Chen e al., 2014). Es o es lógico, ya
que se obse a un inc emen o de la concen ación de as axan ina es e i icada a medida
que el sis ema se ace ca a las condiciones óp imas pa a su acumulación, po lo que de ene
el p oceso p ema u amen e apo a ía alo es in e io es.
36
Figu a 15. Células de AIC bajo mic oscopio óp ico con aumen o x1000 (x100 de obje i o y x10
de ocula ).
A con inuación, en la igu a 16, se mues a un c oma og ama ob enido pa a el
ex ac o AIC, po se la ase más ep esen a i a, ya que apa ecen odos los ca o enoides
analizados en mayo concen ación, mien as que en la igu a 17 se mues a un
c oma og ama ob enido pa a aplanóspo as ojas que mues a los és e es de as axan ina
p incipales (Hol in e al., 2009).
Figu a 16. C oma og ama de ca o enoides ob enido pa a un ex ac o de AIC.
37
Figu a 17. C oma og ama de ca o enoides ob enido pa a aplanóspo as ojas en el que se mues an los
és e es de as axan ina. Tomado y modi icado de Hol in e al., 2009.
El c oma og ama ob enido pa a AIC p esen a los mismos pe iles de ca o enoides
y és e es de as axan ina que se ob u ie on en in es igaciones an e io es empleando
ambién un HPLC-DAD (Hol in e al., 2009). A con inuación, en la abla 9, se mues a la
iden i icación de los p incipales ca o enoides iden i icados.
Tabla 9. Iden i icación de los p incipales ca o enoides p esen es en un ex ac o AIC.
Compues o
mues a
(min)
pa ones
(min)
Coe icien e de
co elación,
R2
λ (nm)
As axan ina
11,373
11,377
0,956
476
Can axan ina
13,343
13,313
0,990
476
Lu eína
12,487
12,470
0,9995
440
Zeaxan ina
12,487
12,530
0,978
440
B-ca o eno
22,330
22,063
0,996
450

38
Como se puede de alla en la abla 9, los alo es de los iempos de e ención de
los pa ones de los isóme os lu eína y zeaxan ina mues an una di e encia de an solo 0,06
minu os. Es a pequeña di e encia hace compleja su iden i icación indi idual en la ma iz
analizada. Di e sos abajos se han en ocado en la sepa ación de es os isóme os
empleando columnas c oma og á icas de C30, equi iendo al os iempos de análisis y
g andes olúmenes de disol en e, lo cual uel e compleja su implemen ación (Schla e e
e al., 2006). Es a azón, aunada a que se espe a una espues a análoga de los isóme os
en la mic oalga, hace que se decida abaja con su espues a conjun a, siendo dicha
cuan i icación conjun a su icien e pa a el obje i o del abajo.
Pa a jus i ica la iden i icación del isóme o de la lu eína y de los es és e es de
as axan ina que se pudie on cuan i ica , se ecu e a la semejanza isual y a los
coe icien es de co elación pa a los espec os de abso ción ob enidos pa a dichos
compues os, al y como se mues a, a con inuación, en la igu a 18.
Figu a 18. Supe posición de los espec os de abso ción de un ex ac o AIC ( osa) y el pa ón (azul). A,
isóme o de lu eína. B, C y D, és e es de as axan ina.
El isóme o de la lu eína se compo a en las dis in as ases del diseño biológico de
mane a semejan e a la lu eína, aunque su iempo de e ención es 2 minu os meno y el
coe icien e de co elación en e espec os es mode ado (R2 = 0,917), lo que indica una
39
es uc u a isomé ica más pola . De odos modos, no puede desca a se po comple o que
no sea un isóme o de la lu eína, sino o o ca o enoide. En cuan o a los és e es de
as axan ina, p esen an una ele ada conco dancia isual y los coe icien es de co elación
son al os, >0,998, y, además, el pe il de es os compues os es semejan e al que se puede
encon a en la bibliog a ía (Ranga e al., 2009).
Debido al inc emen o en la can idad de as axan ina es e i icada con ácidos g asos
en AIC, así como pa a o ece una isión con as ada de los p incipales ácidos g asos en
las di e en es ases del diseño biológico, esul a in e esan e y necesa io su es udio.
2.2. Análisis de ácidos g asos
El con enido lipído en aplanóspo as de Haema ococcus plu ialis puede llega a
supone has a el 35% en peso seco (Bu le e al., 2017), el cual, al igual que los
ca o enoides, se e in luenciado po los di e sos es ados que p esen a la mic oalga. De
es a mane a, se p ocede a ca ac e iza los ex ac os as su de i a ización, mos ándose
un c oma og ama modelo (Figu a 19) en donde se pueden ap ecia la mayo
concen ación de ca o enoides, así como los espec os de masas expe imen al y eó ico
pa a uno de los ácidos g asos iden i icados ( igu as 20A y 20B, espec i amen e).
Figu a 19. C oma og ama de ácidos g asos ob enido pa a un ex ac o de AIC.
40
Figu a 20. A, espec o de masas expe imen al pa a el ácido linoleico ob enido de un ex ac o AIC. B,
espec o de masas eó ico pa a el ácido linoleico.
En el mé odo de análisis po GC-MS, se de e mina on el lími e de de ección
ins umen al (LDI), el lími e de de ección (LOD) y el lími e de cuan i icación (LOQ) pa a
los p incipales ácidos g asos. El LDI es la mínima can idad de anali o que es capaz de
de ec a el equipo, independien emen e de las mues as que se u ilicen, pa a su
de e minación se emplea un ni el de concen ación del calib ado. Po de inición, es la
concen ación de compues o p esen e en el calib ado con una elación señal/ uido = 3
(S/R = 3), calculada en al u a en es e caso. El LOD es la can idad mínima de anali o
p esen e en la mues a que se puede de ec a , y se calcula como aquella concen ación de
compues o p esen e en la mues a con una elación S/R = 3. El LOQ es la can idad mínima
de anali o p esen e en la mues a que el equipo puede cuan i ica , y se calcula como
aquella concen ación que iene una elación S/R = 10. Los esul ados se mues an en la
abla 10, jun o a la elación masa/ca ga (m/z) y el iempo de e ención ( ).
41
Tabla 10. Iden i icación de los p incipales ácidos g asos pa a un ex ac o AIC. Valo es en neg i a indican
el ión de cuan i icación. Valo es en e pa én esis indican la abundancia de cada ión.
(min)
Ácido g aso
m/z
LDI
(ppb)
LOD
(ppb)
LOQ
(ppb)
13,812
Ácido palmí ico
74 (100), 87 (73),
43(25), 55(21)
7
13
42
15,485
Ácido linoleico
81 (100), 67 (114),
95 (70), 294 (3,0)
21
61
204
15,544
Ácido linolénico
79 (100), 95 (51),
108 (31), 292 (0,9)
23
52
173
15,544
Ácido oleico
55 (100), 74 (25),
83 (21), 264 (1,6)
37
67
222
A con inuación, en la igu a 20, se o ece una isión compa ada de los ácidos
g asos p incipales encon ados en las di e en es ases del ciclo celula de
Haema occoccus plu ialis:
Figu a 21. Visión compa ada de la concen ación de ácidos g asos, siendo AG ácidos g asos y PS peso
seco.
En es a g á ica se obse a como los p incipales ácidos g asos, de las amilias
omega-3 (ácido linolénico), omega-6 (ácido linoleico) y omega-9 (ácido oleico), y el
ácido palmí ico, se encuen an más concen ados en las ases de inducción que en las
ases p e ias al pe iodo de enquis amien o, e idenciando la sín esis de sus ancias de
0
1
2
3
4
5
6
Ácido oleico Ácido linoleico Ácido linolénico Ácido palmí ico
mg AG/mg PS
FM PL BIA BIC AIC
48
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