Desarrollo de nuevas técnicas para el análisis genético en fibrosis quística : aplicación al cribado neonatal

Pablo Raña Díez
TESIS
DOCTORAL
2008
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO
EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
Pablo Raña Díez
San iago de Compos ela
Ins i u o de Medicina Legal
Facul ad de Medicina y Odon ología
Uni e sidad de San iago de Compos ela
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL
ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA:
APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
INSTITUTO DE MEDICINA LEGAL
FACULTAD DE MEDICINA Y ODONTOLOGÍA
UNIVERSIDAD DE SANTIAGO DE COMPOSTELA
“DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL
ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA:
APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL”
Memo ia que p esen a, pa a op a al g ado de doc o ,
Pablo Raña Díez
En San iago de Compos ela, junio de 2008.
El Doc o D. Ángel Ca acedo Ál a ez, Ca ed á ico de Medicina
Legal de la Facul ad de Medicina de la Uni e sidad de San iago de
Compos ela y el Doc o D. F ancisco Ba os Anguei a,
CERTIFICAN:
Que la p esen e memo ia que lle a po í ulo “DESARROLLO DE
NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA:
APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL”, del licenciado en Fa macia po la
Uni e sidad de San iago de Compos ela Pablo Raña Díez, ha sido
ealizada bajo nues a di ección, conside ándolo en condiciones pa a op a
al G ado de Doc o y au o izándolo pa a su p esen ación an e el T ibunal
co espondien e.
Y pa a que así cons e, expedimos el p esen e ce i icado en San iago
de Compos ela, a 13 de junio de 2008.
Fdo.: P o .D . Ángel Ca acedo Ál a ez Fdo: D . F ancisco Ba os Anguei a
Fdo: Pablo Raña Díez

Exsilium hominis igno an ia, pa ia es sapien ia. De hoc
exsilio ad pa iam ia es scien ia.
(El exilio del homb e es la igno ancia, su pa ia es la sabidu ía. De
ese exilio a la pa ia el camino es la ciencia).
HONORIO DE AUTUN (Siglo XII), De animae exsilio e pa ia (Sob e el
exilio y la pa ia del alma).
AGRADECIMIENTOS
Pone se a pensa en odas aquellas pe sonas a las que uno debe
es a ag adecido du an e odos es os años me ha esul ado una a ea muy
g a a ya que me he dado cuen a de la in inidad de elaciones humanas que
han su gido du an e la ealización de es a pequeña odisea que ha sido mi
Tesis Doc o al.
- En p ime luga comenza é los ag adecimien os, como no, po la
Unidad de Medicina Molecula , mi o a casa du an e odos es os años. Como
no se me ocu e un o den lógico de ag adecimien os, lle a é uno absu do
de mane a que i é nomb ando a la gen e siguiendo el o den de en ada po
el pasillo de la Unidad. Mis ag adecimien os:
A Ana Éza a, la o ganización pe soni icada, po su ayuda y consejos
pa a lidia con la, po desg acia ecuen e, bu oc acia que odea al beca io
in es igado y que an impo an e esul a pa a pode segui adelan e.
A Ana Vega y Cla a Ruiz, po su a o amable y su disposición pa a
esol e me cualquie duda o p oblema que me su gía.
A Celsa Quin ei o, la D a Quinn, po su sen ido del humo y po ese
oque de sa casmo que apo a an necesa io pa a despe a de la, en
ocasiones, sopo í e a u ina del labo a o io.
A las écnico cum laude del labo a o io (Rocío, Ma ga y Lucía) a las
que no había mues a que se les esis ie a pa a ob ene ADN. Espe o que
algún día me dejéis de ene miedo cuando en o po la pue a con nue as
manchas.
A la nue a ho nada de écnicos (Bego, Ma ía, Olga…), po hace me
siemp e un hueco en los u nos de e mociclado en esos días de mues as
u gen es.
A las nue as inco po aciones de doc o andings (Ca la, Ma cos,
Billy…), po ese ai e esco an necesa io que apo an al abajo en el
labo a o io.
A la cuchipandi del Nesquik (Ana Blanco, Nu ia Gómez, Ce es…), po
aguan a mis iloso adas y mis chis es malos du an e an os y an os días
sin i a me el ca é a la ca a.
A los compañe os con los que comencé la Tesis (I án, Tono y Sil ia)
con los que he compa ido mis inquedanzas en an as ocasiones. Espe o,
pa a los que ya no es áis, que os aya bien con ues os nue os umbos.
A Alejand o Ges ei a, mi g an maes o de la in o má ica (en e o as
cosas) du an e odos es os años. G acias po es a siemp e ahí pa a
esponde me a cualquie duda con ese sosiego y amabilidad de los que
muchos debe ían ap ende .
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
IV.3.3.- RESULTADOS GLOBALES DE CRIBADO EN PERÍODO
2003-2007 .............................................................................................. 130
IV.3.3.1.- DESCRIPCIÓN DE CASOS DIAGNOSTICADOS CON
FIBROSIS QUÍSTICA MEDIANTE EL PROGRAMA
PILOTO DE CRIBADO .................................................................... 135
IV.4.- APÉNDICE .............................................................. 145
IV.4.1.- ESTUDIO MUTACIONAL DE PACIENTES GALLEGOS CON
FIBROSIS QUÍSTICA .......................................................................... 145
IV.4.1.- PUBLICACIÓN .................................................................................... 151
CONCLUSIONES
V.1.- CONCLUSIONES ....................................................... 159
ANEXOS
ANEXO I.- PRIMERS DE AMPLIFICACIÓN Y EXTENSIÓN EN
CHIP-CFTR VERSIÓN 2006. ........................................................ 163
ANEXO II.- PRIMERS DE AMPLIFICACIÓN Y EXTENSIÓN EN
CHIP-CFTR VERSIÓN 2007. ........................................................ 165
ANEXO III.- EVOLUCIÓN EN LA COBERTURA DE LOS CHIPS.............. 169
BIBLIOGRAFÍA
VII.1.- BIBLIOGRAFÍA ..................................................... 177

ABREVIATURAS
ABREVIATURAS
µL Mic oli os
µM Mic omola
AAT α1-an i ipsina
ABC ATP-binding-casse e
ACE Angio ensin 1 con e ing enzyme
ACMG Ame ican College o Medical Gene ics
ACOG Ame ican College o Obs e icians and Gynecologis s
ADN Ácido desoxi ibonucleico
ADNc Ácido desoxi ibonucleico copia
Agua MQ Agua milli-Q
AMPc Adenosín mono os a o-3',5' cíclico
ATB0 Neu al amino acid anspo e B0
ATP Adenosín i os a o
bp Base pai s (pa es de bases)
CBAVD Congeni al bila e al absence o he as de e ens
CDC Cen e o disease con ol and p e en ion
CeGen Cen o Nacional de Geno ipado
CF Cys ic Fib osis
CFGAC Cys ic Fib osis Gene ic Analysis Conso ium
CFTR Cys ic Fib osis T ansmeb ane Conduc ance Regula o
CHUS Complejo Hospi ala io Uni e si a io de San iago de Compos ela
CLC-2 Chlo ide channel-2
cms Cen íme os
D Doc o
dNTP Dinucleó idos i os a o
EDTA E ilendiamino e aace a o
ENaC Epi helial Sodium Channel
FQ Fib osis Quís ica
GST M1 Glu ha ion- S- ans e ase M1
GST M3 Glu ha ion- S- ans e ase M3
GST P1 Glu ha ion- S- ans e ase P1
HFE Pu a i e he edi a y hemoch oma osis gene
HGMD Human Genome Mu a ion Da abase
HLA-II Human leukocy e an igen gene II
hME Homogenous Mass Ex ension
IP Insu iciencia panc eá ica
IRT Immuno eac i e ypsinogen
Kb Kilobase
KDa Kilodal on
M Mola
MALDI-TOF Ma ix Assis ed Lase Deso p ion/Ioniza ion-Mass Spec ome y
MBL Mannose-binding lec in
MDR Mul id ug esis ance
mEq/L Miliequi alen es/li o
min Minu os
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mM Milimola
mRNA Ácido ibonucleico mensaje o
NBD Nucleo ide binding domain
N.D. No disponible
ng/mL Nanog amos/milili o
NHE3 Sodium-hyd ogen exchange iso o m 3
NOS1 Ni ic oxide syn hase- 1
NOS3 Ni ic oxide syn hase- 3
ºC G ados cen íg ados
OMIM Online Mendelian Inhe i ance in Man
ORCC Ou wa dly ec i ying chlo ide channel
PAP P o eína asociada a panc ea i is
PCR Polime ase Chain Reac ion
ROMK Renal ou e -medulla y po assium channel
pm Re oluciones po minu o
s Re e ence SNP iden i ica ion
SAP Sh imp Alkaline Phospha ase
SDS Dodecilsul a o sódico
seg Segundos
SNP Single Nucleo ide Polymo phism
SP Su iciencia panc eá ica
Taq The mus acua icus
TGF β1 T ans o ming g ow h ac o -β1
TIR T ipsinógeno inmuno eac i o
TMD T ansmemb ane domain
TNF-α Tumo nec osis ac o -α
TNF-α Tumo nec osis ac o -α
TRPV4 T ansien ecep o po en ial anilloid 4
U Unidades de ac i idad enzimá ica
UV Ul a iole a
β2AR β2 ad eno ecep o
INTRODUCCIÓN
INTRODUCCIÓN
19
I.1.- INTRODUCCIÓN
La ib osis quís ica (FQ) es una de las en e medades au osómicas
ecesi as g a es más ecuen es en la población Caucásica. Su incidencia se
si úa en o no a 1 de cada 2500 nacidos. Son ca ac e ís icas comunes de
es a en e medad la pa ología espi a o ia obs uc i a, la insu iciencia
panc eá ica, los p oblemas nu icionales y los p oblemas ep oduc i os.
Su diagnós ico se basa p incipalmen e en la de ección de ni eles al os
de clo o en sudo y en la iden i icación de mu aciones en el gen CFTR
(Cys ic Fib osis T ansmemb ane Conduc ance Regula o ).
El gen causan e de la ib osis quís ica, gen CFTR, ue iden i icado
median e clonaje posicional en el año 1989 (Rio dan JR e al), ubicándose
en el b azo la go del c omosoma 7. El gen es á o mado po 27 exones con
un amaño de 250 kb que dan luga a un mRNA de 6500 bp. El gen CFTR
codi ica pa a una p o eína de 1480 aminoácidos, con un peso molecula de
168kDa. La unción p incipal de es a p o eína es la de ac ua como canal de
clo o es imulado po el AMPc (Cheng SH e al, 1991; Ande son MP e al,
1991A; Ande son MP, 1991B). Las células epi eliales de los pacien es con
FQ ienen un anspo e ano mal de sodio y clo o.
La mu ación más impo an e en el gen CFTR (∆F508) se co esponde
con una deleción de 3 pa es de bases que da luga a la pé dida de la
enilalanina en la posición 508 del gen (exón 10). Es a mu ación se ha
iden i icado en ap oximadamen e el 70% de los alelos de pacien es con FQ
a ni el mundial (Cys ic Fib osis Analysis Conso i um, 1990). Ac ualmen e se
encuen an iden i icadas más de 1400 mu aciones que causan FQ (HGMD®-
BIOBASE).
Du an e los úl imos años se ha p oducido una impo an e mejo a en
la calidad y espe anza de ida de los pacien es con FQ (Ke em E e al,
1992). Las úl imas es imaciones indican una espe anza de ida p óxima a
los 40 años pa a un niño con FQ nacido en los años 90 (Elbo n JS e al,

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
20
1991). Los p incipales ac o es que han con ibuido a ello han sido la mejo a
en los a amien os an ibió icos, la isio e apia espi a o ia, el asplan e
pulmona y una mejo o ganización asis encial en cen os médicos.
-EVOLUCIÓN DE LA ESPERANZA DE VIDA EN FIBROSIS QUÍSTICA.
INTRODUCCIÓN
21
I.2.- ANTECEDENTES HISTÓRICOS
Mucho an es de que la FQ ue a econocida po la medicina cien í ica
de la época, se conocía ya en los medios popula es de algunas egiones del
Cen o y No e de Eu opa, en donde se elacionaba el sudo salado de los
bebés con su mue e p ema u a.
En elación a es e sabo salado, se ecoge en un manusc i o alemán
del siglo XV, el Codex La inus Monacensis 849 (ac ualmen e en la biblio eca
es a al de Ba ie a), la bendición Wide Elbe con a las en e medades de los
niños encan ados. Dicha bendición ecomendaba lame la na iz del niño
encan ado pa a comp oba si és a enía un sabo salado. Es la p ime a
documen ación esc i a que elacionaba el sabo salado con una posible
en e medad.
Ap oximadamen e cien años más a de (1606) apa ece una
desc ipción elacionada con el encan amien o de los niños y el sabo salado
en la li e a u a médica de nues o Siglo de O o; el D Juan Alonso y de los
Ruyzes de Fon echa, p o eso de Medicina de la Uni e sidad de Alcalá, en su
lib o Diez p i ilegios pa a muje es p eñadas dice: … conoce a la gen e
emb ujada, si al asca les en la en e, uno después no a un sabo salado
en los dedos ….
P obablemen e la p ime a desc ipción his opa ológica de la FQ se
debe a Pie e Paaw (Holanda) que en 1595 ealizó la au opsia a una niña de
11 años que se suponía es aba hechizada, concluyendo que la causa de la
mue e había sido en ealidad un p oblema panc eá ico.
Una de las p ime as his o ias clínicas de la en e medad ue elabo ada
po Geo g Sege (Polonia) que desc ibió en 1673 a una niña de 3 años cuya
au opsia e eló un pánc eas endu ecido y ci oso as habe obse ado
sín omas de ieb e, ómi os, dia ea, di icul ades pa a gana peso e
inanición p olongada. En 1677 Ge a dus Blasisus (Holanda) obse a un
pánc eas ci oso en un niño allecido a los nue e años. En el siglo XVIII el
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
22
pedia a sueco Nils Rosen on Rosens ein (Uppsala) desc ibe en su lib o
sob e en e medades in an iles una en e medad a la que denominó luxus
coeliasus y que cu saba con dia ea, dis o ia, debilidad y pánc eas
endu ecido. P obablemen e se a aba de en e mos con FQ.
En 1838 el ienés Ca l on Roki ansky (Aus ia), as una au opsia
ealizada a un e o humano que había nacido en el sép imo mes de
emba azo sin da señales de ida, descub ió lo que debía se un íleo
meconial (obs ucción in es inal o al o pa cial de la luz del ac o
gas oin es inal). Alois Bedna , ambién en Viena, desc ibe en 1850 un caso
simila de un ecién nacido i o que había mue o al sex o día de ida. Más
o menos coinciden es en el iempo se desc iben y publican cuad os
semejan es en Ingla e a.
En 1936 Guido Fanconi (Suiza) es ablece una elación en e la
a ec ación panc eá ica y las b onquiec asias como elemen os ca ac e ís icos
de la FQ (Fanconi G e al, 1936) aunque el é mino ib osis quís ica (del
pánc eas) no apa ece has a 1938 cuando la pa óloga es adounidense
Do o hy H. Ande son en au opsias de lac an es y niños da una desc ipción
comp ensible de los sín omas de la FQ y de daños en ó ganos que siemp e
incluían la des ucción del pánc eas y ecuen emen e in ección y daño en el
pa énquima pulmona (Ande son DH e al, 1938).
En el año 1943, Fa be ue quien, al pa ece , acuña el é mino de
muco iscidosis pa a e e i se a la pa ología que nos ocupa, en la que los
sis emas duc ales de los ó ganos a ec ados acababan gene almen e siendo
ocluídos po sec eciones inusualmen e espesas (Fa be D e al, 1944).
Hacia 1946 los es udios de los pacien es comenza on a e ela in o mación
sob e las bases gené icas de la FQ. Después de examina el pa ón de
he encia en las amilias Ande son y Hodges deduje on que se a aba de
una condición ecesi a, p obablemen e causada po una mu ación en un
único gen (monogénica) (Ande son DH y Hodges RG, 1946).
En 1953, as una ola de calo en Nue a Yo k, Paul A. Di San ’Agnese
obse a la excesi a pé dida de sal en el sudo en los pacien es con FQ (Di
INTRODUCCIÓN
23
San ’Agnese PA e al, 1953). Es a obse ación se i ía pa a desa olla un
es clásico en el diagnós ico de la FQ, la medición del con enido de clo u o
en el sudo po es imulación median e ion o o esis de piloca pina (Gibson LE
y Cooke RE, 1959).
El pa ón de he encia au osómico ecesi o de la FQ ue
de ini i amen e indicado po Allen en 1956 (Allen F J . e al, 1956) y
con i mado po Conneally en 1973 (Conneally PM e al, 1973).
La p ime a e e encia a la FQ ecogida en Anales Españoles de
Pedia ía la encon amos en una con e encia celeb ada el 15 de eb e o de
1969 en el Colegio de Médicos de Palma de Mallo ca con el ema
Muco iscidosis.
En los años 80 los cien í icos descub en que el mal uncionamien o de
los ejidos epi eliales (impe meabilidad al ion clo u o) e a un de ec o común
a odos los ó ganos a ec ados po la FQ (Knowles M e al, 1981; Quin on PM
e al, 1983).
En 1985 se localiza el gen en el c omosoma 7 y a inales de es a
misma década se iden i ica de ini i amen e el gen CFTR median e clonaje
posicional po pa e de Lap-Chee Tsui y John Rio dan jun o con F ancis S.
Collins y colabo ado es (Rio dan JR e al, 1989; Rommens JM e al, 1989;
Ke em B e al, 1989).
FUENTE: www. ib osis.o g/comunica/cong eso/a icles/M_his o.h m.
Fecha de acceso mayo 2008 (Pé ez F ías J e al).
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
30
ame icana Ve ex Pha maceu icals que ha mos ado buenos esul ados pa a
los pacien es con la mu ación G551D. Po o o lado g upos de in es igación
como el de Alan Ve kman lle an años desa ollando nume osas moléculas
sin que oda ía hayan llegado al uso en clínica (Ve kman A, 2008).
O as opciones como la e apia in acelula y la e apia génica es án
ambién en ase de in es igación. La FQ es un p ime candida o a la e apia
génica po su ela i a accesibilidad a los ó ganos diana c uciales, es deci ,
los pulmones. Es udios de ans e encia génica lle ados a cabo u ilizando
adeno i us y complejos ADNc-FQ liposomales han log ado la es au ación
de clo u o en los a ones FQ ansgénicos. Va ios ensayos clínicos han sido
ealizados en pequeños g upos olun a ios de pacien es con FQ. Aunque
exis e e idencia expe imen al de la exp esión de CFTR en los pacien es con
FQ a ados, ha sido gene almen e ansi o ia y exis en a ias desc ipciones
de eacciones in lama o ias, especialmen e cuando se u ilizan adeno i us
como ec o es. A pesa de los p oblemas encon ados inicialmen e, exis e
un no able op imismo de que se desa olla á una e apia génica e ec i a
pa a la FQ en los p óximos años (Pa sons DW e al, 2005).
I.5.- DIAGNÓSTICO
I.5.1.- DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Has a hace poco iempo, el diagnós ico de la ib osis quís ica se había
basado en c i e ios clínicos de inidos de alladamen e y el análisis de los
ni eles de clo u o en sudo (Da is PB e al, 1996). La disponibilidad desde
los años 90 del análisis mu acional del locus del gen esponsable de la
en e medad (Cys ic Fib osis Gene ic Analysis Conso ium-CFGAC, 1994) y la
alo ación de las p opiedades bioeléc icas del epi elio espi a o io median e
la medida de la di e encia de po encial nasal ansepi elial (Knowles MR e
al, 1995) han aumen ado el espec o clínico de la FQ al inclui a indi iduos
con p esen aciones a ípicas y menos se e as de la en e medad.

INTRODUCCIÓN
31
Pa a o ien a en el diagnós ico de es e as o no gené ico, un g upo
de expe os clínicos y gene is as en el año 1997 se eunió a a és de la
Cys ic Fib osis Founda ion pa a consensua c i e ios pa a el diagnós ico de
la en e medad (Rosens ein BJ y Cu ing GR, 1998). Así, concluye on que el
c i e io diagnós ico pa a la FQ debe ía inclui la p esencia de una o más
ca ac e ís icas eno ípicas, una his o ia de FQ en un he mano o un esul ado
posi i o en un es de c ibado neona al (además de e idencia en labo a o io
de una ano malidad en CFTR documen ada po una ele ada concen ación
de clo u o en sudo , la iden i icación de mu aciones en los alelos del gen
CFTR o ano malidades en el aspo e de iones en el epi elio nasal).
CRITERIOS DIAGNÓSTICOS DE LA FIBROSIS QUÍSTICA
- Uno o más asgos eno ípicos ca ac e ís icos.
- His o ia de ib osis quís ica en he mano o p imo he mano.
- C ibado neona al posi i o.
E idencia de dis unción en CFTR demos ada po :
- Concen ación de clo u o en sudo ele ada en dos o más ocasiones.
- Iden i icación de dos mu aciones causan es de la en e medad.
- Di e encia de po encial nasal ano mal.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
32
CARACTERÍSTICAS FENOTÍPICAS PARA EL DIAGNÓSTICO DE FQ
- En e medad c ónica sinopulmona mani es ada po :
a) Colonización o in ección pe sis en e con pa ógenos ípicos de FQ, incluyendo
S aphylococcus au eus, Haemophilus in luenzae, Pseudomonas ae uginosa y
Bu kholde ia cepacia.
b) Tos c ónica y p oducción de espu o.
c) Ano malidades pe sis en es en adiog a ía o ácica (b onquiec asias, a elec asias…).
d) Obs ucción de las ías aé eas mani es ada en di icul ad espi a o ia o sibilancias.
e) Poliposis nasal; ano malidades adiog á icas o de omog a ía compu e izada de los
senos pa anasales.
) Dedos en palillo de ambo .
- P oblemas gas oin es inales y nu icionales incluyendo:
a) In es inales: íleo meconial, sínd ome de obs ucción in es inal dis al, p olapso ec al.
b) Panc eá icos: insu iciencia panc eá ica, panc ea i is ecu en e.
c) Hepá icos: en e medad hepá ica c ónica mani es ada po e idencia clínica o
his ológica de ci osis bilia ocal o ci osis mul ilobula .
d) Nu icionales: p oblemas de c ecimien o (malnu ición p o eico-caló ica),
hipop o einemia y edema, complicaciones secunda ias a la de iciencia de i aminas
liposolubles.
- Sínd omes de al a de sal: pé dida aguda de sal, alcalosis me abólica c ónica.
- Ano malidades u ogeni ales masculinas esul an es en azoospe mia obs uc i a
(CBAVD).
INTRODUCCIÓN
33
TEST DEL SUDOR
El es del sudo (S e n RC, 1997) sigue siendo el es de labo a o io
más u ilizado pa a con i ma la FQ. El es se basa en la ecogida de sudo
median e ion o o esis po piloca pina con la de e minación química de la
concen ación de los clo u os. Po lo gene al, un ni el de clo u os en el
sudo de más de 70 mEq/L en dos medidas di e en es se conside a
diagnós ico.
-DISPOSITIVO PARA LA REALIZACIÓN DEL TEST DEL SUDOR.
MEDIDA DE LA DIFERENCIA DE POTENCIAL NASAL
El epi elio espi a o io, como los ejidos epi eliales en o os ó ganos,
egula el con enido de iones y agua de los luidos supe iciales median e
mecanismos de anspo e ac i o. Es os mo imien os iónicos c ean una
di e encia de po encial ansep ielial. La ausencia de CFTR en la supe icie
apical, el lujo disminuído de clo u os esul an e y la hipe abso ción de sodio
dan luga a unas medidas ano males de la di e encia de po encial a a és
del epi elio de los indi iduos con FQ. Debido a la accesibilidad del ejido
epi elial nasal, el dis in o pa ón de di e encias de po encial nasal omado
en pacien es con FQ se encuen a bien es ablecido (Knowles MR e al,
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
34
1995). La di e encia de po encial nasal ha sido acep ada como un es
diagnós ico al e na i o, que puede complemen a el uso del es del sudo y
el análisis mu acional. Es e es es más ú il en pacien es con p esen aciones
a ípicas con ni eles de es del sudo bo de line (40-70 mEq/L) y en los que
no se han iden i icado dos mu aciones asociadas a la FQ (Wilson DC e al,
1998).
-MEDIDA DE LA DIFERENCIA DE POTENCIAL NASAL.
I.5.2.- DIAGNÓSTICO MOLECULAR
El es gené ico pa a la FQ gene almen e se ealiza pa a espalda
una e aluación clínica o pa a es udia a un indi iduo que iene un iesgo
inc emen ado de po a un alelo de FQ.
La iden i icación de po ado es se lle a a cabo gene almen e pa a
alo a el iesgo de la ansmisión de mu aciones a la descendecia.
Indi iduos con una his o ia amilia de FQ ienen un mayo iesgo de se
po ado es de mu aciones en el gen CFTR que el es o de la población, po
lo cual pueden desea un es mu acional pa a de ini con mayo exac i ud
su iesgo.
El diagnós ico p ena al se lle a a cabo gene almen e en pa ejas cuyos
miemb os son po ado es y que po lo an o ienen un iesgo del 25% de
ene hijos con FQ. El análisis mu acional de ambos pad es y el e o puede
INTRODUCCIÓN
35
de e mina si el e o ha he edado un geno ipo de iesgo. El consejo gené ico
puede esul a complicado pa a geno ipos asociados a o mas a ípicas de
FQ.
Po o o lado, el ac ual desa ollo de a amien os especí icos pa a
pacien es con ib osis quís ica con de e minadas mu aciones (codones de
pa ada, G551D) epe cu i á en la necesidad del análisis gené ico de los
mismos pa a la selección de su e apia.
I.5.3.- CRIBADO NEONATAL PARA LA FIBROSIS
QUÍSTICA
I.5.3.1.- FUNDAMENTO
Aunque la FQ gene almen e causa signos y sín omas ca ac e ís icos
du an e la in ancia (Lai HC e al, 2002; Abman SH e al, 1991), los e asos
en el diagnós ico son comunes (Lai HC e al, 1998) y muy pe judiciales.
Cuando se diagnos ica po los mé odos adicionales, basándose en la
sospecha po sín omas clínicos y un es del sudo , casi la mi ad de los
pacien es iene ya malnu ición se e a y muchos ienen in ección c ónica
espi a o ia (Cys ic Fib osis Founda ion, 2001; Fa ell PM, 2003).
Nume osos es udios han demos ado en los úl imos años los múl iples
bene icios de un diagnós ico emp ano de la en e medad, an o en la
e olución clínica como en la educción de la mo bilidad. La e idencia sugie e
que un diagnós ico p esin omá ico emp ano de la FQ a a és de los
p og amas de c ibado neona al es á asociado a bene icios clínicos y pa a la
salud del pacien e (Fa ell PM e al, 1997; Wa e s DL e al, 1999; Fa ell PM
e al, 2001; Mas ella G e al, 2001; Si e D e al, 2003; Sims EJ e al,
2005; Fa ell PM e al, 2003).
Las expec a i as pa a los niños nacidos con FQ han cambiado mucho
en las úl imas dos décadas. Un in o me ecien e sugie e unas mejo es

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
36
unciones cogni i as en es os niños, con mejo es ni eles de i amina E al
diagnós ico (Koscik RL e al, 2005). Además, el c ibado neona al educe la
exposición de las amilias a lo que ecuen emen e cons i uye un pe íodo
la go y es esan e de diagnós ico y les p opo ciona a las pa ejas la
opo unidad de oma decisiones in o madas sob e su ep oducción (Me elle
ME e al, 2003; Kha azi M e al, 2005). El consenso gene al es que exis e
su icien e e idencia pa a apoya el c ibado neona al en FQ y, según
e isiones sis emá icas: …los bene icios en la salud en los niños con FQ
compensan el iesgo de daño y jus i ican el sc eening de FQ… (Fa ell PM e
al, 2005).
El seguimien o de los niños iden i icados median e p og amas de
c ibado ha suminis ado impo an e in o mación sob e la his o ia na u al de
la en e medad así como un mejo en endimien o de su isiopa ología
emp ana. La mayo ía de los niños ienen sín omas gas oin es inales en el
momen o del diagnós ico (Giglio L e al, 1997). El c ecimien o educido
puede ap ecia se a los dos meses de edad. Ap oximadamen e un 60% de
los niños iene una signi ica i a malabso ción de g asas a esa edad y el
g ado de malabso ción se co elaciona con la al a de c ecimien o (B ons ein
MN e al, 1992). No so p ende po an o que los niños con FQ diagnos icada
con encionalmen e engan se e as de iciencias i amínicas o malnu ición
p o eica, conlle ando deshid a ación e hipop o einemia (Wil ond BS e al,
1994). Adicionalmen e a los p oblemas nu icionales, los niños con FQ
iden i icada a a és de p og amas de c ibado ienen e idencias de in ección
en las ías aé eas e in lamación, sugi iendo que la en e medad pulmona en
es os niños es simila a la de adul os y niños de mayo edad (A ms ong DS
e al, 1995). Todos es os p oblemas emp anos sugie en de una mane a
impo an e la necesidad de un a amien o p ecoz.
En la abla siguien e se pueden obse a esumidas las en ajas que
undamen an el diagnós ico emp ano median e el c ibado neona al (Fa ell
PM, 2008):
INTRODUCCIÓN
37
FUNDAMENTOS NUTRICIONALES Y GASTROINTESTINALES
- Los pacien es con FQ son gene almen e bien alimen ados desde el momen o
del nacimien o.
- En el 90% de los pacien es se p oduci á insu iciencia panc eá ica ce ca del
p ime año de ida.
- En el 50 % de los pacien es no a ados se desa olla á malnu ición se e a.
- La IP puede se an icipada y la malnu ición p e enida.
- Los bene icios a la go plazo de una nu ición adecuada son signi ica i os.
FUNDAMENTOS PULMONARES
- Los pulmones de los a ec ados con FQ son gene almen e sanos al nace ,
aunque po poco iempo.
- La en e medad pulmona ecuen emen e se p oduce a los 2 meses de ida.
- La colonización po Pseudomonas ae uginosa ocu i á ap oximadamen e en
un e cio de los pacien es no diagnos icados.
- La con e sión de P. ae uginosa al ipo mucoide supone un al o iesgo a la go
plazo pa a los niños con FQ.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
38
OTROS FUNDAMENTOS
- El daño psicológico asociado a la odisea en el diagnós ico puede p e eni se.
- Los pad es pueden oma decisiones in o madas pa a u u os emba azos.
- Bene icios económicos an o pa a el diagnós ico como pa a el a amien o.
- Se a o ece la in es igación clínica, especialmen e el es udio de es a egias
p e en i as.
En esencia, excep o los pacien es con íleo meconial, los niños con FQ
es án gene almen e sanos en el momen o del nacimien o. Su es ado
nu icional es no mal y el 90 % de los casos con mu aciones de las clases I,
II y III (que se án desc i as pos e io men e) desa olla án IP que puede se
an icipada u ilizando e apias que p e engan la malnu ición. De es e modo
es bas an e p obable que c ezcan de una mane a no mal (Fa el PM e al,
2001; Roussey M e al, 2003).
Los undamen os pulmona es pa a el c ibado son cla os.
A o unadamen e, los pulmones de pacien es con FQ al nacimien o son
no males (Bed ossian CWM e al, 1976), aunque es a si uación suele no
con inua después de los 2 meses de edad (Abman SH e al, 1991; Fa ell
PM e al, 2003b). Exis en muy pocos pacien es diagnos icados a a és de
c ibado neona al que mos a an Pseudomonas ae uginosa en su ac o
espi a o io, mien as que ap oximadamen e un e cio de los pacien es
diagnos icados as los signos o sín omas ya es án colonizados con P.
ae uginosa y muchos con el ipo mucoide (Fi zSimmons SC, 1993).
INTRODUCCIÓN
39
Adicionalmen e a los undamen os clínicos, exis en o as
conside aciones a ene en cuen a. Además de los iesgos a co o plazo
debidos al diagnós ico e a dado, sabemos que exis en o as complicaciones
a la go plazo en e las que se incluyen allo en el desa ollo de la unción
cogni i a (Koscik RL e al, 2004) y un iesgo aumen ado de en e medad
pulmona emp ana (Rosen eld M, 2005).
Po o o lado, ambién exis e e idencia de las implicaciones
económicas y cos e-e ec i idad de los p og amas de c ibado neona al en
FQ. En un es udio pione o ecien e (Sims EJ e al, 2007) se concluye que,
además de los e iden es bene icios clínicos y sociales de los p og amas de
c ibado neona al, exis e un bene icio económico aducido en un aho o
impo an e pa a los sis emas de salud.
I.5.3.2.- APROXIMACIONES ACTUALES
Casi odos los p og amas de c ibado neona al pa a la FQ comienzan
con la de e minación de ipsinógeno inmuno eac i o (TIR) (C ossley JR e
al, 1981), un ma cado de dis unción panc eá ica, de una mancha de sang e
ecogida a los pocos días del nacimien o (Wilcken B e al, 1993). Sin
emba go, un ni el ele ado de TIR as el nacimien o no es especí ico de la
FQ, ya que muchos niños sanos pueden mos a ele aciones empo ales
ansi o ias po di e sos mo i os. T as la in oducción de es e ma cado en
los p og amas de c ibado se hizo e iden e que los niños con FQ enían
ele aciones pe sis en es en los ni eles de TIR, azón po la cual la mayo ía
de los p og amas de c ibado in oduje on una segunda medida de TIR a las
pocas semanas de edad aumen ando así la especi icidad del mé odo.
Un g an núme o de p og amas de c ibado en el mundo han
demos ado que median e la medida de dos ni eles de TIR, acompañado
con un es de sudo , se puede consegui una sensibilidad en la población a
es udio p óxima al 95%.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
46
I.6.1.1.- TEORÍAS SOBRE LA INCIDENCIA ELEVADA
Se han p opues o di e sas eo ías pa a a a de explica la al a
incidencia de la FQ. De en e ellas, la más conocida es la de la en aja
selec i a de los indi iduos he e ocigo os con FQ en e a dis in os ipos de
dia ea p o ocados po bac e ias como Vib io chole ae (Gab iel SE e al,
1994) E.coli (Chao AC e al, 1994) o Salmonella Typhi (Pie GB e al, 1998).
Ninguna de las eo ías p opues as ha sido demos ada, po lo que
oda ía se desconoce la causa exac a de la al a incidencia de la FQ. De
hecho, la eo ía sob e el cóle a ha sido eba ida (Cu hbe AW e al, 1995)
ya que el cóle a y la dia ea sec e o a se p oducen en odas las poblaciones
humanas y po lo an o no es á cla o como es e mecanismo pod ía
inc emen a la ecuencia de los alelos FQ en sólo una aza y no en o as.
I.6.1.2.- CLASIFICACIÓN MUTACIONAL POR FRECUENCIA
Las mu aciones del gen CFTR que causan ib osis quís ica pueden
di idi se en es ca ego ías según su ecuencia: la mu ación más común
(ΔF508), mu aciones menos ecuen es y mu aciones a as:
1) La mu ación ΔF508 ue la p ime a mu ación iden i icada y se
encuen a ap oximadamen e en el 70% de los alelos FQ en las poblaciones
caucásicas (Cys ic Fib osis Analysis Conso ium, 1990; CFGAC, 1994).
-MUTACIÓN ΔF508.

INTRODUCCIÓN
47
Es a mu ación es á apa en emen e ausen e en na i os a icanos y
asiá icos, aunque iene una ecuencia conside able en g upos con mes izaje
caucásico como los A oame icanos (Cu ing G e al, 1992). La ecuencia
de la mu ación ΔF508 a ía en e las poblaciones eu opeas, con un
apa en e g adien e de ecuencia c ecien e desde el su es e has a el
no oes e de Eu opa (30% en Tu quía e Is ael, 88% en Dinama ca y pa es
de las islas B i ánicas).
-FRECUENCIAS DE LA MUTACIÓN ΔF508 EN EUROPA.
La al a ecuencia de la mu ación da luga a que al ededo de la
mi ad de odos los pacien es caucásicos con FQ sean homocigo os pa a la
misma. De hecho, en ausencia de es a mu ación, la FQ se ía una
en e medad he edi a ia ela i amen e a a en Caucásicos y ocu i ía
ap oximadamen e en la misma ecuencia en odas las azas (menos de 1
cada 10000).
2) Exis e o o g upo de ap oximadamen e 20 mu aciones poco
ecuen es que ocu en mundialmen e en una ecuencia de 0,1% ó
supe io . La ecuencia ela i a de cada mu ación depende de la población,
con algunas mu aciones que llegan al 5% de los alelos FQ en algunos
g upos (CFGAC, 1994).
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
48
3) El es o de las mu aciones (94%) son denominadas como
mu aciones a as. Sin emba go, ce ca de 30 mu aciones ienen una
ecuencia ap eciable (mayo al 0,1%) en poblaciones especí icas como
esul ado segu amen e de un e ec o undado . Un ejemplo se ía la mu ación
Y122X que ep esen a el 48% de los alelos FQ en las Islas Reunión
(F ancia) pe o es ex aña en o os luga es (Che alie -Po s F, 1992).
Al menos se han desc i o dos casos de FQ debidos a la he encia de
dos copias del c omosoma sie e de uno de los pad es (disomía unipa en al)
(Spence JE e al, 1988; Voss R e al, 1989). Es a o ma de he encia es
ex emadamen e a a y no debe usa se pa a co egi las es imaciones del
iesgo pa a po ado es sanos de alelos FQ (Wa bu on D e al, 1988).
I.6.2.- AISLAMIENTO Y ESTRUCTURA DEL GEN CFTR
El gen causan e de la FQ ue iden i icado median e combinación de
mapeado ísico, aislamien o de egiones exónicas y análisis gené ico (Ke em
B e al 1989, Rio dan JR e al 1989, Rommens JM e al 1989). Los
agmen os de ADN aislados de la egión en e los ma cado es que
lanqueaban el locus FQ ue on analizados pa a secuencias de i adas de los
genes. Siguiendo la iden i icación y pos e io eliminación de muchas
secuencias candida as, se aisló un agmen o de ADN de 4300 bp que
demos ó con ene el p ime exón del gen esponsable de la FQ. A es e gen
se le denominó el egulado ansmemb ana de la conduc ancia de la FQ
(Cys ic Fib osis T ansmemb ane Conduc ance Regula o , CFTR) y se
encuen a ubicado en el b azo la go del c omosoma 7 (7q31.2).
El mapeado ísico indica que el gen CFTR es á compues o po 27
exones (nume ados del 1 al 24) con un amaño de 250 kb de ADN (Zielinski
J e al 1991; Ellswo h RE e al, 2000). El gen se ansc ibe a un mRNA
madu o de ap oximadamen e 6500 bp (Rio dan JR e al, 1989). Se ha
desc i o el p ocesamien o al e na i o (splicing) de muchos exones, pe o
INTRODUCCIÓN
49
ninguno de los ánsc i os esul an es codi ica pa a una iso o ma uncional
de CFTR (Cu ing GR e al, 1994).
-ESTRUCTURA DEL GEN CFTR Y PROCESO DE TRADUCCIÓN.
Muchos es udios han con imado que el CFTR es el gen esponsable de
la FQ (Ke em B e al, 1989). En p ime luga la deleción de es nucleó idos
∆F508 se encon ó únicamen e en c omosomas de pacien es con FQ. En
segundo luga , no había ecombinaciones en e ∆F508 y el eno ipo de la
FQ. Además, la mu ación ∆F508 se asoció casi exclusi amen e con un
haplo ipo en ue e desequilib io de ligamien o con el locus FQ. Finalmen e,
c omosomas no males con el haplo ipo común a los c omosomas FQ no
ienen la ∆F508, indicando que es a deleción no e a un polimo ismo ligado
al haplo ipo FQ.
El mRNA de CFTR se exp esa en ejidos epi eliales de los pulmones, el
pánc eas, la glándula sudo ípa a, el hígado, el in es ino delgado y los
es ículos (T ezise AEO e al, 1991; C aw o d I e al, 1991). Aunque la
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
50
exp esión del CFTR iene una egulación empo al y espacial muy p ecisa,
las secuencias de con ol de la ansc ipción de CFTR oda ía se conocen de
mane a escasa.
I.6.3.- LA PROTEÍNA CFTR
I.6.3.1.-ESTRUCTURA DE CFTR
El gen CFTR codi ica pa a una p o eína de 1480 aminoácidos que
iene dos es uc u as epe idas cada una de las cuales con iene un dominio
ansmemb ana (TMD) compues o po 6 agmen os hid o óbicos unidos a
un dominio de unión de nucleó idos (NBD). Es as es uc u as es án
sepa adas po una egión de 241 aminoácidos con muchos esiduos
ca gados y múl iples luga es po enciales pa a la os o ilación po
p o einkinasas A y C (Rio dan JR e al, 1989). La úl ima egión se pos uló
que es aba in oluc ada en el con ol de la unción de la p o eína y se le
denominó dominio R.
-ESTRUCTURA DE LA PROTEÍNA CFTR.
La es uc u a global del CFTR es muy simila a miemb os de la amilia
MDR (Mul id ug Resis ance). Es as p o eínas pe enecen a la supe amilia de
INTRODUCCIÓN
51
las p o eínas ABC (ATP-binding casse e), que impo an y expo an
pequeñas moléculas ( á macos, p o eínas, hid a os de ca bono e iones) a
a és de las memb anas celula es (Higgins C, 1989; Klein I e al, 1999).
Los miemb os de es e g upo de p o eínas son muy simila es en la egión
hid o ílica, con eniendo un si io de unión pa a el ATP (Hyde SC e al, 1990;
Rio dan JR e al, 1989). Median e compa ación con es a amilia de
p o eínas, se p opuso que CFTR pod ía ac ua como un anspo ado
dependien e de ATP, posiblemen e expo ando moléculas a a és de las
memb anas celula es.
-COMPONENTES DEL TRANSPORTADOR ABC.
I.6.3.2.- FUNCIONES DE CFTR
Aunque la es uc u a global de CFTR es semejan e a los
anspo ado es ABC, la e idencia expe imen al demues a que su unción
p incipal es la de ac ua como canal de clo o. De di e sos es udios se
ob iene que la exp esión de CFTR da luga a la apa ición de nue as
sec eciones de clo o es imuladas po el AMPc en una a iedad de células
de i adas de ejidos no epi eliales que no enían canales de clo o AMPc
dependien es (Ka ne N e al, 1991; Ande son MP e al, 1991A). Además,
la magni ud de es a sec eción se co elacionó de un modo lineal con la
can idad de p o eína CFTR p esen e.

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
52
También se ha demos ado que CFTR es capaz de egula el
uncionamien o de o os canales como ROMK, ENaC, ORCC, NHE3 y TRPV4
(Bush A e al, 2006).
Se han p opues o o as muchas unciones pa a CFTR además de las
an e io men e ci adas. Se ha suge ido, po ejemplo, que CFTR modula la
sec eción de bica bona o median e la egulación del in e cambiado de
bica bona o y clo o (Poulsen JH e al, 1994; Mas acola T e al, 1998; Lee
MG e al, 1999). CFTR puede ambién juga un papel en la egulación de
canales aniónicos egulados po olumen y canales de uniones gap. O as
unciones p opues as incluyen la de senso de los ni eles in acelula es de
ATP, conducción de una g an a iedad de pequeños solu os y agua a a és
de las memb anas celula es y la de acili a la acidi icación de las o ganelas
in acelula es. La pé dida de es as p opiedades pod ía explica un g an
núme o de desajus es me abólicos en las células. Sin emba go, la e idencia
es insu icien e pa a co obo a es as unciones de CFTR.
I.6.3.3.- CFTR EN PACIENTES CON FIBROSIS QUÍSTICA
El anspo e ano mal de sodio y clo o en las células epi eliales de las
ías aé eas que ecub en los pulmones y las glándulas sudo ípa as es el
de ec o bioquímico en los pacien es con FQ (Knowles MR e al, 1983;
Quin on PM, 1983). Un g an núme o de es udios ha demos ado que la
ans ección de células epi eliales de i adas de pacien es con FQ con el
ADNc sal aje da luga a una e e sión al eno ipo no mal. Asimismo su
exp esión p oduce una co ección del de ec o en el anspo e de iones
(Rich DP e al, 1990). Además, la educción en los ni eles endógenos de
CFTR se asocia a una pé dida del anspo e de clo o ac i ado po AMPc en
las células epi eliales. Va ios es udios han con i mado que CFTR juega un
papel cen al en el anspo e de clo o y sodio que es de ec uoso en
pacien es con FQ (So sche EJ e al, 1991; T apnell BC e al 1991; Wagne
JA e al, 1991).
INTRODUCCIÓN
53
-PULMONES EN INDIVIDUO SANO (IZQUIERDA) Y EN INDIVIDUO CON FQ
(DERECHA).
-GLÁNDULA SUDORÍPARA EN INDIVIDUO SANO (IZQUIERDA) Y EN INDIVIDUO
CON FQ (DERECHA).
Aunque se ienen bas an es conocimien os a ni el molecula y celula ,
el mecanismo po el cual la dis unción de CFTR lle a a una mani es ación de
la en e medad a ni el o gánico no se comp ende oda ía con exac i ud. Es o
es pa icula men e cie o en el caso de la en e medad pulmona , la p ime a
causa de mo bilidad y mo alidad en FQ. De hecho, un deba e impo an e
en la in es igación se cen a en si la isiopa ología subyacen e en FQ se
debe a una pé dida de la abso ción o sec eción de elec oli os y luidos o a
una combinación de ambas (Wine JJ e al, 1999).
I.6.4.- MUTACIONES EN EL GEN CFTR
Pa a coo dina la ecogida y dis ibución de in o mación ela i a a las
mu aciones en FQ se c eó en 1989 un conso cio mundial con 90
labo a o ios, el Cys ic Fib osis Gene ic Analysis Conso ium, con una página
web en la que se puede con as a in o mación ac ualizada sob e las
di e sas mu aciones en indi iduos con FQ (www.gene .sickkids.on.ca/c /).
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
54
El obje i o de es a base de da os es el de p opo ciona a los
in es igado es en FQ y o os p o esionales elacionados in o mación
ac ualizada sob e las mu aciones indi iduales en el gen CFTR.
De es a mane a se in en a inc emen a y acili a la comunicación
en e in es igado es de FQ que es én abajando en la iden i icación de
mu aciones en el gen CFTR e i ando es ue zos innecesa ios e in en ando
mejo a la comp ensión de la unción de los p oduc os génicos en los
pacien es con FQ así como la co elación de los sín omas clínicos y las
mu aciones. Ac ualmen e exis en 130 g upos que abajan en es e conso cio
en al ededo de 30 países.
Además de en es a base de da os, se puede encon a in o mación
ex ensa y ac ualizada sob e las mu aciones del gen CFTR en bases de da os
como la Human Genome Mu a ion Da abase (www.biobase-
in e na ional.com/hgmd/p o/gene.php?gene=CFTR).
Ac ualmen e se encuen an clasi icadas más de 1400 mu aciones en
el gen CFTR, la mayo ía de las cuales co esponden a sus i uciones
nucleo ídicas que dan luga a un cambio de aminoácido o codón de pa ada.
En segundo luga es án las pequeñas deleciones y pos e io men e las
sus i uciones nucleo ídicas que a ec an al p ocesamien o del mRNA.
En la abla siguien e se pueden obse a las dis in as mu aciones
desc i as ac ualmen e clasi icadas según su na u aleza:
INTRODUCCIÓN
55
-CLASIFICACIÓN DE LAS MUTACIONES EN EL GEN CFTR (HGMD-FEBRERO 2008).
-DISTRIBUCIÓN POR EXÓN DE LAS MUTACIONES EN EL GEN CFTR.
La mayo ía de las mu aciones en el gen CFTR se co esponden con
cambios que a ec an a uno o pocos nucleó idos aunque en los úl imos años
se han de ec ado g andes deleciones que dan luga a la pé dida de
agmen os g andes del gen (Han ash FM e al, 2006; Schneide M e al,
2007).
Las dis in as mu aciones se denominan siguiendo un c i e io de
ecomendaciones es ablecido en el año 1998 (An ona akis SE, 1998),
clasi icándose en los siguien es ipos:
• cambio de aminoácido (missense): el cambio de nucleó ido da luga a la
sus i ución de un aminoácido. La mayo ía de las mu aciones pe enecen a
es e ipo.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
62
I.6.7.- GENES MODIFICADORES
La a iedad de mani es aciones pulmona es en los pacien es con FQ y
el desa ollo de complicaciones elacionadas con la FQ no se co elacionan
en ocasiones con el geno ipo de CFTR ni con los ac o es ambien ales.
Es udios ecien es sugie en que las a iaciones eno ípicas en la FQ pueden
se a ibuídas a a iaciones gené icas en o os genes di e en es al CFTR
denominados genes modi icado es. En los úl imos años muchos genes
modi icado es candida os se han in es igado en elación con la FQ,
especialmen e genes implicados en el con ol de la in ección, la inmunidad y
la in lamación. Algunos de es os genes se han iden i icado de alguna
mane a como modi icado es del eno ipo en la FQ, mien as que o as
asociaciones no se han con i mado oda ía (Slieke MG e al, 2005).
RELACIONADOS CON ENFERMEDAD PULMONAR
GEN REFERENCIAS
MBL
(Mannose-binding lec in)
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NOS3
(Ni ic oxide syn hase- 3)
G asemann H e al 2003.
AAT
(α1-an i ypsin)
Do ing G e al 1994, Meye P e al 2002,
Mahade a R e al 1998, Mahade a R e al
1998b, F angolias DD e al 2003, Hen y MT
e al 2001.
HLA-II
(Human leukocy e an igen gene II)
A on Y e al 1999.
TNF-α
(Tumo nec osis ac o -α)
Hull J y Thomson AH 1998.

INTRODUCCIÓN
63
GST M1
(Glu ha ion- S- ans e ase M1)
Hull J y Thomson AH 1998.
GST M3
(Glu ha ion- S- ans e ase M3)
Flaman C e al 2004.
TGF β1
(T ans o ming g ow h ac o -β1)
A kw igh PD e al 2000.
ACE
(Angio ensin 1 con e ing enzyme)
A kw igh PD e al 2003.
β2AR
(β2 ad eno ecep o )
Busche R e al 2002.
CLC-2
(Chlo ide channel-2)
Blaisdell CJ e al 2004.
RELACIONADOS CON ENFERMEDAD
GASTROINTESTINAL
MBL
(Mannose-binding lec in)
Gabolde M e al 2001.
AAT
(α1-an i ypsin)
Mahade a R e al 1998.
HLA-II
(Human leukocy e an igen gene II)
Ca ing on M e al 1994, Lanng S e al 1993,
Du hie A e al 1995.
TNF-α
(Tumo nec osis ac o -α)
Hull J y Thompson AH 1998.
GST M1
(Glu ha ion- S- ans e ase M1)
Hull J y Thompson AH 1998.
GST M3
(Glu ha ion- S- ans e ase M3)
Flaman C el al 2004.
GST P1
(Glu ha ion- S- ans e ase P1)
Hen ion-Caude A e al 2002.
ACE
(Angio ensin 1 con e ing enzyme)
A kw igh PD e al 2003.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
64
HFE
(Pu a i e he edi a y hemoch oma osis
gene)
Rohl s EM e al 1998, De aney J e al 2003.
ATB0
(Neu al amino acid anspo e B0)
La iba S e al 2001.
-POSIBLES GENES MODIFICADORES INVESTIGADOS EN FIBROSIS QUÍSTICA.
Los genes modi icado es pueden in lui en la se e idad de los
eno ipos de FQ median e un g an núme o de mecanismos. Pueden modula
el eno ipo ac uando en el ni el molecula básico, como pe mi iendo una
conduc i idad al e na i a de clo u os, o egulando el p ocesado y la
exp esión del gen CFTR. Pueden ambién ac ua modulando la
suscep ibilidad a la in ección y a la espues a in lama o ia. Además, el
eno ipo pulmona en la FQ puede se modi icado po genes asociados al
acla amien o mucocilia o a la epa ación del ejido epi elial dañado.
Finalmen e, los p oblemas gas oin es inales (hígado, pánc eas, in es ino)
en la FQ pueden es a in luenciados po genes que modulan la p o eólisis y
la ib osis.
INTRODUCCIÓN
65
I.6.8.-INFORMACIÓN Y ASOCIACIONES
Es des acable la exis encia de nume osas páginas web en las que se
o ece in o mación ace ca de la FQ, an o pa a clínicos como pa a amilia es
de pe sonas a ec adas con dicha pa ología. Es os son algunos de los si ios
web de mayo u ilidad con in o mación sob e FQ:
ASOCIACIONES
¾ Fede ación Española con a la FQ: www. ib osis.o g
¾ Sociedad Eu opea de FQ: www.ec soc.o g
¾ Fundación Si a Ca asco pa a ayuda a la FQ:
www. undacion ib osisquis ica.o g
¾ Fede ación la inoame icana de FQ:
www. ib osis.o g/paises/hispano/ la q.h m
¾ Asociación es adounidense de FQ: www.c ound able.com
¾ www.cys ic ib osis.com
¾ www.c .o g/home
¾ www.mycys ic ib osis.com
¾ www.c awa eness.o g
¾ www.c ww.o g
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
66
BASES DE DATOS
¾ Human Genome Mu a ion Da abase (HGMD):
www.biobase-in e na ional.com/hgmd/p o/gene.php?gene=CFTR
¾ Online Mendelian Inhe i ance in Man (OMIM):
www.ncbi.nlm.nih.go /en ez/dispomim.cgi?id=602421
¾ Cys ic Fib osis Mu a ion Da abase: www.gene .sickkids.on.ca/c
¾ SNPpe : h p://snppe .chip.o g
VARIAS
¾ Tu o ial sob e FQ en español:
www.nlm.nih.go /medlineplus/spanish/ u o ials/cys ic ib osisspanish.h ml
¾ In es igación en FQ: www.c i.o g/home.h m
¾ Lib o Blanco de a ención a la ib osis quis ica:
www. amma.o g/asociaciones/Lib o%20Blanco%20Fib osQuis ica.pd
Fecha de acceso a di ecciones web: mayo 2008.
OBJETIVOS

OBJETIVOS
69
II.1.- OBJETIVOS
1.- Desa ollo de nue as écnicas de diagnós ico molecula pa a el análisis
gené ico en ib osis quís ica.
2.- Adecuación de las ecnologías desa olladas pa a su aplicación en
p og amas de c ibado neona al y ap o echamien o de las mismas pa a
op imiza , simpli ica y aba a a dichos p og amas.
3.- Es udio de la incidencia de la en e medad en nues a comunidad y
c eación de un mapa poblacional con las mu aciones más ecuen es en
indi iduos a ec ados con ib osis quís ica en Galicia.
MATERIAL Y
MÉTODOS
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
78
17B 17bi5 TTCAAAGAATGGCACCAGTGT 461 bp
17bi3 ATAACCTATAGAATGCAGCA
18 18i5 GTAGATGCTGTGATGAACTG 399 bp
18i3 AGTGGCTATCTATGAGAAGG
19 19i5 GCCCGACAAATAACCAAGTGA 555 bp
19i3 GCTAACACATTGCTTCAGGCT
20 20i5 GGTCAGGATTGAAAGTGTGCA 472 bp
20i3 CTATGAGAAAACTGCACTGGA
21 21i5 AATGTTCACAAGGACTCCA 475 bp
21i3 CAAAGTACCTGTTGCTCCA
22 22F GGTATCTGAACTATCTTCTCTA 251 bp
22i3 TGTCACCATGAAGCAGGCAT
23 23F CCCATGGTTGAAAAGCTGAT 414 bp
23i3 TAAAGCTGGATGGCTGTATG
24 24i5 GGACACAGCAGTTAAATGTG 548 bp
24i3 ACTATTGCCAGGAAGCCATT
Las secuencias de los p ime s necesa ios pa a la ampli icación-
secuenciación se ob u ie on de la Clinical Molecula Gene ics Socie y, que
en su página web (www.cmgs.o g/BPG/Guidelines/1s _ed/c .h m. Fecha de
acceso: sep iemb e 2003) o ecía un apéndice en el que se p oponían los
p ime s necesa ios pa a ampli ica median e PCR los dis in os agmen os
del gen CFTR. Los p ime s ue on suminis ados po la casa Sigma-Genosys.
Sin emba go, as p uebas iniciales, se comp obó que no odos los
agmen os del gen se ampli icaban o secuenciaban de o ma adecuada po
lo cual en algunos casos los p ime s p opues os se u ie on que cambia
(así sucedió con los p ime s 8i5, 8i3, 11F, 14BS, 14BAS, 17AF, 22F y 23F).
Pa a el diseño de és os se u ilizó el p og ama P ime 3, de acceso g a ui o
online en la siguien e di ección:
h p:// odo.wi.mi .edu/cgi-bin/p ime 3/p ime 3_www.cgi

MATERIAL Y MÉTODOS
79
Las can idades de eac i os u ilizadas pa a lle a a cabo la PCR
ue on:
¾ Agua MILLI-Q: 5 μL
¾ Eppendo mas e mix: 5 μL
¾ ADN: 1 μL
¾ P ime o wa d: 0,75 μL
¾ P ime e e se: 0,75 μL
Las concen aciones de abajo de los p ime s ue on 10 μM (dilución
1/10 del s ock 100μM). Pa a la ampli icación se u iliza on 15 picomoles y
pa a la eacción de secuencia, como se e á más adelan e, 10 picomoles. El
agua MILLI-Q se ob u o del disposi i o GRADIENT A10 de Millipo e.
Además, an es de in oduci la placa en el e mociclado se añadie on
unas go as de acei e mine al a cada pocillo (Mine al oil o molecula biology
Sigma®) con la inalidad de a a de e i a cualquie ipo de e apo ación
de los eac i os.
Los e mociclado es que se u iliza on an o en la ampli icación como
en el es o de pasos has a la consecución de la secuencia de ADN ue on de
dos ipos, ambos álidos pa a placas de 96 pocillos: GeneAmp® PCR
Sys em 2700 (Applied Biosys ems) y DNA Engine Dyad® (MJ) que se
u iliza on indis in amen e según su disponibilidad en el labo a o io.
-TERMOCICLADORES UTILIZADOS EN LA SECUENCIACIÓN DEL GEN CFTR.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
80
Las condiciones seleccionadas pa a lle a a cabo la ampli icación
simul ánea de odos los agmen os del gen CFTR se pueden e en el
siguien e esquema:
-CONDICIONES PARA LA AMPLIFICACIÓN DEL GEN CFTR.
Como se puede obse a , la PCR pa e de una desna u alización
inicial a 95ºC de 2 minu os, pa a p osegui con 35 ciclos de
desna u alización/hib idación/ex ensión (94ºC, 1 min / 55ºC, 1 min / 72ºC
1 min) y inaliza con un ciclo de ex ensión inal a 72ºC du an e 7 minu os.
La du ación ap oximada de la misma es de 2 ho as y media.
III.1.1.4.- COMPROBACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
Pa a comp oba el p oduc o ampli icado se u iliza on geles de aga osa
del disposi i o READY-TO-RUN de Ame shamBiosiences. En algunas
ocasiones, en caso de necesi a una mayo p ecisión, se u iliza on ambién
geles de poliac ilamida del disposi i o PHASTSYSTEM de Pha macia.
MATERIAL Y MÉTODOS
81
-DISPOSITIVO PHASTSYSTEM.
-DISPOSITIVO READY-TO-RUN.
III.1.1.5.- PURIFICACIÓN DEL PRODUCTO AMPLIFICADO
Una ez hecha la comp obación, los ADNs ampli icados se some ie on
a una eacción en la que se elimina on las posibles impu ezas. Pa a ello se
u ilizó el eac i o EXOSAP-IT® de USB. El EXOSAP-IT consigue p epa a el
ADN ampli icado pa a una mejo secuenciación. Es á compues o po dos
enzimas hid olí icas, exonucleasa I ecombinan e y os a asa alcalina de
cama ón (Pandauls bo ealis), o muladas en un ampón especial. La
exonucleasa deg ada los esiduos monoca ena ios de los p ime s o de
cualquie o o ADN p oducido en la PCR mien as que la os a asa se
enca ga de hid oliza los dNTPs sob an es de la mezcla de PCR.
Las can idades u ilizadas pa a es a eacción ue on 0,5 μL de
p oduc o ampli icado y 0,25 μL de exosap-i . En ensayos iniciales se
u iliza on 0,85 μL de exosap-i y 2,15 μL de p oduc o ampli icado (el
ab ican e ecomienda 5 μL de ADN y 2 μL de exosap-i ) pe o
pos e io men e se consiguie on educi las can idades has a las ci adas
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
82
an e io men e con las consecuen es en ajas económicas sin po ello pe de
calidad en las secuencias.
Pa a lle a a cabo es a eacción, el e mociclado man iene la placa a
37ºC du an e 15 minu os ( ase de a amien o) y pos e io men e a 80ºC
o os 15 minu os ( ase de inac i ación).
-ESQUEMA DE ACTUACIÓN EN LA REACCIÓN DE EXOSAP-IT.
III.1.1.6.- REACCIÓN DE SECUENCIA
Finalmen e se lle a a cabo la eacción de secuencia p e ia a la
secuenciación au omá ica, pa a la cual se u iliza el BigDye® Te mina o
3.1 Cycle Sequencing ki (Applied Biosys ems). Las can idades de eac i os
u ilizadas ue on las siguien es:
MATERIAL Y MÉTODOS
83
¾ ADN pu i icado: 0,5 μL
¾ P ime : 1 μL
¾ BigDye Te mina o 3.1 Sequencing Bu e (5x): 1,75 μL
¾ Agua MQ: 6,25 μL
¾ BigDye Te mina o 3.1: 0,5 μL
La eacción de secuencia se undamen a en el mé odo enzimá ico de
Sange . En dicho mé odo se u ilizan análogos dideoxi ibonucleó idos (que
ca ecen de g upo 3’OH) que se inco po an a la cadena c ecien e de ADN
compi iendo con los nucleó idos no males y ac uando como e minado es
dando luga a un bloqueo en la sín esis de la cadena. Al inco po a se de
mane a alea o ia se an a c ea un conjun o de agmen os de ADN de
di e en es longi udes complemen a io al molde de ADN que es á siendo
secuenciado.
-FRAGMENTOS FORMADOS DURANTE LA REACCIÓN DE SECUENCIA.
En nues o caso, al p ocesa en un secuenciado au omá ico los
p oduc os de es a eacción, en ez de usa isó opos adiac i os pa a ma ca
los agmen os de ADN se u ilizan e minado es ma cados con luo ó o os
di e en es (incluídos en los eac i os del ki ). Es a écnica es más sencilla
pues pe mi e lle a a cabo la eacción en un solo pocillo en el que se
añaden los cua o e minado es ma cados.
Las condiciones pa a la eacción de secuencia ue on:
desna u alización inicial de 96ºC (3 minu os) y 25 ciclos de 96ºC (30
segundos) / 50ºC (15 segundos) / 60ºC (4 minu os).

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
84
III.1.1.7.- PURIFICACIÓN PREVIA A LA SECUENCIACIÓN
An es de in oduci la placa en el secuenciado se some e a una
úl ima pu i icación del p oduc o esul an e de la eacción de secuencia. Pa a
ello se u iliza el KIT MONTAGE SEQ96 ® de Millipo e.
Se ealizan dos la ados de la placa median e acío, uno con 25 μL de
solución de inyección y el segundo con 40 μL. Finalmen e se añaden 25 μL
de solución y se in oduce la placa en un agi ado du an e 15 minu os. T as
la agi ación se ans ie e ya el p oduc o a la placa que a al secuenciado .
III.1.1.8.- SECUENCIACIÓN AUTOMÁTICA
Finalmen e ya enemos las mues as p epa adas pa a que se
in oduzca la placa en el secuenciado au omá ico. El equipo unciona de
mane a o almen e au omá ica inyec ando las mues as en un capila
p e iamen e ca gado con un políme o que unciona como si ue a un gel de
secuencia, pe mi iendo sepa a agmen os de ADN de cadena sencilla que
se di e encian en una única base. A una al u a de e minada el láse del
disposi i o de ec a la luo escencia emi ida po cada cadena sencilla de ADN
luo escen e y aduce dicha emisión en la secuencia co espondien e.
-LECTURA DE LOS FRAGMENTOS PROCEDENTES DE LA REACCIÓN DE SECUENCIA.
MATERIAL Y MÉTODOS
85
En nues o labo a o io u ilizamos el secuenciado ABI 3730xl de
Applied Biosys ems que posee 96 capila es.
-SECUENCIDOR ABI 3730XL.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
86
III.2.- ESPECTROMETRÍA DE MASAS PARA EL
ANÁLISIS DEL GEN CFTR
III.2.1.- CHIPS DE ADN
Un chip de ADN ( ambién llamado mic oma iz, biochip o mic oa ay)
consis e en un g an núme o de moléculas de ADN o denadas sob e un
sus a o sólido de mane a que o man una ma iz de secuencias en dos
dimensiones. Es os agmen os de ma e ial gené ico suelen se secuencias
co as llamadas oligonucleó idos o de mayo amaño como cDNA (ADN
complemen a io, sin e izado a pa i de mRNA), o bien p oduc os de PCR. A
es os agmen os de ADN de una sola heb a inmo ilizados en el sopo e, se
les denomina a menudo sondas. Los ácidos nucleicos de las mues as a
analiza se ma can po di e sos mé odos (enzimá icos, luo escen es, e c.)
y se incuban sob e el panel de sondas, pe mi iendo la hib idación
( econocimien o y unión en e moléculas complemen a ias) de secuencias
homólogas. Du an e la hib idación, las mues as de ma e ial gené ico
ma cadas, se uni án a sus complemen a ias inmo ilizadas en el sopo e del
chip, pe mi iendo la iden i icación y cuan i icación del ADN p esen e en la
mues a (mu aciones, pa ógenos, e c.). Con pos e io idad, el escáne u
o as he amien as in o má icas pe mi en la in e p e ación y análisis de los
da os ob enidos.
Aunque la ecnología que hemos desa ollado, y que se á desc i a a
con inuación, no se ajus a de un modo es ic o a la de inición de chip de
ADN (especialmen e has a el momen o de la hib idación) hemos decidido
denomina la así (Chip-CFTR) po sus semejanzas con la misma.
MATERIAL Y MÉTODOS
87
-CHIPS UTILIZADOS PARA EL DIAGNÓSTICO DE FIBROSIS QUÍSTICA
(Spec oCHIP®).
La exis encia de un nodo del Cen o Nacional de Geno ipado (CeGen)
en San iago de Compos ela supuso una en aja po su accesibilidad desde
nues o labo a o io lo cual nos acili ó la in oducción de es a ecnología en
el p og ama pilo o de c ibado neona al pa a la FQ. Conc e amen e la
ecnología seleccionada pa a lle a a cabo nues o p oyec o ue la del
sis ema SEQUENOM MassARRAY®.
-SISTEMA SEQUENOM MASSARRAY®.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
94
µL de ampón DLB (cons i uído con 100 µL de TRIS/HCL 1M pH 7,4, 20 µL
de NaCl 5M, 200 µL de EDTA 0,5 M pH 8,0 y 9,7 ml de agua des ilada).
- Pos e io men e se añaden 50 µL de SDS al 10% y 5 µL de p o einasa K
(20mg/ml) y se deja incubando a 56ºC oda la noche.
- Al día siguien e se añaden 20 µL de NaCl 5M, 250 µL de enol-clo o o mo y
250 µL de alcohol isoamílico 24:1 y se mezcla po in e sión.
- Se cen i uga 3 minu os a 12000 pm y se pasa la ase acuosa (supe io ) a
o o ubo, co ando la pun a de la pipe a pa a e i a la agmen ación del
ADN.
- Pos e io men e se añaden de nue o 250 µL de enol y 250 µL de alcohol
isoamílico y se cen i uga 3 minu os a 12000 pm.
- Se ecoge la ase acuosa nue amen e pasándola a o o ubo y se añade 1
mL de e anol absolu o ío. Se agi a po in e sión y se deja 30 minu os a
80ºC bajo ce o.
- Finalmen e se cen i uga a 12000 pm 15 minu os, se decan a el
sob enadan e con la pipe a y se deja seca 10 minu os. Se añaden 30 µL de
solución de ehid a ación (P omega) y se incuba en un baño con agi ación a
65ºC du an e 1 ho a.
III.2.5.2.- CUANTIFICACIÓN DEL ADN Y NORMALIZACIÓN
El ADN se cuan i ica median e el espec o o óme o NANODROP ND-
1000 y pos e io men e se no malizan las mues as a 10 ng/µL u ilizando
una mac o de Excel. La abla de no malización nos pe mi e sabe el
olumen de mues a necesa io pa a la ealización simul ánea de los
di e en es ensayos a la concen ación adecuada pa a el análisis. En nues o
caso, eniendo en cuen a los ensayos del chip, el olumen mínimo necesa io
pa a cada mues a e a de 70 µL ( e sión 2007).

MATERIAL Y MÉTODOS
95
- EJEMPLO DE TABLA DE NORMALIZACIÓN PARA LAS MUESTRAS DE UN CHIP.
Teniendo en cuen a es os da os se p epa a una placa con las
mues as a la concen ación adecuada (añadiendo el ADN y el agua
necesa ios en cada caso, indicado en la abla). Pos e io men e el CeGen
inicia con es a placa el p oceso de geno ipado.
III.2.5.3.- AMPLIFICACIÓN DEL ADN
El ADN se ampli ica en una eacción PCR mul iplex que end á dis in o
núme o de p ime s según las mu aciones que se analicen en cada ensayo.
Las can idades u ilizadas pa a la eacción de ampli icación de cada
mues a ue on las siguien es :
- Agua MQ: 53 µL.
- PCR Bu e (10x): 27,6 µL.
- MgCl2 (25 nM): 14,4 µL.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
96
- dNTP mix (25mM): 11,0 µL.
- Ho S a Taq polime asa (5 U/µL): 4,4 µL.
- P ime mix (1 µM); 22,1 µL.
Las condiciones de PCR ue on las siguien es: 95ºC 15 min, 45 ciclos
de 94ºC 20 seg / 56ºC 30 seg / 72ºC 1 min y po úl imo 72ºC 3 minu os.
III.2.5.4.- TRATAMIENTO CON SAP
T as la ampli icación se lle a a cabo una eacción de pu i icación
u ilizando el eac i o SAP (Sh imp alkaline phospha ase) que ca aliza la
de os o ilación 5’ os a o de los ex emos del ADN ampli icado. Las
can idades u ilizadas pa a cada placa ue on:
- Agua MQ: 765 µL.
- Bu e : 85 µL.
- SAP: 150 µL.
Las condiciones del e mociclado pa a la eacción ue on 37ºC
du an e 40 minu os y 85ºC du an e 5 minu os.
III.2.5.5.- REACCIÓN DE EXTENSIÓN
Una ez que enemos el p oduc o ampli icado pu i icado, se p ocede a
ealiza la eacción de ex ensión iPLEX, pa a la que se u ilizan di e en es
can idades de eac i os según en el ensayo se lle en a cabo 18 geno ipos o
más:
-De 1 a 18 geno ipos : -Agua MQ: 32,6 µL
-S op Bu e : 8,8 µL
-iPlex mix: 4,4 µL
-Ex end P ime s: 41,5 µL
-Enzima iPlex-Gold: 0,9 µL
MATERIAL Y MÉTODOS
97
-De 19 a 36 geno ipos : -Agua MQ: 27,3 µL
-S op Bu e : 8,8 µL
-iPlex mix: 8,8 µL
-Ex end P ime s: 41,5 µL
-Enzima iPlex-Gold: 1,8 µL
Las condiciones del e mociclado pa a la eacción de ex ensión
ue on las siguien es:
- Desna u alización inicial: 94ºC 30 segundos.
- 40 ciclos de desna u alización-hib idación-ex ensión :
94ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5
seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg / 52ºC 5 seg / 80ºC 5 seg
- Ex ensión inal: 72ºC 3 minu os.
III.2.5.6.- HIBRIDACIÓN EN CHIP Y LECTURA
T as la ex ensión, el p oduc o esul an e en cada pocillo se diluye en
15 µL de agua MQ y se le añade 6 mg de esinas de pu i icación (Clean
Resin Sequenom®) con la inalidad de elimina las sales de los p oduc os
esul an es de la eacción. Despúes se agi a 15 minu os y se cen i uga pa a
in oduci la placa en el obo dispensado (Nanodispense ) que se enca ga
de coge el olumen necesa io pa a hib ida lo en el chip (Spec oCHIP®) así
como de añadi el calib an e necesa io pa a el espec óme o.
Finalmen e el chip se in oduce en el espec óme o (Au o lex B uke
Dal onics) donde se ealiza la lec u a del mismo.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
98
-ESPECTRÓMETRO E INTRODUCCIÓN DE CHIP PARA LECTURA.
El undamen o del análisis de ácidos nucleicos median e un
espec óme o MALDI-TOF (Ma ix Assis ed Lase Deso p ion/Ioniza ion-
Mass Spec ome y) puede e se esquema izado a con inuación (Saue S,
2006):
-ESQUEMA DE FUNCIONAMIENTO DE UN ESPECTRÓMETRO MALDI-TOF.
La i adiación de co-c is ales o mados po pequeñas moléculas
acídicas o gánicas (la ma iz) y biomoléculas con una láse pulsan e
(gene alemen e láse UV) induce una ans e encia de ene gía y un p oceso
de dese ción, e apo ando la ma iz y los iones del anali o en una ase
MATERIAL Y MÉTODOS
99
gaseosa. T as la ionización, las moléculas de la ma iz y el anali o son
acele adas median e un campo eléc ico.
Gene almen e la espec ome ía de masas MALDI-MS se lle a a cabo
con una sepa ación ime-o - ligh ( iempo de uelo). En ella, las moléculas
son guiadas median e óp ica iónica po un ubo en uelo lib e de campo,
donde se sepa an según sus elaciones masa/ca ga an es de que,
inalmen e, lleguen al de ec o . La in e p e ación de los espec os y la
iden i icación de las mu aciones se lle a a cabo median e algo i mos como
los desc i os po Bocke (Bocke S, 2003).
III.2.5.7.- ANÁLISIS DE DATOS
Po úl imo, los da os p oceden es del espec óme o se analizan
median e el p og ama Type Analyze (Sequenom®). Con dicho p og ama
podemos isualiza cada uno de los espec os de las mues as a la ez que
e isamos la asignación au omá ica de geno ipos que e ec úa.
-VISUALIZACIÓN DE ESPECTROS MEDIANTE EL PROGRAMA TYPERANALYZER.

RESULTADOS Y
DISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
103
IV.1.- DESARROLLO DE UNA TECNOLOGÍA DE
ALTO RENDIMIENTO PARA EL GENOTIPADO DE
CFTR
IV.1.1.- DISEÑOS DE CHIPS-CFTR
En el año 2006 se concluye el desa ollo de la p ime a e sión del
Chip-CFTR, que comienza a u iliza se de mane a u ina ia en el p og ama
pilo o de c ibado neona al pa a FQ que se había iniciado es años an es en
la Unidad de Me abolopa ías del Complejo Hospi ala io Uni e si a io de
San iago (CHUS). La u ilización de es a ecnología de al o endimien o a ó
de soluciona los incon enien es de la secuenciación, que se enía u ilizando
como mé odo analí ico en nues o labo a o io desde el año 2003, y sus
ca ac e ís icas especí icas mos a on a es a ecnología du an e los años
siguien es como muy adecuada pa a el diagnós ico gené ico de la
en e medad y más conc e amen e pa a su aplicación en p og amas de
c ibado.
T as di e sos ajus es en las condiciones de los ensayos con el in de
in en a analiza el mayo núme o de mu aciones en un mismo chip,
desa ollamos una p ime a e sión del Chip-CFTR (Chip-CFTR 2006) en la
que se analizaban las siguien es a ian es (mu aciones y polimo ismos) del
gen CFTR, median e los ensayos que se mues an a con inuación (SNPs en
neg i a):
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
110
MUTACIÓN Nº DE ALELOS
ΔF508 23
Y1014C 4
R1162X 3
711+1G-T 2
G576A 2
L206W 2
S1235R 2
R117H 2
2183AA-G 1
V562I 1
D1152H 1
E217G 1
E588V 1
F1052V 1
F1074L 1
G542X 1
I148T 1
R1066C 1
R334W 1
V232D 1
V754M 1
Y1092X 1
-MUTACIONES IDENTIFICADAS MEDIANTE CHIPS EN EL PROGRAMA PILOTO DE
CRIBADO (2006-2007).
Asimismo, siguiendo el p o ocolo de ac uación en el c ibado, se
secuencia on las mues as en las que el chip sólo había iden i icado una
mu ación. En o al se secuencia on en es e pe íodo o as 59 mues as
con i mándose las mu aciones p e iamen e iden i icadas y hallando o as
como la G1069R.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
111
IV.1.3.2.- CASOS DIAGNOSTICADOS CON FIBROSIS QUÍSTICA
MEDIANTE CHIPS EN CRIBADO
Nues o obje i o más impo an e den o del p og ama pilo o de
c ibado pa a la ib osis quís ica e a el de busca ecién nacidos con dos
alelos mu ados, lo cual iden i ica ía de mane a emp ana a un indi iduo
a ec ado con la en e medad. Du an e es e pe íodo se diagnos ica on de es a
mane a un o al de 11 neona os, cuyos geno ipos se pueden e a
con inuación:
AÑO ALELO 1 ALELO 2
2006 R1162X E588V
2006 ΔF508 L206W
2006 ΔF508 ΔF508
2006 ΔF508 ΔF508
2007 ΔF508 R117H
2007 ΔF508 L206W
2007 ΔF508 ΔF508
2007 ΔF508 ΔF508
2007 G576A G1069R
2007 ΔF508 ΔF508
2007 ΔF508 ΔF508
-GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA
PILOTO DE CRIBADO (2006-2007).
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
112
IV.2.- CARACTERÍSTICAS DIFERENCIALES DE
LOS CHIPS-CFTR
T as la expe iencia acumulada u ilizando las e siones iniciales de los
chips se han podido comp oba las ca ac e ís icas di e enciales de los
mismos, que hacen de es a ecnología una de las más adecuadas pa a su
u ilización en p og amas de c ibado neona al con unas en ajas impo an es
espec o a la mayo ía de los mé odos exis en es en la ac ualidad pa a el
análisis gené ico de CFTR.
IV.2.1.- FLEXIBILIDAD
Una de las ca ac e ís icas di e enciales más impo an es de es a
ecnología es su lexibilidad. Las mu aciones incluidas en las plexes de los
chips pueden modi ica se a olun ad y de es a mane a se pueden i
añadiendo nue as mu aciones pa a el análisis gené ico de CFTR en caso de
se necesa io en las sucesi as e siones. Es e sis ema abie o se
con apone o almen e a la mayo ía de los mé odos de análisis gené ico
come ciales, que p esen an el g an incon enien e de se sis emas ce ados
en los que se es udian un núme o muy limi ado de mu aciones
(gene almen e sob e 30-40) y que de ningún modo pueden adap a se a las
necesidades analí icas de poblaciones en las que, como e emos ocu e en
la nues a, pueda exis i una ecuencia ele ada de mu aciones di e en es a
las que apa ecen en los ki s come ciales. La posibilidad de ac ualización de
nues o sis ema se p esen a, po an o, como una de sus ca ac e ís icas
más des acables.
En nues o caso, la p ime a e sión del chip analizaba 119 a ian es.
La e sión siguien e, que apa eció en el año 2007, aumen ó su cobe u a a
175 a ian es. La úl ima e sión, del año 2008 (en p uebas), con iene
inicialmen e 184 a ian es. En el anexo adjun o (Anexo III) puede e se de
mane a esquemá ica la e olución en la cobe u a de análisis de los chips.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
113
IV.2.2.- SENSIBILIDAD
La al a sensibilidad de los chips es o a ca ac e ís ica impo an e de
los mismos. En p incipio, la can idad mínima eó ica necesa ia pa a el
geno ipado es de 10-20 nanog amos de ADN. Es a pequeña can idad
(bas an 2µL a una concen ación 10 ng/µL) hace que mues as mínimas
sean su icien es pa a ob ene el ADN necesa io pa a ealiza un geno ipado
sa is ac o io. En los p og amas de c ibado neona al es a ca ac e ís ica es
undamen al ya que las mues as disponibles pa a ealiza los suelen se
escasas, gene almen e manchas de sang e imp egnadas en papel.
Las can idades mínimas necesa ias pa a el geno ipado con
ecnologías de geno ipado semejan es suelen se mucho mayo es. Po
ejemplo, el CF-Mic oa ay de Aspe Bio ech, equie e 1,75 µg de ADN
genómico pa a el análisis (ap oximadamen e 100 eces más).
IV.2.3.- COBERTURA
La amplia cobe u a de nues o sis ema es un aspec o undamen al
de los Chip-CFTR. La úl ima e sión analiza ya conjun amen e más de 180
mu aciones. Es e panel de geno ipado incluye, como se ha ci ado
an e io men e, a las mu aciones más ecuen es en población eu opea pa a
las que exis e in o mación en la li e a u a cien í ica du an e los úl imos
años.
La mayo ía de los ki s come ciales exis en es en la ac ualidad pa a el
análisis gené ico de FQ adolecen de una cobe u a educida de mu aciones a
es udio (Johnson MA e al, 2007). Es o se debe p incipalmen e a que,
omando como e e encia las ecomendaciones de la ACMG/ACOG
(Ame ican College o Medical Gene ics/Ame ican College o Obs e icians
and Gynecologis s), la mayo ía de ellos incluyen un panel a es udio de
ap oximadamen e 30 mu aciones.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
114
La ACMG/ACOG publicó en el año 2002 (Richa ds CS e al, 2002)
unas ecomendaciones pa a el análisis mu acional de CFTR. En dichas
ecomendaciones se suge ía un panel de 25 mu aciones que se suponía
con enía las mu aciones con una ecuencia de al menos 0,1% exis en es en
los di e sos g upos é nicos no eame icanos. Además, ecomendaba la
ealización de unos es s ( e lex es s) pa a e i a la con usión con o os
polimo ismos en el caso de que apa ecie an la mu aciones ∆F508 ó ∆I507
en homocigosis ( es s pa a I506V, I507V y F508C) o en caso de se posi i o
pa a la mu ación R117H ( es pa a la poli imina del in ón 8).
Pos e io men e, una e isión de es e panel (Wa son MS e al, 2004)
educi ía las ecomendaciones de análisis a únicamen e 23 mu aciones
(man eniendo los e lex es ). Es e panel se conside ó desde el momen o de
su apa ición como e e encia pa a el análisis gené ico de CFTR en
No eamé ica y pa a el desa ollo de ki s come ciales u ilizados en o os
muchos países, incluyendo países eu opeos.
∆F508 R347P
G542X 711+1G-T
W1282X R334W
G551D R560T
621+1G-T R1162X
N1303K 3659delC
R553X A455E
∆I507 G85E
3849+10kbC-T 2184delA
3120+1G-A 1898+1G-A
R117H I148T
1717-1G-T 1078delT
2789+5G-A REFLEX TEST: I506V, I507V, F508C, IVS8-poliT
-PANEL DE MUTACIONES RECOMENDADO POR LA ACMG/ACOG (EN NEGRITA
MUTACIONES ELIMINADAS EN REVISIÓN DE 2004).
Hay que ene en cuen a que, aunque es e panel p e endió
inicialmen e se un panel ú il pa a cualquie g upo é nico, se basó
p incipalmen e en ecuencias de mu aciones en Caucásicos no hispánicos y
en Judíos Ashkenazi, debido a la al a ecuencia de la en e medad y a la
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
115
disponibilidad de los da os mu acionales. De hecho es e panel se
conside aba que iden i icaba ap oximadamen e el 97% de las mu aciones
en Judíos Ashkenazi, 90% en Caucásicos, 69% en A oame icanos y un
57% en Ame icanos Hispanos.
En la población española, sin emba go, nos encon amos con una
si uación muy especí ica. Las publicaciones exis en es sob e el espec o
mu acional en poblaciones españolas indican una g an a iedad de
mu aciones. De hecho, inicialmen e se desc ibió a la población española
como la de mayo he e ogeneidad mu acional en CFTR de las es udiadas
has a el momen o (Casals T e al, 1997), indicando la necesidad del es udio
de al menos 75 mu aciones pa a ca ac e iza el 90% de los alelos mu ados.
Es udios más ecien es en los que se analiza on casi 2000 alelos de
pacien es españoles con FQ indican la necesidad de analiza al menos 121
mu aciones pa a ca ac e iza el 96% de los alelos mu ados (Alonso MJ e al,
2007).
Un da o in e esan e al espec o se puede comp oba obse ando los
esul ados en las mu aciones que hemos iden i icado con nues a
me odología y los que hubiésemos ob enido u ilizando únicamen e el panel
es ánda es adounidense. A con inuación se pueden obse a indicadas en
ojo los geno ipos hallados en los casos iden i icados median e c ibado que
hubiesen pasado inad e idos siguiendo el panel:
ΔF508 S1235R I148T
Y1014C V562I R1066C
R1162X D1152H R334W
2183AA-G E217G V232D
711+1G-T E588V V754M
G576A F1052V Y1092X
L206W F1074L G1069R
R117H G542X

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
116
Como se puede e , de las 23 mu aciones di e en es iden i icadas en
los dis in os casos du an e el p og ama pilo o de c ibado, únicamen e 7
(30%) o maban pa e del panel es adounidense ecomendado.
O o da o a des aca se ía el de los casos iden i icados con FQ
median e nues o sis ema de análisis que hubiesen pasado inade e idos
siguiendo las ecomendaciones no eame icanas. En la siguien e abla se
pueden e los geno ipos de los casos iden i icados con FQ u ilizando Chips-
CFTR, señalando en neg i a los geno ipos no incluídos en el panel:
ALELO 1 ALELO 2
R1162X E588V
ΔF508 L206W
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 R117H
ΔF508 L206W
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
G576A G1069R
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
Como se puede e , de los 11 casos iden i icados du an e el
p og ama pilo o de c ibado (en los que se encon a on 2 alelos mu ados) 3
de ellos hab ían pasado como po ado es y, lo que esul a más ala man e,
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
117
en uno de ellos ni siquie a se hubie a encon ado ninguna mu ación
siguiendo el panel no eame icano.
Teniendo es os da os en cuen a esul a e iden e que es e panel no
pa ece adecuado pa a el análisis gené ico de la FQ en nues a población,
pa a la cual es necesa ia la u ilización de un panel de es udio con una
mayo cobe u a mu acional como sucede en el caso de los chips.
IV.2.4.- COSTE-EFECTIVIDAD
O o aspec o a ene en cuen a en nues o mé odo es lo cos e-
e ec i o que esul a ya que, pese a ene una g an cobe u a de análisis,
es o no implica un gas o excesi o espec o a o os mé odos de análisis
gené icos come ciales.
Pa a ejempli ica es e pun o, podemos compa a nues o chip con uno
de los mé odos come ciales de análisis gené ico pa a CFTR más u ilizados
en Eu opa (po posee ac edi ación eu opea pa a ines diagnós icos)
llamado INNO-LiPA CFTR® (Innogene ics) y que ue u ilizado en nues os
labo a o ios an es de pone a pun o la me odología pa a la secuenciación
del gen.
-TIRAS DE NITROCELULOSA UTILIZADAS EN TEST INNO-LiPA.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
118
Es e es , basado en el p incipio de hib idación e e sa ( e e se do -
blo ), u iliza unas i as de ni ocelulosa con las que se log a analiza
simul áneamen e 36 mu aciones. El p ecio ap oximado en eb e o de 2008
(PVP) de los eac i os necesa ios pa a la ealización de 20 es s e a de 2500
eu os (125 eu os/mues a). Hab ía que ene en cuen a que, además de los
eac i os, es necesa ia la comp a/leasing de un disposi i o necesa io pa a
lle a a cabo las eacciones y del escáne pa a la lec u a au omá ica de las
i as. Po o o lado ambién hab ía que conside a el iempo del pe sonal
que lo lle a a cabo écnicamen e.
Compa a i amen e, el gas o en un análisis con la úl ima e sión del
chip que con iene más de 170 mu aciones (incluidas odas las del INNO-
LiPA) se ap oxima a los 105 eu os.
Po an o, como se puede obse a , nos encon amos con un mé odo
que no sólo apo a mayo cobe u a en el análisis y se adap a mejo a
nues a población sino que su cos e incluso es in e io al de o os mé odos
come ciales adicionalmen e u ilizados.
IV.2.5.- RAPIDEZ
Una ca ac e ís ica impo an e de las p uebas gené icas pa a
diagnós ico clínico es el iempo necesa io pa a su ealización. El geno ipado
median e chips posee ambién la en aja de la apidez. Así, el iempo
ap oximado o al pa a ealiza odos los pasos necesa ios pa a el
geno ipado es de 8 ho as, di idido en las siguien es e apas:
1) PCR: 2 ho as 30 minu os.
2) SAP: 40 minu os.
3) Reacción de ex ensión: 3 ho as 30 minu os.
4) Pu i icación con esinas: 20 minu os.
5) Pun eado de mues a en chip y lec u a: 1 ho a.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
119
Es e iempo pa a el análisis esul a muy co o si se compa a con o os
mé odos que apo an una cobe u a semejan e, como pod ía se el caso de
la secuenciación di ec a. La secuenciación de las 14 mues as que se
pueden analiza simul áneamen e en un mismo chip pod ía p olonga se
du an e semanas, sin ene en cuen a la complejidad de p ocesos pa a
ealiza la. Con nues a me odología, de se necesa io, pod ían ob ene se los
esul ados de los geno ipos en un solo día.
IV.2.6.- EXACTITUD
La g an exac i ud de la espec ome ía de masas MALDI-TOF en el
campo del geno ipado es un hecho cons a ado (Sun X e al, 2006; Saue S,
2006) y ha sido una de las causas del in e és c ecien e de su aplicación en
el campo de la gené ica con unos ni eles de exac i ud desc i os supe io es
al 99.7%.
En nues o caso, la exac i ud de nues os chips iene a alada,
además, de dos mane as: median e la ealización de p og amas de
con oles de calidad y median e la secuenciación.
IV.2.6.1.- CONTROLES DE CALIDAD
En nues o labo a o io, a la ez que desa ollamos los chips pa a el
análisis gené ico de CFTR, lle amos a cabo con oles de calidad ex e nos
que ce i ican su alidez.
En conc e o, odos los años lle amos a cabo dos ipos de con oles de
calidad, el con ol de calidad eu opeo de la Cys ic Fib osis Eu opean
Ne wo k (Ex e nal Eu opean Quali y Assessmen ) y el con ol de calidad
no eame icano del Cen e o Disease Con ol and P e en ion (Newbo n
Sc eening Quali y Assu ance P og am).
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
126
-ESQUEMA DEL PROTOCOLO DE CRIBADO INICIAL PARA FQ.
En es e modelo de c ibado se comenzaba con la medida de ni eles de
TIR de una mues a de mancha de sang e. En el caso de se supe io a 70
ng/mL se p ocedía pedi una segunda mues a, ambién en papel, con la
que se ol ía a ealiza una nue a medida de TIR (gene almen e se
eclamaba la mues a si no llegaba an es de un mes desde la echa de
nacimien o). En caso de se supe io es a segunda medida a 40 ng/mL se
p ocedía a ci a a la amilia pa a ob ene una mues a de sang e líquida y
pode ealiza el análisis gené ico median e secuenciación di ec a. Al mismo
iempo se ealizaba la medida de clo u o en sudo , la anamnesis y el
es udio amilia .
Aún eniendo en cuen a las múl iples en ajas que o ecía la
secuenciación del gen CFTR en e a o os mé odos de análisis gené ico
come ciales p obados en el labo a o io pa a la FQ (como el INNO-LiPA-
CFTR), no dejaba de se un mé odo labo ioso en el que había nume osas
e apas (como puede comp oba se en el capí ulo de me odología) y en el
que podían anscu i a ias semanas an es de pode da una in o mación
comple a ú il pa a los p o esionales médicos debido al g an núme o de
mues as que se acumulaban pa a secuencia . La la ga ince idumb e de los
pad es an es de ecibi la posible con i mación de un diagnós ico de FQ se

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
127
p esen aba como el p oblema c í ico a esol e pa a la op imización del
p og ama de c ibado.
Teniendo es o en cuen a y obse ando los a ances que se sucedían
año as año en las dis in as ecnologías de geno ipado (Meng Z e al, 2004)
decidimos c ea el Chip-CFTR como un posible mé odo óp imo pa a un
p og ama de c ibado.
La in oducción de es a nue a ecnología pa a el análisis gené ico de
CFTR dio luga cambios impo an es en el p o ocolo de c ibado, cuyo
esquema ac ual se puede e en la imagen in e io :
-PROTOCOLO DE CRIBADO ACTUAL PARA FIBROSIS QUÍSTICA.
El cambio de esquema en el p o ocolo ajo consigo dos
epe cusiones impo an es que hicie on que es a ecnología diagnós ica se
adecua a mucho mejo al p oceso de c ibado:
En p ime luga se eliminó la segunda medida de TIR. Con es a
nue a ecnología e a su icien e con un pequeño agmen o de una mancha
de sang e p oceden e del ca ón pa a el es udio de me abolopa ías de odos
los ecién nacidos gallegos (no se necesi aba pedi una nue a mues a a los
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
128
pad es pa a secuencia ) con lo cual se e i aba el es és de unos pad es
pendien es de sabe si su hijo ecién nacido padece ía FQ.
En segundo luga , en el plazo máximo de un mes odos los indi iduos
analizados ienen sus esul ados. Es e plazo se consensuó con la Unidad de
Me abolopa ías eniendo en cuen a plazos o iciales pa a ealiza un
p og ama de c ibado y el núme o de mues as necesa ias pa a que el
análisis ue a cos e-e ec i o (u iliza un chip pa a analiza una sola mues a
no se ía iable).
En es e esquema se simpli ica y se elimina la medida del clo u o en
sudo , que sigue u ilizándose en el seguimien o clínico a olun ad del
acul a i o en caso de encon a dos alelos mu ados. Cabe des aca que
den o de es e p o ocolo no se in o ma a los indi iduos po ado es.
IV.3.2.- RESULTADOS DE CRIBADO PREVIOS AL USO
DE CHIPS
Du an e el pe íodo inicial de c ibado 2003-2005 se analiza on un o al
de 223 mues as. Las mu aciones encon adas en es os años median e el
mé odo de secuenciación di ec a de la egión exónica del gen CFTR ue on
las siguien es:
MUTACIÓN Nº DE ALELOS
∆F508 11
V232D 2
F1052V 2
2184insA 2
I148T 2
L206W 2
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
129
R334W 2
G576A 2
P205S 1
2176insC 1
711+1G-T 1
D1270N 1
M952I 1
R1162X 1
R74W 1
S1235R 1
S42F 1
Y1014C 1
R117H 1
D1152H 1
-MUTACIONES ENCONTRADAS MEDIANTE SECUENCIACIÓN DIRECTA EN EL
PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO (2003-2005).
Además de es as mu aciones, desde un pun o de is a poblacional
cabe des aca el hallazgo de polimo ismos ecuen es en cie os exones de
las mues as analizadas. Conc e amen e, los exones en los que apa ecie on
de SNPs con ecuencia ue on:
1. Exón 10: s213950, s1800094, s1800095.
2. Exón 14A: s1042077.
3. Exón 24: s1800136.
O os SNPs no sinónimos ue on R75Q, T351S, F508C o R668C.
Los geno ipos de los casos iden i icados con FQ du an e es e pe íodo
de c ibado pueden e se en la siguien e abla:
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
130
AÑO ALELO 1 ALELO 2
2003 ΔF508 2184insA
2003 2184insA G576A
2004 ΔF508 R334W
2004 ΔF508 R1162X
2005 ΔF508 D1152H
2005 ΔF508 2176insC
2005 711+1G-T V232D
-GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA
PILOTO DE CRIBADO (2003-2005).
IV.3.3.- RESULTADOS GLOBALES DE CRIBADO EN
PERÍODO 2003-2007
Teniendo en cuen a los esul ados del c ibado ob enidos median e
secuenciación conjun amen e con los de la u ilización de chips, du an e el
pe íodo 2003-2007 hemos encon ado las siguien es mu aciones en los
neona os con los ni eles de TIR ele ados:
MUTACIÓN Nº DE ALELOS
ΔF508 34
Y1014C 5
L206W 4
R1162X 4
G576A 4
711+1G-T 3
F1052V 3
I148T 3
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
131
R334W 3
S1235R 3
V232D 3
R117H 3
2184insA 2
D1152H 2
2176insC 1
2183AA-G 1
D1270N 1
E217G 1
E588V 1
F1074L 1
G1069R 1
G542X 1
M952I 1
P205S 1
R1066C 1
R74W 1
S42F 1
V562I 1
V754M 1
Y1092X 1
-MUTACIONES ENCONTRADAS GLOBALMENTE DURANTE EL PROGRAMA PILOTO DE
CRIBADO (2003-2007).
Como se puede e , en o al se iden i ica on 30 mu aciones di e en es
siendo la más ecuen e, como cab ía espe a , la ΔF508. Respec o a la
dis ibución poblacional de las mu aciones encon adas ( éase g á ica
siguien e) en A Co uña y Pon e ed a encon amos un mayo núme o de
mu aciones lo cual esul a lógico al se las p o incias gallegas en las que se
egis an más nacimien os.

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
132
-DISTRIBUCIÓN DE MUTACIONES POR PROVINCIAS GALLEGAS.
Los da os p oceden es del p og ama pilo o de c ibado neona al pa a
la FQ du an e es os años pueden e se esumidos en la siguien e abla:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
133
2003 2004 2005 2006 2007 TOTAL FRECUENCIA
NIÑOS
ANALIZADOS
19.911 20.548 21.165 21.270 22.143 105.037
TIR ELEVADO
1ª MUESTRA
139 154 164 137 203 797 0.76%
TIR ELEVADO
2ª MUESTRA
- 28 57 - - 85 0.20%
ESTUDIO
GENÉTICO
138 28 57 137 203 563 0.54%
PORTADORES 13 3 6 10 21 53 1:1981
FIBROSIS
QUÍSTICA
2 2 3 4 7 18
1:5835
-DATOS DEL PROGRAMA PILOTO DE CRIBADO NEONATAL (2003-2007).
El núme o ele ado de pacien es pa a es udio gené ico en 2003 se
debe a que en ese año oda ía no se hacía una segunda medida de los
ni eles de TIR. En 2004 y 2005 pa a op imiza el p oceso de secuenciación
se inicia el p o ocolo con doble TIR, con el cual se siguió de ec ando el
mismo núme o de pacien es. A pa i del años 2006 se usan los chips con lo
cual se uel e a elimina la segunda medida de TIR.
Como se puede obse a , la p e alencia al nacimien o en nues a
comunidad se ap oxima a 1 de cada 6000 nacidos. Compa ando es e da o
con el de o os p og amas de c ibado exis en es en España emos que
nues a p e alencia es muy semejan e aunque lige amen e in e io : Cas illa
y León 1/4083, Ca aluña 1/5457 y Balea es 1/4433.
O a cues ión impo an e se desp ende de los da os ecogidos en la
siguien e abla:
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
134
FECHA
INICIO
OFICIAL
TOTAL
DESDE
INICIO
FRECUENCIA
NORMALIZADA
LEUCINOSIS 1978 18 1/30.700
FENILCETONURIA 1978 40 1/13.815
HIPERFENILALANINEMIA 1978 55 1/10.047
HIPOTIROIDISMO
CONGÉNITO
1980 226 1/2.414
DÉFICIT ACIL-COA-
DESHIDROGENASA CADENA
MEDIA (MCAD)
2000 7 1/21.801
FIBROSIS QUÍSTICA 18 1/5.835
-DATOS DE ENFERMEDADES INCLUÍDAS OFICIALMENTE EN EL PROGRAMA GALEGO
PARA A DETECCIÓN PRECOZ DE ENFERMIDADES ENDÓCRINAS E METABÓLICAS EN
PERÍODO NEONATAL.
Compa ando la p e alencia al nacimien o de la FQ con la de algunas
aminoacidopa ías que se analizan en el p og ama gallego de c ibado
(leucinosis, enilce onu ia, hipe enilalaninemia) se e que es de 3 a 5 eces
supe io . Tan sólo el hipo i oidismo congéni o, de las pa ologías
conside adas g a es, iene una mayo p e alencia al nacimien o. Po o o
lado, compa ándola con pa ologías de implan ación ecien e como los
de ec os de la β-oxidación de los ácidos g asos, la FQ ambién mues a una
p e alencia muy supe io .
Debido al éxi o ob enido en es e pe íodo pilo o, ac ualmen e el
c ibado pa a la FQ se encuen a pendien e de su ins au ación o icial en
Galicia. A ni el es a al, se encuen a en deba e en e las sociedades
cien í icas implicadas en el c ibado neona al en España y el Minis e io de
Sanidad la uni icación de un mínimo de pa ologías pa a se de ec adas en
odos los cen os de c ibado neona al egionales (en e las que se ba aja la
posibilidad de incluí a la FQ).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
135
IV.3.3.1.- DESCRIPCIÓN DE CASOS DIAGNOSTICADOS CON
FIBROSIS QUÍSTICA MEDIANTE EL PROGRAMA PILOTO DE
CRIBADO
A con inuación se mues a una abla esumen con los geno ipos de
los casos iden i icados con FQ median e el p og ama pilo o de c ibado desde
su comienzo en el año 2003:
CASO AÑO ALELO 1 ALELO 2
1 2003 ΔF508 2184insA
2 2003 2184insA G576A
3 2004 ΔF508 R334W
4 2004 ΔF508 R1162X
5 2005 ΔF508 D1152H
6 2005 ΔF508 2176insC
7 2005 711+1G-T V232D
8 2006 R1162X E588V
9 2006 ΔF508 L206W
10 2006 ΔF508 ΔF508
11 2006 ΔF508 ΔF508
12 2007 ΔF508 R117H
13 2007 ΔF508 L206W
14 2007 ΔF508 ΔF508
15 2007 ΔF508 ΔF508
16 2007 G576A G1069R
17 2007 ΔF508 ΔF508
18 2007 ΔF508 ΔF508
-GENOTIPOS DE LOS CASOS DIAGNOSTICADOS CON FQ MEDIANTE EL PROGRAMA
PILOTO DE CRIBADO (2003-2007).
Cabe des aca que el c i e io seguido pa a selecciona los casos con
FQ ha sido el de encon a en el ecién nacido dos mu aciones asociadas
p e iamen e a eno ipos más o menos g a es de la en e medad.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
142
CASO 12: ΔF508 / R117H (IVS8 Tn 7/9)
En es e caso encon amos las mu aciones ΔF508 y R117H en
he e ocigosis. Además la poli imina del in ón 8 iene el geno ipo 7/9. Es e
geno ipo se ha asociado a una FQ con sín omas pulmona es le es y CBAVD.
Respec o a los da os clínicos, exis ían an eceden es amilia es de
asma (aunque nunca con diagnós ico de FQ). El es a us al nacimien o ue
no mal, mos ando un ni el de clo u o en sudo de 33 mEq/L. Ac ualmen e
ecibe un seguimien o con a ención a los p ocesos ca a ales y con p o ilaxis
an ibió ica. Su e olución pondoes a u al ha sido no mal aunque en el úl imo
con ol (año y medio) se e idenció un es ancamien o ponde al.
CASO 13: ΔF508 / L206W
Al igual que el caso 9, nos encon amos con o o caso he e ocigo o
pa a las mu aciones ΔF508 y L206W.
Respec o a los da os clínicos, has a el momen o ambién se ha
mos ado como o almen e asin omá ico, con un c ecimien o pondoes a u al
no mal y su iciencia panc eá ica. El ni el de clo u o en sudo es de 70
mEq/L y pasa po los con oles anuales u ina ios.
CASO 14: ΔF508 / ΔF508
Es e caso, homocigo o pa a la mu ación ΔF508, p esen aba a los 8
meses de edad un excelen e es ado gene al, siendo clínicamen e
asin omá ico, mos ando buen ape i o y ecibiendo suplemen ación
enzimá ica y nu icional. Asimismo se oma on medidas p e en i as
in ecciosas.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
143
CASO 15: ΔF508 / ΔF508
Es e caso homocigo o pa a la deleción ΔF508 ambién p esen ó has a
los 8 meses de edad una e olución clínica excelen e con muy buen ape i o.
La explo ación ísica ue no mal. Ac ualmen e ecibe suplemen ación
i amínica y enzimá ica.
CASO 16: G576A / G1069R
En es e caso encon amos las mu aciones G576A y G1069R en
he e ocigosis. Es a úl ima mu ación es una mu ación a a que se ha desc i o
en pacien es con un eno ipo se e o a ni el pulmona y panc eá ico, aunque
asociado a la mu ación ΔF508.
Respec o a los da os clínicos, no iene an eceden es pe sonales
conocidos pa a FQ. Sus pad es y he manos es án sanos. El pacien e se
mue a o almen e asin omá ico con clo u o en sudo de 28 mEq/L. Dados
es os ni eles y la ausencia de sin oma ología clínica se p ocede únicamen e
a e isiones pe iódicas.
CASO 17: ΔF508 / ΔF508
Es e caso homocigo o pa a la mu ación ΔF508 p esen ó íleo meconial
al nacimien o. Debido a su nacimien o ecien e, aún no ienen da os clínicos
ele an es, ecibiendo suplemen ación nu icional y enzimá ica.
CASO 18: ΔF508 / ΔF508
Es e caso homocigo o pa a la mu ación ΔF508 ing esó al mes y medio
de edad po escasa ganancia ponde al. Ac ualmen e ecibe suplemen ación
enzimá ica y i amínica.
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
144
GENOTIPO CLÍNICA
DESTACABLE
CLORURO EN
SUDOR (mEq/L)
ΔF508 / 2184insA -E olución asin omá ica. 105
2184insA / G576A -E olución asin omá ica. N.D.
ΔF508 / R334W -E olución asin omá ica. 77
ΔF508 / R1162X -Es ancamien o ponde al.
-Neumonía neumocócica.
N.D.
ΔF508 / D1152H -In ecciones en ías
aé eas supe io es.
26
ΔF508 / 2176insC -Posible hipop o einemia. 98
711+1G-T / V232D -In ección po S. au eus.
-Consolidación de lóbulo
pulmona .
63
R1162X / E588V -E olución asin omá ica. 72
ΔF508 / L206W -Desnu ición con
a ec ación pondoes a u al.
111
ΔF508 / ΔF508 -Insu iciencia panc eá ica.
-P oblemas pulmona es.
N.D.
ΔF508 / ΔF508 -Desnu ición. 101
ΔF508 / R117H -Es ancamien o
pondoes a u al.
33
ΔF508 / L206W -E olución asin omá ica. 70
ΔF508 / ΔF508 -E olución asin omá ica
(has a 8 meses).
N.D.
ΔF508 / ΔF508 -E olución asin omá ica
(has a 8 meses).
N.D.
G576A / G1069R -E olución asin omá ica. 28
ΔF508 / ΔF508 -Íleo meconial. N.D.
ΔF508 / ΔF508 -Escasa ganancia
ponde al.
N.D.
-TABLA RESUMEN DE CASOS POSITIVOS DE FQ EN CRIBADO(N.D.:NO DISPONIBLE).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
145
IV.4.- APÉNDICE
IV.4.1.- ESTUDIO MUTACIONAL DE PACIENTES
GALLEGOS CON FIBROSIS QUÍSTICA
T as los dos años iniciales del p og ama pilo o de c ibado, den o del
g upo gallego de abajo en FQ su gió la inicia i a de in en a ecopila oda
la in o mación posible ace ca de los geno ipos de odos los pacien es
gallegos diagnos icados con FQ con an e io idad al inicio del p og ama pa a
in en a ob ene así una in o mación más amplia sob e la ecuencia de
mu aciones en indi iduos gallegos. Es a inicia i a su ge debido a que los
clínicos, hablando con sus pacien es, se dan cuen a de que sólo algunos
habían con i mado gené icamen e su en e medad en Galicia (en la mayo
pa e de esos casos se habían some ido a p uebas gené icas sencillas en
o as comunidades) po lo cual muchos enían la gené ica sin hace o
incomple a.
Es a labo , nunca an es lle ada a cabo en nues a comunidad, esul ó
imp escindible a la ho a de diseña un chip ap opiado pa a el análisis
gené ico de CFTR en población gallega ya que, has a la echa, no exis ían
publicaciones sob e las mu aciones de indi iduos con FQ en Galicia.
De es a mane a, has a el momen o hemos conseguido ecopila
in o mación gené ica ace ca de 128 pacien es gallegos con FQ (algunos de
ellos ya allecidos) cuyos geno ipos se pueden obse a en la siguien e abla
(los espacios acíos se co esponden con alelos sin mu ación iden i icada):
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
146
ALELO 1 ALELO 2
ΔF508 G542X
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 2184insA
ΔF508 ΔF508
Y1092X G85V
V562I V562I
ΔF508 1811+1.6Kb A-G
ΔF508 ΔF508
ΔF508 L206W
ΔF508 R1162X
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 1811+1.6Kb A-G
ΔF508 ΔF508
ΔF508 R1162X
ΔF508 ΔF508
ΔF508 2184insA
ΔF508
G542X 2183AA-G
ΔF508
ΔF508 L206W
G542X
ΔF508 ΔF508
R1162X E588V
ΔF508 ΔF508
G542X 1811+1.6Kb A-G
ΔF508 ΔF508
N1303K 711+1G>T
ΔF508 ΔF508
ΔF508 R1162X
ΔF508 R1162X
711+1G>T
ΔF508 ΔF508
ΔF508 G542X
ΔF508 R334W
ΔF508 R1066C
2184insA G576A
ΔF508 ΔF508
ΔF508 V232D
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
S1045Y S1045Y
1609delCA
ΔF508 G85E
ΔF508 ΔF508
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
147
ΔF508 R347P
ΔF508 G542X
ΔF508 ΔF508
3860ins31 711+1G>T
3860ins31 711+1G>T
3860ins31 711+1G>T
ΔF508 G542X
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 R1162X
ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 D1152H
ΔF508 ΔF508
ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
G542X V232D
ΔF508 ΔF508
ΔF508 2176insC
875+1G>A 711+1G>T
ΔF508 ΔF508
ΔF508 R1066C
ΔF508 ΔF508
F1052V
ΔF508 2176insC
ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 G542X
ΔF508 G85E
ΔF508 G85E
G576A G1069R
ΔF508
ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 Q1100P
ΔF508 ΔF508
621+1G>T 621+1G>T
ΔF508 ΔF508
ΔF508
Y1381X Y1381X
ΔF508 R334W

DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
148
ΔF508 ΔF508
V754M
ΔF508 D614G
ΔF508 L206W
ΔF508 L159S
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 A107V
ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 2176insC
ΔF508 R117H
ΔF508 G542X
ΔF508 ΔF508
ΔF508 G542X
G576A
ΔF508 M595I
ΔF508 ΔF508
2184insA
ΔF508
ΔF508 ΔF508
V754M D443Y-G576A-R668C
ΔF508 ΔF508
711+1G-T V232D
ΔF508 ΔF508
ΔF508 ΔF508
ΔF508 2184insA
ΔF508 G542X
-GENOTIPOS DE PACIENTES GALLEGOS CON FQ (EN NEGRITA CASOS DETECTADOS
EN CRIBADO).
En muchos de es os pacien es sólo se había iden i icado un alelo
mu ado debido a las limi aciones écnicas del momen o en que ue on
diagnos icados con la en e medad. Po ello en muchos casos se nos
en ia on mues as, además de pa a ealiza un p ime es udio gené ico del
pacien e, pa a comple a o con as a es udios gené icos p e ios.
Has a el momen o, de 129 pacien es iden i icados en Galicia con FQ,
se ha log ado ob ene in o mación gené ica en 123 casos. A con inuación
mues o una abla con la ecuencia pa a las mu aciones de es os pacien es:
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
149
MUTACIÓN ALELOS PORCENTAJE(%)
ΔF508 146 59,34
Desconocido 14
5,69
G542X 12
4,87
711+1G>T 6
2,43
R1162X 6
2,46
2184insA 5
2,03
G576A 3
1,22
V232D 3
1,22
1811+1.6Kb A-G 3 1,22
3860ins31 3
1,22
L206W 3
1,22
G85E 3
1,22
2176insC 3
1,22
V562I 3
1,22
Y1381X 2
0,81
V754M 2
0,81
S1045Y 2
0,81
R334W 2
0,81
R1066C 2
0,81
621+1G>T 2
0,81
875+1G>A 1
0,41
G85V 1
0,41
L159S 1
0,41
M595I 1
0,41
N1303K 1
0,41
Q1100P 1
0,41
G1069R 1
0,41
R117H 1
0,41
F1052V 1
0,41
R347P 1
0,41
E588V 1
0,41
DESARROLLO DE NUEVAS TÉCNICAS PARA EL ANÁLISIS GENÉTICO EN FIBROSIS QUÍSTICA: APLICACIÓN AL CRIBADO NEONATAL
150
2183AA-G 1
0,41
1609delCA 1
0,41
D1152H 1
0,41
D614G 1
0,41
D443Y-G576A-R668C (ALELO
COMPLEJO)
1 0,41
Y1092X 1
0,41
A107V 1 0,41
-FRECUENCIA DE ALELOS MUTADOS EN PACIENTES GALLEGOS CON FQ.
La ecuencia de la mu ación ΔF508 en pacien es diagnos icados con
FQ en nues a comunidad, p óxima al 60%, se mues a supe io a la
encon ada en el c ibado pe o sigue siendo semejan e a la es imada a ni el
mundial del 66% (Es i ill X e al, 1997).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
151
IV.4.1.- PUBLICACIÓN
THREE NOVEL MUTATIONS IN THE CFTR GENE IDENTIFIED IN
GALICIAN PATIENTS
Rana-Díez P. a, Colón C. b, Alonso-Fe nández, J. R. b, Sola A. c, Ba os-Tizón J.C.
d, Ba os-Casas D. d, Si en J. e, Ca acedo A. a, Ba os F. a,*
a Fundacion Publica Galega de Medicina Xenomica, G upo de Medicina Xenómica, CIBERER, San iago de
Compos ela, 15706 Spain.
b Unidad de Me abolopa ias, Pedia ia, CHUS, San iago de Compos ela, 15706 Spain.
c Unidad de Gas oen e ologia Pedia ica, Hospi al Juan Canalejo, A Co uña, 15006 Spain.
d Se icio de Neumologia, CHUVI, Vigo, 36204 Spain.
e Unidad de Neumologia Pedia ica, Hospi al Juan Canalejo, A Co uña, 15006 Spain.
Keywo ds:
Galicia; Spain; CFTR; mu a ion; Cys ic Fib osis
Abs ac
We epo h ee no el CFTR missense mu a ions de ec ed in Spanish pa ien s
om Galicia (No h Wes o Spain). In he i s case, a pa ien homozygous o a no el
S1045Y mu a ion died due o pulmona y p oblems. In he o he wo cases, bo h
he e ozygous o no el mu a ions combined wi h he F508del mu a ion, clinical
symp oms we e di e en depending on he mu a ion, de ec ed as M595I and A107V.
1. In oduc ion
Mo e han 1400 di e en mu a ions wi hin he CFTR gene ha e been desc ibed
o da e [1]. I is known ha he e a e mu a ions associa ed wi h se e e cys ic ib osis
(CF) pheno ype and mu a ions associa ed wi h milde o a ypical CF disease. The
po en ial o a mu a ion o con ibu e o he pheno ype depends on i s ype, localiza ion
in he gene and in e ac ions wi h seconda y modi ying ac o s [2, 3]. I is assumed ha
nonsense, ameshi and splice si e mu a ions esul in he loss o unc ional CFTR.
Missense mu a ions a e mo e p oblema ical in ha hey may only pa ially a ec CFTR
unc ion. As he amoun o unc ioning CFTR appea s o be ela ed o clinical s a us,
some mu a ions wi h mo e modes e ec may p esen congeni al absence o he as
de e ens wi h o wi hou mild espi a o y disease.
F om 2004, when we s a ed sequencing he exonic egions o he CFTR gene in
ou labo a o y, we ha e sequenced nea ly 150 samples o pa ien s om Galicia (No h
Wes o Spain) wi h possible o independen ly diagnosed cys ic ib osis. F om hese
analyses we disco e ed h ee mu a ions in he CFTR gene no p e iously desc ibed in
he li e a u e: one homozygous S1045Y and wo compound he e ozygous, A107V and